DE68926178T2

DE68926178T2 - Festphase-Verfahren zur Gewinnung von Thymosin-alpha-1

Info

Publication number: DE68926178T2
Application number: DE68926178T
Authority: DE
Inventors: Su Sun Wang
Original assignee: Alpha 1 Biomedicals Inc
Current assignee: Alpha 1 Biomedicals Inc
Priority date: 1988-05-10
Filing date: 1989-05-05
Publication date: 1996-11-28
Anticipated expiration: 2009-05-06
Also published as: KR890017267A; US5856440A; ATE136551T1; US5610272A; JPH0236197A; EP0341935A2; EP0341935A3; JP2812709B2; DE68926178D1; KR970010922B1; HK1014627A1; EP0341935B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Thymosin α&sub1;. Insbesondere ist diese Erfindung auf eine Festphasensynthese für Thymosin α&sub1; ausgerichtet, worin die α-Aminosäure jeder nacheinanderfolgenden Aminosäure durch die 4-Methoxybenzyloxycarbonyl (Moz-) Schutzgruppe geschützt wird, gefolgt von acidolytisch katalysierter Spaltung.
Biologisch aktive Peptide zeigen ihre biologische Aktivität im allgemeinen bei sehr geringen Dosen, zum Beispiel bei Nanogramm-Spiegeln oder darunter. Daher ist es während der anfänglichen Screening- und Erprobungsphasen im allgemeinen ausreichend, das Peptid des Interesses in vergleichbar kleinen Mengen, wie von wenigen Milligramm bis zu wenigen Gramm, herzustellen. In solchen Fällen kann das Volumen an flüssigen Reagenzien, die während der Synthese und den Reinigungsschritten als Lösungsmittel, Reaktanten, Verdünnungsmittel, Waschmittel und dergleichen benotigt werden, obwohl oftmals bedeutend, zum Beispiel von einigen bis zu zig Gallonen, nichtsdestoweniger noch handlich sein in bezug auf Kosten, Lagerplatz, Entsorgung und dergleichen. Jedoch haben bei der großtechnischen Herstellung, zum Beispiel bei Chargengrößen von zig Gramm oder mehr, zum Beispiel von etwa 100 Gramm bis 2 Kilogramm, besonders von 250 Gramm bis 1 Kilogramm (auf Trokkenbasis), die Probleme bei der Produktaufbereitung, Produktreinheit und Handhabung, Lagerung und Entsorgung der Reagenzien solche Schwierigkeiten dargestellt, daß praktisch keine zufriedenstellenden großtechnischen Verfahren verfügbar sind. Als Ergebnis besteht in der Technik eine große Notwendigkeit für ein Festphasen-Peptidsyntheseverfahren, das in der Lage ist, Peptid-Substanzen von gewerblichem Interesse, ob für klinische Großversuche oder für andere gewerbliche Anwendungen, in großen Chargengrößen herzustellen.
Diese Notwendigkeit besteht sogar noch dringender für relativ lange Peptide, d.h. von etwa 10 oder mehr Aminosäuren im Peptid, besonders bei Sequenzen von etwa 15 bis 50 Aminosäuren. Zum Beispiel wird, sogar bei Verwendung eines automatisierten Festphasen-Peptidsynthesegeräts, jeder volle Zyklus von Schützen fünktioneller Gruppen, Koppeln, Abspaltung des Peptids vom Harz, Reinigung und so weiter von einem Tag bis zu einigen Tagen oder Wochen dauern, wobei das gesamte Herstellungsverfahren in einigen Fällen so lange wie bis zu 6 bis 8 Monate erfordert. Da dieser Zeitraum weitgehend unabhängig von der Chargengröße ist, kann leicht ersehen werden, daß auf einer Einheiten-Basis die Herstellungskosten extrem hoch sind, wenn nur kleine Gramm-Mengen hergestellt werden.
In US-Patent 4 079 127 wird gezeigt, daß Thymosin α&sub1; eine relative Molekülmasse von 3 108 und einen pI' im Bereich von 4,0-4,3 besitzt, wie durch isoelektrische Fokussierung auf Plattengel bei einem pH-Bereich von 3-5 bestimmt wurde. Die Verbindung hat die folgende Aminosäuresequenz:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys- Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH.
Es wurde gefunden, daß Thymosin α&sub1; in mehreren in vitro- und in vivo-Assay-Systemen, die ausgelegt waren, um T-Zell-Differenzierung und -Funktion zu messen, 10 bis 1 000 mal aktiver ist als die Thymosin-Fraktion 5. Thymosin α&sub1; kann warmblütigen Säugern durch parenterale Verabreichung entweder intravenös, subkutan oder intramuskulär verabreicht werden. Die Verbindung ist ein wirksames die Immunreaktion verstärkendes Mittel mit einer täglichen Dosis im Bereich von etwa 1 bis 100 µg/kg Körpergewicht pro Tag bei intravenöser Verabreichung. Offensichtlich wird die erforderliche Dosis mit dem besonderen Zustand, der behandelt wird, der Schwere des Zustands und der Dauer der Behandlung variieren.
In US-Patent 4 148 788 beschrieb der Erfinder der vorliegenden Anmeldung die Synthese von Thymosin α&sub1; durch Festphasen-Peptidsynthese und durch Fragmentkondensation. Diese Verfahren verwendeten beide tert.-Butyloxycarbonyl (Boc) als Schutzgruppe für die α-Aminosäure während der Kopplungsreaktionen der C-terminalen Aminosäure an den festen Harzträger und für das Koppeln jeder nacheinanderfolgenden Aminosäure.
Die Boc-Gruppe ist im Hinblick auf ihre Stabilität gegenüber den Kondensations- (Kopplungs) Bedingungen, ihre Leichtigkeit der Entfernung ohne Zerstörung der Peptidbindungen oder Racemisierung chiraler Zentren in der Peptidkette und ihren niedrigen Preis die bevorzugte Aminoschutzgruppe für die Festphasen-Peptidsynthese gewesen. Diese Bevorzugung der Boc- Schutzgruppe offenbart sich eindeutig in der Patent- und allgemeine Literatur durch die fast ausschließliche Verwendung von Boc als Schutzgruppe zum Schützen von α-Aminosäuren.
Zum Beispiel legen G. Barany und R. B. Merrifield in The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Bd. 2, "Special Methods in Peptide Synthesis", Teil A, hrsg. von E. Gross und J. Meienhofer, Academic Press, Inc., New York, 1980 in Kapitel 1, Festphasen-Peptidsynthese, auf den Seiten 101 - 102 dar, daß "die tert.-Butyloxycarbonyl- (Boc-) Gruppe... die bei weitem am weitreichendsten verwendete Funktionalität zur α-Amino-Schützung bei der Festphasen- Peptidsynthese ist." Andere Urethan-bildende tert.-Alkyl-α-Aminoschutzgruppen, die von den Autoren erwähnt werden, schließen tert.-Amyloxycarbonyl (Aoc), Adamantyloxycarbonyl (Adoc) und 1-Methylcyclobutyloxycarbonyl (Mcb) ein. Dieser Text beschreibt auch 10 verschiedene Kombinationen von anorganischen (protischen oder Lewis-) und organischen (einschließlich Carbon-) Säuren in (gewöhnlich wasserfreien) Losungsmittelgemischen. Unter diesen Kombinationen sind pure (neat) wasserfreie Trifluoressigsäure (TFA) und TFA-CH&sub2;Cl&sub2; in Verhältnissen (v/v) von 1:4 bis 1; 1, 25ºC, 20-30 Minuten.
Unter der Überschrift "3. Other Amino-Protecting Groups Removable by Acidolysis", Seiten 106-107 berichten Barany und Merrifield, daß die Benzyloxycarbonyl- (Z-) Gruppe, die durch starke Säuren wie HBr in Essigsäure entfernt wird, die erste für die Festphasensynthese untersuchte Gruppe war, aber daß,
"wenn man den gesamten Zustand der gegenwärtigen Methodik als gegeben ansieht, der Nα-Schutz mit der Benzyloxygruppe wahrscheinlich auf die NH&sub2;-terminale Gruppe eines Peptids beschränkt bleiben wird. Das weitreichend verwendete Schutzsystem für die Lösungssynthese, das auf der hydrogenolysierbaren Nα-Benzyloxycarbonylgruppe und acidolysierbaren Seitenketten-tert.-Butylderivaten beruht, ... ist für die Festphasensynthese nicht anwendbar gewesen."
Andererseits berichten die Autoren auch von Arbeiten anderer, die Furfuryloxycarbonyl- (Foc-) und p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppen (Moz) verwendeten. Sie legen auf Seite 107 dar, daß diese
"Gruppen primäre Urethane sind, die unter denselben acidolytischen Bedingungen und mit im Grunde genommen den gleichen Geschwindigkeit wie die tert.-Butyloxycarbonylgruppen entschützt werden. ... Daher sind sie gelegentlich bei der schrittweisen Festphasensynthese verwendet worden. Das Ultraviolett absorbierende Chromophor von [Moz] fördert die spektroskopische Überwachung der Entschützungs- und Kopplungsschritte."
Im vorgenannten US-Patent 4 148 788 wird nur Boc als die α-Aminoschutzgruppe offenbart, obwohl als Schutzgruppe für die ω-Aminogruppe von Lysin (Lys) die Benzyloxycarbonyl- (Z-) Schutzgruppe verwendet wird und andere ω-Aminoschutzgruppen offenbart werden, einschließlich am aromatischen Ring substituiertes Benzyloxycarbonyl, wie durch 4-Chlor, 2- Brom, 4-Brom, 2,4-Dichlor, 4-Nitro, 4-Methoxy, 3,5-Dimethoxy, 4-Methyl, 2,4,6-Trimethyl, 4-Phenylazo, 4-(4-Methoxyphenylazo), 2-(N,N-Dimethylcarbonamido), 4-Dihydroxyboryl und 2-Nitro-4,5-Dimethoxy; Schutzgruppen vom Urethan-Typ wie 4-Toluolsulfonylethyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) und verwandte durch Basen spaltbare Gruppen, 5-Benzisoxazolylmethylenoxycarbonyl, Methylthio- und Methylsulfonylethyloxycarbonyl, Isonicotinyloxycarbonyl, Halogenethyloxycarbonyl, Diisopropylmethyloxycarbonyl, Benzhydryloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, Dinitrodiphenylmethyloxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl und andere; Acylgruppen wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, Benzolsulfonyl und andere; und Aryl-Niederalkyl-Gruppen wie Diphenylmethyl und Triphenylmethyl.
