DE60320034T2

DE60320034T2 - Behandlung von mastitis mit einer kombination aus prednisolon und cephalosporin

Info

Publication number: DE60320034T2
Application number: DE60320034T
Authority: DE
Inventors: Gerardus Franciscus Cox. Peter; Joseph Antonius Lohuis; Selma Marianne Hensen
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2002-12-16
Filing date: 2003-12-10
Publication date: 2009-05-14
Anticipated expiration: 2023-12-11
Also published as: DE60320034D1; JP2006514642A; ATE390124T1; US7812009B2; CA2508022C; US20060058273A1; ES2300634T3; WO2004054538A1; JP2013035845A; EP1585497B1; AU2003290015A1; CA2508022A1; EP1585497A1; JP5162080B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung für die intramammäre Verabreichung an ein nicht-menschliches Säugetier, umfassend ein Cephalosporin und Prednisolon und seine Verwendung für die Behandlung von klinischer Mastitis.
Mastitis ist eins der Hauptprobleme der bäuerlichen Milchproduktion, weil es Krankheit und Verlust an Milchproduktion bewirkt sowie die Pflege von Milchkühen, Schafen oder Ziegen erfordert. Trotz vorsorglicher Pflege durch selektive Zucht, Melktechnologie und Hygienemassnahmen, ist es häufig unmöglich, Infektionen zu vermeiden, von denen die meisten durch bakterielle Pathogene hervorgerufen werden.
Klinische Mastitis kann durch die Produktion von abnormaler Milch (Flocken, Knötchen und wässrige Sekretionen) dargestellt werden, wobei der infizierte Euter klinische Anzeichen (Schwellungen, Hitze, Schmerz bei Berührung) zeigt. Im Falle von akuter klinischer Mastitis können diese Zeichen mit allgemeinen Symptomen (Fieber, Anorexie, allgemein depressive Stimmung) kombiniert sein.
Es ist ein Hauptziel der Therapie der klinischen Mastitis, die lokalen und systemischen Anzeichen der Krankheit zum Verschwinden zu bringen oder die Zeitdauer des Auftretens dieser Krankheitssymptome zu vermindern, um die Verluste der Milchproduktion zu minimisieren, um eine bakteriologische Heilung des infizierten Teils des Euters zu erhalten und um die Rückzugszeiten für die Erzeugung von Fleisch und Milch kurz zu halten. Antibiotische Behandlung ist das Hauptverfahren zur Eliminierung von bestehenden Infektionen. Leider tritt eine vollständige bakteriologische Heilung, wobei alle infizierenden Mikroorganismen aus dem betroffenen Teil oder Euterviertel eliminiert worden sind, für die meisten bakteriellen Arten nicht immer ein. Die Heilungsrate von einer Mastitis-Behandlung ist abhängig von der Behandlung selber, wie lang die Infektion aufgetreten ist, dem Alter der Kuh und dem Typ des involvierten Mikroorganismus.
Corticosteroide, wie beispielsweise Prednisolon sind in verschiedenen antibiotischen Präparaten eingebunden worden, um Mastitis während der Milchabgabe zu behandeln.
Bei der Behandlung von klinischer Mastitis helfen Corticosteroide bei der Verminderung des Schwellens, des Schmerzes und beim Verbessern der Entfernung von toxischen Sekreten sowohl als auch beim Fördern einer besseren Verteilung von intramammären Infusionen.
Die allgemeinen Wirkungen von Corticosteroiden sind vielgestaltig und zahlreich, diese umfassen: metabolische Wirkungen (beispielsweise Gluconeogenese, Proteolyse, Lipolyse), hormonelle Wirkungen (beispielsweise Unterdrückung von einer endogenen Cortisol-Produktion), Wirkungen auf das Elektrolyt- und Wassergleichgewicht (Mineralocorticoid-Wirkung), eine negative Wirkung auf die Zellteilung und die DNS-Synthese in verschiedenen Zellen (beispielsweise Lymphozyten, Fibroblasten und Schleimhautzellen), hämatologische Wirkungen (Leucozytose, charakterisiert durch Neutrophilie und Lymphopenie), entzündungshemmende Wirkungen und Wirkungen auf das Immunsystem.
Diese Wirkungen hängen allgemein vom Typ des verwendeten Corticosteroids ab, dessen Dosierung, dessen Formulierung und dem Verabreichungsweg.
Eine besonders unerwünschte Wirkung von Corticosteroiden bei den meisten Indikationen liegt im Unterdrücken der Wirkung auf das Immunsystem des Wirts. Corticosteroide sind dafür bekannt, einige humorale und zelluläre Antworten auf das Wirtsimmunsystem zu vermindern, beispielsweise durch Verminderung der Lymphozyten-Antwort auf Mitogene, die Synthese der endogenen Mediatoren zu vermindern und die Anzahl von zirkulierenden Lymphozyten zu verringern. Diese Wirkungen werden als dosisabhängig betrachtet (siehe beispielsweise The Merck Veterinary Manual, 8. Ausgabe, 2002, Kapitel "Steroids").
