DE68919360T2 - Verfahren zur reinigung hochreiner heparinase in grosser menge. - Google Patents

Description

Hintergrund der Erfindung
• Die US-Regierung besitzt Rechte an dieser Erfindung aufgrund der NIH-Beihilfe Nr. GM 25810.
• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Heparinase und anderen Eliminasen aus F. heparinum.
• Heparinase ist eine Eliminase, die Heparin an den alpha-glycosidischen Bindungen in der Hauptrepetiereinheit des Heparins schneidet: →4)-2-Desoxy-2-sulfamino- -D-glucopyranose 6-sulfat-(1→4)-alpha-L-idopyranosyluronsäure 2-sulfat-(1→. Heparin wird für klinische Anwendungen eingesetzt, sowohl in vitro als auch in vivo, um die Blutkoagulation zu hemmen. Heparin ist ein Mucopolysaccharid mit einem weiten Bereich von Molekulargewichten von bis zu 20.000, wobei das mittlere Molekulargewicht 13.500 beträgt; Heparin wirkt durch direkte Hemmung des Thrombins und des aktivierten Faktors X als auch anderer Serinesterasen im Blut.
• Die antikoagulative Wirkung des Heparins wird klinisch neutralisiert entweder durch Präzipitation mit Protamin oder durch immobilisierte Heparinase enthaltende Reaktoren, wie sie in der US-Patentanmeldung 044 245 mit dem Titel "Extracorporeal Reactors Containing Immobilized Species", angemeldet am 22. Mai 1987, Anmelder Howard Bernstein, et al., und in der US-Patentanmeldung Nr. 044 340 mit dem Titel "Bioreactor Containing Suspended, Immobilized Species", angemeldet am 6. Juni 1987 von Lisa E. Freed, et al. beschrieben sind. Die Heparinase ist immobilisiert, um das Herauslösen der Heparinase in den Körper über das durch den Reaktor tretende Blut zu verhindern.
• Sulfatasefreie Heparinase, die auch als Heparinase von katalytischer Reinheit bezeichnet wird, ist erforderlich, um die antikoagulativen Eigenschaften von Heparin durch enzymatischen Abbau vollständig zu entfernen. In der US-Patentschrift Nr. 4 341 869 von Langer, et al. wird beschrieben, daß Heparinase von Bakterien wie Flavobacterium heparinum produziert wird. Man läßt den Organismus wachsen, die Zellen werden lysiert, die Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt, und der Zellextrakt wird über eine Hydroxylapatitsäule, 3Ca&sub3;(PO&sub4;)&sub2; Ca(OH)&sub2; oder Ca&sub1;&sub0;(PO&sub4;)&sub6;(OH)&sub2;, gegeben. Eine Hydroxylapatitsäule kann eine 10- bis 100fache Enzymanreicherung ergeben, wenn das Protein aus der Säule bei hohen Salzkonzentrationen schrittweise eluiert wird. Wie beschrieben, wird eine höhere Enzymausbeute durch schrittweise Elution der Heparinase unter Verwendung einer Phosphatpufferlösung mit zunehmender Natriumchloridkonzentration erhalten, die in einem Bereich von 0,01 M Natriumphosphat, pH 6,8, bis zu 0,10 M Natriumphosphat, 0,19 M Natriumchlorid, pH 6,8 1regt.
• Dieses Reinigungsverfahren wurde dadurch stark verbessert, daß die Hydroxylapatitchromatographie mit wiederholter Gelfiltrationschromatographie und chromatischer Fokussierung kombiniert wurde, beschrieben durch Yang, et al. in "Purification and Characterization of Heparinase from Flavobacterium heparinum", J. Biol. Chem. 260(3), 1849-1857 (1985).
• Die gereinigte Heparinase, ein Protein, weist ein Molekulargewicht von 42.900 ± 1000 Dalton mit einem pI-Wert von 8,5 auf.
• Nakamura et al. (1988), J. Clin. Microbiol. 26, 1070-1071 beschreiben die Isolierung von Heparinase aus Bacteroides heparinolyticus, wobei der erste Schritt im Isolationsverfahren das Aufbrechen der Zellen durch Ultraschall umfaßt.
• Linhardt et al. (1985), Int. J. Biochem. 17, 1179-1183 beschreiben Kaninchenantikörper gegen die 47 kDa Heparinase aus Flavobacterium heparinolyticus und ihre Immunoaffinitätsreinigung.
• Obwohl diese Verfahren bei der Herstellung von Reagenzien im Labormaßstab und zum Charakterisieren des Enzyms brauchbar sind, sind sie zur Herstellung von Heparinase in der Menge und in der Reinheit, wie sie zur klinischen Anwendung im großen Maßstab notwendig sind, ungeeignet. Weiterhin würde das beschriebene Reinigungsverfahren schwierig auf die Gewinnung des Enzyms im großen Maßstab übertragbar sein.
• Andere Verfahren, die zum Extrahieren von Proteinen aus dem periplasmatischen Raum Gram-negativer Bakterien verwendet wurden, umfassen eine osmotische Schockbehandlung als Anfangs schritt (Methods in Enzymology XXII, 490 (1971)). Typischerweise umfassen diese Verfahren zu Beginn das Aufbrechen in einem osmotisch stabilisierenden Medium und die nachfolgende selektive Freisetzung in einem nicht-stabilisierenden Medium. Die Zusammensetzung dieser Medien (pH, Schutzmittel) und die zum Aufbrechen verwendeten Verfahren (Chloroform, Lysozym, EDTA, Ultraschallbehandlung) unterscheiden sich bei den einzelnen beschriebenen Verfahren. Keines dieser Verfahren wurde bisher erfolgreich auf die Reinigung von Heparinase von katalytischer Reinheit angewandt.
• Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung hochreiner Heparinase in großen Mengen zur Verwendung in kommerziellen und klinischen Anwendungen bereitzustellen.
• Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Isolierung anderer Eliminasen aus F. heparinum bereitzustellen.
• Es ist weiterhin eine Aufgabe der Erfindung, große Mengen gereinigter, enzymatisch aktiver Heparinase und anderer Eliminasen bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
• F. heparinum-Zellen, die durch Ultrafiltration konzentriert wurden, werden einer osmotischen Schockbehandlung unterzogen, um aktive Heparinase aus dem periplasmatischen Raum freizusetzen. Die Zerstörung der Zellhülle wird dadurch induziert, daß die Zellen einem osmotisch stabilisierten Medium, mit oder ohne EDTA, ausgesetzt werden, und anschließend eine Anfangsfreisetzung periplasmatischen Materials in ein nichtstabilisiertes Medium (10 mM Phosphat, bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 8,6) mit nachfolgender Freisetzung von Heparinase und anderer Eliminase-Aktivität in ein zweites nichtstabilisiertes Medium (10 mM Phosphat, 150 mM Natriumchlorid, bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 8,6) erfolgt. Bevorzugterweise ist das osmotisch stabilisierte Medium 20% Sucrose. Dieses dreistufige Verfahren ermöglicht zu Beginn eine fünf- bis zehnfache Reinigung mit einer Aktivitätsausbeute von bis zu 75%. Insbesondere werden Verunreinigungen, von denen sich herausgestellt hat, daß sie durch die vorher beschriebenen Verfahren äußerst schwierig entfernbar sind, während der ersten zwei Schritte der osmotischen Schockbehandlung entfernt.
• Nach der Entfernung der Natriumionen durch Diafiltration wird das konzentrierte Material durch Kationenaustauschchromatographie fraktioniert, bevorzugt unter Verwendung einer FPLC-Mono- S-Säule. Die Heparinase-Aktivität liegt in zwei Proteinen vor, einem Protein mit ungefähr 42.000 - 43.000 Dalton und einem Protein mit 65.000 - 75.000 Dalton. Die Gesamtausbeute beträgt typischerweise 25% mit einer 200- bis 300fachen Zunahme in der Reinheit.
• Die Wirksamkeit der osmotischen Schockbehandlung ist dadurch verbesserbar, daß der pH-Wert und die Ionenstärke der zwei Freisetzungsmedien verändert werden. Weiterhin kann ein Scaleup dieses Verfahrens unter Verwendung von Massedurchsatz-Ionenaustauschvorrichtungen durchgeführt werden.
• Ein Verfahren zur Herstellung einer Genbibliothek und Verfahren zum Screenen von Heparinase produzierenden Organismen werden ebenfalls beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
• Die Fig. 1 ist ein Aktivitätschromatogramm des Materials, das durch das dreistufige osmotische Schockverfahren freigesetzt wurde, fraktioniert durch Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung einer FPLC-Mono-S-Säule und eluiert mit einem Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl (1 ml Fraktionen wurden während des Elutionsgradienten gesammelt und unter Verwendung des Azur- A-Farbstoffs auf Heparinase-Aktivität getestet).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
• Das bevorzugte Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Reinigung von Heparinase im großen Maßstab aus Bakterien umfaßt das Herstellen von Heparinase in einem Fermentationsreaktor, der einen Organismus wie Flavobacterium heparinum oder irgendeinen anderen Gram-negativen Organismus enthält, der so konstruiert oder mutiert wurde, daß er Heparinase produziert, das Entfernen des Kulturmediums und das Konzentrieren der Zellen, beispielsweise durch ein Ultrafiltrations- oder Zentrifugationsverfahren, eine dreistufige osmotische Schockbehandlung der konzentrierten Zellen, das Abtrennen der Zellen und des nichtspezifischen periplasmatischen Materials, das Konzentrieren des verbleibenden periplasmatischen Materials durch Diafiltration unter Verwendung einer Membran mit einem Rückhaltevermögen für ein Material mit einem Molekulargewicht von 10.000, um Wasser und Salze zu entfernen, Abtrennen der Heparinase durch Ionenaustauschchromatographie der konzentrierten Lösung, die eine 10 mM NaCl-Lösung enthält (bevorzugt auf einer schnellen Kationenaustausch-Protein-Flüssigchromatographiesäule), und weitere Aufreinigung des aus der Säule eluierten, Heparinase-Aktivität aufweisenden Materials durch Gelelektrophorese oder Gelfiltration.
