DE60318294T2

DE60318294T2 - Nachweis von invasivem Krebs induziert von HPV und dessen Vorläufer Läsionen mit Invasionspotential

Info

Publication number: DE60318294T2
Application number: DE60318294T
Authority: DE
Inventors: Christophorus Joannes Meijer; Petrus Josephus Snijders; Renske Daniela Steenbergen
Original assignee: Stichting Researchfonds Pathologie
Current assignee: Stichting Researchfonds Pathologie
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2003-03-31
Publication date: 2008-12-11
Anticipated expiration: 2023-04-01
Also published as: DE60318294D1; ES2298467T3; WO2004087962A1; US7501261B2; EP1464709B1; EP1464709A1; US20060252029A1; US20090203072A1; ATE382099T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Medizin und befasst sich mit einem molekularen diagnostischen Marker für durch humanes Papillomvirus (HPV) induzierte Karzinome und ihre Vorstufenläsionen, wie invasives Zervixkarzinom, prämaligne zervikale Läsionen mit invasivem Potential und durch humanes Hochrisiko-Papillomvirus (HPV) induzierte invasive nichtzervikale Karzinome. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung des TSLC1-Gens als Marker für HPV-induzierte invasive Karzinome und ihre Vorstufenläsionen.
Hintergrund der Erfindung
Gebärmutterhalskrebs ist bei Frauen weltweit die zweithäufigste Krebsart und ist für ungefähr 250 000 Krebstote im Jahr verantwortlich.
Die Entwicklung eines Zervixkarzinoms ist durch eine Abfolge von prämalignen Läsionen gekennzeichnet, die sogenannte zervikale intraepitheliale Neoplasie (CIN), die mit I bis III abgestuft wird, was sich auf leichte Dysplasie (CIN I), mäßige Dysplasie (CIN II) und schwere Dysplasie/Carcinoma in situ (CIN III) bezieht.
Im letzten Jahrzehnt hat sich die Erkenntnis gut etabliert, dass die zervikale Karzinogenese durch eine Infektion mit humanem Hochrisiko-Papillomvirus (HPV) eingeleitet wird. Es hat sich gezeigt, dass die Expression der viralen Oncogene E6 und E7, die den p53- bzw. den Rb-Tumorsuppressor-Weg stören, wesentlich sowohl für das Einsetzen der Onkogenese als auch für die Aufrechterhaltung eines malignen Phänotyps ist. Im Einklang mit einem mehrstufigen Vor gang der Karzinigenese sind für die Weiterentwicklung einer hr-HPV-infizierten Zelle zu einem invasiven Karzinom jedoch zusätzliche Veränderungen im Wirtszellgenom erforderlich.
Im Einklang mit multiplen Ereignissen, die der zervikalen Karzinogenese zugrunde liegen, steht die Beobachtung, dass nur ein kleiner Anteil der mit Hochrisiko-HPV infizierten Frauen prämaligne zervikale Läsionen einer hohen Stufe (CIN III) oder ein Zervikalkarzinom entwickeln, und bei den meisten Frauen mit prämalignen zervikalen Läsionen bilden sich die Läsionen spontan wieder zurück.
Zur Zeit gibt es jedoch keine Marker, mit denen sich vorhersagen lässt, welche prämalignen Läsionen sich zurückbilden werden oder letztlich zu einem Zervikalkarzinom weiterentwickeln. Daher umfasst die allgemeine medizinische Praxis die Behandlung aller Frauen mit morphologisch bestätigtem CIN II und CIN III, um die Entwicklung eines Zervikalkarzinoms zu verhindern. Folglich werden viele Frauen unnötig behandelt und machen sich unnötige Sorgen.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Es hat sich jetzt überraschenderweise gezeigt, dass das Tumorsuppressor-Gen TSLC1 (tumor suppressor lung cancer 1) als Tumorsuppressor-Gen an der zervikalen Karzinogenese beteiligt ist und dass die Stillschaltung von TSLC1 oder ein niedriges Expressionsniveau des TSLC1-Gens eine wichtige Determinante der zervikalen Karzinogenese ist. Im Vergleich zu seiner Rolle bei der Entwicklung einer Untergruppe von Lungenkarzinomen spielt die Stillschaltung von TSLC1 bei der zervikalen Karzinogenese eine noch bedeutendere Rolle. TSLC1 und seine Genprodukte stellen also wertvolle molekulare Marker dar, um invasive zervikale Läsionen zu diagnostizieren und/oder (besser) vorhersagen zu können, welche prämalignen Läsionen eine hohe Wahrscheinlichkeit haben, sich zu einem Zervixkarzinom weiterzuentwickeln.
Ein Zervixkarzinom ist fast ausschließlich mit einer Infektion durch humanes Papillomvirus (HPV) assoziiert. Humane Papillomviren bilden eine Gruppe von mehr als 100 Typen von Viren, die anhand von Variationen der DNA-Sequenz identifiziert werden. Die verschiedenen HPVs verursachen eine Vielzahl von Haut- und Schleimhauterkrankungen. Bestimmte Typen können Warzen oder Papillome verursachen, bei denen es sich um benigne (gutartige) Tumoren handelt. Bei anderen hat sich gezeigt, dass sie ein invasives Karzinom des Gebärmutterhalses verursachen.
HPVs werden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, bei infizierten Zellen maligne Veränderungen zu induzieren, grob in Niedrigrisiko- und Hochrisikotypen klassifiziert. Niedrigrisiko-HPV-Typen, wie 1, 2, 4, 6, 11, 13 und 32, sind in erster Linie mit gutartigen Läsionen oder gewöhnlichen Warzen assoziiert, während die Hochrisikotypen, wie 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 und 82, in erster Linie mit prämalignen und malignen epithelialen Läsionen assoziiert sind. Diese Hochrisikotypen von HPV verursachen ein Wachstum, das im Vergleich zu den Warzen, die von Niedrigrisikotypen, zum Beispiel HPV-6 und HPV-11, verursacht werden, gewöhnlich flach und fast unsichtbar ist.
Daher ist die vorliegende Erfindung nicht nur geeignet, um mit TSLC1 (tumor suppressor lung cancer 1) assoziiertes invasives Zervixkarzinom nachzuweisen, sondern auch andere invasive Karzinome nachzuweisen, die durch HPV, insbesondere des Hochrisikotyps, induziert werden, und gibt ein Verfahren zur Bewertung des Risikos an, dass prämaligne Läsionen invasiv werden.
Dementsprechend gibt die vorliegende Erfindung Verfahren, wie sie in Anspruch 1 definiert sind, zum Nachweis eines HPV-induzierten invasiven Karzinoms oder einer Vorstufenläsion davon, das bzw. die mit dem tumor suppressor lung cancer 1 (TSLC1) assoziiert ist, bei einem Patienten, der dessen bedarf, an, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen einer Zellkomponente einer Testzelle des Patienten mit einem Reagens, das die Menge der Zellkomponente in der Testzelle nachweist, und die Bestimmung einer Modifikation der Menge der Zellkomponente in der Testzelle im Vergleich zu einer vergleichbaren gesunden Zelle umfasst, wobei die Zellkomponente die Menge an TSLC1 in der Zelle anzeigt und die Modifikation die Anwesenheit eines HPV-induzierten invasiven Karzinoms anzeigt.
Sehr gut geeignete HPV-induzierte invasive Karzinome oder Vorstufenläsionen davon im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung sind invasive Zervixkarzinome und prämaligne zervikale Läsionen mit invasivem Potential, aber auch invasive Karzinome und prämaligne Läsionen, die durch HPV in anderen Geweben induziert werden, wie in der Mundhöhle, dem Oropharynx, Anus, Rektum, Penis, der Vulva usw.
Eine Testzelle kann eine neoplastische Zelle, eine proliferierende Zervixzelle oder irgendeine andere Zelle sein, bei der die Anwesenheit eines HPV-induzierten invasiven Karzinoms oder einer Vorstufenläsion davon, die mit TSLC1 assoziiert ist, nachgewiesen werden soll.
In einer anderen Ausführungsform gibt die vorliegende Erfindung Verfahren, wie sie in Anspruch 1 definiert sind, zum Nachweis von HPV-induzierten invasiven Karzinomen an, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen einer Zielzellkomponente einer Testzelle mit einem Reagens, das TSLC1 nachweist, und den Nachweis einer Reduktion von TSLC1 im Vergleich zu einer vergleichbaren normalen Zelle umfasst, wobei bei diesem Nachweis vorzugsweise eine erhöhte Methylierung des TSLC1-Promotors in der Testzelle und/oder eine reduzierte Produktion von TSLC1 in der Testzelle im Vergleich zu der vergleichbaren normalen Zelle bestimmt wird.
