DE60316718T2

DE60316718T2 - Lösliche notch basierte substrate für gamma secretase, methoden, zusammensetzungen und verwendungen davon

Info

Publication number: DE60316718T2
Application number: DE60316718T
Authority: DE
Inventors: Kenneth Bruce Mattawan RANK; Satish Kumar Ann Arbor SHARMA
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co LLC
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co LLC
Priority date: 2002-11-26
Filing date: 2003-11-17
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2023-11-18
Also published as: ES2293047T3; ATE374824T1; US20110098227A1; EP1567647B1; CA2505764A1; WO2004048578A1; EP1567647A1; AU2003283619A1; NO20052552D0; RU2005115973A; CN1717485A; JP2006508653A; KR20050085177A; NO20052552L; DE60316718D1; HRP20050461A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf neue lösliche Substrate für die γ-Secretase gerichtet. Genauer gesagt, liefert die Erfindung ein lösliches Fusionspolypeptid mit einem Notch-Segment, das die γ-Secretase-abhängigen Spaltstellen (γ und ε) enthält und an ein NusA-Protein fusioniert ist. Es werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Herstellung und Verwendung eines solchen Fusionsproteins offenbart.
Hintergrund
Die Alzheimer-Krankheit (AD) verursacht progressive Demenz mit der daraus folgenden Bildung von Amyloidplaques, neurofibrillärer Tangles, Gliose und Neuronenverlust. Die Krankheit tritt sowohl in genetischen als auch sporadischen Formen auf, deren klinischer Verlauf und deren pathologische Merkmale ziemlich ähnlich sind. Bis jetzt sind drei Gene entdeckt worden, die, wenn mutiert, zu einer autosomal-dominanten Form von AD führen. Diese kodieren den Amyloidproteinpräkursor (APP) und zwei Proteine, Presenilin-1 (PS1) und Presenilin-2 (PS2), die strukturell und funktionell verwandt sind. Es ist beobachtet worden, daß Mutationen in den drei Proteinen die proteolytische Prozessierung von APP über einen intrazellulären Weg, der das Amyloid-beta-Peptid (Aβ-Peptid, manchmal als Abeta bezeichnet), ein Peptid aus 40–42 Aminosäuren, das die primäre Komponente des Amyloidplaques in AD ist, produziert, verstärken (Younkin, Brain Pathol. 1 (4): 253–62, 1991; Haass, J. Neurosci. 11 (12): 3783–93, 1991).
Die Fehlregulation intrazellulärer Wege zur proteolytischen Prozessierung kann im Mittelpunkt der Pathophysiologie von AD stehen. Im Falle der Plaquebildung verändern Mutationen in APP, PS1 oder PS2 übereinstimmend die proteolytische Prozessierung von APP, so daß die Bildung von Aβ 1–42, einer Form des Aβ-Peptids, die scheinbar besonders amyloidogen, und daher in AD sehr wichtig ist, verstärkt wird. APP beschränkt sich örtlich auf die sekretorische Membranstruktur, einschließlich der Zelloberfläche, und hat eine Transmembran-Domäne nahe dem C-Terminus (1). Beispiele spezieller Isotypen von APP, die momentan bekanntermaßen in Menschen existieren, umfassen das 695-Aminosäure- Polypeptid, beschrieben von Kang et al. (1987), Nature 325: 733–736, das als das „normale" APP bezeichnet wird; das 751-Aminosäure-Polypeptid, beschrieben von Ponte et al. (1988), Nature, 331: 525–527 (1988), und Tanzi et al. (1988), Nature, 331: 528–530; und das 770 Aminosäure-Polypeptid, beschrieben von Kitaguchi et. al., Nature, 331: 530–532 (1988).
Das Aβ-Peptid stammt aus einer Region von APP, die sich neben der Transmembran-Domäne befindet und einen Teil dieser enthält (siehe 1). Normalerweise spaltet die Prozessierung von APP an der α-Secretasestelle die Mittelregion der Aβ-Sequenz neben der Membran und setzt die lösliche, extrazelluläre Domäne von APP aus der Zelloberfläche frei. Diese α-Secretase-APP-Prozessierung erzeugt lösliches APP-α, von dem nicht angenommen wird, daß es an AD beteiligt ist. Die pathologische Prozessierung von APP an den β- und γ-Secretasestellen, die sich N-terminal und C-terminal zu der α-Secretasestelle befinden, setzt jedoch das Aβ-Peptid frei. Die b-Secretasespaltstelle befindet sich 28 Reste von der Plasmamembran-Lumenoberfläche entfernt und die APP-γ-Secretasespaltstelie in der Transmembranregion. Die Prozessierung an β- und γ-Secretasestellen kann sowohl im endoplasmatischen Retikulum (in Neuronen) als auch im endosomalen/lysosomalen Weg nach der Reinternalisierung des Zelloberflächen-APP (in allen Zellen) stattfinden.
Daher sind die enzymatischen Aktivitäten der β- und γ-Secretaseenzyme Ziele der Arzneimittelforschung (Olson et al., Curr. Opin. Drug Discovery & Develop. 4: 390–401, 2001). Diese zwei Enzyme agieren zur Spaltung von APP gemeinsam, das anfänglich unter Erzeugung eines Membran-gebundenen C-terminalen (CT-)Fragmentes, genannt CT-100, das wiederum als ein Substrat für die Membran-assoziierte γ-Secretase dient, von β-Secretase gespalten wird. Die intramembranöse Spaltung von CT-100 durch von Presenilin 1 (PS1) abhängige γ-Secretase führt zur Produktion von Aβ 1–40 und 1–42. Überdies gibt es ein anderes Spaltereignis (die gamma-ähnliche oder epsilon-Secretasespaltung), das nahe Rest 721 von APP bei ungefähr 2–5 Resten in der zytoplasmatischen Membrangrenzfläche zur Erzeugung einer Reihe stabiler, C-terminaler APP-Fragmente spaltet (1).