Selektive Freisetzung von periplasmatischem Protein
• F. heparinum-Zellen, die von Alfred Linker, Veterans Administration Hospital, Salt Lake City, Utah bezogen wurden, wurden bei 30ºC in 2,8 l Schüttlerflaschen wachsen gelassen, wobei die Flaschen 500 ml eines definierten Mediums enthielten (3 g K&sub2;HPO&sub4;/l, 1,5 g KH&sub2;PO&sub4;-H&sub2;O/l, 0,5 g NaCl/l, 1,0 g NH&sub4;Cl/l, 2 mM MgSO&sub4;-7H&sub2;O, 0,2 g L-Histidin/l, 0,2 g L-Methionin/l, 8 g Glucose/l, 1 g Heparin/l und je 10-4 mM von NaMoO&sub4;-2H&sub2;O, CoCl&sub2;- 6H&sub2;O, MnSO&sub4;-H&sub2;O, CuSO&sub4;-5H&sub2;O, FeSO&sub4;-7H&sub2;O und CaCl&sub2;). Der Organismus kann bis zu zwei Wochen auf Agarplatten aufbewahrt werden, die 1% Difco-Agar in einem definierten Medium enthalten, das 4 g Heparin/l als einzige Kohlenstoffquelle enthält, oder unbegrenzt in 10% DMSO bei -80ºC.
• Die Heparinase-Aktivität wird dadurch bestimmt, daß die metachromatische Verschiebung von Azur A von blau zu rot in Gegenwart von Heparin entsprechend dem von Gallilher, et al., Appl. Environ. Microbiol. 41, 360-365 (1981) beschriebenen Verfahren beobachtet wird. Die Veränderung in der Absorption wird bei 620 nm im linearen Bereich des Tests bestimmt und mit einer Standardkurve von 0 bis 8 mg/ml Heparin in Testpuffer (0,25 M Natriumacetat, 0,0025 M Calciumacetat, pH 7,0) verglichen. Eine Aktivitätseinheit dieses Tests entspricht einer Enzymmenge, die 1 mg Heparin/h abbaut.
• Die Beta-Galactosidase-Aktivität wird durch das Verfahren von Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York bestimmt. Die Proteinkonzentrationen werden mit dem Bio-Rad-Proteintest bestimmt. Das Wachstum des Organismus wird durch Bestimmung der Absorption der Zellsuspensionen bei 600 nm überwacht. Die Anzahl der überlebensfähigen Zellen wird durch Plattieren geeigneter Verdünnungen auf Agarplatten mit definiertem Medium bestimmt.
• Das osmotische Schockverfahren ist wie folgt: Zellen werden zunächst in einem osmotisch stabilisierenden Medium, beispielsweise einem Schutzmedium, das 20% Sucrose, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0 enthält, suspendiert. Nach dieser Behandlung werden die Zellen nacheinander in zwei nicht-stabilisierenden (Rückgewinnungs-)Medien resuspendiert: 1) 10 mM Natriumphosphat, zwischen pH 7,0 und pH 7,5 (eine gepufferte Lösung mit niedriger Ionenstärke) und 2) 10 mM Natriumphosphat, enthaltend 150 mM Natriumchlorid, zwischen pH 7,0 und pH 7,5 (eine gepufferte Salzlösung). Die Zellen werden zunächst geerntet und anschließend aus jeder Lösung durch Zentrifugation bei 7000 g für 10 Min. in einer Sorval RC-2B-Kühlzentrifuge abgetrennt. Alle Verfahren werden bei pH 7,0 und 4ºC bei einer Zellkonzentration von 5 · 1010 Zellen/ml durchgeführt, falls nicht anders angegeben. Ein Aliquot der Zellen, das keinem osmotischen Schock unterzogen wurde, wird mit einem Branson W-350-Ultraschallgerät 15 Min. lang, 50% gepulst, #6) ultraschallbehandelt und als 100%-Kontrolle verwendet. Die Überstände aus den Osmose-Freisetzungslösungen und die ultraschallbehandelten Zellen werden in 10 mM Phosphat, 150 mM NaCl vor der Bestimmung der Enzymaktivität und des Proteingehalts dialysiert.
• Die höhere spezifische Aktivität des freigesetzten Enzyms, verglichen mit der spezifischen Aktivität der ganzen Zelle (Ultraschallkontrolle), zeigt, daß Heparinase bevorzugt in die nicht-stabilisierenden Medien freigesetzt wird (vgl. Tabelle 1). Eine maximale Freisetzung von Heparinase wird dann erreicht, wenn die aufgebrochenen Zellen zunächst mit der Lösung mit der Niedrigsalzkonzentration gewaschen werden und nachfolgend eine Waschung mit einer Lösung mit hoher Salzkonzentration durchgeführt wird. Weiterhin wird in den Freisetzungsüberständen nur eine geringe Menge an beta-Galactosidase- Aktivität nachgewiesen, was zeigt, daß das cytoplasmatische Material durch dieses Verfahren nicht in großer Menge freigesetzt wird. EDTA, SDS, Lysozym, Toluol oder Chloroform können zum nicht-stabilisierenden Medium zugegeben werden, um ein Aufbrechen der Zellen und das Freisetzen des Enzyms aus dem periplasmatischen Raum zu fördern, oder die Zellen können einer Einfrier- und Auftaubehandlung unterzogen werden. Eine Ultraschallbehandlung wird die periplasmatischen Proteine ebenfalls freisetzen, wobei diese jedoch nicht einfach kontrollierbar ist. Weder eines der zuletzt genannten Additive noch die Ultraschallbehandlung ist jedoch effektiver als Sucrose alleine. TABELLE 1 Spezifische Freisetzung von Heparinase aus F. heparinum durch eine dreistufige osmotische Schockbehandlung PROBE a HEPARINASE β-GALACTOSIDASE PROTEIN Aktivität Sp. Akt. Gesamt ULTRASCHALLBEHANDELT SUCROSE NIEDERSALZ HOCHSALZ a - alle Proben enthielten 5 · 10¹&sup0; Zellen/ml
