DE69001107T2 - Sauerstoff- oder schwefelsubstituierte Fettsäureanaloga zur Behandlung retroviraler Infektionen. - Google Patents
Sauerstoff- oder schwefelsubstituierte Fettsäureanaloga zur Behandlung retroviraler Infektionen.Info
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Description
- Diese Erfindung bezieht sich auf Verbindungen zur Verwendung in einem Verfahren zum Inhibieren von Retroviren mit oxy- und thiosubstituierten Fettsäureanalogonsubstraten von Myristylierungsenzymen. Es handelt sich um Substrate, die bei der Fettsäureacylierung von Peptiden und Proteinen verwendbar sind.
- Fettsäureacylierung von spezifischen eukaryotischen Proteinen ist ein gut etabliertes Verfahren, das zweckdienlich in zwei Kategorien unterteilt werden kann. Einerseits wird Palmitat (C&sub1;&sub6;) durch Ester- oder Thioesterbindung posttranslational, wahrscheinlich in der Golgi-Apparatur, an Membranproteine gebunden.
- Andererseits ist es bekannt, daß Myristat (C&sub1;&sub4;) durch Amidbindung früh im Proteinbiosyntheseweg kovalent an lösliche und Membranproteine gebunden wird. Es ist bekannt, daß in den N- myristylierten Proteinen aminoterminale Glycinreste die Acylierungsstelle sind.
- Es hat sich gezeigt, daß eine Reihe von viralen und zellulären Proteinen durch die kovalente Haftung von Myristat durch ein Amid gebunden an Glycin an ihren Aminotermini so modifiziert wird. Ein Beispiel eines am gründlichsten untersuchten myristylierten Proteins ist das transformierende Protein von Rous- Sarkom-Virus, p60v-src.
- Die Myristylierungsreaktion kann wie folgt dargestellt werden: Myristylierungsenzym
- Weitere Hintergrundinformation über die obige Fettsäureacylierung von Protein kann durch Hinweis auf die folgende Reihe von Artikeln von Wissenschaftlern, die Mitglieder der Washington University School of Medicine sind, erhalten werden:
- Towler und Glaser, Biochemistry 25, 878-84 (1986);
- Towler und Glaser, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 2812-2816 (1986);
- Towler et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84, 2708-2712 (1987);
- Towler et al., J.Biol.Chem. 262, 1030-1036 (1987), und
- Towler et al., Ann.Rev.Biochem., 57, 69-99 (1988).
- Außergewöhnliche synthetische Peptide mit relativ kurzen Aminosäuresequenzen, die als Substrate von myristylierenden Enzymen verwendbar sind, sind im US-Patent 4 740 588 beschrieben. Beispiele derartiger Peptide sind:
- Gly-Asn-Ala-Ala-Ala-Ala-Arg-Arg und Gly-Asn-Ala-Ala-Ser-Tyr-Arg-Arg.
- Bestimmte andere einmalige synthetische Peptide sind Inhibitoren von myristylierenden Enzymen, wie im US-Patent 4 709 012 beschrieben.
- Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren im Inhibieren von Retroviren, wie menschlichem Immundefektvirus (HIV). Als solche haben diese Fettsäureanalogonsubstrate potentielle Verwendung für die Behandlung von erworbenem Immundefektsyndrom (AIDS) und AIDS-related complex (ARC).
- Erworbenes Immundefektsyndrom, das noch vor wenigen Jahren eine medizinische Kuriosität war, ist nun eine ernste Krankheit. Demgemäß gibt es viele Bemühungen, Arzneimittel und Vakzinen zu entwickeln, die AIDS bekämpfen. Das AIDS-Virus, zuerst 1983 identifiziert, wurde mit verschiedenen Namen beschrieben. Es ist das dritte bekannte T-Lymphozytenvirus (HTLV-III) und hat die Fähigkeit, innerhalb von Zellen des Immunsystems zu replizieren und dadurch zu einer profunden Zerstörung von T4+ T-Zellen (oder CD4+-Zellen) zu führen; siehe z.B. Gallo et al., Science 224, 500-503 (1984), und Popovic et al., ibid., 497-500 (1984). Dieses Retrovirus war als lymphadenopathie-assoziiertes Virus (LAV) oder AIDS-verwandtes Virus (ARV) und seit neuestem als menschliches Immundefektvirus (HIV) bekannt. Zwei bestimmte AIDS-Viren, HIV-1 und HIV-2, wurden beschrieben. HIV-1 ist das Virus, das ursprünglich 1983 von Montagier und Mitarbeitern am Pasteur-Institut in Paris idenfiziert wurde [Ann.Virol.Inst. Pasteur 135 E, 119-134 (1984)], während HIV-2 später von Montagnier und seinen Mitarbeitern 1986 isoliert wurde [Nature 326, 662 (1987)]. Wie hier verwendet, soll sich HIV auf diese Viren im allgemeinen Sinn beziehen.
- Obwohl man beginnt, die molekulare Biologie van AIDS zu enträtseln und zu definieren, muß über diese Krankheit noch viel mehr gelernt und verstanden werden. In der Zwischenzeit werden zahlreiche Ansätze in der Forschung nach potentiellen Anti-AIDS- Arzneimitteln und Vakzinen untersucht. Die Entwicklung einer AIDS-Vakzine wird durch das mangelnde Verständnis von Mechanismen schützender Immunität gegen HIV, die Größe der genetischen Variation des Virus und fehlende effektive Tiermodelle für HIV- Infektion behindert; siehe beispielsweise Koff und Hoth, Science 241, 426-432 (1988).
- Das erste von U.S. Food und Drug Administration (FDA) zur Behandlung von AIDS zu genehmigende Arzneimittel war Zidovudin, auch unter seinem übliche Namen Azidothymidin (AZT) bekannt. Chemisch gesehen ist dieses Arzneimittel 3'-Azido-3'-desoxythymidin. Dieses Arzneimittel wurde ursprünglich als eine potentielle Waffe gegen AIDS gewählt, weil sich gezeigt hat, daß es Replikation des Virus in vitro inhibiert. Derartige in vitro- Versuche sind nützlich und faktisch die einzige praktische Methode des ersten Screenings and Testens möglicher Anti-AIDS- Arzneimittel. Ein ernster Nachteil von AZT sind jedoch seine toxischen Nebenwirkungen. Somit dauert die Suche nach besseren Anti-AIDS-Arzneimitteln an.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Fettsäureanalogonsubstrate für myristylierende Enzyme in einem Verfahren zum Inhibieren von Retroviren verwendet. Die bevorzugten antiretroviralen Verbindungen sind oxy- und thiosubstituierte Fettsäureanaloga, die bei der Fettsäureacylierung von Proteinen verwendbar sind. Sie enthalten ein Sauerstoff- oder Schwefelatom anstelle einer Methylen-(CH&sub2;)-gruppe in-einer Kohlenstoffstellung von 4 bis 13 in der Fettsäurekette einer C&sub1;&sub3;-C&sub1;&sub4;-Fettsäure oder eines Alkylesters hievon. Das Carboxylkohlenstoffatom wird hier auf Basis herkömmlicher Nomenklatur als Nr. 1 definiert. Bevorzugte Alkylester der Fettsäureanaloga weisen 1 bis 6 Kohlenstoffatome in der Alkylgruppe auf. Die Fettsäurekette kann von gesättigter Alkancarbonsäure oder ungesättigten Alken- und Alkincarbonsäuren stammen.
