DE68925338T2

DE68925338T2 - Gereinigte Deacetoxycephalosporin-C-Synthase

Info

Publication number: DE68925338T2
Application number: DE68925338T
Authority: DE
Inventors: Joe Edward Dotzlaf; Wu-Kuang Yeh
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1988-10-24
Filing date: 1989-10-19
Publication date: 1996-06-05
Anticipated expiration: 2009-10-20
Also published as: DE68925338D1; EP0366354A3; IL92079A; DK521489A; GR3018596T3; EP0366354A2; DK521489D0; ES2082787T3; EP0366354B1; JPH02242675A; US5082772A

Description

Die Erfindung betrifft die Enzymtechnologie. Insbesondere betrifft sie das Enzym Desacetoxycephalosporin-C-Synthase (DAOC) auch als "Expandase" bekannt, das aus Streptomyces clavuligerus erhalten wurde.
Das Enzym Expandase bewirkt die Ringerweiterung von Penicillin N zu DAOC während der Biosynthese von Cephalosporin C. DAOC wird dann umgewandelt zu Desacetylcephalosporin C (DAC) durch das Enzym Hydroxylase und das letztere zu Cephalosporin C durch die Wirkung einer Acetyltransferase.
Das bifunktionelle Enzym Expandase/Hydroxylase, das aus zellfreien Extrakten von Cephalosporium acremonium erhalten wurde, ist in der US-A 4 753 881 beschrieben. Das hierin bereitgestellte Expandaseenzym von S. calvuligerus unterscheidet sich von dem aus C. acremonium unter anderem dadurch, daß diesem die Hydroxylaseaktivität zur Umwandlung von DAOC zu DAC fehlt.
Aufgrund der Bedeutung der Cephalosporinantibiotika bei der Behandlung von infektiösen Krankheiten ermöglicht die Verfügbarkeit der Expandase in gereinigter Form die Untersuchung der Entwicklung von industriellen Verfahren zur Herstellung dieser Antibiotika. Ferner erlaubt die Verfügbarkeit des Enzyms die Untersuchung der Wirkung dieses Enzyms auf modifizierte Substrate, die zu strukturell unterschiedlichen Antibiotika führen könnten.
Die durch die Erfindung bereitgestellte gereinigte Desacetoxycephalosporin-C-Synthase wird aus Streptomyces clavuligerus erhalten und zeigt eine Expandaseaktivität, die Desacetoxycephalosporin C mit dem Substrat Penicillin N liefert. Im Gegensatz zum bifunktionellen Expandase/Hydroxylase-Enzym, das von Cephalosponum acremonium erhalten wird, fehlt dem gereinigten Enzym dieser Erfindung die Aktivität zur Umwandlung von DAOC zu Desacetylcephalosporin C (DAC). Jedoch katalysiert das von S. clavuligerus stammende Enzym in seinem teilweise gereinigten Zustand die Hydroxylierung von 3-Exomethylencephalosporin C zu DAC.
Das Enzym wurde aus zellfreien Extrakten von S. clavuligerus isoliert und in inaktiver Form durch Chromatographie gereinigt. Die aminoterminale Sequenz des Enzyms wurde bestimmt und zur Klonierung des Expandasegens in Escherichia coli verwendet, J.R. Miller et al., EP-A 0 341 892. Das Enyzm kann in größeren Mengen aus Kulturen des rekombinanten E. coli gewonnen werden und zur offensichtlichen Homogenität in aktiver Form durch ein fünfstufiges chromatographieverfahren gereinigt werden. Das rekombinant hergestellte Enzym ist mit dem nativen Enzym identisch.
Das gereinigte native Enzym, das aus zellfreien Extrakten von S. calvuligerus erhalten wurde, kann partiell durch Phenylmethylsulfonylfluorid und Ethanol stabilisiert werden. So stabilisiert zeigt das Enzym eine Steigerung der Halbwertszeit von 20 h auf 48 h und kann durch ein dreistufiges Chromatographieverfahren gefolgt von einer gelelektrophoretischen Elution gereinigt werden.
Das Enzym ist ein Proteinmonomer, das ein aus der Nuleotidsequenz abgeleitetes Molekulargewicht von 34 600 Dalton aufweist und ein durch SDS-PAGE bestimmtes von 34 000 bis 35 000 aufweist. Der aminoterminale Rest des Enzyms ist frei (unblockiert). Die 22 Aminosäuren lange Sequenz des aminoterminalen Rests des nativen Enzyms wurde durch herkömmliche Verfahren bestimmt und ist folgende: Met-Asp-Thr-Thr-Val-Pro-Thr-Phe-Ser-Leu-Ala-Glu-Leu-Gln- Gln-Gly-Leu-His-Gln-Asp-Glu-Phe. Die für den aminoterminalen Rest der 22 Aminosäuren langen Sequenz des rekombinant hergestellten Enzyms erhaltenen Daten zeigen einen Unterschied in der vierten Aminosäure. Im rekombinanten Enzym scheint die vierte Aminosäure Isoleucin (Ile) zu sein, während wie oben gezeigt die vierte Aminosäure für das native Enzym Threonin (Thr) ist. Sonst sind die Sequenzen identisch. Ob dieser Unterschied auf mehrere Isoenzyme oder auf einem experimentellen Fehler beruht ist derzeit unbekannt.
Die Aminosäurezusammensetzung des gereinigten Enzyms ist in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Aminosäurezusammensetzung der Expandase Aminosäure Anzahl an Resten pro 34 600 Dalton aBestimmt durch Extrapolation auf den Zeitpunkt Null der Hydrolyse bBestimmt als Cysteinsäure cBestimmt durch Hydrolyse in Gegenwart von Thioglycolsäure
Das gereinigte Enzym zeigt zwei distinkte isoelektrische Punkte: 5,3 ± 0,2 und 6,1 ± 0,2.
Das gereinigte Enzym zeigt die optimale Synthaseaktivität mit 0,2 bis 15 mE Enzym in 50 mM HEPES Puffer pH 7 in Gegenwart von 100 mM α-Ketoglutarat, 50 µM zweiwertigen Eisenionen und 500 µM DTT bei der Umsetzung von 100 µM Penicillin N zu DAOC über eine Reaktionszeit von 15 Minuten bei 36ºC.
Das Enzym zeigt eine enge Substratspezifität. Für das Enzym wird keine Synthaseaktivität (HPLC detektierbar) beobachtet mit Isopenicillin N, Penicillin G, Penicillin V, Ampicillin oder 6-Aminopenicillansäure unter den oben erwähnten optimalen Bedingungen zur Umwandlung von Penicillin N zu DAOC.
Das Enzym benötigt α-Ketoglutarat, zweiwertige Eisenionen und Sauerstoff zur Entfaltung seiner katalytischen Aktivität. Die DAOC Synthaseaktivität wird durch Dithiothreit (DTT) stimuliert. Es wird keine detektierbare Stimulierung durch ATP beobachtet.
Der Bedarf an zweiwertigen Eisenionen für die Entfaltung der Enzymaktivität kann nicht durch Magnesium-, zweiwertige Mangan-, zweiwertige Cobalt-, Calcium, zweiwertige Kupfer-, Nickel-, Zink-, Natrium oder Kaliumionen ersetzt werden. Dreiwertige Eisenionen können zweiwertige Eisenionen ersetzen, wenn sie in Gegenwart von DTT und Ascorbat vorkommen, obwohl das Enzym etwas weniger aktiv ist. Die Enzymaktivität wird in der angegebenen Reihenfolge gehemmt durch Zn²&spplus;> Co²&spplus;> Ni²&spplus;.
Das Enzym ist sehr empfindlich gegenüber der Hemmung seiner DAQC Synthaseaktivität durch EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und 1,10-Phenanthrolin. Das Enzym ist ebenfalls sehr empfindlich gegenüber der Hemmung durch bestimmte Sulfhydrylreagentien, beispielsweise p-Hydroxymercuribenzoat, (p-HMB), 5,5-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure (DTNB) und N-Ethylmaleinimid (NEM) und wird etwas durch Iodessigsäure gehemmt. Nach einer vollständigen Inaktivierung durch 0,2 mM DTNB in 0,5 Minuten bei 4ºC wird die Synthaseaktivität des Enzyms in 30 Minuten durch die Zugabe von 2 mM DTT zum Reaktionsgemisch vollkommen wiederhergestellt.
Die folgende Tabelle 2 zeigt die Wirkungen der oben diskutierten Metallchelatbildner und Sulfhydrylreagentien auf das Enzym. TABELLE 2 Wirkung von Metallchelatbildnern und Sulfhydrylreagentien auf die DAOC Synthase¹ Zusatz Konzentration relative Aktivität keiner o-Phenanthrolin Iodessigsäure ¹ Die enzymatischen Reaktionen werden in Gegenwart von 0,06 mM FeSO&sub4; und 0,1 mM DTT durchgeführt. Das Enzym wird mit dem angegebenen Inhibitor für 1 Minute vor dem Beginn der Reaktion mit Penicillin N inkubiert.
Bei der Umsetzung von Penicillin N zu DAOC durch die hierin bereitgestellte gereinigte Synthase bleibt das molare Verhältnis der Reaktion für die DAOC Bildung/Penicillin N Abnahme über 60 Minuten im Bereich von 0,90-0,98, wie dies in Figur 5 gezeigt ist. Die Umsetzung von Penicillin N zu DAOC ist unter den Reaktionsbedingungen zu 94 % vollständig.
Die durch die Erfindung bereitgestellte gereinigte Synthase zeigt die optimale Katalyse bei der Umsetzung von Penicillin N zu DAOC in Gegenwart von zweiwertigen Eisenionen, α-Ketoglutarat und Sauerstoff bei 36ºC entweder in 50 mM Tris-HOL Puffer pH 7,4 oder HEPES Puffer [N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-2-ethansulfonsäure] pH 7,0.
Die Kinetik des nativen und des rekombinanten Enzyms wurden unter den optimalen Reaktionsbedingungen für das Enzym bestimmt, das heißt bei pH 7,0 in 50 mM HEPES Puffer bei 36ºC. Der Km der rekombinant hergestellten DAOC Synthase beträgt für Penicillin N 29 µM und für α-Ketoglutarat 18 µM, wie dies durch das Lineweaver- Burk-Verfahren bestimmt wurde. Der Ka des Enzyms für Fe²&spplus; wird ähnlich mit 8 µM bestimmt. Die Vmax der rekombinanten Synthase beträgt 0,432 µmol gebildetes DAOC/min/mg Protein.
Die entsprechenden kinetischen Konstanten für die native Synthase, die mit dem teilweise gereinigten Enzym (Tabelle 3, Mono Q Eluat) unter denselben optimalen Reaktionsbedingungen ermittelt wurden, außer daß der HEPES Puffer durch Tris-HCl Puffer ersetzt wurde, sind Km (Penicillin N) = 35 µM, Km (α-Ketoglutarat) = 22 µM und Ka (Fe²&spplus;) = 4 µM.
