DE68919245T2

DE68919245T2 - Verfahren zum Nachweis von Endotoxin.

Info

Publication number: DE68919245T2
Application number: DE68919245T
Authority: DE
Inventors: Shuji Matuura; Masakazu Tsuchiya
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1988-02-27
Filing date: 1989-02-22
Publication date: 1995-05-18
Anticipated expiration: 2009-02-23
Also published as: ATE114051T1; US5179006A; EP0330991B1; JPH01219562A; ES2065345T3; CA1339881C; JPH0715474B2; EP0330991A2; US5318893A; DE68919245D1; EP0330991A3

Description

AUSGANGSSITUATION DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen von Endotoxin unter Anwendung einer Reaktion eines Hämatozytlysats (Amöbozytlysat) von Königskrabben ((nachfolgend abgekürzt als. "AL")) mit Endotoxin, bei welchem Verfahren der in AL vorhandene Faktor, der mit β-1,3-Glucan unter Herbeiführen einer Koagulationsreaktion reagiert ((nachfolgend bezeichnet als "β-1,3-Glucan-sensitiver Faktor")), inaktiviert wird, und das Endotoxin allein spezifisch gemessen wird.
Endotoxine sind hauptsächlich in Zellwänden von Gramnegativen Bakterien vorkommende und als Pyrogene bekannte Lipopolysaccharide. Die Messung der Endotoxin-Konzentration in einer Probe ist daher eine der wichtigen Messungen auf den Gebieten der Medizin, Pharmazie und Mikrobiologie.
Gegenwärtig wird als ein Verfahren zur Endotoxin- Messung wegen seiner Einfachheit, Zweckmäßigkeit und geringen Kosten vielfach der sogenannte Limulustest eingesetzt, bei dem das Phänomen genutzt wird, daß eine AL- Lösung durch Endotoxin unter Bildung eines Gelkoagulates aktiviert wird.
Es wurde jedoch festgestellt, daß AL-Lösung nicht nur mit Endotoxinen reagiert, sondern auch mit carboxymethyliertem β-1,3-Glucan, um zu einer Koagulation zu gelangen (Kakinuma et al, Biochem. Biophys. Research Communication, 101(2), 434-439 (1981)). Es wurde nachgewiesen, daß dieses Phänomen hervorgerufen wird durch die Reaktion eines in AL-Lösung vorhandenen β-1,3-Glucansensitiven Faktors mit β-1,3-Glucan oder einem Derivat davon (Iwanaga, et al, Bacterial Endotoxin, veröffentlicht bei Verlag Chemie, 365-382, 1984).
Die meisten kommerziell verfügbaren Reagentien für den Limulustest reagieren daher nicht nur mit Endotoxinen sondern auch mit β-1,3-Glucan, so daß es mit dem Limulustest schwierig ist einzuschätzen, welches von dem Endotoxin, β- 1,3-Glucan bzw. eine Mischung von ihnen in einer Probe vorliegt. Die Spezifität derartiger Reagentien für den Limulustest ist daher ein Problem.
Zur Lösung dieses Problems wurde ein Verfahren zur Herstellung eines für Endotoxine spezifischen Reagens durch Entfernen des β-1,3-Glucan-sensitiven Faktors aus der AL- Lösung veröffentlicht. (JP-A-58-13 516 und 59-27 828, Kokai (Offenlegung)). Alle darin offenbarten Verfahren erfordern jedoch ein sehr aufwendiges Vorgehen bei der Behandlung der AL-Lösung, beispielsweise durch ein Verfahren der Gelfiltration oder ein chromatographisches Verfahren unter Verwendung eines Trägers mit darauf auf gebrachtem Heparin oder Dextransulfat, um die AL-Lösung zu einer Fraktion eines vorkoagulierenden Enzyms, einer Fraktion eines GL-sensitiven Faktors und einer Fraktion eines Faktors (nachfolgend abgekürzt als "Endotoxin-sensitiver Faktor") abzutrennen, der mit Endotoxin zur Auslösung der Koagulation reagiert, und den β-1,3-Glucan-sensitiven Faktor zu entfernen. Um daher zu verhindern, daß die AL-Lösung oder die daraus erhaltenen Fraktionen während der Trennverfahren durch Endotoxin verunreinigt werden, benötigt man beispielsweise Einrichtungen, die ausschließlich für die Ausführung dieser Verfahren verwendet werden. Darüber hinaus sind die vorgenannten Verfahren weiterhin insofern von Nachteil, daß die einzelnen Fraktionen wieder gründlich gemischt werden müssen, um ein für Endotoxin spezifisches Reagens zu erhalten.
Andererseits wird von Kakinuma et al. (Biochem. Biophys. Research Communication, 101(2), 434-439 (1981)) die folgende Tatsache beschrieben.
AL-Lösung reagiert nicht nur mit Endotoxin, sondern auch mit carboxymethyliertem β-1,3-Glucan, um eine Koagulationsreaktion einzugehen, wobei sie jedoch bei Zugabe von carboxymethyliertem β-1,3-Glucan in einer großen Menge (10 ug/ml oder mehr) keine Koagulationsreaktion hervorruft, und bei weiterer Zugabe einer großen Menge (10 ng/ml von Endotoxin zu der Lösung noch eine Koagulationsreaktion hervorgerufen wird. Die in der genannten Veröffentlichung zugesetzte Menge von Endotoxin (10 ng/ml) beträgt jedoch etwa das 200fache der zulässigen Konzentration von Endotoxin in destilliertem Wasser zur Injektion (beispielsweise dem Standardwert (der in einer Probe zulässigen Konzentration) von Endotoxin gemäß der XX. Ausgabe der US-Pharmacopeia (USP) mit 0,25 EU/ml). Da eine solche Menge weitaus größer als diejenige Menge ist, die normalerweise als Endotoxin unter Verwendung von AL-Lösung gemessen wird, war die Anwendung der vorgenannten Tatsache zum Messen von Endotoxin unvorstellbar.
Die WO-A-83/02 123 offenbart ein Verfahren zum Nachweisen von Endotoxinen und β-1,3-Glucanen durch Inkontaktbringen einer zu messenden Probe mit (A) einem Blutzellenlysat eines Krebstieres oder eine Insektes und (B) einem Erkennungsmittel in Form einer Peptidverbindung mit einer spezifischen terminalen Gruppe, die durch die enzymatische Wirkung eines von einem solchen Tier erhaltenen Blutzellenlysats und aktiviert durch die Endotoxine und β-1,3-Glucane abgespalten werden kann, um eine physikalisch oder chemisch nachweisbare Verbindung zu bilden. Für den Fachmann legt diese Offenbarung jedoch nahe, daß die Eigenschaften eines Blutzellenlysats von einem Krebstier oder Insekt von den Eigenschaften des Blutzellenlysats einer Königskrabbe verschieden sind.

