DE68916197T2

DE68916197T2 - Zusammensetzung zur in-vivo bzw. in-vitro steigerung des melaningehaltes der melanocyten und deren in-vitro verwendung.

Info

Publication number: DE68916197T2
Application number: DE68916197T
Authority: DE
Inventors: Barbara Gilchrest; Philip Gordon
Original assignee: Boston University
Current assignee: Boston University
Priority date: 1988-03-30
Filing date: 1989-03-27
Publication date: 1994-09-29
Anticipated expiration: 2009-03-28
Also published as: JPH0785714B2; EP0373195B1; JPH02501443A; DE68916197D1; WO1989009258A1; EP0373195A4; EP0373195A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Zellen der Haut menschlicher Lebewesen und der Tiere und die zellulären Reaktionen in der Haut. Sie ist besonders gerichtet auf neue Zusammensetzungen zur Erhöhung des Melanengehalts der Haut in Lebewesen in-vivo und in-vitro und auf ein Verfahren ihrer Verwendung in-vitro.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Melanine sind eine Klasse strukturell verwandter Verbindungen, die als die hauptsächlichen Pigmente der Haut und des Haares der Säuger dienen. Die Melaninpigmentierung ist in hohem Maße verantwortlich für die normale Hautfarbe und Haarfarbe und liefert Schutz gegen Schaden durch UV-Licht aus dem Sonnenlicht. In der Haut werden Melanine ausschließlich durch "Melanozyten" genannte, spezialisierte Zellen synthetisiert, die in der Haut und den Haarfollikeln zu finden sind. Wenn es synthetisiert ist, wird Melanin über die zellulären Dendrite der Melanozyten zu den umgebenden Keratinozyten transportiert, die den häufigsten Zellentyp in der Epidermis darstellen. Diese anatomische Beziehung, oft als die epidermiale Melanineinheit bezeichnet, stellt man sich im allgemeinen in-vivo so vor, daß ein Melanozyt in den basalen und suprabasalen Schichten der Epidermis mit schätzungsweise 36 Keratinozyten in Kontakt ist. Die Geschwindigkeiten der Melaninpigmentsynthese und die anschließende Melaninübertragung durch Melanozyten werden anscheinend durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht und durch bestimmte entzündliche Prozesse beeinflußt. Die sich daraus ergebenden Folgen können eine Reihe unterschiedlicher Formen annehmen, von denen einige als normal und einige als pathologisch angesehen werden.
Eine dunklere Hautpigmentierung wird von vielen Personen sozial und ästhetisch als erwünscht angesehen. Ferner wurde ein hoher Melaningehalt in der menschlichen Haut als medizinischer Wert erkannt. Ungleicherweise ist der einzige, gegenwärtig bekannte Methode der Hautdunkelung die Hautbräunung unter natürlichem Sonnenlicht oder speziell konstruierten UV-Licht quellen (Bräunungslampen). Die Bestrahlung menschlicher Haut hat bekanntlich langfristige und kurzfristige Gesundheitskonsequenzen, insbesondere Hautkrebs und Lichtalterung (langfristig) und die Gefahr von schmerzhaftem Sonnenbrand und Keratitis (kurzfristig). Hellhäutige Individuen sind für durch Sonne induzierte Hautkrebse in hohem Maße empfänglich, unterliegen einem hohen Melanom- und Carcinomrisiko und setzen sich der Photoalterung oder Dermatoheliose aus, einem Zustand, der durch Faltenbildung, unregelmässige Pigmentierung und Oberflächenrauhigkeit charakterisiert ist. Selbst Individuen mit dunklerer Haut, die sich lange dem Sonnenlicht aussetzen, unterliegen jedoch einem hohen Risiko für Hautkrebs und unerwünschte Alterungsveränderungen.
Andere Individuen können selbst eine normale Pigmentierung nicht erreichen, weil die an Vitiligo, Piebaldismus, Albinismus oder anderen Unterpigmentierungsstörungen leiden. Das Ergebnis dieser abnormalen Zustände ist im Extremfall die vollständige Depigmentierung von Haar und Haut. In weniger schweren Fällen führen einige Unterpigmentierungsstörungen zu unregelmäßigen weißen Flächenbereichen in der Haut und im Haar. Alle diese Zustände verursachen ernste kosmetische Probleme und psychische Belastungen.
Melanozyten sind auch verantwortlich für die Pigmentierung von Haaren und Federn. Das Grauwerden des Haares beruht auf einer Abnahme in Anzahl oder Aktivität der in der Haarwurzel befindlichen Melanozyten. In den nicht-menschlichen Fällen führen Veränderungen im Melanozytengehalt und in der Melaninsynthesegeschwindigkeit zu Änderungen in der Farbe der Körperbedeckung, des Pelzes, der Wolle und anderer Arten des Tierkleids. Das Vermögen, die Melaninproduktion aufrechtzuerhalten, würde daher die Entfärbung von Pelz, Wolle oder Federn und anderem tierischem Haarersatz verhindern. Die Steuerung der Pigmentsynthese in Tieren würde auch die Produktion biologisch beeinflußter Pelze, Wolle und Federn erlauben.
Mit der Entwicklung von Gewebekulturverfahren in den letzten Jahren wurden verschiedene Forschungsanstrengungen und Untersuchungen unter Benutzung von Gewebekulturverfahren in-vitro unternommen. Es gibt jetzt viele Berichte und Publikationen in der wissenschaftlichen und technologischen Literatur, die auf die morphologische und biochemische Prüfung der Zellen in der Haut und den Mechanismus ihrer Wechselwirkungen gerichtet sind, da diese zu dem Wachstum von Melanozyten und der Bildung von Melanin in Beziehung stehen. Diese Veröffentlichungen und Berichte können in vier große Kategorien von Untersuchungen und Informationen eingeteilt werden: Zuerst Kulturmedien und Zellkulturverfahren in-vitro fuhr das Wachstum und die Unterhaltung von Keratinozyten und Melanozyten. Diese Kategorie wird repräsentiert durch die folgenden Veröffentlichungen: Gilchrest und Friedmann, Structure And Function Of Melanin, (Jimbow, K., Herausgeber), Fuji-shoin Company, Ltd., Sapporo, Japan, Bd. 4, 1978, Seiten 1 bis 13; Gilchrest et al., J. Cell. Physiol., 117: 235-240 (1983); Gilchrest et al., J. Invest. Dermatol., 83:370-376 (1984); US- Patent Nr. 4,443,546; US-Patent Nr. 4,507,321; US-Patent Nr. 4,456,687; US-Patent Nr. 4,444,760; Gilchrest et al., J. Cell. Physiol. 112:197 (1982); Groelke et al., In-vitro 17:247 (1981); Maciag et al., Science. 211:1432 (1981); Rheinwald et al., Nature, 265:421 (1977); und Rheinwald et al., Cell. 6:331 (1975).