Wie oben erwähnt fehlt der gereinigten Synthase der Erfinung die Hydroxylaseaktivität zur Umwandlung von DAOC zu DAC (Desacetylcephalosporin C), sie besitzt aber die Fähgkeit zur Umwandlung von 3-Exomethylencephalosporin C zu DAO. Daher liefert die Erfindung ein Verfahren zur Umwandlung von 7β-(α-Aminoadipamido)-3-exomethylencepham-4-carbonsäure "3-Exomethylencephalosporin C", das durch die folgende Formel dargestellt wird
zu Desacetylcephalosporin C, das das Mischen von 3-Exomethylencephalosporin C und α-Ketoglutarat mit der von Streotomyces clavuligerus stammenden Synthase bei einer Temperatur zwischen etwa 30ºC und etwa 40ºC in einem wäßrigen Medium, das zweiwertige Eisenionen enthält, in Gegenwart von Sauerstoff bei einem pH zwischen etwa 6,8 und etwa 7,6 umfaßt.
Das Verfahren wird im gewünschten pH Bereich in Gegenwart eines Puffers, wie Tris-HCl Puffer, durchgeführt. Vorzugsweise wird der pH des Gemisches zwischen etwa pH 7,0 und etwa 7,4 gehalten. Das Verfahren wird vorzugsweise bei einer Tempertur von etwa 36ºC ausgeführt, bei der die gereinigte Synthase ihre beste Aktivität zeigt.
Zweiwertige Eisenionen sind vorzugsweise in einer Konzentration zwischen etwa 20 µM und etwa 100 µM vorhanden und α-Ketoglutarat in einer Konzentration zwischen etwa 20 µM und etwa 300 µM.
Sauerstoff kann aus der Atmosphäre in ausreichender Menge geliefert werden, wenn das Verfahren in einem kleinen Maßstab, wie in einem kleinen Becher oder Kolben im Labormaßstab, durchgeführt wird, jedoch kann der Sauerstoff für Umsetzungen im größeren Maßstab in das Reaktionsgemisch geblasen werden.
Wie bei den meisten enzymatischen Reaktionen wird das Reaktionsgemisch bei einer Ausführung im Batch mit einer guten Durchmischung durch Rühren oder Schütteln versorgt. Alternativ dazu kann das Verfahren mit immobilisierter Synthase ausgeführt werden, wobei das wäßrige Medium, das das 3-Exomethylencephalosporin C, zweiwertige Eisenionen und α-Ketoglutarat enthält und wie oben beschrieben gepuffert ist, mit dem immobilisierten Enzym auf einem unlöslichen Träger in Kontakt gebracht wird. Solche Träger sind gut bekannt, beispielsweise ein quervernetztes Divinylbenzolharz oder ein Polyacrylmethacrylharz und können in Form von Kügelchen verschiedener Größen und Porengrößen vorliegen. Das immobilisierte Enzym kann in eine geeignete Säule gepackt werden und das wäßrige Medium, das das 3-Exomethylencephalosporin enthält, kann die Säule passieren. Sauerstoff kann die Säule nach oben durchströmen oder kann auf andere Weise zugegeben werden, beispielsweise kann dieser in das wäßrige Medium gegeben werden, wenn es auf die Säule aufgebracht wird.
Im allgemeinen wird ein Überschuß der gereinigten Synthase im Verfahren verwendet. Zusätzlich zu Fe²&spplus;, α-Ketoglutarat und Sauerstoff, die zur Entfaltung der enzymatischen Aktivität notwendig sind, können andere Faktoren, wie Reduktionsmittel, beispielsweise Dithiothreit, β-Mercaptoethanol, Dithioerythrit und Ascorbinsäure eine positive Wirkung entweder auf die Ausbeute oder die Geschwindigkeit des Verfahrens haben.
Das 3-Exomethylencephalosporin C ist ein starker Hemmstoff der DAOC Synthaseaktivität des Enzyms und die 3-Excmethylencephalosporin-C-Hydroxylaseaktivität des Enzyms wandelt DAOC nicht in DAC um. Demnach scheint es, daß die 3-exo-Hydroxylaseaktivität eine getrennte Funktion des Enzyms ist.
Die hierin bereitgestellte gereinigte Expandase kann aus zellfreien Extrakten von Streptomyces clavuligerus durch das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren erhalten werden. S. clavuligerus war für einige Zeit verfügbar und wurde von vielen Forschern bei der Untersuchung der Cephalosporinbiosynthese verwendet, beispielsweise S.E. Jensen et al., J. Antibiotics, 38, 263, 1985, S. Wolfe et al., Science, Band 226, 1386-1392, 1984 und US-A 4 536 476. S. clavuligerus ist auch von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC 27064 erhältlich.
Gemäß dem Verfahren werden zellfreie Extrakte von S. clavuligerus hergestellt und während der Präparation aus ganzen Zellen bei pH 7,5 mit einem Proteaseinhibitor, wie Phenylmethylsulfonylfluorid und Ethanol bei einer Temperatur von etwa 0ºC bis etwa 4ºC stabilisiert. Die Zentrifugation des stabilisierten Extrakts liefert einen zellfreien stabilisierten Rohextrakt. Der Rohextrakt wird zuerst bei einer Temperatur zwischen etwa 0ºC und etwa 4ºC über ein schwaches Anionenaustauscherharz chromatographiert, wobei die DAOC Synthase mit einem linearen KCl Gradienten als ein einzelner Aktivitätspeak eluiert wird, der gut von der DAOC Hydroxylaseaktivität getrennt ist. Die Fraktionen des DAOC Synthasepeaks werden vereinigt und durch Ultrazentrifugation konzentriert und das Konzentrat wird einer Gelfiltration unterzogen. Es wird ein einzelner Aktivitätspeak mit Tris-HCl Puffer pH 7,5 eluiert, der 10 % Ethanol enthält. Die 60 % der Aktivität enthaltenden Peakfraktionen werden vereinigt und einer schnellen Proteinflüssigchromatographie (FPLC) über ein starkes Anionenaustauscherharz unterzogen und die Synthase wird mit einem linearen KCl Gradienten in Puffer eluiert. Es wird ein einzelner Aktivitätspeak erhalten.
Das Hauptprotein (Mg von 34 000) eines Teils der Fraktion mit der höchsten Aktivität kann durch elektrophoretische Elution aus einem SDS-Gel fast bis zur Homogenität gereinigt werden.
Das Reinigungsverfahren kann als ein dreistufiges Verfahren betrachtet werden, das umfaßt 1) die Chromatographie über ein schwaches Anionenaustauscherharz, das die DAOC Hydroxylaseaktivität abtrennt, 2) Gelfiltration und 3) FPLC Chromatographie über ein starkes Anionenaustauscherharz.
Die Verfahrensschritte werden bei einer Temperatur von etwa 0ºC bei etwa 4ºC ausgeführt. Anfangs wird ein roher zellfreier Extrakt mit geernteten ganzen Zellen von Streptomyces clavuligerus hergestellt. Die Zellen werden in 15 mM Tris-HCl Puffer pH 7,5, der 10 Volumenprozent Ethanol enthält und später als E-Puffer bezeichnet wird, suspendiert. Die Zellen werden durch Ultraschall aufgebrochen, während ein Proteaseinhibitor, wie Phenylmethylsulfonylfluorid oder Diisopropylfluorphosphat zugegen ist. Das ultrabeschallte Gemisch wird bei 40 000 x g für etwa 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird als Enzymrohextrakt verwendet.
Im ersten Schritt des Verfahrens wird der kalte Rohextrakt über ein schwaches Anionenaustauscherharz chromatographiert, das vorher mit E-Puffer äquilibriert wurde. Schwache Anionenaustauscherharze, die verwendet werden können, sind Cellulosederivate, beispielsweise Diethylaminoethylcellulose, wie die im Handel erhältliche DEAE-Cellulose, Whatman, Inc. und die Acrylcopolymerharze, wie die copolymere von N-[Tris-(hydroxymethyl)methyl]acrylamid mit einem sekundären Monomer eines anionischen Acrylderivats. Das im Handel erhältliche Diethylaminoethyltrisacryl, wie DEAE- Trisacryl LS, IBF Biotechnics, Inc., ist ein geeignetes Anionenaustauscherharz.
Der kalte Rohextrakt wird auf die Säule aufgetragen, die Säule wird mit E-Puffer gewaschen und das gebundene Protein wird mit einem linearen Kaliumchloridgradienten (0-0,35 M) im E-Puffersystem eluiert. Die DAOC Synthase wird als einzelner Aktivitätspeak gut getrennt vom DAOC Hydroxylaseaktivitätpeak abgetrennt, wie dies in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt wird.
Die etwa 60 % der gesamten Synthaseaktivität enthaltenden Peakfraktionen werden vereinigt und durch Ultrafiltration auf ein kleines Volumen konzentriert. Das Synthasekonzentrat wird der Gelfiltration im zweiten Schritt des Verfahrens unterzogen. Das Gel wird mit Puffer E vor der Verwendung äquilibriert und das Protein wird aus dem Gel mit E-Puffer eluiert. In einer typischen Filtration erhält man die Synthaseaktivität als einzelnen Peak. Gele vom quervernetzten Polysaccharidtyp sind zur Verwendung im Verfahren geeignet, beispielsweise die quervernetzten Dextran- und Agarosegele, die im Handel als Sephadex, Sepharose und Superose (Pharmacia, Inc.) und Ultragel A44 (IBF Biotechnics, Inc., Villeneuve-la-Giaremere, Frankreich) erhältlich sind.
Die etwa 60 % der gesamten Synthaseaktivität enthaltenden Peakfraktionen der Gelfiltration werden vereinigt und durch FPLC über ein starkes Anionenaustauscherharz chromatographiert, das mit E-Puffer vor der Verwendung äquilibriert wurde. Ein bevorzugtes Harz ist das polymere Anionenaustauscherharz Mono Q (Pharmacia, Inc.). Das gebundene Protein wird mit einem linearen KCl-Gradienten (0-0,5 M) in E-Puffer eluiert. Man erhält einen einzelnen Synthaseaktivitätspeak. Die Fraktion mit der höchsten Aktivität wird zur Bestimmung der Eigenschaften des gereinigten Enzyms verwendet, die später beschrieben werden.