ZUSAMMENFASSUNG

Die vorliegende Erfindung soll ein Verfahren zum Messen von Endotoxin gewähren, und zwar allein spezifisch und quantitativ mühelos und mit hohem Wirkungsgrad ohne jeden Einfluß des in AL vorhandenen β-1,3-Glucan-sensitiven Faktors.
Die vorliegende Erfindung gewährt ein Verfahren zum spezifischen Messen von Endotoxin, welches umfaßt:
Mischen einer Lösung von Königskrabben-Hämatozytlysat mit einer Probe in Gegenwart eines wasserlöslichen Polysaccharids, enthaltend die wasserlösliche β-1,3-glucosidische Bindung, und/oder eines wasserlöslichen Polysaccharidderivats, enthaltend die wasserlösliche β-1,3- glucosidische Bindung,
Inkubieren der resultierenden Mischung und
Bestimmen der Konzentration des Endotoxins, bei welchem Verfahren der in der genannten Lösung von Königskrabben-Hämatozytlysat vorhandene Faktor, der mit β- 1,3-Glucan unter Herbeiführen von Koagulation reagiert, inaktiviert wird, so daß das Endotoxin spezifisch allein gemessen wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHUNGEN

Es zeigen:
Fig. 1 Eichkurven für Endotoxin, das in Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurde;
Fig. 2 ein Eichkurve für Curdlan, das in Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurde;
Fig. 3 eine Eichkurve für Endotoxin, das in Beispiel 3 erhalten wurde;
Fig. 4 eine Eichkurve für Endotoxin, das in Beispiel 5 erhalten wurde;
Fig. 5 eine Eichkurve für Curdlan, das in Beispiel 5 erhalten wurde.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Im Verlauf einer Untersuchung zu einer Methode, mit der die leichte und wirksame Herstellung eines für Endotoxin spezifischen Reagens unter Verwendung einer AL-Lösung als ein Ausgangsmaterial möglich ist, haben die Anmelder folgende Tatsache festgestellt. Wenn eine große Menge eines wasserlöslichen Polysaccharids, enthaltend die β-1,3-glucosidische Bindung, (nachfolgend abgekürzt als "GLPS") und/oder eines wasserlöslichen Polysaccharidderivats, enthaltend die β-1,3-glucosidische Bindung, (nachfolgend abgekürzt als "GL-D") in einer Reaktionslösung zum Messen von Endotoxin unter Verwendung von AL-Lösung vorliegen, wird die Koagulationsreaktion der AL-Lösung durch β-1,3-Glucan inaktiviert, wobei Endotoxin jedoch eine Koagulationsreaktion herbeiführt. Da der β-1,3-Glucan-sensitive Faktor inaktiviert ist, tritt keine Koagulationsreaktion der AL- Lösung durch β-1,3-Glucan auf. Überraschenderweise kann Endotoxin in einer sehr geringen Menge von weniger als 0,01 EU/ml (0,002 ng/ml) spezifisch mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden, da schließlich der Endotoxin-sensitive Faktor und das vorkoagulierende Enzym von der Gegenwart des GLPS und/oder GL-D nicht beeinflußt werden. Auf der Grundlage des vorgenannten Ergebnisses wurde die vorliegende Erfindung ausgeführt.
Als die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren GLPS und GL-D kann ohne besondere Beschränkung jedes Polysacharid verwendet werden, solange es die β-1,3-glucosidische Bindung enthält und in Wasser löslich ist. Bevorzugte Beispiele für GLPS umfassen natürliche Polysaccharide, die aus Zellwänden erhalten werden, beispielsweise von verschiedenem Bakterien (z. B. die Gattung Alcaligenes und die Gattung Agrobacterium), Hefen (z. B. die Gattung Saccharomyces) und Pilze (z. B. ein Shiitake (Cortinellus Shiitake), Schizophyrum communis und Coriolus verisicolor), spezielle Beispiele für die natürlichen Polysaccharide umfassen Curdlan, Pachyman, Sclerotan, Lentinan, Schizophyllan und Coriolan, Speicher- Polysaccharide von Algen, z. B. Braunalgen, Euglena und Diatomeen, wobei spezielle Beispiele der Speicher-Polysaccharide Laminaran und Paramilon umfassen; und bevorzugte Beispiele von GL-D ein Polysaccharidderivat umfassen, welches dadurch erhalten wird, daß man mindestens eine Gruppe, ausgewählt aus einer Carboxymethyl-Gruppe, einer Carboxyethyl-Gruppe, einer Methyl-Gruppe, einer Hydroxyethyl-Gruppe, einer Hydroxypropyl-Gruppe und einer Sulfopropyl-Gruppe in die natürlichen oder Speicher-Polysacharide entsprechend einem konventionellen Verfahren einführt, beispielsweise nach einem der Verfahren, die z. B. beschrieben wurden in Munio Kotake "Daiyukikagaku" Bd. 19, 17. Ausg., Asakura Shoten, 10. Mai 1967, S. 70 . . . 