DE68924174T2

DE68924174T2 - Verfahren zur rekombination in vivo von teilweise homologen dns-sequenzen.

Info

Publication number: DE68924174T2
Application number: DE68924174T
Authority: DE
Inventors: Miroslav Radman; Christiane Rayssiguier
Original assignee: SETRATECH
Current assignee: Mixis France SA
Priority date: 1988-12-26
Filing date: 1989-12-22
Publication date: 1996-03-14
Anticipated expiration: 2009-12-23
Also published as: EP0449923B1; US5912119A; ATE127519T1; FR2641793A1; DE68924174D1; EP0449923A1; IL92856A0; FR2641793B1; CA2006549A1; IE72469B1; JPH04503601A; US5965415A; WO1990007576A1; JP3056524B2; AU4834390A; ZA899902B; IL92856A; CA2006549C; IE894182L; ES2077058T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vivo-Rekombination von teilweise homologen DNA-Sequenzen, die einen beträchtlichen Mengenanteil von Basen-Fehlpaarungen aufweisen, der bis zu 30 % betragen kann.
Es ist dadurch möglich, einzelne Gene im Bereich von Zellen oder Organisinen von unterschiedlichen Species und Genus zu rekombinieren, welche die gleichen Vorfahren haben.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung von rekombinierten Organismen durch in vivo-Kreuzung und -Rekombination von Organismen unterschiedlicher Species und/oder Genus sowie ein Verfahren zur in vivo-Bildung von Hybrid-Genen und somit von Hybrid- Proteinen, die durch diese codiert sind.
Bei der Synthese der DNA können Fehler auftreten und zu nicht-komplementären Basenpaaren führen, die als Fehlpaarungen bezeichnet werden. Es gibt ein Verfahren zur Korrektur von Fehlern (Basen-Fehlpaarungen und Basen- Nichtpaarungen) in der DNA. Bei diesem Verfahren greift ein enzymatisches System ein. Bei den Bakterien Escherichia coli und Salmonella typhimurium werden die Fehler von zwei Enzytnen (MutS und MutL) sehr schnell und genau entdeckt, die es einem dritten Enzym (MutU) erlauben, die beiden DNA-Stränge aufzurollen, und die es einem vierten Enzym (MutH) erlauben, den neu synthetisierten Strang zu schneiden auf einer Sequenz der DNA (GATC), die später durch ein anderes Enzym selbst methyliert wird (vgl. 1). Die häufigsten Fehler G:T, A:C und mehr oder minder eine Base werden am wirksamsten repariert. Die von den Enzymen Mut nicht oder schlecht aufgefundenen Fehler (G:A, C:T und C:C an bestimmten Stellen) haben eine spezielle Struktur, welche die beiden Stränge "öffnet".
Bisher treten bei der Herstellung von Hybrid-Species oder Hybrid-Genen zahlreiche Probleme auf. Was die Hybrid- Species angeht, so führten die am weitesten fortgeschrittenen Versuche, die auf dem Gebiet der Pflanzen in vitro gemacht wurden durch Fusion von Zellen, zu dem Hauptproblem einer genetischen Instabilität. Was die Herstellung von Hybrid-Genen oder Hybrid-Enzymen angeht, so war sie bisher nur in vitro auf gentechnischem Wege möglich.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, neue Hybrid- Species oder insbesondere neue Hybrid-Gene oder Hybrid-Enzyme durch Intergenera- und/oder Interspecies-in vivo-Rekombinationen mit einer erhöhten Wirksamkeit und Leichtigkeit herzustellen.
Um dies zu erreichen verwendet man gemäß einer ersten Variante der Erfindung Mutanten, deren System zur Reparatur der Fehlpaarungen von Basen der DNA defekt ist, oder irgendeine andere Mutante, welche die Intergenera-Rekombination verbessert.
Insbesondere können genannt werden die Stämme mut, insbesondere mut L, S, H oder U von Escherichia coli und Salmonella typhimurium oder auch die Stämme hex von Streptococcus pneumoniae (vgl.: (2)) und pms bei der Hefe (vgl. (3)).
Es wurde nämlich erfindungsgemäß gefunden, daß der molekulare Mechanismus der Species-Bildung und somit das Auftreten einer neuen Species die Aktivität der Enzyme zur Korrektur der Fehlpaarungen und nur diese auf kritische Weise beeinflussen kann. Die Erfindung besteht nämlich darin, die "Antirekombinations"-Rolle, welche die Enzyme zur Reparatur dieser Fehlpaarungen haben, die durch die Fehlpaarungen von DNA-Basen stimuliert wird, auszunutzen. Diese Rolle definiert einen molekularen Mechanismus der Species-Bildung, d.h. der anfänglichen genetischen Abtrennung von neuen Specles.
Anstatt Mutanten zu verwenden, deren enzymatisches System zur Reparatur der Basenfehlpaarungen der DNA defekt ist, kann man jedoch auch dieses System vorübergehend inaktivieren für eine Zeit zur Herstellung der gewünschten Kombinationen, insbesondere durch Sättigung.
Wenn man berücksichtigt, daß die Mutanten zur Reparatur der Fehlpaarungen genetisch instabil sind, kann es interessant (vorteilhaft) sein, einen vorübergehenden Defekt auszunutzen, der für die gewünschte genetische Konstruktion erforderlich ist, bevor man zur normalen genetischen Stabilität zurückkehrt. Das Hauptproblem in der klassischen Biotechnologie ist die genetische Instabilität der "industriellen" Stämme. Nach der Selektion der gewünschten Variante ist ihre genetische Eigenstabilität gefährdet und sie kehrt im Verlaufe des Wachstums in dem Fermenter zu dem Wild-Typ zurück.
Die Strategie zur vorübergehenden Inaktivierung des Systems zur Korrektur von Fehlpaarungen gemäß der Erfindung ist eine doppelte:
a) man verwendet eine konditionelle Korrektur-Mutante (mutSts-1)von Escherichia coli für jede genetische Konstruktion bei E. coli und
b) man führt eine Sättigung, d.h. eine funktionelle Inaktivierung, des Korrektursystems durch durch Einführung einer großen Anzahl von Fehlpaarungen in die Zelle. Diese Methode ist auf jeden beliebigen Organismus anwendbar.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur in vivo-Intergenera-Rekombination von partiell homologen DNA-Sequenzen, die einen beträchtlichen Mengenanteil von Basenfehlpaarungen, der bis zu 30 % betragen kann, aufweisen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die genannten Sequenzen in Zellen oder in einem Organismus, deren (dessen) enzymatisches System zur Reparatur von Basenfehlpaarungen defekt ist oder durch Sättigung vorübergehend inaktiviert worden ist, zusammenbringt für eine Zeit zur Erzeugung einer Rekombination zwischen den genannten DNA-Sequenzen, wobei die genannten, miteinander zu rekombinierenden DNA-Sequenzen aus Bakterien verschiedener Genera stammen, wenn sie prokaryontischen Ursprungs sind.
Es ist somit zweckmäßig, daß gegebenenfalls mindestens eines der Enzyme inaktiviert ist, d.h. ein Enzym, das an der Erkennung oder an der Korrektur der genannten Fehler beteiligt ist.
Die DNA-Sequenzen, die miteinander kombiniert werden sollen, können Chromosomen- oder Extra-Chromosomen-Sequenzen sein, die im letzteren Falle die Rekombination zwischen einzelnen klonierten Genen erlauben.
Als Anwendung dieses Verfahrens zur in vivo-Rekombination betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur in vivo-Herstellung von Hybrid-Genen und ihren codierten Proteinen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in dem genannten Organismus, dessen enzymatisches System zur Reparatur von Basenfehlpaarungen defekt oder inaktiviert ist, zwei der genannten DNA-Sequenzen zusammenbringt, die aus partiell homologen Genen bestehen, die aus zwei unterschiedlichen Organismen stammen, und das gesuchte Hybrid-Gen oder sein codiertes Protein selektioniert. In diesem Fall handelt es sich um die in vivo-Extrachromosomen-Produktion.
Man kann beispielsweise die beiden partiell homologen Gene in Plasmide einführen, die für eine gleiche Funktion codieren, jedoch eine andere Sequenz und andere enzymatische Eigenschaften des Produkts aufweisen, dann auf einer Petri-Schale unter den tausenden von erhaltenen unterschiedlichen Kombinationen diejenigen selektionieren, die uns interessieren können. Dies würde im übrigen einer immensen gentechnischen Arbeit in vitro entsprechen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur in vivo-Bildung von Hybrid-Genen und ihren codierten Proteinen, bei dem ein erstes Gen eines ersten Orgnanismus von einem ersten Plasmid getragen wird, und ein partiell homologes zweites Gen eines zweiten Organismus durch Transformation in ein Bakterium eingeführt werden, dessen enzymatisches System zur Reparatur von Fehlpaarungen defekt ist, oder in ein Bakterium, dessen System zur Reparatur von Fehlpaarungen vorübergehend inaktiviert ist, wobei die Gene sich rekombinieren und man das gesuchte Hybrid-Gen oder sein codiertes Protein selektioniert.
