DE68928549T3 - Tiermodell für menschliche krankheit - Google Patents

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Tiermodell für eine humane neoplastische Erkrankung. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Tiermodell mit neoplastischem Gewebe, welches aus einem menschlichen Organ, das in das entsprechende Organ des Tieres implantiert wurde, gewonnen wurde.
• Es besteht seit langem ein Bedarf an einem repräsentativen Tiermodell für humane neoplastische Erkrankungen. Ein solches Modell könnte vielen Zwecken dienen. Zum Beispiel könnte es verwendet werden, um den Fortschritt einer neoplastischen Erkrankung in Menschen zu studieren, und könnte dazu beizutragen, die geeigneten Behandlungsformen herauszufinden. Ein solches Modell könnte auch zur Untersuchung der Wirksamkeit von vorgeschlagenen neuen anti-neoplastischen Mitteln eingesetzt werden. Weiters könnte es bei individualisierten Chemosensitivitätstests von Tumoren eines Krebspatienten verwendet werden. Das Vorliegen eines solchen Tiermodells würde das Sichten der Arzneimittel sowie deren Untersuchung und Bewertung wesentlich wirksamer und weniger kostenintensiv gestalten.
• Einige vorhergehende Versuche bei der Schaffung von Tiermodellen für humane neoplastische Erkrankungen verwendeten transplantierbare tierische Tumore. Diese waren Tumore, die sich in Nagetieren entwickelt hatten und von Tier zu Tier, insbesondere in Inzuchtpopulationen, transplantiert worden waren. Andere tierische Tumormodelle wurden dadurch geschaffen, daß in den Tieren mit Hilfe verschiedener Mittel, die zumindest in dem tierischen System karzinogen waren, Tumore hervorgerufen wurden. Noch andere tierische Tumormodelle waren Nagetiere, die spontan auftretende Tumore enthielten. Diese Nagetiermodelle antworteten jedoch häufig auf chemotherapeutische Mittel sehr unterschiedlich im Vergleich zu menschlichen Patienten, die das gleiche Mittel erhielten.
• Ein anderes tierisches Tumormodell, das sich seit etwa 20 Jahren entwickelt hatte, verwendete Mäuse, die keinen Thymus haben. Diese Tiere waren zellulär defizient und hatten daher ihre Fähigkeit, transplantiertes Fremdgewebe abzustoßen, verloren. Aus nicht ganz geklärten Ursachen fehlten den Mäusen im wesentlichen die Haare und so kam es, daß sie "nackte" oder "athymische" Mäuse genannt wurden.
• Es zeigte sich, daß menschliche Tumore oft nach subcutaner Implantation unter der Haut dieser nackten Mäuse wuchsen. Jedoch hing die Aufnahmerate oder die Häufigkeit, mit welcher ein solches humanes Tumorgewebe tatsächlich einen Tumor in der Maus bildete, von dem individuellen Donor und der Tumorart ab. Bei diesen Modellen wuchsen Tumore, die angenommen wurden, oft in großem Ausmaß an der Stelle der Implantation und metastasierten nur selten, selbst wenn der ursprüngliche Tumor in dem Donor hochgradig metastasierend war. Demzufolge hatte das subcutane nackte Maus-Tumormodell; obwohl es besser war, als das vorher beschriebene Nagetiermodell, dennoch einen deutlichen Nachteil, d. h. dem subcutanen Transplantat fehlte die Fähigkeit der Metastasierung.
• Naito et al., Cancer Research 46, 4109 bis 4115 (1986), Wang et al., Experimental Cel Biology, 50, 330 bis 331 (1982) und Ovejera et al., Seminars in Oncology, 8, 386 bis 393 (1981) offenbaren die Implantation von disaggregiertem humanem neoplastischem Gewebe in der Form von Zellsuspensionen in Tiermodellen.
• Um den Bedarf an einem Tiermodell für eine humane neoplastische Erkrankung zu erfüllen, ohne daß die oben genannten Nachteile auftreten, offenbart die vorliegende Erfindung ein neues Tiermodell, welches die Fähigkeit zur genauen Nachahmung des Fortschritts der neoplastischen Erkrankung, wie sie in Menschen auftritt, aufweist.
ZUSAMMENFASSUNG UND ZIEL DER ERFINDUNG
• Es ist ein erstes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Tiermodell für eine humane neoplastische Erkrankung zur Verfügung zu stellen.
• Übereinstimmend mit der vorliegenden Erfindung wird ein neues Tiermodell für eine humane neoplastische Erkrankung zur Verfügung gestellt, bei welchem neoplastisches Gewebe, das aus einem menschlichen Organ wie in Anspruch 1 gewonnen wurde, in das entsprechende Organ des Tieres implantiert wird und bei welchem eine ausreichende Immundefizienz auftritt, um dem implantierten Gewebe Wachstum und Metastasierung zu gestatten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