- Es ist bekannt, daß diese Fettsäureanalogonsubstratverbindungen zum Untersuchen der Regulierung der Enzym (Acyltransferase)-Wirkung und der Rolle der N-Myristylierung in der Proteinfunktion verwendbar sind. Sie können als synthetische Substrate für die N-myristylierenden Enzyme in Quellen, wie Hefen, Weizenkeimlysaten und Säugerzellen, dienen. Diese Verbindungen unterscheiden sich in der Hydrophobizität von Myristinsäure, obwohl sie ungefähr die gleiche Kettenlänge beibehalten. So sollten sie, wenn sie in Myristylproteine eingebaut werden, die anschließenden Wechselwirkungen des Acylproteins mit Membranen oder mit anderen Proteinen ändern; siehe Heuckeroth et al., J.Biol.Chem. 263, 2127-2133 (1988). Es wird angenommen, daß Fettsäureanalogonsubstratverbindungen mit mehreren Heteroatomsubstitutionen eine stärker verminderte Hydrophobizität aufweisen als entsprechende Analoga mit einer einzigen Heteroatomsubstitution; siehe Heuckeroth et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85, 8795-8799 (1988). Heteroatomsubstituierte Fettsäureanaloga wirken als Substrate für N-Myristyltransferase (NMT) sowohl in vitro als auch in vivo. Solche Resultate werden von Heuckeroth et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86, 5262-5266 (1989), mit Säugerzellen gezeigt, z.B. BC&sub3;Hl.
- Illustrative Beispiele der antiviralen oxy- und thiosubstituierten Fettsäureanalogonsubstratverbindungen, die im Verfahren dieser Erfindung verwendbar sind, sind:
- A. 11-(Äthylthio)-undecansäure - CH&sub3;CH&sub2;S(CH&sub2;)&sub1;&sub0;COOH
- B. 11-(Äthoxy)-undecansäure - CH&sub3;CH&sub2;O(CH&sub2;)&sub1;&sub0;COOH
- C. 5-(Octylthio)-pentansäure - CH&sub3;(CH&sub2;)&sub7;S(CH&sub2;)&sub4;COOH
- D. 11-(Methoxy)-undecansäure - CH&sub3;O(CH&sub2;)&sub1;&sub0;COOH
- E. 12-(Methoxy)-dodecansäure - CH&sub3;O(CH&sub2;)&sub1;&sub1;COOH
- F. 5-(Octyloxy)-pentansäure - CH&sub3;(CH&sub2;)&sub7;O(CH&sub2;)&sub4;COOH
- G. 10-(Propylthio)-decansäure - CH&sub3;(CH)&sub2;S(CH&sub2;)&sub9;COOH
- H. 10-(Propoxy)-decansäure - CH&sub3;(CH&sub2;)&sub2;O(CH&sub2;)&sub9;COOH
- I. 11-(1-Butoxy)-undecansäure - CH&sub3;(CH&sub2;)&sub3;O(CH&sub2;)&sub1;&sub0;COOH
- J. 10-(2-Propinoxy)-decansäure - HC CCH&sub2;O(CH&sub2;)&sub9;COOH.
- Für die obigen antiretroviralen oxy- und thiosubstituierten Fettsäureanalogonsubstratverbindungen kann eine andere Nomenklatur verwendet werden. Beispielsweise kann die Verbindung A 12- Thiamyristinsäure, die Verbindung B 12-Oxymyristinsäure, aber vorzugsweise 12-Oxamyristinsäure, und die Verbindung J 11-Oxy- 13-inmyristinsäure bezeichnet werden.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung basieren die antiretroviralen oxy- und thiosubstituierten Fettsäureanalogonsubstratverbindungen auf gesättigten C&sub1;&sub3;-C&sub1;&sub4;-Fettsäuren, wie durch die obigen Verbindungen A bis H exemplifiziert.
- Die Verbindung I, die ein Fettsäureanalogon auf Basis einer gesättigten C&sub1;&sub6;-Fettsäure ist, ist weniger wirksam als die Analoga auf Basis von C&sub1;&sub3;-C&sub1;&sub4;-Fettsäuren.
- In einer durch die obige Verbindung J illustrierten weiteren Ausführungsform basiert das antiretrovirale Fettsäureanalogon auf einer ω-ungesättigten C&sub1;&sub4;-Fettsäure. Es wird angenommen, daß Ergebnisse, wie die mit der letzteren Verbindung erhaltenen, auch mit Fettsäureanaloga basierend auf Δ9, 10 cis- und Δ9, 10 trans-ungesättigten Fettsäuren, z.B. 12-Thiamyristoleinsäure und 12-Oxymyristelaidinsäure, erzielt werden können.
- Die Herstellung der antiretroviralen oxy- und thiosubstituierten Fettsäureanalogonsubstratverbindungen kann durch Verfahren analog der Herstellung von gemischten Athern durch die Williamson-Synthese durchgeführt werden. So kann eine geeignete ω-Bromcarbonsäure mit einem Alkoholat oder einem Alkylthiol umgesetzt werden, um den oxysubstituierten Fettsäureäther bzw. den thiosubstituierten Fettsäureäther zu bilden.
- Insbesondere können die Verbindungen durch Verfahren analog der Synthese von heteroatomsubstituierten Analoga von Stearinsäure, wie von Pascal und Ziering, J.Lipid Res. 27, 221-224 (1986), beschrieben, gebildet werden. Unter Anwendung dieser Methoden können die schwefelhaltigen Analoga durch die Kondensation geeigneter Alkylthiole und ω-Bromcarbonsäuren in Anwesenheit einer alkoholischen Base hergestellt werden. Dies kann durch die Herstellung der obigen Verbindung A wie folgt illustriert werden:
- Ähnlich können die sauerstof fhaltigen Analoga durch Umsetzen der ω-Bromsäuren mit alkoholischer Base hergestellt werden. Dies kann durch die Herstellung der obigen Verbindung E wie folgt illustriert werden:
- Br(CH&sub2;)&sub1;&sub1;COOH + CH&sub3;OH + KOH T CH&sub3;O(CH&sub2;)&sub1;&sub1;COOH + KBr + H&sub2;O
- Andere antiretrovirale oxy- und thiosubstituierte Fettsäureanalogonsubstratverbindungen der Erfindung können durch ähnliche derartige Methoden durch Wählen geeigneter Alkyl- und Fettsäurekettenlängen in den Reaktantenverbindungen zum Bilden der gewünschten Produkte hergestellt werden. Beide Reaktionen des obigen Typs werden in organischem Lösungsmittelmedium bei Rückflußtemperaturen durchgeführt, bis die gewünschte Reaktion im wesentlichen beendet ist.
- Obwohl spezifische Verfahren zur Herstellung der Fettsäureanaloga hier beschrieben sind, ist es klar, daß die antiretroviralen Verbindungen dieser Erfindung nicht auf irgendein spezifisches Herstellungsverfahren beschränkt sind.
- In einer typischen antiretroviralen Verbindung dieser Erfindung, nämlich 11-(Äthylthio)-undecansäure, wurde gefunden, daß das Einführen der Thioäthergruppe in die Fettsäurekette unerwartet und überraschenderweise deren Hydrophobizität und die Hydrophobizität der betreffenden Acylpeptide und Fettacylproteine senkt, aber dennoch die Fähigkeit intakt läßt, als Substrat für das Enzym Myristyl-CoA: Protein-N-myristyltransferase (NMT) zu wirken. Die Reinigung und Verwendung dieses Enzyms sind beispielsweise von Towler et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84, 2708- 2712 (1987); J.Biol.Chem. 262, 1030-1036 (1987), beschrieben.
- Das Verfahren zum Inhibieren von Virus mit diesen Fettsäureanaloga wird hier durch die Inhibierung von zwei Retroviren, nämlich dem menschlichen Immundefektvirus-1 (HIV-1) und dem Maloney-Mausleukämievirus (MoMLV) illustriert. Diese beiden Viren hängen von der N-Myristylierung ihres gag-Polyproteinvorläufers für die Zusammenstellung ab.