• Die Tabelle 2 zeigt die Abhängigkeit der enzymatischen Freisetzung von der Ionenstärke der Rückgewinnungslösungen. Osmotisch stabilisierte Zellen wurden in zwei gleiche Ansätze aufgeteilt und getrennt in Lösungen mit einer niedrigen und einer hohen Salzkonzentration resuspendiert. Nach der Anfangsbehandlung wurden die Zellen wiederum in zwei Ansätze aufgeteilt und getrennt in den zwei nicht-stabilisierenden Lösungen resuspendiert. Alle Überstände wurden gesammelt und auf ihre Heparinase-Aaktivität und ihren Proteingehalt getestet. Die Ergebnisse zeigen die Bedeutung der Verwendung aller drei Lösungen, und zwar in dieser Reihenfolge: 20% Sucose-, Niedersalz- und Hochsalzlösung. TABELLE 2 Abhängigkeit der enzymatischen Freisetzung von der Ionenstärke der Rückgewinnungslösungen PROBE HEPARINASE PROTEIN Aktivität Sp. Akt. Gesamt ULTRASCHALLBEHANDELT I: Niedersalz II: Niedersalz Hochsalz
• Die Tabelle 3 zeigt die Einflüsse von EDTA und des pH-Werts auf die Freisetzung von Heparinase aus F. heparinum unter Verwendung des dreistufigen osmotischen Schockverfahrens. Das Vorhandensein oder die Menge an EDTA scheint die Freisetzung der Heparinase nicht zu verändern. Jedoch nimmt die zur Niedersalzlösung freigesetzte Heparinasemenge mit zunehmendem pH-Wert über einen pH-Bereich von 6,0 bis 8,7 zu. Die größte Gesamtrückgewinnung, entweder für die Niedersalz- oder die Hochsalzfraktionen, liegt bei einem pH-Wert von 7,5. TABELLE 3 Einflüsse von EDTA und pH auf die Freisetzung von Heparinase aus F. heparinum durch das dreistufige osmotische Schockverfahren PROBE EDTA a pH b HEPARINASE Aktivität Einfluß von EDTA: ULTRASCHALLBEHANDELT Niedersalz Hochsalz Einfluß des pH-Wertes: a - im ersten Schritt zugegebene EDTA-Menge b - pH der Rückgewinnungslösungen
• Die Zellwachstumsstufe hat einen Einfluß auf den Grad der Rückgewinnung. Die maximale Rückgewinnung erfolgt aus Proben, die während der mittleren bis späten exponentiellen Phase entnommen wurden, bei einer maximalen Wachstumsrate von 0,21&supmin;¹ für F. heparinum. Die freigesetzte spezifische Aktivität von Heparinase nimmt über das exponentielle Wachstum hindurch zu, während die Gesamtmenge an freigesetztem Protein relativ konstant bleibt. Die Abnahme in der Rückgewinnung von Heparinase während der stationären Wachstumsphase scheint eher mit einer Abnahme in der freigesetzten Proteinmenge in Beziehung zu stehen als mit einem Abfall in der spezifischen Aktivität.
• Im allgemeinen ist die in jeder der Rückgewinnungslösungen freigesetzte Proteinmenge etwa gleich, 5-8% des Gesamtzellproteins. Bei pH 7,0 wird Heparinase bevorzugt in die Hochsalzlösung freigesetzt, die 65-80% der insgesamt freigesetzten Aktivität enthält.
• Unter Verwendung dieser Verfahren können die Bedingungen für eine optimale Rückgewinnung von Heparinase unter Verwendung einer dreistufigen osmotischen Schockbehandlung bestimmt werden. Auf der Grundlage der in den Tabellen 1, 2 und 3 angegebenen Werte wurde ein verbesserter Anfangsreinigungsschritt entworfen, bei dem Heparinase selektiv aus F. heparinum freigesetzt wird und gleichzeitig von anderen periplasmatischen Bestandteilen durch Veränderung der Salzkonzentration in den Freisetzungsmedien abgetrennt wird.
• Während der Proteingehalt in jeder Rückgewinnungslösung in etwa gleich ist, 5 bis 8% des Gesamtzellproteins, werden etwa 75% der freigesetzten Heparinase-Aktivität, mit einer typischen 10fachen Zunahme in der spezifischen Aktivität, in der Hochsalzrückgewinnungsfraktion gefunden. Wenn osmotisch stabilisierte Zellen sofort einer Hochsalzlösung ausgesetzt werden, wird nur wenig Protein freigesetzt. Wenn weiterhin der dritte Verfahrensschritt durch eine Waschung mit einer Niedersalzlösung ersetzt wird, wird keine zur Hochsalzlösung vergleichbare Heparinase-Aktivität freigesetzt.
Ionenaustauschchromatographie und Elektrophorese
• Heparinase, isoliert aus F. heparinum durch osmotische Freisetzung, kann weiterhin durch Kationenaustauschchromatographie aufgereinigt werden, bevorzugt unter Verwendung einer schnellen Proteinflüssigchromatographie (FPLC)-Vorrichtung (Mono S, Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ). Die Proben werden dialysiert und in einem 10 mM Phosphatpuffer bei pH 7,0 beladen und mit einem linearen Salzgradienten im Bereich von 0,0 bis 0,3 M NaCl mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Min. eluiert.