Notch-1 gehört zur Notch-Familie von Zelloberflächenrezeptoren, die eine allgemeine Rolle bei der Zuweisung des Zellschicksals spielen. In den letzten Jahren ging man davon aus, daß die APP-Prozessierung ähnlich der Prozessierung des Zelloberflächenrezeptors Notch 1 ist (Wolfe et al., J. Biol. Chem. 276: 5413–5416, 2001). Tatsächlich ist gezeigt worden, daß APP und Notch-1 konkurrierende Substrate für die vermeintliche endogene γ-Secretase sind. Notch-1 ist ein integrales Membranprotein, das bei der Liganden-vermittelten Aktivierung proteolytisch in seiner Ektodomäne prozessiert wird. Nach der Ligandenbindung unterliegt Notch-1 Presenilin-abhängigen intramembranösen γ–Secretasespaitrnigen (Okochi, EMBO J. 2 5408–5416, 2002). Die erste erfolgt an Stelle 1731/1732 (diese ist mit der Aβ-ähnlichen γ-Secretasespaltung verwandt), und die zweite erfolgt an der 1743/1744-Stelle (diese ist mit der ε-Spaltung bei der Erzeugung von APP verwandt und wird manchmal als S3-Spaltung von Notch bezeichnet; in 1 als eine „ε"-Spaltung gezeigt). Zum Ende der Transmembran-Domäne hin erfolgt unter Freisetzung der intrazellulären Notch-1-Domäne (NICD) die ε-Spaltung an der 1743/1744-Verbindung von Notch. Die freigesetzte NICD verlagert sich in den Kern, wo sie mit einem DNA-Bindungsprotein, bezeichnet als CSL, interagiert (diese Abkürzung steht für drei separate Namen, die diesem Protein in unterschiedlichen Systemen gegeben werden: CBF1/RBP-J bei Säugern; Suppressor of Hairless [Su(H)] in Drosophila und Xenopus; und Lag-1 in C. Elegans). Der zwischen NICD und CSL gebildete Komplex modifiziert die Transkription von Zielgenen. NICD ist für den Signalstoff-Stoffwechselweg, der bei der Embryonalentwicklung kritisch ist, erforderlich (Schroeter 1998; Hupert 2000).
Die Presenilin-abhängige γ-Secretaseaktivität ist für die Prozessierung des Notch-Rezeptors zu NICD erforderlich (De Stropper et al., Nature 398: 518–522, 1999). Es ist berichtet worden, daß in Zellen Notch 1 und APP konkurrierende Substrate für die PS1-abhängige γ-Secretasespaltung sind (Berezovska et al., J. Biol. Chem. 276: 30018–30023, 2001). Als solche inhibieren γ-Secretaseinhibitoren, die die Produktion von pathogenem Aβ inhibieren sollen, auch die Notch-Signalübertragung. Dies hat signifikante Auswirkungen auf die potentielle Verwendung von γ-Secretaseinhibitoren als Arzneimittel bei der Behandlung von AD. Die Inhibierung der Notch-1-Prozessierung bei einem Erwachsenen würde aufgrund der wichtigen Funktion von Notch-1 bei der Hämatopoese zu Immunodefizienz und Anämie führen. Daher besteht Bedarf an der Identifizierung von Verbindungen, die spezifisch die APP CT-100-Spaltung, jedoch nicht die Notch-Spaltung inhibieren. Solche Verbindungen würden als therapeutische Mittel zur Intervention bei AD dienen, ohne die schädigenden Wirkungen der Inhibierung der NICD-Produktion zu erzeugen.
Petit et al., Nat Cell Biol (2001) Mai; 3(5): 507–11 beschreiben Nicht-Peptid-p-Inhibitoren von γ-Secretase und auch Zell-basierende Assays, die die Presenilin-Spaltung des myc-markierten Notch berücksichtigen.
Karlstrom et. al., (JBC Bd. 277, Nr. 9, S. 6763–6766), beschreiben einen quantitativen Assay zur γ-Secretase-vermittelten Spaltung des Alzheimer-Amyloidpräkursorproteins (APP) unter Verwendung einer C99-Form von APP, in das eine Gal 4 DNA-Bindung/VP16-Transaktivierungsdomäne eingeführt worden ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren und Zusammensetzungen zur Identifizierung von Verbindungen, die die γ-Secretase-vermittelte Spaltung von Notch nicht inhibieren. Diese Verfahren und Zusammensetzungen umgehen das Problem der Inhibierung der NICD-Produktion, die an der nicht-spezifischen Inhibierung der γ-Secretaseinhibierung beteiligt ist. Die vorliegende Erfindung ermöglicht daher die Identifizierung therapeutischer Mittel zur Intervention bei AD, ohne schädigende Wirkungen auf die Inhibierung der NICD-Produktion zu verursachen.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert ein lösliches Fusionsprotein, umfassend ein rekombinantes Notch-Protein, fusioniert an den C-Terminus einer NusA-Proteinsequenz. Bevorzugt umfaßt das Notch-Protein die Transmembran-Domäne des Notch-Proteins. Das Notch-Protein kann jedoch von dem Vollängen-Notch-Protein mehr oder weniger als die Transmembran-Domäne enthalten, so lange das Notch-Protein die S3-Spaltstelle von Notch enthält. Das Notch-Protein umfaßt für eine spezielle Ausführungsform die Sequenz von SEQ ID Nr.: 4 und ist durch eine Nukleinsäuresequenz von SEQ ID Nr.: 3 kodiert. Das rekombinante Notch-Protein sollte eines sein, das die S3-Spaltstelle (d. h. die ε-Spaltstelle) von Notch enthält. Das rekombinante Notch-Protein kann ein vertebrales Notch-Protein oder ein invertebrales Notch-Protein sein. In bestimmten Ausführungsformen stammt das rekombinante Notch-Protein aus einem Maus-Notch-Protein mit der Sequenz von SEQ ID Nr.: 5 [Genbank-Zugriffszahl 211886]. Genauer gesagt, umfassen Ausführungsformen, die sich mit der Verwendung eines rekombinanten Notch-Proteins befassen, die Aminosäuren 1703 bis 1860 des Maus-Notch-Proteins. Jedes der löslichen Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung kann ferner eine C-terminale His-Markierung und/oder eine C-terminale Flag-Markierung umfas sen. Natürlich kann auch die gesamte oder ein Teil einer menschlichen Notch-Sequenz, z.B. die Sequenz von SEQ ID Nr.: 6 [Genbank-Zugriffszahl M73980], verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung befaßt sich ferner mit Polynukleotiden, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die hierin beschriebene Fusionsproteine kodiert. Eine exemplarische Polynukleotidsequenz, die ein solches Fusionsprotein kodiert, ist eine, die eine in SEQ ID Nr.: 1 angegebene Sequenz umfaßt. Diese Polynukleotidsequenz kodiert ein Fusionsprotein von SEQ ID Nr.: 2. Hierin befaßt man sich ebenso mit einem Expressionsvektor, der ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfaßt. Der Expressionsvektor ist bevorzugt einer, in dem das Polynukleotid funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft ist, um so die Expression des durch das Polynukleotid in einer Wirtszelle kodierten Proteins zu fördern.