In dem obengenannten Verfahren kann das Bakterium, das mit den Plasmiden transformiert wird, welche die zu rekombinierenden Gene tragen, insbesondere ein Stamm von E. coli oder Salmonella typhimurium sein, der defekt oder vorübergehend inaktiviert ist in bezug auf das enzymatische System zur Reparatur von Fehlpaarungen, oder es kann jede andere Mutante dieses Bakteriums verwendet werden, welche die Intergenera-Rekombination erhöht.
Zweckmäßig verwendet man für jede Konstruktion bei E. coli einen wärmeempfindlichen Stamm für die Funktion der Reparatur der Fehlpaarungen, beispielsweise den Stamm E. coli mutSts-1 der bei 42ºC mutiert zu mutS&supmin; und der normalen Mutante mut&spplus; bei 32ºC. Man aktiviert die heterospezifische Rekombination bei 42ºC und selektioniert die gesuchte Eigenschaft bei 32ºC.
Gegenstand der Erfindung ist unter Anwendung des erfindungsgemäßen in vivo-Rekombinations-Verfahrens ein Verfahren zur Herstellung von rekombinierten Zellen durch Transformations- oder Fusions-Methoden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man:
eine Transformation und eine Rekombination in vivo durchführt:
. mit Hilfe der DNA von Zellen eines Organismus einer ersten Species und eines ersten Genus,
. mit der Chromosomen-DNA der Zellen eines Organismus einer zweiten Species und/oder eines zweiten Genus,
wobei diese Zellen des Organismus der zweiten Species oder des zweiten Genus defekt sind in bezug auf das enzymatische System zur Reparatur von Basen-Fehlpaarungen oder ein insbesondere durch Sättigung vorübergehend inaktiviertes derartiges System aufweisen, oder auch
- die in vivo-Rekombination der Chromosomen dieser beiden Zell-Typen nach der Fusion der genannten Zellen durchführt, wobei diese Zellen beide ein defektes oder ein insbesondere durch Sättigung vorübergehend inaktiviertes enzymatisches System zur Reparatur von Fehlpaarungen aufweisen.
Die Erfindung betrifft außerdem als Anwendung des erfindungsgemäßen in vivo-Rekombinations-Verfahrens ein Verfahren zur Herstellung von rekombinierten Organismen durch in vivo-Kreuzung und -Rekombination von Organismen verschiedener Species und/oder Genera, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine in vivo-Kreuzung und eine in vivo-Rekombination durchführt zwischen:
- einem Organismus einer ersten Species und eines ersten Genus und
- einem Organismus einer zweiten Species und/oder eines zweiten Genus,
wobei mindestens einer dieser beiden Organismen defekt ist in bezug auf das enzymatische System zur Reparatur von Basen-Fehlpaarungen oder ein solches System aufweist, das insbesondere durch Sättigung vorübergehend inaktiviert ist.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von rekombinierten Zellen oder Organismen kann man rekombinierte Zellen oder Organismen von Bakterien, aber auch von Hefen, Pflanzen oder sogar Tieren herstellen.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von rekombinierten Bakterien durch Kreuzung und Rekombination von Bakterien unterschiedlicher Genera, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Konjugation oder Transduktion in vivo durchführt zwischen
- sogenannten Rezeptor-Bakterien eines ersten Genus, die defekt sind in bezug auf die enzymatischen Systeme zur Reparatur von Basen-Fehlpaarungen oder deren enzymatische Systeme zur Reparatur von Basen-Fehlpaarungen insbesondere durch Sättigung vorübergehend inaktiviert sind und
- sogenannten Donor-Bakterien eines Organismus eines zweiten Genus, der eine spezielle Eigenschaft aufweist, die man auf die Rezeptor-Bakterien übertragen will.
Zweckmäßig weisen die sogenannten Rezeptor-Bakterien außerdem Defekte in bezug auf die enzymatischen Systeme zur Restriktion der DNA auf.
Die Erfindung zeigt sich in spektakulärer Weise auf dem Gebiet der Konjugation von Bakterien. Die beiden Bakterien-Genus Escherichia coli und Salmonella typhimurium, die seit 140 Millionen Jahren genetisch voneinander getrennt sind (Ochman und Wilson, 1987) kreuzen sich heute überhaupt nicht durch Rekombination der DNA.
Die Kreuzungen durch Konjugation zwischen Salmonella typhimurium und Escherichia coli sind nämlich steril, d.h. daß die Rekombination fehlt oder sehr gering ist je nach betrachteter Stelle (Baron et al., 1959, Eisenstark 1965, Mergeay und Gerits 1983). Wenn man jedoch die Funktionen MutL oder MutS beispielsweise durch Mutationen aus diesen Stämmen eliminiert, erhält man nach 140 x 10&sup6; Jahren wieder erneut eine sehr wirksame Kreuzung durch Rekombination (die mindestens 10&sup6; mal höher ist als bei den nicht-mutierten Bakterien). Dadurch wird die Rolle der Reparatur- Enzyme bei der Interspecies- und Intergenera-Sterilität bei Bakterienkreuzungen bestätigt.
Bei einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von rekombinierten Bakterien kreuzt man einen Stamm von E. coli und einem Stamm von Salmonella typhimurium, von denen mindestens einer (der Rezeptor) defekt oder inaktiviert ist insbesondere durch Sättigung in bezug auf sein enzymatisches System zur Reparatur von Basen-Fehlpaarungen.
Vorzugsweise konjugiert man ein Donor-Bakterium vom Typ Hfr mit einem Rezeptor-Bakterium vom Typ F&supmin;.
Bei einer speziellen Ausführungsform führt man erfindungsgemäß die Konjugation zwischen einem Donor-Stamm Hfr von E. coli und einem Mutanten-Stamm F von Salmonella typhimurium durch, dessen enzymatisches System zur Reparatur von Basen-Fehlpaarungen defekt ist, vom Typ mutS oder mutl, d.h. das defekt ist in bezug auf die Proteine MutS und MutL, die an der Erkennung der Fehlpaarungen beteiligt sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von rekombinierten Bakterien kann zur Herstellung von neuen Stämmen, beispielsweise von geschwächten pathogenen Stämmen von Salmonella führen, die durch Kreuzung mit Stämmen von Escherichia coli nicht-toxisch gemacht worden sind, die jedoch noch immer die antigenen Oberflächendeterminanten der pathogenen Stämme tragen, um dadurch einen Impfstoff gegen die entsprechende Salmonellose herzustellen.
Bei der Anwendung des erf indungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von rekombinanierten Organismen ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur in vivo-Herstellung von Hybrid-Genen und ihren codierten Proteinen, bei dem man von zwei partiell homologen Genen ausgeht, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man rekombinierte Zellen herstellt aus Zellen des genannten ersten Organismus, der ein erstes Gen enthält, und Zellen des genannten zweiten Organismus, der ein zweites, partiell homologes Gen enthält, und daß man das gesuchte Hybrid-Gen oder sein codiertes Protein selektioniert.
Durch Verwendung der Reparatur-Mutanten für Basen- Fehlpaarungen kann man insbesondere Bakterien unterschiedlichen Ursprungs miteinander kreuzen und auf diese Weise neue Gene bilden und die gesuchten Eigenschaften selektionieren. Es handelt sich in diesem Fall um Chromosomen- Gene.
Wie oben angegeben, kann die Verwendung von Mutanten in einem enzymatischen System zur Reparatur von Basen- Fehlpaarungen durch die Sättigung des enzymatischen Systems ersetzt werden, indem man durch Transfektion ein DNA-Heteroduplex einführt, das reich an Fehlpaarungen ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist schließlich ein Verfahren zur gerichteten inversen Mutagenese eines Gens in einem Organismus, wobei das genannte Gen eine mutierte Base enthält, die man so wieder herstellen will wie sie vor ihrer Mutation war, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in den Organismus ein Heteroduplex, das eine erhöhte Anzahl von Fehlpaarungen aufweist, um das enzymatische System des Organismus zur Korrektur von Fehlpaarungen durch Sättigung zu inaktivieren, und ein Oligonucleotid einführt, das besteht aus der DNA-Sequenz, die wieder in den Zustand vor der Mutation des Gens überführt worden ist.
Nach diesem Verfahren ist es möglich, mit Synthese- Oligonucleotiden gerichtete genetische Veränderungen zu erhalten, indem man sie während einer Periode der funktionellen Inaktivierung des Systems zur Reparatur von Fehlpaarungen in großer Menge in Zellen einführt.
Weitere Vorteile und Charakteristika der vorliegenden Erfindung gehen aus den folgenden Beispielen hervor.
Die Fig. 1 zeigt das Restriktionsprofil von drei Intergenera-Rekombinanten aus Kreuzungen von Escherichia coli Hfr und Salmonella typhimurium F&supmin;.