Die Verwendung von Prednisolon wird als wirksam in der Behandlung von klinischer Mastitis nach intramammärer Verabreichung angesehen, ist aber jetzt aufgrund der bekannten Nachteile, insbesondere in Bezug auf die Immunsystemunterdrückung, nur in geringen Dosismengen eines Äquivalents von 10 mg/Dosiseinheit von Prednisolon eingesetzt worden.
Die entzündungshemmenden Wirkungen von Prednisolon bei klinischer Mastitis nach intramammärer Verabreichung einer geringen Dosismenge im Maximum von 10 mg/Dosiseinheit mit oder ohne antibakterieller Agenzien sind beispielsweise durch Bywater et al in "Proceedings of 15^th World Buiatrics congress", (1988, Palma de Mallorca), Lees et al, Flem. Vet. J., Band 62 (suppl. 1), Seiten 43 bis 54, 1991 und Lohuis et al, J Dairy Sci, Band 72, Seiten 241 bis 249, 1989 beschrieben worden.
Corticosteroide sind in verschiedenen antibakteriellen Produkten aufgenommen worden, die für die Behandlung von Mastitis während der Milchabgabe kommerzialisiert worden sind. Beispiele sind Synolux LC^TM (Pfizer) mit den antibakteriellen Wirkstoffen Amoxicillin-Trihydrat, Clavulansäure und 10 mg Prednisolon; Mastijet forte^TM (Intervet) mit den antibakteriellen Wirkstoffen Neomycin, Bacitracin, Tetracyclin und 10 mg Prednisolon; Lincocin forte^TM (Pharmacia & Upjohn) mit den antibakteriellen Wirkstoffen Lincomycin, Neomycin und 5 mg Methylprednisolon.
In dem kommerziellen Produkt Tetra Delta^TM (Pharmacia & Upjohn) sind die antibakteriellen Wirkstoffe Procain-Penicillin, Novobiocin, Polymyxin B, Dihydrostreptomycin, Chlorbutanolanhydricum verbunden mit 32,5 mg Hydrocortison. Diese Dosis von Hydrocortison ist äquivalent zu 13 mg Prednisolon.
Hydrocortison ist jedoch ein Stoff mit einer ausgeprägteren mineralocorticoiden Wirkung als Prednisolon. Verbindungen mit einer erhöhten mineralocorticoiden Wirkungen sind weniger geeignet für den Einsatz als entzündungshemmender Wirkstoff.
Lohuis et al, J Dairy Science, Band 72, Seiten 241 bis 249, 1989 beschreiben die verbesserten Wirkungen der intramammären Infusion von 40 mg/Dosiseinheit an Prednisolon bei lokalen und systemischen entzündlichen Zeichen bei einer nicht-bakteriellen durch E. coli Endotoxin induzierten klinischen Mastitis unter experimentellen Bedingungen.
Die bekannten das Immunsystem unterdrückenden Nebenwirkungen verhinderten bis jetzt den Einsatz von höheren Dosen von Prednisolon, insbesondere bei Produkten für die Behandlung von bakteriell induzierter Mastitis. Bei einer solchen bakteriell induzierten Mastitis und in diesen Fällen ist die Wirkung der Immununterdrückung wesentlicher, da das infektiöse Agents immer noch virulent ist und ein verminderter Verteidigungsmechanismus das Bakterienwachstum fördern könnte und somit die Krankheit unterstützen könnte.
Es ist daher das Ziel der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von klinischer Mastitis für die intramammäre Verabreichung zu liefern, die eine verbesserte entzündungshemmende Wirkung zeigt, ohne den Nachteil der Immunsystemunterdrückung.
Die vorliegende Erfindung liefert eine pharmazeutische Zusammensetzung für die intramammäre Verabreichung an ein nicht-menschliches Säugetier, umfassend ein Cephalosporin, Prednisolon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, der mindestens 20 mg Prednisolon/Dosiseinheit umfasst.
Es ist gefunden worden, dass eine Zusammensetzung gemäss der Erfindung bei der Behandlung von klinischer Mastitis eine verbesserte entzündungshemmende Wirkung auf lokale und systemische Entzündungssymptome liefert, wie dies in den Beispielen 2 und 3 gezeigt wird, ohne die erwarteten das Immunsystem unterdrückenden Nebenwirkungen (siehe Beispiele 4 und 5). Beispiel 4 zeigt, dass die Zusammensetzung gemäss der Erfindung keinen Einfluss auf die weissen Blut- und Milchzellen hat und somit einen Indikator des Hauptverteidigungsmechanismus des Wirtes und des Euters während der Entzündung bei akuter klinischer Mastitis darstellt. Beispiel 5 zeigt, dass unter Feldbedingungen eine Zusammensetzung gemäss der Erfindung keine negative Wirkung auf die bakteriologische Heilungsrate und die klinische Heilungsrate in Vergleich zu Behandlungen mit einem üblicherweise geringer dosierten Prednisolon-Produkt zeigt.
