DE69018139T2

DE69018139T2 - Methode und Apparat, um Material in biologische Zellen einzufügen.

Info

Publication number: DE69018139T2
Application number: DE69018139T
Authority: DE
Inventors: Alan R Gould; Theodore E Miller Jr; Bradley C Schuchardt; Thomas A Skokut
Original assignee: DowElanco LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 1989-06-30
Filing date: 1990-06-29
Publication date: 1995-07-27
Anticipated expiration: 2010-06-30
Also published as: EP0405696A1; JPH03117476A; AU5806190A; AU649225B2; DE69018139D1; IL94929A0; EP0405696B1; CA2020265A1; ATE120493T1; DK0405696T3; KR910001029A; ES2070996T3; IL94929A; HUT59722A; EG19604A; JP2922261B2; KR950014922B1; NZ234283A; BR9003039A; HU904039D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Beschleunigung eines vorwärts treibbaren Materials. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Inkontaktbringen eines bestimmten unter Druck stehenden Gasvolumens mit einem bestimmten Volumen einer Suspension eines vorwärts treibbaren Materials worauf die Suspension anschließend auf das ausgewählte Ziel hin beschleunigt wird.
Generell wollen Biologen einen breiten Bereich an biologischem Material in lebende Zellen einbringen. Im Hinblick auf die genetische Transformation von lebenden Zellen wird gegenwärtig viel geforscht. Herkömmliche Techniken zum Einbringen von biologischem Material in lebende Zellen umfassen Elektroporation, direkte Aufnahmemechanismen von DNA, Fusionsmechanismen, Mikroinjektionmechanismen und die Verwendung infektiöser Mittel. Jede dieser Techniken weist jedoch bestimmte praktische Nachteile auf.
Die Elektroporation ist eine Methode zum Einbringen einer Vielzahl von Molekülen in Zellen, indem diese kurzen Hochspannungs-Elektropulsen ausgesetzt werden. Für eine allgemeine Erläuterung der Elektroporation siehe Shigekawa et al., Biotechniques 6 (1988), 742; Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 856-860; und Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988), 655-660.
Generelle Beschränkungen der Elektroporation beinhalten (i) die Verminderung der allgemeinen Lebensfähigkeit der Zellen, welche durch die angelegte hohe Spannung bewirkt wird und (ii) das Unvermögen zielgenau bestimmte Zellen zu treffen, insbesondere in einem komplexen multizellulären Organ.
Weiterhin sind Elektroporationsmethoden, obwohl derartige Methoden die Aufnahmeeffizienz chimärer Genkonstrukte stark verbessert haben, bei Verwendung mit Pflanzen auf die in vitro Suspensionssysteme beschränkt. Darüber hinaus erfordern Elektroporationsmethoden, obwohl in der Transformation von einkeimblättrigen und zweikeimblättrigen Pflanzen erfolgreich eingesetzt (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 5824-5828), den relativ arbeitsaufwendigen und zeitraubenden Schritt der Entfernung der Pflanzenzellwand.
Die Mechanismen der Aufnahme beinhalten im allgemeinen Suspensionen einzelner Zellen und erfordern, insbesondere bei Anwendung auf Pflanzenzellen, eine enzymatische Entfernung von Zellwandmaterialien. Als Folge sind die Aufnahmemechanismen zeitraubend und weisen einen relativ geringen Durchsatz auf.
Ein Aufnahmetechnik besteht in der Erhöhung der Membran- Permeabilität, wie durch Verwendung von Calcium (Ca) (Mandel et al., J. Mol. Biol. 53 (1972), 159-162) und eines Temperaturschocks (Dityatkin et al., Biochimica et Biophysica Acta 281 (1972), 319-323)
Eine zweite Aufnahmetechnik stellt die Verwendung Oberflächen-bindender Mittel, wie Polyethylenglycol (PEG) (hinsichtlich einer allgemeinen Erläuterung der Verwendung Oberflächen-bindender Mittel siehe Chang et al., Mol. Gen. Genet. 168 (1972), 111-115; Krens et al., Nature 296 (1982), 72) oder wie Calciumphosphat (Graham et al., Virology 52 (1973), 456; Wigler et al., Cell 16 (1979), 777) dar.
Eine dritte Aufnahmetechnik stellt die Phagocytose von Teilchen in eine Zelle dar. Geeignete Teilchen umfassen Liposomen (Uchimiya et al., Proc. 5th Intl. Cong. Plant Tissue and Cell Culture, Fujiwara (Hrsg.) (1982), 507-508), Organelle (Potrykus, Z. Pflanzenphysiol. 70 (1973), 364-366) oder Bakterien (Cocking, Ann. Rev. Plant Physiol. 23 (1972), 29-50).
Durch Fusionsmechanismen wird durch Fusion der Zellmembran mit der Membran einer anderen Zelle, einem Organell oder einem Liposom neues genetisches Material in eine Zelle aufgenommen. Hinsichtlich der Aufnahmemechanismen beruhen die Pflanzenzell- Fusionstechnologien auf der Verwendung von in vitro Suspensions-Systemen, bei denen Zellen enzymatisch von jeglichem Zellwandmaterial befreit werden.
Die Fusion kann durch elektrische Ströme, PEG und Sendai- Viruspartikel induziert werden. Für eine allgemeine Erörterung der Zellfusion siehe Uchidaz et al., Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells, Baserga et al., (Hrsg.) 1 (1980), 169-185 und Harris, Cell Fusion: The Dunham Lectures
(1970). Obwohl Fusionstechnologien relativ gute Erfolge hinsichtlich der Zahl der beteiligten Zellen vorweisen können, können die Zellselektions-Probleme der komplex sein. Beispielsweise können im Fall von Zell-zu-Zell-Fusion die so erhaltenen Zellen häufig eine erhöhte Ploidie aufweisen, was deren Nützlichkeit einschränken kann.
Die Mikroinjektion stellt eine direkte Methode zum Transfer von Chromosomen durch Mikroinjektion dar. Mikroinjektionstechniken setzen äußerst feine, ausgezogene Kapillar-Röhren ein, die als Kanülen für die direkte Injektion biologischer Substanzen in bestimmte Typen einzelner Zellen verwendet werden können. Wenn eine Injektion in kleine Zellen vorgenommen werden soll, dann sind sehr scharfe Kapillaren, deren Spitzen sehr leicht brechen oder verstopfen, erforderlich. Darüber hinaus werden hohe Drücke benötigt, um den Massefluß durch Kapillaröffnungen kleiner als 1 um zu bewirken und die Regulierung eines derartigen Masseflusses kann schwierig sein. Das gesamte Verfahren ist eher empirisch und erfordert unterschiedliche Abänderungen für unterschiedliche Zelltypen.
Für eine allgemeine Erläuterung der Mikroinjektionstechniken siehe Diacumakos, Methods in Cell Biology, Prescott (Hrsg.) (1973), 287-311; Graessman and Graesmann, Methods in Enzymology 101, 482-492; Crossway et al., Mol. Gen. Genet. 202 (1986), 179-185, Crossway et al., Biotechniques 4 (1986), 320- 334, Reich et al., Can. J. Bot. (1986) und Reich et al., Bio/Technology 4 (1986), 1001-1004.
Die Mikrolnjektionstechniken weisen den Nachteil auf, daß diese hinsichtlich der Zell-Erholung beschränkt sind. Die direkte Mikroinjektion in Pflanzenzellen ist darüber hinaus durch das Vorhabdensein einer festen Zellwand erschwert. Obwohl Protoplasten ohne Zellwand gebildet werden können, ist die Mikroinjektion von Pflanzenzellen aufgrund ihrer extremen Fragilität schwierig.
Der Nachteil der Mikroinjektion besteht daher darin, daß sie die Manipulation einer einzelnen Zelle erforderlich macht und somit zur Behandlung einer Vielzahl von Zellen ungeeignet ist. Das Verfahren ist im allgemeinen eintönig und schwierig. Als Folge weist es eher eine sehr geringe Effizienz und einen geringen Durchgang auf.
Zusätzlich zu den vorstehend aufgeführten Systemen gibt es mehrere infektiöse Mittel, die Nucleinsäuren in Zellen einführen können. Das Pflanzen-Pathogen Agrobacterium tumefaciens besitzt die ihm eigene Fähigkeit einen Teil der DNA eines in ihm enthaltenen Ti-Plasmids (Tumor-induzierend) in eine infizierte Pflanzenzelle zu transferieren. Durch Inserieren von Fremdgenen in Plasmide in Agrobacterium, die bestimmte Sequenzen des Ti- Plasmids tragen, kann die bakterielle Transformationsfähigkeit dazu verwendet werden, die Fremdgene in das Genom der infizierten Pflanzenzellen zu transportieren.
Von besonderer Bedeutung sind Agrobakterium-Vektoren für zweikeimblättrige Pflanzenzellen (Fraley et al., CRC Crit. Rev. Plant Sci. 4 (1986), 1-46) und die retroviralen Vektoren für tierische Zellen (Anderson, Science 226 (1984), 401-409).
Retroviren (RNA-Viren) können dazu verwendet werden Gene in tierische Zellen einzuführen. Wenn das Virus in die Zelle gelangt, dann fungiert seine RNA als Matrize für eine reverse Transkription komplementärer DNA, die sich in das Genom der Wirtszelle integriert. Diese DNA kann isoliert und in ein Plasmid inseriert werden. Das Plasmid mit zusätzlichen Genen kann dazu verwendet werden Zellen mit Hilfe von Helfer-Retroviren zu trans formieren.
Diese Systeme sind jedoch häufig schwierig zu kontrollieren. Das Problem bei der Verwendung infektiöser Mittel, wie den DNA-Einführsystemen ist vielfältig. Zuerst weisen infektiöse Mittel einen begrenzten Wirtsbereich auf. Die Übertragung kann nur auf der Stufe einer einzelnen Zelle durchgeführt werden, im allgemeinen mit somatischen Geweben, das dann künstlich in eine ganze Pflanze regeneriert werden muß. Dies beschränkt die Anwendbarkeit von Agrobakterium vermittelter genetischer Transformation auf solche Arten von Feldfrüchte, die einfach aus Gewebetypen, welche für eine Agrobakterium-Infektion anfällig sind, regeneriert werden können. Der natürliche Wirtsbereich von Agrobakterium beinhaltet nur zweikeimblättrige Pflanzen und eine beschränkte Anzahl einkeimblättriger Arten der Familie Liliaceae. In ähnlicher Art und Weise neigen Retroviren und die Expression der DNA, die sie übertragen, dazu Wirts- und Gewebespezifisch zu sein.
Zweitens komplizieren infektiöse Mittel die Übertragunsverfahren zusätzlich, indem ein zweites lebendes System mit all seinen einhergehenden Schwierigkeiten eingeführt wird. Beispielsweise können Transformationen mit Agrobacterium im allgemeinen somoklonale Varianten hervorbringen, die in in Gewebekultur gehaltenen Pflanzengeweben spontan entstehen und die eine Identifizierung von Transformanten erschweren können. Zusätzlich sind infektiöse Mittel, wie Retroviren potentiell gefährlich - sie können den veränderten Organismus schädigen oder sie können, durch Rekombination, zur Entstehung neuer Pathogene führen.
Erst kürzlich entwickelten Sanford et al. Ein Verfahren, mit dem Substanzen in Zellen von intakten Geweben eingeführt werden können (Klein et al., Nature 337 (1987) und Sanford et al., Particular Sci. and Technol. 5 (1988), 27-37).
Diese Dokumente lehren, daß kleine Wolframpartikel hoher Dichte (Mikroprojektile) durch eine Teilchen-Schußvorrichtung auf eine hohe Geschwindigkeit gebracht werden können. Sanford et al. lehren, daß sie die Mikroprojektile auf ausreichend hohe Geschwindigkeiten gebracht haben, um ein Eindringen in die Pflanzenzelle über die folgenden Ausführungsformen zu ermöglichen: (1) ein Makroprojektil (Kunststoffgeschoß) und eine Bremsplatte, (2) ein transferierter mechanischer Impuls, (3) eine Gas- (beispielsweise Luft-) Entladung und (4) ein Zentripetalbeschleunigungs-System.
Obwohl die Teilchen-Schußvorrichtung einen wirklichen technischen Fortschritt darstellt, weisen dessen unterschiedliche Ausführungsformen bestimmte Nachteile auf. Beispielsweise ist in jeder der unterschiedlichen Ausführungsformen die Beladungsmenge der Wolframsuspension nicht leicht reproduzierbar und es ist vielmehr ein ziemlich arbeitsaufwendiges Verfahren Kulturen wiederholt anzuimpfen. Darüber hinaus muß sich in der Makroprojektilausführung (1) und der Gasentladungsausführung (3) die Geschwindigkeit mit unvermeidbaren Unterschieden in der Feuerungscharakteristik unterscheiden. Schließlich weist die Makroprojektilausführungform (3) die folgenden zusätzlichen Nachteile auf: die Trägheitsmasse der Kuststoffkugel verringert die Geschwindigkeit - was eine starke Explosion erforderlich macht, die Geschwindigkeiten lassen sich nicht leicht verändern oder kontrollieren und die Verbrennungsgase des Schießpulvers können ein Problem darstellen.
Die Entwicklung einer Technik, mit der nicht-zelluläres biologisches Material direkt in lebende Zellen und Gewebe einführbar ist, wäre daher vorteilhaft. Gemäß einer Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung, welche (a) eine unter Druck stehende Gasquelle mit einer Austrittsöffnung, (b) einen Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material mit einer Eintritts- und einer Austrittsöffnung und (c) ein Mehrzweckventil, das eine selektive Verbindung zwischen der Austrittsöffnung der unter Druck stehenden Gasquelle und dem Eingangsventil des Vorratsbehälters für das vorwärts treibbare Material herstellt, umfaßt. In einer zweiten Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Einführen von biologischem Material in ein Zielmaterial, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) eine bestimmte Menge eines Gasvolumens in einem Gasbehälter bei einem bestimmten Druck zur Verfügung zu stellen, (b) eine bestimmte Menge eines vorwärts treibbaren Materials, das eine Suspension eines biologischen Materials in einem Trägermedium umfaßt, in einem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material zur Verfügung zu stellen, wobei der Vorratsbehälter eine Eintrittsöffnung aufweist, die in selektiver Verbindung mit der Gas- Austrittsöffnung steht, und eine Austrittsöffnung aufweist, die in selektiver Verbindung mit der Überlauf-Eintrittsöffnung und der Versorgungs-Eintrittsöffnung steht, (c) das vorwärts treibbare Material mit dem bestimmten Gasvolumen Inkontakt zu bringen und (d) das vorwärts treibbare Material durch ein Zuführmittel auf das Zielmaterial hin zu beschleunigen.
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen deutlicher, worin.
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform zeigt.
Fig. 2 eine schematische Darstellung eines Ventils zur Verwendung mit der Vorrichtung von Fig. 1 und gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Fig. 3 eine schematische Darstellung eines Ausführungsform einer unter Druck stehenden Gasquelle zur Verwendung mit Fig. 1 und zur Verwendung in der erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt.
Die Figuren 4A & 4B schematische Darstellungen verschiedener Ausführungsformen einer Quelle von vorwärts treibbarem Material zur Verwendung mit der Vorrichtung aus Fig. 1 und in der vorliegenden Erfindung zeigen.
Die Figuren 5A & 5B schematische Darstellungen eines vorwärts treibbenden und Visier-Mittels zur Verwendung in einer Vorrichtung, wie in Fig. 1 gezeigt, und gemäß der vorliegenden Erfindung zeigen.
Fig. 6 eine schematische Darstellung eines Beispiels eines Geschwindigkeitsmeßvorrichtunges zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zeigt.
Fig. 7 eine schematische Darstellung eines synchronisierenden Mittels zur Verwendung in einer Vorrichtung, wie in Fig. 1 gezeigt, und gemäß der vorliegenden Erfindung, zeigt.
Die Figuren 8A & 8B schematische Darstellungen eines Stromkreises, wie er in dem in Fig. 6 hier gezeigten Geschwindigkeitsmeßvorrichtung verwendet wird, und wie er nachstehend in dem Abschnitt "Beispiele" erläutert wird, zeigen.