• Mehr als 70% des eingesetzten Gesamtproteins wird nicht an die Säule absorbiert. Die Aktivität wird in zwei Fraktionen rückgewonnen, die weniger als 1% des Gesamtproteins enthalten (vgl. Fig. 1). Das bei 150 mM NaCl eluierende Protein weist ein Molekulargewicht von 42.900 Dalton auf. Die spezifische Aktivität dieser Fraktion liegt im Bereich von 2000-3000 U/mg Protein. Ein zweites Enzym wird bei 75 mM NaCl eluiert. Die Heparinase- Aktivität des bei 75 mM NaCl eluierenden Materials scheint auf Einfrieren sensitiv zu reagieren; jedoch verbleiben mehr als 90% Aktivität für bis zu 7 Tage in 10 mM Phosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,0, ± 20% Glycerin, bei -20ºC.
• Die Enzymzubereitungen können durch Gelfiltration auf einem Molekularsieb, beispielsweise Sephadex G100 oder SDS-PAGE, unter Verwendung des von Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970) beschriebenen Verfahrens (Trennungsgele aus 12,5% Acrylamid), gereinigt und analysiert werden. Das 42.900 Dalton-Protein enthält drei andere Hauptkontaminanten, die durch Elektrophorese entfernt werden.
• Das bei 75 mM NaCl eluierende Material kann weiter durch Chromatographie unter Verwendung einer FPLC-Vorrichtung mit einer Gelfiltrationsmatrix, beispielsweise Superose 12, Pharmacia Eine Chemicals, Piscataway, NJ gereinigt werden. Die Probe wird direkt von der Kationenaustauschchromatographie beladen und mit 10 mM Natriumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,0 mit einer Eließgeschwindigkeit von 0,1 ml/Min. eluiert. Die Heparinase-Aktivität wird in der Fraktion mit einem Molekulargewicht im Bereich von 65.000 bis 75.000 Dalton gefunden. Durch SDS-PAGE-Analyse wurde dem Material mit der größten Aktivität ein Molekulargewicht von 70.000 zugeordnet, sogar unter reduzierenden Bedingungen.
• "Mono S", "Sephadex" und "Superose" sind Warenzeichen.
Produktion durch Fermentation im großen Maßstab
• Nach den zwei Hauptaufreinigungsschritten, der osmotischen Freisetzung und der FPLC, werden zwei Konzentrierungsschritte, Ultrafiltration und Diafiltration, angewandt, um die Handhabung größerer Materialmengen zu erleichtern; diese Ergebnisse sind in der Tabelle 4 für eine 10-Liter-Fermentation von F. heparinum angegeben, die man auf 2 g/l DCW wachsen ließ und durch Mikrofiltration unter Verwendung einer 0,1 um Romicon- Ionenaustauschmembranvorrichtung auf 1 l konzentrierte. Das in die Hochsalzlösung freigesetzte Material wurde durch Diafiltration unter Verwendung einer 10.000 Dalton Ausschluß-Ultrafiltrationsmembran konzentriert und durch FPLC-Kationenaustauschchromatographie fraktioniert. Typischerweise werden 20-25% der Heparinase-Aktivität mit einer 200-300fachen Zunahme der spezifischen Aktivität rückgewonnen. TABELLE 4 Rückgewinnung von Heparinase aus einer 10-Liter-Fermentation von F. heparinum Verfahrensschritt Gesamtaktivität Rückgewinnung der Aktivität Sp. Akt. Gesamtprotein FERMENTATION ULTRAFILTRATION OSMOTISCHER SCHOCK DIAFILTRATION FPLC
Produktion von Antikörpern und Hybridisierungsproben zur Klonierung
• Die durch Gelelektrophorese oder Gelfiltration erhaltenen gereinigten Heparinase-Proteine können zur Herstellung von Antikörpern unter Verwendung von dem Fachmann an sich bekannten Verfahren verwendet werden. Beispielsweise können Antikörper durch Injektion eines Proteins in einem geeigneten Adjuvans, beispielsweise dem unvollständigen Freund-Adjuvans, in ein Tier, beispielsweise ein Kaninchen oder eine Ziege, erzeugt werden. Alternativ hierzu können monoklonale Antikörper durch Immunisieren einer Maus und Fusionieren der Milzzellen mit Hybridaromazellen und nachfolgender Gewinnung des Antikörpers hergestellt werden.
• Das aus der SDS-PAGE eluierte Material war von ausreichender Reinheit, um unter Verwendung der dem Fachmann bekannten Verfahren und Vorrichtungen eine Sequenzierung zu ermöglichen. Die in der Tabelle 5 angegebenen Ergebnisse zeigen für beide Proteine ein ähnliches Zusammensetzungsprofil, obwohl einige Unterschiede offensichtlich sind, am bemerkenswertesten Glutamin/Glutamat, Lysin und Methionin. Die Sequenz für das 42.000-Dalton-Protein ist am N-Terminus modifiziert, bestimmt durch Inhibition der Edmund-Abbautechnik. Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen können zur Herstellung von Hybridisierungsproben und anderen Mitteln verwandt werden, um für Heparinase kodierende Nucleinsäuresequenzen zu erhalten; diese können anschließend in genetisch veränderten Organismen zur vermehrten Produktion von Heparinase oder zur Produktion unter externer Kontrolle eingesetzt werden. TABELLE 5 Aminosäurezusammensetzung von Proteinen aus F. heparinum mit Heparinase-Aktivität Aminosäure D-Protin Reste Glutamin/Glutamat Asparagin/Aspartat Serin Glycin Histidin Arginin Theonin Alanin Prolin Tyrosin Valin Methionin Isoleucin Leucin Phenylalanin Lysin