Die Verbindung Prednisolon (11β)-11,17,21-Trihydroxypregna-1,4-dien-3,20-dion (Δ¹-Dehydro-Hydrocortison) ist ein synthetisches Corticosteroid, abgeleitet von Hydrocortison. Prednisolon ist ein häufig verwandtes Corticosteroid in intramammären Formulierungen. Der Begriff "Prednisolon", wenn er hier benutzt worden ist, umfasst auch pharmazeutisch verträgliche Salze und Ester von diesen.
Gemäss der vorliegenden Erfindung umfasst eine Dosiseinheit der pharmazeutischen Zusammensetzung mindestens 20 mg Prednisolon. Eine typische pharmazeutische Zusammensetzung gemäss der Erfindung umfasst 20 bis 40 mg Prednisolon/Dosiseinheit wie oben bezeichnet. Vorzugsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung 20 bis 30 mg an Prednisolon/Dosiseinheit, noch bevorzugter sind 20 mg Prednisolon/Dosiseinheit.
Das antibakterielle Agens, das in der Zusammensetzung eingeschlossen ist, kann im allgemeinen ein Antibakterium sein, welches ein ausreichend breites Spektrum an antibakterieller Wirksamkeit aufweist, um die wesentlichsten Mikroorganismen zu behandeln, die Mastitis verursachen. Solche antibakteriellen Agentien sind allgemein im Stand der Technik bekannt.
Bevorzugt ist ein Cephalosporin. Cephalosporine sind halbsynthetische Antibiotika, die von Cephalosporin C abgeleitet worden sind, einem natürlichen Antibiotikum, welches von dem Pilz Cephalosporium acremonium erzeugt wird. Celaphosporine gehören zur Klasse der β-lactam Antibiotika und sind als Produkte erster Generation (beispielsweise Cephapirin, Cephalothin, Cephaloridin, Cefazolin), zweiter Generation (Cefamadol, Cefuroxim, Cefoxitin), dritter Generation (Cefotaxim, Ceftriaxon, Cefoperazon) oder vierter Generation (Cefepim, Cefpirom, Cefquinom) gemäss der Reihenfolge ihrer Einführung und der Position und Art der Seitenkette, die in das Basismolekül eingebaut worden sind, klassifiziert. Derzeit werden Cephalosporine in weitem Umfang für die Behandlung von Infektionen eingesetzt. Der Begriff "Cephalosporine", wenn hier benutzt, umfasst ebenfalls pharmazeutisch verträgliche Salze und Ester davon.
Ein besonders bevorzugtes Cephalosporin ist Cephapirin. Cephapirin (3-[(Acetoxy)methyl]-8-oxo-7[[pyridinylthioacetyl]amino]-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-Carbonsäure) ist ein Cephalosporin erster Generation. Vorzugsweise ist das pharmazeutisch verträgliche Salz von Cephapirin das Natriumsalz.
Bei einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das Cephalosporin vierter Generation Cefquinom eingesetzt (INN für international non-proprietary name). Cefquinom ist ein halbsynthetisches Aminothiazol-Cephalosporin, ähnlich zu Cefotaxim, aber mit einer bizyklischen Pyrinidium-Gruppe an der C-3 Position (Isert et al, Seibert et al, 29^th Interscience Conference an Antimicrobial Agents and Chemotherapy Houston, Texas, 1989). Vorzugsweise ist das pharmazeutisch verträgliche Salz von Cefquinom das Sulfatsalz.
Eine typische pharmazeutische Zusammensetzung gemäss der Erfindung umfasst 10 bis 500 mg des antibakteriellen Agens/Dosiseinheit, abhängig von der Wirksamkeit der Verbindung. Vorzugsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung 200 bis 400 mg von Cephapirin/Dosiseinheit, noch bevorzugter 300 mg.
Alternativ umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung 50 bis 150 mg Cefquinom/Dosiseinheit, bevorzugter 50 bis 100 mg.
Der pharmazeutisch verträgliche Träger für die aktiven Wirkstoffe (das Cephalosporin und Prednisolon) wird ausgewählt als nicht-toxisch, veterinär verträglich, kompatibel mit den Wirkstoffen, und mit einer Viskosität, die die Verabreichung gestattet, während es die Abgabecharakteristika der medikamentösen Partikel steuert.
In Übereinstimmung mit allgemeiner Praxis umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung gemäss der Erfindung für die intramammäre Verabreichung eine Suspension oder Lösung des Wirkstoffes in geeignetem Träger, welcher auf wässriger oder öliger Basis hergestellt werden kann.
Öle, die für die Ölbasis bei pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden können, sind im Allgemeinen beispielsweise pflanzlich, semisynthetisch oder synthetische mono-, di- oder tri-Glyceride. Pflanzliche öle, die eingesetzt werden können, sind beispielsweise Sesamöl, Olivenöl, Baumwollöl, Rizinusöl, Erdnussöl oder Kokosnussöl.