- Obwohl die Beschreibung mit Ansprüchen endet, die den Gegenstand, der als die vorliegende Erfindung bildend angesehen wird, besonders herausstreichen und deutlich beanspruchen, wird angenommen, daß die Erfindung aus der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen besser zu verstehen ist, in welchen
- Fig. 1 eine graphische Darstellung ist, die die Wirkung von sauerstoff- und schwefelsubstituierten Analoga von Myristinsäure auf die Replikation von HIV-1 in H-9-Zellen zeigt. Tafel A - H9- Zellen wurden mit HIV-1 akut infiziert und mit 12-(Methoxy)- dodecansäure (13-Oxamyristinsäure, 013), 10-(Propoxy)-decansäure (11-Oxamyristinsäure, 011), 5-(ctyloxy)-pentansäure (6-Oxamyristinsäure, 06) oder 11-(Äthylthio)-undecansäure (12-Thiamyristinsäure, S12) oder Decansäure bei den angegebenen Konzentrationen in serumhaltigem Medium 8 bis 10 Tage behandelt.
- Die Medien wurden jeweils am anderen Tag gewechselt. Die Wirkung dieser Verbindungen auf die Virusproduktion wurde durch Messen der reversen Transkriptase (RT)-Aktivität in Proben der Zellkulturüberstände bestimmt. Azidothymidin (AZT) bei 5 uM wurde als positive Kontrolle verwendet. Negative Kontrollen bestanden aus keinen Zusätzen oder 0,1 % Äthanol. Die Ergebnisse von Doppeltests wurden gemittelt. Tafel B - Konzentrationsabhängige Wirkungen von 13-Oxamyristinsäure auf HIV-1-Replikation, gemessen durch RT-Aktivität (% unbehandelter Kontrolle) und die Anwesenheit von p24-Antigen (ng/ml bestimmt durch ELISA). Fehlerbalken zeigen den SEM von Tests, die dreifach ausgeführt wurden. Tafel C - Die Wirkung von 13-Oxamyristinsäure auf Synzytiabildung unter Verwendung einer willkürlichen Skala, beschrieben nachstehend unter Materialien und Methoden, Beispiel 16. Tafel D - Toxizität von 13-Oxamyristinsäure, bestimmt durch Zahl lebensfähiger Zellen (Trypanblauausschluß) sowie durch [³H]Thymidin- und [³H]Leucinmarkierung (siehe nachstehend Materialien und Methoden, Beispiel 16). Der Einbau dieser radiomarkierten Verbindungen wurde in der gesamten Zellpopulation bestimmt, die in einer Vertiefung nach 10 Tagen Behandlung mit dem Analogon enthalten war. Doppeltests wurden durchgeführt und die Ergebnisse gemittelt; und
- Fig. 2 eine graphische Darstellung ist, die die Wirkung von sauerstoffsubstituierten Myristinsäureanaloga auf MoMLV-Replikation zeigt. Tafel A - Schematische Darstellung des MoMLV- Testsystems. Der Kreis links im Diagramm zeigt die LZ1-Virus produzierende Zelle, die (i) einen stabil integrierten Verpackungsmutanten von MoMLV, pMOV-ψ bezeichnet, der eine 350 bp Deletion zwischen der 5'-Spleißakzeptorstelle für env und das Initiator Met-Codon (AUG) von Pr65gag aufweist, und (ii) eine zweite integrierte rekombinante DNA-Sequenz mit diesen fehlenden Verpackungssequenzen plus dem E.coli LacZ-Gen stromabwärts von einem SV40-Promotor enthält. Diese Zelle produziert infektiöses, replikationsdefektes Virus (LZ1 bezeichnet), das das LacZ-Gen trägt. Wenn NIH3T3-Zellen dem von den LZ1-Virus produzierenden Zellen genommenen Überstand ausgesetzt werden, werden sie zunächst infiziert und ihre Nachkommen sind durch histochemisches Anfärben auf β-Galaktosidase nachweisbar. So kann der Titer des von den LZ1-Zellen produzierten Virus nach Behandlung mit den verschiedenen Mitteln leicht durch Zählen der Zahl von blauen NIH3T3-Zellen bestimmt werden. Replikationskompetentes MoMLV wird unter Verwendung dieses Testsystems nicht nachgewiesen, weil das LacZ-Genprodukt nicht vorhanden ist. Tafel B - Die Wirkung von 6-Oxamyristinsäure und 13-Oxamyristinsäure auf LZ1- Virusproduktion. Die Ergebnisse stellen den Durchschnitt (+1 Standardabweichung) von drei unabhängigen doppelt durchgeführten Versuchen dar. Tafel C - Zahl von lebensfähigen LZ1 produzierenden Zellen am Ende einer 2 Tage langen Behandlung mit Analogon, wie durch Trypanblauausschluß gemessen. Die Ergebnisse von Doppelversuchen wurden gemittelt. Tafel D - Die Wirkung von Analogonbehandlung auf den Einbau von [³H]Leucin. Zellen in Duplikatvertiefungen wurden 4 h nach 3 Tagen inkubation mit Analogon oder Äthanol (0,1 %) impulsmarkiert. Es wurden Doppelversuche durchgeführt. Die Ergebnisse wurden gemittelt und als Prozentsatz der von unbehandelten Zellen erhaltenen Ergebnisse ausgedrückt.
- Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen 1 bis 11 durch die Synthese und das Testen von repräsentativen Verbindungen der Erfindung als antivirale Mittel detaillierter illustriert.
- 1 g (3,77 mMol) 11-Bromundecansäure (Aldrich) wurden einer Lösung von 0,279 ml (3,77 mMol) Äthanthiol (Aldrich) und 0,486 g (8,66 Mol) Kaliumhydroxid in 40 ml absolutem Äthanol zugesetzt und 5 h unter einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluß gehalten. Nach Abkühlen und Ansäuern mit HCl wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde. Der Feststoff wurde in Äthylacetat gelöst und mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wurde durch Kieselerdesäulenchromatographie unter Anwendung steigender Konzentrationen von Äthylacetat in Hexan für Elution gereinigt. Das Produkte eluierte bei 25 % Äthylacetat/Hexan. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei 76 mg (8 %) 11-(Äthylthio)-undecansäure erhalten wurden, Fp. 58-61ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,24 (t, 3H, J=7,4, CH&sub3;), 1,20-1,40 (bm, 12H, Methylenhülle), 1,48-1,67 (bm, 4H, S-CH&sub2;- &sub2;COO-CH&sub2;- &sub2;), 2,33 (t, 2H, J=7,5, &sub2;-COOH), 2,49 (t, 2H, J=7,4, S- &sub2;- CH&sub3;), 2,51 (q, 2H, J=7,4, S- &sub2;-CH&sub3;), 10,5 (br, 1H, COOH); ¹³C- NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 14,88, 24,70, 25,98, 28,97, 29,08, 29,24*, 29,38, 29,48, 29,69, 31,73, 34,11, 180,05; MS, m/z 246 (M+, 50), 217 [COOH(CH&sub2;)&sub1;&sub0;S+, 7], 199 (100), 181 (7), 167 (7), 149 (6), 117 (7), 101 (9), 97 (9), 87 (14), 83 (18), 75 (54), 69 (29), 62 (18), 55 (37).