• Das Tiermodell gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch Implantierung von humanem neoplastischem Gewebe in ein Laboratoriumstier mit ausreichender Immundefizienz, um dem implantierten Gewebe Wachstum und Metastasierung zu erlauben, gebildet. Ein besonders geeignetes Laboratoriumstier zur Verwendung hierin ist ein Stamm von Mäusen, der keine T-Zell-Immunität aufweist. Diese Mäuse, die allgemein als nackte Mäuse oder athymische Mäuse bezeichnet werden, sind leicht erhältlich und können im Handel von den Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, Massachusetts (Katalogbezeichnung: Crl:nu/nu(CD-I)BR, homozygot, 28-42 Tage alt) erhalten werden.
• Die Einbringung des neoplastischen Gewebes in ein immundefizientes Laboratoriumstier gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch orthotopische Implantierung vorgenommen. Das bedeutet, daß ein Implantat oder eine Transplantat an einer Stelle eingebracht wird, die vorher von Gewebe der gleichen Art eingenommen wurde. Bei der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck orthotopische Implantierung verwendet, um die Transplantation von humanem neoplastischem Tumorgewebe aus einem menschlichen Organ in das entsprechende Organ eines immundefizienten Laboratoriumstiers zu bezeichnen. Das hiebei verwendete humane neoplastische Gewebe umfaßt Gewebe von chirurgisch frisch entnommenen Proben, die pathologisch diagnostizierte Tumore darstellen,
• in humaner Niere, Leber, Magen, Pancreas, Dickdarm, Brust, Prostata, Lunge und Hoden vorkommen. Solche Tumore inkludieren Karzinome ebenso wie Sarkome und die hierin durchgeführte Implantierung derselben umfaßt alle Stadien, Grade und Arten von Tumoren.
• Vor der Implantierung wird das humane neoplastische Gewebe instandgehalten, indem es in ein geeignetes Nährmedium, wie etwa Eagle's Minimum Essential Medium, das 10 Prozent fetales Kalbsserum und ein geeignetes Antibiotikum, wie etwa Gentamycin, enthält, eingelegt wird. Das das Gewebe enthaltende Medium wird dann auf etwa 4 Grad C abgekühlt. Das Gewebe kann auf diese Weise etwa 24 Stunden instandgehalten werden.
• Eine ausgewählte Gewebesprobe wird zur Implantierung vorbereitet, indem sie zu einer Masse geeigneter Größe zur Einbringung in einen geeignet vorbereiteten Hohlraum in dem ausgewählten Organ geformt wird. Die Probengröße kann von etwa 0,1 · 0,5 cm bis etwa 0,2 · 0,6 cm variieren. Die zur Herstellung einer Probe geeigneter Größe verwendete Technik umfaßt ein Zerzupfen des Gewebes auf entsprechende Größe durch Zerreißen in Stücke der gewünschten Größe mit einer Pinzette oder dergleichen.
• Mikrochirurgische Instrumente, die in der Regel zur Durchführung einer Gewebeimplantation gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, inkludieren einen Castrovijeo-Nadelhalter, eine Juwelierspinzette (gerade oder gekrümmt), eine Iris-Pinzette, Tris-Scheren und gerade und gekrümmte Gewebepinzetten, inklusive jeweils einer solchen mit Zähnen und einer ohne Zähne.
• Vor der Implantierung des neoplastischen Gewebes wird das ausgewählte immundefiziente Tier mit einem geeigneten Anästhetikum narkotisiert. Die Implantation aller Organgewebe, die hierin erwähnt wurden, mit Ausnahme von Lungengewebe, erfolgt üblicherweise unter konventioneller Narkose, bei welcher Ethylether verwendet wird. Wenn Lungengewebe implantiert wird, wird Pentobarbital als Anästhetikum verwendet.
• Die Implantierung von Gewebe aus einem Hepatom oder einem Tumor einer menschlichen Leber wird durchgeführt, indem der Caudallappen der Leber des Empfängertieres als Implantationsstelle verwendet wird. Mehrere lose Nähte werden über den Lappen hinweg angebracht und es wird ein Längseinschnitt vorgenommen, um eine Tumormasse der Größe etwa 0,2 · 0,5 cm unterzubringen. Nach der Einbringung des Tumors in den Einschnitt werden die Nähte ordentlich über den Tumor gezogen, um ihn an Ort und Stelle festzuhalten.
• Der Vorgang der Implantation des Gewebes aus einem humanen Pancreastumor wird so durchgeführt, daß ein Einschnitt in die Bauchspeicheldrüse des Empfängertieres am Kopf des Organes nahe dem Zwölflingerdarm vorgenommen wird. Man muß sorgfältig sein, um einen gefäßfreien Bereich auszuwählen. Es wird ein Einschnitt in dem ausgewählten Bereich vorgenommen und eine Tumormasse von etwa 0,5 · 0,2 cm wird in identischer Weise, wie sie im vorhergehenden Absatz beschrieben wurde, implantiert. Es kann Gewebe aus allen Stadien und allen Graden von Pancreaskarzenom auf diese Weise implantiert werden.
• Die-Implantation von Gewebe aus einem humanen Brustkarzinom wird durch chirurgische Errichtung einer Tasche in der Brust des weiblichen Empfängertieres durchgeführt. Die Tasche reicht vorzugsweise aus, um eine Tumormasse von der Größe etwa 0,2 · 0,5 cm unterzubringen. Nach Einbringung des Tumors in die Tasche wird diese durch eine Naht geschlossen. Es können alle Stadien und Grade von Brustkarzinom auf diese Weise implantiert werden.