Die zweite breite Kategorie umfaßt Untersuchungen an Simuliermitteln und Mitogenen für Melanozyten. Eine repräsentative Auflistung von Publikationen dieser zweiten Kategorie sind die folgenden: Gordon et al., J. Invest. Dermatol. 87:723-727 (1986); Wilkins et al., J. Cell. Physiol., 122:350-361 (1985); Levine et al., J. Invest. Dermatol., 89:269-273 (1987); Internationale Anmeldung Nr. PCT/US87/00226, veröffentlicht unter der Internationalen Veröffentlichung Nr. W087/04623 am 13. August 1987; Ogata et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 146:1204-1211 (1987); Halaban et al., In-vitro 23:47-52 (1987); Bregman et al.,Exp. Cell. Res. 157:419-428 (1985); Nordlund et al., J. Invest. Dermatol. 86:433-437 (1986); Hadley et al., Endoc. Res. 11:157-170 (1985); und Preston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5247- 5251 (1987).
Die dritte breite Kategorie an Publikationen ist gerichtet auf die Identifizierung biochemischer Vorgänge, die chemischen Gebilde und die intrazellulären Wirkungswege und -mechanismen in Melanozyten unter sich ändernden Bedingungen. Publikationen, die für diese breite Kategorie repräsentativ sind, sind die folgenden: Hadley et al., "Biologische Wirkungen der Melanozyt-stimulierenden Hormone" in Peptides Of The Pars Intermedia, Pitman Medical Company, London, 1981, Seiten 244-262; Lerner und McGuire, N.E.J. Med. 270:539-546 (1964); Friedmann und Gilchrest, J. Cell. Physiol. 133:88-94 (1987); Nordlund, J.J., Dermat. Clin. 4:407- 418 (1986); Nordlund und Abdel-Malek, Prog. Clin Biol. Res. 256: 219-236 (1988); Castagna, M., Biol. Cell. 59:3-14 (1987); Abdel- Malek et al,, In-vitro 22:75-81 (1986); Rosen et al., J. Invest. Dermatol. 88:774-779 (1987); Halaben et al., Arch. Biochem. Biophys. 230:383-387 (1984); und Preston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5247-5251 (1987).
Die vierte breite Kategorie ist gerichtet auf Verfahren und Techniken zur direkten Auslösung oder Steigerung der Melaninproduktion durch Melanozyten. Diese vierte Kategorie ist am wenigsten entwickelt, und die Forscher haben sich oft auf die Verwendung von Mäusehaut und Mäuse-Melanom-Zelllinien beschränkt, anstatt menschliche Melanozyten zu benutzen. Repräsentativ für diese vierte breite Kategorie sind die folgenden Veröffentlichungen: Friedmann und Gilchrist, J. Cell. Physiol. 133:88-94 (1987); Rosdahl und Szabo, J. Invest. Dermatol. 70:143-148 (1978); Warren, R., Photochem. Photobiol. 43:41-47 (1986); Jimbow und Uesugi, J. Invest. Dermatol. 78:108-115 (1982); Rosen et al., J. Invest. Dermatol 84:5247-5251 (1987); US-Patent Nr. 4,508,706; US-Patent Nr. 4,618,484 und US-Patent Nr. 4,695,449.
Wegen der Unterschiedlichkeit und des Umfangs der einschlägigen Literatur im allgemeinen, kann eine Zusammenfassung der einschlägigen Fakten, die als zutreffend angenommen werden und durch empirische Beweise belegt sind, wie folgt angegeben werden: Reine Melanozytenkulturen reagieren direkt auf simuliertes Sonnenlicht mit einem erhöhten Melaningehalt je Zelle, durch morphologische Änderungen und zelluläre Wachstumshemmung. Diese Reaktionen erkennt man als teilweise Nachahmung der Bräunungsreaktion der Melanozyten in intakter Haut. Diese Bräunungsreaktion in-vitro ist nicht einem veränderten cAMP-Gehalt oder den Wirkungen von Vitamin D, seinen Vorstufen, Photoprodukten oder Stoffwechselprodukten zuzuschreiben. Ferner wurde demonstriert, daß eine Mehrzahl unterschiedlicher Gewebeextrakte und derivativer Wachstumsfaktoren die Melanozytenvermehrung stimulieren kann. Die Verwendung vieler Stimuliermittel und Mitogene, wie Choleragen und Phorbolester, machen jedoch - obgleich sie die Zellvermehrung induzieren - auch die Melanozyten gegen viele andere physiologische Reize unempfindlich. Außerdem besteht als Teil der Reaktion auf die meisten Mitogene in-vitro eine umgekehrte Beziehung zwischen der Melanozyten-Wachstumsgeschwindigkeit und dem Melaningehalt je Zelle. Dies steht im Gegensatz zur lebenden Haut, die auf eine UV-Bestrahlung mit einer Zunahme der Anzahl der Melanozyten und einer Zunahme der Melaninsynthesegeschwindigkeit je Melanozyt reagiert. Während die Beziehung zwischen menschlichen Keratinozyten und Melanozyten weiterhin beträchtliches Interesse beansprucht, verbleibt schließlich ein bemerkenswerter Mangel an Informationen und empirischen Daten darüber, wie - wenn überhaupt - lösliche Keratinozyten-Zellprodukte die Melanozytenwachstumsgeschwindigkeit, Melanozytendendrizität und/oder die Melaninpigmentbildung durch Melanozyten steigern oder beeinflussen. Fachleute würden daher erkennen und würdigen, daß die Verfügbarkeit von durch Keratinozyten erzeugten, spezifischen in-vitro-Kulturmediumprodukten, die die Melanozytenvermehrung oder die Melanozytendendrizität oder die Melaninsynthese durch Melanozyten individuell beeinflußen und steuern können, ein größerer Fortschritt und eine anerkannte Verbesserung gegenüber den gegenwärtig bekannten Verfahren und Zusammensetzungen sein würde.