- 2,25 g (8,47 mMol) 11-Bromundecansäure wurden einer Lösung von 2,15 g (38,3 mMol) Kaliumhydroxid in 20 ml absolutem Äthanol zugesetzt und 7 h am Rückfluß gehalten. Nach Abkühlen und Ansäuern mit HCl wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde. Die Probe wurde in Äthylacetat gelöst und mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wurde durch Kieselerdesäulenchromatographie in 1 % Diäthyläther/0,3 % Ameisensäure/Methylenchlorid gereinigt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei 680 mg (35 %) 11-(Äthoxy)-undecansäure erhalten wurden, Fp. 44-45,5ºC. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,20 (t, 3H, J=7,0, CH&sub3;), 1,24-1,40 (bm, 12H, Methylenhülle), 1,52-1,68 (bm, 4H, O-CH&sub2;- &sub2;; &sub2;-CH&sub2;- COOH), 2,34 (t, 2H, J=7,5, &sub2;-COOH), 3,41 (t, 2H, J=6,8, O- &sub2;- CH&sub2;), 3,48 (q, 2H, J=7,0, O- &sub2;-CH&sub3;), 10,25 (br, 1H, ); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 15,27, 24,75, 26,23, 29,11, 29,26, 29,40, 29,55*, 29,80, 34,12, 66,06, 70,76, 179,71; m/z 231 (M+H&spplus;).
- 8,3 ml (22,1 mMol) n-Butyllithium wurden tropfenweise einer Lösung von 2,9 g (19,8 mMol) Octanthiol (1) in 198 ml trockenem THD bei 0ºC zugesetzt. Nach Rühren während 30 min bei 0ºC wurde eine Lösung von 4,2 g (21,6 mMol) Methyl-5-brompentanoat (2) in 43 ml trockenem THF tropfenweise zugesetzt und die erhaltene heterogene Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde konzentriert und der Rückstand zwischen Äther und gesättigtem NH&sub4;Cl aufgeteilt. Nach nochmaligem Extrahieren der wässerigen Schicht mit Äther wurden die vereinigten organischen Extrakte mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und konzentriert. Reinigung durch Destillation bei vermindertem Druck (140 bis 145ºC bei 2 mMol) ergab 4,4 g (86 %) des Titelproduktes. ¹H-NMR-Daten, δ 3,63 (s, 3H, OCH&sub3;), 2,48 (q, 4H, J=6,8 Hz, CH&sub2;-S-CH&sub2;), 2,30 (t, J=7,0 Hz, CH&sub2;CO&sub2;CH&sub3;), 1,78-1,48 (bm, 6H, CH&sub2;'s β zu Thio- und Estergruppen), 1,43-1,15 (bs, 10H, CH&sub2;'s), 0,85 (t, J=6,6 Hz, CH&sub3;); ¹³C-NMR-Daten: δ 173,7, 51,4, 33,5, 32,1, 31,7, 31,6, 29,6, 29,1 (2), 29,0, 28,8, 24,1, 22,5, 14,0.
- 1,24 g (31,0 mMol) NaOH wurden einer Lösung von 4,25 g (16,3 mMol) Methyl-6-thiotetradecanoat in 55 ml trockenem Methanol zugesetzt und die erhaltene Mischung auf Rückfluß gebracht. Nach 5 h wurde die Reaktionsinischung auf Raumtemperatur abgekühlt, mit 100 ml Wasser verdünnt und mit 1 M HCl auf einen pH von 3 angesäuert. Diese angesäuerte Lösung wurde zweimal mit Äther extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte wurden zweimal in Wasser und zweimal in Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und konzentriert. Säulenchromatographie (Äthylacetat/Pentan, 1:9) des Rückstandes ergab 1,4 g (35 %) Produkt. ¹H-NMR-Daten, δ 2,46 (q, 4H, J=7,6 Hz, CH&sub2;SCH&sub2;), 2,33 (t, 2H, 3=7,2 Hz, CH&sub2;CO&sub2;H), 1,75-1,45 (bm, 6H, CH&sub2;'s β zu Thio- und Estergruppen), 1,38-1,15 (bs, 10H, CH&sub2;'s), 0,83 (t, 3H, J=6,6 Uz, CH&sub3;); ¹³C-NMR-Daten: 179,4, 33,5, 32,1, 31,8, 31,6, 29,7, 29,1 (2), 28,9 (2), 23,8, 22,6, 14,0; m/z (E1): 246, 145 (100 %), 115, 101, 88, 69.
- 10,0 g (37,7 mMol) 11-Bromundecansäure wurden einer Lösung von 24,3 g (433 Mol) Kaliumhydroxid in 280 ml Methanol zugesetzt und 5 h am Rückfluß gehalten. Nach Abkühlen und Ansäuern mit HCl wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Die Probe wurde in Äthylacetat gelöst und mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wurde durch Kieselerdesäulenchromatographie unter Verwendung steigender Konzentrationen von Äthylacetat in Hexanen für Elution gereinigt. Das Produkt eluierte in 25 % Äthylacetat in Hexanen. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei 200 mg (2,5 %) 11-(Methoxy)-undecansäure erhalten wurden, Fp. 31-32ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,1-1,3 (bm, 12H, Methylenhülle), 1,45-1,63 (bm, 4H, O-CH&sub2;- &sub2;; &sub2;-CH&sub2;-COOH), 2,34 (t, 2H, J=7,3, &sub2;-COOH), 3,45 (s, 3H, &sub3;), 3,50 (t, 2H, 3=6,8, O- &sub2;), 10,70 (br, ); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 24,64, 26,00, 29,00, 29,16, 29,29, 29,40, 34,00, 58,23, 72,81, 179,17; m/z 216 (M&spplus;).
- 2,0 g (7,16 mMol) 12-Bromdodecansäure wurden einer Lösung von 1,61 g (28,65 Mol) Kaliumhydroxid in 30 ml Methanol zugesetzt und 20 h am Rückfluß gehalten. Nach Abkühlen und Ansäuern mit HCl wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Die Probe wurde in Äthylacetat gelöst und mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wurde durch Kieselerdesäulenchromatographie in 1 % Diäthyläther/0,3 % Ameisensäure/Methylenchlorid gereinigt, wobei 640 mg (39 %) 12-(Methoxy)-dodecansäure erhalten wurden, Fp. 45-47ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,20-1,45 (bm, 15H, Methylenhülle), 1,51-1,69 (bm, 4H, O-CH&sub2;- &sub2;; &sub2;-CH&sub2;-COOH), 2,34 (t, 2H, J=7,4, &sub2;-COOH), 3,34 (s, 3H, O-CH&sub3;), 3,38 (t, 2H, J=6,7, O- &sub2;), 10,99 (br, 1H, ); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 24,75, 26,16, 29,10, 29,27, 29,38, 29,44, 29,53, 34,12, 58,50, 72,97, 179,70; m/z 231 (M+H&spplus;).
- 2 g (11,0 mMol) 12-Brompentansäure wurden einer Lösung von 2,48 g (44,2 Mol) Kaliumhydroxid in 20 ml 1-Octanol zugesetzt und 27 h bei 97ºC gerührt. Nach Abkühlen wurde das Produkt bei pH = 1 mit Äthylacetat und Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. 1-Octanol wurde durch Kurzweg- (Kugelrohr)-destillation [50 bis 70ºC, 66,7 Pa (0,5 mm Hg)] entfernt. Um vollständige Spaltung des Octylesters zu gewährleisten, wurde der Rückstand 3 h mit Methanol/Wasser/KOH (50 %/50 %/2,5 g, 40 ml) bei 25ºC gerührt. 1-Octanol wurde in Äthylacetat bei pH = 12 extrahiert. 5-(Octyloxy)-pentanäure wurde nach Einstellen des pH mit HCl auf 1,5 aus der wässerigen Phase in Äthylacetat extrahiert. Nach Trocknen über Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt. Kieselerdesäulenchromatographie in 10 % Äthylacetat/Hexan/0,3 % Ameisensäure ergab 235 mg (9 %) 5-(Octyloxy)-pentansäure Fp. < 30ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 0,88 (t, 3H, J=6,6), 1,18-1,39 (bm, 10H, Methylenhülle), 1,48-1,77 (bm, 6H, &sub2;CH&sub2;OCH&sub2; &sub2;, &sub2;CH&sub2;COOH), 2,39 (t, 2H, J=7,1, &sub2;COOH), 3,34-3,49 (bm, 4H, &sub2;O &sub2;), 10,66 (br, 1H, COOH); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) 14,18, 21,59, 22,73, 26,22, 29,03, 29,32, 29,51, 29,72, 31,89, 33,85, 70,22, 71,07, 179,55; m/z 231 (M+H).