In noch einer anderen Ausführungsform gibt die vorliegende Offenbarung Verfahren zur Behandlung von durch Hochrisiko-HPV induzierten invasiven Karzinomen und ihrer Vorstufenläsionen, die mit einer Modifikation der TSLC1-Produktion in Testzellen assoziiert ist, bei einem Patienten, der dessen bedarf, an, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen von Zellen eines Patienten, der unter dem Karzinom leidet, mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Reagens umfasst, das die TSLC1-Menge in Testzellen erhöht.
In einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von molekularen diagnostischen Markern, wie sie in Anspruch 21 definiert sind, zum Nachweis von HPV-induzierten invasiven Karzinomen und deren Vorstufenläsionen, die mit dem tumor suppressor lung cancer 1 (TSLC1) assoziiert sind, wobei der Marker eine TSLC1-Promotor-Methylierung, eine Expression von mit der Produktion von TSLC1-Polypeptid assoziierter mRNA und/oder einen Allelverlust des 11q23-Chromosoms anzeigt. Durch diese Verwendung kann die Gefahr einer Weiterentwicklung zum invasiven Karzinom bestimmt werden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt den 5'-regulatorischen Bereich (–894 bis –1) von TSLC1 und codierende sowie transcribierte 3'-nichtcodierende Sequenzen (1 bis 1456), die von dem Genbank-Zugriffscodes AP_003172 bzw. NM_014333 abgeleitet sind. Das Start- und das Stopcodon sind kursiv dargestellt und unterstrichen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
"Expression" bezieht sich auf die Transcription eines Gens zu struktureller RNA (rRNA, tRNA) oder Messenger-RNA (mRNA) und gegebenenfalls die anschließende Translation zu einem Protein.
Der Ausdruck "HPV-induziertes invasives Karzinom" bezieht sich auf ein Karzinom, das durch Hochrisiko-HPV induziert ist und in das umgebende Gewebe eindringt.
Der Ausdruck "invasives Zervixkarzinom" bezieht sich auf ein Zervixkarzinom, das in das umgebende Gewebe eindringt.
Die Ausdrücke "prämaligne Läsion" und "Vorstufenläsion" beziehen sich auf ein Stadium in der mehrstufigen zellulären Entwicklung zu einem Karzinom mit einer stark erhöhten Gefahr, sich zu einem Karzinom weiterzuentwickeln. Mit der klassischen Morphologie ist der Pathologe nicht in der Lage, bei einem individuellen Patienten vorherzusagen, welche dieser Läsionen sich weiterentwickeln oder zurückbilden wird. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, mit dem sich die Weiterentwicklung zum invasiven Karzinom vorhersagen lässt.
Der Ausdruck "invasives Potential" bezieht sich auf das Potential, in umgebendes Gewebe einzudringen und folglich maligne zu werden.
Der Ausdruck "prämaligne zervikale Läsion" bezieht sich auf ein Stadium in der mehrstufigen zellulären Entwicklung zu einem Zervixkarzinom mit einer stark erhöhten Gefahr, sich zu einem Zervixkarzinom weiterzuentwickeln. Mit der klassischen Morphologie ist der Pathologe nicht in der Lage, bei einer individuellen Patientin vorherzusagen, welche dieser Läsionen sich weiterentwickeln oder zurückbilden wird.
Der Ausdruck "zum spezifischen Hybridisieren mit ... befähigt" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die zur spezifischen Basenpaarung mit einer komplementären Nucleinsäuresequenz und zur Bindung an dieselbe unter Bildung eines Nucleinsäureduplex befähigt ist.
Ein "Komplement" oder eine "komplementäre Sequenz" ist eine Sequenz von Nucleotiden, die einen durch Wasserstoffbrücken gebundenen Duplex mit einer anderen Sequenz von Nucleotiden gemäß den Basenpaarungsregeln nach Watson und Crick bildet. Z. B. ist 3'-TTCCGA-5' die komplementäre Basensequenz zu 5'-AAGGCT-3'.
Der Ausdruck "stringente Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich auf Hybridisierungsbedingungen, die die Stabilität von Hybriden beeinflussen, zum Beispiel Temperatur, Salzkonzentration, pH-Wert, Formamid-Konzentration und dergleichen. Diese Bedingungen werden empirisch optimiert, um die spezifische Bindung des Primers oder der Sonde an ihre Zielnucleinsäuresequenz zu maximieren und die unspezifische Bindung zu minimieren. Die Ausdrücke werden so verwendet, dass sie sich auch auf Bedingungen beziehen, unter denen eine Sonde oder ein Primer mit ihrer bzw. seiner Zielsequenz in einem nachweisbar höheren Ausmaß (z. B. wenigstens das Zweifache des Hintergrunds) als mit anderen Sequenzen hybridisiert. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie um etwa 5°C niedriger liegen als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. T_m ist die Temperatur (bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert), bei der 50% einer komplementären Zielsequenz mit einer vollkommen dazu passenden Sonde bzw. Primer hybridisieren. Typischerweise werden stringente Bedingungen diejenigen sein, bei denen die Salzkonzentration kleiner als etwa 1,0 M Na-Ionen ist und typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Na-Ionen-Konzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 beträgt, und die Temperatur beträgt wenigstens etwa 30°C für kurze Sonden oder Primer (z. B. 10 bis 50 Nucleotide) und wenigstens etwa 60°C für lange Sonden oder Primer (z. B. mehr als 50 Nucleotide). Stringente Bedingungen können auch durch die Zugabe von destabilisierenden Mitteln, wie Formamid, erreicht werden. Beispielhafte Bedingungen niedriger Stringenz oder "Bedingungen reduzierter Stringenz" umfassen eine Hybridisierung mit einer Pufferlösung mit 30% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und Waschen in 2×SSC bei 40°C. Beispielhafte Bedingungen hoher Stringenz umfassen eine Hybridisierung in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und Waschen in 0,1×SSC bei 60°C. Hybridisierungsverfahren sind in der Technik wohlbekannt und sind zum Beispiel in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994, beschrieben.
Der Ausdruck "Oligonucleotid" bezieht sich auf eine kurze Sequenz von Nucleotidmonomeren (gewöhnlich 6 bis 100 Nucleotide), die durch phosphorhaltige Bindungen (z. B. Phosphodiester, Alkyl- und Arylphosphat, Phosphorothioat) oder nichtphosphorhaltige Bindungen (z. B. Peptid, Sulfamat und andere) miteinander verknüpft sind. Ein Oligonucleotid kann modifizierte Nucleotide enthalten, die modifizierte Basen (z. B. 5-Methylcytosin) und modifizierte Zuckergruppen (z. B. 2'-O-Methylribosyl, 2'-O-Methoxyethylribosyl, 2'-Fluorribosyl, 2'-Aminoribosyl und dergleichen) aufweisen. Oligonucleotide können natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle von doppel- und einzelsträngiger DNA und doppel- und einzelsträngiger RNA mit zirkulärer, verzweigter oder linearer Form sein und können gegebenenfalls Domänen enthalten, die stabile Sekundärstrukturen (z. B. Stem-and-Loop- sowie Loop-Stem-Loop-Strukturen) bilden können.
Der hier verwendete Ausdruck "Primer" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das sich an das Amplifikations-Target assoziieren kann und dadurch die Anbindung einer DNA-Polymerase ermöglicht, so dass es als Einleitungspunkt der DNA-Synthese dient, wenn es Bedingungen ausgesetzt wird, bei denen die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts, das zu einem Nucleinsäurestrang komplementär ist, induziert wird, d. h. in Gegenwart von Nucleotiden und eines Polymerisationskatalysators, wie DNA-Polymerase, und bei einer geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH-Wert. Der Primer (Amplifikationsprimer) ist vorzugsweise einzelsträngig, um eine maximale Effizienz bei der Amplifikation zu erhalten. Vorzugsweise ist der Primer ein Oligodesoxyribonucleotid. Der Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten in Gegenwart eines Polymerisationskatalysators einzuleiten. Die genauen Längen der Primer hängen von vielen Faktoren ab einschließlich der Temperatur und der Quelle des Primers. Der hier verwendete Ausdruck "Paar von bidirektionalen Primern" bezieht sich auf einen Vorwärts- und einen Rückwärts-Primer, wie sie üblicherweise im Bereich der DNA-Amplifikation, wie bei der PCR-Amplifikation, verwendet werden.
Der Ausdruck "Sonde" bezieht sich auf eine einzelsträngige Oligonucleotidsequenz, die eine komplementäre Sequenz in einem Zielnucleinsäuresequenz-Analyten oder ihr cDNA-Derivat erkennt und einen über Wasserstoffbrücken verbundenen Duplex damit bildet.