Der pharmazeutisch verträgliche Träger bei der Zusammensetzung gemäss der Erfindung umfasst vorzugsweise eine Ölbasis und enthält optional ein oder mehrere Aditive, wie ein Verdickungsmittel, ein Trocknungsmittel und Antioxidantien. Geeignete pharmazeutische Hilfsstoffe sind im Stand der Technik bekannt. Solche pharmazeutischen Hilfsstoffe für den Träger für intramammäre Formulierungen sind beispielsweise in "Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20. Ausgabe, 2000), durch Bezugnahme hier einbezogen, beschrieben.
Konventionelle Verdickungsmittel sind beispielsweise Aluminium-Stearat, Silika oder Fettsäure-Ester, wie Glycerol-Monostearat. Eine geeignete Menge eines Verdickungs-Mittels liegt im Bereich zwischen 2 und 30 Gewichtsprozent. Trocknungsmittel sind beispielsweise Silikate, Aktiv-Lehm, Silika-Gel und Molekular-Siebe. Besonders bevorzugt ist Natrium-Aluminium-Silikat. Eine geeignete Menge eines Trocknungsmittels, die hier eingesetzt werden kann, liegt im Bereich zwischen 5 und 15 Gewichtsprozent, vorzugsweise zwischen 5–10%. Geeignete Anti-Oxidantien sind beispielsweise Butylhydroxytoluen oder Hydroxyanisol. Das Anti-Oxidationsmittel wird üblicherweise vorhanden sein in einem Bereich zwischen 0.01 und 10 Gewichtsprozent. Andere Additive können auch im öligen Vehikel in geringerem Masse vertreten sein.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäss der Erfindung, umfassend die Schritte des Mischens eines Öls und optional von Additiven und des Suspendierens des Cephalosporins und des Prednisolons in dem Träger.
Spezieller liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren gemäss der Erfindung, bei dem der Träger durch Mischen bei einer geeigneten Temperatur von Öl und Additiven ausgebildet wird, um ein Gel auszubilden. Nach dem Abkühlen des Trägers, werden das Cephalosporin und das Prednisolon hinzugefügt, bei Raumtemperatur, unter Einsatz einer geeigneten Mischungs-Vorrichtung, um eine homogene Dispersion zu erreichen. Die Mischung wird dann in Dosiseinheits-Röhrchen oder Spritzen aufgezogen.
Eine einzelne Dosis-Einheit ist der Inhalt eines Applikators, beispielsweise einer Spritze oder eines Röhrchens, welches intramammär durch den Zitzenkanal in die mammäre Drüse eines laktierenden Tieres eingeführt wird. Eine einzelne Dosiseinheit der Zusammensetzung wird normalerweise 1 bis 20 Gramm, vorzugsweise zwischen 2 und 10 Gramm, der formulierten pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten. Typische Dosis-Einheiten können 6–8 Gramm der formulierten pharmezeutischen Zusammensetzung enthalten.
Die gewählte Formulierung kann in das Röhrchen oder die Spritze des üblichen Typs für die intramammäre Verabreichung eingeführt werden. Solch eine intramammäre Spritze ist mit einer Kanülendüse versehen, um in die Zitze eingeführt zu werden, um die Extrusion direkt in die mammäre Drüse über den Zitzenkanal zu gestatten.
Weiterhin liefert die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Cephalosporins und Prednisolons für die Herstellung eines Medikamentes, umfassend mindestens 20 mg Prednisolon/Dosiseinheit für die Behandlung von Mastitis bei nicht menschlichen Säugetieren.
Bei der Behandlung von klinischer Mastitis wird der Inhalt eines intramammären Injektors (Dosiseinheit) der Zusammensetzung gemäss der Erfindung wiederholt nach dem Abmelken des infizierten Euterviertels verabreicht, bis die Krankheits-Symptome verschwinden (die übliche Behandlungsdauer liegt zwischen 1–10 Tagen).
Die Erfindung liefert weiterhin die Verwendung von Prednisolon für die Herstellung eines Medikamentes, umfassend mindestens 20 mg Prednisolon/Dosiseinheit für die Behandlung von bakteriell induzierter klinischer Mastitis bei nicht menschlichen Säugetieren.
Bei der Zusammensetzung für die Behandlung von bakteriell induzierter klinischer Mastitis kann zusätzlich ein Cephalosporin wie oben beschrieben vorhanden sein.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäss der Erfindung kann hauptsächlich an alle nicht menschlichen Säugetier-Arten verabreicht werden, die eine Behandlung von klinischer Mastitis benötigen, wie beispielsweise Rinder, Kamele, Büffel, Ziegen oder Schafe. Mastitis kann jegliche Tierart betreffen, aber sie ist speziell wesentlich bei Wiederkäuern, die für die Milchproduktion für die menschliche Konsumation eingesetzt werden, wie bei Rindern, Büffeln, Schafen und Ziegen.