Beispiel 1

Konjugation der Stämme Hfr von E. coli und F&supmin; von Salmonella typhimurium

Man führt Konjugationen zwischen wilden Stämmen Hfr von E. coli und F&supmin; von Salmonella typhimurium durch, die defekt sind in bezug auf die Restriktions-Enzyme der DNA und die vor allem defekt sind in bezug auf die Reparatursysteme der Fehlpaarungen (Mutanten mutL, mutS, mutH oder MutU).
Der Stamm Hfr von E. coli hat seinen Transfer-Ursprung bei 76,5 min auf der Karte und Xylose ist der zuerst injizierte Marker (78'). Die Stämme F von Salmonella weisen zwei Auxotrophien auf (met A und met E) und sie sind nicht in der Lage, Xylose zu verwerten (xyl&supmin;); sie sind resistent gegenüber Streptomycin. Der Stamm Hfr von E. coli ist für diese Marker wild und empfindlich gegenüber Streptomycin; er weist zwei andere Auxotrophien auf (Leucin und Threonin), was eine dreifache Kontraselektion bei Konjugationen erlaubt. Die Stämme Hfr von E. coli und F&supmin; von Salmonella mut&spplus;, mutL, mutS, mutH oder mutU, deren Restriktionssysteme defekt sind, werden in einem reichen flüssigen Medium (LB) kultiviert. Wenn sie sich in der exponentiellen Phase (1 bis 5 x 10&sup8;/ml) befinden, mischt man 1 ml Hfr mit 1 ml F&supmin; und filtriert sofort die Mischung über ein Milliporen-Filter. Dieses Filter wird in einer vorerwärmten Schale mit reichem Mediüm bei 37ºC inkubiert. Man läßt die Konjugation 40 min lang ablaufen und das Filtrat wird abgetrennt und in 1 ml 10&supmin;²M MgSO&sub4; gegeben und dann 1 min lang stark verwirbelt, um die Bakterien wieder zu suspendieren und die Konjugate voneinander zu trennen. Die aliquoten Anteile werden auf Schalen mit dem selektiven Medium ausgestrichen (ausgebreitet): dem Minimal-Medium 63 (vgl.: J.H. Miller, 1972, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, N.Y.) mit Glucose (0,4 %) und ohne Methionin, um die met&spplus; zu selektionieren, oder mit Xylose als einziger Zuckerquelle (0,4 %) und mit Methionin (100 ug/ml), um die xyl&spplus; zu selektionieren. Diese beiden selektiven Medien enthalten weder Threonin noch Leucin, sondern sie enthalten Streptomycin (25 ug/ml), um eine dreifache Kontraselektion der Hfr zu gewährleisten. Die Schalen werden 40 h, 60 h und 88 h lang bei 37ºC inkubiert und die rekombinierten Klone werden ausgezählt und untersucht. Ein der homospezifischen Kreuzung Hfr Coli x F&supmin; Coli entsprechender Vergleichsversuch wird unter den gleichen Bedingungen durchgeführt.
Darüber hinaus wurden die Stämme F&supmin; von Salmonella zu Mutanten gemacht für recA (das Protein recA ist für alle homologenen Rekombinationen unerläßlich).
Die Ergebnisse, die erhalten wurden für die Stämme mutL und mutS, für welche der Effekt am stärksten ist, sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben. Diese Tabelle zeigt die Häufigkeit der Rezeptoren F&supmin;, die zu xyl&spplus; geworden sind, pro Donor-Bakterium Hfr nach Subtraktion der mit den Rezeptor-Stämmen allein erhaltenen Revertanten (60-stündige Inkubation). Äquivalente Eregebnisse wurden für den Marker met erhalten. Tabelle 1 Konjugationen Häufigkeit xyl&spplus;/Hfr Donor
Die Intergenera-Rekombinations-Häufigkeit nimmt um einen Faktoren von mindestens 10&sup4; zu für mutL und mutS und ist etwas geringer für Mut H und U, bezogen auf Konjugationen, die mit Salmonella F&supmin; durchgeführt wurden, die defekt sind in bezug auf die Restriktion der DNA, die jedoch wild sind für die Fehlpaarungs-Reparatur-Gene (mut&spplus;). Durch Selektion der Rekombinanten auf selektiven Medien konnten diese Hybride zwischen E. coli und Salmonella typhimurium erhalten werden, die, wie angenommen wird, neue Species "Eschenellal, oder "Salmorichia" sind mit neuen Kombinationen von Genen und neuen rekombinierten Genen.
Prototrophe Rekombinate (met&spplus;), die in der Lage sind, den Zucker Xylose (xyl&spplus;) zu fermentieren, die durch Interspecies-Rekombination erhalten werden, können nach verschiedenen Mechanismen gebildet werden. Der einfachste ist der direkte Ersatz des Gens, das übliche Ergebnis der recA-abhängigen Konjugation zwischen E. coli oder zwischen S. typhimurium (Intraspecies-Konjugation). Die beiden anderen möglichen Mechanismen führen zur Bildung von partiellen Diploiden. Diese Rekombinanten-Typen unterscheiden sich im Hinblick auf ihre Stabilität. Man erwartet, daß die einfachen Ersatzprodukte stabil sind und die partiellen Diploide instabil sind. Infolgedessen wurde die phänotypische Stabilität der Rekombination jeder Kreuzung untersucht durch Ausstreichen auf Indikator-Schalen (1 % Xylose McConkey-Medium, vgl. J.H. Miller, "Experiments in Molecular Genetics" (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1972)). Insgesamt zeigen die Stabilitätssprofile der Intergenera-Rekombinanten eine heterogene Gruppe. Tabelle 2: Analyse der Rekombinanten xyl± und metE± meta± der Konjugtions-Kreuzungen E. coli Hfr X S. typhimurium F Marker Rekombinanten xyl&spplus; Rezeptor-F&supmin; stabil: instabil: Transposon Verlust S. Typhimurium mut E. coli
Um zu wissen, ob die Gene mut&spplus; von Escherichia die Gene mut von Salmonella ersetzt haben, wurde das Schicksal der in die Gene mut von Salmonella inserierten Transposone verfolgt wenn das funktionelle Gen mut von E. coli das residente Gen mut, das Tn trägt, ersetzt hat, dann hat die Rekombinante gleichzeitig ihre Resistenz gegenüber Antibiotika und ihren mutanten Charakter verloren. Dies ist effektiv eingetreten bei sieben der acht stabilen Rekombinanten xyl&spplus; met&spplus;, die bei der Kreuzung mit einem S. typhimurium-Rezeptor-Stamm mutL: : Tn10 erhalten wurden, was vermuten läßt, daß mit Ausnahme einer Rekombinanten die Escherichia coli-Sequenzen die Salmonella-Sequenzen ersetzt haben bis zu etwa 5 min nach dem letzten selektionierten Gen (metA) in der Region mutL. Bei der Kreuzung mit S. typhimurium mutU::Tn5 als Rezeptor-Stamm wurde das Gen mutU bei 19 der 19 stabilen Rekombinanten xyl&spplus; ersetzt. Keine der Rekombinanten xyl&spplus; met&spplus; der Kreuzungen von mutS::Tn10 und mutH::Tn5 zeigte einen Verlust an Transposon oder einen Ersatz des Gens mut, da die Konjugation nach 40 min unterbrochen wurde und die Chromosomen- Region der Gene mutS, mutH nicht transferiert worden war.
Die Fig. 1 zeigt die physische Bindung zwischen den Salmonella- und Escherichia coli-Sequenzen. Die Genom-DNA der beiden Eltern-Stämme und ihrer drei stabilen Intergenera-Rekombinanten xyl&spplus; met&spplus; (bzw. der Kreuzungen mutL, mutS und mutH) wurden durch das Enzym SpeI geschnitten und die Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem Gel mit einem pulsierten Feld in einer Beckmann-Apparatur Gene Line TAFE voneinander getrennt. Die beiden größten DNA- Fragmente der Eltern-Stämme S. typhimurium F&supmin; (Δ) fehlten in den drei Rekombinanten, die stattdessen mindestens ein Nicht-Eltern-Fragment erhalten hatten, von dem man annimmt, daß es eine Inter-Species-DNA-Verbindung enthält. Außerdem wurde mindestens ein großes DNA-Restriktions- Fragment von E. coli Hfr (V) in den Rekombinanten L17 und S12 beobachtet (L17 ist die Rekombinante, die unter der Nummer 1832 hinterlegt wurde).
Der verwendete S. typhimurium-Stamm mutL F&supmin; wurde unter dem Kennzeichen SL4213 mutL (Nr. 1831) bei der CNCM des Institut Pasteur hinterlegt.
Eine Intergenera-Rekombinate E. coli Hfr/S. typhimurium F&supmin; mutL wurde ebenfalls unter der Bezeichnung SCLl7 (Nr. 1832) bei der CNCM des Institut Pasteur hinterlegt.