101; A.E. Clarke et al, Phytochemistry, 1, 175 . . . 188 (1967); und T. Sasaki et al Europ. J. Cancer, 15, 211 . . . 215 (1967). Diese natürlichen Polysaccharide, Speicher-Polysaccharide und deren Derivate können einzeln oder in Verbindung von 2 oder mehreren von ihnen verwendet werden.
Als die in der vorliegenden Erfindung verwendbare AL- Lösung kann ohne besondere Einschränkung jede exemplifiziert werden. Vorzugsweise wird sie von Hämatozyten von Königskrabben extrahiert, die zur Gattung Limulus, Tachypheus oder der Gattung Carcinoscorpius gehören und unter Koagulation mit Endotoxin reagieren. Selbstverständlich ist die Verwendung von AL-Lösung möglich, die aus gefriergetrockneten Produkten von AL-Lösungen hergestellt wird, welche beispielsweise kommerziell bei der Associates of Cape Cod Inc. (ACC) verfügbar sind.
Als eine Methode, mit der es möglich ist, daß GLPS und/oder GL-D in einer Reaktionslösung von AL und Endotoxin existieren können, werden beispielsweise eine Methode exemplifiziert, umfassend das Auflösen des GLPS und/oder GL-D davon in Wasser, eine Pufferlösung oder eine verdünnte Alkalilösung, und Auflösen eines gefriergetrockneten Produkts von AL in der resultierenden Lösung; sowie eine Methode, umfassend den Zusatz einer Lösung des GLPS oder GL- D, die durch eine solche Methode dargestellt werden, wie sie beispielsweise vorstehend beschrieben wurde, zu einer AL- Lösung, dargestellt durch Auflösen eines gefriergetrockneten Produkts von AL in destilliertem Wasser zur Injektion oder einer Pufferlösung; eine Methode, umfassend das Zusetzen des GLPS oder GL-D zu einer Probe; sowie eine Methode, umfassend das Auflösen eines Reagens, erhalten durch Gefriertrocknen einer AL-Lösung, enthaltend eine erforderliche Menge des GLPS oder GL-D, zuvor zugesetzt, in destilliertem Wasser zur Injektion oder eine Pufferlösung. Die Methode, mit der es möglich ist, daß die GLPS und/oder GL-D in einer Reaktionslösung von AL und Endotoxin existieren, ist nicht auf diese Methoden beschränkt, und es kann jede Methode eingesetzt werden, solange das GLPS und/oder GL-D am Ende in der Reaktionslösung zum Umsetzen von AL mit Endotoxin in einer solchen Menge vorhanden sind, daß das GLPS und/oder GL-D den β-1,3-Glucan-sensitiven Faktor in AL-Lösung hemmt, nicht jedoch die Reaktion von Endotoxin mit dem Endotoxinsensitiven Faktor und die Koagulationsreaktion der AL-Lösung hemmt, die durch eine solche Reaktion herbeigeführt wird.
Obgleich die Konzentration von GLPS und/oder GL-D in der Reaktionslösung in Abhängigkeit von beispielsweise der Produktionsmenge und Nachweisempfindlichkeit (EU/ml) für Endotoxin der AL-Lösung als gefriergetrocknetes Produkt oder als AL-Lösung ein wenig variierte, beträgt sie normalerweise 100 ng/ml bis 100 mg/ml, vorzugsweise 10 ug/ml bis 10 mg/ml, in der Reaktionslösung. AL-Lösungen zum Messen von Endotoxin, die aus den vorgenannten kommerziell verfügbaren gefriergetrockneten Produkten von AL hergestellt wurden, haben eine Nachweisempfindlichkeit für Endotoxin von 0,03 bis 5 EU/ml und unterliegen der Koagulationsreaktion, wenn ein Polysaccharid mit β-1,3-glucosidischer Bindung und/oder ein Derivat davon in einer Menge von 0,1 bis 1000 ng/ml zugesetzt wird. Die Konzentration von GLPS und/oder GL-D, die zu einer solchen AL-Lösung für die Aufgabe der vorliegenden Erfindung zugesetzt wird, beträgt vorzugsweise das 1000fache oder mehr einer Konzentration eines Polysaccharids mit β-1,3-glucosidischer Bindung und/oder einem Derivat davon, bei der das Polysaccharid und/oder ein Derivat davon eine Koagulationsreaktion der AL-Lösungen herbeiführen.