• Die Implantation von Gewebe aus einem humanen Prostatakarzinom in die Prostata des Empfängertieres wird durch chirurgische Errichtung einer Öffnung in der Prostata und anschließende Einbringung der Gewebeprobe von der Größe etwa 0,2 · 0,3 cm in diesen Raum vorgenommen. Nach der Einbringung der Gewebeprobe wird die Öffnung mit geeigneten Nähten geschlossen. Es werden zwei zusätzliche Nähte am Hals der Prostata angebracht, sodaß das implantierte Gewebe nicht von seiner ursprünglichen Stelle wegwandern kann.
• Die Implantation von Gewebe aus einem humanen Hodenkarzinom in den Hoden eines Empfängertieres wird so vorgenommen, daß der Hoden entlang seiner Längsachse mit einer Nadel der Größe Nr. 18 penetriert und eine Tumormasse von der Größe etwa 0,1 · 0,5 cm durch die Nadel injiziert wird. Wenn das Ende der Tumorprobe gleichzeitig mit der Nadel sichtbar wird, wird die Nadel vorsichtig zurückgezogen, wobei das sichtbare Tumorgewebe mit einer Pinzette an Ort und Stelle gehalten wird. Das von der Nadel hervorgerufene Loch wird dann mit einer einzigen Naht verschlossen.
• Bei der Vorbereitung zur Implantation von neoplastischem Lungengewebe in die Lungen des Empfängertieres wird eine Tracheotomie vorgenommen und ein elastisches Rohr wird intubiert. Anschließend kann jedes der beiden folgenden Implantierungsverfahren verwendet werden:
• (1) das Tracheotomierohr wird vorgeschoben, um einen der beiden Lungenlappen zu erreichen; eine kleine längliche Tumormasse (2 · 6 mm) wird durch das Rohr injiziert; und dann wird das Rohr herausgezogen und die Trachealwunde mit einer Naht verschlossen; oder
• (2) vorsorglich wird ein Röhrchen in die Trachea eingesetzt; es wird eine kleine Stichwunde in der rechten Brust gemacht, um einen Lappen der rechten Lunge zu erfassen, der den Thoraxhohlraum verlegt, wodurch ein Kollabieren der Lunge verhindert wird; der Lungenlappen wird vorsichtig an der Basis festgeklemmt und zwei Ligaturen werden lose an der Lunge angebracht; es erfolgt ein Einschnitt in der Lunge, ein Tumor von etwa 0,2 · 0,5 cm wird darin eingebettet und die Ligaturen werden sorgfältig zugezogen; der Lungenlappen wird in den Thoraxhohlraum zurückgedrückt und dann die Wunde verschlossen.
• Gewebe aus allen Stadien und Graden des Kleinzellen- und Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinoms können nach jeder oben beschriebenen Maßnahme implantiert werden.
• Die Tiermodelle gemäß der vorliegenden Erfindung sind besonders zum Studium des Fortschritts einer humanen neoplastischen Erkrankung geeignet. Diese Untersuchungen in Kombination mit anderen klinischen Untersuchungsmodalitäten, wie etwa diagnostischer Bilddarstellung, helfen bei der Auswahl der geeignetsten Behandlungsform.
• Wenn zum Beispiel ein Tiermodell gemäß der vorliegenden Erfindung einer Tumorabbildung unterzogen wird, kann der Arzt sowohl die primären als auch die sekundären Stellen des Tumorwachstums identifizieren und die Allgemeinbelastung des Tumors für das Tier abschätzen. Tumordarstellung erfolgt üblicherweise dadurch, daß dem Tier ein gekennzeichneter Anti-Tumor-Antikörper injiziert wird, wie etwa ein mit einem radioaktiven Isotop markierter Antikörper; daß dem Antikörper Zeit gelassen wird, um sich innerhalb des Tumors zu lokalisieren; und daß dann das Tier unter Verwendung eines Strahlendedektors gescannt wird. Wenn ein Computer verwendet wird, um ein Bild der in dem Körper des Tiers festgestellten Radioaktivität zu erfassen, kann der Computer das Bild je nach der Intensität der Strahlung farbmäßig codieren. Bereiche mit hoher Radioaktivität in Regionen des Körpers, in denen nicht erwartet wurde, daß sie den Antikörper oder seine Metabolite anreichern, deuten auf die mögliche Anwesenheit von Tumoren.
• Die Tierniodelle gemäß der vorliegenden Erfindung können auch dazu verwendet werden, um neue anti-neoplastische Mittel auszusuchen und die Fähigkeit solcher Mittel zur Beeinflussung von Tumoren an der primären Stelle und auch an entlegenen metastatischen Stellen oder zur Verhinderung der Bildung entfernt gelegener Metastasen festzustellen. Die Modelle werden auch zur individualisierten Chemosensitivitätstestung der Tumore eines Krebspatienten verwendbar sein.
• Zusätzlich dazu sind die erfindungsgemäßen Tiermodelle zum Studium der Wirkungen der Mitrution auf den Fortschritt einer humanen neoplastischen Erkrankung zu verwenden. Diese Untersuchungen können im Hinblick auf die gezeigte Wirkung verschiedener Mängel auf gesunde Personen besonders wichtig sein.
BEISPIEL I