Beispiel 2

Heterospecies-Rekombination in dem Histidin-Operon: Ersatz der Gene von Salmonella typhimurium durch diejenigen von Escherichia coli

Die experimentelle Strategie zur Bestimmung der Häufigkeit des Ersatzes der Gene durch die Heterospecies-Rekombination zwischen Salmonella typhimurium und Escherichia coli war die folgende:
(1) als "Rezeptor"-Stamm für die genetische Information von S. typhimurium LT2, der zwei defekte Gene trägt, deren funktionelle Wiederherstellung durch die Rekombination versucht wurde, wurden verwendet:
- hisD::IS200 mit einer Mutation, welche die Zelle zu His&supmin; macht (die unfähig ist, selbst in Gegenwart eines Zwischenprodukt-Histidinols Histidin zu synthetisieren) und
- proAB47 mit einer Deletion, die den Stamm unfähig macht, das Prolin (pro&supmin;) zu synthetisieren (vgl.S. Lam und J.F. Roth (1983), "Cell", 34, 951-960; L.N. Csonka (1981), "Mol. Gen. Genet." 182, 82-86). HisD:IS200 entspricht der Insertion eines inaktiviertes Transposon-Element, das niemals in hisD&spplus; wieder zurückkehrt.
Der Donor-Stamm für die genetische Information ist entweder ein Stamm von S. typhimurium mit den intakten Histidin- und Prolin-Operonen (his&spplus; und pro&spplus;) oder ein Stamm von S. typhimurium, der in bezug auf das Operon his deletiert ist (his644), der jedoch zu his&spplus; geworden ist durch Einbau eines Episoms von E. coli, F'150 his&spplus;, welches das Operon his von E. coli trägt (vgl. Hartman et al. (1971), "Adv. Genet.", 16, 1-34; K.B. Low (1973) "Bact. Rev.", 36, 587-607)
(2) Der genetische Transfer von dem Donor zu dem Rezeptor erfolgt mit Hilfe eines Transduktor-Bakteriophagen p22 Hft int3 (H. Schnieger (1972) "Mol. Gen. Genet", 119, 75- 88). Dies ist ein klassisches Gen-Übertragungsverfahren (I.H. Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1972); man erzeugt einen Vorrat an Phagen und läßt ihn auf dem Donor-Stamm wachsen, dann infiziert man den Rezeptor-Stamm mit einer Vielzahl von Bakterien-Infektionen und man streicht die infizierten Bakterien auf sogenannten "selektiven" Schalen aus, auf denen nur die Bakterien wachsen, die den genetischen Charakter des Donor-Stammes erworben haben (beispielsweise das Agar M63-Minimal-Medium (vgl. Miller s. oben) mit dem Prolin, jedoch ohne Histidin und mit Histidinol (30 ug/ml), um die Bakterien hisD&spplus; nachzuweisen, oder mit Histidin und Arginin, jedoch ohne Prolin, um die Bakterien pro&spplus;) nachzuweisen). Man zählt die Kolonien hisD&spplus; oder pro&spplus; nach 2-tägiger Inkubation bei 37ºC aus.
Eine Art, die Änderungen bei der homeologen Rekombination (Intergenera-Rekombination) in bezug auf die homologe Rekombination (Intraspecies-Rekombination) auszudrücken, besteht darin, das Verhältnis der Transduktanten hisD&spplus; und pro&spplus; für ein Lysat von P22Hft int3 zu bestimmen, das entweder aus dem Donor hisD&spplus; von E. coli oder aus dem Donor hisD&spplus; von S. typhimurium stammt (die beiden Stämme haben die gleichen proAB von Salmonella).
Die Tabelle 3A zeigt diese beiden Verhältnisse hisD&spplus;/proAB+ (heterospezifisch und homospezifisch) für den Wild-Stamm mut&spplus; und die Derivate mutL, mutS, mutU und mutH des Rezeptor-Stammes. Man sieht daraus, daß das Verhältnis hisD&spplus;/proAB&spplus; für heterospezifisches hisD um mehr als das 100-fache zunimmt bei den Bakterien mutS und mutL, während es bei mutH etwas geringer zunimmt und bei mutU sehr wenig zunimmt. Das Verhältnis erhöht sich nicht mehr als um einen Faktor 4, wenn der Donor hisD&spplus; und proAB&spplus; von Salmonella ist. Diese Ergebnisse bestätigen die Ergebnisse der Konjugation, jedoch auf qualitative Weise.
Der Ersatz der Gene wird hier demonstriert durch Verwendung eines defekten Transposons Tn10-dcam, das die Resistanz gegenüber Chloramphenicol (10 ug/ml) trägt und in dem das hisD zerstört worden ist, als genetischer Marker des Defizits an hisD durch Inserieren in das Gen (T. Eliott und J.R. Roth (1988), "Mol. Gen. Genet.", 213, 332- 338). Der Ersatz des defekten Gens hisd::Tn10d-cam durch das funktionelle Gen hisD&spplus; von E. coli bringt zwei gleichzeitige phänotypische Effekt mit sich:
(i) das Rezeptor-Bakterium wird zu hisD&spplus; (es wächst in Gegenwart von Histidinol; der Phänotyp wird als Hol&spplus; bezeichnet) und
(ii) es verliert sein Transposon Tn10d-cam und wird für Chloramphenicol empfindlich.
Die Tabelle 3B zeigt, daß bei keinem Transduktanten hisD&spplus; die Resistenz gegenüber Chloramphenicol aufrechterhalten wurde, während die Transduktanten pro&spplus; (die Gene proAB sind weit entfernt von dem Gen hisD) ihre Resistenz gegenüber Chloramphenicol beibehalten. Tabelle 3: Kreuzung durch Transduktion A. Die Mutanten-Allele fördern die Fähigkeit von E.coli- Sequenzen, die Histidinol-Prototrophie auf S. typhimurium zu übertragen heterospezifische Kreuzungen homospezifische Kreuzungen Hol&spplus; : E. coli Pro&spplus; : S. typhimurium Allel mut des Rezeptor-Stammes B. Interspecies-Transduktion durch Allel-Ersatz Gehalt an Platten Selektion der Platten mittlere Anzahl der Kolonien Legende: Hol+ = Wachstum in Gegenwart von Histidinol Pro = Prolin Arg = Arginin Cam = Chloramphenicol