In der Methode zum Messen von Endotoxin der vorliegenden Erfindung kann Endotoxin nach einer konventionellen Methode zum Messen von Endotoxin unter Verwendung von AL- Lösung mit der Ausnahme der Anwesenheit einer vorbestimmten Menge von GLPS und/oder GL-D in einer Reaktionslösung zum Reagieren von AL mit Endotoxin gemessen werden. Andere, in der erfindungsgemäßen Methode verwendete Reagentien können in geeigneter Weise entsprechend den in einer konventionellen Methode zum Messen von Endotoxin verwendeten Reagentien gewählt werden. Mehr ins Detail gehend, kann Endotoxin folgendermaßen gemessen werden:
(i) Gel-Koagulationsmethode:
Diese Methode umfaßt das Mischen von AL-Lösung mit einer Probe in Gegenwart von GLPS und/oder GL-D, Inkubieren der resultierenden Mischung bei einer Temperatur von 0ºC . . . 40ºC, bevorzugt 25ºC . . . 40ºC, für eine vorbestimmte Zeit und Bewerten mit bloßem Auge, ob durch die Koagulation ein Gel erzeugt wurde oder nicht.
(II) Turbidimetrische Endpunktmethode:
Diese Methode umfaßt das Mischen von AL-Lösung mit einer Probe in Gegenwart von GLPS und/oder GL-D, Inkubieren der resultierenden Mischung bei einer Temperatur von 0ºC bis 40ºC, bevorzugt 25ºC bis 40ºC, für eine vorbestimmte Zeit und Messen einer Trübung infolge von Koagulation unter Verwendung eines Koagulometers, eines Nephelometers oder eines Spektrophotometers.
(iii) Methode der kinetischen Turbidimetrie:
Diese Methode umfaßt das Mischen von AL-Lösung mit einer Probe in Gegenwart von GLPS und/oder GL-D, Inkubieren der resultierenden Mischung bei einer Temperatur von 0ºC . . . 40ºC, bevorzugt 25ºC . . . 40ºC, für eine vorbestimmte Zeit und Messen einer für eine Trübungsänderung infolge der Koagulation erforderlichen Zeit, um einen bestimmten Wert oder ein Verhältnis der Trübungsänderung unter Verwendung eines Koagulometers, eines Nephelometers oder eines Spektrophotometers zu erreichen.
(iv) Farberzeugende Methode:
Diese Methode umfaßt das Mischen von AL-Lösung mit einer Probe in Gegenwart von GLPS und/oder GL-D und einem synthetischen Substrat, wie beispielsweise Boc-Val-Leu-Gly- Arg-p-Nitroanilin, Boc-Val-Leu-Gly-Arg-[(4-N-Ethyl-N-2- hydroxyethyl)aminoanilin], der Protease, welche durch die Reaktion einer Komponente der AL-Lösung mit Endotoxin aktiviert wird, Inkubieren der resultierenden Mischung bei einer Temperatur von 0ºC . . . 40ºC, bevorzugt 25ºC . . . 40ºC, für eine vorbestimmte Zeit, sodann im Bedarfsfall Zusetzen eines Abstoppmittels für die Proteasereaktion und Messen einer vom synthetischen Substrat durch Proteaseaktivität freigesetzten Substanz auf beispielsweise kolorimetrischem Wege. Der Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung ist auf diese Methoden nicht beschränkt. Die vorliegende Erfindung ist auf jede Meßmethode anwendbar, bei der eine Reaktion von AL mit Endotoxin eingesetzt wird.
In dem Meßverfahren kann als pH-Wert zum Zeitpunkt der Messung jeder pH-Wert eingesetzt werden, solange er die Faktoren nicht inaktiviert, die mit Endotoxin in AL-Lösung unter Herbeiführung einer Koagulationsreaktion reagieren, obgleich im allgemeinen ein pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 bevorzugt eingesetzt wird. Als die Temperatur zum Zeitpunkt der Messung kann jede Temperatur angewendet werden, solange sie nicht die Faktoren inaktiviert, die mit Endotoxin in AL- Lösung unter Herbeiführung einer Koagulationsreaktion reagieren, obgleich im allgemeinen eine Temperatur von 0ºC . . . 40ºC, bevorzugt 25ºC . . . 40ºC, eingesetzt wird.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele konkret veranschaulicht, worin alle Prozentangaben, sofern nicht anders angegeben, auf Masse bezogen sind.