Fig. 9 eine graphische Darstellung der Roh-Daten, die verwendet wurden, die Flugzeit des vorwärts treibbaren Materials durch den Stromkreis zu messen, wie nachstehend in dem Abschnitt "Beispiele" erläutert wird, zeigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft generell ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Beschleunigen von vorwärts treibbarem Material. Es sollte klar sein, daß die Erfindung nicht auf ein Verfahren oder eine Vorrichtung zum vorwärts Treiben eines spezifischen Materials beschränkt ist, sondern daß die vorliegende Erfindung vielmehr zum vorwärts Treiben von vielen Arten von Materialien verwendet werden kann. Die Erfindung ist jedoch im Prinzip an ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Beschleunigen einer Suspension von biologischem Material angepaßt.
Das biologische Material kann zellulär oder nicht-zellulär sein. Das biologische Material kann relativ klein sein, vorzugsweise kleiner als 1 um, mehr bevorzugt kleiner als 0,1 um. Die Menge des verwendeten biologischen Materials wird im allgemeinen bis zu 5 ug betragen, wobei spezifische Mengen möglicherweise aufgrund der Typs des verwendeten zellulären Materials unterschiedlich sind.
Der Ausdruck "nicht-zelluläres biologisches Material" umfaßt Viren (Tabak-Mosaik-Virus (TMV), Blumenkohl-Mosaik-Virus (GAMV), Mais-Streifenvirus (MSV) usw.), Organelle (beispielsweise Mitochondrien, der Kern, Chloroplasten oder Plastide), genetisches Material (beispielsweise entweder Ribonucleinsäure (RNA) oder Desoxyribonucleinsäure (DNA) in Form von Plasmiden oder Einzel- oder Doppelsträngen), Proteine (Antikörper oder Enzyme) oder Stämme.
Wenn das nicht-zelluläre Material DNA ist, dann kann die DNA in einen Vektor konstruiert werden, welcher zur Expression des exogenen Gens in den Zellen geeignet ist. Geeignete Transformationsvektoren umfassen Expressionsvektoren.
Vektoren, die zur Expression geeignet sind, müssen im allgemeinen neben der codierenden Sequenz des gewünschten exogenen Gens, zweckmäßige flankierende regulatorische Sequenzen beinhalten. Derartige flankierende Sequenzen umfassen einen geeigneten Promotor, der zur Förderung der Transkription und Expression in vivo in Zellen befähigt ist und einen Translations- Terminator, der zur Bezeichnung des Transkriptionsendes oder des zweckmäßigen Prozessierens der RNA in einer derartigen Art und Weise, daß eine zweckmäßige Translation der Boten-RNA für die Proteinsynthese erfolgt, befähigt ist.
Wenn DNA in lebende Zellen inseriert wird, dann ist es bevorzugt die Nachkommen in einem bestimten Stadium durchzumustern, um auf Transformanten zu selektieren, da nicht alle Zellen in diese inserierte Trägerteilchen besitzen und nicht alle Zellen oder Nachkommen die DNA in ihr Genom aufnehmen werden. Die Anwesenheit der gewünschten DNA in den Zellen kann dann auf eine Vielzahl von Wegen festgestellt werden, je nach der Natur der DNA.
Der Transformations-Vektor kann einen selektierbaren Marker enthalten, der die Selektion der transformierten Zellen erlaubt. Der Selektionsmarker kann eine Eigenschaft, die biochemisch nachgewiesen werden kann oder ein phänotypisches Merkmal, das registriert werden kann, bestimmen.
Alternativen zur Verwendung derartiger selektierbarer Marker umfassen morphologische oder biochemische Untersuchungen zum Durchmustern der transformierten Nachkommen. Eine morphologische Durchmusterung kann auf ein dominantes phänotypisches Merkmal in den Nachkommen abstellen. Eine geeignete Durchmusterung stellt ein sogenannter "Southern-Blot" mit einer Probe, die mit der transformierten DNA selbst im Genom der Mikroorganismus, der Pflanze oder der tierischen Zelle hybridisiert, dar.
Die Anwesenheit eines Gens, das ein exogenes Produkt synthetisiert, kann zudem durch Isolierung und Lyse der Zelle und einer Analyse des Zytoplasmas auf das exogene Produkt oder des Kerns auf das exogene Gen, nachgewiesen werden. Das exogene Produkt kann mittels Elektrophorese, Chromatographie, Immunassay, Southern blotting oder dergleichen nachgewiesen werden.
Mit "zellulärem biologischem Material" werden einzelne oder multizelluläre Massen zellulärer Mikroorganismen, Pflanzenzellen oder tierischer Zellen bezeichnet.
Der Ausdruck "zellulärer Mikroorganismus", wie er hier verwendet wird, umfaßt Bakterien und Protozoen.
Der Ausdruck "Pflanzenzellen", wie er hier verwendet wird, umfaßt Zellen, die in der Pflanze intakt sind oder einen Teil der Pflanze, beispielsweise Blüten, Fruchtkerne, Ähren, Obstkerne, Blätter, Hülsen, Stiele, Pflanzenzellen oder Gewebskulturen, die mit oder ohne Zellwand oder anderen natürlichen Schutzschichten vorliegen, beispielsweise Protoplasten, Pflanzen-Galli, Pflanzengewebesklumpen, subzelluläre Strukturen, Pollenkörner, Pflanzen-Meristem, Eier, Zygoten, Samen, die dazu befähigt sind in eine Pflanze auszukeimen.
Die Pflanzenzelle kann von jeder Pflanzen-Spezies abstammen. Der Ausdruck "Pflanzen-Spezies" beinhaltet Einkeimblättrige (beispielsweise Gräser und die Weizenfrüchte, wie Mais, Roggen, Gerste, Weizen, Mohrenhirse, Hafer, Kolbenhirse und Reis) und die Zweikeimblättrigen beispielsweise breitblättrige Pflanzen, wie Tabak, Kartoffel und Alfalfa).
Der Ausdruck "tierische Zellen", wie er hier verwendet wird, umfaßt Säuger-, Fisch-, Vogel-, Reptilien- und Amphibien- Gewebe.
Das biologische Material kann auf der Oberfläche eines Trägerteilchens durch eine Vielzahl von Techniken adsorbiert werden. Das biologische Material kann beispielsweise einfach durch Trocknen auf geeigneten Trägerteilchen, wie nachstehend beschrieben, hergestellt werden. Die Trägerteilchen sollten eine Größe, eine Form und eine Dichte aufweisen, die ausreichend ist, um in die Zellmembran und/oder die Zellwand einzudringen ohne der Zelle größeren physischen Schaden zuzufügen. Trägerteilchen, die zu klein oder nicht dicht genug sind, können in bestimmte Zellen nicht eindringen, während Trägerteilchen, die zu groß oder zu dicht sind, für andere Zellen tödlich sind. Andere Faktoren als die Zellgröße, wie die Anwesenheit einer Zellwand oder zu viele interzelluläre Kerne, können die Wirksamkeit der Transformation durch Projektile einer ausgewählten Größe und Dichte ebenfalls beeinflussen.
Im allgemeinen besitzen die Trägerteilchen einen Durchmesser zwischen 0,1 um und 100 um, vorzugsweise zwischen 0,5 um und 5 um. Die Trägerteilchen besitzen im allgemeinen eine Dichte zwischen 1 g/cm³ und 25 g/cm³, vorzugsweise zwischen 10 g/cm³ und 25 g/cm³.
Die Trägerteilchen können aus einem biologisch inerten dichten Material hergestellt werden. Beispiele für Materialien umfassen bestimmte Metalle, beispielsweise Wolfram, Gold, Platin, Palladium, Silber und Nickel, Latex, Glas, Keramik, in der Chirurgie eingesetzte Legierungen und Ferrit-Kristalle.
In einer anderen Ausführungsform können die biologischen Materialien in inerten Materialien eingekapselt sein. Ein beispielhaft genanntes Verkapselungsmittel stellt Polylysin dar (Molekulargewicht 200.000). Das Verkapselungsmittel wird auf die Teilchen aufgebracht, indem die Teilchen in einer Lösung des Verkapselungsmittels getaucht wird und dann die so getrockneten Teilchen Luft-getrocknet oder Wärme-getrocknet werden. Sobald die Trägerteilchen mit einem Verkapselungsmittel beschichtet sind und ausreichend getrocknet wurden, kann das biologische Material auf die Teilchen aufgebracht werden. In einer alternativen Ausführungsform könnte die Verkapselung des biologische Materials in Verbindung mit Ausfällung des Materials auf die Teilchen erreicht werden.
Darüber hinaus kann das entweder prokaryotische oder eukaryotische biologische Material gefroren werden, in dem Trägermedium suspendiert werden und als Projektil direkt zur Beschleunigung auf das Ziel verwendet werden.
Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung von Trägerteilchen mit den vorwärts zu treibendem, biologischen Material beschränkt. Die vorwärts zu treibenden biologischen Materialien können gefroren werden, in einem Trägermedium suspendiert werden und als Projektil direkt zur Beschleunigung auf das Ziel verwendet werden.
Jedes Medium, das dem vorwärts treibbaren biologischen Material nicht schadet, ist als Träger geeignet.
Das biologische Material kann in jedem Medium gezüchtet werden, welches das Material erhalten kann und/oder den Zellmetabolismus und das Wachstum aufrecht erhalten kann. Beispiele für Kulturen werden in Murashige and Skoog, Physiol. Plantarum 15 (1962), 473-496 und Schenk and Hildebrandt, Canadian Journal of Botany 50 (1972), 199-204 gelehrt.
Das Trägermedium sollte so gewählt werden, daß es eine Fließeigenschaft besitzt, die zum Transport der darin enthaltenen Trägerteilchen befähigt ist. Die Fließeigenschaft des Trägermediums hängt von der Dichte, der Oberflächenspannung, dem wirksamen Voumen und der Viskosität des vorwärts treibbaren Materials ab. Das Trägermedium wird vorzugsweise dazu in der Lage sein, das zelluläre oder nicht-zelluläre biologische Material und wahlweise die Trägerteilchen zu suspendieren.
Das Trägermedium sollte im allgemeinen eine Dichte aufweisen, die dazu geeignet ist, die Teilchen bei dessen Bewegung darin zu halten. Die Dichte des Trägermediums sollte vorzugsweise zwischen 0,5 g/cm³ und 2 g/cm³ liegen.
Das Trägermedium sollte im allgemeinen eine Oberflächenspannung aufweisen, die dazu geeignet ist dessen kohäsives vorwärts treibbares Volumen zu erhalten. Die Oberflächenspannung des Trägermediums sollte vorzugsweise zwischen 20 und 80 dynes/cm liegen.
Das Trägermedium sollte im allgemeinen ein Volumen aufweisen, das dazu geeignet ist eine gewünschte Anzahl von Trägerteilchen zu suspendieren. Das Volumen des Trägermediums sollte vorzugsweise zwischen 0,5 ul und 1000 ul, mehr bevorzugt zwischen 5 ul und 100 ul liegen.
Das Trägermedium sollte eine Viskosität aufweisen, welche dazu geeignet ist ein kohäsives vorwärts treibbares Volumen aufrecht zu erhalten und die Teilchen zu suspendieren. Die Viskosität des Trägermediums sollte zwischen 0,1 Centipoise (Cp) und 10 Cp betragen, am meisten bevorzugt zwischen 0,5 und 2 Cp.
Beispiele für Trägermedien umfassen Flüssigkeiten, wie Wasser, Ethanol, Pufferlösungen, einschließlich Phosphat-, Citrat- und Acetatpuffer, Salzlösungen, einschließlich Chloride von Kalium, Natrium und Calcium, Glycole, Gylcerine und fluorierte Kohlenwasserstoffe und flüssigen Stickstoff, wenn das zelluläre oder nicht-zelluläre biologische Material gefroren ist.
Ein zweckmäßige Ziel kann ein zelluläres biologisches Material oder ein nicht-zelluläres biologisches Material sein. Das biologische Material kann in jedem Medium gezüchtet/gehalten werden, welches das biologische Material, wie vorstehend beschrieben, erhält und es während des Aufpralls der Mikroteilchen unterstützt.
Ein Ölschicht kann über die Zellen aufgebracht werden, um den hydraulischen Druck des Mediums zu kontrollieren und um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern, indem ein Verschließen von Verletzungen nach dem Eindringen unterstützt wird. Die lebenden Zellen können beispielsweise in einer isotonischen Lösung gebadet werden, um im Zeitpunkt, in dem die Membran ein Loch bekommt, das Gleichgewicht zwischen dem osmotischen Druck des intrazellulären Material und der extrazellulären Lösung im Bereich der Lochs in der Zellmembran aufrecht zu erhalten. Als Membran-Stabilisierungsmittel können in all diesen Lösungen Calciumionen vorhanden sein, so daß der verletzte Teil der Membran schnell wiederhergestellt werden kann. Beispiele für isotonische Lösungen umfassen Lösungen, welche generell für Mikroinjektions-Techniken für Pflanzenzellen eingesetzt werden, Ringer-Lösung für Zellen von Kaltblütlern, Protozoen und Mikroorganismen und Ringer-Locke, Ringer-Tirode und andere Lösungen für Zellen und tierische Zellen.
Der Beschuß des Zielmaterials kann dazu führen, daß ein Teil der Probe aufgrund von Dispersion beim Auftreffen des vorwärts treibbaren Materials auf das Zielmaterial verloren geht. Beispiele für Mittel, welche dazu dienen das Zielmaterial an seinem Platz halten, umfassen Filterpapier, Agarmedium, Metallscheiben und Metallscheiben-Kästen. So kann beispielsweise eine nachfolgende Inkubation und Färbung des biologischen Materials direkt auf dem Filterpapier vorgenommen werden. In einer anderen Ausführungsform können sowohl das Zielmaterial sowie das vorwärts treibbare Material in Lösung gebracht werden und mit unbeschichteten Trägerteilchen, die in dem Trägermedium suspendiert sind, beschossen werden. Derartige Trägerteilchen können in ihrer Spur ein bestimmtes Volumen der äußeren Lösung, die das nicht-zelluläre biologische Material enthält, in das zelluläre biologische Material hineinziehen.
Eine bevorzugt Ausführungsform der Erfindung wird mit Bezug zu den Zeichnungen beschrieben. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann jede zweckmäßige Ausgestaltung annehmen, die ermöglicht, daß ein bestimmtes Gasvolumen mit einem bestimmten Gasdruck eine bestimmte Menge eines vorwärts treibbaren Materials kontaktiert und dieses auf das gewählte Ziel hin beschleunigt.
Verschiedene Ausführungsformen einer Vorrichtung, welche innerhalb des Bereichs der Erfindung liegen und in den Figuren gezeigt sind, werden nachstehend erläutert.
In Fig. 1 wird schematisch eine Vorrichtung gezeigt, die allgemein mit der Referenznummer 10 bezeichnet wird. Die Vorrichtung umfaßt ein Mehrzweckventil 70 mit Eintrittsöffnungen und Austrittsöffnungen, eine unter Druck stehende Gasquelle 30 mit einer Austrittsöffnung, eine wahlweise Quelle an vorwärts treibbarem Material 20 mit einer Austrittsöffnung, ein Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 mit einer Eintritts- und einer Austrittsöffnung, eine wahlweise Versorgungseinrichtung 50 mit einer Eintritts- und einer Austrittsöffnung und ein wahlweises Rückgewinnungsmittel 60 mit einer Eintritts- -und einer Austrittsöffnung.
Das Mehrzweckventil 70 wird so gewählt, daß es eine Anordnung aufweist, welche so eingestellt werden kann, daß eine selektive Verbindung zwischen der unter Druck stehenden Gasquelle 30 oder wahlweise der Quelle an vorwärts treibbarem Material 20 und dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 hergestellt wird. Das Mehrzweckventil 70 wird darüber hinaus so gewählt, daß es eine Anordnung aufweist, die eine selektive Verbindung zwischen dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 und entweder der Versorgungseinrichtung 50 oder wahlweise dem Rückgewinnungsmittel 60 liefern kann.