- 1,0 g (3.98) 10-Bromdecansäure wurde einer Lösung von 0,893 g (15,9 mMol) Kaliumhydroxid in 30 ml 1-Propanthiol und 30 ml Methanol zugesetzt und 18h bei 69ºC gerührt. Die Reaktionsmischung wurde nach Zusatz von 20 ml Wasser auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Nach Ansäuren auf pH = 1 und Extrahieren in Äthylacetat wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt, wobei ein weißes kristallines Pulver erhalten wurde. Das Produkt wurde durch Kieselerdesäulenchromatographie in 8 % Äthylacetat/Hexan/0,3 % Ameisensäure und Umkristallisation aus Hexan gereinigt, wobei 210 mg (21 %) 10-(Propylthio)-decansäure erhalten wurden, Fp. 42-43,5ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCL&sub3;) δ 0,96 (t, 3H, J=7,3, &sub3;), 1,15-1,40 (bm, 10H, Methylenhülle), 1,49-1,64 (bm, 6H, CH&sub3; &sub2;CH&sub2;SCH&sub2; &sub2;, &sub2;CH&sub2;COOH), 2,32 (t, 2H, J=7,6, &sub2;COOH), 2,40-2,55 (bm, 4H, CH&sub3;CH&sub2; &sub2;S &sub2;), 10,93 (br, 1H, COO ); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 13,64, 23,09, 24, 71, 28,96, 29,07, 29,13, 29,24, 29,36, 29,77, 32,16, 34,10, 34,28, 179,98; m/z 247 (M+H).
- 1,0 g (3,98 mMol) 10-Bromdecansäure wurde einer Lösung von 0,893 g (15,9 mMol) Kaliumhydroxid in 30 ml n-Propanol zugesetzt und 18 h bei 102ºC gerührt. Die Reaktionsmischung wurde nach Zusatz von 20 ml Wasser auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Nach Ansäuern auf pH = 1 und Extrahieren in Äthylacetat wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt, wobei ein gelbes Öl erhalten wurde. Das Produkt wurde durch Kieselerdesäulenchromatographie in 2 % DiÄthylÄther/Methylenchlorid/0,2 % Ameisensäure und dann in 7 % Äthylacetat/Hexan/0,3 % Ameisensäure gereinigt. Umkristallisation aus Hexan bei -20ºC ergab 74 mg (12 %) 10- (Propoxy)-decansäure, Fp. < 30ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 0,91 (t, 3H, J=7,5, &sub3;), 1,18-1,40 (br, 10H, Methylenhülle), 1,48-1,67 (bm, 6H, CH&sub3; &sub2;CH&sub2;OCH&sub2; &sub2;, &sub2;CH&sub2;COOH), 2,33 (t, 2H, 3=7,4, &sub2;COOH), 3,31-3,45 (bm, 4H, &sub2;O &sub2;), 10,37 (br, 1H, COO ); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 10,67, 22,94, 24,72, 26,19, 29,09, 29,22, 29,41, 29,74, 34,11, 70,88, 7 2,53, 179,69; m/z 231 (M+H).
- 2,0 g (17,5 mMol) 11-Bromundecansäure wurden einer Lösung von 1,7 g (30,2 mMol) Kaliumhydroxid in 20 ml 1-Butanol zugesetzt und die Lösung 5 h bei 40ºC gerührt. Nach Abkühlen wurde die Reaktionsmischung mit Äthylacetat und Wasser bei pH = 2 extrahiert. Die organische Phase wurde dann mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wurde durch Kieselerdesäulenchromatographie in 2-10 % Äthylacetat/Hexan/0,2 % Ameisensäure gereinigt, wobei 336 mg (17 %) 11-(1-Butoxy)-undecansäure erhalten wurden, Fp. 29-30,5ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 0,84-0,96 (t, 3H, 3=7,3, &sub3;), 1,18- 1,46 (bm, 14H, Methylenhülle), 1,47-1,68 (bm, 6H, &sub2;CH&sub2;OCH&sub2; &sub2;, &sub2;CH&sub2;COOH), 2,31 (t, 2H, &sub2;COOH), 3,32-3,46 (bin, 4H, &sub2;O &sub2;), 11,02 (br, 1H, COOH); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 14,02, 19,43, 24,74, 26,21, 29,11, 29,28, 29,35, 29,56, 29,64, 29,76, 31,85, 34,14, 70,63, 70,94, 179,82; m/z 259 (M+H).
- 420 mg (8,75 mMol) Natriumhydrid wurden zu 68 ml (1,17 Mol) Propargylalkohol bei 4ºC zugesetzt und 30 min bei 25ºC gerührt. 2 g (7,96 mMol) 10-Bromdecansäure wurden dieser Mischung zugesetzt und die Reaktionsmischung 48 h bei 98ºC gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser und Äthylacetat bei pH = 1 extrahiert. Nach Trocknen der organischen Phase über Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wurde durch Silikagelchromatographie in 7-10 % Äthylacetat/Hexan/0,3 % Ameisensäure und dann über einer zweiten Silikagelsäule in 1-2,5 % Äthylacetat/Benzol/0,3 % Ameisensäure gereinigt, wobei 245 mg (14 %) 10-(2-Propinoxy)-decansäure erhalten wurden, Fp. < 30ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,25-1,42 (br, 10H, Methylenhülle), 1,54-1,70 (bm, 4M, OCH&sub2; &sub2;, &sub2;CH&sub2;COOH), 2,35 (t, 2H, 3=7,4, &sub2;COOH), 2,43 (t, 1H, 3=2,3, HC=C), 3,52 (t, 2H, 3=6,8, O &sub2;), 4,14 (d, 2H, 3=2,5, C=C &sub2;O), 10,42 (br, 1H, COO ); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 24,68, 26,06, 29,04, 29,17, 29,35*, 29,46, 34,09, 57,95, 70,22, 74,09, 79,90, 180,02; m/z 227 (M+H).
- Die folgenden Beispiele illustrieren die antivirale Wirksamkeit dieser Fettsäureanalogonsubstrate gegen zwei Retroviren, nämlich HIV-1 und MoMLV.
- 12-(Methoxy)-dodecansäure (13-Oxymyristinsäure), 10-(Propoxy)-decansäure (11-Oxamyristinsäure), 5-(Octyloxy)-pentansäure (6-Oxamyristinsäure) und 11-(Äthylthio)- undecansäure (12-Thiamyristinsäure) wurden durch oben beschriebene Verfahren hergestellt. Gereinigte Analoga wurden durch TLC, Schmelzpunkt (wenn geeignet), ¹H-NMR, ¹³C-NMR und Massenspektroskopie charakterisiert.
- Die menschliche T-Lymphoidzellinie, H9, wurde von R.D. Gallo (NIH) geliefert und in RPMI-1640 Medium, ergänzt mit 10 % Rinderfötusserum, 100 IE/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin, gehalten. HIV-1- Stamm HxB2gptx [Fisher et al., Science 233, 655-659 (1986)] wurde von Kulturen von chronisch infizierten H9-Zellen erhalten [Popovic et al., Science 224, 497-500 (1984)], durch 0,2 um- Millipore-Filter filtriert und bei -90ºC gelagert. Der Titer des Virusvorrates wurde durch serielle Verdünnung unter Verwendung von Synzytiabildung und reverser Transkriptase-Aktivität (siehe unten) als Maß der Infektiosität in H9-Zellen bestimmt.