Referenzbeispiel 1

Herstellung von carboxymethyliertem Curdlan

Zu 60 g Curdlan (verfügbar bei der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurden 540 ml Toluol und 60 ml Ethanol zugegeben, gefolgt von einem tropfenweisen Zusatz von 61 g einer 50%igen wäßrigen Natriumhydroxidlösung. Die resultierende Mischung wurde bei 50ºC erhitzt und für 1 Stunde gerührt. Zu der Mischung wurde eine Lösung von 35 g Monochloressigsäure in 100 ml eines gemischten Lösemittels aus Toluol und Ethanol im Verhältnis von 9 : 1 zugesetzt und die resultierende Mischung bei 50ºC für eine weitere Stunde gerührt. Dieses Reaktionsgemisch wurde zwei Wiederholungen der vorgenannten Prozedur des Zusetzens von wäßriger Natriumhydroxidlösung und Monochloressigsäurelösung unterzogen und danach gekühlt und über Nacht stehend gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde sodann in 1 Liter 90%igem Methanol gegossen und der gebildete Niederschlag durch Filtration aufgenommen und getrocknet, um 142 g Rohkristalle zu erhalten. Die erhaltenen Rohkristalle wurden in 1420 ml destilliertem Wasser aufgelöst und der pH-Wert der resultierenden Lösung mit verdünnter Salzsäure auf 8 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden tropfenweise 12,78 l Methanol und Rühren zugesetzt und der gebildete Niederschlag durch Filtration aufgenommen, mit 500 ml 90%igem Methanol gewaschen und sodann getrocknet, um die gewünschte Verbindung des carboxymethylierten Curdlans (nachfolgend abgekürzt als "CMCU") zu erhalten.

Beispiel 1

[Proben]

Die folgenden Curdlan-Lösungen und Endotoxin-Lösungen wurden als Proben verwendet.

Curdlan-Lösungen

Es wurden Lösungen verwendet, die durch Auflösen von Curdlan mit einer nichtnachweisbaren Menge von Endotoxin (verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in einer 50 mMol Endotoxin-freien wäßrigen Natriumhydroxidlösung zu einer Konzentration von 5 mg/ml und geeignetem Verdünnen der resultierenden Lösung mit destilliertem Wasser zur Injektion hergestellt wurden.

Endotoxin- Lösungen

Es wurden Lösungen verwendet, die durch Auflösen von Escherichia coli als Endotoxin-Vergleichsstandard (ein vom Stamm E. coli UKT-B abgeleitetes Lipopolysaccharid, verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd., jede Ampulle enthält das Lipopolysaccharid in einer Menge entsprechend 500 ng des FDA-Vergleichsstandard-Endotoxins EC-2, zur Auflösung in 5 ml) in 5 ml destilliertem Wasser zur Injektion und geeignetem Verdünnen der resultierenden Lösung mit destilliertem Wasser zur Injektion hergestellt wurden.

[Herstellung von CMCU-LAL-Lösung]

Ein gefriergetrocknetes Produkt einer AL-Lösung von zur Gattung Limulus gehörenden Königskrabben (nachfolgend wird das gefriergetrocknete Produkt abgekürzt als "LAL"; verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Koagulationsempfindlichkeit 0,5 EU/ml; zur Auflösung in 5 ml) wurde aufgelöst in 5 ml einer Lösung, hergestellt durch Auflösen des in Referenzbeispiel 1 erhaltenen CMCU in destilliertem Wasser zur Injektion auf eine Konzentration von 0,2 mg/ml, wodurch eine CMCU-LAL-Lösung erhalten wurde.

[Meßverfahren]

Es wurden zu 0,1 ml der cMCU-LAL-Lösung 0,1 ml jeder Probe zugesetzt und nach ausreichendem Mischen eine zum Herabsetzen der Durchlässigkeit auf 5% (nachfolgend abgekürzt als "Tg") erforderliche Zeit bei 37ºC mit Hilfe eines Toxinometers ET-201 (hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) gemessen.

[Ergebnisse]

Eine in Fig. 1 mit -O- gezeigte Eichkurve wurde durch Auftragen des Tg-Werts auf der Ordinate entsprechend den einzelnen Endotoxin-Konzentrationen (EU/ml) auf der Abszisse erhalten. Bei Verwendung von Curdlanlösungen als Proben wurde die Durchlässigkeit der Probe innerhalb von 80 Minuten für keine der Curdlan-Konzentrationen auf 5% herabgesetzt (Daten sind nicht gezeigt).