ABRISS DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zur Erhöhung des Melaningehalts von Melanozyten in-vitro mit den Stufen der
Verschaffung eines Diacylglycerins und
Zugabe des genannten Diacylglycerins zu den Melanozyten.
Sie schafft ferner eine örtliche Formulierung zur Erhöhung des Melaningehalts der Haut in-vivo, wobei die genannte Formulierung
einen mit der Haut eines Lebewesens verträglichen strömungsfähigen Träger und
ein Diacylglycerin enthält.
Ein in der Zusammensetzung und in dem Verahren der Erfindung einsetzbares Material ist wenigstens ein Glied, das aus der aus Diacylglycerinen, Diacylglycerin-Analoga und Diacylglycerin-Derivaten bestehenden chemischen Klasse ausgewählt ist.
Jedes oder irgendein beliebiges dieser Diacylglycerine kann in einer Mischung mit einem mit der Haut des Lebewesens verträglichen, strömungsfähigen Träger unter Bildung einer örtlich anzuwendenden Formulierung kombiniert werden, die den Melaningehalt der Haut in-vivo erhöhen kann. Diese außergewöhnlichen Zusammensetzungen können auch bei herkömmlich bekannten Medien und Kulturverfahren für die in-vitro-Kultur von Melanozyten sowohl in der wissenschaftlichen Forschung als auch für kommerzielle Zwecke eingesetzt werden. Beispielsweise steigert die Verwendung dieser Zusammensetzungen in-vivo und in-vitro die Melaninsynthese in Melanozyten.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Die vorliegende Erfindung kann leichter und vollständiger in Verbindung mit der beiliegenden Zeichnung verstanden werden.
Figur 1a und 1b sind Graphiken, die die Wirkungen eines Diacylglycerins auf die menschliche Melanozytenvermehrung und den Melaningehalt zeigen.
Figur 2 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkungen eines Diacylglycerins auf die Vermehrung menschlicher Melanozyten zeigt, wenn es alleine oder nach Vorbehandlung mit einem Phorbolester angewendet wird.
Figur 3 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkungen eines Diacylglycerins auf die Melaninbildung bei menschlichen Melanozyten zeigt, wenn es alleine oder nach Vorbehandlung mit einem Phorbolester angewendet wird.
Figur 4 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkungen eines Diacylglycerins auf die Vermehrung von S91-Melanom-Zellen in einer Kultur zeigt.
Figur 5 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung eines Diacylglycerins auf den Melaningehalt von S91-Melanom- Zellen in Kultur zeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung betrifft eine allgemeine Methodologie zur Steuerung der biologischen Aktivität menschlicher und tierischer Melanozyten unter den Bedingungen in-vitro. Sie betrifft ferner örtlich anzuwendende Formulierungen zur Steuerung der biologischen Aktivität menschlicher und tierischer Melanozyten unter den Bedingungen in-vivo. Die vorliegende Erfindung beruht in all ihren Aspekten auf einer fundamentalen Voraussetzung, daß die Fähigkeit, das Melanozytenwachstum und die Melanozytendendrizität zu steuern und spezifisch zu regeln, von der Fähigkeit der Regelung der Melaninsynthesegeschwindigkeit in den Melanozyten separat steuer- und unterscheidbar ist. Die Voraussetzung ist daher, daß mehrere verschiedene Faktoren und Zwischenkörper jede dieser spezifischen Aktivitäten unabhängig, aber zusammen mit den anderen modulieren. Während beispielsweise die Geschwindigkeit der Melaninsynthese durch einen oder mehrere spezifische Faktoren oder Mediatoren (Zwischenkörper) direkt gesteuert wird, besteht ein gewisses Maß an gegenseitiger Beeinflussung und Überkreuzwirkung mit den anderen spezifischen Faktoren oder Mediatoren, die für die Regulierung des Melanozytenwachstums und der Melanozytendendrizität individuell verantwortlich sind. Diese fundamentale Voraussetzung unterscheidet sich von der herkömmlichen Lösung wesentlich.
Die von den gewöhnlichen Praktikern auf diesem Gebiet dokumentierte und akzeptierte herkömmliche Anschauung folgt und ist in Übereinstimmung mit den herkömmlichen histologischen Untersuchungen. Demgegenüber wurde eine neue Folge von in primären in-vitro-Kulturen der menschlichen Epidermis auftretenden Vorgängen zwischen den zwei bedeutenden Zelltypen, den Keratinozyten und Melanozyten, beobachtet. Zu Anfang enthält die in einem ernährungsmäßig ausreichenden Kulturmedium gehaltene epidermiale Suspension mehr als 90% Keratinozyten und nur schätzungsweise 2 bis 4% Melanozyten. In einigen Kultursystemen ist das Kulturmedium derart, daß die Keratinozytenpopulation schwindet und innerhalb weniger Tage verloren ist, wodurch irgendeine bedeutsame Wechselwirkung mit Melanozyten unterbunden wird. In anderen Kultursystemen überleben die Keratinozyten, aber die Zellenanteile kehren sich nach einer Kultur von 2 oder 3 Wochen allmählich um, da sich die Melanozyten vermehren und die Keratinozyten sich schließlich in einem selektiven Wachstumsmedium differenzieren. Zu dieser Zeit ist eine bemerkenswerte, überraschende Haufenbildung dendritischer Melanozyten um die wenigen verbliebenen lebensfähigen Keratinozyten leicht erkennbar. Die Keratinozyten verschwinden aus den Kulturen nach 3 oder 4 Wochen vollständig. Das Verschwinden ist begleitet von einem Aufhören der Melanozytenvermehrung und einer Abnahme der Melanozytendendrizität mit einer wesentlichen Veränderung dieser Zellen zu einer polygonalen Zellenmorphologie. Nach unseren Kenntnissen bestand bisher keine allgemein oder generell akzeptierte Meinung, daß die Keratinozyten eine regulatorische Funktion haben bei der Bestimmung der Morphologie, des Wachstums und der Melanisierung der Melanozyten. Daher ist sogar das Konzept, daß die Keratinozyten eine größere Rolle spielen, neu, und die Voraussetzung, daß von Keratinozyten in der Kultur erzeugte und freigesetzte, verschiedene lösliche Faktoren und/oder Zwischenkörper einzelne Teile des Verfahrens alleine oder im Zusammenwirken spezifisch regulieren, ist völlig neu und im Hinblick auf die vorliegenden Kenntnisse unerwartet.
Es besteht auch eine zweite größere Differenz und Unterscheidung in der Grundvoraussetzung und der Lösung der vorliegenden Erfindung von den bisher vertretenen Ansichten und Meinungen der Praktiker auf diesem Gebiet. Ein wesentlicher Teil der veröffentlichten Literatur, die Versuche in-vitro und in-vivo beschreibt und empirische Daten liefert, hat nicht-menschliche Tiermodelle und nicht-menschliche Keratinozyten und Melanozyten benutzt. Beliebt bei vielen Forschern war die Verwendung von Mäusezellen, wobei die S91-Mäusemelanomzellen vielleicht am besten bekannt sind. Die vorherrschende Meinung ist die, daß tierische Daten und Modelle auf den menschlichen Melanozytenzustand direkt anwendbar sind und daß die Reizmittel, Mitogene und andere Zwischenkörper mit Melanozytenaktivität, die in dem Mäusezellsystem und in anderen Tierzellsystemen wirksam sind, auch bei der menschlichen Melanozyte und der menschlichen Haut existent und wirksam sind. Die vorliegende Erfindung akzeptiert diese Meinung nicht und liefert tatsächlich den Beweis, daß die Pigmentierung in der menschlichen Haut durch spezifische Faktoren und auf intrazellulären Wegen vermittelt wird, die von denen in der tierischen Haut verschieden sind. Die Faktoren, die das menschliche Melanozytenwachstum, die menschliche Pigmentbildung und die menschliche Pigmentübertragung beherrschen, sind wirksame Regulatoren für menschliche Melanozyten, während von nicht-menschlichen Keratinozyten abgeleitete Faktoren und Mediatoren oft unwirksam und nicht-regulatorisch sind. Der zweite fundamentale Unterschied ist daher die Erkenntnis, daß größere Differenzen und Unterschiede bestehen zwischen den Faktoren und Mediatoren (Zwischenkörpern) der Melanozyten, die unter den menschlichen und nicht-menschlichen zellulären Bedingungen wirksam sind.
Die vorliegende Erfindung schafft eine Klasse von Diacylglycerin-Zusammensetzungen, -Analogen und -Derivaten, mit mit Nutzen in der Methodologie für eine Reihe verschiedener Zwecke und Vorteile eingesetzt werden können
Die Klasse der Diacylglycerin-Zusammensetzungen ist besonders nützlich für Menschen und liefert den folgenden Nutzen und Gewinn:
(a) Auslösung der Hautbräunung in Abwesenheit oder Anwesenheit von Sonnenlicht;
(b) Wirkung als Beschleuniger der Hautbräunung in Gegenwart von natürlichem Sonnenlicht, und
(c) Schaffung einer Behandlung von grauem (entpigmentiertem) Haar.
Die chemische Klasse der Diacylglycerine als Ganzes sind Materialien, die in-vivo oder in-vitro mit lebenden Melanozyten in Wechselwirkung treten.