• Frische chirurgische Gewebesproben aus einem Tumor, der aus einer menschlichen Niere entnommen wurde, wurden in die Nieren von fünf Empfängertieren transplantiert. Die Gewebeproben, die pathologisch als Renalzellkarzinom diagnostiziert waren, wurden durch das oben beschriebene Zerreißverfahren in ihrer Größe vorbereitet.
• Fünf athymische nackte Mäuse im Alter von vier (4) bis sechs (6) Wochen wurden für die Implantate als Empfängertiere ausgewählt. Bei der Vorbereitung für den chirurgischen Eingriff wurden die Mäuse mit Ether narkotisiert. Es folgte ein Einschnitt in jedes Tier, um die Niere zu erreichen. Es wurde ein keilförmiger Hohlraum durch Entnahme des Renalcortex jeder Empfängerniere gebildet und eine Masse von Tumorgewebe der Größe von etwa 0,5 · 0,2 cm wurde in den ausgenommenen Hohlraum eingebracht. Zur Fixierung des Implantats an Ort und Stelle wurde dann eine Matratzennaht verwendet.
• Die fünf Mäuse dieses Beispiels lebten sechs Monate später immer noch. Etwa ein Monat nach der Implantierung des Gewebes wurden die Mäuse chirurgisch geöffnet und die implantierten Tumore wurden beobachtet. In jedem Fall zeigte es sich, daß der Tumor angenommen worden war. Das bedeutet, daß das implantierte neoplastische Gewebe das benachbarte Gewebe infiltriert hatte. Es wurden histologische Untersuchungen an den Gewebe-Implantaten zu diesem Zeitpunkt vorgenommen. Bei solchen Analysen wurden Gewebeproben aus jedem Tier entnommen und die Proben mit einer Gewebeprobe des Gewebespenders verglichen.
• Die Vorbereitung der Gewebeproben für die histologischen Analysen erfolgte durch (1) Fixierung der Probe in Formalin; (2) Einbetten der fixierten Probe in Paraffin; (3) Herstellung von Schnitten mit 5 Mikron der fixierten eingebetteten Probe; (4) Färben der Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin; und (5) mikroskopische Betrachtung der Gewebestruktur in jedem Schnitt.
• Die histologische Analyse zeigte, daß das Gewebe in den Empfängertieren (1) seinen Aufbau und den Gewebetyp beibehielt und (2) den Fortschritt der Erkrankung wie in dem humanen Spender gleichermaßen durchführte.
BEISPIEL II
• Proben von humanem Gewebe, das aus dem Magen entnommen und pathologisch als Magenkarzinom diagnostiziert worden war, wurden durch das oben beschriebene Zerreißverfahren in entsprechender Größe hergestellt.
• Fünf athymische nackte Mäuse im Alter von vier (4) bis sechs (6) Wochen wurden als Empfängertiere für die Implantate ausgewählt. Bei der Vorbereitung des chirurgischen Eingriffs wurden die Mäuse mit Ether narkotisiert.
• Jede narkotisierte Maus wurde geöffnet, um einen Zugang zum Magen zu schaffen. Es erfolgte ein Einschnitt in die Magenwand unter Verwendung eines Skalpells Nr. 11, wobei vorsichtig gearbeitet wurde, um die Schleimhautschicht nicht zu durchdringen. Es wurde eine Tasche von ausreichender Größe gebildet, um eine Tumormasse von etwa 0,5 · 0,2 cm aufzunehmen. Ein Tumor von etwa dieser Größe wurde ausgewählt und in die Tasche eingesetzt und der Einschnitt wurde unter Verwendung einer 7-0 Naht geschlossen. Die fünf Mäuse dieses Beispiels überlebten etwa drei (3) bis vier (4) Monate und schienen im übrigen gesund zu sein. Eine anschließende chirurgische Öffnung des Magens dieser Mäuse zeigte, daß die Tumore angenommen worden waren.
BEISPIEL III
• Proben von humanem Gewebe, das aus einem humanen Dickdarm entnommen und pathologisch als Dickdarmkarzinom diagnostiziert worden war, wurden durch das oben beschriebene Zerreißverfahren in entsprechender Größe vorbereitet. Fünf athymische nackte Mäuse im Alter von vier (4) bis sechs (6) Wochen wurden als Empfängertiere für die Implantate ausgewählt. Bei der Vorbereitung des chirurgischen Eingriffs wurden die Mäuse mit Äther narkotisiert.
• Jede narkotisierte Maus wurde geöffnet, um einen Zugang zum Dickdarm zu schaffen. Eine Hohlraumtasche wurde chirurgisch in der seromuskulären Schichte gebildet, wobei vorsichtig gearbeitet wurde, um nicht in das Lumen einzudringen. Eine ausgewählte Tumormasse von etwa 0,5 · 0,2 cm wurde in die Tasche eingesetzt, die anschließend mit einer Naht geschlossen wurde.
• Vier der fünf Mäuse, an denen diese chirurgische Implantation vorgenommen worden war, überlebten drei bis vier Monate und schienen bei guter Gesundheit zu sein. Etwa ein Monat nach der Gewebe-Implantation wurden die Mäuse chirurgisch geöffnet und es zeigte sich, daß die Tumore angenommen worden waren. Keiner der Tumore schien zu diesem Zeitpunkt nicht zu anderen Organen metastasiert zu haben.
• Obwohl die obige Erfindung detailliert erläutert wurde und Beispiele für die Zwecke des besseren Verständnisses angegeben sind, ist es eindeutig, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der angeschlossenen Ansprüche vorgenommen werden können.