In der vor kurzem veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 0 002 404, veröffentlicht am 5. November 1986, die der US-Anmeldung Eingangs-Nr. 722 218, angemeldet am 4. November 1985, die mittlerweile aufgegeben worden ist, und der gleichzeitig anhängigen Teilfortführungsanmeldung Eingangs-Nr. 849 835, angemeldet am 9. April 1986, entspricht, offenbarte der Anmelder der vorliegenden Anmeldung eine verbesserte Festphasen-Peptidsynthese von Thymosin α&sub1; unter Verwendung von Methylbenzhydrylamin- (MBHA-) Harz als Trägermaterial und Wasserstoffbromid (HBr) mit Trifluoressigsäure (TFA) und Anisol und Thioanisol als Spaltungs- und Entschützungsagenzien. Auch hier wird Boc offenbart als die bevorzugte und wird verwendet als die α-Aminoschutzgruppe. Andere α-Aminoschutzgruppen werden erwähnt, einschließlich Benzyloxycarbonyl (Z), Biphenylisopropyloxycarbonyl, t- Amyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 1,1-Dimethyl-3,5-Dimethyloxybenzyloxycarbonyl (Ddz), o-Nitrophenylsulfenyl, 2-Cyan-t-butyloxycarbonyl und 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl.
Die Patentliteratur, die Festphasen-Peptidsynthesen von anderen Peptiden als Thymosin α&sub1; offenbart, gibt auch im wesentlichen ausschließlich beispielhatt Boc als α-Aminoschutzgruppe an, ungeachtet allgemeiner Offenbarungen anderer Schutzgruppen wie Benzyloxycarbonyl (Z) und substituierter Z-Gruppen, einschließlich zum Beispiel derjenigen, die oben als Schutzgruppen für ω-aminofunktionelle Gruppen erwähnt sind.
Andererseits werden für die klassischen Flüssigphasen (Lösungs-) Peptidsynthese-Reaktionen die Benzyloxycarbonyl- (Z-) und Boc-α-Aminoschutzgruppen mit etwa gleicher Häufigkeit eingesetzt. Daher ist, während die acidolytische Spaltung von α-Aminoschutzgruppen Gegenstand erheblicher Forschungsarbeit gewesen ist, im Fachgebiet die allgemeine Schlußfolgerung gewesen, daß die Säureempfindlichkeiten der Boc- oder 4-Methoxy-substituierten Z- , d.h. 4-Methoxybenzyloxycarbonyl- (Moz-), Schutzgruppen ungefähr gleich sind. So weit der Anmelder weiß, ist jedoch kein genauer oder exakter Vergleich tatsächlich jemals durchgeführt worden, um die relativen Säureempfindlichkeiten von Boc und Moz bei der Festphasen- Peptidsynthese zu untersuchen.
In den vorgenannten US-Anmeldungen Eingangs-Nr. 722 218 und 849 835 und der entsprechenden veröffentlichten Anmeldung 0 002 404 wurden die Vorteile der Verwendung von Wasserstoffbromid als saurem Spaltungs- und Entschützungsagens anstelle des stärker korrodierend wirkenden Fluorwasserstoffs beschrieben.
Jedoch weist die Verwendung von HBr den Nachteil auf, daß es, da es ein Gas ist, dadurch in Kontakt mit dem am Harz gebundenen geschützten Thymosin α&sub1; gebracht wird, daß das gasförmige HBr in eine Lösung des am Harz gebundenen geschützten Peptids in, normalerweise, Trifluoressigsäure hineinperlen gelassen wird. Das Verfahren des Hineinperlenlassens ist nicht nur langsam, sondern erfordert auch druckbeaufschlagte Gasbehälter und erfordert immer noch ein gewisses Maß an Fertigkeit bei seiner Verwendung. Daher wäre es wünschenswert, ein flüssiges saures Spaltungsagens zu finden, das nicht die HF innewohnenden Korrosionsprobleme aufweist und mit gewöhnlichen Laborgeräten und -apparaten aus Glas oder Plastik verwendet werden kann, doch wenigstens so hochwirksam und selektiv bei der sauren Spaltung und Entschützung des am Harz gebundenen geschützten Thymosin-α&sub1;-Peptids ist.
In Chem. Abs. (1988), Bd. 108, Seite 6403, Abstrakt Nr.640 lb, wird die Verwendung von Trifluormethansulfonsäure (TFMSA) als Entschützungsagens bei der Festphasen-Peptidsynthese offenbart, während Chem. Abs. (1988), Bd. 109, Seite 731, Abstrakt Nr.55211 u die Verwendung von Triethylamin als Neutralisierungsmittel erwähnt.
Die Vorteile der Erfindung, die nach einem Überblick der folgenden ausführlichen Beschreibung und bevorzugten Ausführungsformen einschließlich der begleitenden Zeichnungsfiguren offensichtlicher werden werden, werden durch die Festphasen-Peptidsynthese zur Herstellung von Thymosin α&sub1; bereitgestellt, bei der der Stickstoff der α-Aminogruppe (Nα) jeder Aminosäure während der Synthese an 4-Methoxybenzyloxycarbonyl (Moz) gebunden wird und die Spaltung unter Verwendung einer stark verringerten Menge an Trifluoressigsäure (TFA) ausgeführt wird.
Gemäß dieser Erfindung wird Thymosin α&sub1; oder ein biologisch aktives Analog oder Fragment davon durch Festphasen-Peptidsynthese hergestellt durch die Schritte: (a) vorübergehendes chemisches Schützen der reaktiven Aminogruppe an der α-Position mit 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, und jedweder anderen reaktiven Gruppen außer der β-Carbonsäuregruppe an der C-terminalen Aminosäure des Thymosin-α&sub1;-Peptids; (b) chemisches Binden der geschützten C- terminalen Aminosäure über die ungeschützte Carbonsäure (-COOH)-Gruppe davon an einem Harzträger; (c) chemisches Entschützen der reaktiven Aminogruppe der am Harz gebundenen, geschützten Aminosäure durch acidolytische Spaltung unter Verwendung von flüssiger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid oder Chloroformlösungsmittel und Neutralisieren des entschützten Peptidharzes mit Tributylamin; (d) chemisches Koppeln der nächsten Aminosäure in der gewünschten Sequenz über eine Peptidbindung in Gegenwart eines Kopplungsmittels, indem die am Harz gebundene Aminosäure aus Schritt (c) mit der nächsten Aminosäure in der gewünschten Sequenz in Kontakt gebracht wird, bei der die reaktiven Aminogruppe und alle anderen reaktiven Gruppen davon außer der Carbonsäuregruppe an der α-Position durch 4- Methoxybenzyloxycarbonyl chemisch geschützt sind; (e) chemisches Entschützen der reaktiven Aminogruppe der gekoppelten Aminosäure aus Schritt (d) durch acidolytische Spaltung unter Verwendung von flüssiger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid oder Chloroformlösungsmittel; (f) Fortsetzen der Synthese durch das Wiederholen der Schritte (d) und (e) mit der Reihe nach und eine zur Zeit hinzugesetzten Aminosäuren, bis die gesamte gewünschte Sequenz des geschützten Peptids auf dem Harz aufgebaut ist; (g) Spalten des geschützten Peptids von dem Harzträger und Entschützen geschützter Reaktionsgruppen unter sauren Spaltbedingungen unter Verwendung von flüssiger Trifluoressigsäure; und worin das Lösungsmittel aus der Abfallauge durch Destillation zurückgewonnen wird, ohne Verunreinigung des Destillats durch das hochsiedende Tributylamin-Neutralisationsmittel.
Vorzugsweise ist der Harzträger in Schritt (b) ein Benzhydrylamin-Harz oder ein Methylbenzhydrylamin-Harz.
Auf die Zeichnungen Bezug nehmend:
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der sauren Spaltungsgeschwindigkeiten von Moz-Ala- Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Val-OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-Harz durch 10%ige TFA ( - ) und durch 5%ige TFA (o-o) und Boc-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Val-OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-Harz durch 40%ige TFA (Δ-Δ), 20%ige TFA ( - ), 10%ige TFA ( - ) (und 5%ige TFA ( - );
Fig. 2 ist eine chromatographische Verfolgung der HPLC-Analyse für das rohe Thymosin α&sub1;, das hergestellt wurde durch (a) Boc-Schutz mit HF-Spaltung, (b) Boc-Schutz mit HBr-Spaltung, (c) Moz-Schutz mit HF-Spaltung und (d) Moz-Schutz mit HBr-Spaltung;
Fig. 3 ist eine chromatographische Verfolgung der präparativen HPLC-Reinigung von Thymosin α&sub1; unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen;
Fig. 4 ist eine chromatographische Verfolgung einer analytischen HPLC für (a) rohes (links) und (b) gereinigtes (rechts) Thymosin α&sub1;, wie es in Beispiel 1 erhalten wird; und