Beispiel 1
Herstellung der Zusammensetzung
Für eine Charge von 20 kg in einem Produktions-Gefäss (Fryma VME-20 mit Wandkratzer, Lösungsmittel und interner Kolloid-Mühle) werden 17.9 kg Erdnussöl, 4 g BHT und 1.2 kg Glycerol-Monostearat gemischt. 0.1% Wasser wird hinzugefügt und die Mischung ist bei 121°C für 1 Stunde aufgeheizt worden. Das hinzugefügte Wasser wird durch weiteres Aufheizen bei 121°C für 30 Minuten unter Stickstoff-Atmosphäre entfernt. Die Mischung wird auf 25°C abgekühlt und 803.0 g Cephapirin-Natrium und 50.4 g Prednisolon werden während dem weiteren Mischen hinzugefügt. Die Mischung wird für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur kolloidiert (unter 30°C). Die Suspension wird in intramammäre Injektoren eingefüllt.
Beispiel 2
Wirkung von verschiedenen Dosen Prednisolon bei Zeichen von lokaler Entzündung
Verfahren und Materialien
24 Kühe sind in vier Gruppen von jeweils 6 Kühen aufgeteilt worden, gemäss der Milchproduktion und Parität. Allen Kühen sind intramammär in zwei homolateralen Eutervierteln 100 μg Escherichia Coli Endotoxin (gereinigtes Lipopolysacchid (LPS) erhalten aus E. Coli 0111:B4) in 20 ml Salzlösung infundiert worden.
Die Testpräparate erhielten Cephapirin und Prednisolon in einem öligen Träger. Vier verschiedene Dosis-Niveaus von Prednisolon sind getestet worden: 0 mg (Gruppe 1), 10 mg (Gruppe 2), 20 mg (Gruppe 3) und 40 mg (Gruppe 4) je Injektor (8 g) zusammen mit 200 mg Cephapirin-Natrium.
Kühe sind mit dem Inhalt von jeweils einem Injektor je Endotoxin infundiertem Euterviertel behandelt worden, wenn die ersten Zeichen von klinischer Mastitis klar erkennbar waren, d. h. 1.5 Stunden nach der Endotoxin-Infusion. Die nächsten drei Behandlungen sind unmittelbar nach aufeinanderfolgendem Nachmittags- und Morgen-Abmelken (12 Stunden Intervall) während 2 Tagen durchgeführt worden. Insgesamt sind vier Behandlungen verabreicht worden.
Euter-Werte: Der Zustand und das Anschwellen der Euterviertel ist durch Betasten einmal täglich nach dem morgendlichen Melken vom Tag –7 bis zum Tag –1 relativ zur Endotoxin-Infusion und zweimal täglich nach dem Abmelken vom Tag +1 bis zum Tag +6 relativ zur Endotoxin-Infusion durchgeführt worden. Am Tag der Endotoxin-Infusion ist das Schwellen der Euterviertel durch Abtasten jede halbe Stunde während ±12.5 Stunden nach der Infusion festgestellt worden. Das Bewertungs-System lieferte Werte zwischen 0 und 4. Höhere Werte bezogen sich auf erhöhte und schwerere Zeichen von lokaler Entzündung.
Ergebnisse:
Die durchschnittlichen Euter-Werte sind in 1 dargestellt.
Eine klare Dosis-Wirkungs-Beziehung ist für Prednisolon und die Summer der Euter-Werte festgestellt worden. Höhere Dosierungen von Prednisolon resultierten in geringeren Summen von Euter-Werten. Die Summe der Euter-Werte, die mit 40 mg Prednisolon behandelt worden sind, war signifikant geringer von 8 Stunden nach der Infusion bis zum Abendmelken des Tages 5 im Vergleich zu den Euter-Werten der Placebo-Euterviertel (0 mg Prednisolon) und den Eutervierteln, die mit 10 mg Prednisolon behandelt worden sind. Euterviertel, die mit 20 mg Prednisolon behandelt worden sind, hatten einen geringeren Summen-Wert der Euter-Werte als die Placebo-Euterviertel während derselben Zeitdauer.
Beispiel 3
Rektal-Temperatur (systemisches Zeichen von Entzündung bei Mastitis) in Kühen mit experimenteller Streptococcus Uberis Mastitis nach intramammärer Verabreichung von Cephapirin-Natrium alleise im Vergleich zur Verabreichung von Cephapirin-Natrium + 20 mg Prednisolon zusammen und zur Nichtbehandlung
Materialien und Verfahren:
18 milchgebende Kühe sind intramammär inokuliert worden in zwei linke Euterviertel mit Streptococcus Uberis (±1000 CFU/Euterviertel). Am Tag 2 nach dem Challenge, wenn alle Kühe klinische Zeichen von Mastitis zeigten (d. h. die Vormilch-Modifikation der Euterviertel und/oder eine Euter-Schwellung) sind die Kühe in drei Gruppen von sechs Kühen aufgeteilt worden, um Gruppen mit ähnlicher Parität und Milchproduktion zu erzeugen.
