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Diese Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum NK 130119,
ein Verfahren zur Herstellung desselben und dessen
Verwendung.
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Die erfindungsgemäße Verbindung weist Antifungi-,
Antitumor- und Vascularisierungs (Gefäßbildungs) -Inhibitor- und
insektizide Effekte bzw. Aktivitäten auf. Es ist somit zu
erwarten, daß sie verwendbar ist als landwirtschaftliche
Chemikalie, beispielsweise als Insektizid und als Fungizid
oder als chemotherapeutisches Agens gegenüber Fungi oder
bösartigen Tumoren oder zur Prävention und/oder Behandlung
von Erkrankungen, die durch Vasculärneoplasie
(Gefäßneubildung), wie Nodose-Rheumatismus, diabetische
Retinopathie, Neugeborenen-Retinopathie, senile
Macula-Degenerierung oder übermäßige Narbenbildung während der Hei
lung einer Wunde verwendbar ist.
Hintergrund der Erfindung
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Zu bekannten Antifungi-Antibiotika gehören Amphotericin B
und Nystatin A1, während zu bekannten
Antitumor-Antibiotika Cisplatin, Bleomycin und Adriamycin gehören. Zu
bekannten Vascularisierungs-Inhibitoren gehören außerdem
Indomethacin, Medroxyprogesteron, eine Kombination von
Cortison und Heparin und der Rohextrakt aus Rinderknorpel
oder einer Aorta-Wand.
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Das Auftreten von Fungi oder Zellen, die gegenüber den
konventionellen Antibiotika oder Antitumor-Mitteln
resistent sind, macht es jedoch erforderlich, ständig neue
Mittel zu entwickeln. Andererseits wurde bisher kein
Vascularisierungs-Inhibitor in der Praxis als Arzneimittel
verwendet. Es war deshalb erforderlich, eine neue Substanz
zu entwickeln, die Antifungi-, Antitumor- und
Vascularisierungsinhibitor-Effekte bzw -Aktivitäten aufweist.
Zusammenfassung der Erfindung
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Unter diesen Umständen wurden verschiedene Metabolite von
Mikroorganismen untersucht und dabei wurde gefunden, daß
ein Stamm, der zum Genus Streptomyces gehört, ein neues
Antibiotikum NK 130119 der Formel (I) bildet:
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das eine Antifungi-, Antitumor-,
Vascularisierungsinhibitor- und insektizide Aktivität aufweist.
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Darauf beruht die vorliegende Erfindung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Die Fig. 1 zeigt Ultraviolett-Absorptions-Spektren von NK
130119, worin darstellen
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eine 20 ug/ml Lösung desselben in Methanol;
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- - - - eine 20 ug/ml Lösung desselben in 0,1 N
Chlorwasserstoffsäure/90 % Methanol; und
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- - - eine 20 ug/ml Lösung desselben in 0,1 N
Natronlauge/90 % Methanol.
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Fig. 2 zeigt ein Infrarot-Absorptions-Spektrum von NK
130119, das in Form einer Kaliumbromid-Tablette
bestimmt wurde.
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Fig. 3 zeigt ein Wasserstoff-NMR-Spektrum von NK
130119, das in deuteriertem Chloroform bestimmt
wurde.
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Fig. 4 zeigt ein Kohlenstoff-NMR-Spektrum von NK
130119, das in deuteriertem Chloroform bestimmt
wurde.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Das vorstehend beschriebene neue Antibiotikum NK 130119
kann erhalten werden durch Züchten (Kultivieren) eines NK
130119 bildenden Stammes, der zum Genus Streptomyces
gehört, um dadurch NK 130119 anzureichern, und
anschließendes Abtrennen (Gewinnen) desselben aus dem Kulturmedium.
Ein typisches Beispiel für den NK 130119 bildenden Stamm
ist Streptomyces bottropensis NK86-0279, der aus dem
Erdboden in Funabashi, in der Chiba-Präfektur im August 1986
isoliert wurde (FERM BP-1785), der nachstehend der
Einfachheit halber als "NK86-0279-Stamm" bezeichnet wird.
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Eine Probe dieses Stammes wurde im Fermentation Research
Institute Agency of Industrial Science and Technology, 1-
3, Higashi 1-chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japan,
hinterlegt und er erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-
1785.
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Der NK86-0279-Stamm hat die folgenden mykologischen
Eigenschaften.
Mykologische Eigenschaften des NK86-0279-Stammes:
1. Morphologie
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Beim Betrachten unter einem Mikroskop zeigt dieser Stamm
spiralförmige Hyphen aus verzweigten Lufthyphen und keine
Wirbel. Eine gereifte Sporenkette umfaßt 20 oder mehr
Sporen (0,6-0,8 u x 1,2-1,4 u) mit einer glatten Oberfläche.
Es wurde kein Sporangium beobachtet.
2. Wachstum in verschiedenen Medien
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Jede Farbe wird ausgedrückt entsprechend dem Standard, wie
er von Nippon Shikisai Kenkyusho festgelegt wurde.
1) Saccharose/Nitrat-Agar-Medium (kultiviert bei 27ºC)
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auf einem Blaß-gelblich-braunen vegetativen Mycel werden
weiße Lufthyphen gebildet. Es ist ein schwach gelbliches
lösliches Pigment zu beobachten.
2) Glucose/Asparagin-Agar-Medium (kultiviert bei 27ºC)
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Auf einem blaß-gelben bis blaß-gelblich-braunen
vegetativen Mycel werden weiße bis hellbräunlich-graue
Lufthyphen gebildet. Es ist kein lösliches Pigment
festzustellen.
3) Stärke/anorganisches salz-Agar-Medium (ISP-Medium 4,
kultiviert bei 27ºC)
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Auf einem blaß-gelblich-braunen vegetativen Mycel werden
hell-bräunlich-graue bis bräunlich-graue Lufthyphen
gebildet. Es ist ein schwach braunes lösliches Pigment
festzustellen.