Die Fraktionen von dem einzelnen Peak, die die Synthaseaktivität enthalten, können bei -70ºC gelagert werden, bis sie benötigt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren liefert im allgemeinen das Enzym in einer Reinheit von mehr als 85 % und gewöhnlich liegt die Reinheit zwischen 90 % und 98 %.
Wie dies oben erwähnt wurde, wurde die von S. calvuligerus stammende Synthase rekombinant hergestellt, wie dies von J.R. Miller et al., EP-A 0 341 892 beschrieben wurde. Die rekombinant hergestellte Synthase wurde ebenfalls gereinigt und das Enzym ist zum Enzym aus der natürlichen Quelle identisch.
Die Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung der rekombinant hergestellten Synthase.
Das Verfahren zur Reinigung des rekombinant hergestellten Enzyms ist dem ähnlich, das oben für die Reinigung des nativen Enzyms beschrieben wurde. Da jedoch das rekombinante Enzym in konzentrierter Form und größerer Menge gebildet wird als in der natürlichen Quelle und da verschiedene Fremdproteine von den zwei Quellen gebildet werden, unterscheiden sich die zwei Verfahren.
Das durch einen rekombinanten E. coli hergestellte Enzym wird in Granula innnerhalb der Zellen konzentriert. Im allgemeinen wird das Verfahren folgendermaßen durchgeführt. Ein Granulaextrakt des Enzyms wird zuerst über ein schwaches Anionenaustauscherharz mittels eines linearen Natriumchloridgradienten zur Elution chromatographiert. Es wird ein einzelner Aktivitätspeak erhalten und die etwa 60 % der gesamten Enzymaktivität enthaltenden Eluatfraktionen werden vereinigt. Das Volumen der vereinigten Fraktionen wird durch Ultrafiltration auf ein kleines Volumen verringert. Das Konzentrat wird einer Gelfiltration unterzogen und das gebundene Protein wird unter Bildung eines einzelnen Aktivitätspeaks vom Gel mit Puffer eluiert. Die etwa 60 % der gesamten Enzymaktivität enthaltenden Peakfraktionen werden vereinigt und mit 0,1 mM Penicillin N versetzt. Die vereinigten Fraktionen werden dann über ein starkes Anionenaustauscherharz (FPLC) mit einem Puffer bei pH 8 chromatographiert und das gebundene Protein wird mit einem linearen NaCl-Gradienten in einem Puffer mit pH 8 eluiert. Man erhält nach dem Test zwei Aktivitätspeaks. Die etwa 60 % der Enzymaktivität des Hauptpeaks enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und mittels Ultrafiltration konzentriert. Das Konzentrat wird einer Gelfutration unterzogen und das gebundene Protein wird unter Verwendung eines mit 0,1 KCl versetzten Puffers unter Bildung von zwei teilweise getrennten Aktivitätspeaks eluiert. Die etwa 80 % der Enzymaktivität des Hauptpeaks enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und einer FPLC über ein starkes Anionenaustauscherharz mit einem Puffer bei pH 7 unterzogen, der mit 0,05 M KCl versetzt ist. Die Säule wird mit einem linearen KCl-Gradienten in einem Puffer mit pH 7 eluiert. Die Fraktionen des Hauptaktivitätspeaks, die eine Synthaseaktivität von mindestens 275 mE/ml aufweisen, werden vereinigt und bei -70ºC für die spätere Verwendung gelagert.
Zuerst werden die Synthase enthaltenden Granula aus den E. coli Zellen durch Homogenisierung der Zellen in einem gepufferten Medium, beispielsweise 50 mM Tris-HCl pH 7,5 Puffer isoliert. Die mit DAOC-Synthase angereicherten Granula können durch eine differentielle Zentrifugation bei 8 000 x g für etwa eine Minute abgetrennt werden. Die Granula werden in Puffer resuspendiert und mit 5 M Harnstoff in 15 mM Tris-HCl pH 8,0 resuspendiert, worin 5 mM DTT und 10 Volumenprozent Glycerin enthalten sind (im folgenden UDG-Puffer). Das Gemisch wird bei 40 000 x g für etwa 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand des Granulaextrakts, der die rohe DAOC-Synthase enthält, wird dann im hierin bereitgestellten Verfahren gereinigt.
Das folgende Verfahren wird bei einer Temperatur zwischen etwa 0ºC und etwa 4ºC ausgeführt. Alle Puffer werden vor der Verwendung gründlich entgast.
Der Rohextrakt wird zuerst über ein schwaches Anionenaustauscherharz chromatographiert, wie einem der hierin vorher zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung des Enzyms aus der natürlichen Quelle beschriebenen. Ein bevorzugtes Harz ist DEAE-Sepharose (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ). Das Harz wird zuerst mit UDG Puffer äquilibriert und nach der Beladung des Harzes mit Rohextrakt wird das Harz mit UDG-Puffer gewaschen. Das gebundene Protein wird mit einem linearen Salzgradienten, beispielsweise KCl oder NaCl, vorzugsweise NaCl (0-0,3 M) eluiert. Die Synthase wird als einzelner Aktivitätspeak erhalten, wie dies in Figur 3A der Zeichnungen gezeigt ist. Die etwa 60 % der gesamten Enzymaktivität enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und durch Ultrafiltration auf ein kleines Volumen konzentriert.
Das Konzentrat wird einer Gelfiltration über ein geeignetes Gel, vorzugsweise eines wie Bio-Gel A0.5m, das von Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA erhalten werden kann, unterzogen. Das Gel wird mit UDG-Puffer vor der Verwendung äquilibriert. Das Protein wird vom Gel mit UDG-Puffer eluiert, was zu einem einzelnen Aktivitätspeak führt, wie dies in Figur 3B der Zeichnungen gezeigt ist.
Erneut werden die etwa 60 % der gesamten Enzymaktivität enthaltenden Peakfraktionen vereinigt und mit 0,1 mM Penicillin N zur Stabilisierung des Enzyms versetzt. Die vereinigten Fraktionen werden einer FPLC über ein starkes Anionenaustauscherharz unterzogen. Starke Anionenaustauscherharze, wie die, die im Handel erhältlich sind, beispielsweise Accell (Waters Associates), QAE-Sephadex (Pharmacia, Inc.) und Mono Q (Pharmacia, Inc.) können verwendet werden. Ein bevorzugtes Harz ist Mono Q. Das Harz wird mit Glycerin-freiem UDG-Puffer bei pH 8,0 vor der Verwendung äquilibriert. Die gebundenen Proteine werden mit einem linearen NaCl- Gradienten (0-0,5 M) im Äquilibrierungspuffer eluiert. Man erhält zwei Aktivitätspeaks (Haupt- und Nebenpeak) in der Chromatographie, wie dies in der Figur 3C der Zeichnungen gezeigt ist.
Die etwa 60 % der Enzymaktivität des Hauptpeaks enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und durch Ultrafiltration auf ein kleines Volumen konzentriert. Das Konzentrat wird einer Gelfiltration über ein geeignetes Gel unterzogen. Ein bevorzugtes Gel ist Superose (Pharmacia, Inc.), das im Handel erhältlich ist. Das Gel wird mit dem Glycerin-freien Puffer vor der Verwendung äquilibriert, und das Protein wird mit dem Glycerin-freien Puffer eluiert, der mit 0,1 M KCl versetzt ist. Zwei teilweise getrennte Aktivitätspeaks werden beobachtet, wie dies in Figur 3D der Zeichnungen gezeigt ist.
Als nächstes werden die etwa 80 % der Enzymaktivität des Hauptpeaks enthaltenden Fraktionen vereinigt, mit 0,1 mM Penicillin N zur Stabilisierung versetzt und erneut über ein starkes Anionenaustauscherharz, wie Mono Q, chromatographiert. Das Harz wird mit dem Glycerin-freien Puffer bei pH 7,0 statt bei pH 8, wie mit dem UDG-Puffer der ersten oben beschriebenen FPLC äquilibriert. Die gebundenen Proteine werden mit einem linearen KCl-Gradienten (0,05-0,2 M) eluiert, der im Äquilibrierungspuffer enthalten ist. Die Auftragung des Chromatogramms zeigt den Hauptpeak der Synthaseaktivität, wie dies in Figur 4A der Zeichnungen gezeigt ist.
Die Reinigung des Enzyms kann während des Verfahrens durch SDS-PAGE verfolgt werden. Die Figur 4B der Zeichnungen ist eine Reproduktion der Photographie des Gels nach einer Elektrophorese der Enzymproben bei verschiedenen Verfahrensstufen. Wie in Figur 4B gezeigt, ist die dem einzelnen Fleck der DAOC-Synthase entsprechende Spur im wesentlichen frei von anderen Proteinen.
Die in aktiver Form aus dem obigen Reinigungsverfahren für die rekombinante Synthase erhaltene DAOC-Synthase ist zu etwa 97 % rein, wie dies durch laserdensitometrisches Scannen des SDS-PAGE- Gels gezeigt wird. Demnach ist das oben beschriebene Verfahren zur Reinigung der rekombinanten Synthase das bevozugte erfindungsgemäße Verfahren.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter beschreiben und sind nicht als Beschränkung gedacht.
Falls nichts anderes angegeben ist, wird die DAOC-Synthase folgendermaßen getestet: Ein Reaktionsgemisch von 1 ml enthält 0,28 µmol Penicillin N, 0,3 µmol α-Ketoglutarat, 0,06 µmol FeSO&sub4;, 0,25 µmol Ascorbat, 1 µmol Dithiotreit und 0,0002 bis 0,015 Einheiten Enzym in 50 mM Tris-HCl Puffer pH 7,4. Die enzymatische Reaktion wird durch die Zugabe von Penicillin N gestartet und für 15 Minuten bei 36ºC durchgeführt. Die Synthaseaktivität wird durch Aufzeichnung der DAOC-Bildung bei 260 nm mit HPLC bestimmt, wie dies von J.E. Dotzlaf und W.K. Yeh (1987), J. Bacteriol. 169, 1611-1618 beschrieben ist.