Rekombinante Wirtszellen, transformiert oder transfiziert mit einem hierin beschriebenen Polynukleotid oder Expressionsvektor, sind ebenso in der vorliegenden Erfindung enthalten. Die Erfindung befaßt sich mit einem Verfahren zur Herstellung eines Substrats für einen γ-Secretaseassay, umfassend das Heranziehen einer rekombinanten Wirtszelle in einer Art und Weise, die die Expression des Fusionsproteins ermöglicht. Das Verfahren kann ferner die Reinigung des Polypeptids umfassen. In einem solchen Verfahren kann die Wirtszelle irgendeine Wirtszelle sein, die für die Produktion eines rekombinanten Proteins zugänglich ist, einschließlich eine Säuger-Wirtszelle, eine bakterielle Wirtszelle und eine Hefe-Wirtszelle.
In exemplarischen Ausführungsformen ist die Wirtszelle eine Hela-Zelle, eine menschliche embryonale Nierenzelle der Linie 293, ein Fibroplast oder eine CHO-Zelle.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung eines solubilisierten Notch-Proteins, wobei das Verfahren die Herstellung eines Fusionsproteins, in dem das Notch-Protein an den C-Terminus eines NusA-Proteins fusioniert ist, umfaßt. Genauer gesagt, umfaßt das Verfahren die rekombinante Produktion des Fusionsproteins, die die Herstellung eines Expressionskonstrukts, umfassend eine Nukleinsäure, die ein Fusionsprotein, umfassend ein Notch-Protein, enthaltend die Aminosäuren der S3-Spaltstelle von Notch, verknüpft am C-Terminus eines NusA-Proteins, umfaßt; die Transformation einer Wirtszelle mit dem Expressionskonstrukt unter Bedingungen, die die Expression des Fusionsproteins erleichtern; und das Heranziehen der transformierten Wirtszelle in Kultur. Das Verfahren kann ferner die Isolierung des Fusionsproteins aus dem transformierten Wirt in Kultur umfassen. In bestimmten Ausführungsformen umfaßt das Verfahren die Herstellung des Fusionsproteins mittels chemischer Proteinsynthese. In solchen Verfahren umfaßt das Notch-Protein bevorzugt die Aminosäuren 1703 bis 1860 des Maus-Notch-Proteins.
Hierin befaßt man sich ebenso mit einem In-vitro-Verfahren zur Analyse der γ-Secretase-vermittelten ε-Spaltung (1743/1744) des Notch-Proteins, umfassend das Kontaktieren einer ersten Zusammensetzung, umfassend einen Säuger-γ-Secretase-Komplex oder ein biologisch aktives Fragment davon, mit einer zweiten Zusammensetzung, umfassend ein Fusionsprotein der Erfindung; und das Messen der Spaltung des Fusionsproteins.
Der γ-Secretasekomplex aus dem obigen Verfahren kann eine Membranfraktion, gereinigt und isoliert aus Säugerzellen oder Zellen, die mit Expressionskonstrukten, umfassend Nukleotidsequenzen, die den γ-Secretasekomplex kodieren, transformiert oder transfiziert wurden, umfassen. In dem obigen Verfahren ist das Fusionsprotein ein solubilisiertes Notch-Protein, hergestellt gemäß den hierin erörterten Verfahren.
Die Erfindung befaßt sich speziell mit Zusammensetzungen, umfassend γ-Secretasemodulatoren, die durch die hierin beschriebenen Screening-Verfahren identifiziert wurden. Die Erfindung umfaßt ebenso ein Verfahren zur Modulation der γ-Secretaseaktivität in vivo, umfassend einen Schritt der Verabreichung eines durch die hierin beschriebenen Screening-Verfahren identifizierten Modulators, der ein γ-Secretasemodulator ist, der selektiv ist für die Inhibierung der γ-Secretase-vermittelten Spaltung von APP im Vergleich zur γ-Secretase-vermittelten Spaltung des Notch-Proteins, an einen Säuger in einer Menge, die effektiv die γ-Secretaseaktivität in Säugerzellen moduliert.
Die vorliegende Erfindung ist ebenso auf pharmazeutische Zusammensetzungen gerichtet, die einen oder mehrere Modulatoren, identifiziert durch die vorliegende Erfindung, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen. Es geht ebenso um ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit oder eines Zustandes, die/der durch eine abnormale γ-Secretaseaktivität gekennzeichnet ist, umfassend die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung an ein Individuum, das behandelt werden muß. Insbesondere geht es um die Verwendung der hierin identifizierten Modulatoren bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung ersichtlich. Es sollte jedoch selbstverständlich sein, daß die ausführliche Beschreibung und die speziellen Beispiele, die bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen, nur zum Zwecke der Veranschaulichung angegeben sind, da einem Fachmann verschiedene Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der Erfindung aus dieser ausführlichen Beschreibung ersichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die folgenden Zeichnungen bilden einen Teil der vorliegenden Beschreibung und sollen Aspekte der vorliegenden Erfindung veranschaulichen. Die Erfindung ist anhand der Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung der hierin dargestellten speziellen Ausführungsformen besser verständlich.
1. Vergleich der γ-Secretase-ähnlichen Spaltstellen. Es wird die die Transmembran-Domäne von APP (SEQ ID Nr.: 10), Notch-1 (SEQ ID Nr.: 12) und E-Cathedrin (SEQ ID Nr.: 11) umgebende Sequenz gezeigt. Ebenso sind die γ-Secretase-Spaltstellen in APP zur Erzeugung von Aβ 1–40 und 1–42 sowie die ε-Spalt- (ε) oder γ-Secretase-ähnlichen Spaltstellen für die drei Substrate gezeigt.
2. Aminosäuresequenz, die die γ-Secretase-ähnliche Spaltstelle in Notch-1 umgibt. Diese Sequenz (1703–1860; SEQ ID Nr.: 13) wurde zur Expression in E. coli gewählt. Die Transmembran-Domäne ist durch Unterstreichung angezeigt und die 1743/1744-Spaltstelle durch fette und unterstrichene Zeichen. Die Spaltung dieser Notch-Sequenz würde zu einem NICD-Fragment führen, das die Aminosäuren 1744–1860 enthält.