Das TSLC1-Gen (tumor suppressor in lung cancer 1) (Genbank-Zugriffsnummer NM_014333) wurde ursprünglich als Tumorsuppressor-Gen in der Lungenkrebs-Zelllinie A549 durch funktionelle Komplementierungsstudien identifiziert (Kuramochi et al., 2001; Nature Genet. 27, 427-430). Es wurde gezeigt, dass die erneute Expression von TSLC1 in der Lungenkrebs-Zelllinie A549 die Tumorigenität bei Nacktmäusen unterdrückte. Außerdem wurde gezeigt, dass der Verlust oder die Unterdrückung der TSLC1-Expression in anderen Lungenkrebs-Zelllinien bei Nacktmäusen sowohl mit der Tumorigenität als auch mit der Milz-zu-Leber-Metastasierung korreliert. Es zeigte sich, dass die Unterdrückung der TSLC1-mRNA in diesen Zelllinien mit der Hypermethylierung des TSLC1-Promotors korreliert.
Die anschließende Analyse von nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen (NSCLC) ergab bei etwa 40% der Lungenkarzinome einen Allelverlust bei 11q23.2, dem TSLC1-Locus, und innerhalb dieser Gruppe von Tumoren mit Allelverlust konnte in 85% der Fälle einer Promotorhypermethylierung des anderen Allels nachgewiesen werden.
TSLC1 codiert einen Vertreter der Immunglobulin-Superfamilie von Zelladhäsionsmolekülen (IgCAMs), die aus einer Vielzahl von Zelloberflächenmolekülen besteht, die durch eine Immunglobulineinheit gekennzeichnet sind. Das TSLC1-Protein ist ein N-verknüpftes Glycoprotein von 75 kDa, das in der Zellmembran lokalisiert ist und an der intrazellulären Adhäsion über homophile trans-Wechselwirkung beteiligt ist (Masuda et al, 2002; J Biol Chem 277, 31014-31019).
Die Erfinder haben jetzt festgestellt, dass die TSLC1-Stillschaltung ein häufiges Ereignis in Zervixkarzinom-Zelllinien ist. Es zeigt sich, dass sich die TSLC1-Stillschaltung aus einer Hypermethylierung des TSLC1-Promotors ergibt, entweder in Kombination mit einem Allelverlust oder auch nicht. In-vitro-Studien zeigten eine funktionelle Beteiligung der TSLC1-Inaktivierung sowohl am verankerungsunabhängigen Wachstum als auch an der Tumorigenität von Zervixkarzinomzellen, während die Immortalität und die Proliferation nicht beeinflusst waren. Dies deutet auf eine Rolle der TSLC1-Stillschaltung bei der Tumorinvasion und nicht bei der Proliferation hin. Es war bereits bekannt, dass der Verlust eines mutmaßlichen Tumorsuppressor-Gens auf dem Chromosom 11 an der Tumorigenität von SiHa-Zervixkarzinomzellen beteiligt ist, und ein Allelverlust bei 11q22-23 wurde bei invasiven Zervixkarzinomen häufig nachgewiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Inaktivierung von TSLC1 bei 11q23.2 eine entscheidende Rolle bei der Invasion durch ein Zervixkarzinom spielen könnte.
Die Analyse von Zervix-Gewebeproben zeigte, dass die Hypermethylierung des TSLC1-Promotors nur auf eine Teilmenge der CIN-Läsionen hoher Stufe beschränkt, aber bei bis zu 58% der invasiven Zervixkarzinome nachweisbar ist. Außerdem kann die Hypermethylierung des TSLC1-Promotors spezifisch in Zervixabstrichen nachgewiesen werden, die von Frauen mit Zervixkarzinom stammen. Die Analyse von Zervixkarzinom-Zelllinien zeigte, dass die Stillschaltung der TSLC1-Expression in bis zu 91% (10/11) der Zelllinien vorhanden ist. Die TSLC1-Stillschaltung schien nicht nur mit der Methylierung des Promotors, sondern auch mit dem Allelverlust am TSLC1-Locus und noch unbekannten Ereignissen assoziiert zu sein, was vermuten lässt, dass der Prozentsatz der Zervixkarzinome, die eine Methylierung des TSLC1-Promotors zeigen, sogar noch eine Unterschätzung des tatsächlichen Prozentsatzes von Fällen ist, in denen das TSLC1-Gen stillgeschaltet ist.
Dementsprechend gibt die vorliegende Erfindung Verfahren, wie sie in Anspruch 1 definiert sind, zum Nachweis von HPV-induzierten invasiven Karzinomen und ihren Vorstufenläsionen, die mit dem tumor suppressor lung cancer 1 (TSLC1) assoziiert sind, bei einem Patienten, der dessen bedarf oder bei dem eine entsprechende Indikation besteht, an, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen einer Zellkomponente einer Testzelle des Patienten mit einem Reagens, das die Menge der Zellkomponente in der Testzelle nachweist, und die Bestimmung einer Modifikation der Menge der Zellkomponente in der Testzelle im Vergleich zu einer vergleichbaren gesunden Zelle umfasst, wobei die Zellkomponente die Menge an TSLC1 in der Zelle anzeigt und die Modifikation die Anwesenheit von HPV-induzierten invasiven Karzinomen und ihren Vorstufenläsionen anzeigt.
Die Testzelle des Patienten kann eine Zelle aus einer Probe von Hautzellen (z. B. in Falle von Warzen, Verrucae und dergleichen, die vermutlich durch kutane HPV-Infektionen verursacht werden), einer Probe von Schleimhautzellen, wie Zervixzellen, und auch von anderem Gewebe, wie Mundhöhle, Oropharynx, Penis, Vulva, Anus, Rektum und anderen Geweben, bei denen ein mit HPV assoziiertes Karzinom nachgewiesen werden soll, umfassen. Alle solchen Proben können in einem Verfahren der vorliegenden Erfindung als Probe verwendet werden. Vorzugsweise umfasst eine Probe von Zellen eines Patienten Zervixzellen als Testzellen.
Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung ist besonders gut für den Nachweis von HPV-induzierten invasiven Karzinomen und ihre Vorstufenläsionen, die mit dem tumor suppressor lung cancer 1 (TSLC1) assoziiert sind und durch Hochrisiko-HPVs induziert werden, geeignet. Ein Verfahren zum Nachweis von HPV-induzierten invasiven Karzinomen und ihren Vorstufenläsionen, die mit dem tumor suppressor lung cancer 1 (TSLC1) assoziiert sind, kann sich dementsprechend auf die Messung der TSLC1-Expression beziehen, wie etwa in Form einer Messung von TSLC1-Gen-Transcripten und/oder anschließenden Proteinen, die ausgehend von diesen Transcripten translatiert werden. Ein Verfahren zum Nachweis von HPV-induzierten invasiven Karzinomen und ihren Vorstufenläsionen kann auch die Messung der Methylierung des TSLC1-Promotors als Hinweis auf die TSLC1-Expressionskapazität und/oder die TSLC1-Proteinproduktionskapazität umfassen.
1 zeigt den CG-reichen Promotorbereich stromaufwärts des ATG-Startcodons im TSLC1-Gens und den codierenden Bereich für das TSLC1-Protein. Die Methylierung des CG-reichen Promotorbereichs führt zu einer stark reduzierten Transcription oder sogar zu einer vollständigen Blockierung der Transcription. Daher liefert der Promotorbereich eine positive Markersequenz für das Expressionspotential dieses Gens. Alternativ dazu kann die Expression des TSLC1-Gens auch durch Messen der Gentranscripte nachgewiesen werden. Als solcher liefert der codierende Bereich für das TSLC1-Protein in diesem Gen eine Markersequenz für den Nachweis von Transcripten des Gens. In noch einer anderen Alternative kann die Expression des TSLC1-Gens nachgewiesen werden, indem man das TSLC1-Protein direkt misst.
Die in Kontakt gebrachte Testzellkomponente kann also eine Nucleinsäure, wie DNA oder RNA, vorzugsweise mRNA, oder ein Protein sein. Wenn eine Zellkomponente ein Protein ist, ist das Reagens typischerweise ein Anti-TSLC1-Antikörper. Wenn die Komponente eine Nucleinsäure ist, ist das Reagens typischerweise eine Nucleinsäuresonde (DNA oder RNA) oder ein Primer (PCR-Primer). Durch Verwendung solcher Sonden oder Primer können zum Beispiel Genexpressionsprodukte, wie mRNA, nachgewiesen werden. Wenn die Komponente eine Nucleinsäure ist, kann das Reagens alternativ dazu auch eine Restriktions-Endonuclease sein, vorzugsweise eine methylierungsempfindliche Restriktions-Endonuclease zum Nachweis der Anwesenheit von Methylgruppen an der Nucleinsäure der Testzelle, wobei es sich bei der Nucleinsäure der Testzelle dann vorzugsweise um DNA handelt.