Fig. 5 ist eine chromatographische Verfolgung einer analytischen HPLC für (a) rohes und (b) gereinigtes Thymosin α&sub1;, wie es in Beispiel 2 erhalten wird.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat jetzt herausgefunden, und dieses bildet den Hauptinhalt der vorliegenden Erfindung, daß die Moz-Aminosäure bei der Festphasen- Peptidsynthese wesentlich empfindlicher gegenüber saurer Spaltung (Entschützung) ist als die entsprechende Boc-Aminosäure. Diese größere Empfindlichkeit zeigt sich in der tatsächlichen Praxis durch viel höhere Geschwindigkeiten der Entschützung, wodurch viel geringere Mengen des sauren Entschützungsagens benötigt werden.
Die größere Unbeständigkeit der Moz-Gruppe gegenüber saurer Entschützung bedeutet, daß die Selektivität zwischen der Nα-Schutzgruppe und den auf Benzyl basierenden Schutzgruppen an den Seitenketten oder am Harz verankernden Bindungen viel größer ist. Daher werden Verluste von Peptidketten vom Träger vemngert werden, und Nebenreaktionen wegen vorzeitiger Seitenketten-Entschützung werden vermindert werden. Außerdem können Deletions- Peptide, die aus unvollständiger Entfernung der Nα-Gruppe resultieren, leichter vermieden werden. Ein anderer Vorteil der Moz-Gruppe liegt in der Möglichkeit, Kopplungs- und Entschützungsreaktionen spektroskopisch zu überwachen. Noch ein anderer Vorteil der Verwendung von Moz-Aminosäuren anstelle von Boc-Aminosäuren bei der Festphasen-Peptidsynthese liegt in der beträchtlichen Kosteneinsparung, die erreicht werden kann, da viel weniger TFA benötigt wird, besonders bei der Herstellung biologisch aktiver Peptide in großem Maßstab. Außerdem sind, im Gegensatz zu anderen säureempfindlichen Aminoschutzgruppen wie 2-(p- Biphenyl)propyl-2-oxycarbonyl (Bpoc), α,α-Dimethyl-3,5-dimethyloxybenzyloxycarbonyl (Ddz) etc., die kostspielig herzustellen sind, die Kosten für das Herstellen von Moz- Aminosäurederivaten etwa dieselben wie diejenigen für Boc-Aminosäuren.
Um die Nützlichkeit von Moz-Aminosäuren zu veranschaulichen, wurde die automatisierte Synthese des Modell-Tetrapeptids Leu-Ala-Gly-Val (LAGV) unternommen. Für die Synthese, von der die Einzelheiten im nachstehenden Referenzbeispiel 2 gezeigt sind, wurde eine 30- minütige Behandlung in 10%iger TFA verwendet, um die Moz-Gruppe in jedem synthetischem Zyklus zu entschützen. Als Kontrollversuch wurde eine entsprechende Synthese desselben Peptids unter den genau gleichen Bedingungen mit Boc-Aminosäuren als Synthesematerialien und 40%iger TFA in CH&sub2;Cl&sub2; (30 Minuten) als Entschützungsagens durchgeführt.
Daher wurde Moz-Val-OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-Harz, das aus ClCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-Harz und Moz-Val-OH via die Cäsiumsalz-Methode, wie zum Beispiel von Gisin, B. F., Helv. Chim. Acta., 56, 1476-1482 (1973) und in Solid-Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl. von J. M. Stewart und J. D. Young, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) beschrieben, hergestellt wurde, als Ausgangsmaterial für die automatisierte Synthese von Moz-Leu-Ala-Gly-Val-OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-Harz verwendet. Nach HF-Spaltung dieses Tetrapeptid-Harzes wurde eine Probe von rohem LAGV erhalten. Eine Aminosäure-Analyse und eine HPLC-Analyse zeigten, daß die Substanz etwa 98% rein war. Sie wurde dann einer ionenaustauschchromatographischen Analyse auf einem Aminosäure-Analysator gemäß dem von R. B. Merrifield et al. J. Org. Chem., 39, 660-668 (1974) beschriebenen Verfahren unterworfen. Die Ergebnisse wurden mit denen verglichen, die aus einer entsprechenden rohen LAGV-Probe, die aus einer entsprechenden Synthese unter Verwendung von Boc-Aminosäuren erhalten wurde, abgeleitet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle I tabellarisiert. Es wurde gefünden, daß die Anteile von Deletions-Peptiden, die in der Moz-Probe vorhanden waren, im allgemeinen niedriger waren als diejenigen, die in der Boc- Probe vorhanden waren. Tabelle I Rohes, aus Moz-Aminosäuren oder Boc-Aminosäuren hergestelltes Leu-Ala-Gly- Val (LAGV).a LAGV-Probeb Vom Moz-Verfahren Vom Boc-Verfahren a Um die Unterschiede zu erhöhen, wurden einzelne Kopplungen für diesen Vergleich verwendet. Deletions-Peptide werden durch Doppel-Kopplungs-Protokolle stark verringert. Die angegebenen Zahlen sind der Durchschnitt aus zwei Analysen. b Rohe Proben aus der HF-Spaltung des Peptid-Harzes wurden direkt in den Aminosäure-Analysator (Becktnan 120B) eingespritzt, worin die Peptide gut getrennt werden. Die Anteile des erwünschten Tetrapeptids LAGV und der in den Proben vorhandenen Deletions-Peptide sind tabellarisiert.
Als ein weiterer Hinweis auf die unterschiedlichen relativen Empfindlichkeiten der Moz- und Boc-Aminoschutzgruppen bei größeren Peptiden wurden zwei ansonsten identische Heptapeptide: Moz-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Val-OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-Harz und Boc-Ala-Leu-Leu-Leu- Leu-Leu-Val-OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-Harz hergestellt und wurden getrennt mit verschiedenen Konzentrationen von TFA in CH&sub2;Cl&sub2; behandelt. Nach verschiedenen Zeitspannen wurden kleine Proben entnommen und sofort mit verdünntem Triethylamin (Et&sub3;N) in CH&sub2;Cl&sub2; gequencht, gefolgt von sorgfältigem Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;. Die neutralisierten Proben wurden dann mit Boc-Phe-OH in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) koppeln gelassen, bis sie gegenüber dem Ninhydrin-Test negativ waren. Aminosäure-Analysen wurden für jede Probe durchgeführt, und der Anstieg im Verhältnis Phe/Ala wurde als die Geschwindigkeit der acidolytischen Spaltung der Moz- oder Boc-Gruppe an den Heptapeptid- Harzen genommen. Die Einzelheiten der Spaltungsreaktion werden im nachstehenden Referenzbeispiel 3 gezeigt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 zusammengefaßt. Wie gesehen werden kann, verlief die Entschützung der Moz-Gruppe schnell und vollständig, so daß sie viel weniger TFA erforderte als die Entschützung der Boc-Gruppe. Der zeitliche Verlauf der Moz- Abspaltung in 5%iger TFA fällt fast vollständig mit demjenigen für die Boc-Abspaltung in 40%iger TFA zusammen. Mit 10%iger TFA wurde beobachtet, daß Moz fast augenblicklich mit einer Halbwertszeit von weniger als 0,3 Minuten entfernt wurde.
Als ännliche Versuche an Moz-Ile-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Val-OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-Harz und Boc- Ile-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Val-OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-Harz durchgeführt wurden, um zu bestimmen, ob die Geschwindigkeit der Acidolyse für Ile verschieden von der für Ala sein würde, zeigten die Ergebnisse an, daß die entsprechenden Geschwindigkeiten identisch waren. Es wurden keine Unterschiede beobachtet, wenn die Schutzgruppen entweder von Ile-Peptid-Harz oder Ala-Peptid-Harz abgespalten wurden.
Beruhend auf diesen Untersuchungen unternahm der Erfinder die Festphasen-Peptidsynthese von Thymosin α&sub1; unter Verwendung der Verfahren, wie vorher allgemein in den vorgenannten Anmeldungen Eingangs-Nr. 849 835 und 722 218 oder im vorgenannten US-Patent 4 148 788 beschrieben, aber unter Verwendung von 4-Methoxybenzyloxycarbonyl (Moz) der Formel:
als α-Aminoschutzgruppe anstelle von tert.-Butyloxycarbonyl (Boc) der Formel
Im Vergleich mit der Synthese-Reaktion unter Verwendung einer Nα-Boc-Aminosäure brachte die Reaktion unter Verwendung einer Nα-Moz-Aminosäure weniger Verunreinigungen und Deletions-Peptide hervor und erforderte wesentlich weniger Trifluoressigsäure (TFA) als saures Solvens.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Thymosin α&sub1; mit der folgenden Sequenz
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys- Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
oder biologisch aktive Positionsanaloga oder Fragmente davon durch Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung herkönnnlicher Methoden hergestellt, außer daß als Nα-Aminoschutzgruppe 4-Methoxybenzyloxycarbonyl (Moz) verwendet wird und wesentlich kleinere Volumina von Trifluoressigsäure als saurem Spaltungs-Solvens benötigt werden.
Die Moz-Aminosäure-Herstellung kann ähnlich der Boc-Aminosäure-Herstellung durchgeführt werden, wie bereits in der Literatur beschrieben, zum Beispiel auf den Seiten 31-32 von The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Bd. 3, "Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis", Hrsg. E. Gross und J. Meienhofer, Academic Press, New York, 1981.
Jeder der Schritte bei der Festphasen-Peptidsynthese von Thymosin α&sub1; gemäß dieser Erfindung wird nun beschrieben werden.