Wie in Fig. 2 ersichtlich ist kann eine Ausführungsform des Mehrzweckventils 70 eines erstes Unterventil 70a und ein zweites Unterventil 70b umfassen. Das erste Unterventil 70a liefert eine selektive Verbindung zwischen der Austrittsöffnung der unter Druck stehenden Gasquelle 30 oder der Austrittsöffnung der Quelle an vorwärts treibbarem Material 20 und der Eintrittsöffnung des Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40. Das zweite Unterventil 70b liefert eine selektive Verbindung zwischen der Austrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Materials 40 und entweder der Eintrittsöffnung der Versorgungseinrichtung 50 oder der Eintrittsöffnung des Rückgewinnungsmittels 60.
Beispiele für das erste Unterventil 70a und das zweite Unterventil 70b können jede der Dreiweg-Ventile oder Zweiweg- Ventile sein, mit der Maßgabe, daß die Zweiweg-Ventile über geeignete Mittel wahlweise in operativer Verbindung stehen. Beispielhaft genannte Mittel zum Halten der Zweiweg-Ventile in operativer Verbindung umfassen herkömmliche Stellglieder oder unterschiedliche Stellglieder (nicht gezeigt).
Das erste und zweite Unterventil kann wiederum über zweckmäßigen Mittel in operativer Verbindung stehen. Beispiele für Mittel, um die zwei Zweiweg-Ventile in operativer Verbindung zu halten, umfassen ein herkömmliches Stellglied (wie durch 70c gezeigt) oder unterschiedliche Stellgliedern (nicht gezeigt).
Die Stellglieder der ersten und zweiten Unterventile werden so gewählt, daß ein Umschalten der unter Druck stehenden Vorräte auf das Ventil ermöglicht wird. Generell kann jedes Stellglied, das sich linear oder rotationsgerichtet bewegen läßt, verwendet werden. Beispiele für Stellglieder umfassen doppeltwirkende pneumatische Einheiten mit Zahnstangengewinde. Wenn unterschiedliche Stellglieder verwendet werden, dann können die Stellglieder mittels Zeitmeßvorrichtungen (nicht gezeigt) synchronisiert werden.
Die Stellglieder befinden sich in operativer Verbindung mit einem Fußpedal (nicht gezeigt), wodurch der Betrieb vereinfacht und der relative Durchsatz der Vorrichtung gesteigert wird.
Der Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 kann unter einer Anzahl von Behältern, wie einer Röhre, gewählt werden. Der Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 kann vorzugsweise eine Innenfläche aufweisen, die so gewählt ist, daß ein Innenraum mit einem Längenverhältnis gebildet wird, das ausreichend ist einen einheitlichen Ausstoß des vorwärts treibbaren Materials sicherzustellen und eine minimale Blockierung zu gewährleisten, d.h. durch ein Material, das an die Innenseite des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material 40 anhaftet oder diese benetzt. Beispiele für einen Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 werden in der Lage sein zwischen 0,005 ml und 100 ml an vorwärts treibbarem Material aufzunehmen.
Der Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 wird im allgemeinen aus einem Material hergestellt sein, das physisch stark genug ist mit dem vorwärts treibbarem Material aus der Quelle an vorwärts treibbarem Material 20 und/oder mit Gas aus der unter Druck stehenden Gasquelle beladen zu werden, ohne dabei physisch deformiert zu werden. Der Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 wird vorzugsweise aus einem Material hergestellt sein, das in der Lage ist einem Druck von mindestens 1000 Pfund/Inch² (Psi) bei physiologischen Temperaturen zu widerstehen. Ein beispielhaft genanntes Material zur Verwendung bei der Herstellung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material ist rostfreier Stahl.
Wie aus Fig. 2 ersichtlich kann die Temperatur innerhalb des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material 40 durch Temperaturkontrollmittel 42 überprüft werden. Beispiele für Temperaturkontrollmittel umfassen Thermoelemente, welche in einen Heizblock, der den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 umgibt, eingebaut ist.
Obwohl die schematische Darstellung in den Figuren 1 und 2 die Verwendung nur einer Quelle an vorwärts treibbarem Material zeigt können die bei dem Betrieb der Vorrichtung 10 aufgestellten Grundsätze auf die Beschleunigung von zwei oder mehreren Typen vorwärts treibbaren Materials aus einer Vielzahl von Quellen an vorwärts treibbarem Material angewandt werden.
Im allgemeinen kann das Volumen des vorwärts treibbaren Materials 20 in dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 durch jede Art und Weise überprüft werden, die abgemessene, reproduzierbare Proben an vorwärts treibbarem Material ergeben. Bei Verwendung von Röhren oder dergleichen kann eine Röhre, die ein erstes Volumen halten kann durch eine andere Röhre, die ein zweites Volumen halten kann, ersetzt werden. Die Vorrichtung ist jedoch nicht dazu gedacht auf diese Art und Weise begrenzt zu sein. Beispielsweise kann ein Füllhöhen- Sensor (nicht gezeigt) an jeder Stelle angebracht werden, welche dazu geeignet ist genaue, reproduzierbare Volumenmessungen in dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 zu liefern.
Wie aus Fig. 1 ersichtlich kann die unter Druck stehende Gasquelle 30 ein Gasversorgungsmittel 31 und wahlweise ein Gasregulierungsmittel 32 enthalten. Die unter Druck stehende Gasquelle wird so gewählt, daß vorbestimmte Gas-Volumina in den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 geliefert werden. Der Gasdruck hängt von dem verwendeten Gastyp und dem Volumen des Gases ab. Im allgemeinen wird der Gasdruck zwischen 15 Atmosphären (Atm) und 150 Atm betragen.
Die unter Druck stehenden Gasquelle 30 kann durch jedes Mittel gesteuert werden, welches Gas bei einem bestimmten Druck in den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 liefern kann. Das Gasregulierungsmittel kann manuell oder automatisch betrieben werden.
Die unter Druck stehende gasquelle 30 wird in der Lage sein Gas-Volumina in den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 kontinuierlich zu liefern, um ein relativ schnelles, wiederholtes Ingang setzen der Vorrichtung 10 zu ermöglichen.
Ein Beispiel für eine unter Druck stehende Gasquelle 30 wird weiter in Fig. 3 erläutert. Wie in Fig. 3 gezeigt umfaßt die unter Druck stehende Gasquelle 30 (1) eine Gasversorgungseinrichtung 31 in Form eines Gasversorgungsbehälters 31a mit einer Austrittsöffnung, (2) eine Gasversorgungsleitung 33 mit einer Eintritts- und einer Austrittsöffnung und (3) ein Gasregulierungsmittel 32 in Form eines Gasventils 32a und eines Gasvorratsbehälter 32b mit einer Eintritts- und einer Austrittsöffnung.
Die Austrittsöffnung des Gasvorratbehälters 31a steht in pneumatischer Verbindung mit der Eintrittsöffnung der Gasversorgungsleitung 33. Die Austrittsöffnung der Gasversorgungsleitung 33 steht wiederum über ein Gasventil 32a in selektiver pneumatischer Verbindung mit der Eintrittsöffnung des Gasvorratbehälters 32b.
Beispielhaft genannte Gasversorgungsmittel 31 umfassen Gaszylinder und Gasbehälter.
Der Gasvorratsbehälter 32b kann unter jeder Zahl von Behältern, wie Röhren, gewählt werden. Beispiele für Gasvorratsbehälter werden zwischen 1 ml und 100 l Gas enthalten können.
Im allgemeinen kann der Gasvorratsbehälter 32b aus einem Material gemacht sein, das physikalisch stark genug ist mit Gas aus der unter Druck stehenden Gasquelle 30 beladen zu werden, ohne dabei physikalisch verformt zu werden. Der Gasvorratsbehälter 32b wird vorzugsweise in der Lage sein einem Gasdruck bis zu 150 Atm zu widerstehen. Beispiele für Materialien zur Verwendung bei der Herstellung der Gasversorgungsleitung umfassen rostfreien Stahl.
Das Gas sollte so gewählt werden, daß es ein Molekulargewicht besitzt, das ausreichend niedrig ist eine annehmbar schnelle Ausdehnung zu ermöglichen, um die erforderliche Teilchengeschwindigkeit zu ergeben. Das Molekulargewicht des Gases sollte im allgemeinen zwischen 2 und 40 Atommassen-Einheiten (amu) betragen. Beispiele für Gase umfassen Helium, Wasserstoff und Luft.
Wie vorstehend unter Bezug zu Fig. 1 und 2 bemerkt umfaßt die Vorrichtung vorzugsweise eine Quelle eines vorwärts treibbaren Materials 20, die in selektiver Fluid-Verbindung mit dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 steht. Wenn die Quelle an vorwärts treibbarem Material nicht vorhanden ist, dann kann der Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 manuell gefüllt werden und in Fluid-Verbindung mit der Vorrichtung verbunden werden.
Wie aus Fig. 1 ersichtlich und wie in den Figuren 4A und 4B insbesondere gezeigt, ist die Quelle an vorwärts treibbarem Material so gewählt, daß sie dazu in der Lage ist vorbestimmte Volumina an vorwärts treibbarem Material in den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material zu liefern.
Die Quelle an vorwärts treibbarem Material 20 wird in der Lage sein kontinuierlich gewählte Volumina an vorwärts treibbarem Material in den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 zu liefern, um ein relativ schnelles und wiederholtes Ingang setzen der Vorrichtung 10 zu ermöglichen. Die Quelle an vorwärts treibbarem Material 20 umfaßt eine Versorgungseinrichtung 21 für vorwärts treibbares Material. Beispiele für Versorgungseinrichtungen für vorwärts treibbares Material umfassen Spritzen, Behälter, Röhren oder andere Leitungen.
Im allgemeinen wird die Versorgungseinrichtung für vorwärts treibbares Material 21 aus einem Material hergestellt sein, das sterilisiert werden kann. Beispiele für Materialien umfassen rostfreier Stahl und Polytetrafluorethylen.
Je nach der inhärenten Regulierungskapazität der Versorgungseinrichtung für vorwärts treibbares Material, kann die Vorrichtung Mittel umfassen, die dden Strom an vorwärts treibbarem Material steuern können, d.h. ein Steuerungsmittel für vorwärts treibbares Material 22. Das Steuerungsmittel für vorwärts treibbares Material kann mit dem Versorgungsmittel 21 für vorwärts treibbares Material in operativer Verbindung stehen, damit ein gewähltes Volumen an vorwärts treibbarem Material in den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material geliefert werden kann. Beispiele für Steuerungsmittel für vorwärts treibbares Material umfassen Ventile und Pumpen.
Wie kürzlich gezeigt, sind beispielhafte Ausführungsformen der Quelle an vorwärts treibbarem Material 20 in den Figuren 4A und 4B gezeigt. Diese Ausführungsformen zeigen Quellen von vorwärts treibbarem Material, die dazu ausgelegt sind ein gewähltes Volumen an vorwärts treibbaren Materials zu entleeren.
In einer Ausführungsform, wie in Fig. 4A ersichtlich, umfaßt die Quelle an vorwärts treibbarem Material (1) eine Versorgungseinrichtung 21 für vorwärts treibbares Material in Form einer Spritze 21a mit einer Austrittsöffnung und (2) eine Versorgungsleitung 23 für vorwärts treibbares Material mit einer Eintritts- und einer Austrittsöffnung. Die Austrittsöffnung der Spritze 21a steht in selektiver Fluid-Verbindung mit der Eintrittsöffnung der Versorgungsleitung 23 des vorwärts treibbaren Materials. Die Austrittsöffnung der Versorgungsleitung 23 des vorwärts treibbaren Materials steh wiederum in Fluid-Verbindung mit einer Eintrittsöffnung eines Mehrzweckventils 70, das zu dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 führt.
In einer andern Ausführungsform, wie in Fig. 4B ersichtlich, umfaßt die Quelle an vorwärts treibbarem Material (1) eine Versorgungseinrichtung für vorwärts treibbares Material 21 in Form eines Versorgungsbehälters 21b mit einer Austrittsöffnung, (2) ein Steuerungsmittel für vorwärts treibbares Material 22 in Form eines Ventils für vorwärts treibbares Material 22a und (3) eine Versorgungsleitung für vorwärts treibbares Material 23 mit einer Eintritts- und einer Austrittsöffnung. Die Austrittsöffnung des Behälters 21b steht über das Ventil für vorwärts treibbares Material 22 in selektiver Fluid-Verbindung mit der Eintrittsöffnung der Versorgungsleitung für vorwärts treibbares Material. Die Austrittsöffnung der Versorgungsleitung für vorwärts treibbares Materials 23 steht wiederum in Verbindung mit einer Eintrittsöffnung des Ventils 70, das zu dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material führt.
Je nach der Zeit, für die das vorwärts treibbare Material in dem Versorgungsbehälter für vorwärts treibbares Material 21b gehalten wird, kann der Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 21b in operativer Verbindung mit einem Temperaturkontrollmittel 25, wie in der alternativen Ausführungsform der Fig. 4B gezeigt ist, stehen, um das vorwärts treibbare Material bei einer bestimmten Temperatur zu halten. Beispiele für Temperaturkontrollmittel umfassen Thermoelemente, die in einen Heizblock eingebettet sind, welcher den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 21b umgibt.
Je nach der relativen Viskosität des Trägermediums kann der Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 21b in operativer Verbindung mit einem Rührmittel 24 stehen, um die Teilchen in dem Trägermedium in Suspension zu halten. Beispiele für Rührmittel umfassen sich hin und her bewegende Spritzenpumpen, Magnetrührer-Bewegung, Ventil-Anordnungen und Pumpen, um unterschiedliche Strömungsrichtungen innerhalb des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material 21b zu erzeugen. Das Rührmittel wird vorzugsweise so gewählt, daß unterschiedliche Strömungsrichtungen innerhalb des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material 40 erzeugt werden, beispielsweise eine sich hin und herbewegende Spritzenpumpe.
Wie in den Figuren 1 und 2 ersichtlich kann die Austrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material 40 über ein Mehrzweckventil 70 mit der Eintrittsöffnung des Rückgewinnungsmittels 60 in selektiver Verbindung stehen.
Das Rückgewinnungsmittel 60 erlaubt ein Überlaufen von zuviel an vorwärts treibbarem Material aus dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40. Das Rückgewinnungsmittel 60 beinhaltet jedes Mittel zum Auffangen des vorwärts treibbaren Materials. Ein bevorzugtes Rückgewinnungsmittel umfaßt eine Röhre, welche versiegelt ist und aus der Material herausgezogen werden kann. Eine derartige Anordnung erlaubt zudem ein offenes System, mit dem eine Rührvorrichtung, beispielsweise eine sich hin und herbewegende Spritzenpumpe, selektiv kombiniert werden kann, wobei unterschiedliche Strömungsrichtungen innerhalb des Vorratsbehä1ters für vorwärts treibbares Material 40 zur Verfügung gestellt werden.
Das Rückgewinnungsmittel 60 kann aus jedem Material hergestellt werden, welches dazu in der Lage ist das vorwärts treibbare Material aufzunehmen und keine schädliche Wirkung darauf auszuüben. Um ein Überfließen erheblicher Mengen von geeigneten vorwärts treibbarem Material aus dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material zu verhindern, kann das Rückgewinnungsmittel 60 vorzugsweise aus einem transparenten Material hergestellt sein, um eine einfache Messung des darin enthaltenen Materials zu ermöglichen. Beispiele für Materialien, die eine visuelle Überprüfung des Überfließens erlauben umfassen Polytetrafluoroethylen (PFTE)