Beispiel 1

Isolierung und Reinigung der DAOC Synthase von S. clavuligerus

Ein Stamm des Cephamycin C-bildenden Streptomyces calvuligerus ATCC 27064 wird in 500 ml Erlenmeyerkolben unter Verwendung der von J.G. Whitney et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Band 1, Seiten 247-251 (1972) beschriebenen Bedingungen angezogen. Nach einer Kultivierung für 2 Tage werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und mit 15 mM Tris-HCl Puffer pH 7,5 in Gegenwart von 10 % Ethanol und 1,0 M KCl gewaschen. Die Zellen werden dann mit salzfreiem Puffer gewaschen und bis zur Verwendung bei -70ºC gelagert.
Die Isolierung und Reinigung der DAOC Synthase aus den S. calvuligerus Zellen wird bei einer Temperatur zwischen etwa 0ºC und etwa 4ºC durchgeführt. Alle Puffer werden vor der Verwendung gründlich entgast.
Frische Zellen (Naßgewicht 300 g) werden in 15 mM Tris-HCl pH 7,5 in Gegenwart von 10 % Ethanol (hierin später E-Puffer) in einem Gesamtvolumen von 600 ml suspendiert. Die Zellen werden durch Ultrabeschallung bei 4ºC oder darunter aufgebrochen. Während der Ultrabeschallung werden 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Desoxyribonuklease (1 µg/ml)/MgSO&sub4; (10 mM) zur Suspension gegeben. Nach der Ultrabeschallung wird die aufgeschlossene Zellsuspension bei 40 000 x g für 30 Minuten zentrifugiert und der Überstand wird als Zellrohextrakt verwendet.
Der Rohextrakt wird auf eine DEAE-Trisacryl LS Säule (2,6 x 50 cm) aufgetragen, die vorher mit E-Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit zwei Bettvolumina E-Puffer gewaschen und die gebundenen Proteine werden mit einem linearen KCl Gradienten (0-0,35 M) in E-Puffer eluiert. Die DAOC Synthase wird als einzelner Aktivitätspeak gut getrennt von der DAOC Hydroxylaseaktivität eluiert (Figur 1).
Die 60 % der gesamten Synthaseaktivität enthaltenden Peakfraktionen werden vereinigt und durch Ultrafiltration mit einem BlS Minicon Konzentriergerät (Amicon) auf 5 ml konzentriert. Das Konzentrat wird auf eine Ultragel A44 Säule (2,6 x 95 cm) aufgetragen, die vorher mit E-Puffer äquilibriert wurde und das Protein wird mit E-Puffer eluiert. Es wird ein einzelner Aktivitätspeak erhalten.
Die 60 % der gesamten Synthaseaktivität enthaltenden Peakfraktionen werden vereinigt und auf eine Mono Q Säule (1 x 10 cm), Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ aufgetragen, die vorher mit E-Puffer äquilibriert wurde. Gebundene Proteine werden mit einem linearen KCl Gradienten (0-0,5 M) in E-Puffer eluiert. Es wird ein einzelner Aktivitätspeak erhalten. Die Fraktion mit der höchsten Synthaseaktivität wird bei -70ºC bis zur weiteren Verwendung gelagert. Das Hauptprotein (nämlich mit einem MG von 34 000) von einem Aliquot (1,0 mg) dieser Fraktion der Mono Q Säule wird weiter durch elektrophoretische Elution aus einem 12 %igen SDS-PAGE-Gel gereinigt.
Die SDS-PAGE Analyse (Figur 2) zeigt, daß das Hauptprotein etwa 50 % des gesamten Proteins aus der Fraktion ausmacht und nach der elektrophoretischen Elution ist es nahezu homogen. Das Gelgereinigte Protein ist jedoch als DAOC Synthase inaktiv. In Figur 2 enthalten die Spuren 1 und 4 2,5 µg von Proteinstandards. Die Spuren 2 und 3, "Geleluat" enthalten 5 µg des Gel-eluierten S. clavuligerus Proteins von der Reinigung der nativen Synthase.
Die oben beschriebene dreistufige Reinigung der S. clavuligerus Synthase ist in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3 Reinigung der DAOC Synthase von S. clavuligerus Schritt Protein¹ Aktivität² sp. Akt.³ (E/mg) Ausbeute (%) Rohextrakt DEAE-Trisacryleluat Ultragel A44-Eluat Mono Q-Eluat ¹der Proteingehalt wird durch das Verfahren von M.M. Bradford (1979), Anal. Biochem. 72, 248-254 unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. ²eine Einheit (E) der Enzymaktivität wird als Menge an Synthase definiert, die zur Bildung von einem µmol DAOC pro Minute aus Penicillin N im vorher beschriebenen Testverfahren erforderlich ist. ³die spezifische Aktivität sind die Einheiten (E) pro mg Protein.

Beispiel 2

Isolierung und Reinigung der rekombinanten DAOC Synthase

Das folgende Reinigungsverfahren wird bei einer Temperatur zwischen etwa 0ºC und etwa 4ºC durchgeführt und alle Puffer werden vor der Verwendung gründlich entgast.
Der Escherichia coli K12 Stamm JM109, der eine Kopie des DAOC Synthasegens von S. clavuligerus enthält, wird in 10 Liter Fermentern unter den für die Schüttelkolbenkulturen beschriebenen Bedingungen in der anhängigen Patentanmeldung EP-A 0 192 273 vom 9. Mai 1988 angezogen. Etwa 6 Stunden nachdem die Fermentationstemperatur von 30ºC auf 42ºC angehoben wurde, werden die E. coli Zellen durch Zentrifugation gewonnen und werden durch die für die S. calvuligerus Zellen verwendeten Verfahren gewaschen, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist.
Die gewaschenen Zellen werden in 50 mM Tris-HCl Puffer pH 7,5 suspendiert und in einem Gaulin Homogenisator zerstört. Die mit DOAC Synthaseprotein angereicherten Granula werden durch differentielle Zentrifugation bei 8 000 x g für 1 Minute isoliert.
Die Granula werden mit 5 M Harnstoff in 15 mM Tris-HCl Puffer pH 8 in Gegenwart von 5 mM Dithiothreit (DTT) und 10 % Glycerin (UDG Puffer) aufgelöst und das Gemisch wird bei 40 000 x g für 15 Minuten unter Bildung eines Granulaextrakts (Überstand) zentrifugiert. Der Extrakt wird auf eine DEAE-Sepharosesäule (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) (1,6 x 25 cm) aufgetragen, die vorher mit UDG Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit zwei Bettvolumina desselben Puffers gewaschen und die gebundenen Proteine werden mit einem linearen NaCl-Gradienten (0-0,3 M) eluiert. Die Synthase wird als einzelner Aktivitätspeak erhalten, wie dies in Figur 3A gezeigt ist.
Die 60 % der gesamten Enzymaktivität enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und durch Ultrazentrifugation mit einem B15 Minicon Konzentriergerät (Amicon) auf ein Volumen von 2 ml konzentriert. Das Konzentrat wird auf eine Bio-Gel A0.5 m Säule (Bio- Rad Laboratories, Richmond, CA) (1,6 x 95 cm) aufgetragen, die vorher tnit UDG Puffer äquilibriert wurde. Das gebundene Protein wird mit UDG Puffer eluiert und es wird ein einzelner Aktivitätspeak erhalten, wie dies in Figur 3B gezeigt ist. Die 60 % der gesamten chromatographierten Enzymaktivität enthaltenden Peakfraktionen werden vereinigt, mit 0,1 mM Penicillin N versetzt und auf eine Mono Q Säule (0,5 x 5 cm) aufgetragen, die vorher mit dem Glycerin-freien Puffer (5 M Harnstoff, 15 mM Tris-HCl pH 8,0 und DTT) äquilibriert wurde. Die gebundenen Proteine werden mit einem linearen NaCl-Gradienten (0-0,5 M) im Puffer eluiert, der für die Äquilibrierung der Säule verwendet wurde. Es werden zwei Aktivitätspeaks erhalten, wie dies in Figur 3C gezeigt ist.
Die 60 % der Enzymaktivität des Hauptpeaks enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, mit einem Centricon-30 (Amicon) auf ein Volumen von 0,5 ml konzentriert und auf eine Superose-Säule (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) (1,6 x 85 cm) aufgetragen, die vorher mit dem Glycerin-freien Puffer äquilibriert wurde. Das gebundene Protein wird mit dem Glycerin-freien Puffer eluiert, der mit 0,1 M KCl versetzt ist. Zwei teilweise getrennte Aktivitätspeaks werden erhalten, wie dies in Figur 3D gezeigt ist.
Die 80 % der Enzymaktivität des Hauptpeaks enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden mit 0,1 mM Penicillin N versetzt und werden auf eine zweite Mono Q Säule (0,5 x 5 cm) aufgetragen, die mit dem Glycerin-freien Puffer pH 7,0 (anstatt pH 8,0 für den UDG Puffer) äquilibriert wurde, welcher mit 0,05 M KCl versetzt war. Die gebundenen Proteine werden mit einem linearen KCl Gradienten (0,05-0,2 M) im Äquilibrierungspuffer eluiert. Die Aktivität und die Proteinelutionsmuster sind in der Figur 4A gezeigt. Die drei Fraktionen mit einer Synthaseaktivität von mindestens 275 mE/ml werden vereinigt.
Das vereinigte Eluat wandert bei einer Analyse durch SDS- PAGE als eine Haupt- und eine Nebenproteinbande (Figur 4B). Ein laserdensitrometrisches Scannen des Gels zeigt, daß das Hauptprotein zu mehr als 95 % rein ist.
Die oben beschriebene Reinigung der rekombinant hergestellten DAOC Synthase ist in der folgenden Tabelle 4 zusammengefaßt. Die gereinigte rekombinante DAOC Synthase ist in einer aktiven Form.
In Figur 4B (SDS-PAGE der rekombinant hergestellten DAOC Synthase) enthalten die Spuren 2/8 2,5 µg des Proteinstandards, die Spur 1 20 µg des Granulaextrakts und die Spuren 3/7 20 µg des DEAE-Sepharoseeluats, Biogel A0.5 m Eluats, Mono Q I Eluats, Superose 12 Eluats und Mono Q II Eluats unter Bezugnahme auf die folgende Tabelle 4. Tabelle 4 Reinigung der DAOC Synthase aus rekombinanten E. coli Schritt Protein (mg) Aktivität (E) Ausbeute (%) Granulaextrakt DEAE-Sepharose-Eluat Bio-Gel A0.5m-Eluat Mono Q I-Eluat Superose 12-Eluat Mono Q II-Eluat
Das für den rekombinanten DAOC-bildenden E. coli Stamm verwendete Klonierungsverfahren wird folgendermaßen durchgeführt.