Schritt (a). Schutz der α-Aminosäure

Die C-terminale Aminosäure von Thymosin α&sub1; ist Asparagin (Asn), .
Asn wird an den Harzträger als Asparaginsäure (Asp) gebunden, wobei eine Amidbindung zwischen der β-Carbonsäure und dem Harzträger gebildet wird. Daher ist jede der Aminogruppe und Carboxylgruppe am α-Kohlenstoffatom chemisch geschützt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird 4- (oder p-) Methyloxybenzyloxycarbonyl (Moz) der Formel
verwendet, um die Nα-Gruppe zu schützen.
Die α-Carbonsäuregruppe kann durch jede der Carbonsäureschutzgruppen geschützt werden, aber vorzugsweise mit einem einfachen Benzylester. Somit ist die geschützte C-terminale an den Harzträger zu bindende Aminosäure vorzugsweise Nα-Moz-α-benzyl-L-asparaginsäure.

Schritt (b). Binden der geschützten C-terminalen Aminosäure an den Harzträger

Wie in der obenerwähnten gleichzeitig anhängigen Anmeldung Eingangs-Nr. 849 835, eingereicht am 9. April 1986, beschrieben, ist der bevorzugte Harzträger Methylbenzhydrylamin- Harz, jedoch kann auch das Benzhydrylamin-Harz verwendet werden.
Das Methylbenzhydrylamin-Harz kann aus handelsüblichen Polystyrolharzkörnern (1% Divinylbenzol, 200-400 Mesh, US-Standard) hergestellt werden durch Umsetzen desselben mit p- Toluoylchlorid in Gegenwart einer Lewis-Säure wie Aluminiumchlorid in einem inerten Lösungsmittel wie Dichlorethan bei einer niedrigen Temperatur, vorzugsweise 0 bis 5ºC, um ein p-Toluoylharz, CH&sub3;-C&sub6;H&sub4;-CO-C&sub6;H&sub4;-Harz, zu bilden. Dieses Harz wird mit einer Mischung von Ammoniumformiat, Formamid und Ameisensäure bei der Rückflußtemperatur (160º- 170ºC) 24 Stunden lang zur Reaktion gebracht, um N-Formylmethylbenzhydrylamin-Harz, CH&sub3;-C&sub6;H&sub4;-CH(NH-CO-H)-C&sub6;H&sub4;-Harz zu erhalten. Durch Hydrolyse in verdünnter Chlorwasserstoffsäure wird das erwünschte Methylbenzhydrylamin-Harz, d.h. CH&sub3;-C&sub6;H&sub4;- CH(NH&sub2; HCl)-C&sub6;H&sub4;-Harz, gebildet.
Das so gebildete Methylbenzhydrylamin-Harz wird neutralisiert und mit der in Schritt (a) gebildeten Nα-Moz-α-benzyl-L-asparaginsäure in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid acyliert, um Moz-Asparaginyl-Harz zu erhalten.
Spezifischer wird die geschützte C-terminale Aminosäure Nα-Moz-α-benzylasparaginsäure mit Hilfe einer von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)/1-Hydroxybenzotriazol (HBT) vermittelten Kopplung während von etwa 2 bis 24 Stunden, vorzugsweise etwa 12 Stunden, bei einer Temperatur zwischen etwa 10º und 50ºC, vorzugsweise 25ºC, in einem Lösungsmittel wie Dichlormethan oder Dimethylformamid (DMF), vorzugsweise Dichlormethan, am Methylbenzhydrylamin-Harz gebunden.

Schritt (c). Chemische Entschützung

Die chemische Entschützung der Nα-Moz-Gruppe wird durch Acidolyse unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA) erreicht. Jedoch kann im Gegensatz zu herkömmlichen Entschützungs-Programmen, die entwässerte TFA oder TFA:CH&sub2;Cl&sub2;-Mischungen mit (v/v) von 1:4 bis 1:1 verwenden, die TFA-Konzentration in CH&sub2;Cl&sub2; stark verringert werden, wie 1:5 bis 1:50, vorzugsweise 1:5 bis 1:20. Normalerweise wird TFA in einer etwa 10%igen (v/v)-Konzentration verwendet werden, wie von 8 bis 15%. Bei diesen niedrigen TFA-Konzentrationen ist die Benzylester-Schutzgruppe viel beständiger gegenüber acidolytischer Spaltung, und es werden als Folge weniger unerwünschte Nebenprodukte und Deletions-Peptide bei der Synthese gebildet.
Die Entschützung mit TFA-CH&sub2;Cl&sub2; wird vorzugsweise in Gegenwart kleiner Mengen von Indol, z.B. etwa 0,01 bis 0,1% nach Gewicht, basierend auf dem Gesamtgewicht von TFA und CH&sub2;Cl&sub2;, durchgeführt. Das Indol füngiert als Radikalfanger für möglicherweise schädliche Oxidationsmittel, wie Aldehyde, die als eine Verunreinigung in TFA vorhanden sein können. Die Entschützungs-Temperatur kann im Bereich von etwa 0º bis etwa 50ºC liegen, obwohl Raumtemperatur, z.B. etwa 18º bis 25ºC vorgezogen wird, und 25ºC besonders bevorzugt sind. Die Entschützungsreaktion bei 25ºC ist im allgemeinen innerhalb von etwa 10 bis 60 Minuten beendet, und gewöhnlich sind 30 Minuten ausreichend. Chloroform (CHCl&sub3;) kann anstelle von CH&sub2;Cl&sub2; verwendet werden.
Nach dem Entfernen der Nα-Moz-Schutzgruppe im acidolytischen TFA-Entschützungsschritt und vor dem nächsten Kopplungsschritt wird das entschützte Peptid-Harz neutralisiert. Diese Neutralisation geschieht gewöhnlich durch Aussetzen des Peptid-Harz-Salzes einem Überschuß (z.B. 2,5% bis 10% (v/v)) eines tertiären Amins in einem Lösungsmittel wie CH&sub2;Cl&sub2;, CHCl&sub3; oder DMF. Als tertiäres Amin wird am häufigsten Triethylamin (Et&sub3;N) verwendet. Jedoch wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Tributylamin (Bu&sub3;N) als tertiäres Amin-Neutralisationsmittel anstatt Et&sub3;N verwendet, besonders mit CH&sub2;Cl&sub2; oder CHCl&sub3; und besonders bevorzugt CH&sub2;Cl&sub2; als Lösungsmittel.
Somit siedet Bu&sub3;N bei 216-217ºC, wohingegen TFA und Et&sub3;N relativ nahe Siedepunkte, 72,4ºC bzw. 89-90ºC, besitzen. Daher wird die Rückgewinnung des CH&sub2;Cl&sub2; oder CHCl&sub3;- Lösungsmittels aus der Ablauge (in erster Linie Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;, Sdp. = 41ºC) oder Chloroform (CHCl&sub3;, Sdp. = 61,2ºC) mit geringeren Anteilen von TFA, Isopropylalkohol, Säuren, Basen, überschüssigen Reagenzien und Aminosäuren (weniger bedeutend)) durch Destillation sehr erleichtert werden, da das Bu&sub3;N das Destillat nicht verunreinigen wird, wodurch es möglich wird, den Großteil an CH&sub2;Cl&sub2; oder CHCl&sub3; wiederzuverwerten.