Zuführvorrichtung

Wie in den Figuren 1, 2 und 7 ersichtlich kann die Austrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material 40 über ein Mehrzweckventil 70 mit der Eintrittsöffnung der Zuführvorrichtung 50 in selektiver Verbindung stehen.
Die Zuführvorrichtung 50, die insbesondere in den Figuren 5A und 5B gezeigt ist, ermöglicht ein relativ genaues Zielen des vorwärts treibbaren Materials. Das Zuführvorrichtung 50 kann eine Makro-Zielvorrichtung 51 und/oder eine Mikro-Zielvorrichtung 52 enthalten. Aufgrund der Kraft des vorwärts treibbaren Materials, das aus dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material (in den Figuren 1 und 2 gezeigt) austritt ist es bevorzugt, daß die Zuführvorrichtung auch eine Makro-Zielvorrichtung umfaßt, wenn sie eine Mikro-Zielvorrichtung enthält.
Wie in Fig. 5A ersichtlich, steht die Makro-Zielvorrichtung 51 wiederum in Fluid-Verbindung mit der Mikro-Zielvorrichtung 52.
Im allgemeinen wird die Makro-Zielvorrichtung 52 so gewählt, daß sie eine innere Oberfläche aufweist, welche eine Bohrung mit einer Länge, einer Geometrie und einem Durchmesser aufweist, welche ausreichend ist, einen wesentlichen Beschleunigungsverlust des vorwärts treibbaren Materials aufgrund eines Vorbeiziehens von Gas an dem vorwärts treibbaren Material, verhindert. Die Makro-Zielvorrichtung 51 ist vorzugsweise eine Röhre, die so gewählt ist, daß die Innenfläche eine generelle zylindrische Bohrung mit einem Innendurchmesser zwischen 500 um und 2000 um, vorzugsweise 750 um bis etwa 1250 um aufweist.
Die Makro-Zielvorrichtung 51 kann aus jedem Material hergestellt werden, das seine Form unter den Zuführbedingungen aufrechterhält. Beispiele für Materialien umfassen Glas, Kunststoff und rostfreier Stahl.
Besteht die Zuführvorrichtung nur aus der Makro-Zielvorrichtung 51, so kann diese dazu verwendet werden, das vorwärts treibbare Material in einem sogenannten "shotgun" Feuerungsmuster zu beschleunigen. Umfaßt die Zuführvorrichtung eine Mikro- Zielvorrichtung 52, dann erlaubt diese ein genaueres Zielen des vorwärts treibbaren Materials.
In einer ersten Ausführungsform, wie in Fig. 5A ersichtlich, umfaßt die Mikro-Zielvorrichtung 52 eine Pipette 52a, die mit der Makro-Zielvorrichtung 51 in Fluid-Verbindung steht, ein Mikroinstrument 52b, das in einer Haltevorrichtung 52c, welche mit einem bewegliches Werkzeug 52d eines Dreiwege-Mikromanipulators 52e fest verbunden ist, angeordnet ist. Der Mikromanipulator 52e kann einen Joystick (nicht gezeigt) enthalten, der die Position der Pipette steuert.
Die Pipette 52a sollte so gewählt werden, daß sie einen Innendurchmesser mit ausreichendem Innenvolumen besitzt, um das vorwärts treibbare Material durchzuleiten. Der Innendurchmesser der Pipette beträgt im allgemeinen zwischen etwa 10 um und etwa 500 um, vorzugsweise zwischen etwa 100 bis etwa 250 um. Pipetten werden herkömmlich aus Kapillarenröhren gemäß wohlbekannter Techniken hergestellt (siehe allgemein Graesmann et al., Methods in Enzymology 65 (1980), 816-825).
Beispiele für Mikro-Zielvorrichtungen 52 können zweckmäßig aus herkömmlichen Mikroinjektionsvorrichtungen konstruiert werden, die gemäß der hier gegebenen Lehre durch den Fachmann relativ leicht verändert werden können, um Mikro-Zielvorrichtungen zu ergeben.
Herkömmliche Mikroinjektionsvorrichtungen und -Techniken werden in den folgenden Dokumenten gelehrt: US-P- 4,743,548; Yamamoto et al., Exp. Cell Res. 142 (1982), 79-84; Purres, Methods for Intracellular Recording and Ionophoresis (1981); Ocho et al., Acta Med. Okayama 35 (1981), 381-384; Lawrence and Davies, Plant Cell Rep. 4 (1985), 33-35; Steinbiss et al., Proceedings of the 1984 Wye International Symposium, Experimental Manipulation of Ovule Tissue: Their Micromanipulation, Tissue Culture and Physiology; Steinbiss and Stabel, Protoplasma 116 (1983), 223-227; Morikawa and Yamada, Plant Cell Physiol. 26 (1981), 229-236; Graessman et al., Methods in Enzymology 65 (1980), 816-825; und Lin and Ruddle, Exp. Cell. Res. 134 (1981), 485-488.
Darüber hinaus enthalten die Zuführvorrichtungen vorzugsweise eine Visiervorrichtung 58, obwohl visuell gezielt werden kann. Die Visiervorrichtung sollte eine Vergrößerung liefern, mit der man das Ziel wirksam fokussieren kann, vorzugsweise zwischen 10x und 200x. Beispiele für Visiervorrichtungen umfassen Präpariermikroskope und Boroskope.
In einer zweiten Ausführungsform, wie in Fig. 5B ersichtlich, umfaßt die Mikro-Zielvorrichtung 52 eine Pipette 52a, welche in operativer Verbindung mit der Visiervorrichtung 58 steht.
Wie aus den Figuren 1, 5A, 5B und 7 deutlich wird, öffnet sich die Austrittsöffnung der Zuführvorrichtung in eine Vortriebszone 80, in der das Zielmaterial angeordnet werden kann.
Das Zielmaterial kann auf eine geeignete Plattform überführt werden. Beispielsweise kann eine Petrischale 59a dazu verwendet werden das Zielmaterial aufzunehmen. Um das Zielen mit der Zuführvorrichtung 51 zu unterstützen kann das Zielmaterial vorzugsweise auf einer X-Y-translational verschiebbaren Bühne angeordnet werden.
Beispielsweise kann ein Vakuum an die Vortriebszone angelegt werden. Das Ausmaß des Vakuums sollte ausreichend sein, eine Verminderung der Geschwindigkeit der Teilchen aufgrund der Verminderung durch den Luftwiderstand zu vermeiden und ein Streuen des vorwärts treibbaren Materials zu verhindern. Das Ausmaß des Vakuums sollte vorzugsweise von 0 Atm bis 0,5 Atm reichen.
Eine geeignete, von außen kontrollierte Kammer wird in "Fisher 88", Laboratory Equipment Catalog of Fisher Scientific, Inc., Pittsburgh, PA gelehrt.