A. Kultivierung von E. coli K12 RR1ΔM15/pOW380

Lyophilisierte E. coli K12 RR1ΔM15/pOW380 können von den Northern Regional Research Laboratories (NRRL), Peoria, IL 61604 unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18264 erhalten werden und direkt als "Kultur" im anschließend beschriebenen Verfahren verwendet werden.
Ein Liter TY Medium (8 g Trypton, 5 g NaCl und 5 g Hefeextrakt pro Liter), das 100 µg/ml Ampicillin enthält, wird mit einer Kultur von E. coli K12 RR1ΔM15/pOW380 beimpft und unter Belüftung bei 37ºC über Nacht (15-18 Stunden) inkubiert. Die entstehende Kultur wird als Quelle für Plasmid pOW380 verwendet.

B. Isolierung von Plasmid pOW380

Die in Beipsiel 1A hergestellte Kultur wird bei 5 200 U/min für 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der entstehende Überstand wird verworfen. Das Zellpellet wird in 28 ml einer Lösung aus 25 % Saccharose und 50 mM EDTA resuspendiert. Etwa 1 ml einer Lösung aus 20 mg/ml Lysozym in 50 % Glycerin und 0,25 M Tris-HCl pH = 8,0 und etwa 1,5 ml 0,5 M EDTA pH = 8,0 werden zugegeben und mit der Zellsuspension vermischt. Das entstehende Gemisch wird für 15 Minuten auf Eis inkubiert. Drei ml Lyselösung (hergestellt durch Mischen von 3 ml 10 % Triton X-100, 75 ml 0,25 M EDTA pH 8,0 und 7 ml Wasser) werden zu den Lysozymbehandelten Zellen unter sanftem Mischen gegeben. Die entstehende Lösung wird für weitere 15 Minuten auf Eis inkubiert.
Der Zeildebris wird durch Zentrifugation bei 17 000 U/min für etwa 45 Minuten bei 4ºC entfernt. Etwa 28,6 g CsCl und 1 ml einer 5 mg/ml Ethidiumbromidlösung werden zu den 30 ml Überstand gegeben. Dann wird das Volumen mit Wasser auf 40 ml eingestellt und die Lösung in ein Ultrazentrifugenröhrchen dekantiert. Das Röhrchen wird zugeschmolzen und die Lösung wird bei 49 500 U/min für 18 Stunden zentrifugiert. Die entstehende Plasmidbande, durch ultraviolettes Licht sichtbargemacht, wird isoliert, mit Salz-gesättigtem Isopropanol unter Entfernung des Ethidiumbromids extrahiert und gegen dreimal gewechselten 20 Volumina TE Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5 und 1 mM EDTA) dialysiert. Das Dialysat wird gesammelt, dann werden zwei Volumina Ethanol und OJOS Volumina 3 M Natriumacetatlösung zugegeben. Das Ethanolgemisch wird auf -20ºC abgekühlt und die Plasmid DNA wird durch Zentrifugation bei 10 000 U/min für 30 Minuten bei -10ºC pelletiert. Das entstehende Pellet wird in 1 ml TE Puffer resuspendiert und dann mit einem gleichen Volumen eines Phenol : Chloroform Gemisches (1:1, V/V) extrahiert. Die DNA in der wäßrigen Phase wird durch die Zugabe von 0,1 Volumina 3 M NaOAC und 2 Volumina Ethanol, gefolgt von einer Inkubation bei -20ºC für 30 Minuten und einer Zentrifugation bei 15 000 U/min für 20 Minuten gewonnen. Das entstehende DNA Pellet wird zuerst mit 70 % Ethanol und dann mit 100 % Ethanol gewaschen und dann getrocknet.
Die durch dieses Verfahren erhaltenen 1,5 mg an Plasmid pOW380 DNA werden in 1,5 ml 0,1fachem TE Puffer suspendiert und bei -20ºC gelagert.

Konstruktion des Phagen mOW380

Es können identische Plasmidkonstrukte unter Verwendung verschiedener Verfahren und Quellen der Gensequenzen erhalten werden. Der Phage mOW380 wird durch Ligation des DAOCS-Gen-enthaltenden 3 kb BamHI Restriktionsfragment von Cosmid pOW379 mit dem BamHI-verdauten M13 Vektor in der replikativen Form (RF) konstruiert. Der Cosmidklon pOW379 stammt von einer genomischen Streptomyces clavuligerus Cosmidbank und wurde durch Hybridisierung nicht nur mittels des IPNS Gens von S. lipmanii sondern auf einer "Vermutungs" DNA-Sonde identifiziert, die auf der Grundlage der aminoterminalen Aminosäuresequenz der gereinigten S. clavuligerus Expandase und der speziessepezifischen Godonverwendung entworfen wurde. Der gewünschte M13 Phagenklon kann unter Verwendung der "Vermutungs" Sonde in einem Plaquehybridisierungsverfahren oder durch Restriktionsanalyse identifiziert werden. Aufgrund der vorliegenden Erfindung wird jedoch die Konstruktion von mOW380 stark vereinfacht, vor allem da das Plasmid pOW380 als Quelle des S. calvuligerus DAOCS-Gens verwendet werden kann. Der von M13 stammende Phage mOW380 ist ein nützliches Zwischenprodukt bei der ortsspezifischen Mutagenese, die zur Bildung einer NdeI Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende der für die S. clavuligerus Expandase kodierenden Sequenz durchgeführt wurde.

A. Isolierung des 3 kb BamHI Restriktionsfragments von Plasmid pOW380

Etwa 25 µg der wie in Beispiel 1B hergestellten Plasmid pOW380 DNA werden in 25 µl 0,1fach TE Puffer zu 40 µl 10fach BamI Puffer (1,0 M NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 und 100 mM MgCl&sub2;), 335 µl Glas-destilliertem Wasser und 5 µl ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym BamI gegeben und vermischt. Falls nichts anderes angegeben ist, werden die Restriktionsenzyme von New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverley, MA 01915 bezogen. Die Einheitendefinition hierin entspricht der speziellen Einheitendefinition des Herstellers. Die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 90 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird dann mit Phenol und Chloroform extrahiert und die Bam-verdaute Plasmid pOW380 DNA wird mit NaOAc und Ethanol gefällt und dann in 9 µl H&sub2;O resuspendiert. Etwa 1 M1 Auftragspuffer (25 % V/V Glycerin, 0,05 % G/V Bromphenolblau und 0,05 % xylencyanol) wird zur DNA Lösung gegeben, die dann auf einem 1 %igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen wird, bis das gewünschte 3 kb BamHI Restriktionsfragment deutlich von den anderen Produkten des Verdaus abgetrennt ist.
Die DNA wird nach der Elektrophorese durch Färben des Gels in einer verdünnten Ethidiumbromidlösung (0,5 µg/ml) und Aussetzen des gefärbten Gels gegenüber langwelligem UV-Licht sichtbargemacht. Nach der Lokalisierung der Fragmente macht man einen kleinen Schnitt in das Gel vor dem 3 kb Fragment und gibt ein Stück Schleicher und Schuell DEAE Membran (Keene, NH 03431) in den Schnitt. Bei weiterer Elektrophorese bindet die DNA nicht-kovalent an die DEAE Membran. Nachdem das gewünschte Fragment an die DEAE Membran gebunden ist, wird die Membran entfernt und mit Niedrigsalzpuffer (100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA und 20 mM Tris-HCl pH = 8) gewaschen. Als nächstes wird die Membran in ein kleines Röhrchen gesteckt, in Hochsalzpuffer (1 M NaCl, 0,1 mM EDTA und 20 mM Tris- HCl pH = 8) getaucht und dann bei 65ºC für 10 Minuten inkubiert, um die DNA vom DEAE Papier zu entfernen. Nach der 65ºC Inkubation wird der Inkubationspuffer gesammelt, und die Membran wird mit Hochsalzpuffer gewaschen. Die Waschlösung wird mit dem Inkubationspuffer vor dem Gewinnen der gewünschten DNA Fragmente vereinigt.
Das Volumen der Hochsalz-DNA-Lösung wird so eingestellt, daß die NaCl Konzentration 0,25 M beträgt und dann werden drei Volumina kaltes, absolutes Ethanol zu der Lösung gegeben. Die entstehende Lösung wird gemischt und für 10-20 Minuten auf Eis gestellt. Die Lösung wird dann bei 15 000 Upm für 15 Minuten zentrifugiert. Nach einer weiteren Fällung zur Entfernung des restlichen Salzes wird das DNA Pellet mit 70 %igem Ethanol gewaschen, getrocknet, in 20 µl TE Puffer resupendiert und enthält das gewünschte Restriktionsfragment. Etwa 0,6 Mg des 3 kb Fragments werden erhalten.