4) Tyrosin-Agar-Medium (ISP-Medium 7, kultiviert bei 27ºC)
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Auf einem dunkel-bräunlich-grauen vegetativen Mycel werden
gräulich-weiße bis hell-bräunlich-graue Lufthyphen
gebildet. Es ist ein dunkelbraunes lösliches Pigment
festzustellen.
5) Nähr-Agar-Medium (kultiviert bei 27ºC)
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Auf einem blaß-gelblich-braunen vegetativen Mycel werden
keine Lufthyphen gebildet. Es wird ein schwach braunes
lösliches Pigment beobachtet.
6) Hefe/Malz-Agar-Medium (ISP-Medium 2 kultiviert bei
27ºC)
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Es werden gräulich-weiße bis bräunlich-graue Luft-Hyphen
auf einem blau-gelblich-braunen vegetativen Mycel
gebildet. Es ist ein schwach braunes lösliches Pigment
festzustellen.
7) Haferflocken-Agar-Medium (ISP-Medium 3, kultiviert bei
27ºC)
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Auf einem farblosen vegetativen Mycel werden
gräulichweiße bis hell-bräunlich-graue Lufthyphen gebildet. Es ist
kein lösliches Pigment zu beobachten.
8) Stärke-Agar-Medium (kultiviert bei 27ºC)
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Auf einem blaß-gelben bis blaß-gelblich-braunen
vegetativen Mycel werden weiße bis hell-bräunlich-graue
Lufthyphen gebildet. Es ist ein schwach braunes lösliches
Pigment festzustellen.
9) Calciummalat-Agar-Medium (kultiviert bei 27ºC)
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Auf einem blaß-gelben bis blaß-gelblich-braunen
vegetativen Mycel werden leicht weiße Lufthyphen gebildet. Es
ist kein lösliches Pigment festzustellen.
10) Glycerin/Asparagin-Agar-Medium (ISP-Medium 5,
kultiviert bei 27ºC)
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Auf einem blaß-gelben vegetativen Mycel werden bräunlich-
weiße bis hell-bräunlich-graue Lufthyphen gebildet. Es ist
kein lösliches Pigment festzustellen.
11) Glycerin/Nitrat-Agarmedium (kultiviert bei 27ºC)
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Auf einem blaß-gelblich-braunen vegetativen Mycel werden
weiße Lufthyphen gebildet. Es ist ein schwach braunes
lösliches Pigment festzustellen.
12) Gelatine-Probe-Kultur
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Auf einem blaß-gelben bis blaß-gelblich-braunen
vegetativen Mycel, das entweder in einem Gelatinemediuin bei 20ºC
oder in einem Glucose/Pepton-Gelatine-Medium bei 24ºC
kultiviert worden ist, werden keine Lufthyphen gebildet. Es
ist ein braunes lösliches Pigment festzustellen.
13) Magermilch (kultiviert bei 32ºC)
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Auf einem blaß-gelben bis blaß-gelblich-braunen
vegetativen Mycel werden weiße Lufthyphen gebildet. Es ist ein
braunes lösliches Pigment festzustellen.
3. Physiologische Eigenschaften
1) Wachstumstemperaturbereich
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Der Teststamm wird in einem Hefe/Stärke-Agar-Medium, das
1,0 % lösliche Stärke, 0,2 % Hefeextrakt (hergestellt von
der Firma Nippon Seiyaku Co., Ltd.) und 2,0 % Agar-Pulver
(hergestellt von der Firma Eiken Chemical Co., Ltd.)
enthält (pH 7,0), bei 5, 10, 24, 27, 32, 37 und 45ºC
kultiviert. Als Ergebnis wird gefunden, daß es bei allen diesen
Temperaturen außer bei 5 und 45ºC wächst. Die optimale
Wachstumstemperatur scheint in dem Bereich von 24 bis 32ºC
zu liegen.
2) Verflüssigung von Gelatine
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Der Teststamm wird in einem 15 %igen Gelatine-Medium bei
20ºC und in einem Glucose/Pepton/Gelatine-Medium bei 27ºC
kultiviert. Als Ergebnis ist in jedem Falle eine
Verflüssigung der Gelatine ab dem 17. Tag festzustellen. Der
Verflüssigungseffekt des Teststammes auf Gelatine ist somit
verhältnismäßig gering.
3) Hydrolyse von Stärke
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Der Teststamm wird in einem Stärke/anorganischen Salz-
Agar-Medium bei 27ºC und in einem Stärke-Agar-Medium bei
27ºC kultiviert. Als Ergebnis ist in jedem Fall eine
Hydrolyse der Stärke ab dem 10. Tag zu beobachten. Die
Hydrolysewirkung des Teststammes auf Stärke ist somit mäßig.
4) Koagulation/Peptonisierung von Magermilch
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Der Teststamm wird in entfetteter Milch bei 32ºC
kultiviert. Als Ergebnis ist weder eine Koagulation noch eine
Peptonisierung der Magermilch selbst am 21. Tag zu
beobachten.
5) Bildung von Melanin-artigem Pigment
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Der Teststamm wird in einem Trypton/Hefe/Brühe-ISP-Medium
1 bei 27ºC, in einem Pepton/Hefe/Eisen-Agar-Medium, ISP-
Medium 6 bei 27ºC und in einem Tyrosin-Agar-Medium, ISP-
Medium 7 bei 27ºC kultiviert. Als Ergebnis wird in jedem
Falle ein Melanin-artiges Pigment gebildet.
6) Verwertung einer Kohlenstoffquelle
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Der Teststamm wid in einem Pridham-Gottlieb-Agar-Medium
ISP-Medium 6 bei 27ºC kultiviert. Als Ergebnis wird
gefunden, daß dieser Stamm Glucose, L-Arabinose, D-Xylose,
Saccharose, Inosit, D-Fructose, D-Mannit, Rhamnose, Raffinose
und Galactose verwertet.