Eine Gruppe ist mit Cephapirin alleine (Gruppe 1), eine Gruppe mit Cephapirin und 20 mg Prednisolon (Gruppe 2) und eine Gruppe nicht behandelt worden (Gruppe 3). Kühe, die in Gruppe 1 und Gruppe 2 inkludiert waren, sind in den zwei verbliebenen inokulierten Eutervierteln am Tag 2 nach dem Challenge behandelt worden. Die erste Behandlung ist nach einem morgendlichen Abmelken verabreicht worden und die folgenden drei Infusionen sind unmittelbar nach den drei aufeinanderfolgenden Melkvorgängen durchgeführt worden. Kühe der Gruppe 3 sind unbehandelt gelassen worden. Aufgrund des Auftretens von zu schweren klinischen Zeichen von Mastitis sind drei Kühe der unbehandelten Kontrollgruppe aus ethischen Gründen nach 2½ Tagen nach dem Challenge behandelt worden. Diese drei Kühe sind intramammär mit Cephapirin-Natrium und 20 mg Prednisolon behandelt worden. Der Inhalt eines Injektors ist in jedes herausgeforderte Euterviertel an vier aufeindanderfolgenden Abmelk-vorgängen verabreicht worden. Diese drei Kühe sind von der Kontrollgruppe ausgeschlossen worden. Die rektale Temperatur ist vom Tag 9 vor der ersten Behandlung bis zum Tag 9 nach der ersten Behandlung bestimmt worden.
Ergebnisse:
Rektal-Temperaturen sind in 2 dargestellt.
Rektal-Temperaturen, die am Tag 0 (Abend) und Tag 1 (Morgen) nach der ersten Behandlung in der mit 20 mg Prednisolon behandelten Gruppe behandelt worden sind, sind signifikant geringer gewesen als die Rektal-Temperaturen, die in den anderen Gruppen beobachtet worden sind. Nach der Behandlung mit Cephapirin alleine ist die durchschnittliche Rektal-Temperatur langsam abgesunken. Die durchschnittliche Rektal-Temperatur der unbehandelten Kühe war < 39°C bis zum Tag 2 (Abend). Die durchschnittliche Rektal-Temperatur der 3 Kühe, die später mit Cephapirin +20 mg Prednisolon behandelt worden waren, ist auf die Normal-Temperatur (< 39°C) beim nächsten Melken folgend der ersten Behandlung abgesunken.
Beispiel 4
Wirkung der intramammären Verabreichung von Prednisolon auf polymorphonukleare Leukozyten (PMN) Funktionen isoliert vom Blut und Milch von Kühen mit experimentell E. Coli Endotoxin induzierter Mastitis
Materialien und Verfahren
15 Kühe sind in drei Gruppen von jeweils 5 Kühen aufgeteilt worden, gemäss der Milchproduktion und Parität. Die Kühe sind intramammär in zwei homo-lateralen Eutervierteln mit 100 μg Escherichia Coli Endotoxin (gereinigtes Lipopolysacchid (LPS) erhalten aus E. Coli 0111:B4) in 20 ml Salzlösung infundiert worden.
Kühe sind mit den Inhalten eines Injektors je Endotoxin infundiertem Euterviertel behandelt worden, wenn die ersten Zeichen von klinischer Mastitis klar ersichtlich waren, d. h. ungefähr zwei Stunden nach der Endotoxin-Infusion. Eine Gruppe ist mit 300 mg Cehpapirin, eine Gruppe mit 300 mg Cephapirin und 20 mg Prednisolon behandelt worden und eine Gruppe ist die nicht behandelte Kontrollgruppe gewesen. Die Test-Präparate enthielten Cephapirin und Prednisolon in einem öligen Träger.
Die nächsten drei Behandlungen sind unmittelbar nach drei aufeinanderfolgenden Nachmittags- und Morgen-Melkvorgängen (12 Stunden Intervall) während 2 Tagen infundiert worden.
Blutproben sind von der Halsader 24 Stunden vor der Endotoxin-Infusion und 1.5, 8, 48 und 72 Stunden nach der Endotoxin-Infusion genommen worden.
Euterviertels-Milch aus den mit Endotoxin infundierten Eutervierteln ist 24 Stunden vor der Infusion, 1.5 Stunden nach der Infusion (d. h. 0.5 h vor der ersten Behandlung) und 8, 48 und 72 Stunden nach der Endotoxin-Infusion gesammelt worden.
Ergebnisse:

Die Wirkung auf Blut PMN: 8 Stunden nach der Endotoxin-Infusion ist der Gesamt-Leukozytenanteil im Blut geringer bei den mit Cephapirin und Prednisolon (Gruppe 3) behandelten Kühen als bei Kühen, die mit Cephapirin alleine behandelt worden sind, aber nicht unterschiedlich von der gesamten Leukozyten-Zahl im Blut der nicht behandelten Kühe (Tabelle 1 und 3). Die Abnahme der zirkulierenden Leukozyten ist das Ergebnis einer Leukopenie, die durch LPS induziert worden ist, was ein normales Phänomen ist, welches beim Prozess der Immunantwort involviert ist. Im Falle einer negativen Wirkung von Prednisolon würde diese Leukopenie unterdrückt werden, was in einer geringeren Abnahme in der Zahl der zirkulierenden Leukozyten resultieren würde. Tabelle 1: Wirkung von Prednisolon auf die Anzahl von Leukozyten im Blut von Kühen mit Endotoxin-induzierter Mastitis.