Beispiel 3

Inaktivierung durch vorübergehende Sättigung des Reparatursystems der Fehlpaarungen

Bei E. coli ist das System zur Korrektur der Fehler Mut (H, L, S, U) begrenzt und kann durch Titration, d.h. durch funktionelle Inaktivierung des Proteins MutL, gesättigt werden.
Der stärkste bekannte mutativ wirksame Stamm von E. coli mutD5 hat einen Defekt in bezug auf das Korrekturlesen der Exonuclease in Kombination mit der DNA-Polymerase III, von der er viele Replikationsfehler erzeugt.
Es wurde durch Transfektion mit einem DNA-Heteroduplex der Phagen φX 174 oder λ gezeigt, daß während des vollen Wachstums in einem reichen Medium diese Bakterien Defekte in bezug auf die Fehlpaarungs-Reparatur aufweisen. Wenn man jedoch die Replikation der Bakterien-DNA stoppt (stationäre Phase oder spezifischer Stopp der Replikation durch eine wärmeempfindliche Mutation), wird die Reparatur-Aktivität vollständig zurückgewonnen. Diese Reparatur wird blockiert, wenn man die Proteinsynthese erneut durch Chloramphenicol blockiert. Somit ist das System Mut nicht nur gesättigt, sondern "tot" und die Reparaturenzyme oder das Reparaturenzym müssen erneut synthetisiert werden.
In einem in vivo-Fehlpaarungs-Reparaturtest verwendet man als Substrat vorgegebene Moleküle, die konstruiert worden sind durch Trennung der DNA-Stränge und Wiederaufbau von neuen Duplexen vom Heteroduplex-Typ. Durch Verwendung von Mutanten-Genen, die in bezug auf ihre Sequenz vorgegeben sind, ist es möglich, Moleküle mit einer einzigen vorgegebenen Fehlpaarung herzustellen. Es wurde ein Mutanten-Gen in dem Gen cI verwendet, das für den Repressor des Bacteriophagen Lambda codiert, das Protein, das für den "schlafenden" Zustand des Prophagen des Bacteriophagen Lambda verantwortlich ist, das einen "klaren" Phänotypus im Bereich (Zone, Hof) der Lysis, bezogen auf die "trüben" Bereiche (Zonen, Höfe) des wilden Phagen ergibt. Es handelt sich um die Mutation UV23, die einer Mutation G:C entspricht, die im Bereich des 43. Basenpaares des Gens cI A:T ergibt. Somit wurde als Funktion des gewählten Stranges die DNA des Phagen Lamda mit einem wilden Strang und mit einem Strang, der die Mutation UV23 trägt, konstruiert, wobei das Duplex über etwa 50 000 Basenpaare normal ist mit Ausnahme der Fehlpaarung G:T oder A:C im Bereich der Mutation UV23. Die Herstellung von Vorräten an dem Phagen Lambda und die Trennung der Stränge in dem Cäsiumchlorid-Gradienten in Gegenwart der Polymeren Poly (U,G) (Uridin und Guanosin) wurde von M. Meselson und R. Yuan (1968) in "Nature", 217: 1110-1114, beschrieben.
Da das Fehlpaarungs-Korrektursystem durch die Methylierung (6-Methyladenin) der 5'GATC-Sequenzen gesteuert (gelenkt) wird (Radman und Wagner (1988), "Scientific American Ao t 1988 pour la Science", October 1988), wurde eine Heteroduplex-DNA konstruiert, welche die Methylierung auf einem einzigen Strang trägt. Die DNA wird in einer einzigen Kopie in das Bakterien E. coli eingeführt, das nach dem Calciumchlorid-Verfahren für die externe DNA durchlässig gemacht worden ist (Mandel und Miga (1970), "J. Mol. Biol." 53, 159-162 (die Bakterien werden während des exponentiellen Wachtums in Gegenwart von 0,1 M CaCl&sub2; in Eis mindestens 2,5 h lang gehalten)). Die transfektierten Bakterien werden zusammen mit weichem Agar auf Petrischalen ausgestrichen (ausgebreitet), eine Nacht lang inkubiert und die Phagen-Descendenz jedes Heteroduplex-Moleküls in den infizierten Zentren wird durch erneute Ausbreitung der aus jedem Infektionszentrum überimpften (ausgelesenen) Phagen bestimmt. Es sind drei Typen von Infektionszentren möglich: nur trübe (c&spplus;), nur klare (c) und gemischte, welche die Phasen c&spplus; und c enthalten. Die gemischten Infektionszentren enthalten den Abkömmling eines nicht-reparierten DNA-Heteroduplex: die beiden Stränge, ein c&spplus;, das andere c, werden repariert und ergeben den Phagen-Abkömmling, bevor eine Reparatur eine fehlgepaarte Base eliminieren kann, welche die Eigenschafte c+ oder c trägt. Eine große Anzahl von gemischten Infektionszentren bedeutet somit, daß wenig Reparatur stattgefunden hat, und umgekehrt. Außerdem ergibt die gerichtete Reparatur reine Infektionszentren vom Typ, wie er von dem methylierten Strang getragen wird, und dies äußert sich in dem Verhältnis c/c&spplus; (vgl. die folgende Tabellel Tabelle 4).
Diese Verfahrensweise wurde von Dohet, Wagner und Radman in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 82, 503-505 (1985), beschrieben.
Die nachstehende Tabelle 4 zeigt, daß in einem mutierten Stamm mutD5, der einen Defekt in bezug auf die Synthese-Treue (Genauigkeit) der DNA aufweist, der somit viele Fehlpaarungen im Verlaufe der Replikation seiner DNA ergibt, die Reparatur der Fehlpaarungen defekt ist. Tabelle 4: genetische Analyse der Phagen-Descendenz der Heteroduplex-Moleküle des hemimethylierten Phagen λ in den verschiedenen Stämmen und unter verschiedenen Wachstumsbedingungen Stamm von E. coli Kultivierungsbedingungen Heteradupiex Descendenz mut
Wenn man die 3 % an gemischten Infektionszentren des Bakteriums W 3110 DNA Ats mit den 48 und 49 % an gemischten Infektionszentren bei dem Bakterium mutD5 vergleicht, so scheint es, daß die Reparatur der Fehlpaarungen bei der Mutanten mutD5 defekt ist. Beim Vergleich der 49 % an gemischten Infektionszentren mit den 86 bis 92 % bei der Mutanten mutL scheint es, daß der Defekt an Fehlpaarungs-Reparatur nicht vollständig ist. Der Stopp der Beginn der Replikation der Bakterien-DNA bei den Mutanten dna Ats bei 42ºC während 2 h hat die Reparatur der Fehlpaarungen bei den anderen Stämmen als mutD5, dna Ats, bei denen die Wiederherstellung der Reparatur der Fehlpaarungen mit 10 % gemischten Infektionszentren beobachtet werden konnte, nicht beeinflußt. Diese Wiederherstellung erfolgte nicht in Gegenwart eines Proteinsynthese-Inhibitors oder mit 100 ug/ml Chloramphenicol. Durch Beendigung der Bildung der Fehlpaarungen durch fehlerhafte Replikation wird somit nur die Reparatur durch die Synthese der Proteine wiederhergestellt. Dies läßt vermuten, daß die Reparatur der Fehlpaarungen einen enzymatischen "Selbstmord" mit sich bringt. Die Sättigung würde dann einer funktionellen Inaktivierung eines oder mehrerer Proteine Mut entsprechen. In den nachstehend beschriebenen Versuchen wird gezeigt, daß das Fehlen der funktionelle Protein das Protein Mut L ist.