3. a) Konstrukte, geklont zur Expression von Notch in E. coli. Vier Konstrukte sind gezeigt, die alle die Aminosäuresequenz 1703–1860 von Notch-1 enthalten. Es war keine Expression zu sehen, wenn entweder eine Caspase-Leadersequenz, Ubiquitin oder die N-terminale Domäne von tau als eine N-terminale Markierung zum Antreiben der Expression verwendet wurde. Wenn Notch (1703–1860) an das NusA-Protein fusioniert wurde, war die lösliche Expression in E. coli zu beobachten. b) Eine schematische Darstellung des Notch-F-Konstruktes, geklont in pET 43.1a. Dieses Konstrukt enthält auch C-terminale Flag- und 8His-Markierungen.
4. IMAC-Isolierung der NusA-Notch-Fusion. Eine schematische Darstellung des Fusionsproteins ist im oberen Teil gezeigt. Details der Expression und Reinigung von NusA-Notch sind in den Materialien und Verfahren zu finden. Der Pfeil kennzeichnet die Fusionsproteinexpressionsbande auf der 10-%-SDS-PAGE-Gel, Bahn 1, rohes E. coli-Lysat; Bahn 2, E. coli-Überstand, Bahn 3, IMAC-Durchfluß; Bahn 4,50 mM Imidazolwäsche; Bahnen 5–9, 300 mM Imidazolelutionsfraktionen; Bahn 10, Benchmark-Molekulargewichtsmarker.
5. Western-Blot, der die Spaltung der NusA-Notch-Fusion unter Verwendung solubilisierter γ-Secretase zeigt. Die Details des Experiments sind in Beispiel 1 zu finden. Kurz gesagt, wurde die NusA-Notch-Fusion über Nacht mit solubilisierter γ-Secretase in Gegenwart und Abwesenheit variierender Konzentrationen von DAPT (PHA-568638) inkubiert. Die Proben wurden der Elektrophorese unterworfen, geblottet und mit Val-1744-Antikörper, der für die Spaltung bei Val 1744 spezifisch ist, sondiert.
6. Detektion der spezifischen Notch-Spaltung durch ELISA. Es wird eine schematische Darstellung des Sandwich-ELISA, der zur Detektion der Spaltung der NusA-Notch-Fusion durch solubilisierte γ-Secretase verwendet wird, gezeigt. Die spezifische Spaltung wird unter Verwendung des Val-1744-Antikörpers detektiert.
7. Spaltung des NusA-Notch-Fusionsproteins durch γ-Secretase, detektiert durch ELISA. Das NusA-Notch-Substrat (0,9 μM) wurde in Abwesenheit oder Gegenwart von 68 μg/ml solubilisierter γ-Secretase (Enzym) inkubiert und der ELISA gemäß Materialien und Verfahren durchgeführt. Die Daten sind ein Mittel aus sechs Experimenten.
8. Charakterisierung der Notch-Spaltung durch ELISA. Der ELISA wurde, wie in Materialien und Verfahren beschrieben, durchgeführt. Bei der Variation der Notch-Substratkonzentration wurden 0,11 bis 3,6 μM NusA-Notch mit 68 μg/ml solubilisierter γ-Secretase inkubiert und die Daten unter Verwendung der Michaelis-Menton-Kurvenanpassung geplottet. Wurde die Enzymkonzentration variiert, wurden 2,1 bis 68 μg/ml solubilisierte γ-Secre tase mit 0,9 μM Notch-Substrat inkubiert. Die Daten sind ein Mittel aus drei Experimenten und wurden unter Verwendung von GraFit 4,0 geplottet. Es gab ein ungefähr 5-faches Signal: Hintergrund (Hintergrund unter Verwendung von Enzym allein ist vernachlässigbar).
9. Inhibierung der Notch-Spaltung durch Verbindungen, die bekanntermaßen die In-vitro-Spaltung von CT-100 durch γ-Secretase inhibieren. Es sind die Inhibierungsprofile für DAPT (PHA-568638) und Fenchylamin (PHA-512088), gemessen unter Verwendung des Notch-Spaltungs-ELISA, gezeigt. Ebenso gezeigt sind relative IC₅₀-Werte.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
AD ist eine der führenden altersbezogenen Störungen, verbunden mit progressiver Demenz und Pathologie, gekennzeichnet durch kortikale Atrophie und die Ablagerung Altersplaques und neurofibrillärer Tangles. Eine primäre Komponente der Plaques ist das 40–42 Aminosäure lange Peptid, Aβ, aus einer Region von APP, die sich neben der Transmembran-Domäne des Vollängen-APP befindet und einen Teil davon enthält. Dieses pathogene Peptid wird als ein Ergebnis der sequentiellen Prozessierung aufgrund von β- und γ-Secretase-aktivitäten erzeugt. Daher sind die enzymatischen Aktivitäten dieser beiden Secretaseenzyme Ziele der Arzneimittelforschung (Olson et al., Curr. Opin. Drug Discovery & Develop. 4: 390–401, 2001).
Es ist gezeigt worden, daß die Prozessierung des Zelloberflächenrezeptors Notch der APP-Prozessierung ähnelt (Wolf et al., J. Biol. Chem. 276: 5413–5416, 2001). 1 zeigt einen Vergleich von γ-Secretase-ähnlichen Spaltstellen in APP und Notch. Wie gezeigt, befindet sich die Spaltstelle in APP in der Mitte der Transmembran-Domäne, während Notch sehr nah am C-terminalen Ende seiner Transmembran-Domäne gespalten wird. Eine ähnliche ε-Spaltstelle ist kürzlich (Marambaud et al., EMBO J., 21: 1948–1956, 2002) in Cathedrin E (1) erwähnt worden. 2 zeigt die Aminosäuresequenz aus 1703–1860 des Notch-Proteins, einschließlich der S3-Spaltstelle in Notch (Steiner et al., J Mol. Neurosci. 17: 193–198, 2001). Die spezifische Spaltung an der 1743/1744-Verbindung erzeugt die V1744-D1860 intrazelluläre Notch-Domäne (NICD), ein Fragment der NICD, das in Zellen zu beobachten ist, die mit mΔE-Notch-Konstrukten (1704 bis 2183), denen es an den Si- und S2-Spaltstellen fehlt, transfiziert wurden (Kopan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 1683–1688, 1996). Obgleich ein Notch-Konstrukt (Val 1711-Glu 1809) erwähnt worden ist (Esler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 2720–2725, 2002), ist die spezifische Spaltung durch γ-Secretase an der 1743/1744-Verbindung in vitro nicht beschrieben worden. Die spezifische Spaltung an der 1743/1744-Verbindung kann ohne weiteres durch die Verwendung des Val-1744-Antikörpers bestimmt werden (Cell Signaling Technology). Dieser Antikörper ist für das gespaltene Notch spezifisch und kreuzreagiert nicht mit ungespaltenem Notch-Protein.