Behandlung		Anzahl der Leukozyten im Blut zu einer Zeit relativ zur Endotoxin-Infusion (Stunden)
Behandlung		–24	1.5	8	24	72
Kontrollgruppe (ohne Behandlung)	Mittelwert Stunden	9336	9229	4910	11126	11167
Kontrollgruppe (ohne Behandlung)	Mittelwert Stunden	2835	3760	1636	4946	5236
Cephapirin	Mittelwert Stunden	8217	8157	6329	12148	11317
Cephapirin	Mittelwert Stunden	1677	2218	2573	4744	4245
Cephapirin + Prednisolon	Mittelwert Stunden	8895	7734	3399	9391	9153
Cephapirin + Prednisolon	Mittelwert Stunden	2201	3093	986	2919	2855

* Behandlungen mit Cephapirin alleine oder Cephapirin und Prednisolon sind 2, 8, 24 und 36 Stunden nach der Endotoxin-Infusion gegeben worden.

Kein Unterschied in Bezug auf Maturität, Grösse, Granularität, Phagocytose und oxidativem Zerplatzen von Blut-PMN's ist zwischen Gruppe 3 und Gruppen 1 und 2 beobachtet worden.
Während ihres Reifungsprozesses hat die Grösse des PMN abgenommen, während sich die Granularität erhöhte. Oxidative Bursts sind ein Hinweis auf PMN-Aktivität. Falls Prednisolon eine negative Wirkung auf PMN hätte, würde die Grösse von PMN ansteigen, die Granularität würde absinken und/oder oxidative Bursts würden reduziert werden. Das ist jedoch nicht bei einer intramammären Infusion von 20 mg Prednisolon beobachtet worden.

24 Stunden nach der Endotoxin-Infusion ist die Chemotaxe der Blut PMN's höher in Gruppe 3 als in den Gruppen 1 und 2 (Tabelle 2 und 4) gewesen. 20 mg Prednisolon scheinen die Fähigkeit von PMN zu erhöhen, in den Euter zu migrieren, da die Chemotaxe von Blut PMN's nach der intramammären Infusion von Cephapirin und 20 mg Prednisolon anstieg. Tabelle 2: Wirkung von Prednisolon auf Chemotaxe von Leukozyten im Blut von Kühen mit Endotoxin induzierter Mastitis.

Behandlung		Chemotaktisches PMN (× 10⁵ ml) zu einer Zeit relativ zur Endotoxin-Infusion (Stunden)
Behandlung		–24	1.5	8	24	72
Kontrollgruppe (ohne Behandlung)	Mittelwert Stunden	12,37	9,96	7,60	5,11	2,02
Kontrollgruppe (ohne Behandlung)	Mittelwert Stunden	6,55	6,05	9,31	5,85	1,28
Cephapirin	Mittelwert Stunden	21,15	14,04	1,42	6,50	1,35
Cephapirin	Mittelwert Stunden	11,68	4,11	1,53	6,40	0,85
Cephapirin + Prednisolon	Mittelwert Stunden	20,01	24,49	7,70	22,96	2,65
Cephapirin + Prednisolon	Mittelwert Stunden	26,80	28,71	9,04	13,09	1,50

Wirkung auf Milch PMN: Keine Unterschiede sind bei der Chemolumineszenz von PMN's, die von Milch isoliert worden sind, zwischen den Gruppen 1,2 und 3 beobachtet worden, wie dies in der 5 dargestellt ist. Chemolumineszenz ist ein Hinweis auf PMN-Aktivität, basierend auf der Messung von Licht-Photonen, die durch reaktive Sauerstoff-Verbindungen erzeugt werden, die von der PMN-Aktivität ausgehen. Chemolumineszenz steht in starker Verbindung zu oxidativem Burst. Im Falle einer negativen Wirkung auf den Verteidigungs-Mechanismus würde ein grösserer Abfall in der Chemo-Lumineszenz beobachtet werden.
Schlussfolgerungen
Die höhere Dosierung von Prednisolon (20 mg) hatte keinen Einfluss auf Blut und Milch PMN-Morphologie und Funktionen.