Geschwindigkeitsmeßvorrichtung

In einer anderen Ausführungsform umfaßt die Vorrichtung 10 eine Geschwindigkeitsmeßvorrichtung 90, wie in den Figuren 1, 6 und 7 gezeigt ist. Jede Vorrichtung, die zur Messung der Geschwindigkeit des vorwärts treibbaren Materials in der Lage ist, ist zur Verwendung als die Geschwindigkeitsmeßvorrichtung geeignet.
Im allgemeinen kann die Geschwindigkeitsmeßvorrichtung an jeder Stelle angebracht werden, von der die Geschwindigkeit des vorwärts treibbaren Materials reproduzierbar gemessen werden kann. Die Geschwindigkeitsmeßvorrichtung 90 kann vorzugsweise an dem Zuführmittel angebracht sein.
Wie aus Fig. 6 ersichtlich umfaßt eine beispielhaft genannte Geschwindigkeitsmeßvorrichtung 90 einen ersten Geschwindigkeits-Sensor 92 und einen zweiten Geschwindigkeits-Sensor 94, wobei die Sensoren an aufeinanderfolgenden Stellen an dem Zuführmittel angebracht ist.
Der erste Geschwindigkeits-Sensor 92 umfaßt ein Quellen- Mittel 92a und einen Sensor 92b. Der zweite Geschwindigkeits- Sensor 94 umfaßt ein Quellen-Mittel 94a und einen Sensor 94b.
Beispiele für Quellen-Mittel 92a und 94a umfassen Infrarotstrahler, wie Infrarotlicht ausstrahlende Dioden (LED) oder jede andere ähnliche Lichtquelle. Wenn die Befestigung Infrarotstrahler enthält, dann ist das Zuführmittel vorzugsweise aus einem transparenten Material, wie Glas oder klarem Kunststoff gemacht.
Beispiele für Sensoren 92b und 94b umfassen Photodioden, Phototransistoren oder Photovoltaik-Zellen.
Die ersten und zweiten Sensoren können im allgemeinen über eine elektrische Leitung in operativer Verbindung mit dem Mehrzweckventil 70 stehen.
Der Stromkreis sollte generell die Messung der Flugzeit (wie in dem Abschnitt "Beispiele" nachstehend und in Fig. 9 gezeigt) zwischen den ersten und zweiten Sensoren ermöglichen. Der Stromkreis kann vorzugsweise eine "Folgezeitschaltung" liefern, um sicherzustellen, daß alle Teile der Geschwindigkeitsmeßvorrichtung 90 mit der Beschleunigung des vorwärts treibbaren Materials synchronisiert sind. Nachdem der Stromkreis den Status der zeitlichen Steuerung sichergestellt hat kann der Stromkreis eine operative Verbindung zwischen der Geschwindigkeitsmeßvorrichtung 90 und dem Mehrzweckventil 70 liefern, wobei ein vorgewähltes Zeitintervall mit ausreichender elektrischer Kraft zur bewegung des Mehrzweckventil 70 eine Verbindung zwischen der unter Druck stehenden Gasquelle 30 und dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material herstellt.
Jede Anzahl von Stromkreisen kann durch den Fachmann strukturiert werden, um die vorstehend gezeigten Voraussetzungen zu erfüllen. Beispiele für Stromkreise für Geschwindigkeitsmeßvorrichtungen sind in den Figuren 8A und 8B gezeigt und werden nachstehend erläutert.

Synchronisations-Mittel

In einer anderen Ausführungsform, wie aus Fig. 7 ersichtlich, kann die Vorrichtung 10 in operativer Verbindung mit einem Mittel stehen, das zur Synchronisation mindestens einiger Elemente zum Beladen und Beschleunigen des vorwärts treibbaren Materials wirksam sind. Die Synchronisation mindestens einiger Vorrichtungselemente ist dazu gedacht, die Anzahl an Schritten, die ein Bediener durchführen müßte, zu verringern und folglich die zwischen den Betätigungen erforderliche Zeit zu verringern und den Durchsatz zu steigern.
Eine beispielhaft genannte Ausführungsform eines Synchronisations-Mittels wird in Fig. 7 gezeigt. Das Synchronisations- Mittel 100 umfaßt einen Computer 110, der in operativer Verbindung mit der Vorrichtung 10 steht.
Der Computer 110 steht über die Leitung 101 mit der Box 102 in Verbindung, welche eine Reihe von Sensor- und Befehlsleitungen enthält.
Eine erste Zuleitung 102a kann als Sensor- oder Befehlsverbindung mit einem Temperaturkontrollmittel 25 in Verbindung stehen, wobei die Temperatur des Versorgungsbehälters für vorwärts treibbares Material 21b automatisch reguliert wird.
Eine zweite Zuleitung 102b kann als Sensor- oder Befehlsverbindung mit dem Rührmittel 24 in Verbindung stehen, wobei das vorwärts treibbare Material bei einer bestimmten Geschwindigkeit gerührt wird.
Eine dritte Zuleitung 102c steht in Befehlsverbindung mit dem Regulierungsmittel 22 für vorwärts treibbares Material. Die Zuleitung hält die Quelle des vorwärts treibbaren Materials in einer offenen oder geschlossenen Position.
Eine vierte Zuleitung 102d steht in Sensor-Verbindung mit der dritten Zuleitung 102c und in Befehlsverbindung mit dem Mehrzweck-Unterventil 70a. Wenn die Quelle des vorwärts treibbaren Materials in der offenen Position gehalten wird, dann liefert das Mehrzweckventil 70 eine selektive Fluid-Verbindung zwischen der Quelle an vorwärts treibbaren Material 20 und dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 und eine selektive Fluid-Verbindung zwischen dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 und dem Rückgewinnungsmittel 60.
Ein fünfte Zuleitung 102e steht in Sensor- und Befehlsverbindung mit dem Temperatur-Regelungsmittel 42, wobei die Temperatur des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material reguliert wird.
Eine sechste Zuleitung 102f steht in Sensor-Verbindung mit der vierten Zuleitung 102d und in Befehlsverbindung mit der Geschwindigkeitsmeßvorrichtung 90. Wenn sich ein gewähltes Volumen an vorwärts treibbarem Material in dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 befindet, dann wird ein Zeitzyklus für das Feuern der Vorrichtung initiiert.
Eine siebte Zuleitung 102g steht in Sensorverbindung mit der sechsten Zuleitung 102f und dem Gasventil 32a. Wenn der Zeitzyklus der Geschwindigkeitsmeßvorrichtung sichergestellt ist, dann wird das Gas-Steuerungsmittel in der offenen Position gehalten.
Eine achte Zuleitung 102h steht in Sensor-Verbindung mit der siebten Zuleitung 102g und dem Mehrzweckunterventil 70b. Wenn sich die unter Druck stehenden Gasquelle in der offenen Position befindet, dann liefert das Mehrzweckventil 70 über den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 eine selektive pneumatische Verbindung zwischen der unter Druck stehenden Gasquelle 30 und dem Zuführmittel 50.
Eine neunte Zuleitung 102i steht in Sensor-Verbindung mit der Geschwindigkeitsmeßvorrichtung 90. Nachdem ein gewähltes Gasvolumen in den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 entleert wurde und ein beschleunigtes Volumen an vorwärts treibbarem Material die Geschwindigkeitsmeßvorrichtung passiert, wird die Geschwindigkeit des vorwärts treibbaren Materials angezeigt.
Im allgemeinen kann das Synchronisationsmittel jedes Verfahrenskontrollmittel sein, das in der Lage ist Daten, die durch die verschiedenen Sensorzuleitungen geliefert werden zu verarbeiten. Beispiele für Synchronisationsmittel umfassen einfache Bordrechner oder das Camilet- (Handelsname der Firma Dow Chemical) Datenerfassungs- und Verarbeitungs-Kontrollsystem, das von der Firma Dow Chemical käuflich zu erwerben ist.