B. Herstellung der BamHI-verdauten M13mp19 RF Vektor-DNA und Konstruktion des Phagen mOW380

Etwa 2,5 µg M13mp19 RF DNA (erhältlich von New England Biolabs (NEB)) werden in 100 µl BamHI Puffer mit 1 µl ( 20 Einheiten) Restriktionsenzym BamHI für 90 Minuten bei 37ºC verdaut. Das Reaktionsgemisch wird mit Phenol:Chloroform extrahiert und die DNA in der wäßrigen Phase wird durch Ethanolfällung konzentriert. Das DNA Pellet wird in 20 µl 0,1fachem TE Puffer resuspendiert und enthält 2 µg des gewünschten BamHI-verdauten M13mp19 Vektors. Die erhaltene Vektor DNA wird bei -20ºC gelagert.
Zwei µl des 3 kb BamHI Restriktionsfragments von Plasmid pOW380 und 1 µl des BamHI-verdauten Vektors M13mp19 werden in einer 20 µl umfassenden Reaktion ligiert, die die DNA Fragmente, 2 µl 10fach Ligasepuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 und 100 mM MgCl&sub2;), 2 µl 5 mM ATP, 1 µl 6 µg/µl RSA, 12 µl Glas-destilliertes Wasser und 1 µl (1 Weiss-Einheit) T4 DNA Ligase (NEB) enthält. Die Reaktion wird für 18 Stunden bei 15ºC inkubiert. Die ligierte DNA enthält den gewünschten Phagen mOW380 zusammen mit anderen Ligationsprodukten.
Es werden kompetente E. coli K12 JM109 ("Epicurean Coli ") von Stratagene (3770 Tansy Street, San Diego, CA 92121) bezogen und mit einem den Phagen mOW380 enthaltenden Ligationsreaktionsgemisch im wesentlichen gemäß den Anweisungen des Herstellers transformiert, außer daß die DNA in einem Volumen von 20 µl vorliegt und keine Verdünnung in Medium oder eine Expressionszeit notwendig ist. Nach der Transformation werden die Zellen in 1, 10, 20, 40 und 50 µl Proben in sterile 13 x 100 mm Glasröhrchen verteilt, die 0,25 ml/Röhrchen E. coli K12 JM109 in der logarithmischen Wachstumsphase enthalten. Zu diesen Röhrchen werden 3 ml Überschichtungsagar gegeben (L-Medium mit 0,8 % Agar, das bei 45ºC geschmolzen gehalten wird). Das Zellen-Überschichtungsagar-Gemisch wird dann auf L-Agarplatten ausplattiert, die 40 µg/ml 5-Brom-4- chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal) und 0,1 M Isopropylthio-β- galactosid (IPTG) enthalten, und die Platten werden bei 37ºC über Nacht inkubiert. (Für ausführlichere Beschreibungen und Erklärungen der M13 Verfahren siehe M13 Cloning/Dideoxy Sequencing Instruction Manual, Bethesda Research Laboratories (BRL), Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD 20877.) Die Transformanden werden durch Insertionsinaktivierung der β-Galactosidaseaktivität (farbloser Plaquephänotyp) und Restriktionsenzymanalyse der replikativen DNA Form (RF) identifiziert. Für Screeningzwecke werden klare Plaques mit einer Pasteurpipette aus der Plattenüberschichtung ausgestochen und in 3 ml pro Plaque einer E. coli K12 JM1O9 Kultur in der frühen logarithmischen Wachstumsphase überführt. Die Kulturen werden 6 bis 18 Stunden bei 37ºC mit Belüftung inkubiert.
Nach dieser Inkubation werden 1,5 ml jeder Kultur in getrennten 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäßen pelletiert. Die Überstände werden in frische Röhrchen dekantiert und bei 4ºC gelagert, um als Quelle für das Phagenimpfgut zu dienen. Die replikative Form der DNA wird aus den Zellpellets im wesentlichen gemäß dem alkalischen Plasmidisolierungsverfahren von Birnboim und Doly, 1979, Nuc. Acid Res. 7(6): 1513-1523 mit folgenden Ausnahmen präpariert. Das Verfahren wird so erweitert, daß 1,5fache Volumina der Lösungen I, II und III verwendet werden und das klare Lysat einmal mit einem gleichen Volumen CHCl&sub3; extrahiert wird. Die DNA wird dann durch die Zugabe von 0,4 Volumina Isopropanol und einer Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten gefällt. Die DNA wird durch Zentrifugation gewonnen und dann mit Ethanol aus 0,3 M NaOAc gefällt. Die Analyse des Restriktionsmusters der RF DNA wird durch das Vorkommen einer asymmetrischen ScaI Restriktionsschnittstelle vereinfacht, die für das Vorkommen der gewünschten Insertion nicht nur diagnostisch ist, sondern auch zur Orientierung der Insertionssequenz relativ zum Polylinker (MCS) des M13 Vektors verwendet werden kann. Durch dieses Verfahren werden E. coli K12 JM109/mOW380 Zellen identifiziert und diese Zellen werden dann als Quelle für den Phagen mOW380 zur ortsspezifischen Mutagenese wie im folgenden beschrieben verwendet.

C. Präparation von einzelsträngiger Phagen mOW380 DNA und Ortssdezifische Mutagenese zur Konstruktion des Phagen mOW381

Eine 10 ml Kultur von E. coli K12 JM109 wird in der frühen logarithmischen Wachstumsphase mit 200 µl Phagenstammlösung (hergestellt in Beispiel 28) beimpft und 18 Stunden bei 37ºC mit Belüftung inkubiert. Die Kultur wird zentrifugiert und der entstehende Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt und erneut zentrifugiert. Der Überstand wird erneut in ein frisches Röhrchen dekantiert. Ein ml einer Lösung aus 25 % Polyethylenglycol (Molekulargewicht etwa 3 350) in 3 M NaCl wird zum überstand gegeben, der dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wird. Das entstehende Gemisch wird für 30 Minuten bei 10 000 U/min zentrifugiert. Das durch die Zentrifugation erhaltene Pellet enthält den einzeisträngigen Phagen mOW380 und wird in 400 µl TE Puffer resuspendiert. Die Lösung wird zuerst mit CHCl&sub3; und dann mit TEgesättigtem Phenol extrahiert. Das Phenol läßt man mit der wäßrigen Phase für 15 Minuten in Kontakt. Die Lösung wird dann zweimal mit einem Gemisch aus TE-gesättigtem Phenol CHCl&sub3; (1:1, V/V) und zweimal mit CHCl&sub3; alleine extrahiert. Die DNA wird dann aus 0,3 M NaOAc gefällt, durch Zentrifugation gewonnen und das entstehende Pellet wird in 100 µl 0,1fachem TE Puffer resuspendiert. Diese Lösung besteht aus 5 µg einzeisträngiger Phagen mOW380 DNA.