Schritte (d), (e) und (f). Wiederkehrendes Koppeln/Entschützen

Die bevorzugte geschützte Form des voll geschützten, am Harz gebundenen Thymosin α&sub1; ist in der folgenden Formel gezeigt:
Ac-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)- Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(ClZ)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(ClZ)-Glu(OBzl)- Lys(ClZ)-Lys(ClZ)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)- Asp(NH-CH(C&sub6;H&sub4;-CH&sub3;)C&sub6;H&sub4;-Harz)-OBzl,
worin die Schutzgruppen Bzl, OBzl und ClZ für Benzyl, Benzylester bzw. 2-Chlorbenzyloxycarbonyl stehen und Ac Acetyl bedeutet.
Während zur Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform für die Synthese von Thymosin α&sub1; spezifische Schutzgruppen verwendet worden sind, ist im Fachbereich die Möglichkeit bekannt, gleichwertige herkömmliche Seitenketten-Schutzgruppen zu verwenden. Eine Seitenketten-Schutzgruppe sollte (1) stabil sein und die fünktionelle Seitenketten-Gruppe unter den bei der Kopplungsreaktion angewendeten Bedingungen inert machen, (2) unter den beim Entfernen der α-Aminoschutzgruppe angewendeten Bedingungen stabil sein und (3) nach Vervollständigung der erwünschten Aminosäuresequenz leicht unter Reaktionsbedingungen entfembar sein, die die Struktur der Peptidkette nicht verändern und keine Racemisierung irgendeines der darin enthaltenen Chiralitätszentren bewirken.
Einzelheiten geeigneter Seitenketten-Schutzgruppen für die Aminosäuren können zum Beispiel in Protective Groups in Organic Chemistry, Herausgeber M. McOmie, Plenum Press, N. Y., 1973; und dem vorgenannten The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, hrsg. von E. Gross und J. Meienhofer, Bd. 2 und Bd. 3, aufgefunden werden.
Das Koppeln aufeinanderfolgender geschützter Aminosäuren kann in einem automatischen Polypeptidsynthesegerät durchgeführt werden, wie im Fachgebiet gut bekannt. Jede geschützte Aminosäure wird vorzugsweise in angenähert 2,5 bis 3,0 oder höherem molaren Überschuß eingeführt, und das Koppeln kann in Dichlormethan, Dichlormethan/DMF-Mischungen, DMF und dergleichen durchgeführt werden, besonders in Methylenchlorid bei etwa Umgebungstemperatur. Andere Lösungsmittel, von denen bekannt ist, daß sie nützlich für den Verwendungszweck einer Peptid-bildenden Kondensationsreaktion sind, zum Beispiel Dimethylsulfoxid, Pyridin, Chloroform, Dioxan, Tetrahydrofüran, Ethylacetat, N-Methylpyrrolidon etc. sowie geeignete Gemische von diesen, können ebenfalls verwendet werden.
Die Reaktionstemperatur für die Kondensations-/Kopplungsreaktion kann aus dem Bereich ausgewählt werden, von dem bekannt ist, daß er nützlich für den Verwendungszweck Peptidbildender Kondensationsreaktionen ist. Somit kann sie normalerweise innerhalb des Bereichs von etwa -40ºC bis etwa 60ºC, und vorzugsweise etwa -20ºC bis etwa 30ºC, liegen. Das Kupplungsreagenz ist normalerweise DCC in Dichlormethan, kann aber N,N'-Diisopropylcarbodiimid oder ein anderes Carbodiimid, entweder allein oder in Gegenwart von HBT oder N- Hydroxysuccinimid, sein. Alternativ können geschützte Aminosäure-Aktivester (z.B. p-Nitrophenyl, Pentafluorphenyl und dergleichen) oder symmetrische Anhydride verwendet werden.
Nach jeder aufeinanderfolgenden Kopplungsreaktion wird die Nα-Moz-Gruppe entschützt wie in Schritt (c) beschrieben.