Verfahren zum Screenen einer Expressionsbibliothek auf Heparinase-Gene
• Es wurden Versuche entwickelt, um große Populationen von zur Heparinase-Produktion genetisch veränderten Organismen zu screenen. Die bisher unternommenen Versuche, unter Verwendung von gegen Heparinase gerichteten Antikörpern zu screenen, waren aufgrund der extensiven Kreuzreaktivität mit verschiedenen anderen F. heparinum-Proteinen nicht erfolgreich. Die Versuche und Verfahren zum Screenen können verwendet werden, um entweder das Gen für die 42.000-Dalton-Heparinase oder das 65.000- 75.000-Dalton-Protein mit Heparinase-Aktivität zu isolieren und zu charakterisieren.
• Basierend auf der Präzipitation von Heparin aus menschlichem Blut durch elektrostatische Assoziation mit Protaminsulfat wurde ein Agarplattentest entwickelt. Heparinase-Testplatten, die aus 0,25 M Natriumacetat, 0,0025 M CaCl&sub2;, 1,0 g Heparin aus der Intestinalschleimhaut von Schweinen (Hepar Industries, Franklin, OH)/l und 1,5% Agarose (BRL), pH 7,0 bestehen, werden hergestellt. Die Platten werden mit den auf Heparinase-Produktion zu testenden Zellen beimpft. Als Kontrolle wird Heparinase durch das oben beschriebene Verfahren isoliert und in verschiedenen Mengen auf eine Platte aufgebracht, und zwar 0,0, 0,01, 0,10 und 1,00 U in 10 ul 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0, worauf die Platte anschließend bei 37ºC 1 Std. lang inkubiert wird. Eine 2% Protaminsulfat (Lachs, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)-Lösung wird über die Oberfläche der Platten gegossen. Über einen Zeitraum von 1 bis 2 Std. bildet sich ein weißes Präzipitat, wobei Aufhellungszonen mit zunehmender Intensität in denjenigen Abschnitten verbleiben, wo erhöhte Heparinasemengen zugegeben werden, oder wo eine Bakterienkolonie Heparinase produziert. Beispielsweise wurden Aufhellungszonen um F. heparinum-Kolonien gebildet, die man auf 1,0 g Heparin/l enthaltenden LB-Agarplatten wachsen ließ, nicht jedoch um E. coli JM83, den man auf den gleichen Platten wachsen ließ.
• Der Nachweis eines konstitutiv produzierenden F. heparinum- Stammes erfordert das Wachstum des Organismus auf einem Medium ohne Heparin. Es wurde ein Test entwickelt, bei dem man F. heparinum auf 1 mM MgSO&sub4; enthaltendem Minimalmedium (Repressionsbedingungen) wachsen ließ und diese dann auf zwei Agarplatten mit Minimalmedium ausplattierte, von denen eine Platte mit 1,0 g/l Heparin supplementiert war (Induktionsbedingungen). Die Platten werden bei 30ºC 36 Std. lang inkubiert, und die Kolonien werden auf Nitrocellulose (NC)-Papier transferiert. F. heparinum-Kolonien kleben an das NC-Papier und werden dadurch lysiert, daß sie 20 Min. lang Chloroformdämpfen ausgesetzt werden. Das NC-Papier wird dann, wie oben beschrieben, über Heparinase-Testplatten gelegt und bei 37ºC 1 Std. lang inkubiert. Die NC-Papiere werden verworfen und die Platten mit 2% Protaminsulfat entwickelt. Es erscheinen Aufhellungszonen auf der Platte, die Zellen entsprechen, die unter induzierenden Bedingungen (Heparin-supplementierte Platte) wuchsen, während auf der Platte, die den Zellen entsprach, die unter Sulfat-Repressionsbedingungen wuchsen, keine Zonen nachweisbar sind.
• Der Plattentest ist zum Nachweis von Heparinase-Aktivität ausreichend, und er erfordert nicht das Vorhandensein anderer katabolischer Heparinenzyme. Dieses Merkmal stellt eine Verbesserung zu den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren dar, und es kann deshalb zum Screenen von E. coli-Expressions-Genbanken auf das klonierte Heparinase-Gen nutzbringend eingesetzt werden. Weiterhin erhöht die Fähigkeit, unter reprimierten und induzierten Bedingungen gewachsene F. heparinum-Bakterien zu differenzieren, und zwar unter Verwendung von NC-Papier, die Einsetzbarkeit der vorliegenden Technik zum Identifizieren konstitutiver Mutanten.