Vergleichsbeispiel 1

Es wurde die Messung an den gleichen Proben durchgeführt wie in Beispiel 1, und zwar mit exakt dem gleichen Meßverfahren wie in Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß anstelle der in Beispiel 1 verwendeten cMcU-LAL-Lösung eine durch Auflösen von LAL der gleichen Charge wie in Beispiel 1 in 5 ml destilliertem Wasser zur Injektion (nachfolgend abgekürzt als "unbehandelte LAL-Lösung") hergestellte LAL- Lösung verwendet wurde.

[Ergebnisse]

Eine in Fig. 1 mit - - gezeigte Eichkurve wurde durch Auftragen des Tg-Werts auf der Ordinate in Abhängigkeit von den einzelnen Endotoxin-Konzentrationen auf der Abszisse erhalten. Eine in Fig. 2 mit - - gezeigte Eichkurve wurde durch Auftragen des Tg-Werts auf der Ordinate in Abhängigkeit von den einzelnen Curdlan-Konzentrationen (ng/ml) auf der Abszisse erhalten.
Wie aus Fig. 1 ersichtlich, konnte, wenn die Endotoxin- Lösungen als Proben verwendet wurden, eine Eichkurve mit einer guten Linearität durch Verwendung entweder der CMCU- LAL-Lösung oder der unbehandelten LAL-Lösung als Reagens zum Messen von Endotoxin erhalten werden.
Wie jedoch aus Fig. 2 ersichtlich, reagiert unbehandelte LAL-Lösung auch mit den Curdlan-Lösungen, um eine Eichkurve mit einer guten Linearität zu ergeben.
Wie aus den vorstehenden Ergebnissen ersichtlich, kann ein auf Endotoxin spezifisches Reagens durch Zusetzen von CMCU zu AL-Lösung erhalten werden kann.

Beispiel 2

In Tabelle 1 werden die Ergebnisse der mit dem gleichen Meßverfahren wie in Beispiel 1 ausgeführten Messung dargestellt, wobei die in Beispiel 1 (Probe 1) hergestellte Probe mit 1,5 EU/ml Endotoxin und eine Mischung gleicher Mengen der Probe mit 20 ng/ml Curdlan und der Probe mit 3,0 EU/ml Endotoxin verwendet wurden, welche in Beispiel 1 (Probe 2) hergestellt wurde.

Vergleichsbeispiel 2

In Tabelle 1 werden ebenfalls die Ergebnisse der für die gleichen Proben wie in Beispiel 2 und mit exakt dem gleichen Meßverfahren wie in Beispiel 2 ausgeführten Messung mit der Ausnahme gezeigt, daß anstelle der im Beispiel 2 verwendeten CMCU-LAL-Lösung die gleiche unbehandelte LAL- Lösung wie in Vergleichsbeispiel 1 verwendet wurde. Tabelle 1 Probe Beispiel 2 Vergleichsbeispiel 2 Probe
Wie aus den in Tabelle 1 gezeigten Ergebnissen ersichtlich, kann entnommen werden, daß bei Verwendung der CMCU- LAL-Lösung als Reagens zum Messen von Endotoxin ein Tg-Wert für die sowohl Endotoxin als auch Curdlan enthaltende Probe erhalten wird, der im wesentlichen gleich dem für die Endotoxin-Lösung erhaltenen ist, wodurch nachgewiesen wird, daß die cMCU-LAL-Lösung nicht mit Curdlan reagiert. Ebenfalls ist zu entnehmen, daß bei Durchführung der Messung unter Verwendung der unbehandelten LAL-Lösung als ein Reagens zum Messen für Endotoxin der Tg-Wert durch Zusatz von Curdlan zur Endotoxin-Lösung stark herabgesetzt wird, was darauf hinweist, daß die unbehandelte LAL-Lösung sowohl mit Endotoxin als auch mit Curdlan reagiert.

Beispiel 3

[Proben]

Curdlan- Lösungen

Es wurden Lösungen verwendet, die durch Auflösen von Curdlan mit einer nichtnachweisbaren Menge von Endotoxin (verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in einer 50 mMol wäßrigen Natriumhydroxidlösung (Endotoxin-frei, jedoch 0,2 mg/ml cMCU enthaltend) zu einer Konzentration von 5 mg/ml und geeignetem Verdünnen der resultierenden Lösung mit destilliertem Wasser zur Injektion, 0,2 mg/ml CMCU enthaltend, hergestellt wurden.