- Zellfreies HIV-1, bei einer Infektionsmultiplizität (m.o.i.) von 0,01 bis 0,001, wurde zu 10- H9-Zellen zugesetzt, die mit 2 g/ml Polybrene (Hexadimethrenbromid, Sigma) vorbehandelt worden waren. Nach 30 min Inkubation bei 37ºC zum Absorbieren des Virus wurden 4 x 10&sup5; virusbehandelte Zellen in 1 ml frischem Medium (plus 10 % Kalbfötusserum, Penicillin und Streptomycin) in jede Vertiefung einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen (Falcon) eingebracht und mit einem gleichen Volumen von analogonhaltigem serumfreien RPMI-1640-Medium gemischt. Medium enthaltend 5 % Serum, Antibiotika ± Analogon wurde an jedem anderen Tag ersetzt. Jedes der heteroatomsubstituierten Analoga wurde als eine 100 mM Vorratslösung in 100 % Äthanol hergestellt und vor Verdünnung im serumfreien RPMI-1640-Medium bei -90ºC gelagert. Die nach Verdünnung der verschiedenen Analoga im Medium erreichte maximale Endäthanolkonzentration betrug 0,1 %. Daher wurden nicht-infizierte und infizierte H9-Zellen, behandelt mit oder ohne 0,1 % Äthanol, als Kontrollen für jeden Versuch verwendet. Äthanol allein hatte keine demonstrierbaren Wirkungen.
- Ausgenommen des vorläufigen Screenings der verschiedenen (codierten) Analoga, das zweimal erfolgte, wurden alle anderen Tests mindestens dreimal durchgeführt. Proben wurden jedesmal, wenn der Test wiederholt wurde, doppelt getestet.
- Das Virus wurde unter Verwendung überstehender Lösungen von am Tag 8 (m.o.i. = 0,01) oder am Tag 10 (m.o.i. = 0,001) der Behandlung geernteten Zellen quantifiziert. Virionen wurden durch Ausfällung von Kulturüberständen mit einer Lösung von Polyäthylenglykol (30 % in 150 mM NaCl, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) konzentriert. Die Niederschläge wurden solubilisiert und die virusassoziierte reverse Transkriptase (RT)- Aktivität durch [³²P]TTP-Einbau unter Verwendung eines poly(rA)- oligo(dT)-Templats gemessen [Poiesz et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77, 7415-7419 (1980)]. Zellüberstände wurden auch auf virusspezifisches Antigen unter Verwendung eines p24 ELISA von Dupont (Wilmington, DE) getestet. Dieser Test kann sowenig wie 0,03 ng Antigen/ml nachweisen (Antigen = p24, das Strukturhauptnukleokapsidprotein von HIV-1 sowie sein Vorläufer, Pr55gag).
- Die Zahl von Synzytia in jeder Vertiefung wurde durch mikroskopische Prüfung an den Tagen 4 bis 6 (infizierte unbehandelte Kontrollkulturen), 8 und 10 (analogon- oder decanoatbehandelte Kulturen) bestimmt. Die mittlere Zahl von multikernhaltigen Zellen gezählt pro 10 Niederleistungs-Felder (low-power fields) (LPF = 40-fache Vergrößerung) wurde einer willkürlichen Synzytiaskala zugeordnet: 0 = < 1/LPF, 1+ = 1-4/LPF, 2+ = 5-7/LPF, 3+ = 8-10/LPF, 4+ = > 10/LPF. Durch diese Kriterien hatten nicht-infizierte Kontrollzellen Null Synzytia und infizierte unbehandelte H9-Zellen wurden übereinstimmend mit 4+ bewertet.
- Der LZ1-Titertest wurde für rasche histochemische Quantifizierung infektiöser Virusproduktion entwickelt. Kurz gesagt wurde die LZ1-Virus produzierende Zellinie von Sanes et al., EMBO J. 5, 3133-3142 (1986), von der ψ-2- Zellinie abgeleitet. ψ-2-Zellen sind NIH 3T3-Zellen, die einen stabil integrierten Verpackungsmutanten (pMOV-ψ-) von MoMLV enthalten. Dieser Mutant weist eine Deletion von 350 Nucleotiden zwischen der 5'-Donatorspleißstelle für env und das Initiatormethionincodon für pr65gag auf [Mann et al., Cell 33, 153-159 (1983)]. Die LZ1-Zellinie ist ein Subklon von ψ-2-Zellen, die mit pM-MuLV-SV-LacZ [Sanes et al., supra) und pSVTK NeoB cotransfiziert und dann auf G418 (Geneticin )-Antibiotikumresistenz und Produktion von defektem MoMLV enthaltend das E. coli β-Galaktosidase-Gen [Sanes et al., supra] selektiert wurden. Dag von LZ1-Zellen produzierte rekombinante Virus ist zur primären Infektion von NIH 3T3-Zellen imstande, aber replikationsdefekt [Sanes et a1., supra]. Infizierte NIH 3T3 enthaltend das lac-Z-Gen können durch histochemische Anfärbung auf β- Galaktosidase-Aktivität identifiziert werden.
- Um die Wirkungen von Analogonbehandlung auf MoMLV-Replikation festzustellen, wurden 1 x 10&sup5; LZ1 produzierende Zellen in jede Vertiefung einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen in 1 ml Dulbecco's Modified Eagle-Medium (DME) enthaltend Kälberserum (Endkonzentration = 10 %), Penicillin (100 IE/ml), Streptomycin (100 ug/ml) mit oder ohne Analogon (10 bis 100 uM) eingebracht. Nach 24 h wurde das Medium entfernt und frisches serumhaltiges Medium ± Analogon wurde zugesetzt. Am nächsten Tag (48 h nach Plattierung) wurde der virushaltige Überstand entfernt und durch ein 0,2 um Filter geleitet. Aliquote Mengen verschiedener Größe (25 bis 100 ul des 1 ml-Filtrats) wurden zu 1 x 1&sup4; NIH 3T3-Zellen enthalten in 1 ml DME/10 % Kälberserum/Penicillin/Streptomycin zugesetzt. Diese Indikatorzellen waren 24 h vorher in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen plattiert worden. Polybrene (Sigma) wurde gleichzeitig wie das Filtrat zugesetzt, so daß dessen Endkonzentration 10 ug/ml betrug. 2 Tage nach Infektion wurden die NIH 3T3-Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und 5 min bei -25ºC in einer Lösung enthaltend PBS, Formaldehyd (2 %) und Glutaraldehyd (2 %) fixiert. Danach wurden die Zellen in PBS (zweimal bei 25ºC) gewaschen und auf β-Galaktosidase-Aktivität durch Inkubation mit einer Mischung, die 4-Chlor-5-brom-3-indoyl-β-galaktosidase (X- Gal, 1 mg/ml, wie von Sanes et al., supra), Kaliumeisen(III)- cyanid (5 mM), Kaliumeisen(II)-cyanid (5 mM) und MgCl&sub2; in PBS enthielt, angefärbt. Die histochemische Reaktionsmischung wurde 6 bis 14 h bei 37ºC mit Zellen inkubiert. Die Gesamtzahl von galaktosidasepositiven blauen Zellen/Vertiefung wurde dann unter Verwendung eines Präpariermikroskops bestimmt. Versuche wurden dreimal wiederholt, wobei jedes Mal Doppeltests durchgeführt wurden. Die nach Analogonbehandlung erhaltenen Ergebnisse wurden mit Ergebnissen verglichen, die mit Zellen erhalten wurden, welche keine Zusätze zum Kulturmedium oder Athanol (Endkonzentration = 0,1 %) allein erhielten.