Keratinozyten und Melanozyten

Die Quelle beider Arten menschlicher Zellen ist vorzugsweise die Vorhaut Neugeborener, die man innerhalb zwei Stunden der wahlfreien Beschneidung erhält. Die Epidermis wird von der Lederhaut getrennt, nachdem sie über Nacht in 0,25% Trypsin inkubiert wurde (GIBCO, Grand Island, New York; Gilchrest et al., J. Invest. Dermatol. 83:370-376 (1984)). Primäre Kulturen epidermialer Keratinozyten werden hergestellt unter Benutzung der Methode von Rheinwald und Green (Cell. 6:331-334 (1975)), die dadurch modifiziert wurde, daß ein Verhältnis 4:1 des nach Dulbecco modifizierten Eagle-Mediums (nachfolgend "DMEM") und F12-Mediums nach Ham, ergänzt mit 10 mM Adenin und 10% fötalem Rinderserum (MA Bioproducts, Walkersfield, MR) zur Anwendung kam.
Die zusammenwachsenden Primärkulturen der Keratinozyten werden dann mit 0,5 mM Äthylendiamintetraessigsäure (nachfolgend "EDTA") gewaschen und etwa 15 Minuten mit 1 Milliliter (im folgenden "ml") 0,25 %igem Trypsin inkubiert. Die resultierende Zellensuspension wird dann mit einem gleichen Volumen 10% FBS in M199-Kulturmedium (GIBCO) gemischt. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren pelletiert, in BITIC-Medium wieder suspendiert und mit 1 x 10&sup6; Zellen in Schalen von 60 Millimeter (im folgenden "mm") eingeimpft, die 4 ml BITIC-Medium enthielten. Das BITIC-Medium wird wie folgt hergestellt: BITIC-MEDIUM (500 ml) Vorrat Schluß Medium 199 (Gibco 400-1100) Insulin* (INS) Epidermialer Wachstumsfaktor (EGF) Trijodthyronin (T3) Transferrin (Tf) Hydrocortison (HC) Inosit (Ino) Cholinchlorid (GG) Rinderserumalbumin (BSA) Penicillin/Streptomycin**(P/S) (wahlweise) * Insulin wird erst zugesetzt, da es sauer ist ** Wenn Pen/Strep eingesetzt wird, wird das Volumen des M199 auf 486 ml verringert.
Vor dem Plattieren wurden die Kulturschalen mit 30 Mikrogramm (nachfolgend "ug") je Schale affinitätsgereinigtem Human- Fibronectin vorbehandelt. Die Kulturen wurden dann bei 37 ºC in 8% Kohlendioxid/Luft inkubiert und zweimal wöchentlich mit frischem Medium versehen.
Melanocyten wurden in primärer Kultur aus ähnlich zubereiteter Epidermis nach der Verfahrensweise von Gilchrest et al. hergestellt (J. Invest. Dermatol. 83:370-376 (1984)). Kurz gesagt wurden die operativen Proben in Teile von 4 mm² geschnitten, in calciumfreier, phosphatgepufferter Salzlösung (nachfolgend "PBS") gespült, und über Nacht bei 4 ºC in 0,25% Trypsin (GIBCO) inkubiert. Die epidermialen Teile der Fragmente wurden mit der Pinzette von der Lederhaut getrennt, 10 Minuten bei 37 ºC in 0,02% EDTA inkubiert, zur Bildung einer einzigen Zellensuspension verwirbelt, in einer Konzentration von 10&sup6; Zellen je 35 mm-Schale in ein Melanozyten-Wachstumsmedium eingeimpft und in 8% Kohlendioxid und 92% Luft bei 37 ºC gehalten. Die Kulturen wurden dreimal wöchentlich mit frischem Melanozyten-Wachstumsmedium versehen.
Das Melanozyten-Wachstumsmediun wird wie folgt hergestellt: MELANOZYTEN-WAGHSTUMSMEDIUM (500 ml) Vorrat Schluß Medium 199 (Gibco 400-1100) Insulin* (INS) Trijodthyronin (T3) Epidermialer Wachstumsfaktor (EGF) Transferrin (Tf) Hydrocortison (HC) Choleratoxin (CT) dialysierter Gehirnextrakt (dBE) Penicillin/Streptomycin** (wahlweise) * Insulin wird erst zugesetzt, da es sauer ist. ** Wenn Pen/Strep eingesetzt wird, wird das Volumen des M199 auf 462 ul verringert.
Bezüglich der Keratinozyten und Melanozyten nicht-menschlicher Herkunft wird angenommen, daß die Herkunft der Zellen und die Art und Weise, wie sie isoliert und in Kultur gehalten werden, nach jenen Arbeitsverfahren erfolgt, die für diese spezifischen Zwecke früher in der Literatur angegeben wurden.