Endotoxin- Lösungen

Es wurden Lösungen verwendet, die durch Auflösen von Escherichia coli als Endotoxin-Vergleichsstandard (ein vom Stamm E. coli UKT-B abgeleitetes Lipopolysaccharid, verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd., jede Ampulle enthält das Lipopolysaccharid in einer Menge entsprechend 500 ng des FDA-Vergleichsstandard-Endotoxins EC-2, zur Auflösung in 5 ml) in 5 ml destilliertem Wasser zur Injektion, 0,2 mg/ml CMCU enthaltend, und geeignetem Verdünnen der resultierenden Lösung mit destilliertem Wasser zur Injektion, 0,2 mg/ml CMCU enthaltend, hergestellt wurden.

[Meßverfahren]

Es wurden zu 0,1 ml der gleichen unbehandelten LAL- Lösung, wie sie in Vergleichsbeispiel 1 verwendet wurde, 0,1 ml jeder Probe zugesetzt und nach ausreichendem Mischen die Tg bei 37ºC mit Hilfe eines Toxinometers ET-201 gemessen.

[Ergebnisse]

Eine in Fig. 1 gezeigte Eichkurve wurde durch Auftragen des Tg-Werts auf der Ordinate entsprechend den einzelnen Endotoxin-Konzentrationen (EU/ml) auf der Abszisse erhalten.
Bei Verwendung von Curdlan-Lösungen als Proben wurde die Durchlässigkeit der Probe innerhalb von 80 Minuten für keine der Curdlan-Konzentrationen auf 5% herabgesetzt (Daten sind nicht gezeigt).
Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich, reagiert unbehandelte LAL-Lösung nicht mit Curdlan, wohl aber nur mit Endotoxin spezifisch, wenn zuvor CMCU in die Proben einbezogen wurde.

Beispiel 4

In Tabelle 2 werden die Ergebnisse der mit dem gleichen Meßverfahren wie in Beispiel 3 ausgeführten Messung dargestellt, wobei die in Beispiel 3, 0,2 mg/ml CMCU enthaltend (Probe 1), hergestellte Probe mit 1,5 EU/ml Endotoxin und eine Mischung gleicher Mengen der Probe mit 20 ng/ml Curdlan (0,2 mg/ml cMCU enthaltend) und der Probe mit 3,0 EU/ml Endotoxin (0,2 mg/ml cMCU enthaltend) verwendet wurden, welche in Beispiel 3 (Probe 2) hergestellt wurde.

Vergleichsbeispiel 3

Unter Verwendung der gleichen unbehandelten LAL-lösung, wie sie in Vergleichsbeispiel 1 verwendet wurde, wurde die Messung nach der gleichen Methode ausgeführt wie in Beispiel 4, indem anstelle der in Beispiel 4 verwendeten Proben die gleichen Proben wie in Beispiel 2 verwendet wurden, d. h. die Probe, die 1,5 EU/ml Endotoxin (kein CMCU enthaltend) (Probe 3) enthielt und die Mischung von gleichen Mengen der Probe, die 230 ng/ml Curdlan (kein CMCU enthaltend) enthielt, und die Probe, die 3,0 EU/ml Endotoxin (kein CMCU enthaltend) (Probe 4) enthielt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Probe Beispiel 2 Vergleichsbeispiel 2 Probe
Wie aus, den in Tabelle 2 gezeigten Ergebnissen ersichtlich, kann entnommen werden, daß beim Messen der CMCU enthaltenden Probe ein Tg-Wert erhalten wird, der im wesentlichen gleich dem für die Endotoxin-Lösung erhaltenen ist, und zwar selbst in dem Fall, in dem die Probe zusätzlich zum Endotoxin Curdlan enthält, was darauf hinweist, daß die Einbeziehung von CMCU in die Probe die unbehandelte LAL-Lösung am Reagieren mit Curdlan hindert. Wenn die Messung im Gegensatz dazu unter Verwendung der Probe durchgeführt wird, die kein CMCU enthält, wird die Tg durch Zusatz von Curdlan zur Endotoxin-Lösung stark herabgesetzt, was darauf hinweist, daß die unbehandelte LAL- Lösung auch mit Curdlan reagiert.

Beispiel 5

[Proben]

Das gleiche wie in Beispiel 1.

[CMCU- LAL-Lösung]

Das gleiche wie in Beispiel 1.

[Reagens zum Messen]

Es wurde ein Reagens zum Messen durch Zusatz von 1 ml von 0,45 Mol N,N-Bis(2-hydroxy-ethyl)-2-aminoethansulfonsäure-Puffer (pH 7,5) und 1 ml einer Substratlösung (enthaltend 1,02 mMol Boc-Val-Leu-Gly-Arg-[(4-N-Ethyl-N-2- hydroxyethyl)aminoanilin], hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2,25 mMol Diethylanilin und 0,12 Mol Magnesiumchlorid] zu 1 ml der CMCU-LAL-Lösung hergestellt.

[Meßverfahren]

Zu 0,2 ml des Reagens zum Messen wurden 0,1 ml von jeder Probe zugesetzt und nachfolgend ausreichend gemischt. Die Mischung wurde bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Reaktion durch Zusatz von 1 ml einer Lösung eines Abstoppmittels für die Reaktion, das 0,17% Natriummetaperiodat und 0,25% Natriumlaurylsulfat (SDS) enthielt, abgestoppt und sodann die Extinktion der Reaktionslösung bei 730 nm gemessen.