Herstellung des circulären Heteroduplex des Phagen M13 mp2

Die Phagen-DNA und die intrazelluläre DNA werden durch Zentrifugieren von CsCl in Gegenwart von Ethidiumbromid hergestellt, wie von Brooks et al. (1988) beschrieben, aus dem gereinigten Phagen und nach der Infektion durch die Phagen und 30-minütige Inkubation. Es handelt sich dabei um Standardverfahren, wie sie von Maniatis, Fritsch und Sambrook (1982) in "Molecular Cloning", Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, beschrieben sind. Das Heteroduplex wird hergestellt durch Hybridisierung des Stranges einer intrazellulären Doppel- Strang-DNA (RFI), der linearisiert worden ist, mit dem Enzym Ava II 10 min lang bei 70ºC in Wasser denaturiert, dann in Gegenwart von Einfachstrang-DNA 10 min lang bei 60ºC in dem Puffer 2x SSC renaturiert.
Die Einfachstrang-DNA wird durch Benzoyl-Naphthoyl- Cellulose in Gegenwart von 0,1 M NaCl eliminiert. Das DNA- Heteroduplex mit einer Fehlpaarung G:T wird in dem Puffer 0,05 M Tris und 0,001 M EDTA bei pH 8 aufbewahrt.
Die Fehlpaarung G:T trägt ihre genetische Markierung:
Wie oben bei der DNA des Phagen Lambda tritt ein einzelnes Molekül in die Zelle ein, die nach der Hanahan-Methode (Maniatis et al., 1982), die auf dem Effekt von Calciumdithiothreit und -dimethylsulfoxid auf die Zellwände basiert, durchlässig gemacht worden ist. Die transfektierten Bakterien werden verdünnt und zusammen mit dem Indikator-Stamm CSH 50 (del lac-pro, ara&supmin;,pro&supmin;, str A) in Gegenwart von X-gal und IPTG ausgestrichen, um die Blaufärbung der Phagen-Platte lac&spplus; und nicht diejenige der Phagen lac&supmin; (Mutanten) zu ermöglichen. Die Höfe (Bereiche) der gemischten Lysen (weiß/blau) zeigen das nicht-reparierte Heteroduplex.
Die nachstehende Tabelle 5 zeigt, daß in der logarithmischen Wachstumsphase der Anteil der gemischten Infektionszentren bei der Mutanten mutL, die einen Reparatur-Defekt hat, und bei der Mutanten mutd ähnlich ist. In der späten logarithmischen Phase vor der stationären Phase ist jedoch der Anteil der gemischten Infektionszentren bei der Mutanten mutD der gleiche wie bei dem Wild-Typ mut&spplus;, die Mutante mutD weist somit einen Defekt an Fehlpaarungs- Reparatur während des schnellen Wachstums auf, sie erlangt jedoch ihre Reparaturaktivität während des verlangsamten Wachstums wieder. Tabelle 5: Phasen-Descendenz der Heteroduplex-Moleküle des Bacteripophagen M13 mp2 (Heteroduplex mit der Fehlpaarung G:T) in den Mutanten- Stämmen. Einfluß der Wachstumsphase.Art und Prozentsatz der Infektionszentren Stamm von E. coli logarithmische Frühphase gemischt weiß blau insgesamt logarithmische Spätphase mut
Die nachstehende Tabelle 6 zeigt, daß die klonierten und überexprimierten Gene ihre Fehlpaarungs-Reparaturaktivität in dem Stamm mutD wiedererlangen können. Insbesondere rufen die Gene mutL und mutH und nicht die Gene mutS und mutU, die in dem Plasmid pBR325, der in den Stamm mutD eingeführt worden ist, kloniert wurden, eine praktisch vollständige Rückgewinnung der Reparaturaktivität hervor. Entsprechend dieser Beobachtung nimmt die Häufigkeit der spontanen Mutationen in der Mutanten mutD, die das Plasmid pBR325 trägt (mutL&spplus;) oder das Plasmid pBR325 trägt (mutH&spplus;), ab und nicht bei den Plasmiden pBR325 (mutS&spplus;) oder pBR325 (mutU&spplus;), wie aus der nachstehenden Tabelle 7 hervorgeht. Tabelle 6: Phagen-Descendenz der Heteroduplex-Moleküle (Fehlpaarung G:T) des Phagen M13 mp2 in dem Mutanten-Stamm mutD5, der die Plasmide zusammen mit den Genen mutH, mutL, mutS und mutU trägt. Stämme von d'E. coli Art und Prozentsatz der Infektionszentren gemischt weiß blau insgesamt Segregationsmittel Tabelle 7: Häufigkeit der spontanen Mutationen in mutD5, das die Plasmide pBR325 trägt (mutH, mutL, mutS oder mutU) Stämme von E. coli Häufigkeit der Mutationen Segregationsmittel
Diese Versuche stellen die erste experimentelle Demonstration einer Fehler-Katastrophe oder eines Lawineneffekts dar. Ein Übermaß an Fehlern im Bereich der Synthese der DNA ruft die Sättigung (Inaktivierung) des Fehlpaarungs Reparatursystems hervor. Das Ergebnis ist ein doppelter Defekt in den Systemen in bezug auf die Replikations- Treue.
Durch Einführung der Plasmide mutH&spplus;, mutL&spplus;, mutS&spplus; und mutU&spplus; in E. coli mutD5 kann man zeigen, daß kein Reparaturaktivitätsverlust auftritt, wenn die Funktion MutL im Übermaß produziert wird. Das Protein MutL bringt sich somit in dem Reparaturakt selbst um. Die Mutante mutD5 stellt den ersten experimentellen Fall einer "Fehlerkatastrophe" dar: zu viele Fehler im Bereich der Replikation der DNA, die das Korrektursystem überlasten, das zusammenbricht und einen "Lawineneffekt" hervorruft.
Es genügt somit, auf einen Schlag eine übermäßig hohe Anzahl von Basenfehlpaarungen in eine Zelle einzuführen, damit das Reparatursystem zusammenbricht und inaktiv bleibt, bis zur "Verdünnung" des Substrats mit den Fehlpaarungen und der erneuten Synthese des Enzyms Mut.