Beispiel 5
Wirksamkeit einer Zusammensetzung mit 20 mg Prednisolon und einer antibakteriellen Verbindung im Vergleich zu einer Zusammensetzung mit 10 mg Prednisolon unter Einsatz-Bedingungen
Materialien und Verfahren:
Milch abgebende Kühe mit klinischer Mastitis in einem einzigen Euterviertel (571) sind intramammär mit entweder einer Zusammensetzung A (n = 260), umfassend 300 mg Cefapirin-Natrium und 20 mg Prednisolon, viermal innerhalb von einem 12 Stunden Intervall, oder mit Zusammensetzung B (n = 254), umfassend 200 mg Amoxicillin, 50 mg Clavulansäure und 10 mg Prednisolon, dreimal innerhalb von einem 12 Stunden Intervall behandelt worden. Diese Regime entsprechen den empfohlenen Dosierungen dieser Produkte.
Die Wirksamkeit der Behandlung ist durch eine bakteriologische Heilungsrate (Eliminierung des Pathogens, identifiziert am Tag 0) am Tag 14 und am Tag 21, und die klinische Heilungsrate (betroffene Euterviertel produzieren normale Milch und zeigen keine Zeichen von einer klinischen Mastitis mehr) an den Tagen 14 und 21 bestimmt worden.
Ergebnisse:
Bakteriologische Heilung: eine Kuh ist als bakteriologisch geheilt angesehen worden, wenn sowohl an den Tagen 14 und 21 die Milchproben von den betroffenen Eutervierteln frei von Pathogenen waren, die am Tag 0 vorhanden gewesen sind (bei der Zulassung vor der Behandlung). Bei klinischer Mastitis ist die Behandlung als ein Versagen betrachtet worden bei Kühen, die noch nicht an der ersten Nachbehandlungs-Probenentnahme (Tag 14) klinisch geheilt worden sind. Diese Kühe sind von der zweiten Probennahme (Tag 21) ausgeschlossen worden. Daher sind diese Kühe als nicht bakteriologisch geheilt angesehen worden (Definition gemäss den Richtlinien für die Führung von Wirksamkeits-Studien bei intramammären Produkten für den Einsatz bei Rindern EMEA/CVMP/344/99).
Klinische Heilung: Eine Kuh ist als klinisch geheilt angesehen worden am Tage der ersten Nachbehandlungs-Probenentnahme (Tag 14), wenn die Kuh normale Milch produzierte und keine Zeichen von klinischer Mastitis in dem betroffenen geheilten Euterviertel gezeigt hat (Definition gemäss den Richtlinien EMEA/CVMP/344/99).

Die Parameter in Bezug auf die Wirksamkeit sind die Ergebnis-Variablen „Bakteriologische Heilung" (Heilung/keine Heilung) und „Klinische Heilung" (Heilung/keine Heilung) Die Ergebnisse in Tabelle 3 und 6 sind als Zahlen und Prozent-Zahlen der geheilten Kühe zu verstehen. Tabelle 3: Gesamtbetrachtete bakteriologische und klinische Heilungsrate (Zahlen und Prozentsatz) nach Behandlung und Land

	Bakteriologische Heilung
Land	Zusammensetzung B			Zusammensetzung A
	Anzahl Fälle	Anzahl geheilte	Prozent geheilte	Anzahl Fälle	Anzahl geheilte	Prozent geheilte
NL	56	21	37.5	50	21	42.0
HU	39	19	48.7	45	20	44.4
FR	31	15	48.4	24	19	79.2
GB	53	17	32.1	50	23	46.0
Gesamt	179	72	40.2	169	83	49.1
Chi-Quadrat Adj. Contin. P = 0.1

	Klinische Heilung
Land	Zusammensetzung B			Zusammensetzung A
	Anzahl Fälle	Anzahl geheilte	Prozent geheilte	Anzahl Fälle	Anzahl geheilte	Prozent geheilte
NL	60	37	61.7	51	33	64.7
HU	43	32	74.4	49	37	75.5
FR	34	21	61.8	28	26	92.9
GB	54	34	63.0	51	38	74.5
Gesamt	191	124	64.9	179	134	74.9
Chi-Quadrat Adj. Contin. P = 0.049

Schlussfolgerung:
Die höhere Dosierung von Prednisolon (20 mg) beeinflusst die bakteriologische Heilungsrate nicht negativ.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung für intramammäre Verabreichung an ein nicht-menschliches Säugetier, umfassend ein Cephalosporin, Prednisolon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung mindestens 20 mg an Prednisolon/Dosiseinheit umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Cephalosporin Cephapirin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Cephalosporin das Natriumsalz von Cephapirin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Cephalosporin Cefquinom ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Cephalosporin das Sulfatsalz von Cefquinom ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie Prednisolon in einer Menge von 20 bis 40 mg/Dosiseinheit umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie Prednisolon in einer Menge von 20 bis 30 mg/Dosiseinheit umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Cephalosporin in einer Menge von 10 bis 500 mg/Dosiseinheit umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend die Schritte des Mischens von einem Öl und optional Additiven und Suspendieren des Cephalosporins und des Prednisolons in dem Träger.
Verwendung von Cephalosporin und Prednisolon für die Herstellung eines Medikamentes, umfassend mindestens 20 mg an Prednisolon/Dosiseinheit für die Behandlung von Mastitis bei nicht-menschlichen Säugetieren.