Die Testzellkomponente kann direkt in situ nachgewiesen werden, oder sie kann durch übliche Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, von anderen Zellkomponenten isoliert werden, bevor man sie mit dem Reagens in Kontakt bringt (siehe zum Beispiel "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. 1995, 4. Auflage, John Wiley and Sons; "A Laboratory Guide to RNA: Isolation, analysis, and synthesis", Krieg (Hrsg.), 1996, Wiley-Liss; "Molecular Cloning: A laboratory manual", J. Sambrook, E. F. Fritsch, 1989, 3 Bände, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Zu den Nachweisverfahren gehören Analysen wie Southern- und Northern-Blot-Analysen, RNase-Schutz, Immunoassays, in-situ-Hybridisierung, PCR (Mullis 1987, US-Patente Nr. 4,683,195 , 4,683,202 und 4,800,159 ), LCR (Barany 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193; EP-Anmeldung Nr. 320,308 ), 3SR (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), SDA ( US-Patente Nr. 5,270,184 und 5,455,166 ), TAS (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), Q-Beta-Replicase (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6: 1197), Rolling Circle Amplication (RCA) oder andere Verfahren zur Amplifikation von DNA. In einem alternativen Verfahren kann RNA auch durch Verfahren wie NASBA (L. Malek et al., 1994, Meth. Molec. Biol. 28, Ch. 36, Isaac PG, Hrsg., Humana Press, Inc., Totowa, NJ) oder TMA nachgewiesen werden.
Nucleinsäuresonden, Primer und Antikörper können durch Markieren nachweisbar gemacht werden, zum Beispiel mit einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Verbindung, einer biolumineszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung, einem Metallchelator oder einem Enzym. Der Fachmann wird andere geeignete Marker zur Bindung an die Reagentien kennen oder mit Routineexperimenten herausfinden können.
Andere Verfahren zum Nachweis umfassen solche Analysen, die mit Nucleinsäurearrays durchgeführt werden können (siehe u. a. Chee et al., 1996, Science 274 (5287): 610-614). Zum Nachweis von Nucleinsäuren gemäß der Erfindung können zum Beispiel DNA-Arrays verwendet werden. Solche Arrays umfassen Oligonucleotide mit Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit der Nucleinsäure-Zellkomponente hybridisieren können, deren Menge in einem Verfahren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wird.
Da die vorliegende Erfindung zeigt, dass ein reduziertes Niveau der TSLC1-Transcription häufig das Ergebnis einer Hypermethylierung des TSLC1-Gens ist, ist es häufig wünschenswert, direkt zu bestimmen, ob das TSLC1-Gen hypermethyliert ist. Insbesondere sind die cytosinreichen Bereiche, die "CpG-Inseln" genannt werden und in den 5'-regulatorischen Bereichen von Genen liegen, normalerweise unmethyliert. Der Ausdruck "Hypermethylierung" umfasst jede Methylierung von Cytosin in einer Position in der TSLC1-Gensequenz, die normalerweise unmethyliert ist (z. B. der TSLC1-Promotor). Hypermethylierung kann zum Beispiel durch Restriktions-Endonuclease-Behandlung des TSLC1-Polynucleotids (Gens) und Southern-Blot-Analyse nachgewiesen werden. Daher ist es in einem erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem es sich bei der nachgewiesenen zellulären Komponente um DNA handelt, bevorzugt, die Hypermethylierung des TSLC1-Gens nachzuweisen. Jede Restriktions-Endonuclease, die CG als Bestandteil ihrer Erkennungsstelle umfasst und die gehemmt wird, wenn das C methyliert ist, kann verwendet werden. Methylierungsempfindliche Restriktions-Endonucleasen, wie BssHII, MspI, NotI oder HpaII, die allein oder in Kombination verwendet werden, sind Beispiele für solche Endonucleasen.
Weitere methylierungsempfindliche Restriktions-Endonucleasen werden dem Fachmann bekannt sein.
Weitere Verfahren zum Nachweis der Hypermethylierung des TSLC1-Promotors beinhalten die Bisulfit-Modifikation von DNA, bei der die unmethylierten Cytosine in ein Uracil umgewandelt werden, während die methylierten Cytosine vor chemischer Modifikation geschützt sind. Die anschließende PCR-Amplifikation und Sequenzierung zeigt, ob Cytosine in CpG-Inseln im Falle einer Methylierung erhalten bleiben oder im Falle eines unmethylierten Zustands durch ein Uracil ersetzt werden. Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Behandlung eines PCR-amplifizierten Produkts, das aus Bisulfit-modifizierter DNA erzeugt wurde, mit einer Restriktions-Endonuclease, die CG als Bestandteil ihrer Erkennungsstelle beinhaltet.
Ein alternatives Mittel, um auf methylierte Sequenzen zu testen, ist eine methylierungsspezifische PCR, die ebenfalls auf der Bisulfit-Modifikation von DNA beruht, worauf spezifische PCR-Reaktionen folgen, die auf CpG-reiche Sequenzen abzielen.
Für die Zwecke der Erfindung kann ein für TSLC1 spezifischer Antikörper (d. h. ein Anti-TSLC1-Antikörper) oder eine für TSLC1 spezifische Nucleinsäuresonde verwendet werden, um die Anwesenheit von TSLC1-Polypeptid (unter Verwendung von Antikörper) oder TSLC1-Polynucleotid (unter Verwendung einer Nucleinsäuresonde) in biologischen Flüssigkeiten oder Geweben nachzuweisen. Oligonucleotid-Primer, die auf einem codierenden Sequenzbereich und einem regulatorischen Sequenzbereich in der TSLC1-Sequenz beruhen, sind geeignet, um DNA zu amplifizieren, zum Beispiel durch PCR.
Wenn man PCR-Primer, Nucleinsäuresonden oder Restriktions-Endonucleasen verwendet, werden der 5'-regulatorische Bereich und die codierende Sequenz der TSLC1-Sequenz analysiert.
Jede Probe, die eine nachweisbare Menge an TSLC1-Polynucleotid oder TSLC-1-Polypeptid-Antigen enthält, kann verwendet werden. Eine Nucleinsäure kann auch durch RNA-in-situ-Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, analysiert werden, wie durch in-situ-Hybridisierung. Zu den bevorzugten Proben zum Testen gemäß Verfahren der Erfindung gehören Proben wie (Zervix-)Abstriche und/oder (Zervix-)Biopsien und dergleichen. Vorzugsweise werden cytologisch abnormale (Zervix-)Abstriche und/oder Biopsien von (prä)malignen Läsionen hoher Stufe als Proben zum Testen verwendet. Der Patient kann zwar ein beliebiger Säuger sein, ist jedoch vorzugsweise ein Mensch.
In den erfindungsgemäßen Verfahren können Antikörper, die gegenüber TSLC1-Polypeptid immunreaktiv sind, dessen vorhergesagte Aminosäuresequenz unter der GenBank-Zugriffsnummer BAA75822 erhältlich ist, oder immunreaktive Fragmente davon verwendet werden. Antikörper, der im Wesentlichen aus gepoolten monoklonalen Antikörpern mit unterschiedlichen epitopischen Spezifitäten besteht, sowie gesonderte monoklonale Antikörperpräparate können verwendet werden. Monoklonale Antikörper werden nach dem Fachmann bekannten Verfahren aus antigenhaltigen Fragmenten des Proteins hergestellt (Kohler et al., Nature, 256: 495, 1975).
Der in dieser Erfindung verwendete Ausdruck Antikörper soll intakte Moleküle sowie Fragmente davon, wie Fab und F(ab')2, die eine epitopische Determinante an TSLC1 binden können, umfassen.
Monoklonale Antikörper können in den erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahren verwendet werden, zum Beispiel in Immunoassays, in denen sie in flüssiger Phase oder gebunden an einen Festphasenträger verwendet werden können. Außerdem können die monoklonalen Antikörper in diesen Immunoassays in verschiedener Weise nachweisbar markiert werden. Beispiele für Typen von Immunoassays, in denen monoklonale Antikörper der Erfindung verwendet werden können, sind kompetitive und nichtkompetitive Immunoassays in einem direkten oder indirekten Format. Beispiele für solche Immunoassay sind der Radioimmunoassay (RIA) und der Sandwich-Assay (immunometrische Assay).
Der Nachweis der Antigene unter Verwendung der monoklonalen Antikörper der Erfindung kann mit Hilfe von Immunoassays erfolgen, die entweder im Vorwärts-, Rückwärts- oder im simultanen Modus durchgeführt werden, einschließlich immunhistochemischer Assays an physiologischen Proben. Der Fachmann wird auch andere Immunoassayformate kennen oder ohne unzumutbare Experimente leicht ausmachen können.
Monoklonale Antikörper können an viele verschiedene Träger gebunden und zum Nachweis der Anwesenheit von TSLC1 verwendet werden. Beispiele für wohlbekannte Träger sind Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Der Träger kann für die Zwecke der Erfindung entweder löslicher oder unlöslicher Natur sein. Der Fachmann wird andere geeignete Träger für die Bindung monoklonaler Antikörper kennen oder ohne unzumutbare Experimente herausfinden können.