[Ergebnisse)

Eine in Fig. 4 gezeigte Eichkurve wurde durch Auftragen der Extinktion auf der Ordinate in Abhängigkeit von den einzelnen Endotoxin-Konzentrationen auf der Abszisse erhalten. Eine in Fig. 5 gezeigte Eichkurve wurde durch Auftragen der Extinktion auf der Ordinate in Abhängigkeit von den einzelnen Curdlan-Konzentrationen auf der Abszisse erhalten.
Wie aus Fig. 4 und 5 ersichtlich, reagierte die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene CMCU-LAL-Lösung mit Endotoxin und zeigte eine Eichrelation mit einer guten Linearität, wobei sie jedoch bei keiner Konzentration mit Curdlan reagierte.
Bei Durchführung der Messung unter Verwendung einer Mischung gleicher Mengen der Probe mit 20 ng/ml Curdlan und der Probe mit 1,0 EU/ml Endotoxin betrug die Extinktion der Reaktionslösung bei 730 nm 0,490, welche die gleiche wie diejenige war, die für die Probe mit 0,5 EU/ml Endotoxin allein gemessen wurde.
Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich, kann entnommen werden, daß die cMCU-LAL-Lösung nicht mit Curdlan reagiert, jedoch lediglich von Endotoxin aktiviert wird.
Wie vorstehend beschrieben, gewährt die vorliegende Erfindung ein Verfahren, zum Messen von Endotoxin unter Verwendung von AL-Lösung, wodurch es möglich ist, spezifisch Endotoxin allein leicht und wirksam zu messen, indem der in AL-Lösung enthaltende β-1,3-Glucan-sensitive Faktor gehemmt wird, und zwar ohne irgendein spezielles Verfahren, wie beispielsweise Fraktionierung und Rekombination von Komponenten in der AL-Lösung. Damit stellt die vorliegende Erfindung einen wesentlichen Beitrag zum Stand der Technik dar.

Claims

1. Verfahren zum spezifischen Messen von Endotoxin, welches umfaßt:

Mischen einer Lösung von Königskrabben-Hämatozytlysat mit einer Probe in Gegenwart eines wasserlöslichen Polysaccharids, enthaltend die wasserlösliche β-1,3-glucosidische Bindung, und/oder eines wasserlöslichen Polysaccharidderivats, enthaltend die wasserlösliche β-1,3- glucosidische Bindung,

Inkubieren der resultierenden Mischung und

Bestimmen der Konzentration des Endotoxins,

bei welchem Verfahren der in der genannten Lösung von Königskrabben-Hämatozytlysat vorhandene Faktor, der mit β- 1,3-Glucan unter Herbeiführen von Koagulation reagiert, inaktiviert wird, so daß das Endotoxin spezifisch allein gemessen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das wasserlöslich Polysaccharid, enthaltend die β-1,3-glucosidische Bindung, und/oder das wasserlösliche Polysaccharidderivat, enthaltend die β-1,3-glucosidische Bindung, in der Reaktionslösung in einer Menge von 100 ng/ml bis 100 mg/ml vorliegt.

3. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei welchem das wasserlösliche Polysaccharid, enthaltend die β- 1,3-glucosidische Bindung, mindestens ein Vertreter ist, ausgewählt aus Curdlan, Pachyman, Sclerotan, Lentinan, Schizophyllan, Coriolan, Laminaran, Liminarin und Paramilon.

4. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei welchem das wasserlösliche Polysaccharidderivat, enthaltend die β-1,3-glucosidische Bindung, erhalten wird durch Einführen von mindestens einer Gruppe, ausgewählt aus einer Carboxymethyl-Gruppe, einer Carboxyethyl-Gruppe, einer Methyl-Gruppe, einer Hydroxyethyl-Gruppe, einer Hydroxypropyl-Gruppe und einer Sulfopropyl-Gruppe, in Curdlan, Pachyman, Sclerotan, Lentinan, Schizophyllan, Coriolan, Laminaran, Laminarin oder Paramilon.

5. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei welchem die Bestimmung der Konzentration von Endotoxin in der Probe durch Bewertung eines erzeugten Gels durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welchem die Bestimmung der Konzentration von Endotoxin in der Probe durch Messen einer Trübung infolge Koagulation durchgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welchem die Bestimmung der Konzentration von Endotoxin in der Probe durchgeführt wird, indem eine Zeit gemessen wird, die zum Erreichen eines vorbestimmten Wertes einer Trübungsänderung infolge Koagulation oder eines Verhältnisses der Trübungsänderung benötigt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welchem das Mischen gemeinsam mit einem synthetischen Substrat von Protease erfolgt, wobei die Bestimmung der Konzentration von Endotoxin in der Probe durch Messen einer von dem synthetischen Substrat durch Proteaseaktivität freigesetzten Substanz durchgeführt wird.