7) Auflösung von Calciummalat
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Der Teststamm wird in einem Calciummalat-Agar-Medium bei
27ºC kultiviert. Als Ergebnis wird gefunden, daß er eine
Auflösungswirkung darauf hat.
8) Reduktion von Nitrat
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Der Teststamm wird in wäßrigem Pepton, das 0,1 %
Kaliumnitrat enthält, ISP-Medium 8, bei 27ºC kultiviert. Das
Ergebnis ist negativ.
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Diese Eigenschaften zeigen, daß der NK86-0279-Stamm zum
Genus Streptomyces gehört und LL-2,6-Diaminopimelinsäure
in der Zellwand enthält. Er weist spiralförmige Lufthyphen
ohne irgendein Sporangium oder einen Wirbel auf. Die
Oberfläche der Sporen ist glatt. Er bildet gräulich-weiße bis
hell-bräunlich-graue Lufthyphen auf einem blaß-gelben bis
blaß-gelblich-braunen vegetativen Mycel in verschiedenen
Medien. Es ist ein schwach braunes lösliches Pigment zu
beobachten. Er bildet ein Melanin-artiges Pigment und übt
eine verhältnismäßig geringe Zersetzungswirkung auf
Protein und einen mäßigen Hydrolyseeffekt auf Stärke aus.
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Ein bekannter Stamm, der dem NK86-0279-Stamm auf der Basis
der obengenannten Eigenschaften nahe verwandt ist, ist
Streptomyces bottropensis (vgl. "International J.
Systematic Bacteriol.", 19, 410 (1969)). Diese beiden Stämme
stimmen vollständig miteinander überein beispielsweise in
bezug auf die Farben der Lufthyphen auf verschiedenen
Medien, in bezug auf die Verwertung von Zuckern und in bezug
auf die Bildung eines Melanin-artigen Pigments. Diese
Tatsachen zeigen an, daß der NK86-0279-Stamm zu Streptomyces
bottropensis gehört. Er wird daher als Streptomyces
bottropensis NK86-0279 bezeichnet.
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Die NK 130119-Produktivität des erfindungsgemäß zu
verwendenden Streptomyces bottropensis NK 86-0279 kann durch
verschiedene mutagene Methoden erhöht werden, wie sie
üblicherweise auf diesem Gebiet angewendet werden,
beispielsweise durch Bestrahlung mit UV-Licht oder mit &sup6;&sup0;Co,
durch Verwendung eines mutagenen Agens, ausgewählt
beispielsweise aus Stickstofflost, Salpetriger Säure,
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) und 2-Aminopurin,
durch Transduktion oder Zellfusion.
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Das erfindungsgemäße Antibiotikum NK 130119 kann
hergestellt werden durch Kultivieren eines Mikroorganismus, der
zum Genus Streptomyces gehört, und in der Lage ist, das
Antibiotikum NK 130119 zu bilden, in einem Medium, um
dadurch das Antibiotikum in dem Medium anzureichern, und
anschließendes Abtrennen (Gewinnen) desselben.
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Obgleich die Kultivierung als allgemeine Regel auf die
gleiche Weise durchgeführt werden kann, wie sie bei der
Kultivierung von Actinomyces angewendet wird, ist im
allgemeinen eine Submerskultur in einem flüssigen Medium
vorteilhaft. Dafür kann jedes beliebige Medium verwendet
werden, so lange es Nährstoffe enthält, die durch den NK86-
0279-Stamm verwertet werden können.
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Als Nährstoff-Quellen können solche verwendet werden, wie
sie üblicherweise zum Kultivieren von Actinomycetes
verwendet werden. Zu Beispielen dafür gehören
Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Galactose, Mannit, Dextrin, Stärke,
Stärke-Sirup (Hydrolyse von Stärke durch Malz),
Sojabohnenöl und Mischungen davon; und anorganische und
organische Stickstoff-Quellen, wie Ammoniumchlorid,
Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Pepton,
Fleischextrakt, Hefeextrakt, trockene Hefe,
Maisquellwasser, Sojabohnenöl-Kuchen, Haferflocken, Casaminosäuren,
Bactosoytone, lösliches pflanzliches Protein und
Mischungen davon. Das Medium kann außerdem, falls erforderlich,
ein oder mehr anorganische Salze enthalten, beispielsweise
gewöhnliches Salz (Kochsalz), Magnesiumsulfat,
Kupfersulfat, Zinksulfat, Manganchlorid, Calciumcarbonat und
Phosphate. Es kann ferner ein oder mehr organische Materialien
enthalten, die in der Lage sind, das Wachstum des Stammes
und die Bildung von NK 130119 zu fördern, z.B.
Nucleinsäuren, Aminosäuren und Vitamine, sowie ein oder mehr
anorganische Materialien. Wenn während der Kultivierung eine
beträchtliche Schaumbildung zu beobachten ist, kann dem
Kulturmedium gegebenenfalls ein pflanzliches Öl, wie
Sojabohnenöl oder Leinsamenöl oder ein
Petroleum-Entschäumungsmittel, wie Pronal 1 (hergestellt von der Firma Toho
Chemical Industry Co., Ltd.) oder Silicone KM-70
(hergestellt von der Firma Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.),
zugegeben werden. Vorzugsweise wird die Kultivierung bei
einer Temperatur von 25 bis 30ºC unter neutralen bis
schwach sauren Bedingungen durchgeführt. Das angestrebte
NK 130119 kann im allgemeinen gebildet und angereichert
werden in einem flüssigen Medium nach 3 bis 6-tägiger
Kultivierung. Wenn die Menge des Produkts ein Maximum
erreicht hat, wird die Kultivierung beendet und das Mycel
wird abfiltriert. Aus dem so erhaltenen Mycel wird das
angestrebte Produkt isoliert und gereinigt.