Bei der Durchführung der Assays kann es wünschenswert sein, bestimmte "Blocker" im Inkubationsmedium mitzuverwenden (gewöhnlich mit dem markierten löslichen Antikörper versetzt). Die "Blocker" werden hinzugefügt, um zu gewährleisten, dass unspezifische Proteine, Proteasen oder antiheterophile Immunglobuline gegen in der experimentellen Probe vorhandene Anti-TSLC1-Immunglobuline die Antikörper auf dem Festphasenträger oder den radioaktiv markierten Indikatorantikörper nicht vernetzen oder zerstören und somit falsche positive oder falsche negative Ergebnisse liefern. Die Auswahl von "Blockern" kann daher wesentlich zur Spezifität der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Assays beitragen. Mehrere unerhebliche (d. h. unspezifische) Antikörper derselben Klasse oder Unterklasse (Isotyp), wie sie in den Assays verwendet werden (z. B. IgG1, IgG2a, IgM usw.), können als "Blocker" verwendet werden. Die Konzentration der "Blocker" (normalerweise 1–100 g/μl) kann wichtig sein, um die richtige Empfindlichkeit aufrechtzuerhalten und dennoch jede unerwünschte Interferenz durch gegenseitig vorkommende kreuzreaktive Proteine in der Probe zu hemmen.
Bei der Verwendung eines monoklonalen Antikörpers für den in-vivo-Nachweis von Antigen wird der nachweisbar markierte monoklonale Antikörper in einer Dosis verabreicht, die diagnostisch wirksam ist. Der Ausdruck "diagnostisch wirksam" bedeutet, dass die Menge des nachweisbar markierten monoklonalen Antikörpers in ausreichender Menge verabreicht wird, um den Nachweis der Stelle mit dem TSLC1-Antigen, für das die monoklonalen Antikörper spezifisch sind, zu ermöglichen. Die Konzentration des nachweisbar markierten monoklonalen Antikörpers, der verabreicht wird, sollte ausreichend sein, so dass die Bindung an Zellen, die TSLC1 aufweisen, im Vergleich zum Hintergrund nachweisbar ist, je nachdem, welches in-vivo-Bildgebungs- oder Nachweisverfahren eingesetzt wird, wie MRI, CAT-Scan und dergleichen. Weiterhin ist es wünschenswert, dass der nachweisbar markierte monoklonale Antikörper schnell aus dem Kreislaufsystem entfernt wird, so dass man das beste Target-Hintergrund-Signalverhältnis erhält.
Gewöhnlich variiert die Dosierung des nachweisbar markierten monoklonalen Antikörpers für die in-vivo-Diagnose je nach Faktoren wie Alter, Geschlecht und Ausmaß der Krankheit des Individuums. Die Dosierung des monoklonalen Antikörpers kann von etwa 0,001 mg/m² bis etwa 500 mg/m², vorzugsweise 0,1 mg/m² bis etwa 200 mg/m² und am meisten bevorzugt etwa 0,1 mg/m² bis etwa 10 mg/m² variieren. Solche Dosierungen können zum Beispiel in Abhängigkeit davon, ob mehrere Injektionen gegeben werden, der Tumorbelastung und anderen Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind, variieren.
Für die diagnostische in-vivo-Bildgebung ist die Art des verfügbaren Nachweisinstruments ein wesentlicher Faktor bei der Auswahl eines gegebenen Radioisotops. Das gewählte Radioisotop muss einem Zerfallstyp angehören, der für einen gegebenen Instrumententyp nachweisbar ist. Noch ein weiterer wichtiger Faktor bei der Auswahl eines Radioisotops für die in-vivo-Diagnose besteht darin, dass die Halbwertszeit des Radioisotops lang genug sein muss, so dass es zum Zeitpunkt der maximalen Aufnahme durch das Target noch nachweisbar ist, aber kurz genug sein muss, dass die Strahlungsbelastung des Wirts minimiert wird. Idealerweise weist ein Radioisotop, das für die in-vivo-Bildgebung verwendet wird, keine Teilchenemission auf, sondern produziert eine große Zahl von Photonen im Bereich von 140–250 keV, die leicht mit herkömmlichen Gammakameras nachgewiesen werden können.
Für die in-vivo-Diagnose können Radioisotope entweder direkt oder indirekt durch Verwendung einer funktionellen Zwischengruppe an Immunglobulin gebunden werden. Funktionelle Zwischengruppen, die häufig verwendet werden, um Radioisotope, die als Metallionen vorliegen, an Immunglobuline zu binden, sind die bifunktionellen Chelatbildner, wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und ähnliche Moleküle. Typische Beispiele für Metallionen, die an die monoklonalen Antikörper der Erfindung gebunden werden können, sind ¹¹¹In, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ⁸⁹Zr und ²⁰¹Tl.
Ein monoklonaler Antikörper, der für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, kann auch für Zwecke der in-vivo-Diagnose mit einem paramagnetischen Isotop markiert werden, wie bei der Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) oder der Elektronenspinresonanz (ESR). Im Allgemeinen kann jedes herkömmliche Verfahren zur sichtbarmachenden diagnostischen Bildgebung verwendet werden. Gewöhnlich werden Gammastrahlen und Positronen emittierende Radioisotope für die Kamerabildgebung und paramagnetische Isotope für MRI verwendet. Zu den Elementen, die für solche Techniken besonders gut geeignet sind, gehören ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr und ⁵⁶Fe.
Weitere diagnostische Verfahren, zum Beispiel ex-vivo-Verfahren, zum Nachweis der TSLC1-Produktion, TSLC1-Gen-Expression oder Störungen derselben sind Verfahren, bei denen eine Probe zum Testen bereitgestellt wird, wobei die Probe ein Zellpräparat aus Zervix- oder anderem Gewebe umfasst. Vorzugsweise werden solche Proben als Abstriche bereitgestellt. Um für effiziente Testschemata zu sorgen, werden cytologisch abnormale (Zervix-)Abstriche und/oder Biopsien von (prä)malignen Läsionen hoher Stufe als Proben zum Testen verwendet.
Eine Gewebeprobe, die von einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen, erhalten wird, wird zweckmäßigerweise vorbehandelt, um einen Kontakt zwi schen einer Zielzellkomponente einer in der Probe enthaltenen Testzelle mit einem Reagens, das TSLC1 nachweist, zu ermöglichen und eine Reduktion des TSLC1 im Vergleich zu einer vergleichbaren normalen Zelle nachzuweisen. Proben können auf einem geeigneten Träger montiert sein, um die Beobachtung von individuellen Zellen zu ermöglichen. Beispiele für wohlbekannte Trägermaterialien sind Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Polyurethan, die gegebenenfalls mit Schichten versehen sind, um die Zelladhäsion und Immobilisierung der Probe zu verbessern, wie Schichten aus Poly-L-lysin oder Silan. Zervixabstriche oder -biopsien können zum Beispiel wie für den Papanicolaou(Pap)-Test oder irgendeine geeignete Modifikation davon, die der Fachmann kennt, hergestellt und durch Verfahren, die einen ordentlichen Zugang zur Zielkomponente für das Reagens ermöglichen, fixiert werden. Wenn eine Lagerung erforderlich ist, verwenden Routineverfahren für die Fixierung gepuffertes Formalin mit anschließender Einbettung in Paraffin, was für eine wohlkonservierte Infrastruktur des Gewebes sorgt. Um eine immunhistochemische Färbung oder Immunfluoreszenzfärbung zu ermöglichen, muss die Antigenität des Probenmaterials wiedererlangt oder demaskiert werden. Ein Verfahren zur Wiedererlangung der Antigenität von mit Formaldehyd vernetzten Proteinen beinhaltet die Behandlung der Probe mit proteolytischen Enzymen. Dieses Verfahren führt zu einem (partiellen) Verdau des Materials, und für die Antikörper sind lediglich Fragmente der ursprünglichen Proteine zugänglich.
Ein weiteres Verfahren zur Wiedererlangung der Immunreaktivität von mit Formaldehyd vernetzten Antigenen beinhaltet die thermische Verarbeitung mit Hilfe von Wärme- oder Hochenergiebehandlung der Proben. Ein solches Verfahren ist zum Beispiel im US-Patent Nr. 5,244,787 beschrieben. Noch ein weiteres Verfahren zur Wiedererlangung von Antigenen aus mit Formaldehyd fixierten Geweben ist die Verwendung eines Dampfkochtopfs, entweder in Kombination mit einem Mikrowellenofen oder in Form eines Autoklaven, wie es zum Beispiel in Norton, 1994, 3. Pathol. 173(4): 371-9, und Taylor et al. 1996, Biotech Histochem 71(5): 263-70, beschrieben ist.
Mehrere Alternativen zu Formaldehyd können verwendet werden, wie Ethanol, Methanol, Methacarn oder Glyoxal, citrat-versetztes Aceton, oder es können Fixierungsmittel in Kombination verwendet werden. Alternativ dazu kann die Probe vor der Weiterverarbeitung auch luftgetrocknet werden.