Betrieb

Die Vorrichtung, wie in Fig. 1 gezeigt, kann wie folgt betrieben werden. Das Zielmaterial kann selektiv in der Vortriebszone in einer bestimmten Entfernung von dem Zuführmittel positioniert werden.
Wenn das vorwärts treibbare Material oder das Zielmaterial biologisches Material enthält, dann wird das Zielmaterial selektiv in einer Entfernung angeordnet, die wirksam ist, einen Kontakt mit dem vorwärts treibbaren Material zu ermöglichen, der für eine wesentliche Zahl des zellulären biologischen Materials nicht tödlich ist (obwohl einige Zellen sterben können)
Im allgemeinen wird das Zielmaterial in einer Entfernung zwischen 1 cm und 100 cm von der Austrittsöffnung des Zuführmittel angeordnet.
Wenn das Zuführmittel nur eine Makro-Zielvorrichtung enthält, d.h. ohne eine Mikro-Zielvorrichtung vorliegt, dann wird das Zielmaterial in einer Entfernung von 5 bis 20 cm von der Austrittsöffnung des Zuführmittels entfernt angeordnet. Wenn das Zuführmittel eine Mikro-Zielvorrichtung enthält, dann wird das Zielmaterial in einer Entfernung von 1 mm bis 100 cm von der Austrittsöffnung des Zuführmittels entfernt angeordnet.
Die Vorrichtung, wie in Fig. 1 allgemein gezeigt und in den gewählten Figuren insbesondere genauer erläutert, kann wie folgt betrieben werden. Wie aus den Figuren 1, 2 und 4B ersichtlich werden das Mehrzweckventil 70 und das Regulierungsmittel für vorwärts treibbares Material 22a so eingestellt, daß sie eine Fluid-Verbindung zwischen der Versorgungseinrichtung für vorwärts treibbares Material 21 und dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 liefern. In der Folge gelangt vorwärts treibbares Material von der Quelle an vorwärts treibbarem Material 20 in den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40.
Wie aus den Figuren 1 und 2 ersichtlich, wird das Mehrzweckventil 70 zudem so eingestellt, daß es eine Fluid- Verbindung zwischen dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 und dem Rückgewinnungsmittel 60 liefert. Jedes Volumen an vorwärts treibbarem Material, das über das des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material 40 hinausgeht, gelangt in das Rückgewinnungsmittel 60.
Wie aus den Figuren 1, 2 und 3 ersichtlich werden das Mehrzweckventil 70 und das Gas-Regulierungsmittel 32a dann so eingestellt, daß sie eine pneumatische Verbindung zwischen der Gasversorgungseinrichtung 31 und dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 liefern. In der Folge gelangt ein bestimmtes Volumen Gas unter einem Druck, welcher zur Beschleunigung des vorwärts treibbaren Materials auf eine bestimmte Geschwindigkeit ausreicht, von der unter Druck stehenden Gasquelle 30 zu dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40.
Das Mehrzweckventil 70 wird zudem so eingestellt, daß es eine pneumatische Verbindung zwischen dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 und der Zufürvorrichtung 50 liefert. Sobald das Gas in den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material 40 entlassen wurde, trifft es auf das vorwärts treibbare Material, das in das eventuell vorhandene Zuführmittel 50 beschleunigt wird.
Wie aus den Figuren 1 und 6 ersichtlich ist wird das vorwärts treibbare Material in dem Zuführmittel einen ersten Sensor 92 und einen zweiten Sensor 94 passieren. Mit dem ersten und zweiten Sensor 92 und 94 kann die Geschwindigkeit des vorwärts treibbaren Materials aufgezeichnet werden, was eine reproduzierbare Beschleunigung des vorwärts treibbaren Materials erlaubt.
Das vorwärts treibbare Material wird vorzugsweise auf eine wirksame Geschwindigkeit beschleunigt. Die "wirksame" Geschwindigkeit wird von den gewünschten Ergebnissen abhängen.
Um biologisches Material in zelluläres biologisches Material einzuführen sollte die Geschwindigkeit des vorwärts treibbaren Materials im allgemeinen dergestalt wirksam sein, daß das biologische Material in die Zellmembran und in die eventuell vorhandene Zellwand eindringt. Für derartige Systeme sollte das vorwärts treibbare Material vorzugsweise am Punkt, an dem sie das Zuführmittel verläßt eine Geschwindigkeit zwischen 200 Meilen/Stunde und 1200 Meilen/Stunde (89,4 bis 536,4 ms&supmin;¹) aufweisen.
Wie klar sein sollte hängt die Geschwindigkeit des vorwärts treibbaren Materials von einer Vielzahl bekannter Parameter ab. Derartige Parameter umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Länge und den Innendurchmesser des Zuführmittels, den Gasdruck, die Strömungseigenschaften des Gases, die Strömungseigenschaften des vorwärts treibbaren Materials, die physikalischen Eigenschaften des vorwärts treibbaren Materials, die Entfernung zwischen der Austrittsöffnung des Zuführmittels und dem Zielmaterial und das Volumen und die Strömungseigenschaften des Mediums, in dem das Zielmaterial gezüchtet wird.
Die Strömungscharacteristika des vorwärts treibbaren Materials sind nicht besonders kritisch. Das vorwärts treibbare Material kann daher im Massenfluß oder turbulenter Strömung beschleunigt werden. Mit "Massenfluß" wird verdeutlicht, daß sich das vorwärts treibbare Material als eine generell kontinuierliche Masse bewegt und daß sich die Gasbereiche und die Bereiche des vorwärts treibbaren Materials im wesentlichen nicht vermischen. Mit "turbulenter Strömung wird ein flüssiger Strom bezeichnet, bei dem sich die Geschwindigkeit an einem gegebenen Punkt in Höhe und Richtung unberechenbar ändert, wobei sich in der Folge das Gas und das vorwärts treibbare Material vermischen. Liegt eine turbulente Strömung vor, dann findet eine Wechselwirkung zwischen dem Gas und dem vorwärts treibbaren Material statt, wobei eine Dispersion gebildet wird und folglich ein breiterer säulenartiger Strahl an vorwärts treibbarem Material beim Heraustreten aus der Vorrichtung entsteht.
Da das unter Druck stehenden Gas das vorwärts treibbare Material direkt kontaktiert und selbst in die Vortriebszone gelangt wird das in den Vorratsbehälter geladene vorwärts treibbare Material reproduzierbar in die Vortriebszone entleert. Ein kleinerer, jedoch reproduzierbarer Teil an vorwärts treibbarem Material verbleibt in dem Zuführmittel. Im Grunde gelangt nur das vorwärts treibbare Material nicht in die Vortriebszone, das an den Innenwänden der Ventile und der Entleerungsmittel haftet oder diese benetzt. Dieses vorwärts treibbare Material wird als "hängengeblieben" bezeichnet. Die Menge des hängengebliebenen Materials wird abhängig von der Viskosität und dem jeweiligen vorwärts treibbaren Material und variieren.
Die Geschwindigkeit des vorwärts treibbaren Materials wird beim Passieren der Geschwindigkeitsmeßvorrichtung gemessen. Insbesondere zeigt die Flugzeit zwischen dem ersten und dem zweiten Sensor der Geschwindigkeitsmeßvorrichtung, die auf dem Zuführmittel angebracht sind, die Geschwindigkeit des vorwärts treibbaren Materials.
Indem reproduzierbare Messungen der Flugzeit des vorwärts treibbaren Materials geliefert werden kann der Fachmann die verschiedenen Parameter, die die Geschwindigkeit des vorwärts treibbaren Materials beeinflussen, einstellen. Durch Einstellen der Parameter kann der Fachmann die optimale Geschwindigkeit für das vorwärts treibbare Material wählen.
Ein gewünschtes Volumen an vorwärts treibbarem Material tritt aus dem Zuführmittel in die Vortriebzone.
Der Betrieb wird dadurch eingestellt, daß das Mehrzweckventil selektiv so gestellt wird, daß der Gasstrom aus dem Gas- Vorratsbehälter 32 in den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material blockiert wird.
Die vorherige Diskussion ist dazu gedacht eine allgemeine Idee der Kriterien, die bei dem Betrieb der erfindungsgemäßen Vorrichtung berücksichtigt werden müssen, zu liefern. Gemäß den vorstehenden Lehren wird die Wahl von Betriebsbedingungen für jedes verwendete System dem Fachmann offensichtlich.
Die vorliegende Erfindung kann in verschiedenen biologischen Wissenschaftsgebieten, einschließlich der Transformation von Pflanzenzellen, von tierischen Zellen und von Mikroorganismen eingesetzt werden.
Ein besonderes Merkmal der vorliegenden Erfindung stellt die Tatsache dar, daß sie die Behandlung von Pflanzenzellen erlaubt, deren Wände intakt sind. Da die Schwierigkeit aus Protoplasten ganze Pflanzen wiederherzustellen umgangen werden kann, kann die gentechnologische Behandlung wichtiger Korn-Spezies erleichtert werden.
Zwei wichtige Ziele für die Transformation von Pflanzen- Keimzellen sind Pollen oder Eier und Meristem-Kuppel oder Gewebekultur-Zellen (aus intakten Pflanzen und Embryos oder aus Gewebekultur). Die Transformation von Pollen, Eiern oder Meristem-Kuppeln sind mögliche Verfahren für sich sexuell fortpflanzende Feldfrüchte, während die Transformation von Gewebekultur-Zellen oder Meristem-Kuppeln mögliche Verfahren für sich asexuell fortpflanzende Feldfrüchte darstellen. Jede dieser Vorgehensweisen erlaubt die Herstellung transformierter ganzer Pflanzen.
Gewebekultur-Zellen können transformiert und dann gezüchtet werden, wobei sich somatische Embryos oder Meristem-Kuppeln ergeben, die sich wiederum in umgewandelte Pflanzen regenerieren.
Die Transformation von Meristem kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß die meristematische Kuppel chirurgisch herausgenommen und mit DNA-enthaltenden Teilchen beschossen wird, was die Transformation einer großen Anzahl meristematischer Zellen erlaubt. Die transformierten Meristems sind dazu befähigt in chimäre Sprößlinge zu wachsen, aus denen stabile transformierte Sektoren gewählt werden.
Bezüglich einer allgemeinen Diskussion eines Verfahrens, bei dem Gene in unreife Embryo-Achsen inseriert werden, die dann dazu verwendet werden Pflanzen zu regenerieren, siehe McCabe et al., Bio/Technology 6 (1988), 923-926.
Schließlich wurde auch die Chloroplast-Transformation in Chlamydomonas, einer einzelligen Alge, unter Einsatz eines Beschusses mit Mikroprojektilen berichtet (Boynton et al., Sci. 240 (1988), 1543-1537. Drei Mutanten des Chloroplast atpB-Gens von Chlamydomonas reinhardtii wurden mit Chloroplasten DNA, die das Wildtyp-Gen enthielt, transformiert. In den Transformanten wurde die Fähigkeit zur Photosynthese wiederhergestellt.
Die genetische Transformation kleiner Zellgruppen in tierischem Gewebe ist nun unter Verwendung des Verfahrens und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung möglich. Eine derartige Therapie liefert einen nicht-infektiösen, jedoch höchst wirksamen Mechanisus zur Transformation tierischer Gewebe in situ. Bezüglich einer allgemeinen Diskussion siehe Sanford et al., vorstehend.
Die Transformation von Mitochondrien in Hefe durch Beschuß mit Projektilen wurde berichtet (Johnston et al., Sci. 240 (1988), 1538-1541. Das Dokument lehrt die Transformation eines nicht-revertierenden Hefestamms, der hinsichtlich der Atmung aufgrund einer Deletion in dem mitochondrialen Oxi-3 Gen defizient ist, mit DNA-Sequenzen, die die Oxi-3 Deletion korrigieren könnten. Atmungsfähige Transformanten wurden erhalten, die einen homologen Ersatz des defekten Oxi-3 Gens enthielten.
Das Schicksal fremder Biopolymere, wie RNA, Protein, Lipiden und sowohl organischen als auch anorganischen Chemikalien kann analysiert werden, indem Teilchen, die mit diesen Molekülen oder Kombinationen von Molekülen beladen sind, abgefeuert werden.
Darüber hinaus können isolierte subzelluläre Organelle, wie Mitochondrien oder Chloroplasten transformiert werden und die transformierten Organelle in die Pflanzenzellen oder Protoplasten wieder eingebracht werden.