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Die Isolierung und Reinigung des Antibiotikums aus dem
Mycel kann auf eine Weise durchgeführt werden, wie sie
üblicherweise für die Isolierung und Reinigung eines
mikrobiellen Metaboliten aus einem ihn bildenden Mycel
angewendet wird. Obgleich das NK 130119 in organischen
Lösungsmitteln, wie Methanol, Aceton, Ethylacetat und Ethanol,
löslich ist, ist es in Wasser schwerlöslich. Es kann daher
nach einem Verfahren gereinigt werden, wie es zur
Reinigung von fettlöslichen Materialien angewendet wird.
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Die Isolierung und Reinigung des angestrebten NK 130119
kann durchgeführt werden durch geeignetes Kombinieren
beispielsweise einer Extraktion mit verschiedenen organischen
Lösungsmitteln, einer Silicagel-Säulenchromatographie und
einer präparativen Hochleistungs-Flüssigchromatographie
(HPLC).
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So wird beispielsweise das Kulturmedium filtriert, um
dadurch das Mycel zu sammeln, das dann zweimal mit Aceton
extrahiert wird. Die Acetonlösung wird im Vakuum zur
Trockne eingeengt.
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Das so erhaltene braune rohe Pulver wird in Chloroform
gelöst und durch Silicagel-Säulenchromatographie gereinigt.
Für die stufenförmige Elution wird als
Entwicklungslösungsmittel ein Chloroform/Methanol (40:1 T 2:1)-Gemisch
verwendet. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und zur
Trockne eingeengt, wobei man ein blaßbraunes Pulver
erhält. Dieses Pulver wird in Chloroform gelöst und durch
Silicagel-Säulenchromatographie erneut gereinigt. Für die
stufenförmige Elution wird als Entwicklungslösungsmittel
ein Chloroform/Methanol (100:1 T 20:1)-Gemisch verwendet.
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Dann werden die aktiven Fraktionen miteinander vereinigt
und mit n-Hexan ausgefällt, wobei man ein blaßgelbes
Pulver erhielt.
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Das so erhaltene Pulver wird in 80 %igem wäßrigem Methanol
gelöst und durch präparative HPLC mit einer Umkehrphasen-
Säule gereinigt, wobei man ein farbloses Pulver erhält.
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Die NK 130119-Titer werden während der Kultivierung und in
den rohen Fraktionen durch Messung des
Wachstumsinhibierungseffektes desselben auf HeLa S&sub3;-Zellen mittels des
Farbstoffexklusionstests (Farbhemmungstests) bestimmt.
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Das dabei erhaltene NK 130119 hat die folgenden
physikalisch-chemischen Eigenschaften:
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1) Aussehen: farblose Kristalle,
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2) Molekulargewicht: FD-MS m/z; 805 (M+1)&spplus;,
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3) Elementaranalyse: Kohlenstoff 68,34 %, Wasserstoff
9,67 % und Sauerstoff 21,99 %
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4) Molekularformel: C&sub4;&sub6;H&sub7;&sub6;O&sub1;&sub1;
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5) Schmelzpunkt 161 - 165ºC
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6) spezifische Drehung [α]D20 = -39,5º(C 1,00, Methanol)
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7) Löslichkeit: löslich in Methanol, Aceton, Ethylacetat
und Dimethylsulfoxid, schwerlöslich in Wasser und
Hexan
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8) Rf-Wert bei der Silicagel-Dünnschicht-Chromatographie
0,41 und 0,59 bei Verwendung von Hexan/Aceton
(Volumenverhältnis 3:2) bzw. Chloroform/Methanol
(Volumenverhältnis 3:1) als
Entwicklungslösungsmittelsysteme,
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9) Ultraviolett-Absorptions-Spektren: wie in Fig. 1
dargestellt,
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UV λ Methanol max (E 1 % 1 cm): 219.0 nm (sh), 225 nm (357.8),
232.5 nm (339.8), 242 nm (sh)
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10) Infrarot-Absorptions-Spektrum (bestimmt in Form einer
Kaliumbromid-Tablette): wie in Fig. 2 dargestellt,
die Absorptionsmaxima (cm&supmin;¹) sind wie folgt:
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11) Wasserstoff-NMR-Spektrum, bestimmt in deuteriertem
Chloroform: wie in Fig. 3 dargestellt,
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12) Kohlenstoff-NMR-Spektrum, bestimmt in deuteriertem
Chloroform: wie in Fig. 4 dargestellt, die chemischen
Verschiebungen (6) sind wie folgt
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13) Farbreaktionen: positiv bei der
Molybdatophosphorsäure-, Schwefelsäure- und
Kaliumpermanganat-Reaktion, negativ bei den Pauly- und
Rydon-Smith-Reaktionen.
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Wie nachstehend beschrieben, ist die erfindungsgemäße
Verbindung verwendbar als Arzneimittel, beispielsweise als
Antifungi-Mittel, als Antitumor-Mittel oder als
Vascularisierungs-Inhibitor und als Insetizid. Wenn die
erfindungsgemäße Verbindung als Arzneimittel verwendet werden soll,
kann sie entweder allein oder im Gemisch mit einem oder
mehr Exzipienten verwendet werden und beispielsweise zu
einem Injektionspräparat, einem Oral-Arzneimittel oder
einem Suppositorium formuliert werden. Es kann jeder
beliebige pharmazeutisch akzeptable Exzipient dafür verwendet
werden und der Typ und die Zusammensetzung desselben
können in geeigneter Weise festgelegt werden in Abhängigkeit
vom Weg oder der Methode der Verabreichung. Zu flüssigen
Exzipienten gehören beispielsweise Wasser, Alkohole und
pflanzliche, tierische und synthetische Öle, wie
Sojabohnenöl,
Erdnußöl, Sesamöl und Mineralöle, während zu festen
Exzipienten gehören Zucker, wie Maltose und Saccharose,
verschiedene Aminosäuren, Cellulosederivate, wie
Hydroxypropylcellulose und organische Säuresalze, wie
Magnesiumstearat.