Daher spaltet die PS1-abhängige γ-Secretase in Zellen neben der Spaltung des CT-100-Fragments, produziert durch die Wirkung der β-Secretase, unter Erzeugung von NICD ebenso an der ε-Stelle 1743/1744. Diese gespaltene NICD wandert in den Kern und ist in den Signalstoffwechsel involviert. Die therapeutische Inhibierung der γ-Secretaseaktivität, die AD lindern soll, führt ebenso zur Inhibierung der NICD-Produktion. Die vorliegende Erfindung liefert zum ersten Mal Verfahren und Zusammensetzungen zur Identifizierung therapeutischer Mittel, die die Produktion von NICD aus Notch-1 nicht inhibieren.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung liefern In-vitro-Assays für die Notch-Spaltung und die Verwendung solcher Assays bei der Sekundärbewertung von γ-Secretaseinhibitoren. Diese Assays nutzen ein lösliches Notch-Substrat für die γ-Secretase, das ein lösliches Fusionsprotein, umfassend ein rekombinantes Notch-Protein, fusioniert an den C-Terminus einer NusA-Proteinsequenz, umfaßt. Die Assays der vorliegenden Erfindung können als direkte In-vitro-ELISA-Assays und/oder Western-Blots für die Notch-Protein-Spaltung durch γ-Secretase durchgeführt werden. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung liefern die Produktion und Reinigung eines löslichen rekombinanten Notch-Protein-Substrats (Asn 1703-Asp 1860), exprimiert in geeigneten Zellinien, z. B. E. coli, als ein Fusionsprotein mit NusA, gekoppelt an eine Notch-Proteinsequenz (siehe 6).
Unter Verwendung des gereinigten Fusionsproteinsubstrats der vorliegenden Erfindung demonstrierten die Erfinder die spezifische Spaltung an der 1743/1744-Stelle in Notch unter Verwendung solubilisierter γ-Secretase aus HeLa-Zellen. Wie in den ausführlichen Beispielen beschrieben, kann das gespaltene Notch-Protein unter Verwendung eines Antikörpers, spezifisch für Val-1744, detektiert werden. Die Erfinder bestätigten diesen Assay und zeigten, daß die Spaltung des Notch-Proteins dosisabhängig von DAPT, einem allgemein bekannten starken Inhibitor von γ-Secretase, inhibiert wurde. Ein ELISA wurde, basierend auf Anti-Val- 1744-Antikörpern entwickelt. Eine weitere Bestätigung des In-vitro-Notch-Assays wurde durch die Inhibierung der Spaltung durch γ-Secretaseinhibitoren bereitgestellt. Praktisch gesehen, wird ein Inhibitor oder Modulator als eine Verbindung definiert, die Aβ durch γ-Secretase verringert.
I. Notch-Substrat für einen In-vitro-Notch-Assay
Das Notch-Substrat zur Verwendung in den Assays der vorliegenden Erfindung ist ein lösliches Fusionsprotein eines Notch-Polypeptids an ein Nus-Protein. Das Fusionsprotein kann markiert oder anderweitig modifiziert werden, um die Reinigung des Peptids, die Detektion des Notch-Fusionsproteins selbst oder die Detektion des Spaltproduktes des Notch-Fusionsproteins bei der Einwirkung der γ-Secretase zu erleichtern. Die Produktion des Fusionsproteins und exemplarische Modifikationen werden nachstehend ausführlich beschrieben.
In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Notch-Substrat, enthaltend die Aminosäuren N1703-D1860 eines Maus-Notch-1-Proteins (DNA-Sequenz-Zugriffszahl 211886; siehe 2) am N-Terminus mit dem C-Terminus von NusA verbunden. Es ist davon auszugehen, daß das Fusionspolypeptid durch die Produktion eines rekombinanten Proteins oder durch automatische Peptidsynthese, wie an anderer Stelle in der Beschreibung erörtert, erzeugt werden kann. Die Transmembran-Domäne in 2 erstreckt sich über die Aminosäuren 1723 bis 1744 (siehe 1). γ-Secretase spaltet Notch bei der ε-Spaltung zwischen den Aminosäuren 1743 und 1744. Diese Spaltung wird auch S3-Spaltstelle genannt und erzeugt NICD (d. h. ein Peptid, das sich über die Aminosäuren V1744-D1860 erstreckt).
Neben diesem neuen Fusionsprotein umfaßt die vorliegende Erfindung ferner die Erzeugung terminaler Additionen, auch Fusionsproteine oder Fusionspolypeptide genannt, des oben beschriebenen oder gemäß der vorliegenden Erfindung definierten Notch/NusA-Fusionsprotein-Substrats. Überdies sollte klar sein, daß, während die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ein Notch/NusA-Fusionspeptid, umfassend N1703-D1860 von Maus-Notch-1, zeigen, das Notch-Protein aus irgendeiner anderen Quelle stammen kann. Eine solche Quelle kann ein Säuger oder Nicht-Säuger sein. Daher kann, während das Notch-1 bevorzugt vom Menschen, von Mäusen, Ratten oder anderen Säugerquellen stammt, das Notch-1 in bestimmten Ausführungsformen z. B. von C. Elegans, Xenopus, Drosophila und anderen invertebralen Quellen stammen.
Ferner kann jedes Notch-1-Derivat, das die γ-Secretase-Spaltstellen 1731/1732 (γ-Stelle) und 1743/1744-Stelle (ε-Spaltung) enthält, in dem Fusionsproteinsubstrat der vorliegenden Erfindung nützlich sein. In Notch-1 befindet sich die γ-Secretase-Spaltstelle, die NICD freisetzt, an der 1743/1744-Stelle in Notch. Es ist anzunehmen, daß der Abstand zwischen der Spaltstelle und dem Beginn eines NusA etwa 500 Aminosäuren beträgt, um so die sterischen Eigenschaften der Notch-γ-Secretase-Spaltdomäne nachahmen zu können. Dieser Abstand kann aus dem NusA-Protein oder mittels eines heterologen Peptid-Linkers erzeugt werden. Diese Region besteht bevorzugt aus dem NusA-Protein. Die NusA-Proteindomänenkomponente des Notch/NusA-Fusionspolypeptids kann im wesentlichen irgendein Teil des NusA-Proteins sein, durch den die Notch/NusA-Fusion löslich bleibt und daher für einen In-vitro-Assay zugänglich ist.