Schritt (g). Abspaltung/Entschützung

Nachdem der N-terminale Rest, der im Falle von Thymosin α&sub1; Essigsäure ist, an das am Harz gebundene Peptid gekoppelt worden ist, wird das geschützte Peptid vom Harzträger gespalten. In der bevorzugten Ausführungsform werden die Spaltung des geschützten Peptids vom Träger und das Entschützen der geschützten fünktionellen Seitenketten-Gruppen durch geeignete Auswahl der Spaltungs- und Entschützungsreaktion gleichzeitig durchgeführt. Wenn Methylbenzhydrylamin-Harz als Träger verwendet wird, wird vorzugsweise Wasserstoffbromid oder Trifluormethansulfonsäure als Spaltungs- und Entschützungsagens verwendet. Falls Benzhydrylamin-Harz verwendet wird, dann wird Fluorwasserstoff verwendet. Die Spaltungs- /Entschützungsreaktion kann wie folgt durchgeführt werden.
Das geschützte Thymosin-α&sub1;-Harz wird in Trifluoressigsäure suspendiert und mit trockenem Bromwasserstoffgas bei gewöhnlicher Temperatur (20º-25ºC) etwa eine Stunde lang behandelt, um das Polypeptid vom Harz abzuspalten und zur selben Zeit alle Schutzgruppen von den Seitenketten der Aminosäurereste zu entfernen. Obwohl Wasserstoffbromid alleine verwendet werden kann, wird bevorzugt, der Trifluoressigsäure Anisol und am meisten bevorzugt eine Mischung von Anisol und Thioanisol beizufügen, wenn mit trockenem Bromwasserstoffgas behandelt wird. Wie vorher in Eingangs-Nr. 849 835 beschrieben, wird, wenn ein Gemisch von HBr, TFA und Anisol als Entschützungs- und Spaltungsmischung verwendet wird, die Ausbeute an Thymosin α&sub1; um etwa 50% gegenüber dem Fall gesteigert, wenn ein Gemisch von nur TFA und HBr verwendet wird. Wenn ein Gemisch von HBr, TFA, Anisol und Thioanisol verwendet wird, wird die Ausbeute um etwa 90% verbessert. Das Volumenverhältnis Anisol:Thioanisol beträgt vorzugsweise von etwa 20:80 bis etwa 80:20, am meisten bevorzugt etwa 50:50 (d.h. etwa 1:1).
In einer alternativen Ausführungsform wird Trifluormethansulfonsäure, CF&sub3; SO&sub3;H, anstelle von HBr als Spaltungs-/Entschützungsagens verwendet, wiederum vorzugsweise mit Anisol und besonders bevorzugt mit Anisol und Thioanisol in TFA. Im Gegensatz zu HBr-Gas, das langsam durch die Suspension des am Harz gebundenen geschützten Peptids in TFA hindurchperlen gelassen wird, kann Trifluormethansulfonsäure, da sie eine Flüssigkeit ist, langsam, z.B. tropfenweise, oder schnell, alles auf einmal, im allgemeinen bei gewöhnlicher Temperatur zugegeben werden und erfordert wie HBr kein besonderes Laboratoriumgerät für die Handhabung.
Die überschüssigen Säuren werden dann bei 40ºC unter Teilvakuum abgedampft, und das Anisol und Thioanisol werden mit Ether weggewaschen. Rohes Thymosin α&sub1; wird aus dem Rückstand mit Ammoniumacetat (z.B. 1-2%) extrahiert und entsalzt, zum Beispiel auf einer Sephadex G- 10 Säule unter Verwendung von 0,1 N Essigsäure als Eluent. Danach kann das Thymosin α&sub1; durch eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie (C&sub1;&sub8;-Umkehrphasensäule, 5,7×30 cm) gereinigt werden. Wenn es einer analytischen Hochdruckflüssigkeitschromatographie unterworfen wird, verhält sich das so erhaltene Thymosin α&sub1; gleich wie Referenz- Thymosin α&sub1;, das durch das Fragmentkondensations-Verfahren hergestellt wurde. Überdies wurde gefünden, daß das gegenwärtig synthetisierte Thymosin α&sub1; von natürlichem Thymosin α&sub1; ununterscheidbar ist und eine zufriedenstellende Aminosäure-Analyse ergibt.
Während die Kopplungs- und Entschützungs-/Spaltungsreaktionen typischerweise bei etwa 25ºC durchgeführt werden, sind auch höhere oder tiefere Temperaturen, zum Beispiel -10ºC bis 50ºC, geeignet. Die genaue Temperatur für irgendeine bestimmte Reaktion wird natürlich von den Substraten, Reagenzien, Lösungsmitteln und so weiter abhängig sein, was aber alles gut innerhalb der Möglichkeiten des Praktikers liegt.
Überdies können, obwohl oben eine spezifische Abfolge von Reinigungsschritten des entschützten Thymosin-α&sub1;-Peptids beschrieben wurde, auch andere Arbeitsweisen verwendet werden. Im allgemeinen kann das vollständig entschützte Polypeptid durch eine Abfolge chromatographischer Schritte unter Verwendung einiger oder aller der folgenden Arten gereinigt werden: Ionenaustauschchromatographie auf einem schwach basischen DEAE-Sephadex A-25 in der Acetat-Form; Gelpermeationschromatographie, z.B. auf Sephadex G-25; hydrophobe Adsorptionschromatographie auf underivatisiertem Polystyrol-Divinylbenzol (zum Beispiel Amberlite XAD); Kieselgel-Adsorptionschromatographie; oder Gegenstromverteilung; Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), besonders Umkehrphasen-HPLC auf einer Kolonnenpackung mit Octyl- oder Octadecylsilyl-Silica-gebundener Phase.
Obwohl die obenstehende Beschreibung mit besonderer Betonung der Festphasen-Peptidsynthese von Thymosin α&sub1; mit seiner vorgegebenen Aminosäuresequenz und vorgegebenen geschützten Seitenketten-Gruppen gegeben worden ist, wird der Praktiker leicht erkennen, daß das Erfindungs-Verfahren auch auf Fragmente - kürzere Aminosäuresequenzen - der vollen 28-Aminosäuresequenz von Thymosin α&sub1; angewendet werden kann, einschließlich Aminosäuresequenzen, die mit der N-terminalen Serin-Essigsäure beginnen und kurz vor dem C- terminalen Asparagin enden, oder umgekehrt. Im Fachgebiet ist auch die Möglichkeit bekannt, eine oder mehrere der Aminosäurereste von Thymosin α&sub1; durch andere Aminosäurereste zu ersetzen, um spezifische Eigenschaften zu erreichen, wänrend die wesentlichen biochemischen Eigenschaften von Thymosin α&sub1; erhalten werden. Gleichfalls ist im Fachgebiet die Möglichkeit bekannt, eine oder mehr, wie bis zu etwa 10, vorzugsweise bis zu etwa 6, Aminosäurereste an einem oder beiden der N- und C-terminalen Enden hinzuzufügen, um Peptide mit bis zu etwa 48, vorzugsweise bis zu etwa 40 Aminosäuren, zu erhalten, worin das Thymosin-α&sub1;-Peptid enthalten ist.
Gleichwohl werden die bedeutendsten Vorteile, die von der Verwendung des Nα-Moz-Schutzes herrühren, im allgemeinen für die längeren Peptidsequenzen von wenigstens etwa 20 Aminosäuren beobachtet werden, da die kumulierenden Auswirkungen der milderen acidolytischen Entschützung der Nα-Moz-Gruppe und der Volumeneinsparung des sauren Lösungsmittels (TFA) stärker hervortreten, wenn die Anzahl der Kopplungs-/Entschützungs-Zyklen zunimmt.
Wo Thymosin-α&sub1;-Fragmente oder Analoga mit C-terminalen Aminosäuren, die nicht die Amidgruppe (-CONH&sub2;) besitzen, hergestellt werden, werden eher herköminliche Trägermaterialien als das bevorzugte Methylbenzhydrylamin-Harz oder Benzhydrylamin-Harz verwendet werden.
Geeignete für die Festphasen-Peptidsynthese nützliche Trägermaterialien sind diejenigen Substanzen, die gegenüber den Reagenzien und Reaktionsbedingungen der schrittweisen Kondensations-Entschützungsreaktionen inert sind und ebenfalls unlöslich in den verwendeten Medien sind. Geeignete Trägermaterialien sind Chlormethylpolystyrol-Divinylbenzol-Polymer, Hydroxymethylpolystyrol-Divinylbenzol-Polymer, fünktionalisierte, vernetzte Poly-N-acrylylpyrrolidin-Harze und dergleichen, besonders Chlormethylpolystyrol-1%- (oder 2%-) Divinylbenzol-Polymer. Die Befestigung an das Harz vom Chlormethylpolystyrol-Divinylbenzol-Typ wird erzeugt mit Hilfe der Reaktion der Moz-Aminosäure als ihrem Cäsium-, Tetramethylammonium-, Triethylammonium-, 4,5-Diazabicyclo[5.4.0]undec-5-en- oder ähnlichem Salz in Ethanol, Acetonitril, N,N-Dimethylformamid (DMF) und dergleichen, besonders dem Cäsium- Salz in DMF, mit dem Chlormethylharz bei einer erhöhten Temperatur, zum Beispiel zwischen etwa 40º und 60ºC, vorzugsweise etwa 50ºC, während etwa 12 bis 48 Stunden, vorzugsweise etwa 24 Stunden.
Diese Erfindung wird weiter veranschaulicht durch die folgenden, nicht-einschränkenden Beispiele.

Referenzbeispiel 1

Methylbenzhydrylamin-Harz

50,9 g Polystyrolharz-Kügelchen (Copolystyrol-1%-Divinylbenzol, 200-400-Mesh-Kügelchen, von Lab Systems, San Mateo, California) wurden in 500 ml Dichlorethan suspendiert. Die Gemische wurden unter gelindem mechanischen Rühren in einem Eisbad gekühlt, bis die Temperatur unter 5ºC sank.
15,5 g p-Toluoylchlorid und 13,3 g Aluminiumchlorid wurden in einem Tropftrichter in 250 mi Dichlorethan vermischt. Die Lösung wurde tropfenweise zu der gekühlten, gerührten Suspension der Harzkügelchen während einer Zeitspanne von etwa 40 Minuten zugegeben, wobei darauf geachtet wurde, daß der Reaktion nicht gestattet wurde, sich über 5ºC zu erwärmen. Das Rühren wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur fortgesetzt, wonach das Harz aufeinanderfolgend mit Isopropanol, Isopropanol-Wasser (1:1-Mischung) und Isopropanol gewaschen und getrocknet wurde, wodurch 53,8 g p-Tolylharz erhalten wurden. Dieses Harz wurde dann mit 168 g Ammoniumformiat, 201 ml Formamid, 134 ml Ameisensäure und 350 ml Nitrobenzol vermischt. Das Gemisch wurde allmählich unter Rückfluß auf 165-168ºC aufgeheizt und 1 Tag lang gehalten, wänrend welcher Zeit etwa 115 ml der wäßrigen Phase durch eine Dean-Stark-Falle aufgefangen wurden. Das Harz wurde wie oben gewaschen und getrocknet, um 55,5 g N-Formylmethylbenzhydrylamin-Harz zu ergeben. Das Produkt wurde in einem Gemisch von jeweils 300 ml 12 N HCl und Isopropanol 3 Stunden lang unter Rückfluß hydrolysiert. Waschen und Trocknen des sich ergebenden Harzes lieferten 54,9 g der Hydrochlorid-Form von Methylbenzhydrylamin-Harz. Es zeigte eine sehr starke positive Reaktion gegenüber dem Ninhydrin-Reagenz und lagerte 0,4 mmol Moz-Ala-OH an, wenn es neutralisiert und mit Moz-Ala-OH in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid gekoppelt wurde.