Um einen Nachweis mit Nucleinsäuresonden zu ermöglichen, muss das Probenmaterial im Falle von formalinfixiertem und in Paraffin eingebettetem Material wiederhergestellt oder demaskiert werden. Ein Verfahren beinhaltet die Behandlung mit proteolytischen Enzymen und eine Nachfixierung mit Paraformaldehyd. Dem proteolytischen Verdau kann ein Denaturierungsschritt in HCl vorangehen. Dieses Verfahren führt zu einem (partiellen) Verdau des Materials, was Sonden den Zugang zum Target ermöglicht. Im Falle von nicht formalinfixiertem Material, z. B. gefrorenem Material, sind keine spezifischen Demaskierverfahren erforderlich. Vor der Hybridisierung können die Proben durch Behandlung mit Triethanolamin-Puffer acetyliert werden.
Dann werden die Nucleinsäuresonden oder Antikörper in einem geeigneten Puffer mit dem Probenmaterial in Kontakt gebracht und spezifisch mit ihrem Nucleinsäure- oder Proteinziel hybridisieren oder daran binden gelassen. Nach der spezifischen Bindung der Nucleinsäuresonden oder Antikörper an die Zielkomponenten können markierte Sonden und/oder Antikörper mit Verfahren wie konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie, Hellfeldmikroskopie, Durchflusscytometrie, gegebenenfalls in Kombination mit fluoreszenzassoziierter Zellsortierung, oder Modifikationen dieser Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind, nachgewiesen werden.
In einer Ausführungsform eines Verfahrens der Erfindung wird eine erhöhte Methylierung des TSLC1-Promotors in der Testzelle und/oder eine reduzierte Produktion von TSLC1 in der Testzelle im Vergleich zur vergleichbaren normalen Zelle nachgewiesen.
In der vorliegenden Offenbarung werden auch Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit HPV-induzierten invasiven Karzinomen, die mit einer Modifikation der TSLC1-Produktion assoziiert sind oder eine solche anzeigen, angegeben, welche die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Reagens, das die TSLC1-Expression erhöht, an einen Patienten mit dem Karzinom umfasst. Bei HPC-induzierten invasiven Karzinomen, die mit dem tumor suppressor lung cancer 1 (TSLC1) assoziiert sind, ist die TSLC1-Nucleotidsequenz im Vergleich zur Expression in einer normalen Zelle unterexprimiert, und daher ist es möglich, geeignete therapeutische oder diagnostische Techniken zu entwerfen, die auf diese Sequenz gerichtet sind. So können Nucleinsäuresequenzen, die die TSLC1-Expression auf dem Transcriptions- oder Translationsniveau erhöhen, verwendet werden, und zum Beispiel könnten Nucleinsäuresequenzen, die TSLC1 (Sense) codieren, dem Patienten mit dem HPV-induzierten invasiven Karzinom, wie dem invasiven Zervixkarzinom, verabreicht werden.
Der Ausdruck "invasives Zervixkarzinom" bezeichnet maligne sowie prämaligne Zellpopulationen, die sich häufig sowohl morphologisch als auch genotypisch von dem umgebenden Gewebe zu unterscheiden scheinen. Es zeigt sich, dass diese Störungen mit der Abwesenheit oder reduzierten Expression von TSLC1 assoziiert sind. Im Wesentlichen könnte jede Testzellenabnormität, die ätiologisch mit der Expression von TSLC1 verknüpft ist, als mit Verfahren der vorliegenden Erfindung, bei denen ein Reagens zur Erhöhung der TSLC1-Expression eingesetzt wird, behandlungsfähig gelten.
Eine erhöhte TSLC1-Expression kann durch Unterdrückung der Methylierung des TSLC1-Polynucleotids erreicht werden, wenn TSLC1 unterexprimiert ist. Wenn nach der Diagnose gemäß der vorliegenden Erfindung das nachgewiesene HPV-induzierte Karzinom mit der TSLC1-Expression assoziiert ist, können methylierungsunterdrückende Reagentien, wie 5-Azacytidin, in eine Zelle eingeführt werden. Alternativ dazu kann, wenn nach der Diagnose gemäß der vorliegenden Erfindung das nachgewiesene invasive Zervixkarzinom mit einer Unterexpression des TSLC1-Polypeptids assoziiert ist, eine Sense-Polynucleotidsequenz (der codierende DNA-Strang), die TSLC1-Polypeptid codiert, oder 5'-regulatorische Nucleotidsequenzen (d. h. ein Promotor) von TSLC1 in funktioneller Verknüpfung mit TSLC1-Polynucleotid in die Zelle eingeführt werden. Es könnten auch in der Technik bekannte Demethylasen verwendet werden, um die Methylierung zu entfernen.
Die vorliegende Offenbarung gibt auch eine Gentherapie für die Behandlung von HPV-induziertem Karzinom, das mit einer Modifikation der TSLC1-Produktion assoziiert ist, an. Eine solche Therapie würde ihre therapeutische Wirkung durch Einführung des geeigneten TSLC1-Polynucleotids, das ein TSLC1-Struktur-Gen enthält (Sense), in Zellen von Patienten mit HPV-induziertem Karzinom erreichen. Schemata und Verfahren zur Durchführung einer gentherapeutischen Behandlung sind in der Technik bekannt, zum Beispiel in WO 02/14557 . Die Verabreichung von Sense-TSLC1-Polynucleotidkonstrukten kann erreicht werden, indem man einen Expressionsvektor verwendet oder indem man ein kolloidales Dispersionssystem verwendet, vorzugsweise einen rekombinanten Expressionsvektor, wobei der rekombinante Expressionsvektor vorzugsweise ein Plasmid, ein Viruspartikel oder ein Phage ist.
Bei den in den Verfahren der Erfindung verwendeten Polynucleotidsequenzen kann es sich um die native, unmethylierte Sequenz oder alternativ dazu um eine Sequenz handeln, bei der innerhalb der Sequenz ein nichtmethylierbares Analogon verwendet wird. Vorzugsweise ist das Analogon ein nichtmethylierbares Analogon von Cytidin, wie 5-Azacytidin. Dem Fachmann werden weitere Analoga bekannt sein. Alternativ dazu könnten solche nichtmethylierbaren Analoga einem Patienten auch allein oder gleichzeitig mit einem strukturellen Sense-Gen für TSLC1 oder einem Sense-Promotor für TSLC1, der funktionell mit dem TSLC1-Struktur-Gen verknüpft ist, als Wirkstofftherapie verabreicht werden. Vorzugsweise ist das in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete TSLC1-Polynucleotid von einem Säugerorganismus und am meisten bevorzugt von einem Menschen abgeleitet.
Der Allelverlust des TSLC1-Locus (oder LOH) kann durch PCR-Amplifikation von polymorphen Sequenzen, die das TSLC1-Gen flankieren, nachgewiesen werden. Sowohl DNA von Testzellen als auch von gesunden Zellen desselben Individuums werden PCR-amplifiziert. Die zwei PCR-Fragmente, die die beiden Allele darstel len, werden auf einem Polyacrylamid-Gel durch Kapillarelektrophorese getrennt. PCR-Produkte, die von DNA von gesunden Zellen und von Testzellen abgeleitet sind, werden miteinander verglichen, wobei der Verlust von einem von zwei PCR-Fragmenten in Testzellen auf einen Allelverlust/eine genetische Deletion des TSLC1-Locus hinweist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Kit, wie er in Anspruch 22 definiert ist, zur Verwendung bei einem Verfahren zum Nachweis von HPV-induzierten invasiven Karzinomen und deren Vorstufenläsionen, die mit dem tumor suppressor lung cancer 1 (TSLC1) assoziiert sind, in Testzellen eines Patienten bereit. Ein solcher Kit kann zweckmäßigerweise einen Pinsel oder Spatel zur Entnahme einer (zervikalen) Ausschabung zusammen mit einem Behälter, der mit Sammelmedium zur Entnahme von Testzellen gefüllt ist, umfassen. Alternativ dazu wird auch eine Probeentnahmevorrichtung, die aus einer Spülungsspritze, einem Einwegharnkatheter für Frauen und einem Behälter mit Spülungsflüssigkeit besteht, dabei sein, um zervikale Zellen durch cervicovaginale Spülung zu entnehmen.
Ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung kann Primer und Sonden für den Nachweis der TSLC1-Promotor-Methylierung, für den Nachweis von Allelverlusten am Chromosom 11823.2 oder für den Nachweis der TSLC1-mRNA-Expression umfassen. In einer anderen Ausführungsform kann ein Kit gemäß der Erfindung Antikörper und Reagentien zum Nachweis einer TSLC1-Proteinexpression in zervikalen Ausschabungen oder Gewebeproben umfassen.
Ein Kit gemäß der Erfindung umfasst Mittel zum Nachweis der TSLC1-Promotor-Methylierung oder der TSLC1-Expression, wie TSLC-1-spezifische Antikörper, methylierungsempfindliche Restriktionsenzyme oder Sonden oder Primer, die mit der Nucleotidsequenz von 1 hybridisieren können.