Beispiel 4

Sättigung des Fehlpaarungs-Reparatursystems bei Säugetierzellen

Es ist schwierig, eine Mutante mut&supmin; bei Säugetierzellen zu isolieren. Es handelt sich dabei um rezessive Mutationen in diploiden Zellen, die eine gleichzeitige Inaktivierung von zwei Kopien des gleichen Gens erfordern. Diese Mutanten können außerdem tödlich sein. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß der Polymorphismus der Sequenzen, vor allem im Bereich der verschiedenen Familien von wiederkehrenden Sequenzen, das Schlüsselelement der Chromosomen-Stabilität ist. Dies ist nämlich auf den Polymorphismus zurückzuführen, wonach das Fehlpaarungs-Reparatursystem jede gefährliche Rekombination zwischen den wiederkehrenden Sequenzen (Chromosomen-Aberrationen) oder zwischen den homologen Chromosomen (Homozygotie durch mitotische Rekombination), ausgenommen die wiederherstellenden Rekombination zwischen den Schwesterchromatiden (Austausch von Schwesterchromatiden), die aus der Replikation eines Mutter-Moleküls hervorgeht und somit eine identische Sequenz aufweist, verhindern kann.
Es wurden drei Versuche durchgeführt: nach der Einführung eines DNA-Heteroduplex, das reich an Fehlpaarungen war, in die Zellen einer Maus wurde versucht, zu bestimmen, ob man:
a) das Auftreten von Chromosomen-Aberrationen beobachten kann, die durch die Aktivierung der Rekombination zwischen den verschiedenen wiederkehrenden Sequenzen hervorgerufen werden,
b) das Auftreten von Mutationen als Folge der nicht-korrigierten Replikationsfehler beobachten kann,
c) durch ein synthetisches Oligonucleotid eine cancerogene Mutation hervorrufen und sie dann durch ein anderes Oligonucleotid korrigieren kann.
a) Man führt die Transfektion von CHO-Zellen (chinesiche Hamster-Ovarien-Zellen) und von NIH3T3-Zellen (Fibroblasten der Maus) nach dem von C. Chen und H. Okayama (1987) in "Mol. Cell. Biol." 7, 2745-2752, beschriebenen Verfahren durch ("High efficiency tranformation of mammalian cells by plasmid DNA"). Etwa 50 % der Zellen werden durch die zirkuläre DNA, bei der es sich um das Heteroduplex M13/fd handelt, dessen Herstellung nachstehend erläutert wird, wirksam transfektiert, und etwa 10&sup6; Basenpaare der DNA gelangen in die Zellen, von denen etwa 200 Moleküle etwa 35 000 Fehlpaarungen tragen. Die Metaphasen-Platten zur Beobachtung der kondensierten mitotischen Chromosomen werden nach klassichen Verfahren hergestellt, wie sie von A.R. Kinsella und M. Radman in "Inhibition of carcinogen-induced chromosomal aberrations by an anticarcionogenic protease inhibitor" in "Proc. Natl. Acad. Sci., USA" (1980), 77, 3544-3547 und in "Tumor promoter induces sister chromatid exchanges: relevance to mechanisms of carcinogenesis" in "Proc. Natl. Acad. Sci.", USA (1978), 75, 6149-6153, beschrieben sind.
b) Um den Mutations-Effekt der Transfektion durch ein an Fehlpaarungen reiches Heteroduplex zu prüfen, mischt man die DNA des Plasmids pcD neo (Chen und Okayama (1987), "Mol. Cell. Biol.", 7, 2745-2752, "High efficiency tranformation of mammalian cells by plasmid DNA") mit dem Heteroduplex. Dies erlaubt die Selektion von Zellen, in welche die exogene DNA eingedrungen ist, in Gegenwart von 400 ug/ml Neomycin G418. Unter diesen Zellen wird die Häufigkeit der Mutationen der Resistenz gegenüber 6-Thioguanin und gegenüber Ouabain geprüft, wie von Kinsella und Radman (1978) in "P.N.A.S., USA", 75, 6149-6153, beschrieben.

c) Gerichtete und programmierte Mutagenese

Um die Penetration der Synthese-Oligonucleotide zu bewirken, kann man mehrere Verfahren anwenden, z.B. das Caliumphosphat-Verfahren, das Elektroporations-Verfahren und das Liposom-Verfahren, wie von Chen und Okayama, Andreason und Evans und Mannins und Gould-Fogente jeweils in "Biotechniques", Band 6, Nr. 7, Juli/August 1988, beschrieben). Die Methode durch direkte Mikroinjektion in den Kern kann ebenfalls angewendet werden.
Man verwendet NIH3T3-Zellen der Maus für die Transformation und das Heteroduplex M13/fd, dessen Herstellung nachstehend erläutert wird, als Inaktivator des Fehlpaarungs-Korrektursystems sowie das Synthese-Oligonucleotid 19-mer 5' GTTGGAGCT GTGGCGTAG (das unterstrichene T ist die "mutierte" Base in vielen Human-Tumoren und Nagetier- Tumoren, die sich in dem Codon 12 des Onkogens K-ras befindet). Der cancerogene Charakter der transformierten Zelle ergibt sich aus dem Wachstum im "Herd" auf dem Monoschichten-Rasen oder aus dem Wachstum in weichem Agar. Durch reverse Mutagenese mit dem Oligonucleotid 5' GTTGGAGCT GTGGCGTAG kann man eine genetische Heilung erzielen.

Herstellung des Heteroduplex M13/fd und des Heteroduplex φX&sub1;74/G4

Es wurde ein 3 % Fehlpaarungen enthaltender Heteroduplex zwischen den DNAs der Bakterien-Phagen M13 und fd hergestellt. Das Arbeitsprinzip ist das folgende:
- Isolierung der intrazellulären DNA (zirkulär, Doppelstrang oder RFI),
- Schneiden (Spalten) jeder Molekülbesetzung einmal, jedoch an verschiedenen Stellen des Moleküls,
- Denaturieren - Renaturieren,
- Isolieren der zirkulären DNA (wie von Brooks et al., 1989, beschrieben). BalI BamHI Mischen Denaturieren + Renaturieren 174 Fehlpaarungen pro Molekül von 6408 bp
(Die Sequenzen: Van Wezenbeek et al. (1980), "Gene", 11, 129-148).
Die Bakterienkulturen, die Phagen-Infektionen, die Isolierung der replikativen Form (RFI) der Bacteriophagen M13 oder fd wurden von Messing beschrieben in "Methods in Enzymology", Band 101, S. 20-78 (1983).
Die Form I (RFI) wird für den Phagen M13 durch BalI und den Phagen fd durch BamHI geschnitten. Nach der enzymatischen Digestion werden die DNAs denaturiert, dann renaturiert nach dem von Lee, Clark und Modrich beschriebenen Versuchsprotokoll in "PNAS" 80, 4639-4643 (1983). Nach dem Einwirkenlassen der Ligase von E. coli wird die durch eine kovalente Bindung geschlossene zirkuläre DNA durch Zentrifugieren in CsCl-EtdBr gereinigt.
Es wurde auch ein 30 % Fehlpaarungen enthaltender Heteroduplex zwischen den DNAs der Phagen φX 174 und G4 nach dem gleichen Verfahren hergestellt.
Die folgenden Stämme wurden bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, am 23. Dezember 1988, hinterlegt:
Salmonella typhimurium SL4213 mut L Nr. I 831.
Intergenera-Rekombinante SACL17 Nr. I 832.

Literaturhinweise

1. M. Marinus und N. Morris (1973), "J. Bacteriol.", 114, 1143-1150.
2. G. Tiraby und A. Sicard (1973), "J. Bacteriol.", 116, 1130-1135.
3. Williamson et al. (1965), "Genetics" 110, 609-646.
4. Ochman und Wilson in "E. coli and Salmonella typhimurium", Bd. 2, "American Society for Microbiology", Washington DC, S. 1649-1654.
5. Baron et al (1959), "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 45, 976-984.
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8. P. Brooks et al., angenommen für "Proc. Natl. Acad. Sci. USA".
9. Maniatis et al. (1982), "Molecules Cloning Cold Spring Harbor Laboratory".
10. Meselson und Yaun (1968), "Nature", 217, 1110-1114.
11. Radman und Wagner (1988), "Scientific American August 1988" ("Pour la Science" October 1988).
12. Mendel und Miga (1970), "M. Mol. Biol." 53, 159-162.
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15. Kinsella und Radman (1978), "PNAS", 75, 6149-6153.
16. Kinsella und Radman (1980), "PNAS", 77, 3544-3547.
17. "Biotechniques", Bd. 6, Nr. 7, Juli/August (1988).
18. "Methods in Enzymology", Bd. 101, S. 20-78 (1983).
19. "PNAS", 80, 4639-4643 (1983).