NusA ist früher zur Erzeugung der löslichen Expression von Proteinen in E. coli verwendet worden (siehe z. B. Wilkinson, et al., Bio/Technology 9, 443–448, 1991; Davis et al., Biotechnol Bioeng., 65 (4): 382–8, 1999). Hierin wird ein NusA-Protein, umfassend die Sequenz von SEQ ID Nr.: 17 (kodiert durch eine Nucleinsäuresequenz von SEQ ID Nr.: 16), an Notch fusioniert. Ein Fachmann kann jedoch eine andere NusA-Sequenz als die in SEQ ID Nr.: 17 angegebene Sequenz nutzen und dennoch ein lösliches Notch/NusA-Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung produzieren. Beispielsweise kann ein Fachmann ein NusA-Protein, umfassend 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder mehr Sequenzhomologie zu der Sequenz von SEQ ID Nr.: 17, verwenden. Alternativ kann ein Fachmann ein kleineres angrenzendes NusA-Fragment aus SEQ ID Nr.: 17 verwenden, beispielsweise kann das Fragment 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 425, 450, 475, 500, 510, 520, 530, 540, 550 oder mehr angrenzende Aminosäuren von SEQ ID Nr.: 17 sein.
Allgemeine Prinzipien zur Gestaltung und Herstellung von Fusionsproteinen sind dem Fachmann allgemein bekannt. Zum Beispiel Fusionen, die typischerweise Leader-Sequenzen aus anderen Spezies einsetzen, um die rekombinante Expression eines Proteins oder Peptids in einem heterologen Wirt zu ermöglichen. Eine andere nützliche Fusion umfaßt die Addition einer immunologisch aktiven Domäne, wie eines Antikörperepitops, zur Erleichterung der Reinigung des Fusionspolypeptids. Der Einschluß einer Spaltstelle an oder nahe der Fusionsverbindung wird die Entfernung des exogenen Polypeptids nach der Reinigung erleichtern.
Die rekombinante Produktion dieser Fusionen wird an anderer Stelle in der Beschreibung ausführlich beschrieben. Andere nützliche Fusionen umfassen die Verknüpfung funktioneller Domänen, wie aktiver Stellen aus Enzymen, Glycosylierungsdomänen, zellulärer Targetingsignale oder Transmembranregionen.
Genauer gesagt, umfaßt die vorliegende Erfindung ein Fusionspolypeptid mit einer ersten Komponente, umfassend das Notch-Protein, das die 1731/1732- (γ-Saltung) und 1743/1744-(ε-Spaltung) -Spaltstellen enthält, die an eine zweite Komponente, umfassend das gesamte oder einen Teil des NusA-Proteins, angelagert ist. In weiteren Ausführungsformen umfaßt das Fusionspolypeptid ferner eine dritte Komponente, die ein Reportergenprodukt umfaßt. In noch weiteren Ausführungsformen kann die Fusionspolypeptide ferner eine markierte Sequenzkomponente umfassen. Ein besonderes Fusionspolypeptid ist eines, das ein Reportergenprodukt auf einer Seite des NusA-Portions, einen Sequenzabschnitt, enthaltend das Notch-Protein mit den γ-Secretase-Spaltstellen, und eine markierte Sequenz auf der anderen Seite des Notch-Proteins umfaßt. Das Reportergenprodukt, das in den Fusionspolypeptiden der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann irgendein Reporterprotein sein, das üblicherweise von einem Fachmann verwendet wird. Exemplarische Reporterproteine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Luciferase; sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP); β-Galactosidase; β-Glucoronidase; grünes fluoreszierendes Protein und Chloramphenicol-acetyltransferase.
Andere besondere Ausführungsformen umfassen ferner eine markierte Sequenz als eine vierte Komponente der Fusionspolypeptide der vorliegenden Erfindung. Es gibt verschiedene kommerziell erhältliche Fusionsproteinexpressionssysteme, die zur Bereitstellung einer markierten Sequenz in diesem Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Besonders nützliche Systeme umfassen, sind aber nicht beschränkt auf das Glutathion-S-Transferase-System (GST-System) (Pharmacia, Piscataway, NJ), das Maltosebindungsproteinsystem (NEB, Beverley, MA), das FLAG-System (IBI, New Haven, CT) und das 6xHis-System (Qiagen, Chatsworth, CA). Diese Systeme können rekombinante Polypeptide produzieren, die nur eine kleine Anzahl zusätzlicher Aminosäuren tragen, die eher unwahrscheinlich die biologisch relevante Aktivität des rekombinanten Fusionsproteins beeinflussen. Beispielsweise fügen sowohl das FLAG-System als auch das 6xHis-System nur kurze Sequenzen an, die bekanntermaßen beide kaum antigen sind und das Falten des Polypeptids in seine natürliche Konformation nicht nachteilig beeinträchtigen. Eine andere N-terminale Fusion, die als nützlich betrachtet wird, ist die Fusion eines Met-Lys-Dipeptids an der N-terminalen Region des Proteins oder der Peptide. Solch eine Fusion kann zu vorteilhaften Steigerungen der Proteinexpression und/oder -aktivität führen. Spezielle markierte Sequenzen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, umfassen die C-terminale FLAG-Markierungssequenz DYKDDDDK (SEQ ID Nr.: 14). Überdies können markierte Sequenzen auch eine 8His-Markierung enthalten, um so eine an das Fusionsprotein angelagerte FLAG/8His-Markierung zu erzeugen (DYKDDDDKHHHHHHHH, SEQ ID Nr.: 15).
Ein Beispiel eines bevorzugten Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung ist eines, in dem NusA entweder an ein Teil- oder Vollängen-Maus-Notch-1-Protein fusioniert ist, das die 1731/1732- und 1743/1744-γ-Secretase-Spaltstellen zusammen mit einem kurzen C-terminalen FLAG/8His-markierten Schwanz umfaßt. Die Sequenz eines exemplarischen Fusionspolypeptids umfaßt die Aminosäuren 1703–1860 von Maus-Notch (d. h. angegeben in SEQ ID Nr.: 13), fusioniert an ein NusA-Protein. Dieses exemplarische Fusionspolypeptid hat die Sequenz von SEQ ID Nr.: 2. Zur Überwachung der Spaltung dieses chimären Konstrukts durch γ-Secretase werden Anti-Val-1744-Antikörper gegen das Notch-Spaltprodukt, das den Val-1744-Rest enthält, zur Bestimmung der Gegenwart und Konzentration des Val-1744-Fragments, das als ein Ergebnis der Notch-Spaltung erzeugt wurde, eingesetzt. Anti-Flag-Antikörper können zur Detektion des C-Terminus des chimären Konstrukts eingesetzt werden. Es ist jedoch anzumerken, daß das chimäre Konstrukt auch ein Reporterprotein wie beispielsweise alkalische Phosphatase am C-Terminus anstelle der Flag-Markierung einsetzen kann. Ein solches Reporterprotein wird im Ergebnis einer Notch-Spaltung freigesetzt und unter Verwendung der dem Fachmann allgemein bekannten Assays detektiert.