In noch einer anderen alternativen Ausführungsform des Kits der Erfindung können die Mittel zum Nachweis der TSLC1-Promotor-Methylierung oder der TSLC1-Expression mit Mitteln zum Nachweis einer HPV-Infektion, vorzugsweise für den Nachweis einer HPV-Infektion des Hochrisikotyps, kombiniert sein. Solche Mittel können HPV-spezifische Primer oder Sonden, wie sie in der Technik bekannt sind, umfassen.
Die vorliegende Erfindung wird jetzt anhand der folgenden nichteinschränkenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele
Beispiel 1a. Häufige TSLC1-Stillschaltung in Zervixkarzinom-Zelllinien
Die TSLC1-mRNA-Expressionsniveaus wurden in 11 Zervixkarzinom-Zelllinien durch quantitative Echtzeit RT-PCR unter Verwendung der Lightcycler-Technologie (Roche) gemessen. Im Vergleich zu normalen primären Epithelzellen war TSLC1-mRNA in 8 der 11 Zelllinien nicht nachweisbar und in weiteren 2 Zelllinien stark reduziert, was zeigt, dass die Herunterregulierung von TSLC1 in 91% (10/11) der analysierten Zervixkarzinom-Zelllinien zu sehen ist.
Andererseits war die TSLC1-Expression in HPV-immortalisierten Zellen noch reichlich vorhanden. Diese HPV-immortalisierten Zellen sind noch nicht tumorigen, und es wurde bereits gezeigt, dass sie in vivo repräsentativ für prämaligne zervikale Läsionen sind.
Anschließend wurde die Analyse der Mechanismen, die der Herunterregulierung von TSLC1 zugrunde liegen, vorgenommen. Neben genetischen Ereignissen, d. h. Deletionen und inaktivierenden Mutationen, können epigenetische Ereignisse zu einer Gen-Stillschaltung führen, wie es für Lungenkarzinome beschrieben wurde [Kuramochi et al., 2001].
Beispiel 1b. Rolle der Methylierung bei der TSLC1-Stillschaltung in Zervixkarzinomzellen
Um zu bewerten, ob der TSLC1-Stillschaltung in Zervixkarzinomzellen ein Methylierungsereignis zugrunde liegt, wurden die Zelllinien SiHa, HeLa und CaSki mit dem Methylierungsinhibitor 5-Azacytidin behandelt. Die TSLC1-mRNA-Konzentrationen wurden mit Expressionsniveaus in primären Epithelzellen verglichen, die auf 100% gesetzt wurden. Nach 5 bis 7 Tagen Inkubation mit 5-Azacytidin wurden die TSLC1-Expressionsniveaus in SiHa von 0% auf 26% und in HeLa- und CaSki-Zellen von 4% auf 70% bzw. von 0% auf 33% hochreguliert. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Herunterregulierung von TSLC1 in allen diesen 3 Zelllinien wenigstens teilweise aus einem Methylierungsereignis resultiert.
Dann wurde die TSLC1-Promotor-Methylierung durch radioaktive Bisulfit-Sequenzierung untersucht. Es zeigte sich, dass bei 9/11 Zervixkarzinom-Zelllinien alle 6 sequenzierten CpG-Stellen methyliert waren. Außer bei einer Zelllinie wurden in diesen Zelllinien keine Wildtypsequenzen nachgewiesen, was darauf hinweist, dass die TSLC1-Promotor-Methylierung klonal erfolgte. In den übrigen 2 Zelllinien war keine der CpG-Stellen methyliert. Außer bei einer Zelllinie war die TSLC1-Promotor-Methylierung mit einer reduzierten oder nicht nachweisbaren TSLC1-mRNA-Expression korreliert. Bei 4 Isolaten von normalen Epithelzellen und bei den nichttumorigenen HPV-immortalisierten Zellen wurde keine TSLC1-Promotor-Methylierung nachgewiesen.
Beispiel 1c. Rolle einer chromosomalen Deletion bei der TSLC1-Stillschaltung
Um zu analysieren, ob eine chromosomale Deletion einer TSLC1-Stillschaltung zuzuschreiben war, wurde eine Loss-of-Heterozygosity(LOH)-Analyse durchgeführt, wobei 8 polymorphe Marker verwendet wurden, die das TSLC1-Gen flankierten. Normale DNA, die entweder aus Lymphoblasten oder aus Fibroblasten von 8 Zervixkarzinom-Zelllinien stammte, stand zur Verfügung. Bei 3 (38%) dieser Zelllinien war ein Allelverlust bei 11q23.2 zu erkennen. Alle 3 Zelllinien zeigten eine Hypermethylierung des TSLC1-Promotors und ein Fehlen von nachweisbarer TSLC1-mRNA, was vermuten lässt, dass der Gen-Stillschaltung eine Alleldeletion in Kombination mit einer Promotor-Hypermethylierung zugrunde lag.
Die Analyse der HPV-immortalisierten Zelllinien zeigte einen LOH bei 11q23.2 bei allen immortalisierten Passagen der vier Zelllinien. Die TSLC1-Expression war aber in diesen Passagen noch nachweisbar, und es wurde keine Promotormethylierung gefunden, was darauf hinweist, dass das beibehaltene Allel noch aktiv transcribiert wurde. Bei den anderen drei Zelllinien wurde kein Allelverlust bei 11q23 nachgewiesen.
Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die TSLC1-Stillschaltung in Zervixkarzinomzellen aus Folgendem resultieren kann: 1) einer Promotormethylierung eines Allels in Kombination mit der Deletion des anderen Allels, wie man es bei 3/8 Zelllinien findet, 2) einer Promotormethylierung ohne Allelverlust, was vermuten lässt, dass entweder beide Allele hypermethyliert sind oder dass eines mutiert ist, wie sich bei zwei Zelllinien zeigte, oder 3) anderen, noch unbekannten Mechanismen, wie sich bei zwei Zelllinien zeigte.
Beispiel 2. TSLC1 unterdrückt das verankerungsunabhängige Wachstum in vitro und die Tumorigenität bei Nacktmäusen
Es zeigte sich, dass die maligne Transformation von hr-HPV-infizierten Epithelzellen in vitro über den anschließenden Erwerb 1) eines unsterblichen Phänotyps und 2) eines verankerungsunabhängigen Phänotyps, der anhand des Wachstums von Zellen in weicher Agarose gemessen werden kann, verläuft.
Um zu testen, ob die TSLC1-Stillschaltung funktionell an der Entwicklung von Zervixkarzinom beteiligt ist, wurde die Zervixkarzinom-Zelllinie SiHa, in der eine endogene TSLC1-Expression nicht nachweisbar war, mit der TSLC1-codierenden Sequenz transfiziert. Die erneute Expression von TSLC1 in diesen TSLC1-mRNA-negativen SiHa-Zellen führte zu einem hochgradig reduzierten Wachstum in weicher Agarose, das ein Maß für Verankerungsunabhängigkeit ist, während das Wachstum in einem normalen Monolayer unbeeinflusst blieb. Außerdem führte die erneute Expression von TSLC1 in SiHa-Zellen bei zwei von vier SiHa/TSLC1-Transfektanten zu einer Unterdrückung des Tumorwachstums in Nacktmäusen, und Tumoren, die sich aus den SiHa/TSLC1-Transfektanten ergaben, wuchsen langsamer als bei den Kontrollen.
Letztlich zeigen diese Ergebnisse, dass TSLC1 sowohl das verankerungsunabhängige als auch das tumorigene Wachstum von Zervixkarzinomzellen unterdrücken kann, wobei die Immortalität und die Proliferation unbeeinflusst bleiben.
Beispiel 3. Stillschaltung von TSLC1 in Zervix-Gewebeproben
Um zu bestimmen, ob und in welchem Stadium während der zervikalen Karzinogenese in vivo eine TSLC1-Stillschaltung erfolgt, wurde der Methylierungszustand des TSLC1-Promotors in Zervixgewebeproben analysiert.
Da die Gewebeproben aus einem Gemisch von normalen stromalen Komponenten und abnormen Zellen bestehen, wurde die Empfindlichkeit des Assays zum Nachweis von methylierten CpG-Inseln vor einem Hintergrund von normaler unmethylierter DNA bestimmt. Durch Analysieren einer Verdünnungsreihe von SiHa-DNA (methylierter TSLC1-Promotor) in DNA, die von primären Keratinocyten stammt (unmethylierter TSLC1-Promotor), zeigte sich, dass nur 5% methylierte DNA vor einem Hintergrund von unmethylierter DNA noch mit hoher Zuverlässigkeit nachgewiesen werden können, wenn man radioaktive Bisulfit-Sequenzierung auf einer Genomyx-Vorrichtung verwendet.