- Diese Analysen wurden für beide Testsysteme durchgeführt. Das Zellüberleben wurde durch Trypanblauausschluß bestimmt. Die Zahl von ungefärbten Zellen/ml in den behandelten Kulturen wurde durch die Zahl von ungefärbten Zellen/ml in den unbehandelten Kontrollkulturen dividiert und als % Kontrolle ausgedrückt. Proteinsynthese wurde am Ende der Behandlungszeiträume durch metabolisches Markieren während 4 h mit L-[4,5³H(N)]-Leucin ((74 kBq/ml (2 uCi/ml) Medium, spezifische Aktivität = 5180 GBq/mMol (140 Ci/mMol)] gemessen. Alle in einer bestimmten Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen enthaltenen Zellen wurden durch Kratzen gewonnen, das Protein durch TCA ausgefällt (Endkonzentration = 10 %) und die Lösung danach vor Leiten über Glasfaserfilter (Whatman) 5 min bei 100ºC inkubiert. Im Fall des H-9-Tests wurden behandelte oder unbehandelte Zellen am Ende der 10 Tage dauernden Inkubation impulsmarkiert. Für den MoMLV-Test wurden Markierungsstudien an LZ1-Virus produzierenden Zellen am Ende der 2 Tage dauernden Behandlungsperiode durchgeführt. Ein zusätzlicher Kontrollversuch wurde an NIH 3T3-Zellen durchgeführt, die niemals dem Virus ausgesetzt worden waren, die aber 2 Tage mit Medium (± Analogon) inkubiert worden waren. DNA-Synthese wurde am Tag 10 des H9- Tests geprüft. Zellen wurden 12 h lang mit [5'-³H]Thymidin [18,5 kBq/ml (0,5 uCi/ml), spezifische Aktivität = 74 GBq/mMol (2 Ci/mMol)] markiert. Alle Zellen in einer Vertiefung wurden durch Kratzen geerntet, ihre Nukleinsäure mit TCA ausgefällt (Endkonzentration = 10 %) und dann vor dem Zählen auf Glasfaserfiltern gesammelt.
- Eine Gruppe von sauerstoff- und schwefelsubstituierten Myristatanaloga wurde in einem Doppelblindversuch auf ihre Fähigkeit, HIV-1-Produktion durch die CD4+ H-9-menschliche T-Lymphoidzellinie zu affizieren, gescreent [Popovic et al., Science 224, 497-500 (1984)]. Zellen wurden dem Virus ausgesetzt, wie oben beschrieben, und Analogon (1 bis 100 uM) 1/2 bis 1 h später zugesetzt. Kalbfötusserum ± Analogon enthaltendes Medium wurde an jedem anderen Tag während eines Zeitraumes von 10 Tagen ersetzt. Am Ende des Behandlungszeitraumes wurde Virusreplikation durch Messen von reverser Transkriptase-Aktivität festgestellt.
- Die Ergebnisse des Doppelblind-Arzneimittelscreenings sind in Fig. 1A angegeben. Bei Vergleich mit mit Medium allein, Medium plus Äthanol (0,1 %) oder Medium enthaltend Decansäure behandelten Kulturen ist ersichtlich, daß jedes der vier Analoga HIV-1-Produktion reduzierte, obwohl mit unterschiedlicher Effizienz. 6-Oxamyristat war das am wenigsten wirksame. Keine Verminderung von reverser Transkriptase-Aktivität (im Vergleich mit mit oder ohne 0,1 % Äthanol behandelten Kontrollkulturen) wurde nach einer 10-tägigen Inkubation bei Analogonkonzentrationen von 1 bis 10 uM festgestellt. Jedoch verminderten 100 uM 6-Oxamyristat reverse Transkriptase (RT)-Aktivität auf 20 % der Kontrolle. Ausgeprägtere Wirkungen wurden mit 1 bis 10 uM 11- Oxamyristat und 13-Oxamyristat sowie 12-Thiamyristat festgestellt. 13-Oxamyristat schien die stärksten Wirkungen zu haben - Verminderung der reversen Transkriptase-Aktivität auf 20 % der Kontrolle bei 10 uM und < 10 % der Kontrolle bei 100 uM. Dieser Inhibierungsgrad war ähnlich dem mit 5 uM Azidothymidin (AZT) erhaltenen, das Virusreplikation um mehr als 90 % im "akuten" H9-Test inhibierte. Im Gegensatz dazu verminderten 100 uM Decansäure RT-Aktivität nur auf 80 % der Kontrolle.
- Die Wirkung von 13-Oxamyristinsäure auf HIV-1-Replikation wurde weiter untersucht. Eine dosisabhängige Reduktion der reversen Transkriptase-Aktivität wurde von 0,1 uM bis 100 uM festgestellt (Fig. 1B). Als die Menge von Viruskapsidantigen (p24) gleichzeitig unter Anwendung eines ELISA-Tests gemessen wurde, wurde außerdem eine ähnliche Dosis-Reaktion erhalten, die mit den Ergebnissen des reversen Transkriptase-Tests eng korreliert (siehe Einschaltung in Fig. 1B). In beiden Fällen zeigte 13-Oxamyristat mehr als 90 % Verminderung der Virusreplikation im Bereich von 20 bis 40 uM Synzytiareduktion entsprach den Ergebnissen des reversen Transkriptase- und p24-ELISA-Tests (Fig. 1C). Die Wirkung von 13-Oxymyristat auf die Synzytiabildung reflektiert wahrscheinlich eine Verminderung der Ausbreitung und Zytopathizität von HIV-1 in diesem Kultursystem. Die Verminderung von Synzytia durch 40 bis 80 uM 13-Oxamyristat war vergleichbar mit jener, die mit 5 uM AZT erhalten wurde, während Decansäure oder 0,1 % Äthanol allein im Vergleich mit infizierten, unbehandelten H9-Kontrollen keine Wirkung auf die Synzytiazahl hatte (Fig. 1C, andere Daten nicht gezeigt).
- Die zelluläre Toxizität von 13-Oxamyristat wurde unter Anwendung von drei unabhängigen Zellebensfähigkeitstests analysiert. Zunächst wurde die Zahl lebensfähiger Zellen am Ende des 10 Tage dauernden Behandlungszeitraumes unter Anwendung von Typanblauausschluß bestimmt. Der Prozentsatz lebender Zellen in unbehandelten, HIV-1-infizierten Kulturen wurde um 50 % im Vergleich mit jenem von unbehandelten, nicht-infizierten Zellen vermindert (Fig. 1D). Dies zeigt die zytopathischen Wirkungen, auf die man mit diesem Stamm von HIV-1 trifft [Ratner et al., Nature 313, 277-284 (1985)]. Wenn 13-Oxamyristat den infizierten H9-Kulturen zugesetzt wurde, wurde eine Erhöhung der Zahl lebensfähiger Zellen festgestellt. 20 bis 40 uM Analogon ergaben Zellzahlen, die jenen von unbehandelten Kontrollen äquivalent waren. Diese "Normalisierung" der Zahl lebensfähiger Zellen spiegelt auch die Verminderung des produzierten infektiösen Virus wieder: wie Virusreplikation inhibiert wird, so ist das Ausmaß von zytopathischen Wirkungen. Diese Feststellung legte auch nahe, daß das Analogon für die Zellen nicht direkt toxisch war. Um diese Hypothese weiter zu untersuchen, wurden die Wirkungen zunehmender Konzentrationen des Analogons auf DNA- und Proteinsynthese bestimmt. Die Ergebnisse von [³H]Leucin- und [³H]Thymidininarkierung korrelierten mit den Zellüberlebensdaten (Fig. 1D). In getrennten metabolischen Markierungsversuchen unter Verwendung nicht-infizierter H9-Zellen hatten 0,1 bis 100 uM 13-Oxamyristat keine signifikanten Wirkungen auf Wachstumsraten oder Protein- oder DNA-Syntheseraten. Miteinander zeigten diese Ergebnisse, daß die festgestellten Wirkungen von 13- Oxamyristat auf HIV-1-Replikation wahrscheinlich nicht auf nicht-spezifische, schädliche Änderungen im Zellmetabolismus zurückzuführen waren.