E. Mutagenese

Die bei der Mutagenese (und den anschließenden Hybridisierungen zur Detektion der gewünschten Phagen) verwendeten einzelsträngigen DNA Fragmente werden mit Ausnahme des M13 Universalprimers (ein 15-mer), der von BRL bezogen wird, auf einem automatisierten DNA Synthesegerät synthetisiert. Die Mutagenesefragmente werden folgendermaßen bezeichnet: (1) STNDE-A, eine 41 Nukleotide lange einzelsträngige DNA, die zur DAOCS-kodierenden Sequenz im Phagen mOW380 bis auf drei Basen homolog ist, wobei die Fehlbasenpaarung (unterstrichen) eine NdeI Restriktionsschnittstelle bei etwa Position 1 der für DAOCS kodierenden Sequenz, mit folgender DNA Sequenz bildet:
(2) STNDE-B, eine 17 Nukleotide lange einzelsträngige DNA, die lediglich ein Unterabschnitt von STNDE-A mit folgender Sequenz ist:
Die 5'-Enden von etwa 100 pmol von STNDE-A werden in einem Reaktionsgemisch phosphoryliert, das enthält einzelsträngige DNA in einer Konzentration von 1 pmol/µl, 10 µl 10fach Ligasepuffer, 1000 pmol Adenosintriphosphat (ATP), 10 µl 0,1 M DTT, 65 µl Glasdestilliertes Wasser und 1 µl (10 Richardson-Einheiten) der T4 Polynukleotidkinase (Boehringer Mannheim Biochemicals, (BMB) 7941 Castleway Drive, P.O. Box 50816, Indianapolis, Indiana 46250). Das Reaktionsgemisch wird bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert, wonach zusätzlich 1 µl Enzym zugegeben wird. Das Reaktionsgemisch wird dann für weitere 30 Minuten bei 37ºC inkubiert und dann wird die Reaktion durch eine fünfminütige Inkubation auf 68ºC gestoppt. Die 5'-Enden von etwa 40 pmol M13 Universalprimer werden in einem analogen Reaktionsgemisch von 40 µl phosphoryliert, das dieselbe Enzymmenge enthält.
Die einzelsträngige Phagen mOW380 DNA wird im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Adelman et al., 1983, DNA 2(3): 183-193 mutagenisiert, wie dies später beschrieben ist. Die Anelierungsreaktion wird ausgeführt durch Zugabe von 500 Nanogramm (in 15 µl 0,1 fachem TE Puffer) einzelsträngiger Phagen mOW380 DNA zu 8 µl 10fach Anelierungspuffer (100 mM Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM EDTA und 500 mM NaCl), 4 µl (4 pmol) phosphoryliertem STNDE-A, 4 µl (4 pmol) phosphoryliertem M13 Universalsequenzierungsprimer und 50 µl Wasser und einer Inkubation des Gemisches bei 80ºC für 2 Minuten, dann bei 55ºC für 5 Minuten und schließlich bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
Die Extensionsreaktion wird durch Zugabe von 120 µl des folgenden Gemisches zur Lösung anelierter DNA ausgeführt: 20 µl lofach Klenow-Ligase-Puffer (100 mM Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM EDTA und 500 mM NaCl), 20 µl 0,1 M DTT, 20 µl einer Lösung von jeweils 6,25 mM dGTP, dATP, TTP und dCTP, 20 µl 5 mM ATP, 120 µl Wasser, und 2,5 µl (12,5 Einheiten) Klenowenzym (BMB). Das Extensionsreaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 1 Stunde, dann bei 37ºC für 4 Stunden und schließlich bei 14ºC für 18 Stunden inkubiert.
Das Extensionsreaktionsgemisch wird einmal mit CHCl&sub3; extrahiert und die DNA wird mit Ethanol und NaOAc gefällt und durch Zentrifugation gewonnen. Das DNA Pellet wird in 400 µl 1fach S1 Puffer (0,3 M NaCl und 3 mM ZnOAc) resuspendiert. Die Hälfte der DNA Lösung wird als Reserve bei 20ºC aufbewahrt, und die andere Hälfte wird in fünf 1,5 ml Röhrchen aliquotiert. Zu vier dieser Röhrchen wird 1 µl S1 Nuklease (BMB) gegeben, die auf 200 30- Minuteneinheiten pro µl verdünnt wurde. Die Reaktionen werden bei Raumtemperatur für jeweils 5, 10, 15 und 20 Minuten inkubiert. Die Reaktionen werden gestoppt, indem man zuerst 5-10 µg tRNA zum Reaktionsgemisch als Träger gibt und dann mit einem TE-gesättigtem Phenol-CHCl&sub3; Gemisch (1:1, V/V) extrahiert. Die nicht mit S1 behandelte Probe (Negativkontrolle) wird ebenfalls extrahiert. Die DNA in der wäßrigen Phase wird durch Ethanolfällung konzentriert und durch Zentrifugation gewonnen. Die DNA Pellets werden jeweils in 20 µl Wasser resuspendiert.
Zehn µl von jeder dieser entstehenden S1-behandelten DNA Lösungen werden zur Transformation von E. coli K12 JM109 im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 28 beschriebenen Verfahren verwendet, außer daß die Platten weder X-Gal noch IPTG enthalten. Die gewünschten Transformanden werden durch Hybridisierung des radioaktiv markierten Oligonukleotids STNDE-B mit der Phagen DNA identifiziert, die wie unten beschrieben auf Nitrocellulosefilter geblottet ist.
Nach der Plaquebildung werden die Platten bei 4ºC für 1 Stunde inkubiert, um die Agarüberschichtung aushärten zu lassen. Die Nitrocellulosefilter werden auf den Rasen von jeweils zwei Platten der negativ Kontrolle, der 10 Minuten mit S1 behandelten Reihe und der 20 Minuten mit S1 behandelten Reihe gelegt, die 50- 200 Plaques enthalten. Der Kontakt zwischen dem Filter und der Rasenoberfläche wird für 1 Minute aufrechterhalten, wonach die Nitrocellulosefilter mittels gesättigten 3 MM Chr Filterpapieren (Whatman Labales, Inc. P.O. Box 1359, Hillsboro, Oregon 97123- 1359) mit 0,1 N NaOH-1,5 M NaCl für 5 Minuten und dann mit 0,5 M Tris-HCl (pH = 7,0) -3 M NaCl für 5 Minuten behandelt werden. Die Nitrocellulosefilter werden luftgetrocknet und dann im Vakuum bei 80ºC für 30 Minuten eingebacken.
Die Nitrocellulosefilter werden für 5 Minuten bei Raumtemperatur in einer Lösung aus 6fach SSC (20fach SSC ist 3 M NaCl und 0,3 M Natriumcitrat), lüfach Denhardt's Lösung (0,2 g Polyvinylpyrrolidon, 0,2 g Rinderserumalbumin und 0,2 g Ficoll pro 100 ml Wasser), 0,1 % NAPPi, 0,1 % SDS und 10 Mg/ml denaturierter chromosomaler E. coli DNA prähybridisiert. Die Filter werden dann in einer Lösung aus 6fach SSC, lüfach Denhardt's Lösung 0,1 % NaPPi und 1 pmol/5 ml ³²P-STNDE-B hybridisiert. Der ³²P-STNDE-B wird durch Phosphorylierung der 5'-Enden von 100 pmol STNDE-B im wesentlichen gemäß dem vorher in diesem Beispiel beschriebenen Verfahren hergestellt, außer daß 70 pmol gamma-³²P-ATP (New England Nuclear (NEN), 549 Albany Street, Boston, MA, 02118, Katalognummer NEG- 002A) anstatt nicht radioaktivem ATP verwendet werden. Nach der Hybridisierung werden die Filter zweimal für 5 Minuten pro Waschschritt im Überschuß mit 6fach SSC bei Raumtemperatur, dann bei 52ºC im Überschuß mit 6fach SSC für 20 Minuten pro Waschschritt gewaschen. Die Filter werden luftgetrocknet und für 2 Stunden bei -70ºC mit einem Quanta III Verstärkerschirm (Dupont, Instrument Produkts, Biomedical Division, Newtown, CN 06470) autoradiographiert. Die gewünschten Mutanten, jene, die die zur Sequenz von STNDE-B komplementären Sequenzen enthalten, belichten den Film aufgrund der Bindung des radioaktiv markierten Oligomers an die auf dem Filter gebundene Plasmid DNA. Die Identität einer korrekten Mutante, als Phage mOW381 bezeichnet, wird durch Restriktionsanalyse der RF DNA bestätigt, welche im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 28 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.

E. Abschließende Konstruktion von Plasmid pOW381

Obwohl die RF DNA des Phagen mOW381 die für DAOCS kodierende Sequenz auf dem NdeI-BamHI Restriktionsfragment enthält, das zur Konstruktion des E. coli Expressionsplasmids pOW382 verwendet wurde, ist es manchmal schwierig, die RF von mOW381 in ausreichender Menge zur Fragmentisolierung anzureichern. Um die Konstruktion des E. coli Expressionsplasmids pOW382 zu erleichtern, wird das als Zwischenstufe verwendete Plasmid pOW381 konstruiert.
Die DNA in der replikativen Form aus E. coli K12 JM 109, die mit dem Phagen mOW381 infiziert sind, wird im wensentlichen gemäß dem in Beispiel 28 beschriebenen Verfahren isoliert. Etwa 10 µg der RF DNA der Phagen mOW381 DNA werden mit den Restriktionsenzym BamHI ( 10 Einheiten) in einer Reaktion verdaut, die die DNA in einfachem BamHI Puffer enthält. Nach einer Inkubation für 90 Minuten bei 37ºC wird das Reaktionsgemisch einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und das 3 kb BamHI Fragment wird im wesentlichen gemäß Beispiel 2A isoliert.
Die BamHI-verdaute Plasmid pUC8 DNA (die Plasmid pUC8 DNA ist von BRL erhältlich) wird im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 2B beschriebenen Verfahren isoliert. Fünf µl ( 1 Mg) des aus dem Phagen mOW381 isolierten 3 kb BamHI DNA Fragments und 1 µl (100 ng) der BamHI-verdauten Plasmid pUC8 DNA werden im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 28 beschriebenen Verfahren ligiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pOW381 zusammen mit anderen Ligationsprodukten. Das Plasmid pOW381 weist eine identische Restriktionskarte zu Plasmid pOW380 auf, außer daß eine zusätzliche NdeI Restriktionsschnittstelle etwa am ersten Godon der für DAOCS kodierenden Sequenz vorkommt.
Die das gewünschte Plasmid pOW381 enthaltende Ligationsreaktion wird in kompetente E. coli K12 RR1ΔM15 (NRRL B-15440) transformiert. Aliquots des Transformationsgemisches werden auf L- Agarplatten plattiert, die Ampicillin (100 Mg/ml) X-Gal (40 µg/ml) und IPTG (0,1 M) enthalten. Die Platten werden bei 37ºC für 18 Stunden inkubiert. Ampicillin-resistente Transformanden mit einer weißen Koloniefarbe (aufgrund der Insertionsinaktivierung des α-Fragments der β-Galactosidase, das auf dem Plasmid pUC8 kodiert ist) werden weiter durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA zur Identifizierung der gewünschten Plasmid pOW381 Transformanden gescreent. Die Plasmid DNA wird aus 3 ml Kulturen im wesentlichen gemäß dem oben zur Präparation der RF DNA aus Phagen- M13-infizierten E. coli K12 JM109 Zellpellets beschriebenen Verfahren von Birnboim und Doly präpariert. Die Plasmid pOW381 DNA von einem Transformand wird im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren zur Verwendung in anschließenden Konstruktionen präpariert.