Keratinozytenprodukt erzeugendes Medium (KPGM)

Eine Reihe von verschiedenen Formulierungen und Zusammensetzungen in Mischung soll als KPGM für die Zwecke der vorliegenden Erfindung benutzt werden können. KPGM ist daher nicht eine einzelne Formulierung oder ein Gemisch spezifischer Bestandteile, sondern umfaßt eine Reihe unterschiedlich hergestellter Kulturmedien, die sich zur in-vitro-Haltung gewachsener Keratinozyten für den spezifischen Zweck der Induzierung der Keratinozyten in Kultur zwecks Erzeugung einer Reihe verschiedener Faktoren und/oder Mediatoren (Zwischenkörper) als Produkte und ihrer Freisetzung in das umgebende Medium eignen. KPGM kann daher am allgemeinsten definiert werden als eine Reihe spezifisch hergestellter Haltungsmedien für die Weiterführung einer in-vitro- Kultur gezüchteter Keratinozyten. Zumindest umfaßt dieses Medium das folgende: Wenigstens eine isotonische Salzlösung bei etwa neutralen pH-Werten für die Minimalhaltung gezüchteter Keratinozyten in Kultur;
0 - 20 mg/ml Albumin,
0 - 100 ug/ml Inosit und
0 - 50 ug/ml Cholinchlorid.
Eine andere Minimalformulierung umfaßt das folgende:
Essentielle Aminosäuren, Vitamine, Nährstoffe und Salze für die Minimalunterhaltung von Keratinozyten in Kultur;
1 - 100 ug/ml Insulin,
0 - 10 nM eines Jodthyronins, vorzugsweise Trijodthyronin,
0 - 100 ug/ml Transferrin,
0 - 15 M eines Cortisons, vorzugsweise Hydrocortison, und
0 - 100 ng/ml epidermialer Wachstumsfaktor.
Eine bevorzugte Formel I für KPGM umfaßt:
Dulbecco's Minimal Eagles Medium, das
10 ug/ml Insulin,
1 nM Trijodthyronin,
10 ug/ml Transferrin,
1,4 x 10&supmin;&sup6; M Hydrocortison,
10 ng/ml epidermialer Wachstumsfaktor, und
10&supmin;&sup9; M Choleragen (Choleratoxin) enthält
Eine andere bevorzugte Formel II für KPGM umfaßt: Medium 199 (GIBGO), das 0,3 uM Myo-Inosit, 3,6 uM Cholin, 1,8 uM Calcium und 0,5 nM Chlorid enthält;
10 ug/ml Insulin,
10&supmin;&sup9; M Transferrin,
1,4 x 10&supmin;&sup6; M Hydrocortison,
10 ng/ml epidermialer Wachstumsfaktor, und
2 mg/ml Rinderserumalbumin.
Eine andere bevorzugte Formel III für KPGM enthält das folgende:
1 Teil Dulbecco's Minimal Eagle's Medium,
4 Teile Ham-F12-Medium,
10 mM Adenin,
10%iges fötales Kalbsserum,
10 ug/ml Insulin,
10&supmin;&sup9; M Trijodthyronin,
10 ug/ml Transferrin,
1,4 x 10&supmin;&sup6; M Hydrocortison, und
10 ng/ml epidermialer Wachstumsfaktor.
Innerhalb dieser alternativen Definitionen für KPGM können eine Anzahl von Additiven wahlweise zugesetzt werden, um die Langlebigkeit der Keratinozyten in der Kultur zu erhöhen oder die Konzentration der löslichen Faktoren und/oder Mediatoren zu steigern, die während der Keratinozytenkultur in das Medium freigesetzt werden. Diese Additive sind:
20 - 300 ug/ml hypothalmischer Rinderextrakt (Gilchrest et al., J. Invest. Dermatol. 83:370-376 (1984); Wilkins et al., J. Cell. Physiol. 122:350-361 (1985));
0,5 - 500 uM Myo-Inosit,
0,4 - 40 uM Cholin und 0,5 - 500 MM Myo-Inosit in Kombination;
0,5 - 500 uM Äthanolamin,
0,5 - 500 uM Phosphoäthanolamin,
0 - 5 mM Serin,
0 - 1 uM Selen,
0 - 10 uM Prostaglandin E&sub2;, E&sub1;, und
10&supmin;&sup8; - 10 &supmin;¹³ M Gholeratoxin.
Verbindungen, die als Additive zu KPGM zu vermeiden sind, sind im allgemeinen die folgenden:
Stearinsäure in verdünnter oder konzentrierter Form,
Methionin in verdünnter oder konzentrierter Form,
Cyanocobalamin in verdünnter oder konzentrierter Form und
Folsäure in verdünnter oder konzentrierter Form.

Kulturbedingungen für KPGM und Keratinozyten in-vitro

Die Inkubationsbedingungen für Keratinozyten und das KPGM folgen herkömmlicher Praxis. Alle Kulturen werden vorzugsweise bei 37 ºC ± 4 ºC in einer Atmosphäre mit 8 ± 4% Kohlendioxid inkubiert. Jeder Schale wird frisches Medium in Intervallen zugesetzt, die von 1 bis 4-mal je Woche reichen. Die Anwendung steriler Technik und steriler Vorkehrungen wird durchweg angenommen.

DIACYLGLYGERINE (DAG)

Chemische Struktur und Vorkommen

Diacylglycerine (im folgenden "DAG") sind eine Klasse organischer chemischer Zusammensetzungen mit der chemischen Struktur und Formel der Verbindungen A, B oder C wie folgt:
worin R und R' kohlenstoffhaltige Reste sind. R und R' sind gewöhnlich langkettige (mehr als 14 Kohlenstoffatome) Carbonsäuren und können eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen enthalten. In den meisten Fällen sind R und R' in der Zusammensetzung chemisch verschieden. Zum Vergleich dazu kann R" irgendeine chemische Einheit sein, die mit dem benachbarten Kohlenstoffatom in der Glycerinstruktur keine Kohlenstoffesterbindung bildet. Demgemäß kann R" eine Hydroxylgruppe, eine Phosphatgruppe, ein Schwefelatom, eine Äthergruppe, ein Halogenid, ein Stickstoff enthaltendes Gebilde oder Wasserstoff sein.
Diacylglycerine sind eine Klasse natürlich vorkommender Substanzen. Eine bekannte Aufgabe für Diacylglycerine besteht bei einem intracellulären Signalübertragungsweg darin, daß DAGs als physiologische Aktivatoren des Proteins Kinase C (nachfolgend "PKC") angesehen werden, und Phorbolester können durch ähnliche biochemische Wege wirksam sein (Berridge, N.J. Ann. Rev. Biochem. 56:159-193 (1987); Nishizuka, Y., Science 233:305-312 (1986)). Die Synthese von DAG und vielen DAG-Analoga ist herkömmlicherweise bekannt (Ganong und Bell, Methods In Enzymology, Bd. 141, 1987, Seiten 313-320).