Referenzbeispiel 2

Synthese von Leu-Ala-Gly-Val

Moz-Val-OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-Harz (1,0 g; 0,52 mmol/g) wurde in das Reaktionsgefaß eines automatischen Beckman 990B Peptidsynthesegeräts eingebracht und die Synthese durchgeführt mit Moz-Gly-OH (0,5 g) im ersten Zyklus, Moz-Ala-OH (0,53 g) im zweiten Zyklus und Moz- Leu-OH (0,62 g) im letzten Zyklus unter Verwendung des DCC- (0,43 g) Kopplungsverfahrens. Das Gerät wurde programmiert, die folgenden Schritte in jedem Zyklus durchzuführen: 1) Vorwaschen mit dem 20fachen Volumen 10%iger TFA in CH&sub2;Cl&sub2;, das 0,05% Indol enthielt, 2) 28 Minuten langes Rühren in 10%iger TFA, 3) 3mal Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 4) Vorwaschen mit 10%igem Triethylamin (Et&sub3;N) in CH&sub2;Cl&sub2;, 5) 5 Minuten langes Rühren in 10%igem Et&sub3;N, 6) 3 mal Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 7) Zugeben von Moz-Aminosäure und DCC, dann 120 Minuten langes Rühren, 8) jeweils 3 Wäschen mit (a) CH&sub2;Cl&sub2;, (b) Isopropylalkohol (i-PrOH):CH&sub2;Cl&sub2;- Mischung (1:1) und (c) CH&sub2;Cl&sub2;. Keine doppelte Kopplung wurde während der gesamten Synthese verwendet. Das vollständige Tetrapeptid-Harz Moz-Leu-Ma-Gly-Val-OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;- Harz (1,15 g) wurde mit HF (10 ml) in Gegenwart von Anisol (1 ml) bei 0ºC 45 Minuten lang behandelt. Entfernung von überschüssiger Säure und Anisol in vacuo und Extraktion mit Wasser ergaben 0,22 g von rohem Leu-Ala-Gly-Val. Es besaß eine Aminosäurezusammensetzung von Gly, 0,95; Ala, 1,03; Val, 1,01; Leu, 1,00. Eine analytische HPLC auf einem Beckman Altex Model 344 Gradient System unter Verwendung einer Hamilton PRP-1 Umkehrphasensäule (4,1 × 150 mm), eluiert mit linearen Gradienten von pH 6,0, 0,03 M Kaliumphosphat, 4-12,5% Acetonitril, zeigte, daß die Substanz etwa 98% rein war. Sie wurde auf einem Becktnan Model 120B Aminosäure-Analysator analysiert, um den Gehalt an Deletions-Peptiden durch Ionenaustauschchromatographie zu bestimmen, und die Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt.
Eine entsprechende Synthese derselben Verbindung wurde unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, außer daß Boc-Val-OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-Harz und Boc-Aminosäuren (von Peptide Institute, Inc., Osaka, Japan) anstelle der Moz-Derivate verwendet wurden. Das sich ergebende Boc-Leu-Ala-Gly-Val-OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-Harz (1,10 g) wurde mit HF-Anisol behandelt und wie oben aufgearbeitet, wodurch 0,20 g von rohem Leu-Ala-Gly-Val erhalten wurden, das ein fast identisches HPLC-Muster mit dem aus dem Moz-Experiment erhaltenen zeigte. Aminosäure-Analyse: Gly, 0,97; Ala, 1,00; Val, 1,00; Leu, 0,97. Die Ergebnisse der Deletions-Peptid- Analyse auf einem Aminosäure-Analysator sind auch in Tabelle I gezeigt.

Referenzbeispiel 3

Geschwindigkeiten der Abspaltung der Moz-Gruppe und der Boc-Gruppe durch TFA Moz-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Val-OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-Harz (0,5 g, 0,42 mmol/g), das unter Befolgung derselben Arbeitsweise, die im Referenzbeispiel 2 verwendet wurde, hergestellt wurde, wurde mit dem 20-fachen Volumen 5%iger TFA in CH&sub2;Cl&sub2; gerührt. Nach gewünschten Zeitspannen wurden Proben (jeweils 20% der Gesamtmenge) entnommen, sofort auf eine Sinterglasfritte gebracht, trocken gesaugt, mit 10% Et&sub3;N in CH&sub2;Cl&sub2; gequencht und gründlich mit mehr CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Die neutralisierten Peptid-Harz-Proben (Ninhydrin positiv) wurden in kleine mit einem Deckel versehenen Glasfläschchen überführt und jeweils mit Boc- Phe-OH (53 mg) und DCC (41,2 mg) in 1 ml CH&sub2;Cl&sub2; 2 Stunden lang gerührt. Die Peptid- Harze wurden Ninhydrin-negativ. Nach gründlichem Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, i-PrOH-CH&sub2;Cl&sub2; (1:1) und MeOH, gefolgt von Trocknen, wurden die Proben einzeln in Dioxan-HCl (1:1) bei 110ºC 24 Stunden lang hydrolysiert und dann auf ihre Aminosäurezusammensetzungen untersucht. Das Verhältnis Phe/Ala wurde als der Bruchteil der Schutzgruppen angenommen, der vor der abschließenden Kopplung entfernt worden war. Dieselben Versuche wurden mit 10%iger TFA bei Moz-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Val-OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-Harz und ebenfalls mit 40%iger, 20%iger, 10%iger und 5%iger TFA an Boc-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Val-OCH&sub2;- C&sub6;H&sub4;-Harz wiederholt. Die Ergebnisse sind in Figur 1 gezeigt.

Beispiel 1

Synthese von Thymosin α&sub1;

MBHA-Harz (1,00 g; 0,40 mmol/g), wie es in Referenzbeispiel 1 erhalten wurde, wurde in das Reaktionsgefaß eines automatischen Beckman 990B Synthesegeräts eingebracht und mit 10%igem Et&sub3;N neutralisiert (20 Vol., 10 Minuten), 3mal mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und dann mit einem dreifachen Überschuß von Moz-Asparaginsäure-α-benzylester (äquivalente Menge DCC, 2 Stunden) gekoppelt. Die automatische Synthese wurde durch Zugeben der zutreffenden Moz-Aminosäure in jedem Zyklus weitergeführt, ähnlich derjenigen, die für die Modell- Tetrapeptidsynthese, die oben im Referenzbeispiel 2 beschrieben ist, programmiert wurde. Dreifache Überschüsse von Moz-Aminosäure und DCC wurden in jedem Zyklus verwendet. Zur Entschützung der Moz-Gruppe wurde 10%ige TFA in CH&sub2;Cl&sub2; mit 0,05% Indol (30 Minuten) verwendet. Das auf diese Weise erhaltene geschützte Thymosin-α&sub1;-Harz Ac-Ser(Bzl)- Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)- Thr(Bzl)-Lys(ClZ)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(ClZ)-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Lys(ClZ)-Glu(OBzl)-Val- Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asp(MBHA-Harz)-OBzl wog 3,55 g.
Ein Teil dieses geschützten Peptid-Harzes (1,05 g) wurde in einer Mischung aus TFA (16 ml), Anisol (2 ml) und Thioanisol (2,2 ml) in gewöhnlichen Laborgeräten und -apparaten aus Glas suspendiert, und ein gleichmaßiger Strom von trockenem HBr-Gas wurde 60 Minuten lang hindurchperlen gelassen. Die überschüssigen Säuren wurden rasch an einem Rotationsverdampfer (3 8ºC, 5 min) abgedampft und der Rückstand mit trockenem Ether auf eine Sinterglasfritte gewaschen. Nach weiterem Waschen mit mehr Ether wurde das Peptid in zwei Portionen von 25 ml 2%igem Ammoniumacetat extrahiert. Die Lösung wurde zu einem kleineren Volumen aufkonzentriert, auf einer Sephadex G-10 Säule (2,6 × 95 cm; 0,1 M HOAc) entsalzt und lyophilisiert, um 0,351 g von rohem Thymosin α&sub1; zu ergeben. Eine analytische HPLC dieser Substanz ist in Figur 2 gezeigt. Das Rohprodukt wurde auf der präparativen HPLC (eluiert mit pH 5,0, 0,3 M Kaliumphosphat, abgestuftem Gradienten 9% bis 10,37% CH&sub3;CN) gereinigt (Fig. 3), gefolgt von Entsalzen auf einer Sephadex G-10 Säule (5,2 × 95 cm; 0,1 M HOAc), um 0,123 g (35% Ausbeute) Thymosin α&sub1; zu liefern (siehe Figur 4), das bei einer analytischen HPLC identisch wanderte wie das natürliche Hormon und den anderswo hergestellten Standardsubstanzen. Aminosäure-Analyse (24-Stunden-Hydrolyse): Asp, 3,95; Thr, 2,89; Ser, 2,69; Glu, 6,20; Ala, 2,90; Val, 2,44; Ile, 0,95; Leu, 1,00; Lys, 4,01, (100 Stunden Hydrolyse): Asp, 4,09; Thr, 2,74; Ser, 2,13; Glu, 6,26; Ala, 2,92; Val, 3,00; Ile, 0,95; Leu, 1,00; Lys, 4,13.
Ein anderer Teil dieses geschützten Peptid-Harzes (0,55 g) wurde mit 1 ml Anisol vermischt und mit 10 ml HF bei 0ºC 45 Minuten lang in einer HF-Vorrichtung gerührt wie in Stewart, J. M. & Young, J. D. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; und Sakakibara, S., Kishida, Y., Kikuchi, Y., Sakai, R. und Kakiuchi, K. (1968) Bull. Chem. Soc. Japn., 41 1273-1276 beschrieben. Die flüchtigen Bestandteile wurden, zuerst mit einer Wasserstrahlpumpe, dann mit einer Hochvakuumpumpe, abgedampft und der Rückstand mit Ether auf eine Sinterglasfritte gewaschen. Eine Aufarbeitung wie oben ergab 0,189 g Rohprodukt, das ein demjenigen der obengenannten Substanz ähnliches chromatographisches Muster zeigte (siehe Figur 2).
Eine entsprechende Synthese von Thymosin α&sub1; unter Verwendung von Boc-Aminosäuren anstelle von Moz-Aminosäuren wurde auf dieselbe Art und Weise im automatischen Synthesegerät unter Verwendung des identischen Programms durchgeführt, außer daß 40%ige TFA in CH&sub2;Cl&sub2;, das 0,05% Indol enthielt, (30 Minuten) als Entschützungsagens verwendet wurde. Ausgehend von 1,05 g desselben MBHA-Harzes wurden 3,36 g geschütztes Thymosin- α&sub1;-Harz erhalten. Die Spaltung von 1,01 g dieses Peptid-Harzes mit dem HBr-Verfahren wie oben beschrieben lieferte 0,325 g von rohem Thymosin α&sub1;. Nach präparativer HPLC-Reinigung und Entsalzen wurden 0,095 g (29% Ausbeute) reine Substanz erhalten. Aminosäure- Analyse 24 Stunden Hydrolyse: Asp, 4,01; Thr, 2,93; Ser, 2,44; Glu, 6,15; Ala, 3,00; Val, 2,37; Ile, 0,86; Leu, 1,00; Lys, 4,14.
Dasselbe geschützte Peptid-Harz aus dem Boc-Verfahren wurde ebenfalls nach dem HF-Verfahren gespalten. Ausgehend von 0,5 g des Harzes wurden 0,166 g rohes Peptid erhalten. Ihre analytischen HPLC-Muster sind in Figur 2 gezeigt.
In diesen Beispielen wurde ein Waters PrepLC/system 500A mit Prepack-500/C&sub1;&sub8; (5 × 30 cm) für die präparative HPLC-Reinigung der synthetischen Peptide verwendet. Im Handel erhältliche Lösungsmittel von HPLC-Qualität und analysenreine Chemikalien wurden ohne weitere Reinigung verwendet.
Zur Aminosäure-Analyse wurde ein Beckman Model 6300 High Performance Analyzer verwendet.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von Trifluormethansulfonsäure zur Entschützung und Spaltung des Thymosin-α&sub1;-Harzes.
Geschütztes Thymosin-α&sub1;-Harz (0,508 g), das aus MBHA-Harz mit Moz-Aminosäuren auf dem automatischen Peptidsynthesegerät (Beckman 990B) wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, wurde mit 1 ml Anisol, 1 ml Thioanisol und 3 ml Trifluoressigsäure vermischt und mit 0,3 ml Trifluormethansulfonsäure, die tropfenweise während eines Zeitraums von 1 Minute zugegeben wurde, während schonend mit einem Magnetstab gerührt wurde, behandelt.
Nach weiteren 60 Minuten Rühren wurde das Gemisch in 100 ml trockenen Ether gegossen. Der gummiartige Niederschlag, der sich bildete, wurde kurz einige weitere Male mit frischem Ether gewaschen und das Peptid mit 30 ml 2%igem Ammoniumacetat gefolgt von wenigen ml Wasser extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden dann filtriert, um die festen Bestandteile zu entfernen, zu einem kleineren Volumen aufkonzentriert und auf einer Sephadex G-10 Säule (2,6 × 85 cm, 0,1 M HOAc) entsalzt. Die Lyophilisation des Peak-Peptids lieferte 0,164 g rohes Thymosin α&sub1;. Die Fig. 5-a zeigt die analytische HPLC des rohen Thymosin α&sub1;.
Das rohe Peptid wurde dann auf einer Hamilton PRP-Säule (21,5 × 250 mm, 10 Mikrometer, pH 6, 6,5% Acetonitril) gereinigt, um 0,057 g gereinigtes Thymosin α&sub1; zu ergeben. Die analytische HPLC dieser Substanz ist in Fig. 5-b gezeigt.