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Um das erfindungsgemäße Antibiotikum zu einem
Injektionspräparat zu formulieren, ist es bevorzugt, einen oder mehr
Exzipienten, wie eine physiologische Salzlösung,
verschiedene Puffer, Lösungen von Zuckern, wie z.B. Glucose,
Inosit und Mannit, und Glycolen, wie Ethylenglycol und
Polyethylenglycol, zu verwenden. Es ist auch möglich, das
erfindungsgemäße Antibiotikum zu lyophilisieren zusammen mit
einem oder mehr Exzipienten, wie Zuckern, beispielsweise
Inosit, Mannit, Glucose, Mannose, Maltose und Saccharose,
und Aminosäuren, wie Phenylalanin. Das lyophilisierte
Präparat kann in einem für die Injektion geeigneten
Lösungsmittel gelöst werden, beispielsweise in sterilisiertem
Wasser, einer Glucoselösung, einer Elektrolytlösung oder
einer Aminosäurelösung, und es kann dann intravenös oder
intramuskulär verabreicht werden.
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Zur Herstellung eines oralen Arzneimittels wird das
erfindungsgemäße Antibiotikum zu verschiedenen Präparaten
formuliert, beispielsweise zu Tabletten, Kapseln, Pulver,
Körnchen, Lösung oder zu einem trockenen Sirup zusammen
mit dem (den) obengenannten flüssigen oder festen
Exzipient(en). Es ist außerdem möglich, sie zu Pellets zu
formulieren für die endermatische oder mucosale Verabreichung
bei einer lokalen Behandlung.
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Die erfindungsgemäße Verbindung kann im allgemeinen in
einer Menge von 0,001 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise von 0,01
bis 0,1 Gew.-%, einem Präparat einverleibt werden. so kann
beispielsweise ein Injektionspräparat 0,01 bis 0,05 Gew.-%
derselben enthalten, während ein orales Arzneimittel 0,005
bis 1 Gew.-%, vorzugsweise 0,05 bis 0,5 Gew.-% derselben
enthalten kann, während der Rest aus einem oder mehr
Exzipienten besteht.
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Die Dosis, in der das erfindungsgemäße Antibiotikum
verabreicht werden sollte, hängt ab vom Alter, vom
Körpergewicht und dem Zustand des Patienten sowie vom Zweck der
Behandlung. Allgemein gilt, daß es parenteral in einer
Dosis von 0,1 bis 5 ug/kg pro Tag oder oral in einer Dosis
von 0,5 bis 50 ug/kg pro Tag verabreicht werden kann. Die
akute Toxizität (LD&sub5;&sub0;) von NK 130119 bei Mäusen beträgt
1,05 mg/kg (i.p.).
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Wenn die erfindungsgemäße Verbindung als
landwirtschaftliche Chemikalie, beispielsweise als Insektizid oder
Fungizid, verwendet werden soll, kann sie gewünschtenfalls
allein verwendet werden, sie wird jedoch im allgemeinen
formuliert durch Mischen mit geeigneten Adjuvantien, um ihre
Effekte zu verbessern oder zu stabilisieren und sie wird
als solche oder nach dem Verdünnen, falls erforderlich,
verwendet. Die erfindungsgemäße Verbindung kann auf
konventionelle Weise, wie sie auf diesem Gebiet bekannt ist,
zu jeder geeigneten Form formuliert werden, beispielsweise
als Staub, Granulat, Mikrogranulat, benetzbares Pulver,
fließfähiges Präparat, Emulsion, Mikrokapsel, Öl, Aerosol,
Erhitzungsräuchermittel (wie z.B. als Moskito-
Abweisungsmittel vom Anlockungs-Typ oder vom elektrischen
Typ), als Rauchbildner, beispielsweise zur Nebelbildung,
als Nicht-Erhitzungs-Räuchermittel oder als toxisches
Futter.
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Beispiele für die genannten Adjuvantien sind Träger (d.h.
Verdünnungsmittel) und andere Adjuvantien, wie z.B. ein
Verteilungsmittel, ein Emulgiermittel, ein Netzmittel, ein
Dispergiermittel, ein Fixiermittel oder ein Desintegrator.
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Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in einer Menge
verwendet werden, die von bestimmten Bedingungen abhängt,
beispielsweise der Form der Formulierung, der
Auftragssaison oder -methode. Im allgemeinen wird sie in einer Menge
von 10 bis 300 g/10 a (a = 100 m²), vorzugsweise von 15
bis 200 g/100 a (ausgedrückt als aktiver Bestandteil),
verwendet zur Kontrolle (Bekämpfung) von
Insektenschädlingen in einem Schutzwald oder bei der Viehzucht und in
einer Menge von 2 bis 200 mg/m², vorzugsweise von 5 bis 100
mg/m² (bezogen auf den aktiven Wirkstoff) zum Zwecke der
Ausrottung der Hygiene-Insektenschädlinge. So werden
beispielsweise 15 bis 120 g/10 a des aktiven Bestandteils im
Falle eines Staubes (Pulvers) verwendet, 30 bis 240 g/10 a
desselben werden im Falle eines Granulats verwendet und 40
bis 250 g/10 a desselben werden im Falle einer Emulsion
oder eines benetzbaren Pulvers verwendet. In einem
speziellen Falle kann es jedoch auch möglich oder sogar
erforderlich sein, den aktiven Bestandteil in einer Menge zu
verwenden, die außerhalb des obengenannten Bereiches
liegt.
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Der Gehalt der aktiven Bestandteile (Wirkstoffe) in der
erfindungsgemäßen Formulierung variiert in Abhängigkeit
von den Verwendungsbedingungen, beispielsweise der Form
der Formulierung oder dem Auftragsverfahren, und er
beträgt in der Regel 0,2 bis 95 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis
80 Gew.-%, obgleich der aktive Bestandteil in einem
speziellen Fall auch allein verwendet werden kann.
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Die Effekte der erfindungsgemäßen Verbindung werden
nachstehend beschrieben.