Diacylglycerine der vorliegenden Erfindung

Die Diacylglycerine der vorliegenden Erfindung sind jene DAG-Verbindungen und -Analoga, die biologisch aktiv sind, um einen Anstieg des cellulären Melaningehalts in Melanozyten unter in-vivo- und/oder in-vitro-Bedingungen zu erzeugen. Die natürlich auftretenden DAGs sind Derivate des Phosphatidylinosits, enthalten gewöhnlich eine langkettige einfach-ungesättigte Fettsäure, mit der die Kohlenstoffposition Nr. 1 in der Glycerinstruktur acyliert ist und enthalten auch typischerweise eine hoch-ungesättigte Fettsäure, hauptsächlich Arachidonsäure, mit der die Kohlenstoffposition Nr. 2 der Glycerinstruktur acyliert ist. Das am meisten bevorzugte Glied dieser chemischen Klasse für den Einsatz in der vorliegenden Methodologie ist 1-Oleoyl-2-acetyl-glycerin wegen seiner Löslichkeit in Wasser und seiner Fähigkeit, eine dosisabhängige Reaktion auf den Melanlngehalt ohne Begleitwirkung auf die Vermehrung und/oder das Wachstum von Melanozyten hervorzurufen. Andere bevorzugte Ausführungsformen des DAG enthalten in der Glycerinstruktur an der Kohlenstoffposition Nr. 3 eine freie Hydroxylgruppe und sind auf die herkömmliche Drei-Kohlenstoff-Skelettstruktur des Glycerins beschränkt. Eine repräsentative aber unvollständige Auflistung von DAG-Molekülen, von denen man annimmt, daß sie biologisch aktiv und für die Stimulierung der Melaninsynthese in Melanozyten potent sind, sind jene, die unten in der folgenden Tabelle II angegeben sind.

BEVORZUGTE DAG-ANALOGA

1,2-Diformylglycerin
1,2-Diacetylglycerin
1,2-Dibutanoylglycerin
1,2-Dihexanoylglycerin
1,2-Dioctanoylglycerin
1,2-Didecanoylglycerin
1,2-Didodecanoylglycererin
1,2-Ditetradecanoylglycerin
1,2-Dihexadecanoylglycerin
1,2-Dioctadecanoylglycerin
1,2-Dieicosanoylglycerin
1,2-Didocosanoylglycerin
1,2-Ditetracosanoylglycerin
1,2-Dipalmitoylglycerin
1,2-Dioleoylglycerin
1,2-Dilinoleoylglycerin
1,2-Dilinolenoylglycerin
1.2-Arachidonoylglycerin
1-Octanoyl-2-formyl-glycerin
1-Octanoyl-2-acetyl-glycerin

BEVORZUGTE DAG-ANALOGA (FORTS.)

1-Octanoyl-2-butanoyl-glycerin
1-Octanoyl-2-hexanoyl-glycerin
1-Octanoyl-2-decanoyl-glycerin
1-Octanoyl-2-dodecanoyl-glycerin
1-Octanoy1-2-tetradecanoyl-glycerin
1-Octanoyl-2-hexadecanoyl-glycerin
1-Octanoyl-2-octadecanoyl-glycerin
1-Octanoyl-2-eicosanoyl-glycerin
1-Octanoyl-2-docosanoyl-glycerin
1-Octanoyl-2-tetracosanoyl-glycerin
1-Octanoyl-2-palmitoyl-glycerin
1-Octanoyl-2-oleoyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-formyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-acetyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-butanoyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-hexanoyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-octanoyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-decanoyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-dodecanoyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-tetradecanoyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-hexadecanoyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-octadecanoyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-eicosanoyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-docosanoyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-linoleoyl-glycerin
1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-glycerin
1-Oleoyl-2-formyl-glycerin
1-Oleoyl-2-acetyl-glycerin
1-Oleoyl-2-butanoyl-glycerin
1-Oleoyl-2-hexanoyl-glycerin

BEVORZUGTE DAG-ANALOGA (FORTS.)

1-Oleoyl-2-octanoyl-glycerin
1-Oleoyi-2-decanoyl-glycerin
1-Oleoyl-2-dodecanoyl-glycerin
1-Oleoyl-2-tetradecanoyl-glycerin
1-Oleoyl-2-palmitoyl-glycerin
1-Oleoyl-2-linoleoyl-glycerin
1-Oleoyl-2-arachidonoyl-glycerin
1-Hexanoyl-2-formyl-glycerin
1-Hexanoyl-2-acetyl-glycerin
1-Hexanoyl-2-butanoyl-glycerin
1-Hexanoyl-2-octanoyl-glycerin
1-Hexanoyl-2-decanoyl-glycerin
1-Hexanoyl-2-dodecanoyl-glycerin
1-Hexanoyl-2-tetradecanoyl-glycerin
1-Hexanoyl-2-hexadecanoyl-glycerin
1-Hexanoyl-2-octadecanoyl-glycerin
1-Hexanoyl-2-eicosanoyl-glycerin
1-Hexanoyl-2-palmitoyl-glycerin
1-Hexanoyl-2-oleoyl-glycerin
1-Hexanoyl-2-linoleoyl-glycerin
1-Hexanoyl-2-arachidonoyl-glycerin