Claims (8)

1. Nicht-humanes Tiermodell für eine humane neoplastische Erkrankung, wobei dieses Tiermodell neoplastische Zellen, die aus einer humanen Leber, Niere,

Pankreas, Dickdarm, Brust, Prostata, Lunge oder Hoden erhalten wurden, in das entsprechende Organ des Tieres eingepflanzt enthält und eine ausreichende Immundefizienz hat, um dem implantierten neoplastischen Gewebe Wachstum und Metastasierung zu erlauben, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in der Form einer intakten Masse von neoplastischem Gewebe vorliegen.

2. Tiermodell nach Anspruch 1, worin das genannte Tier eine athymische Maus ist.

3. Athymisches Mausmodell nach Anspruch 2, worin das genannte humane neoplastische Gewebe aus humaner Niere gewonnen wurde.

4. Athymisches Mausmodell nach Anspruch 3, worin das genannte humane neoplastische Nierengewebe in den Renalcortex der Niere der Maus implantiert ist.

5. Athymisches Mausmodell nach Anspruch 2, worin das genannte neoplastische Gewebe aus humanem Magen gewonnen wurde.

6. Athymisches Mausmodell nach Anspruch 5, worin das genannte humane neoplastische Magengewebe in den Magen der Maus zwischen der inneren Schleimhautauskleidung des Magens und dem äußeren peritonealen Mantel des Magens implantiert ist.

7. Athymisches Mausmodell nach Anspruch 2, worin das genannte neoplastische Gewebe aus humanem Dickdarm gewonnen wurde.

8. Weibliches athymisches Mausmodell nach Anspruch 2, worin das genannte neoplastische Gewebe aus einer humanen weiblichen Brust gewonnen wurde.