Testbeispiel 1
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Es wurde das Antifungi-Spektrum der erfindungsgemäßen
Verbindung untersucht.
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Die Tabelle 1 zeigt das Antifungi-Spektrum von NK 130119
auf einem Czapek-Dox-Lösungs-Agar.
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Wie in der Tabelle 1 angegeben, übte NK 130119 starke
Wachstumsinhibierungseffekte auf Fungi einschließlich
Penicillium chrysogenum, Altenaria kikuchiana und Fusarium
roseum f. Sp. aus.
Tabelle 1
Test-Stamm
minimale Hemmkonzentration (ug/ml)
Mucor javanicus
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
Penicillium chrysogenum
Altenaria kikuchiana
Botrytis cinera(*)
Fusarium roseum f. sp.
Rhizopus hangchao
Mycosphaerella melonis
Sporobolomyces salmonicolor
Saccharomyces cerevisiae
Candida albicans
* Es wurde ein Kartoffel-Saccharose-Agar-Medium
verwendet.
Testbeispiel 2
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Es wurde der Wachstumsinhibierungseffekt der
erfindungsgemäßen Verbindung auf HeLa S&sub3;-Kulturzellen untersucht. Eine
Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit HeLa S&sub3;-Zellen in
einer
Menge von 1,5 x 10³ Zellen/Vertiefung inokuliert und
inkubiert. Einen Tag nach der Inokulation wurde die
erfindungsgemäße Verbindung dem Kulturmedium in verschiedenen
Konzentrationen zugesetzt. 3 Tage nach der Zugabe wurden
die Zellen in jeder Vertiefung unter Anwendung der
Farbstoffexklusionsmethode ausgezählt, wodurch der
Wachstumsinhibierungseffekt der erfindungsgemäßen Verbindung
bei verschiedenen Konzentrationen auf HeLa S&sub3;-Zellen
bewertet wurde.
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Die Tabelle 2 zeigt die erhaltenen Ergebnisse. So betrug
die IC&sub5;&sub0; der erfindungsgemäßen Verbindung 0,987 ug/ml und
sie übte eine starke Wachstumsinhibierungswirkung auf HeLa
S&sub3;-Zellen aus.
Tabelle 2
Konzentration der Verbindung (ug/ml)
Wachstumsinhibhierungsverhältnis (%)
Testbeispiel 3
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Die Wachstumsinhibierungseffekte der erfindungsgemäßen
Verbindung auf Maus-Colonkrebs-Zellen (Colon 26) und
Human-Colonkrebs-Zellen (SW1116) wurden untersucht. Eine
Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit
Maus-Colonkrebs-Zellen in einer Menge von 1,5 x 10³ Zellen pro Vertiefung
inokuliert, wähend eine andere Platte mit 96 Vertiefungen
mit Human-Colonkrebs-Zellen in einer Menge von 3,0 x 10³
Zellen pro Vertiefung inokuliert wurde. Diese Zellen
wurden
24 h lang unter 5 % CO&sub2; bei 37ºC in einem Inkubator
inkubiert. Dann wurde die erfindungsgemäße Verbindung in
verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Die Zellen in
jeder Vertiefung wurden unter Anwendung der
Farbstoffexklusionsmethode 45 h und 96 h nach der Zugabe
ausgezählt, wodurch der Wachstumsinhibierungseffekt der
Testverbindung auf die Maus-Colonkrebs-Zellen und auf die
Human-Colonkrebs-Zellen bewertet wurde.
-
Die Tabelle 3 zeigt die erhaltenen Ergebnisse. So betrug
die IC&sub5;&sub0; der erfindungsgemäßen Verbindung auf die
Maus-Colonkrebs-Zellen weniger als 0,025 ug/ml, während diejenige
auf die Human-Colonkrebs-Zellen 2,80 ug/ml betrug, was in
jedem Falle einen starken Wachstumsinhibierungseffekt
anzeigt.
Tabelle 3
Wachstumsinhibierungsverhältnis (%)
Konzentration der Verbindung (ug/ml)
Maus-Colonkrebs-Zellen (Colon 26)
Human-Colonkrebs-Zellen (SW1116)
Testbeispiel 4
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Die Wachstumsinhibierungseffekte der erfindungsgemäßen
Verbindung auf Maus-Lungenkrebs-Zellen (LL) und
Human-Lungenkrebs-Zellen (PC-3) wurden untersucht.
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Eine Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit
Maus-Lungenkrebs-Zellen in einer Menge von 8,0 x 10² Zellen pro
Vertiefung inokuliert, während eine andere Platte mit 96
Vertiefungen mit Human-Lungenkrebs-Zellen in einer Menge von
2,5 x 10³ Zellen pro Vertiefung inokuliert wurde. Diese
Zellen wurden 24 h lang unter 5 % CO&sub2; bei 37ºC in einem
Inkubator inkubiert. Dann wurde die erfindungsgemäße
Verbindung in verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Die
Zellen in jeder Vertiefung wurden 3 Tage nach der Zugabe
unter Anwendung der Farbstoffexklusionsmethode ausgezählt,
wodurch der Wachstumsinhibierungseffekt der Testverbindung
auf die Maus-Lungenkrebs-Zellen (LL) und auf die Human-
Lungenkrebs-Zellen (PC-3) bewertet wurde.
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Die Tabelle 4 zeigt die erhaltenen Ergebnisse. So betrug
die IC&sub5;&sub0; der erfindungsgemäßen Verbindung auf die Maus-
Lungenkrebs-Zellen 0,0085 ug/ml, während diejenige auf die
Human-Lungenkrebs-Zellen 2,00 ug/ml betrug, was in jedem
Falle einen starken Wachstumsinhibierungseffekt anzeigt.