Diacylglycerin-Verabreichung und Art und Weise der Verwendung

Wie anschließend empirisch gezeigt wird, können DAG-Analoga Anstiege im cellurären Melaningehalt ohne Änderung der Melanozytenvermehrung erzeugen. Außerdem steigern die DAG-Analoga die Dendrizität der Melanozyten nicht. DAGs sind daher in ihrer biologischen Wirkung und zellulären Funktion selektiv und im allgemeinen auf ihre Fähigkeit beschränkt, die Melaninsynthese und -produktion spezifisch innerhalb vorexistierender Melanozyten zu induzieren.
Es ist beabsichtigt, daß die DAG-Analoga unter in-vivo- und in-vitro-Bedingungen verwendet werden. Für den in-vivo-Einsatz ist es erwünscht, daß die örtliche Anwendung einer oder mehrerer DAG-Analoga direkt auf der Haut des Lebewesens erfolgt. Zu diesem Zweck wird ein strömungsfähiger Träger in Mischung mit dem gewählten DAG-Analogon kombiniert. Demgemäß sollen die DAG-Analoga in einen pharmakologischen, örtlich anzuwendenden Träger eingemischt werden, z.B. in ein Gel, eine Salbe, eine Lotion oder eine Krem. Sie enthalten solche strömungsfähigen Träger, wie Wasser, Glycerin, Alkohol, Propylenglykol, Fettalkohole, Triglyceride, Fettsäureester oder Mineralöle. Andere mögliche örtlich anzuwendende Träger sind Vaseline, Isopropylpalmitat, Polyäthylenglykol, Äthanol (95%), Polyoxyäthylenmonolaurat (5%) in Wasser, Natriumlaurylsulfat (5%) in Wasser und dergl.. Andere Materialien, wie Antioxidantien, Feuchthaltemittel, Viskositätsstabilisatoren und ähnliche Mittel können nötigenfalls zugesetzt werden. Ferner ist in bestimmten Fällen zu erwarten, daß die hier beschriebenen fertigen Präparate in Geräten angeordnet werden können, die auf, in oder unter der Haut plaziert werden. Solche Geräte umfassen Pflaster, Implantate und Injektionen, die das fertige Präparat durch passive oder aktive Freigabemechanismen in die Haut freigeben. Bei der in-vivo-Anwendung ist es bevorzugt, daß das DAG-Analogon in einer Endkonzentrationsbereich von 0,10 - 20,00 mM in einem fluiden Trägermaterial vorliegt. Alternativ kann für die in-vitro-Anwendung als Laborreagenz bei Melanozytenkulturen das ausgewählte DAG-Analogon direkt den die lebenden Zellen umgebenden Kulturmedien in irgendeiner gewünschten Konzentration entsprechend des Zwecken und Zielen der experimentellen Auslegung zugesetzt werden. Es ist klar zu erwarten und beabsichtigt, daß unzulässige und toxische Konzentrationen für das ausgewählte DAG-Analogon empirisch bestimmt werden. Demgemäß gibt es keine wirksame Grenze für die Konzentration des gewählten DAG-Analogons bei diesen Anwendungen und Einsätzen inin-vitro.
Wie weiter unten empirisch gezeigt wird, ist das bevorzugte DAG-Analogon 1-Oleoyl-2-acetyl-glycerin in seiner Aktivität für Melanozyten aus menschlicher Baut selektiv; dagegen ist dieses DAG-Analogen nachweislich inaktiv und induziert keinen Anstieg der Melaninproduktion, wenn es S91-Melanom-Mäusezellen, dem am häufigsten getesteten tierischen Melanozytenmodell, verabreicht wird.
Um die einzigartige biologische Aktivität und Funktionsfähigkeit der Zusammensetzungen und des Verfahrens der Erfindung als Ganzes zu zeigen, wird eineReihe verschiedener im Laboratorium durchgeführter Versuche beschrieben. Diese in-vitro-Versuche dienen nur zur Erläuterung der Verschiedenartigkeit der Anwendungen und Bedingungen, bei denen das erfindungsgemäße Verfahren mit Nutzen eingesetzt werden kann. Obgleich die experimentelle Auslegung nur Labormaßstab hat, ist es klar, daß die empirischen Parameter wunschgemäß vergrößert werden können, um verschiedenen Anwendungen in-vivo und in-vitro zu entsprechen. Außerdem sind die beschriebenen empirischen Daten und Versuche eindeutig nur repräsentativ für dieAnzahl, Mannigfaltigkeit und Verschiedenheit der Zusammensetzungen und Kulturmedien, die mit Vorteil zur Anwendung kommen können.

Melanozyten-Biountersuchung

Melanozyten wurden in einer Menge von 2 x 10&sup4; Zellen je 35 mm Schale eingesät und mit KPGM vereinigt, das mit 2% FBS und 100 ug/ml BHE ergänzt wurde. DasGemisch wird nun als fertiges Melanozytenmedium bezeichnet. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 ºC erhielten die gezüchteten Melanozytenkulturen in zweioder dreifacher Ausfertigung eine der folgenden Zugabe Freies fertiges Melanozytenmedium oder ergänztes vollständiges KDCM. Jede Melanozytenkultur wurde dann 6-7 Tage bei 37 ºC inkubiert. Anschließend wurde jede Melanozytenkultur geerntet und die Zellenanzahl je Schale empirisch bestimt. Jede Melanozytenkultur wird mit 0,4 mM EDTA in PBS gewaschen, mit 1 ml eines 0,13% Trypsin und 0,2 mM EDTA enthaltenden Gemisches behandelt, dann etwa 10 Minuten bei 37 ºC inkubiert und dann wurde 1 ml PBS zugesetzt. Anschließend wurde ein aliquoter Teil von 0,5 ml jeder entstandenen Suspension unter Benutzung einer isotonischen Salzlösung auf 10 ml Gesamtvolumen verdünnt und unter Benutzung eines Teilchenzählers (Modell ZM, Colter Science) bearbeitet.
Zur Bestimmung des Melaningehalts wurde die restliche Suspension 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, das Überstehende wurde verworfen, und der entstandene Zellenpellet wurde in 0,1 ml einer 1M NaOH gelöst, die anschließend mit 0,4 ml Wasser verdünnt wurde. Die Melaninkonzentration wurde durch die Bestimmung der optischen Dichte bei 475 Nanometern berechnet. Die Werte wurden durch Vergleich mit einer Standardkurve von Bestimmungen mit synthetischem Melamin extrapoliert, einer Melanogenesemessung, die mit dem ¹&sup4;C-DOPA-Einbau und mit der Tyrosinaseaktivität sehr gut korreliert (Friedmann und Gilchrest, J. Cell. Physiol. 133:88-94 (1987)). Die Melaninwerte wurden als Gesamtmelanin je Kultur oder als Melaningehalt je Zelle oder als Prozentsatz der unbehandelten Kontrollwerte ausgedrückt.
In bestimmten Fällen wurde Phasenkontrast-Mikroaufnahmen unter Benutzung eines Umkehrmikroskops aufgenommen, nachdem die Kulturen einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen worden waren.