Beispiele

Die folgenden Beispiele werden zur weiteren Erläuterung der Erfindung gegeben ohne deren Bereich zu beschränken. Alle Teil- und Prozentangaben sind auf das Gewicht bezogen, wenn nicht anders angegeben.
Das vorwärts treibbare Material wurde wie folgt hergestellt.
Trägerteilchen, die mit DNA-enthaltenden Plasmiden beschichtet waren, wurden in einem Trägermedium suspendiert. Insbesondere wurde das Plasmid an der Oberfläche von Gold-Teilchen adsorbiert. Das Plasmid enthielt ein Gen, das das Enzym β- Glucuronidase (GUS-Gen) codiert und das unter der Kontrolle eines 355 California Mosaik Virus-Promotor (CaMV) stand (Gen, Promotor und regulatorische Sequenzen von Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, USA erhalten). Die Gold- Teilchen lagen als ein kugeliges Pulver mit einem Durchmesser von 1,5 bis 3 um vor (im Handel von Alfa Products, Danvers, MA erhältlich).
Um Adsorption zu bewirken wurden 50 ul einer Lösung des Plasmids (1,8 ug DNA/ul 0,01 M Tris-Puffer, pH 8,0 mit 0,001 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)) zu 400 ul einer Suspension von Gold-Trägerteilchen (300 mg Gold-Trägerteilchen pro ml destilliertem Wasser) gegeben. Die DNA wurde durch Zugabe von 74 ul einer 2,5 M Calciumchloridlösung und 30 ul einer 0,1 M Spermidin-Lösung ausgefällt. Die beschichteten Trägerteilchen wurde am Boden eines Eppendorf-Röhrchens absetzen gelassen und die so erhaltene klare Flüssigkeit wurde vollständig abgezogen. Die Trägerteilchen wurden in 500 ul Ethanol (100%) resuspendiert (Trägermedium). Ein Trägerteilchen war mit etwa 10 Kopien des Plasmids beschichtet.
Das Zielmaterial wurde wie folgt hergestellt. Suspensionskulturen der Kulturvarietät Black Mexican Sweet (BMS) Erbsenzellen wurden von Professor Virginia Walbot (Stanford University) erhalten. Die BMS sind in Sheridan, J. Cell Biol. (1975), 3969 beschrieben. Diese Kulturen wurde routinemäßig in einem flüssigen Murahige und Skoog (MS) Medium (Physiol. Plantarum 15 (1962), 473-496), das mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2 mg/l) ergänzt wurde, gehalten.
Zur Vorbereitung für den Beschuß mit Trägerteilchen wurde eine 100 mg Probe von Zellen aus der Suspension auf einem 7 cm Whatman Nr. 1 Filterpapier durch Vakuum-Filtration auf einem Buchner-Trichter gesammelt. Das Filterpapier mit den Zellen wurde auf eine 9 cm Petri-Schale 59a, die das MS-Medium enthielt, wie vorstehend beschrieben in fester Form überführt.
Die zur Beschleunigung der beschichteten Gold-Teilchen auf die BMS-Erbsen-Zellen verwendete Vorrichtung bestand aus den folgenden Elementen, die zuvor in den Figuren 1, 2, 3und 4A beschrieben wurden:
(1) Ein Gaszylinder der Größe 1A (d.h. Gasversorgungseinheit 31), mit Heliumgas gefüllt, stand in Fluid-Verbindung mit einer rostfreien Stahl-Kapillar-Röhre mit den Abmessungen 7' x 0,02" (Innendurchmesser) (d.h. Gasversorgungsleitung 33). Die Gasversorgungsleitung stand in operativer Verbindung mit einem Standard-2-Stufen Druckregulierungsventil (d.h. das Gasregulierungsventil 32a), das im Handel von Victor Equipment Co. erhältlich ist. Die Gasversorgungsleitung stand wiederum in Verbindung mit einer Hochdruck-Gaskammer aus rostfreiem Stahl mit den Abmessungen 1/8" x 3" (Außendurchmesser x Länge) (d.h. der Gasbehälter 32b).
(2) Eine sterile 3 Kubikzentimer (cm³) Luer Lok Spritze (d.h. die Versorgungseinrichung für vorwärts treibbares Material 21a) stand in Fluid-Verbindung mit einer 1/10" Teflon FEP- Röhre (Handelsname von E.I. DuPont de Nemours Co., Wilmington, DE) (d.h. die Versorgungsleitung für vorwärts treibbares Material 23). Die Leitung stand in operativer Verbindung mit einem 3-Weg-Ventil (Rheodyne Modell 7030) (d.h. das Mehrzweckventil 70).
(3) Eine klare FEP-Leitung mit einem Außendurchmesser von 1/10" (d.h. die Rückgewinnungsvorrichtung 60).
(4) Eine Pyrex-Glasröhre mit den Abmessungen 10 cm x 1,2 mm Außendurchmesser x 0,8 mm Innendurchmesser (d.h. das Zuführmittel 50).
(5) Eine Geschwindigkeitsmeßvorrichtung, welche zwei nebeneinander auf dm Zuführmittel 50 angeordnete Sensoren umfaßt. Jeder Sensor (d.h. der erste Sensor 92 und der zweite Sensor 94) umfaßte eine Photodiode und einen Infrarotstrahler. Die Photodioden sind im Handel von Motorola Semiconductor Products, Inc. (Phoenix, AZ, USA) unter der Handelsbezeichnung MRD5∅∅ erhältlich und die Infrarotstrahler sind im Handel von General Electric unter der Handelsbezeichnung LED55C erhältlich.
Der erste und der zweite Sensor standen über einen elektrischen Stromkreis, der eine Anordnung aufwies, wie sie in der schematischen Darstellung der Figuren 8A und 8B gezeigt ist, in operativer Verbindung.
Nachstehend wird eine ausführliche Erläuterung der Figuren 8A und 8B gegeben, welche die operative Verbindung zwischen der Geschwindigkeitsmeßvorrichtung 90 und dem Mehrzweckventil 70 zeigen.
Der Block 113 lieferte die Folgezeitschaltung, um sicherzustellen, daß nach Pressen der Betätigungsvorrichtung (d.h. des Feuerungsknopfes 113a) alle anderen Teile des Kreises für den Zeitzyklus vorbereitet waren. Der Block 113 sendet das Signal 113b' gleichzeitig, indirekt über den Block 112 (Eingang als Signal 113b") zu dem Flip-Klop 115a (Eingang als Signal 112b) um das Zeitmeßgerät zu stoppen und das Signal 113b' direkt zu dem Flip-Flop 115b (Eingang als Signal 113b") um den Block 115 zurückzusetzen, so daß nur ein Startsignal (111b) angenommen wird und um den Zeitmeßgerät-Block 116auf Null zurückzustellen. Das indirekte Signal wird als eine Rückversicherung zur Verfügung gestellt, um das Zeitmeßgerät zu stoppen, wenn die optische Vorrichtung des zweiten Sensors (durch Quellenmittel 94a und Sensor 94b dargestellt) das Passieren des vorwärts treibbaren Materials nicht registrierte. Der Block 113 liefert dann das Signal 113c, um den Betrieb einer Zeitmeßgeräts in Block 114 zu beginnen (d.h. 114a in Fig. 8A).
Der Block 114 erhält das Signal 113c von Block 113 und liefert dann ein vorgewähltes Zeitintervall über ein Feststoff- Relais (d.h. 114c in Fig. 8A), das ein 4-Wege-Ventil betreibt (d.h. 114b in Fig. 8A), das ein vorgewähltes Luftdruck-Volumen zu einem pneumatischen Bedienungselement (nicht gezeigt) in dem Mehrzeckventil 70 liefert. Das so betriebene Ventil 70 liefert eine Verbindung zwischen der unter Druck stehenden Gasquelle und dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material.
Der Block 111 empfängt das Signal 111a, das durch das Passieren des vorwärts treibbaren Materials zwischen dem Quellenmittel und dem Sensor der ersten Geschwindigkeitsmeßvorrichtung 92 (wie durch Quellenmittel 92a und Sensor 92b gezeigt) hervorgerufen wird und stimmt das Signal ab und ruft ein scharfes Ansteigen eines Spannnungssignals hervor, das hinsichtlich der Zeit der abnehmenden Spannung des Signals 111a, d.h. einem "Start"-Signal 111b, das eine Zeitmeßvorrichtung in Gang setzen kann (Block 116 in Fig. 8B), entspricht.
Der Block 112 empfängt das Signal 112a, das dadurch generiert wird, das das vorwärts treibbare Material die Kombination von Quellennmittel und Sensor der zweiten Geschwindigkeitsmeßvorrichtung 94 passiert und ruft einen starken Anstieg eines Spannungssignals hervor, das hinsichtlich der Zeit der Abnahme der Spannung des Signals 112a, d.h. ein "Stop"-Signal 112b, das ein Stoppen der Zeitmeßgeräts bewirken kann (Block 116 in Fig. 8B), entspricht.
Der Flip-Flop 115a empfängt das "Start"-Signal 111b von Block 111, das "Stop"-Signal 112b von Block 112 und der Flip- Flop 115b empfängt das Signal zum "Löschen des Zeitmeßgeräts" (113") von dem Sequenzblock 113 und erhält den Zeitstatus, d.h. daß nur ein Zeitzyklus pro Zuführzyklus des vorwärts treibbaren Materials erlaubt wird. Der Flip-Flop 115a generiert das Signal 115c, das zu Block 116 geschickt wird.
Der Block 116 enthält ein mit einem Quarzkristall stabilisiertes Zeitmeßgerät, das eine Uhr mit einem integriertem Schaltkreis 116a und eine digitale Zählvorrichtung 116b umfaßt. Der Block 117 umfaßt eine vielfach binär codiertes Dezimal- (BCD) Dekodieranzeigegerät mit 7 Stellen (d.h. 117a in Fig. 8B) und ein LED-Display (d.h. 117b in Fig. 8B). Der Block 117 zeigt so die Flugzeit des eben erst durchgegangenen vorwärts treibbaren Materials.
Die Digital-Zählvorrichtung 116b empfängt die Signale 113" des Zeit-Status und 115c von Block 115. Diese Signale des Zeit- Status waren "Zeitmeßgerät-Lauf" (d.h. 115c) und "Zeitmeßgerät-Löschen" (d.h. 113b"). Wenn das Signal der Zeitmeßvorrichtung ∅ Volt betrug, zählte der Zeitmeßgerät-Block die Mikrosekunden von Null an. Wenn das Signal des Zeitmeßgerät-Laufs 12 Volt betrug, dann stoppe die Zeitmeßvorrichtung und behielt den zuletzt gezählten Wert. Wenn das Signal Zeitmeßgerät-Löschen ∅ Volt betrug, dann startete die Zeitmeßvorrichtung. Wenn das Signal Zeitmeßgerät-Löschen 12 Volt betrug, dann wurde die Zeitmeßvorrichtung auf Null zurückgestellt. Der Anzeigeblock 117 empfängt die numerischen BCD-Signale von Block 116 und zeigt so die kürzlichen Klugzeiten des vorwärts treibbaren Materials in Mikrosekunden vorne am Display an.
Obwohl ein Beispiel für einen Stromkreis gezeigt wurde sind zum Erreichen der gleichen Ergebnisse viele Stromkreise möglich.
(6) Ein Dual-3-Wege-Ventil (Mehrzweckventil 70) mit zwei Unterventilen (Unterventil 70a und 70b) ist im Handel von Rheodyne, Inc., Cotati, Ca unter dem Handelsnamen Modell 7030 ARV erhältlich ist. Die Unterventile des Dual-3-Wege-ventils 70 standen in operativer Verbindung mit einer pneumatischen Betätigungsvorrichtung, Kit #4187, die im Handel von Anspec Co., Ann Arbor, MI erhältlich ist. Die pneumatische Betätigungsvorrichtung wird durch Luft betrieben, die von einem 4-Wege- Magnetventil, das im Handel von der Automatic Switch Company (ASCO), Florham Park, NJ, erhältlich ist, geliefert wird.
(7) Eine externe Schleife 40, die aus rostfreiem Stahl gemacht ist und einen äußeren Durchmesser von 1/16" aufweist (d.h. der Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material) stand in operativer Verbindung mit dem ersten und dem zweiten 3-Kanal-Ventil.
Das erste 3-Kanal-Ventil lieferte eine selektive Fluid- Verbindung zwischen dem Zuführmittel für vorwärts treibbares Material oder dem Gasbehälter und dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material.
Das zweite 3-Kanal-Ventil lieferte eine selektive Fluid- Verbindung zwischen dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material und der Rückgewinnungsvorrichtung oder dem Zuführmittel.
Das Mehrzweckventil wurde anfänglich so eingestellt, daß eine Fluid-Verbindung zwischen der Spritze und dem vorwärts treibbaren Material hergestellt wurde und daß die pneumatische Verbindung zwischen dem Gasbehälter und dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material blockiert wurde.
Die Spritze, die 1 ml an vorwärts treibbarem Material (Trägermedium-Suspension beschichteter Teilchen) liefern kann wurde in Fluid-Verbindung mit dem Zuführmittel des vorwärts treibbaren Materials gestellt. Das Zuführmittel für vorwärts treibbares Material stand in Fluid-Verbindung mit dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material.
Das Steuerungsventil für vorwärts treibbares Material 22a wurde geöffnet, um eine Fluid-Verbindung zwischen dem Zuführmittel des vorwärts treibbaren Materials und dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material herzustellen. Nachdem ein gewähltes Volumen an vorwärts treibbarem Material in den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material entleert wurde wurde das Ventil des vorwärts treibbaren Materials geschlossen.
Jedes Volumen an vorwärts treibbarem Material, das über das Volumen des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material hinausgeht, wurde durch die Rückgewinnungsvorrichtung entlassen.
Das Gassteuerungs-Ventil 32a wurde geöffnet, um eine pneumatische Verbindung zwischen der Gasversorgungseinrichtung und dem Gasbehälter herzustellen. Ein Gasdruck von etwa 1000 psi wurde in dem Gasbehälter erhalten. Das Gasregulierungsventil wurde dann geschlossen.
Der Restbetrieb wurde über den in den Figuren 8A und 8B beschriebenen Stromkreis kontrolliert. Der Stromkreis wurde wie folgt betrieben.
Nach Pressen des Feuer-Knopfes 113a lieferte der Block 113 eine Sequenzzeit von 0,05 Sekunden, um das digitale Zeitmeßgerät von Block 116 zu halten. Block 115 hielt den Status von Block 116, d.h. wenn das digitale Zeitmeßgerät irrtümlicherweise nach einer vorherigen Betätigung der Vorrichtung immer noch lief, wurde es auf Null zurückgestellt, um auf den nächsten Zeitzyklus vorbereitet zu sein. Nach Stoppen des digitalen Zeitmeßgeräts wurde der Zeitstatus von Block 115 so eingestellt, daß nur ein Startsignal von Block 111 empfangen wird.
Als nächstes wurde der Intervall-Zeitmeßgerät-Block 114 gestartet. Der Intervall-Zeitmeßgerät-Block 114 lieferte ein vorbestimmtes Zeitintervall von 0,8 Sekunden mit 120 Volt Wechselstrom (VAC), um das Ventil 114b zu betreiben, wobei 65 bis 75 Pfund/Gauge² (Psig) Luft zum Betreiben einer pneumatischen Betätigungsvorrichtung (nicht gezeigt) des Mehrzweckventils 70 geliefert wurde, wobei das Mehrzweckventil so eingestellt wurde, daß eine selektive Verbindung zwischen der Gasquelle und dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material geliefert wurde, was zur Beschleunigung des unter Druck stehenden Gases und des vorwärts treibbaren Materials an dem ersten und dem zweiten Sensor vorbei führte.
Sobald der vordere Rand des vorwärts treibbaren Materials des ersten Sensor der Geschwindigkeitsmeßvorrichtung passierte wurde ein elektrisches Signal (111a) generiert. Nach Abgleichung durch Block 111 wurde das elektrische Signal dazu verwendet den digitalen Zeitmeßgerät-Block 116 zu starten.
In ähnlicher Art und Weise wurde ein elektrische Signal (112a) generiert, sobald der vordere Rand des vorwärts treibbaren Materials den zweiten Sensor der Geschwindigkeitsmeßvorrichtung passierte. Nach Abgleichen durch Block 112 wurde das elektrische Signal von Block 115 dazu verwendet den digitalen Zeitmeßgerät-Block 116 zu stoppen. Die Flugzeit des vorderen Randes des vorwärts treibbaren Materials zwischen dem ersten Sensor und dem zweiten Sensor wurde auf der LED-Anzeige (3 Ziffern, 7 Segmente) (d.h. 117b) von Block 117, einem Multisegment-LED-Anzeigegerät, angezeigt.
Fig. 9 zeigt weiter die ursprünglichen Daten, die aus dem Betrieb der Vorrichtung erhalten wurden. Das elektrische Signal 111a wurde von Sensor 92 und das elektrische Signal 112a wurde von Sensor 94 erhalten. Die Sensoren waren 2,8 cm voneinander getrennt. Sobald das vorwärts treibbare Material die Sensoren passiert verändert sich das elektrische Signal ausgehend von einem Grundliniewert. Diese Veränderung ist für das elektrische Signal 111a am Punkt der Linie 1 gezeigt und für das elektrische Signal 112a am Punkt der Linie 2. Die Wanderungszeit zwischen dem ersten und dem zweiten Sensor, wie durch die Entfernung zwischen den Linien 1 und 2 gezeigt, betrug 60 Mikrosekunden. Dies zeigt, daß sich das vorwärts treibbare Material in einer Geschwindigkeit von etwa 1044 Meilen/Stunde (6051 Meter/Sek.) vorwärts bewegte.
Das vorwärts treibbare Material trat aus dem Zuführmittel in Richtung der BMS-Zellen in die Vortriebszone. Die Vortriebszone bestand aus einer Vakuumkammer, deren Aufbau in "Fisher 88", vorstehend, 114 gelehrt wird. Der Druck in der Vortriebszone betrug absolut etwa 0,1 Atm.
Der Betrieb wurde beendet, indem das Ventil selektiv so eingestellt wurde, daß der Durchtritt von Gas aus dem Gasbehälter durch das Ventil in das Zuführmittel blockiert wurde, und eine Fluid-Verbindung zwischen der Spritze und dem Vorratsbehälter für übergeflossenes vorwärts treibbares Materials hergestellt wurde.
Einzellschichten von BMS-Zellen in Petri-Schalen (d.h. Petrischale 59a) mit MS-Medium wurden gleichzeitig beschossen. Es befanden sich 100 mg BMS-Zellen in jeder Petrischale. Die mit den GUS-enthaltenen Plasmiden beschichteten Trägerteilchen wurde in die BMS-Zellen eingeführt.
Nach Beschuß der BMS-Zellen wurde die Kultur im Dunklen 2 tage bei 27ºC gezüchtet. Nach 2 Tagen wurden die Zellen auf GUS-Aktivität hin untersucht.
Die Expression der GUS-Gene in den BMS-Zellen wurde unter Verwendung eines histochemischen Assays (5-Br-4-Cl-3-Indolyl-β- d-glucuronsäure [X-Gluc]-Substrat und Verfahren von Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) verzeichnet. Die BMS-Zellen und Zell-Klumpen wurden bei 37ºC 24 bis 48 Stunden in einer 1 mMol X-Gluc-Lösung, die 0,5 mM Kaliumferrocyanid und 10 mM EDTA enthielt, inkubiert. Die Zellen und Zellklumpen, die mit diesem Assay blau wurden, wurden als bezüglich GUS-Aktivität positiv bewertet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Beschuß-Modus Anzahl BMS-Zellen oder Zellklumpen mit GUS-Aktivität/Petrischale Zellen, die mit Goldteilchen beschossen wurden, welche mit einem das GUS enthaltenden Plasmid beschichtet wurden Wiederholung
Diese Erkenntnisse zeigen, daß ein Beschuß mit Teilchen dazu verwendet wurde, gleichzeitig DNA in intakte Pflanzenzellen einzubringen und daß das durch dieses Verfahren eingebrachte Gen nachfolgend exprimiert werden kann.
Wie aus der vorstehenden Disussion ersichtlich ist werden dem Fachmann aus der vorstehend Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen zuzüglich zu den hier beschriebenen verschiedene Modifikationen der Erfindung offensichtlich sein. Aus diesem Grunde sollte klar sein, daß das Vorstehende nur als Erläuternung dienen soll und nicht dazu gedacht ist einschränkend oder auf andere Art und Weise für die vorliegende Erfindung begrenzend zu wirken mit der Maßgabe, was in den hier beiliegenden Ansprüchen vorgebracht wird.