Tabelle 4
Wachstumsinhibierungsverhältnis (%)
Konzentration der Verbindung (ug/ml)
Maus-Lungenkrebs-Zellen (LL)
Human-Lungenkrebs-Zellen (PC-3)
Testbeispiel 5
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Es wurden die Wachstumsinhibierungseffekte der
erfindungsgemäßen Verbindung auf Maus-Melanomzellen (B16) und auf
Human-Melanomzellen (G361) untersucht. Eine Platte mit 96
Vertiefungen wurde mit Maus-Melanomzellen in einer Menge
von 1,5 x 10³ Zellen pro Vertiefung inokuliert, während
eine andere Platte mit 96 Vertiefungen mit
Human-Melanomzellen in einer Menge von 1,0 x 10³ Zellen pro Vertiefung
inokuliert wurde. Diese Zellen wurden unter 5 % CO&sub2; bei
37ºC in einem Inkubator inkubiert. Dann wurde die
erfindungsgemäße Verbindung in verschiedenen Konzentrationen
zugegeben. Die Zellen in jeder Vertiefung wurden unter
Anwendung des Farbstoffexklusionsverfahrens 72 h nach der
Zugabe ausgezählt, wodurch der Wachstumsinhibierungseffekt
der Testverbindung auf die Maus-Melanomzellen und auf die
Human-Melanomzellen in verschiedenen Konzentrationen
bewertet wurde.
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Die Tabelle 5 zeigt die erhaltenen Ergebnisse. So betrug
die IC&sub5;&sub0; der erfindungsgemäßen Verbindung auf die
Maus-Melanomzellen 0,64 ug/ml, während diejenige auf die Human-
Melanomzellen 1,63 ug/ml betrug, was in jedem Falle einen
Wachstumsinhibierungseffekt anzeigt.
Tabelle 5
Wachstumsinhibierungsverhältnis (%)
Konzentration der Verbindung (ug/ml)
Maus-Melanom (B16)
Human-Melanon (G361)
Testbeispiel 6
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Es wurde der Wachstumsinhibierungseffekt der
erfindungsgemäßen Verbindung auf Endothel-Zellen untersucht. Eine
Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit
Rindernieren-Kapillar-Endothel-Zellen in einer Menge von 1 x 10&sup4; Zellen pro
Vertiefung inokuliert. Einen Tag nach der Inokulation
wurde die erfindungsgemäße Verbindung in verschiedenen
Konzentrationen zugegeben. Es wurden die Zellen in jeder
Vertiefung mit einem Coulter-Counter 3 Tage nach der
Zugabe ausgezählt, wodurch der Wachstumsinhibierungseffekt
der Testverbindung auf die Kapillar-Endothelzellen
bewertet wurde. Die Tabelle 6 zeigt die erhaltenen Ergebnisse.
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Die IC&sub5;&sub0; der erfindungsgemäßen Verbindung auf die
Endothelzellen betrug somit 0,0003 ug/ml, was einen starken
Wachstumsinhibierungseffekt anzeigt.
Tabelle 6
Konzentration der Verbindung (ug/ml)
Wachstumsinhibierungsverhältnis (%)
Testbeispiel 7
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Es wurde der Vascularisierungsinhibierungseffekt der
erfindungsgemäßen Verbindung mittels des Kaninchen-Cornea-
Assays, wie er von M.A. Gimbrone et al. in "J. National
Cancer Inst.", 52, 412 (1974), beschrieben ist,
untersucht. Das Zentrum der Augen-Cornea eines Kaninchens wurde
mit einem Messer in einer Länge von etwa 2 mm
eingeschnitten, um dadurch eine Tasche zu bilden. Dann wurde ein
Pellet mit verzögerter Freisetzung, das 100 ug eines
Rohextrakts von Ehrlich-Ascites-Tumorzellen enthielt, die
vorher nach einem Verfahren hergestellt worden waren, wie es
von R. Langer et al. in "Naturell", 263, 797 (1979),
vorgeschlagen worden ist, in die Tasche eingeführt.
Außerdem wurde ein weiteres Pellet mit verzögerter Freisetzung,
das 0,3 bis 81 ug der erfindungsgemäßen Verbindung
enthielt, so eingeführt, daß diese Pellets miteinander in
Kontakt kamen. Dann wurde der Grad der Vascularisierung 4,
6, 8 und 10 Tage nach der Einführung beobachtet. Als
Ergebnis wurde gefunden, daß die Vascularisierung durch den
Ehrlich-Ascites-Tumorzellen-Rohextrakt signifikant
hinausgezögert wurde bis zum 4. Tag in den Gruppen, denen 1 ug
oder mehr der erfindungsgemäßen Verbindung verabreicht
worden waren, und bis zum 8. Tag in den Gruppen, denen 2,7
ug oder mehr derselben verabreicht worden waren,
verglichen mit einer Kontrollgruppe.
Testbeispiel 8
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Es wurde die insektizide Wirkung der erfindungsgemäßen
Verbindung unter Anwendung des folgenden Verfahrens
untersucht.
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1) Ein Imago von 2-Punkt-Blattspinnmilben-Acariden (eine
Kelthan-resistente Species) wurde als Test-Schädling
verwendet und es wurde die Mortalitätsrate derselben unter
Anwendung eines üblichen Verfahrens (wie es auf Seite 327
von "Noyaku Seibutsu Kenteiho", herausgegeben von Toyoji
Hosotusuji beschrieben ist) bestimmt.
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Insbesondere wurde eine Lösung der erfindungsgemäßen
Verbindung in Aceton (0,1 %) zu 0,5 ml einer wäßrigen
Saccharoselösung (1 %) zugegeben zur Einstellung einer
vorgegebenen Konzentration. Zehn
2-Punkt-Blattspinnmilben-Acariden wurden in einen Behälter (20 ml-Becher) freigesetzt
und der Behälter wurde mit einem Paraffinfilm
abgedeckt. Die oben hergestellte Agenslösung wurde auf den
Paraffinfilm aufgebracht und es wurde ein weiterer
Paraffinfilm daraufgelegt. Der Becher wurde in einer
thermostatischen Kammer (20 ± 1ºC) für eine vorgegebene Zeitspanne
stehen gelassen und es wruden die Lebenden und die Toten
des Testinsektizids bestimmt.