Neben dem bereits beschriebenen Fusionspolypeptid liefert die Erfindung Notch-Fusionsproteine, die weiter modifiziert wurden und beispielsweise eine Markierung oder andere detektierbare Einheit enthalten.
Beispielsweise können die Notch/NusA-Fusionsproteinsubstrate intern gelöschte Markierungen umfassen, die zu einer verstärkten Detektierbarkeit nach der Spaltung des Notch-Substrats führen. Die Notch/NusA-Fusionsproteinsubstrate können so modifiziert sein, daß sie angelagertes gepaartes Flurophor und Quencher aufweisen, einschließlich, aber nicht be schränkt auf 7-Amino, 4-Methylcoumarin beziehungsweise 2,4-Dinitrophenol, so daß die Spaltung des Peptids durch die γ-Secretase zu einer verstärkten Fluoreszenz aufgrund der physikalischen Trennung von Flurophor und Quencher, die an gegenüberliegenden Stellen der spaltbaren Bindung für die γ-Secretase angelagert sind, führt. Andere gepaarte Flurophore und Quencher umfassen BODIPY-Tetramethylrhodamin und QSY-5 (Molecular Probes, Inc.). In einer Variante dieses Assays kann Biotin oder eine andere geeignete Markierung an einem Ende des Peptids plaziert werden, um das Peptid auf einer Substratassayplatte zu verankern, und ein Flurophor kann an dem anderen Ende des Fusionsproteins plaziert werden. Nützliche Flurophore umfassen die oben aufgeführten sowie Europiummarkierungen wie W8044 (EG & g Wallac, Inc.). Eine andere bevorzugte Markierung, die verwendet werden kann, ist Oregon green, das an einen Cys-Rest angelagert werden kann. Die Spaltung des Fusionsproteins durch γ-Secretase wird das Flurophor oder eine andere Markierung aus der Platte freisetzen, wodurch die Verbindungen hinsichtlich der Inhibierung der proteolytischen Spaltung analysiert werden können, gezeigt durch eine Erhöhung der erhaltenen Fluoreszenz. Bevorzugte colorimetrische Assays der γ-Secretase-Protelyseaktivität nutzen andere Notch/NusA-Fusionsproteine, in denen die Aminosäuren, die die γ-Secretase-Erkemiungsstelle zur Spaltung umfassen, durch eine Amidverknüpfung mit o-Nitrophenol verknüpft sind, so daß die Spaltung des Fusionsproteins durch die γ-Secretase zu einer höheren optischen Dichte nach der Veränderung des Assaypuffers zu einem alkalischen pH führt.
Ferner können die Notch/NusA-Fusionsproteine unter Verwendung von Markierungen, die einem Fachmann allgemein bekannt sind, markiert werden, beispielsweise sind Biotinmarkierungen besonders bevorzugt. Die Verwendung derartiger Markierungen ist einem Fachmann allgemein bekannt und wird beispielsweise in US-Patent Nr. 3,817,837 ; US-Patent Nr. 3,850,752 ; US-Patent Nr. 3,996,345 und US-Patent Nr. 4,277,437 beschrieben. Andere Markierungen, die nützlich sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf radioaktive Markierungen, fluoreszierende Markierungen und chemilumineszierende Markierungen. US-Patente, die die Verwendung solcher Markierungen betreffen, umfassen beispielsweise US-Patent Nr. 3,817,837 ; US-Patent Nr. 3,850,752 ; US-Patent Nr. 3,939,350 und US-Patent Nr. 3,996,345 . Alle Notch/NusA-Fusionsproteinzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können eine, zwei oder mehrere dieser Markierungen umfassen.
II. γ-Secretasezusammensetzungen
Zusätzlich zu den neuen Notch-Fusionsproteinen ist die vorliegende Erfindung auf Verfahren zur Verwendung solcher Notch-Fusionsproteine in verschiedenen γ-Secretaseassays gerichtet. Der betreffende Abschnitt liefert eine Erörterung der Erzeugung von Fraktionen, die Proteine mit γ-Secretaseaktivität enthalten.
Während die exakte Identität von γ-Secretase schwer bestimmbar bleibt, gibt es einen starken Beweis dafür, daß γ-Secretase Presenilin 1 sein kann. Ungeachtet der Tatsache, daß die Sequenz des γ-Secretaseproteins noch identifiziert werden muß, werden Fachleute Verfahren und Zusammensetzungen zur Isolierung zellulärer Fraktionen, die γ-Secretase umfassen, kennen. Beispielsweise beschreiben Li et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 6138–6143, 2000) Verfahren und Zusammensetzungen zur Herstellung eines Membranpräparats, das eine solubilisierte γ-Secretaseaktivität enthält. Solch ein Verfahren ist in der vorliegenden Erfindung zur Bereitstellung einer gereinigten Fraktion, die eine γ-Secretase enthält, nützlich. Nach der Herstellung einer solchen Fraktion kann diese in den Assays der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Überdies können die neuen Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung zur weiteren Isolierung und Reinigung der γ-Secretase aus einer solchen Membranfraktion, beispielsweise unter Verwendung affnitätschromatographischer Abtrennungstechniken, verwendet werden.