Claims

1. Vorrichtung welche Folgendes umfaßt:

(a) eine unter Druck stehende Gasquelle (30) mit einer Gas-Austrittsöffnung und eine Quelle für vorwärts treibbares Material mit einer Austrittsöffnung;

(b) ein Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material (40) mit einer Eintrittsöffnung und einer Austrittsöffnung,

dadurch gekennzeichnet, daß sie weiter umfaßt:

(c) ein Mehrzweckventil (70), worin das Mehrzweckventil (70) so ausgelegt ist, daß zwischen der Austrittsöffnung der unter Druck stehenden Gasquelle (30), die eine Gasversorgungseinrichtung (31) mit einer Austrittsöffnung und ein Gasregulierungsmittel (32), welches mit der Gasversorgungseinrichtung (31) unter selektiver Verbindung mit der Austrittsöffnung der Gasversorgungseinrichtung (31) in operativer Verbindung steht, enthält, und der Eintrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material (40) oder der Austrittsöffnung der Quelle für vorwärts treibbares Material (20) eine selektive Verbindung zur Verfügung gestellt wird, wobei die Quelle an vorwärts treibbarem Material ein Zuführmittel für vorwärts treibbares Material (21) aufweist, um eine selektive Verbindung zwischen der Austrittsöffnung des Zuführmittels für vorwärts treibbares Material (21) und einem Regulierungsmittel für vorwärts treibbares Material (22), das mit der Austrittsöffnung der Versorgungseinrichtung für vorwärts treibbares Material (21) und der Eintrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material (40) in operativer Verbindung steht, herzustellen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Vorrichtung weiter umfaßt:

ein Rückgewinnungsmittel (60) mit einer Eintrittsöffnung und wobei

das Mehrzweckventil (70) so ausgestaltet ist, daß zwischen entweder der Austrittsöffnung der unter Druck stehenden Gasquelle (30) oder der Austrittsöffnung der Quelle an vorwärts treibbarem Material (20) und der Eintrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material (40) eine selektive Verbindung hergestellt wird und zwischen entweder der Eintrittsöffnung des Zuführmittels (50) oder der Eintrittsöffnung des Rückgewinnungsmittels (60) und der Austrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material (40) eine selektive Verbindung hergestellt wird.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, worin die Vorrichtung weiter umfaßt:

(f) ein Zuführmittel (5) mit einer Eintrittsöffnung und einer Austrittsöffnung, worin die Eintrittsöffnung des Zuführmittels (50) mit der Austrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material (40) in Fluid-Verbindung steht, und

wobei das Mehrzweckventil (70) so ausgelegt ist, daß zwischen entweder der Austrittsöffnung der unter Druck stehenden Gasquelle (30) oder der Austrittsöffnung der Quelle an vorwärts treibbarem Material (20) und der Eintrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material (40) eine selektive Verbindung hergestellt wird und zwischen entweder der Eintrittsöffnung des Zuführmittels (50) oder der Eintrittsöffnung des Rückgewinnungsmittels (60) und der Austrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material (40) eine selektive Verbindung hergestellt wird.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin das Gasregulierungsmittel (32) ein Gasventil (32a) und einen Gasvorratsbehälter (32b) mit einer Eintrittsöffnung umfaßt, wobei das Gasventil (32a) zwischen der Austrittsöffnung der Gasversorgungseinrichtung (31) und der Eintrittsöffnung des Gasvorratbehälters (32b) eine selektive pneumatische Verbindung liefert.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, welche weiter umfaßt:

ein Temperaturregulierungsmittel (42), wobei das Temperaturregulierungsmittel (42) mit dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material (40) in operativer Verbindung steht.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Quelle an vorwärts treibbarem Materials (20) weiter umfaßt:

ein Rührmittel (24), wobei das Rührmittel (24) mit der Versorgungseinrichtung für vorwärts treibbares Material (21) in operativer Verbindung steht.

7. Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei das Zuführmittel (50) eine Makro-Zielvorrichtung (51) umfaßt.

8. Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei das Zuführmittel (50) eine Mikro-Zielvorrichtung (52) umfaßt.

9. Vorrichtung nach Anspruch 3, worin die Vorrichtung eine Geschwindigkeitsmeßvorrichtung (90) umfaßt.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, worin die Vorrichtung einen ersten Sensor (92) und einen zweiten Sensor (94) umfaßt.

11. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin der Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material (40) mit einer von außen kontrollierten Kammer, die einen Vortriebsbereich festlegt, in Fluid-Verbindung steht.

12. Verfahren zum Einführen von biologischem Material in lebende Zellen, welches die folgenden Schritte umfaßt:

(a) ein bestimmtes Volumen eines Gases mit einem bestimmten Gasdruck zu liefern;

(b) eine bestimmte Menge eines vorwärts treibbaren Materials zu liefern, wobei das vorwärts treibbare Material in einem Trägermedium suspendiertes biologisches Material ist; und

(c) das vorwärts treibbare Material mit dem bestimmten Gasvolumen Inkontakt zu bringen, wobei das vorwärts treibbare Material auf ein bestimmtes Ziel hin beschleunigt wird.

13. Verfahren zum Einführen von biologischem Material in Zielmaterial, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) ein bestimmtes Volumen eines Gases in einem Gasbehälter bei einem vorbestimmten Druck zu liefern;

(b) einen Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material, eine bestimmte Menge eines vorwärts treibbaren Materials, welche eine Suspension eines biologischen Materials in einem Trägermedium umfaßt, zu liefern;

(c) das vorwärts treibbare Material mit dem bestimmten Volumen eines Gases Inkontakt zu bringen; und

(d) das vorwärts treibbare Material durch ein Zuführmittel auf das Zielmaterial hin zu beschleunigen.

14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das vorwärts treibbare Material auf ein bestimmtes Zielmaterial hin durch ein Zuführmittel (50) beschleunigt wird und das Zuführmittel (50) in einer Geschwindigkeit zwischen 322 und 1931 km/Std. (200 und 1200 Meilen/Std., 89,4 und 536,4 ms&supmin;¹) verläßt.

15. Vorrichtung, welche das Folgende umfaßt

(a) einen Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material (40) mit einer Eintrittsöffnung und einer Austrittsöffnung;

(b) ein Zuführmittel (50) mit einer Eintrittsöffnung und einer Austrittsöffnung, wobei die Eintrittsöffnung des Zuführmittels (50) mit der Austrittsöffnung des Vorratsbehälters (40) für vorwärts treibbares Material in Verbindung steht; und

(c) ein Mehrzweckventil (70), welches ein erstes Unterventil (70a) mit einer Austrittsöffnung und ein zweites Unterventil (70b) mit einer Eintrittsöffnung und einer Autrittsöffnung umfaßt, wobei die Austrittsöffnung des ersten Unterventils (70a) eine selektive Verbindung mit der Eintrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material (40) liefert und das zweite Unterventil (70b) eines elektive Verbindung zwischen der Austrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material (40) und der Eintrittsöffnung des Zuführmittels (50) liefert.

16 Vorrichtung nach Anspruch 15, welche weiter umfaßt: (d) eine unter Druck stehende Gasquelle (30) mit einer Austrittsöffnung, wobei

das erste Unterventil (70a) des Mehrzweckventils (70) dazu befähigt ist eine selektive pneumatische Verbindung zwischen der Austrittsöffnung der unter Druck stehenden Gasquelle (30) und der Eintrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material (40) herzustellen, wobei die unter Druck stehende Gasquelle (30) bei Verbindung mit dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material (40) das Gas in den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material (40) entleert und dies bei ausreichendem Druck, um das vorwärts treibbare Material zum Verlassen des Zuführmittels (50) zu bringen, wenn der Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material (40) mit dem Zuführmittel in Verbindung (50) steht, in einer Geschwindigkeit, welche ausreicht ein nicht-zelluläres biologisches Material in eine biologische Zelle einzuführen.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, worin die unter Druck stehende Gasquelle (30) bei Verbindung mit dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material (40) Gas unter einem ausreichendem Druck entleert, daß das vorwärts treibbare Material das zuführmittel (50) verläßt wenn der Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material (40) mit der Zuführvorrichtung in Verbindung steht, bei einer Geschwindigkeit zwischen 322 und 1931 km/Std. (200 und 1200 Meilen/Std., 89,4 und 536,4 ms&supmin;¹).

18. Vorrichtung nach Anspruch 15, welche weiter umfaßt:

(e) eine Quelle an vorwärts treibbarem Material (20) mit einer Austrittsöffnung, das erste Unterventil (70a) des Mehrzweckventils (70), welche eine selektive Verbindung zwischen der Austrittsöffnung der Quelle an vorwärts treibbarem Material (20) und der Eintrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material herstellt.

19. Verfahren zum Einführen von biologischem Material in Zielmaterial, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, welche aufweist:

(i) eine unter Druck stehende Gasquelle (30) mit einer Gas-Austrittsöffnung und eine Quelle an vorwärts treibbarem Material mit einer Aulaßöffnung;

(ii) einen Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material (40) mit einer Eintrittsöffnung und einer Austrittsöffnung;

(iii) ein Zuführmittel (50) mit einer Eintrittsöffnung und einer Austrittsöffnung, wobei die Eintrittsöffnung des Zuführmittel mit der Austrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material in Verbindung steht; und

(iv) ein Mehrzweckventil (70), worin das Mehrzweckventil (70) so ausgestaltet ist, daß es zwischen der Austrittsöffnung der unter Druck stehenden Gasquelle (30) und der Eintrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material eine selektive Verbindung liefert; und

(b) das Zielmaterial in einer bestimmten wirksamen Entfernung von der Austrittsöffnung der Zuführvorrichtung anzuordnen; und

(c) die Zuführvorrichtung auf das Zielmaterial auszurichten;

(d) das Mehrzweckventil so einzustellen, daß eine Fluid-Verbindung zwischen der Versorgungseinrichtung und dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material hergestellt wird, wobei ein gewähltes Volumen an vorwärts treibbarem Material in den Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material gelangt; und

(e) das Mehrzweckventil so einzustellen, daß eine pneumatische Verbindung zwischen der Austrittsöffnung der Gasversorgungseinrichtung und der Eintrittsöffnung des Vorratsbehälters für vorwärts treibbares Material und der Eintrittsöffnung des Zuführmittels geliefert wird, wobei ein gewähltes Gasvolumen auf das vorwärts treibbare Material in dem Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material trifft.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Geschwindigkeit des vorwärts treibbaren Materials durch eine Geschwindigkeitsmeßvorrichtung verfolgt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, welches den Schritt (f) umfaßt, bei dem das Ventil selektiv so eingestellt wird, daß der Durchgang des Gases aus dem Gasbehälter durch das Ventil in die Versorgungseinrichtung verhindert wird und daß eine Fluid- Verbindung zwischen einer Spritze und dem Überfluß-Vorratsbehälter für vorwärts treibbares Material hergestellt wird.