• Der auf der metachromatischen Verschiebung von Azur A von blau zu rot in Gegenwart von Heparin basierende Heparinase-Test wurde zur Entwicklung eines Mikrokulturtests verwendet, um Heparinase produzierende Zellen zu identifizieren, insbesondere Zellen, die normalerweise Heparinase nicht produzieren, beispielsweise E. coli-Zellen, die genetisch verändert wurden. Vorherige Versuche zur Verwendung von Azur A in Mikrokulturtests wurden durch Background-Effekte gestört, wahrscheinlich aufgrund eines Medienbestandteils, wodurch Farbunterschiede in Proben mit oder ohne Heparin nicht nachweisbar waren. Natriumchlorid wurde als ein Bestandteil identifiziert, der für diesen Background-Effekt verantwortlich ist, wobei 0,02 g/l Heparin enthaltende B-Nährlösung und verschiedene NaCl-Mengen zu den Löchern von 96-Loch-Mikrokulturplatten zugegeben wurden, und anschließend ein geeiches Volumen an 0,04 g Azur A/l zu jedem Loch zugegeben und die Absorption bei 605 nm mit einem Titertek-Multiscan-Plattenlesegerät bestimmt wurde. Die Background-Effekte konnten dadurch ausreichend verringert werden, daß die NaCl-Konzentration unter 1 g/l gehalten wurde.
• Der Test ist wie folgt: Modifizierte B-Nährlösung, enthaltend Bacto-Trypton, 10 g/l; NaCl, 1,0 g/l; Heparin, 0,02 g/l; und supplementiert mit Methionin, Prolin, Histidin und Thiamin, wird filtersterilisiert und zu Mikrokultur-Löchern zugegeben (150 ul/Loch). Ganze Lochreihen werden entweder nicht beimpft, mit E. coli JM83 beimpft oder mit F. heparinum beimpft. Eine Reihe enthält modifizierte B-Nährlösung ohne Heparin. Die Platte wird bei 30ºC 36 Std. lang inkubiert und anschließend eingefroren und aufgetaut. Die aufgetaute Platte wird bei 37ºC 3 Std. lang vor Zugabe von 150 ul 0,04 mg Azur A/ml zu jedem Loch inkubiert, und die Absorption wird bei 605 nm bestimmt. Der Farbunterschied zwischen den unterschiedlichen Lochreihen: nicht beimpft, E. coli JM83-Kulturen und F. heparinum-Kulturen, ist durch einfache visuelle Kontrolle nachweisbar.
Screening einer Expressionsbibliothek auf Heparinase-Gene
• Eine Chromosomengenbank von F. heparinum wurde unter Verwendung des Plasmid-Expressionsvektors pUC18 in E. coli konstruiert. Chromosomale DNA aus F. heparinum wurde vor der Zugabe der BamH1-Linker leicht mit Ultraschall behandelt und in die dephosphorylierte BamH1-Stelle von pUC18 ligiert. Es wurden 50.000 unabhängige Transformanten mit einer mittleren chromosomalen DNA-Insertgröße von 6 kbp isoliert. Die Verwendung-von ultraschallbehandelter DNA bei dieser Konstruktion erhöht die Zufallshäufigkeit der erzeugten Fragmente im Vergleich zu solchen, die durch Verdau mit Restriktionsenzymen, die an spezifischen Stellen schneiden, erhalten wurden, die möglicherweise im Strukturgen lokalisiert sind. Diese pUC18-Genbank ist deshalb zur Verwendung für Screening-Techniken, die auf der Expression von aktivem Protein zum Nachweis beruhen, geeigneter. Beide oben beschriebenen Testtechniken werden verwendet, um Kandidaten aus dieser Genbank zu screenen.
• Die Schwierigkeiten, die damit verbunden sind, ausreichend reine Heparinase-Zubereitungen zu erhalten, könnten durch Expression des Heparinase-Gens in einem Organismus wie E. coli gelöst werden. E. coli würde eine Umgebung zur Biosynthese bereitstellen, die von kontaminierenden, in F. heparinum vorhandenen Background-Enzymen wie Sulfatasen, Glycuronidase usw. frei ist; hierdurch könnten die Reinigungsverfahren für Heparinase von katalytischer Reinheit, die zur Blut-Deheparinisierung erforderlich ist, stark vereinfacht werden. Weiterhin könnte man eine Zunahme in den Produkt-Titern in einem rekombinanten System im Vergleich zu F. heparinum-Fermentationen erwarten. Eine Verbesserung im Gesamtproduktionsverfahren ist zur ökonomischen Brauchbarkeit eines Herstellungsverfahrens im industriellen Maßstab notwendig. Eine vorläufige Analyse ergab, daß die ökonomische Rentabilitätsgrenze bei einer Produktionsmenge von 1 · 106 U reinem Enzym/l Fermentationsnährlösung liegt. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können 2 · 104 U reines Enzym/l aus F. heparinum-Fermentationen erhalten werden, wobei von einer 20%-Ausbeute ausgegangen wird.
• Die vorstehende Erfindung wurde anhand spezifischer Ausführungsbeispiele beschrieben. Veränderungen und Modifikationen dieser Verfahren liegen für den auf diesem Fachgebiet arbeitenden Fachmann aufgrund der vorangegangenen detaillierten Beschreibung der Erfindung auf der Hand. Derartige Modifikationen und Abänderungen werden vom Schutzbereich der nachfolgenden Patentansprüche mit umfaßt.