- Zwei Analoga wurden in diesem Test geprüft: 6-Oxamyristinsäure, die die am wenigsten wirksame der im HIV-1-Replikationstest getesteten vier Verbindungen war, und 13-Oxamyristinsäure, die die wirksamste war. Ein neues Testsystem wurde entwickelt, um die Wirkungen dieser Verbindungen auf MoMLV-Replikation festzustellen. Die Einzelheiten des Systems sind oben beschrieben und in Fig. 2A illustriert. Das LZ1-Virus ist ein Derivat von MoMLV, das in der Replikation defekt ist. Wenn die Infektion einmal erfolgt ist, wird die Virusvermehrung blockiert und das Provirus auf die Nachkommen der anfänglich infizierten Zelle beschränkt. Das Virus trägt auch das E. coli LacZ-Gen, das einen quantitativen Marker von infektiöser Virusproduktion vorsieht. Im hier eingeführten MoMLV-Testsystem werden LZ1-Virus produzierende Zellen 2 Tage mit den verschiedenen Analoga behandelt. NIH 3T3- Zellen werden dann aliquoten Mengen des von LZ1-Virus produzierenden Zellen geernteten filtrierten Mediums ausgesetzt und die resultierenden Foci durch histochemische Anfärbung auf β- Galaktosidase identifiziert. Die Wirkung von Arzneimitteln auf Virusreplikation kann durch Vergleichen der Zahl von Foci (blaue Zellen), die von Filtraten produziert werden, welche aus behandelten Kulturen hergestellt wurden, mit der von unbehandelten Kontrollen produzierten bestimmt werden. Wie in Fig. 2B gezeigt, hatte 13-Oxamyristat keine Wirkung auf Virusreplikation in Konzentrationen bis zu 100 uM. Im Gegensatz dazu inhibiert 6-Oxamyristat, das auf HIV-1-Replikation keine Wirkung hatte, MoMLV- Replikation auf konzentrationsabhängige Weise: eine 40 %ige Verminderung wurde bei 10 uM festgestellt, während 100 uM eine mittlere Verminderung der Virustiter von > 60 % bewirkten. Äthanol (0,1 %) und Decansäure (10 bis 100 uM) bewirkten keine signifikanten Verminderungen im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen.
- Toxizitätsstudien analog den für das HIV-1-Testsystem beschriebenen wurden durchgeführt. Die Zahl von lebensfähigen LZ1- Virus produzierenden Zellen sowie der NIH 3T3-"Reporter" zeigte < 20 % Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen und unbehandelten Kontrollen (Fig. 2C; andere Daten nicht gezeigt). Impulsmarkierungsstudien mit [³H]Leucin zeigten eine 10 bis 40 %ige Verminderung der Proteinsynthese in behandelten LZ1- Zellen im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen (Fig. 2D). Jedoch war diese Verminderung wahrscheinlich nicht-spezifisch, da es keine signifikanten Unterschiede zwischen mit Analoga, 0,1 % Äthanol oder 10 bis 100 uM Decansäure behandelten Zellen gab. [³H]Leucin-Markierungsversuche von NIH 3T3-Zellen, die 2 Tage mit Analogon behandelt wurden, zeigten keine signifikanten (< 10 %) Unterschiede im Vergleich mit Kontrollzellen.
- Die hier beschriebenen antiretroviralen Mittel können zur Verabreichung an mit Retroviren infizierte Säugerwirte auf herkömmliche Weise, vorzugsweise in Formulierungen mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln und Trägern, verwendet werden. Die zu verabreichende Menge des aktiven Mittels muß eine wirksame Menge sein, d.h. eine Menge, die medizinisch vorteilhaft ist, aber keine toxischen Wirkungen zeigt, die die Vorteile, die seine Verwendung begleiten, überwiegen. Es wäre zu erwarten, daß die Dosierung für einen erwachsenen Menschen gewöhnlich bis zu etwa 1 mg der aktiven Verbindung beträgt. Ein geeigneter Verabreichungsweg ist oral in Form von Kapseln, Tabletten, Sirupen oder Elixieren, obwohl auch parenterale Verabreichung angewandt werden kann. Geeignete Formulierungen der aktiven Verbindung in pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln und Trägern in therapeutischer Dosierungsform können an Hand allgemeiner Texte auf diesem Gebiet, wie beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, Herausg. Arthur Osol, 16. Aufl., 1980, Mack Publishing Co., Easton, PA, hergestellt werden.
- Standardaminosäureabkürzungen werden nachstehend verwendet, um die Sequenz der Peptide hier wie folgt zu identifizieren: Aminosäure Abkürzung L-Alanin L-Arginin L-Asparagin L-Asparaginsäure L-Glutamin L-Glycin L- Leucin L-Lysin L-Prolin L-Serin L-Tyrosin L-Valin
Claims (12)
1. Oxy- oder thiosubstituiertes Fettsäureanalogonsubstrat
von myristylierenden Enzymen ausgewählt aus C&sub1;&sub3;- und
C&sub1;&sub4;-Fettsäuren oder Alkylestern hievon, in dem eine gewöhnlich in einer
Kohlenstoffstellung von 4 bis 13 befindliche Methylengruppe
durch Sauerstoff oder Schwefel ersetzt ist, zur Verwendung bei
der Behandlung von Retrovirusinfektionen.
2. Oxy- oder thiosubstituiertes Fettsäureanalogon nach
Anspruch 1, in dem eine Methylengruppe durch Sauerstoff ersetzt
ist, zur Verwendung bei der Behandlung von
Retrovirusinfektionen.
3. Oxy- oder thiosubstituiertes Fettsäureanalogon nach
Anspruch 1, in dem eine Methylengruppe durch Schwefel ersetzt ist,
zur Verwendung bei der Behandlung von Retrovirusinfektionen.
4. Oxy- oder thiosubstituiertes Fettsäureanalogon nach
einem der Ansprüche 2 und 3, wobei die Fettsäure im Analogon
eine gesättigte C&sub1;&sub3;- oder C&sub1;&sub4;-Fettsäure ist, zur Verwendung bei
der Behandlung von Retrovirussinfektionen.
5. 12-(Methoxy)-dodecansäure zur Verwendung bei der
Behandlung von Retrovirusinfektionen
6. 5 -(Octyloxy)-pentansäure zur Verwendung bei der
Behandlung von Retrovirusinfektionen.
7. Oxy- oder thiosubstituiertes Fettsäureanalogon nach
einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung bei der Behandlung
von HIV-1-Infektionen.
8. Oxy- oder thiosubstituiertes Fettsäureanalogon nach
einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung bei der Behandlung
von MoMLV-Infektionen.
9. Verwendung eines oxy- oder thiosubstituierten
Fettsäureanalogonsubstrats von myristylierenden Enzymen ausgewählt
aus C&sub1;&sub3;- und C&sub1;&sub4;-Fettsäuren oder Alkylestern hievon, in dem eine
gewöhnlich in einer Kohlenstoffstellung von 4 bis 13 befindliche
Methylengruppe durch Sauerstoff oder Schwefel ersetzt ist, zur
Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von
Retrovirusinfektionen.
10. Verwendung nach Anspruch 9 eines oxy- oder
thiosubstituierten Analogons einer gesättigten C&sub1;&sub3;- oder C&sub1;&sub4;-Fettsäure.
11. Verwendung nach Anspruch 9 von 12-(Methoxy)-dodecansäure
oder 5-(Octyloxy)-pentansäure.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 eines oxy-
oder thiosubstituierten Fettsäureanalogons, wobei das Medikament
der Behandlung von HIV-1- oder MoMLV-Infektionen dient.
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