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2) Als Testschädling wurde eine Larve von
Moskito-Stechmücken(-Culices) (eine empfindliche Species) verwendet und
es wurde die Mortalitätsrate derselben unter Anwendung
eines üblichen Verfahrens (wie es auf Seite 109 von "Noyaku
Jikkenho I Sacchuzaihen", publiziert von Soft Science,
Inc., beschrieben ist) bestimmt.
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Insbesondere wurden 10 ml Quellwasser in einen Behälter
(15 ml Petrischale) eingeführt und es wurden fünf Larven
von Moskito-Stechmücken (dritte Stufe) in den Behälter
freigelassen. Eine Lösung der erfindungsgemäßen Verbindung
in Aceton (0,1 %) wurde zugegeben, so daß eine vorgegebene
Konzentration erhalten wurde. Der Behälter wurde in einer
thermostatischen Kammer (26 ± 1ºC) für eine vorgegebene
Zeitspanne stehen gelassen und es wurden die Lebenden und
die Toten des Test-Insektizids bestimmt. Die Ergebnisse
sind in der Tabelle 8 angegeben. Wie aus der Tabelle
hervorgeht, wies die erfindungsgemäße Verbindung eine
acarizide Wirkung und eine culizide Wirkung auf.
Tabelle 8
Mortalitätsrate (%)
Moskito-Larven
Test-Verbindung
Konzentration der Verbindung (ppm)
Imagos von 2-Punkt-Spinnmilben nach 2 Tagen
nach Tagen
(unbehandelt)
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Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäße Verbindung
Antifungi-, Antikrebs-, Vascularisierungsinhibitor und
insektizide Effekte (Aktivitäten) aufweist und daß sie
somit höchst nützlich
ist als neues Antifungimittel,
Antitumormittel, Vascularisierungsinhibitor oder Insektizid.
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In dem folgenden Beispiel wird ein Verfahren zur
Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung erläutert.
Beispiel 1
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100 ml eines Mediums (pH 7,2), das 2 % lösliche Stärke,
0,5 % Glucose, 0,5 % Pepton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,05 %
dibasisches Kaliumphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat und 0,5 %
Sojabohnenpulver enthielt, wurde in einen
Erlenmeyer-Kolben (500 ml) einpipettiert und 20 min lang in einem
Autoklaven bei 120ºC sterilisiert. Dann wurde es mit einer
Platinösenfüllung des NK 86-0279-Stammes (FERM BP-1785)
inokuliert. Der Stamm wurde unter Schütteln mit 190 UpM
bei 27ºC in einem Rotationsschüttler 2 Tage lang
kultiviert. Getrennt davon wurde 1 l des vorstehend
beschriebenen Mediums in einen konischen Kolben (5 l) einpipettiert
und 20 min lang in einem Autoklaven bei 120ºC
sterilisiert. Dann wurden 20 ml des obengenannten Kulturmediums
in den zuletzt genannten Kolben inokuliert und unter
Schütteln mit 190 UpM bei 27ºC in einem Rotationsschüttler
für 2 Tage darin kultiviert. Dann wurden 120 l eines
Mediums (pH 7,0), enthaltend 4 % Glycerin, 0,5 % Polypepton,
0,3 % Hefeextraktpulver, 0,5 % Fleischextrakt, 0,3 %
Natriumchlorid und 0,05 % Magnesiumsulfat, in einen Tank
(120 l) einpipettiert und 30 min lang bei 120ºC
sterilisiert. Danach wurden 2,4 l des obengenannten Kulturmediums
in den Tank inokuliert und unter Belüften mit einer Rate
von 120 l/min unter Rühren mit 270 UpM bei 27ºC 5 Tage
lang kultiviert. Die resultierende Kultur (240 l) wurde
durch Zugabe von 3 % Filterhilfsmittel filtriert. Es
wurden 50 l Aceton zu der so erhaltenen Mycel-Fraktion
zugegeben und die Extraktion wurde unter Rühren durchgeführt.
Nach dem Filtrieren wurde der Acetonextrakt gesammelt. Der
Rückstand wurde erneut mit 30 l Aceton extrahiert. Der so
erhaltene Acetonextrakt wurde im Vakuum unter Entfernung
des Lösungsmittels eingedampft, wobei man 220 g eines
braunen öligen Materials erhielt. Es wurde in Chloroform
gelöst und auf eine Silicagel-Säule (3,5 l) aufgegeben,
die vorher mit einem Chloroform/Methanol(40:1)-Gemisch
äquilibriert worden war, dann wurde stufenweise eluiert
mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol von 20:1,
10:1 und 2:1. Die aktiven Fraktionen wurden miteinander
vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne
eingeengt, wobei man 28,8 g eines hellbraunen Pulvers
erhielt.
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Dann wurde dieses Pulver erneut in Chloroform gelöst und
an einer Silicagel-Säule (2,5 l) chromatographiert unter
Anwendung einer stufenförmigen Elution mit einem Gemisch
von Chloroform und Methanol von 100 : 1, 50 : 1 und 20 :
1.
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Die aktiven Fraktionen wurden miteinander vereinigt und
unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man
11,1 g eines blaßelben Pulvers erhielt. Dieses Pulver
wurde in Chloroform gelöst und dann mit n-Hexan
ausgefällt, wobei man 4,95 g eines farblosen Pulvers erhielt.
Es wurde einer präparativen
Hochleistungs-Flüssigchromatographie (Säule: ODS 5301 20,0 x 300 mm; Eluierungsmittel:
80 Vol/Vol.-%iges wäßriges Methanol; Flußgeschwindigkeit:
10,0 ml/min; nachgewiesen mittels eines UV-Detektors)
unterworfen.
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Die den Peaks mit einer Retentionszeit von etwa 32,5 min
entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und eingeengt,
wobei man 0,8 g NK 130119 als farbloses Pulver erhielt.