Claims (14)

1. Verfahren zur Reinigung von Heparinase aus Gram-negativen Bakterien durch:

Suspendieren der Gram-negativen Bakterien in einem osmotisch stabilisierten Medium, Aufbrechen der Hülle und Freisetzen von Nicht-Heparinase-Proteinen aus dem periplasmatischen Raum der aufgebrochenen Bakterien durch Einwirkenlassen eines auf einen pH-Wert zwischen 6,0 und 8,6 eingestellten Puffers einer Ionenstärke von 10 mM Phosphat auf die Bakterien; und

Freisetzen der Heparinase aus den aufgebrochenen Bakterien durch Einwirkenlassen einer auf einen pH-Wert zwischen 6,0 und 8,6 eingestellten, gepufferten Salzlösung einer Ionenstärke eines Gemisches von 10 mM Phosphat und 0,15 M Natriumchlorid auf die mit einer niedrigen Ionenstärke gewaschenen Bakterien.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das osmotisch stabilisierte Medium aus einer 20%igen Saccharoselösung besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die freisetzenden Lösungen Phosphat enthalten und auf einen pH-Wert zwischen 6,0 und 8,6 eingestellt sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die erste freisetzende Lösung aus 10 mM Phosphat besteht und auf einen pH- Wert zwischen 7,0 und 7,5 eingestellt ist und die zweite freisetzende Lösung aus einem 0,15 M Natriumchlorid enthaltenden Phosphatpuffer besteht und auf einen pH-Wert zwischen 7,0 und 7,5 eingestellt ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, des weiteren umfassend die Zugabe einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe Ethylendiamintetraessigsäure, Lysozym und Toluol sowie Chloroform, zu den freisetzenden Lösungen.

6. Verfahren nach Anspruch 1, des weiteren umfassend Eingefrieren und Auftauen der Bakterien in den freisetzenden Lösungen.

7. Verfahren nach Anspruch 1, des weiteren umfassend ein Fraktionieren der Heparinase durch Kationenaustauschchromatographie.

8. Verfahren nach Anspruch 7, des weiteren umfassend ein Fraktionieren der Heparinase durch Gelfiltration.

9. Verfahren nach Anspruch 7, des weiteren umfassend ein Fraktionieren der Heparinase durch Polyacrylamidgelelektrophorese.

10. Heparinase eines Molekulargewichts von 65 000 bis 75 000 aus Flavobacterium heparinum, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.

11. Heparinase eines Molekulargewichts von 65 000 bis 75 000 aus Flavobacterium heparinum.

12. Antikörper gegen Heparinase eines Molekulargewichts von 65 000 bis 75 000 aus Flavobacterium heparinum.

13. Genetisch konstruierte Nucleinsäuresequenz mit Codierung für die Heparinase eines Molekulargewichts von 65 000 bis 75 000 aus Flavobacterium heparinum.

14. Test zur Sichtung von die nach Anspruch 1 reinigbare Heparinase bildenden Bakterien durch Animpfen einer Heparin enthaltenden Agarplatte mit dem zu sichtenden Organismus, Inkubieren der Platte, Aufgießen einer Protaminsulfatlösung auf die Oberfläche der Platten und Bestimmen, ob sich ein weißer Niederschlag bildet.