Claims

1. Verfahren zur in vivo-Intergenera-Rekombination von partiell homologen DNA-Sequenzen, die bis zu 30 % Basen- Fehlpaarungen aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß man die genannten Sequenzen in Zellen oder in einem Organismus, deren (dessen) enzymatisches System zur Reparatur von Fehlpaarungen defekt ist oder insbesondere durch Sättigung vorübergehend inaktiviert worden ist, zusammenbringt für eine Zeit zur Erzeugung einer Rekombination zwischen den genannten DNA-Sequenzen, wobei die genannten, miteinander zu rekombinierenden DNA-Sequenzen aus Bakterien verschiedener Genera stammen, wenn sie prokaryontischen Ursprungs sind.

2. Verfahren zur in vivo-Bildung von Hybrid-Genen und ihren codierten Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Verfahren nach Anspruch 1 in dem genannten Organismus, dessen enzymatisches System zur Reparatur von Fehlpaarungen defekt oder inaktiviert ist, zwei der genannten DNA-Sequenzen, die aus partiell homologen Genen bestehen und aus zwei verschiedenen Organismen stammen, zusammenbringt und das gesuchte Hybrid-Gen oder sein codiertes Protein selektioniert.

3. Verfahren zur in vivo-Bildung von Hybrid-Genen und ihren codierten Proteinen nach Anspruch 2, bei dem ein erstes Gen aus einem ersten Organismus, das von einem ersten Plasmid getragen wird, und ein partiell homologes zweites Gen eines zweiten Organismus durch Transformation in ein Bakterium, dessen enzymatisches System zur Reparatur von Fehlpaarungen defekt ist, oder in ein Bakterium, dessen System zur Reparatur von Fehlpaarungen vorübergehend inaktiviert ist, eingeführt werden, die Gene rekombiniert werden und das gesuchte Hybrid-Gen oder sein codiertes Protein selektioniert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das mit den Plasmiden, welche die zu rekombinierenden Gene tragen, transformierte Bakterium ein solches vom Stamm E. coli oder Salmonella typhimurium, das defekt oder vorübergehend inaktiviert ist in bezug auf das enzymatische System zur Reparatur der Fehlpaarungen, oder irgendeine andere Mutante dieses Bakteriums sein kann, welche(s) die Intergenera-Rekombination verbessert.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Funktion der Reparatur der Basen-Fehlpaarungen einen wärmeempfindlichen E. coli-Stamm mutSts-1 verwendet, der bei 32ºC zur normalen Mutante mut&spplus; und bei 42ºC zur Mutante mutS&supmin; mutiert.

6. Verfahren zur Bildung von rekombinierten Zellen durch Transformations- oder Fusions-Methoden nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man:

- die Transformation und die Rekombination in vivo durchführt:

. mit Hilfe der DNA von Zellen eines Organismus einer ersten Species und eines ersten Genus und

. mit Hilfe der Chromosomen-DNA der Zellen eines Organismus einer zweiten Species und/oder eines zweiten Genus,

wobei diese Zellen des Organismus der zweiten Species oder des zweiten Genus defekt sind in bezug auf das enzymatische System zur Reparatur von Basen-Fehlpaarungen oder ein insbesondere durch Sättigung vorübergehend inaktiviertes derartiges System aufweisen, oder

- die in vivo-Rekombination der Chromosomen dieser beiden Zell-Typen nach der Fusion der genannten Zellen durchführt, wobei diese Zellen beide ein defektes oder ein insbesondere durch Sättigung vorübergehend inaktiviertes enzymatisches System zur Reparatur von Fehlpaarungen aufweisen.

7. Verfahren zur Bildung von rekombinierten Organismen durch in vivo-Kreuzung und -Rekombination von Organismen verschiedener Species und/oder Genera nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

die Kreuzung in vivo durchführt zwischen:

- einem Organismus einer ersten Species und eines ersten Genus und

- einem Organismus einer zweiten Species und/oder eines zweiten Genus,

wobei mindestens einer dieser beiden Organismen defekt ist in bezug auf das enzymatische System zur Reparatur von Basen-Fehlpaarungen oder ein solches System aufweist, das insbesondere durch Sättigung vorübergehend inaktiviert ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnete daß man, ausgehend von entsprechenden Organismen, rekombinierte Bakterien, Hefen, Pflanzenzellen oder Tierzellen herstellt.

9. Verfahren zur Herstellung von rekombinierten Bakterien durch Kreuzen und Rekombinieren in vivo von Bakterien verschiedener Genera nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnete daß man

eine in vivo-Konjugation oder -Transduktion durchführt zwischen

- sogenannten Empfänger-Bakterien eines Organismus eines ersten Genus, die defekt sind in bezug auf die enzymatischen Systeme zur Reparatur von Basen-Fehlpaarungen oder deren enzymatische Systeme zur Reparatur von Basen-Fehlpaarungen, insbesondere durch Sättigung, vorübergehend inaktiviert sind für eine Zeit zur Erzielung der gewünschten Rekombination, und

- sogenannten Donor-Bakterien eines Organismus eines zweiten Genus, der eine spezielle Eigenschaft aufweist, die man auf die Empfänger-Bakterien übertragen will.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Empfänger-Bakterien außerdem defekt sind in bezug auf das enzymatische System zur Restriktion der DNA.

11. Verfahren zur in vivo-Bildung von Hybrid-Genen und ihren codierten Proteinen, wobei man von zwei partiell homologen Genen ausgeht, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10 ein erster Organismus ein erstes Gen enthält und der genannte zweite Organismus das partiell homologe zweite Gen enthält, und daß man das gesuchte Hybrid-Gen oder sein codiertes Protein selektioniert.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm E. coli und einen Stamm Salmonella typhimurium, von denen mindestens einer defekt oder vorübergehend inaktiviert ist in bezug auf das enzymatische System zur Reparatur von Fehlpaarungen, miteinander kreuzt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm E. coli oder Salmonella typhimurium, der defekt ist in bezug auf das enzymatische System zur Reparatur von Basen-Fehlpaarungen, ein Stamm mutS&supmin; oder mutL&supmin; ist, d.h. defekt ist an dem Protein MutS oder MutL, die an der Erkennung der Fehlpaarungen beteiligt sind.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß im Fall der Konjugation das Donor-Bakterium ein Stamm HFr und das Rezeptor-Bakterium ein Mutanten-Stamm F&supmin; ist.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sättigung des enzymatischen Systems zur Reparatur von Basen-Fehlpaarungen durch Einführen eines an Fehlpaarungen reichen Heteroduplex erfolgt.

16. Verfahren zur gezielten inversen Mutagenese eines Gens in einem Organismus nach Anspruch 1, wobei das genannte Gen eine mutierte Base aufweist, die man wieder in ihren Zustand vor ihrer Mutation überführen will, dadurch gekennzeichnet, daß man in den Organismus ein Heteroduplex einführt, das eine erhöhte Anzahl von Fehlpaarungen aufweist, um das enzymatische System des Organismus zur Korrektur van Fehlpaarungen durch Sättigung zu inaktivieren, und ein Oligonucleotid einführt, das besteht aus der DNA- Sequenz die wieder in den Zustand vor der Mutation des Gens überführt worden ist.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Heteroduplex aus den Phagen M13 und fd stammt.