Versuch 1: Wirkungen der Diacylglycerine

Diese Versuchsreihe untersucht die biologischen Wirkungen der Diacylglycerine (DAG) auf menschliche Melanocyten und zeigt die Wirkungen der Vorbehandlung menschlicher Melanozyten mit spezifischen Mitteln vor der Inkubation mit einem DAG. Eine erste Versuchsreihe wurde durchgeführt unter Benutzung menschlicher Melanozyten in Verbindung mit dem bevorzugten DAG 1-Oleoyl-2-acetyl-glycerin, das wegen seiner wirksamen Einlagerung in Melanozytenmembrane ausgewählt wurde. Vorhäute Neugeborener, die mann innerhalb von zwei Stunden der wahlweisen Beschneidung erhalten hatte, dienten als Quelle für menschliche Melanozyten. Die Epidermis wurde nach Inkubation in 0,25% Trypsin über Nacht von der Lederhaut getrennt. Eine primäre Melanozytenkultur wurde nach der Methode von Gilchrest et al. eingerichtet (J. Invest. Dermatol. 83:370-376 (1984)). Das bevorzugte DAG wurde mit den menschlichen Melanozyten in fertigem Melanozytenmedium vereinigt, und das Gemisch wurde bei 37 ºC für einen Zeitraum von 6 Tagen inkubiert. Die Ergebnisse sind durch die Figuren 1a und 1b graphisch dargestellt, die eine deutliche dosisabhängige Reaktion auf erhöhten Melaningehalt bei Konzentrationswerten in dem Bereich von 25 bis 200 uM ohne bedeutsame Wirkungen auf die Vermehrung oder das Wachstum der Melanozyten zeigen. Bei einer optimalen Konzentration von 100 uM erzeugte dieses DAG im Mittel einen vierfachen Anstieg des zellulären Melaningehalts je Zelle im Vergleich zur unbehandelten Kontrollprobe. Es ist auch zu bemerken, daß dieses DAG die Dendrizität der menschlichen Melanozyten nicht erhöhte und keinen bedeutsamen Effekt auf das menschliche Melanozytenwachstum hatte.
Eine zweite Versuchsreihe wurde durchgeführt, bei der die gezüchteten menschlichen Melanozyten zunächst mit Tetradecanoylphospol-13-acetat (nachfolgend "TPA") einer Konzentration von 100 nM vorbehandelt wurden. Zunächst wurden die menschlichen Melanozyten wie oben beschrieben erhalten und gezüchtet. Anschließend wurden die gezüchteten menschlichen Melanozyten mit 100 nM TPA in Melanozytenmedium vereinigt und 24 Stunden bei 37 ºC inkubiert. Das DAG wurde dann zugesetzt, und die Kultur wurde erneut 6 Tage inkubiert. Der Melaningehalt der Zellen wurde dann nach der oben beschriebenen Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Figuren 2 bzw. 3 graphisch dargestellt.
TPA alleine induzierte eine extreme Dendrizität, und Diacylglycerin induzierte eine verstärkte Melanisierung. Die Kombination war gleichermaßen wirksam für die Melanisierung und die Induzierung der Dendrizität. Diese Kombinationen wären in der Lage, Synthese und Übertragung des Pigments zu steigern.
Figur 2 zeigte empirisch, daß weder das DAG-Analogon noch die Vorbehandlung mit TPA noch ihre Kombination irgendeinen wesentlichen Effekt auf die menschlichen Melanozytenvermehrung hat. Zum Vergleich zeigt Figur 3 empirisch einen größeren und bedeutenden Anstieg des Melaningehalts je menschlicher Melanozyte als Funktion der TPA-Vorbehandlung in Werten, die bedeutend höher sind als die des gewählten DAG-Analogons alleine. Zur maximalen Melaninproduktion ist es daher in höchstem Maße erwünscht, menschliche Melanozyten vor Austeilung des ausgewählten DAG-Analogons vorzubehandeln.

Versuch 2: Wirkungen der Diacylglycerin-Analoga auf nicht-menschliche Melanozyten

Diese Versuchsreihe wurde durchgeführt, um die Wirkung eines DAG auf Melanozyten zu bestimmen, die anstatt von menschlichen aus tierischen Quellen stammten. Bei dieser Versuchsreihe wurden Mäuse-S91-Melanomzellen unter Benutzung herkömmlicher Methoden in Kultur gezüchtet und gehalten (Friedmann und Gilchrest, J. Cell. Physiol. 133:88-94 (1987)). Die gezüchteten S91-Melanomzellen wurden dann mit 100 uM des bevorzugten DAG, 1-Oleoyl-2-acetylglycerin, oder mit 100 uM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) vereinigt. Jedes chemische Mittel wurde 7 Tage bei 37 ºC mit den S91- Melanomzellen in Dulbecco's Minimal Eagle's Medium vereinigt, das 2% FBS enthielt. Die Ergebnisse sind in den Figuren 4 bzw. 5 graphisch dargestellt.
Figur 4 zeigt empirisch, daß das gewählte DAG bei Konzentrationen in dem Bereich von 1 bis 200 uM keine Vermehrung der S91- Melanomzellen induzierte. Das IBMX war in der Wirkung ähnlich und versagte ebenfalls zur Herstellung irgendeines zellulären Wachstums. Zum Vergleich zeigt Figur 5 größere Differenzen zwischen dem gewählten DAG und IBMX in der Induzierung eines Anstiegs der Melaninproduktion. IBMX verursachte bei einer Konzentration von 100 uM eindeutug einen größeren Anstieg der Melaninproduktion in S91-Melanomzellen. Im Vergleich dazu versagte das ausgewählte DAG weiterhin darin, irgendeinen wesentlichen Anstieg in der Melaninproduktion im Vergleich zu den Kontrollproben herbeizuführen. Es ist daher eindeutig gezeigt, daß die biologischen Wirkungen von DAG selektiv und charakteristisch entsprechend der Herkunft der Melanozyten sind. Es ist unbestreitbar, daß dieses DAG keine bedeutsame Wirkung auf S91-Melanomzellen ausübt, die von der Maus stammen. Auf der anderen Seite verursacht die Verabreichung dieses DAG an menschliche Melanozyten klar und eindeutig größere wesentliche Zunahmen des Melaningehalts, ohne daß diese von einer Zellvermehrung der menschlichen Melanozyten begleitet sind.
Die Form und der Umfang der vorliegenden Erfindung wird nur durch die folgenden Ansprüche begrenzt.

Claims

1. Verfahren zur Erhöhung des Melaningehalts von Melanocyten in-vitro mit den Stufen der

Verschaffung eines Diacylglycerins und

Zugabe des genannten Diacylglycerins zu den Melanocyten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die genannten Melanocyten in Kultur gehalten werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem die genannten Melanocyten innerhalb von als eine Haut zu verwendendem Hautgewebe sind.

4. Verwendung eines Diacylglycerins für die Herstellung einer örtlichen Formulierung zur Erhöhung des Melaningehalts der Melanocyten in der Haut in-vivo.