Aminosäure-Analyse: (6 N HCl, 100º)

24 Stunden Hydrol. Asp, 4,00; Thr, 2,91; Ser, 2,80; Glu, 5,99; Ala, 2,87; Val, 2,13; Ile, 0,96; Leu, 1,01; Lys, 3,83.
100 Stunden Hydrol. Asp, 4,00; Thr, 2,79; Ser, 2,30; Glu, 5,90; Ala, 2,85; Val, 2,66; Ile, 0,96; Leu, 1,09; Lys, 3,93.
Als ein Ergebnis der Verwendung von Moz als Nα-Schutzgruppe bei der Festphasen-Peptidsynthese gemaß dieser Erfindung werden nicht nur höhere Ausbeuten und höhere Reinheitsgrade des gegenständlichen Thymosin α&sub1; erzielt, sondern es besteht auch der zusätzliche wichtige Vorteil des Verbrauchs von nur etwa 20% bis etwa 25% des Gesamtvolumens an TFA im Vergleich zu etwa derselben Ausbeute an Peptid unter Verwendung der Boc-Schutzgruppe. Die Entsorgung der Abfallflüssigkeit wird daher einfacher sein, und die Menge an Schadstoff, die in die Umwelt gelangt, wird stark vermindert sein.
Die Verwendung von Trifluormethansulfonsäure anstelle von HBr oder HF als Spaltungs-/- Entschützungsagens sorgt für ähnliche Vorteile wie HBr, vermeidet aber zusätzlich die Verwendung von unter Druck stehendem HBr-Gas und die Unannehmlichkeit, das Gas durch das suspendierte Peptid-Harz hindurchperlen lassen zu müssen.
Noch weitere Verbesserungen der Gesamtausbeute werden erhalten, wenn Thioanisol und Anisol gleichzeitig während der Spaltung/Entschützung verwendet werden.
Die Wirksamkeit des gesamten Verfahrens wird durch die Verwendung von Tributylamin als Neutralisierungsmittel weiter erhöht, und erlaubt dadurch die Wiederverwertung des Methylenchlorids, Chloroforms oder anderer verhältnismäßig niedrigsiedender Lösungsmittel.
Obwohl die vorstehende Erfindung einigermaßen ausführlich durch Veranschaulichung und Beispiele zum Zweck der Klarheit des Verständnisses beschrieben worden ist, wird offensichtlich sein, daß gewisse Veränderungen und Abwandlungen innerhalb des Umfangs der beigefügten Patentansprüche praktiziert werden können.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Thymosin α&sub1; oder einem biologisch aktiven Analog oder Fragment davon durch Festphasen-Peptidsynthese, umfassend die folgenden Schritte: (a) vorübergehendes chemisches Schützen der reaktiven Aminogruppe an der α-Position mit 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, und jedweder anderen reaktiven Gruppen außer der β- Carbonsäuregruppe an der C-termimalen Aminosäure des Thymosin-α&sub1;-Peptids; (b) chemisches Binden der geschützten C-terminalen Aminosäure über die ungeschützte Carbonsäure (-COOH)-Gruppe davon an einem Harzträger; (c) chemisches Entschützen der reaktiven Aminogruppe der am Harz gebundenen, geschützten Aminosäure durch acidolytische Spaltung unter Verwendung von flüssiger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid oder Chloroformlösungsmittel und Neutralisieren des entschützten Peptidharzes mit Tributylamin; (d) chemisches Koppeln der nächsten Aminosäure in der gewünschten Sequenz über eine Peptidbindung in Gegenwart eines Kopplungsmittels, indem die am Harz gebundene Aminosäure aus Schritt (c) mit der nächsten Aminosäure in der gewünschten Sequenz in Kontakt gebracht wird, bei der die reaktiven Aminogruppe und alle anderen reaktiven Gruppen davon außer der Carbonsäuregruppe an der α- Position durch 4-Methoxybenzyloxycarbonyl chemisch geschützt sind; (e) chemisches Entschützen der reaktiven Aminogruppe der gekoppelten Aminosäure aus Schritt (d) durch acidolytische Spaltung unter Verwendung von flüssiger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid oder Chloroformlösungsmittel; (f) Fortsetzen der Synthese durch das Wiederholen der Schritte (d) und (e) mit der Reihe nach und eine zur Zeit hinzugesetzten Aminosäuren, bis die gesamte gewünschte Sequenz des geschützten Peptids auf dem Harz aufgebaut ist; (g) Spalten des geschützten Peptids von dem Harzträger und Entschützen geschützter Reaktionsgmppen unter sauren Spaltbedingungen unter Verwendung von flüssiger Trifluoressigsäure; und worin das Lösungsmittel aus der Abfallauge durch Destillation rückgewonnen wird, ohne Verunreinigung des Destillats durch das hochsiedende Tributylamin-Neutralisationsmittel.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt (c) das Entschützen der reaktiven Aminogruppe durch acidolytische Spaltung mit einer Lösung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid bei einem Volumenverhältnis von etwa 1:5 bis etwa 1:50 umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Volumenverhältnis von Trifluoressigsäure zu Methylenchlorid im Bereich von etwa 1:5 bis etwa 1:20 ist.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, worin Trifluoressigsäure bei etwa 8 bis etwa 15 Vol-% verwendet wird.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Trifluoressigsäure in einem Volumen von etwa 10 % verwendet wird.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der Harzträger Methylbenzhydrylamin-Harz beinhaltet.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der Harzträger Benzhydrylamin ist.

8. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin im Schritt (g) die Spaltung und Entschützung in Gegenwart von Trifluoressigsäure in Kombination mit Wasserstoffbromid, Thioanisol und Anisol durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Volumenverhältnis von Anisol zu Thioanisol von etwa 20:80 bis etwa 80:20 ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Volumenverhältnis von Anisol zu Thioanisol etwa 50:50 ist.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches in einem automatischen Festphasen-Peptidsynthesegerät durchgeführt wird.