Konstruktion von Plasmid pOW382

Das Plasmid pOW382 kann durch Ligation des 2,4 kb NdeI- BamHI Restriktionsfragments von Plasmid pOW381, das die für die Streptomyces calvuligerus Expandase (DAOCS) kodierende Sequenz enthält, mit dem 5,8 kb NdeI-BamHI Restriktionsfragment von Plasmid pCZR336 konstruiert werden. Das 5,8 kb NdeI-BamHI Fragment von pCZR336 enthält DNA Sequenzen, die für den Lambda pL Promotor, eine Translationsaktivierungssequenz, den cI857 Repressor, einen Plasmidreplikationsursprung und ein Tetracyclinresistenzverleihendes Gen kodieren. Das Plasmid pCZR336 enthält auch eine kodierende Sequenz für das humane Wachstumshormon. Die in dem 5,8 kb NdeI-BamHI Fragment von Plasmid pCZR336 enthaltenen DNA Sequenzen können konstruiert weren, wie dies in Teil A dieses Beispiels beschrieben ist.

A. Konstruktion des 5.8 kb NdeI-BamHI Restriktionsfragments von Plasmid pCZR336

Das meiste der DNA im 5,8 kb NdeI-BamHI Restriktionsfragment von Plasmid pCZR336 kann von Plasmid pCZR111 auf einem 5,75 kb XbaI-BamHI Restriktionsfragment isoliert werden. Das Plasmid pCZR111 kann aus E. coli K12 RV308/pCZR111 erhalten werden, der von den NRRL unter der Hinterlegungsnumer NRRL B-18249 erhalten werden kann. Das Plasmid pCZR111 verleiht eine Resistenz gegenüber 10 µg/ml Tetracyclin und ihm fehlt eine ClaI Restriktionsschnittstelle.
Das Plasmid pCZRLXI wird ebenfalls mit den Enzymen XbaI und BamHI verdaut und das große XbaI-BamHI Fragment wird aus Agarose gereinigt. Dieses XbaI-BamHI Restriktionsfragment von Plasmid pCZR111 wird mit einem doppelsträngigen XbaI-NdeI Restriktionsfragment ligiert, das durch das Phosphotriesterverfahren synthetisiert wurde, um das 5,8 kb NdeI-BamHI Restriktionsfragment von Plasmid pCZR336 zu erhalten (Figur 2). Das doppelsträngige DNA Fragment hat die folgende Sequenz:

B. Isolierung des 2,4 kb NdeI-BamHI Fragments von Plasmid pOW381

Etwa 25 µg (in 25 µl 0,1fachem TE Puffer) der Plasmid pOW381 DNA werden zu 4 µl 10fach NdeI Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,8, 70 mM MgCl&sub2; und 1,5 M NaCl), 6 µl H&sub2;O, 3 µl Restriktionsenzym NdeI und 3 µl Restriktionsenzym BamHI gegeben und vermischt. Das entstehende Reaktionsgemisch wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert und anschließend einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Das -2,4 kb NdeI-BamHI Fragment wird aus dem Agarosegel isoliert und zur Ligation präpariert.

C. Abschließende Konstruktion von Plasmid pOW382 und E. coli K12 JM109/pOW382

Etwa 1 µl ( 0,5 Mg) des 5,8 kb NdeI-BamHI Restriktionsfragments der Plasmid pCZR336 DNA und 4 µl ( 0,1 Mg) des isolierten 2,4 kb NdeI-BamHI Restriktionsfragments von pOW381 werden im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren ligiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pOW382. Die Ligationsreaktion wird in kompetente E. coli K12 JM109 Zellen (Stratagene) im wesentlichen gemäß den Empfehlungen des Herstellers transformiert. Das Transformationsgemisch wird auf Tetracyclin enthaltende (10 Mg/ml) TY Agarplatten plattiert und die Platten werden bei 25ºC-30ºC inkubiert, um die Transkription vom Lambda pL Promotor zu verhindern. Die gewünschten Transformanden werden durch ihren Tetracyclin-resistenten Phänotyp und durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA identifiziert.

Test der von E. coli gebildeten DAOCS Aktivität

A. Kultivierung von E. coli K12 JM109/pOW382 zur Expression der DAOCS Aktivität

Ein E. coli K12 JMXOg/pOW382 Transformand wird über Nacht bei 30ºC in 500 ml L-Medium (enthält 10 µg/ml Tetracyclin) in einem Schüttelinkubator (250 Upm) angezogen. Die Zellen werden bofach durch Zugabe von 10 ml der Übernachtkultur zu 990 ml frischem Medium, das 10 Mg/ml Tetracyclin enthält, in einem 2,8 l Kolben verdünnt und für eine weitere Stunde bei 30ºC unter denselben Wachstumsbedingungen inkubiert. Die Temperatur des Rundschüttelinkubators wird dann auf 42ºC angehoben und die Inkubation wird für weitere 6,5 Stunden fortgesetzt. Der temperatursensitive cI857 Repressor des Lambda pL Promotors, der zur Steuerung der für DAOCS kodierenden Sequenz auf Plasmid pOW382 positioniert ist, wird bei 42ºC inaktiviert, so daß bei 42ºC die Expression der DAOCS in den Wirtszellen stattfindet. Nach der Induktion werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und als bevorzugte Quelle der von E. coli gebildeten DAOCS Aktivität verwendet.

Claims

1. Desacetoxycephalosporin-C-Synthase in gereinigter Form, die ein Monomer ist mit einem Molekulargewicht von etwa 34 600 Dalton, die zwei isoelektrische Punkte von 5,3 ± 0,2 und 6,1 ± 0,2 aufweist, die die folgende aminoterminale Sequenz aus 22 Aminosäuren aufweist: Met-ASP-Thr-Ile-Val-Pro-Thr-Phe-Ser-Leu-Ala-Glu- Leu-Gln-Gln-Gly-Leu-His-Gln-Asp-Glu-Phe, die die folgende Aminosäurezusammensetzung aufweist: Aminosäure Anzahl an Resten pro 34 600 Dalton aBestimmt durch Extrapolation auf den Zeitpunkt Null der Hydrolyse bBestimmt als Gysteinsäure cBestimmt durch Hydrolyse in Gegenwart von Thioglycolsäure

die zweiwertige Eisenionen, α-Ketoglutarat und Sauerstoff für die Entfaltung ihrer Aktivität benötigt, die eine erhöhte Aktivität in Gegenwart von Dithiothreit entwickelt, die die folgenden kinetischen Parameter zeigt:

Km (Penicillin N) = 29 µM

Km (α-Ketoglutarat) = 18 µM

Ka (Fe²&spplus;) = 8 µM

der die Desacetoxycephalosporin-C-Hydroxylaseaktivität fehlt und die die Fähigkeit zur Umwandlung von 7β-(α-Aminoadipamido)- 3-exomethylencepham-4-carbonsäure zu Desacetylcephalosporin C besitzt.

2. Verfahren zur Präparation des Enzyms nach Anspruch 1, das die folgenden Schritte umfaßt:

1. Herstellung eines zellfreien Extrakts des Rohenzyms aus einer Wirtszelle, die das Enzym von Anspruch 1 exprimiert, der bei pH 7,5 bis 8,0 in der Gegenwart eines Reduktionsmittels gepuffert ist,

2. Chromatographie dieses Extrakts über ein Anionenaustauscherharz in Gegenwart eines Reduktionsmittels und Puffers und Elution dieses Enzyms mit einem linearen Gradienten von bis etwa 0,3 M NaCl oder KCl,

3. Konzentrierung der Chromatographiefraktionen von Schritt 2 durch Ultrafiltration, die 60 % der Enzymaktivität enthalten und Filtration dieser Fraktionen durch ein Gel mit einem Puffer,

4. Chromatographie über ein starkes Anionenaustauscherharz bei einem gepufferten pH von etwa 8 in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wobei das Gelfiltrat von Schritt 3 60 % der Enzymaktivität enthält, und Elution dieses Enyzms mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl,

5. Konzentrierung der chromatographischen Fraktionen von Schritt 4 durch Ultrafiltration, die 60 % der Enzymaktivität enthalten, und Filtration dieser Fraktionen durch ein Gel mit Puffer, der 0,1 M KCl enthält, und

6. Chromatographie über ein starkes Anionenaustauscherharz bei einem gepufferten pH von 7 in Gegenwart von etwa 0,05 M KCl der Gelfiltratfraktionen von Schritt 5, die 80 % der Enzymaktivität enthalten, und Elution dieses gereinigten Enzyms mit einem gepufferten linearen Gradienten von 0,05 bis 0,2 M KCl bei pH 7, worin die Schritte 1-6 bei einer Temperatur von etwa 0ºC bis etwa 4ºC ausgeführt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei in Schritt 2 das Reduktionsmittel Dithiothreit, Dithioerythrit oder β-Mercaptoethanol ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei in den Schritten 1, 2, 3 und 5 der Puffer 15 mM Tris-HCl Puffer pH 8 ist, der 5 M Harnstoff, 10 % Glycerin und das Reduktionsmittel in einer Konzentration von 5 mM enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei in Schritt 4 der Puffer 15 mM Tris-HCl pH 8 ist, der 5 M Harnstoff und etwa 5 mM Reduktionsmittel enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 2, wobei in Schritt 6 der Puffer 15 mM Tris-HCl pH 7 ist, der 5 M Harnstoff und das Reduktionsmittel in einer Konzentration von etwa 5 mM enthält.

7. Verfahren zur Herstellung von Desacetylcephalosporin C, das das Zusammenbringen von 3-Exomethylencephalosporin C der Formel

und α-Ketoglutarat mit der von Streptomyces clavuligerus stammenden Desacetoxycephalosporin-C-Synthase nach Anspruch 1 bei einer Temperatur zwischen etwa 30ºC und 40ºC in einem wäßrigen Medium, das zweiwertige Eisenionen enthält, in Gegenwart von Sauerstoff bei einem pH zwischen etwa 6,8 und etwa 7,6 umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die zweiwertigen Eisenionen in einer Konzentration zwischen etwa 20 µM und etwa 100 µM vorkommen.

9. Verfahren nach Anspruch 7, worin das α-Ketoglutarat in einer Konzentration zwischen etwa 20 µM und etwa 300 µM vorkommt.