Bei Verwendung dieses Verfahrens zeigte keine von 15 normalen zervikalen Epithelbiopsien eine Methylierung des TSLC1-Promotors. Ähnlich war die Methylierung des TSLC1-Promotors bei allen CIN-Läsionen niedriger Stufe nicht nachweisbar (n = 10). Von 30 CIN-Läsionen hoher Stufe zeigten 35% eine Methylierung des TSLC1-Promotors. Außerdem wurden insgesamt 50 Zervix-Plattenepithelkarzinom-Schnitte analysiert, von denen 58% (29/50) eine Methylierung des TSLC1-Promotors zeigten. Somit scheint die TSLC1-Promotor-Methylierung ein eher häufiges Ereignis bei Zervix-Plattenepithelkarzinomen zu sein und tritt spät in der mehrstufigen Abfolge der Karzinogenese auf. Da außer der Hypermethylierung des TSLC1-Promotors auch andere Veränderungen einschließlich eines Allelverlust bei 11q23.2 zur Stillschaltung von TSLC1 beitragen können, liegt der tatsächliche Prozentwert der TSLC1-Stillschaltung in Zervixkarzinomen wahrscheinlich noch höher als 58%.
Beispiel 4. Nachweis der TSLC1-Promotor-Methylierung in Zervixabstrichen
In einer kleinen Pilotstudie wurde bewertet, ob der Nachweis von TSLC1-Veränderungen auf Zervixabstriche angewendet und damit als Marker in Zervixkarzinom-Reihenuntersuchungsprogrammen verwendet werden kann.
Dazu wurde die Methylierung des TSLC1-Promotors in archivierten Anstrichen von Frauen, die ein Zervixkarzinom entwickelten, analysiert. Diese Ausschabungen stammten aus einer retrospektiven Fallkontrolle, die dazu bestimmt war, den Wert von hr-HPV-Tests zum Signalisieren von falsch negativen Zervixabstrichen bei Frauen, die ein Zervixkarzinom entwickelten, zu bestimmen und zu bewerten, ob hr-HPV in normalen Abstrichen, die einem Zervixkarzinom vorangehen, vorhanden ist (Zielinski et al., 2001; Br. J. Cancer 85, 398-404). Die Analyse von 9 Indexabstrichen, d. h. Anstrichen, die zum Zeitpunkt der Diagnose des Zervixkarzinoms gemacht und als Pap4 oder Pap5 klassifiziert wurden (d. h. Verdacht auf Carcinoma in situ/invasives Karzinom), sowie von 9 assoziierten Zervixkarzinom-Biopsien zeigte, dass die TSLC1-Promotor-Methylierung in Abstrichen von Frauen mit einer in Bezug auf TSLC1-Promotor-Methylierung positiven Karzinombiopsie nachgewiesen werden konnte. In Kontrollabstrichen (n = 12) wurde keine TSLC1-Promotor-Methylierung nachgewiesen.
Als Nachsorge wurde bestimmt, ob der Nachweis der TSLC1-Promotor-Methylierung nicht nur einen diagnostischen Marker zum Nachweis eines Zervixkarzinoms liefern kann, sondern auch einen Marker für die Risikobewertung von prämalignen zervikalen Läsionen liefern kann. Dazu wurde dieselbe Patientengruppe, wie sie oben beschrieben wurde, untersucht, und archivierte Zervixabstriche, die 1–2 Jahre vor der Diagnose des Zervixkarzinoms entnommen und als Pap3a2/3b, d. h. mäßige/schwere Dyskaryose, klassifiziert wurden, wurden analysiert. Bei einer Patientin konnte die TSLC1-Promotor-Methylierung bereits in einem dem Karzinom vorausgehenden Abstrich, der 1 Jahr vor der Diagnose des Zervixkarzinoms genommen wurde, nachgewiesen werden.

Claims

Verfahren zum Nachweis eines HPV-induzierten invasiven Karzinoms oder einer Vorstufenläsion davon, das bzw. die mit dem tumor suppressor lung cancer 1 (TSLC1) assoziiert ist, bei einem Patienten, der dessen bedarf, wobei das Verfahren das ex vivo In-Kontakt-Bringen einer Zellkomponente, die aus der Gruppe bestehend aus einer das TSLC1-Polypeptid codierenden Nucleinsäure und dem TSLC1-Polypeptid ausgewählt ist, einer Testzelle des Patienten mit einem Reagens, das die Menge der Zellkomponente in der Testzelle nachweist, und die Bestimmung einer Abnahme der Expressionsstärke der Zellkomponente in der Testzelle im Vergleich zu einer vergleichbaren gesunden Zelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich beim HPV-induzierten invasiven Karzinom oder einer Vorstufenläsion davon um ein invasives Zervixkarzinom oder eine prämaligne Zervixläsion mit invasivem Potential handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich beim HPV-induzierten invasiven Karzinom um ein HPV-induziertes invasives Karzinom mit hohem Risiko handelt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zellkomponente eine Nucleinsäure ist, die das TSLC1-Polypeptid und Regulationsregionen codiert und das Reagens auf die Nucleinsäure in der Testzelle abzielt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Nucleinsäure RNA, vorzugsweise mRNA ist.
Verfahren zum Nachweis eines HPV-induzierten invasiven Karzinoms oder einer Vorstufenläsion davon nach einem der Ansprüche 1–3, wobei bei dem Nachweis eine erhöhte Methylierung des TSLC1-Promotors in der Testzelle und/oder ein Allelverlust des TSLC1-Locus im Vergleich zur vergleichbaren normalen Zelle bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Reagens eine Restriktionsendonuclease, vorzugsweise eine methylierungsempfindliche Restriktions-Endonuclease, ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Reagens eine Nucleinsäure-Sonde oder ein Nucleinsäure-Primer, die bzw. der an der Nucleinsäure bindet, ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Nucleinsäure-Sonde oder der Nucleinsäure-Primer eine detektierbare Markierung hat.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Nucleinsäure-Sonde eine Nucleotidsequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Polynucleotidsequenz, die dazu fähig ist, unter stringenten Bedingungen an der 5'-regulatorischen Region oder der codierenden Region der TSLC1-Sequenz, die in 1 aufgeführt ist, zu hybridisieren, b) einem Polynucleotid, das eine Identität von wenigstens 70% mit dem Polynucleotid von a) aufweist, c) einem Polynucleotid, das zum Polynucleotid von a) komplementär ist, und d) einem Polynucleotid, das wenigstens 15 aufeinanderfolgende Basen eines Nucleotids von a) oder b) umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die Zellkomponente ein TSLC1-Polypeptid ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Reagens ein Anti-TSLC1-Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–12, wobei der Patient an einem Verlust der Heterozygotie am Chromosom 11q23 leidet.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Reagens, das TSLC1-Mengen in Zellen erhöht, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von HPV-induzierten invasiven Karzinomen und deren Vorstufenläsionen, die mit einer Modifikation der Erzeugung von TSLC1 in Zellen assoziiert sind, bei Patienten, die deren bedürfen, wobei das Reagens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem TSLC1-Polypeptid, einer TSLC1 codierenden Nucleotidsequenz und methylierungsunterdrückenden Reagenzien wie 5-Azacytidin.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Reagens eine Polynucleotidsequenz ist, die eine TSLC1-Sense-Polynucleotidsequenz umfasst.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Polynucleosid die native, unmethylierte TSLC1-Sense-Sequenz ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei innerhalb der TSLC1-Sense-Sequenz ein Cytidin durch ein nichtmethylierbares Analogon substituiert ist.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das nichtmethylierbare Analogon vorzugsweise 5-Azacytidin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14–18, wobei die Polynucleotidsequenz in einem Expressionsvektor enthalten ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei der Expressionsvektor vorzugsweise ein Plasmid, ein virales Partikel oder ein Phage ist.
Verwendung eines molekularen diagnostischen Markers zum Nachweis von HPV-induzierten invasiven Karzinomen und deren Vorstufenläsionen, die mit dem tumor suppressor lung cancer 1 (TSLC1) assoziiert sind, wobei der Marker eine TSLC1-Promotor-Methylierung und/oder TSLC1-mRNA-Expression oder TSLC1-Polypeptid-Expression ist.
Kit zur Verwendung bei einem Verfahren zum Nachweis von HPV-induzierten invasiven Karzinomen und deren Vorstufenläsionen, die mit dem tumor suppressor lung cancer 1 (TSLC1) assoziiert sind, in Testzellen eines Patienten, wobei der Kit Folgendes umfasst: – Mittel zum Nachweis der TSLC1-Promotor-Methylierung oder der TSLC1-Expression, wobei die Mittel Sonden, Primer und/oder Antikörper umfassen, die für TSLC1 spezifisch sind oder für eine TSLC1 codierende Nucleotidsequenz oder einen Promotor von TSLC1 spezifisch sind, und – Mittel zum Nachweis einer HPV-Infektion, wobei das Mittel Sonden und Primer umfasst, die für HPV spezifisch sind.