Die γ-Secretasefraktion wird im allgemeinen aus irgendeiner Zelle, die eine γ-Secretaseaktivität exprimiert, isoliert. Beispielweise können HeLa3-Zellen verwendet werden. Die Zellen werden beispielsweise unter Verwendung einer French-Presse oder einer anderen Zellrupturtechnik, umfassend, aber nicht beschränkt auf Gefrier/Tau-Techniken (z. B. Kreislaufführung von Zellen zwischen Trockeneis und 37 °C warmem Wasserbad); Feststoffscherverfahren unter Verwendung einer Hughes- oder French-Presse; Detergenslyse (z. B. anionische Detergenslösungen, wie Tween, Triton, NP-40 usw.); hypotonische Lösungslyse (z. B. Wasser, Zitratpuffer); Flüssigkeitenscherverfahren (Homogenisierer; Impingement-Jet-Mikrofluidisierer); Sonifikation (Ultraschall), gespalten. Nach der Zellyse können Zelttrümmer und -kerne durch Sedimentation unter Anwendung von Zentrifugation entfernt werden. Die Membranfraktion wird beispielsweise bei 100.000 g für 60 Minuten präzipitiert, und die Membranfraktion kann unter Verwendung eines Detergens weiter solubilisiert werden. Beispielsweise spielsweise wird in dem von Li et al., oben, gelehrten Solubilisierungsverfahren das Membranfraktionspellet aus dem 100.000-g-Zentrifugationsschritt in Puffer erneut suspendiert und 60 Minuten bei 4 °C mit 1 % CHAPSO behandelt und 60 Minuten zentrifugiert. Durch dieses Detergenssolubilisierungsverfahren enthält der Überstand der 100.000-g-Fraktion die solubilisierte γ-Secretase.
Die oben solubilisierte Fraktion wird in den hierin beschriebenen γ-Secretaseassays verwendet.
III. Protein- oder Peptidherstellung und -reinigung
Die vorliegende Erfindung liefert lösliche Notch-Proteinsubstrate zur Verwendung bei der Identifizierung von Modulatoren von γ-Secretase, die für die APP-Spaltung spezifisch sind, die Spaltung von Notch jedoch nicht inhibieren. Solche Substrate können durch herkömmliche automatisierte Peptidsyntheseverfahren oder durch rekombinante Expression hergestellt werden.
A. Synthetische Peptidherstellung
Die Peptide oder selbst das Vollängen-Fusionspolypeptid der Erfindung können in Lösung oder auf einem festen Träger gemäß herkömmlicher Techniken synthetisiert werden. Es sind verschiedene automatische Synthetisierer kommerziell erhältlich und können gemäß bekannten Protokollen verwendet werden. Siehe beispielsweise Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 6442, 1983; Merrifield, Science, 232: 341–347,1986; und Barany und Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, Hrsg., Academic Press, New York, 1–284, 1979, alle hierin durch Verweis aufgenommen. Die neuen Notch-Fusionsproteinsubstrate der Erfindung umfassen die γ-Secretase-Spaltstellen 1731/1732 und 1743/1744, die für die Spaltung durch γ-Secretase zugänglich sind, ohne weiteres synthetisiert und dann in γ-Secretase-Screeningassays analysiert werden können.
In besonders bevorzugten Verfahren werden die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung durch Festphasentechnologie unter Einsatz von Model 433A von Applied Biosystems Inc. synthetisiert. Die Reinheit irgendeines gegebenen Notch-Fusionsproteins, erzeugt durch automatisierte Peptidsynthese oder durch rekombinante Verfahren, kann unter Verwendung der Umkehrphasen-HPLC-Analyse bestimmt werden. Die chemische Authentizität jedes Peptids kann durch irgendein Verfahren, das einem Fachmann allgemein bekannt ist, nachgewiesen werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Authentizität durch Massenspektrometrie nachgewiesen.
Des weiteren können die Fusionsproteine unter Verwendung der Aminosäureanalyse, in der Mikrowellenhydrolysen durchgeführt werden, quantifiziert werden. Solche Analysen können einen Mikrowellenofen wie den MDS 2000-Mikorwellenofen der CEM Corporation nutzen. Das Peptid (ungefähr 2 mg Protein) wird mit 6 N HCl (Pierce Constant Boiling z. B. etwa 4 ml) mit ungefähr 0,5 % (Volumen zu Volumen) Phenol (Mallinckrodt) kontaktiert. Vor der Hydrolyse werden die Proben abwechselnd evakuiert und mit N₂ gespült. Die Proteinhydrolyse wird unter Verwendung eines Zweistufenverfahrens durchgeführt. Während der ersten Stufe werden die Fusionsproteine einer Reaktionstemperatur von etwa 100 °C unterzogen, und diese Temperatur wird 1 Minute gehalten. Unmittelbar nach dem ersten Schritt wird die Temperatur auf 150 °C erhöht und diese Temperatur etwa 25 Minuten gehalten. Nach dem Abkühlen wurden die Proben getrocknet, und die Aminosäure aus den hydrolysierten Fusionsproteinproben wurde unter Verwendung von 6-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat derivatisiert, wodurch stabile Harnstoffe erhalten wurden, die bei 395 nm fluoreszieren (WatersAccQ Tag Chemistry Package). Die Proben wurden durch Umkehrphasen-HPLC analysiert, und die Quantifikation kann unter Verwendung eines verstärkten Integrators erreicht werden.
B. Rekombinante Proteinherstellung
Als eine Alternative zur automatisierten Peptidsynthese kann die rekombinante DNA-Technologie eingesetzt werden, wobei eine Nukleotidsequenz, die ein Peptid der Erfindung kodiert, in einen Expressionsvektor eingeführt, transformiert oder in eine geeignete Wirtszelle tranfiziert und unter Bedingungen, die für die Expression geeignet sind, wie nachstehend beschrieben, kultiviert wird. Rekombinante Verfahren sind insbesondere für die Herstellung längerer Polypeptide, die die Peptidsequenzen der Erfindung umfassen, bevorzugt.
Aus der Offenbarung neuer Notch-Fusionsproteinsubstrate der vorliegenden Erfindung können auch die Fusionspolypeptide durch rekombinante Techniken hergestellt werden. Es können viele Expressionsvektor/Wirtssysteme genutzt werden, die die Peptid- oder Fusionspoly peptid-kodierende Sequenz enthalten oder exprimieren. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Mikroorganismen, wie Bakterien, transformiert mit rekombinanter Bakteriophage, Plasmid- oder Kosmid-DNA-Expressionsvektoren; Hefe, transformiert mit Hefeexpressionsvektoren; Insektenzellsysteme, infiziert mit Virusexpressionsvektoren (z. B. Baculovirus); Pflanzenzellsysteme, transfiziert mit Virusexpressionsvektoren (z. B. Blumenkohlmosaik-Virus, CaMV; Tabakmosaik-Virus, TMV) oder transformiert mit bakteriellen Expressionsvektoren (z. B. Ti- oder pBR322-Plasmid); oder tierische Zellsysteme. Säugerzellen, die bei rekombinanten Proteinherstellungen nützlich sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf VERO-Zellen, HeLa-Zellen, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), COS-Zellen (wie COS-7-), W138-, BHK-, HepG2-, 3T3-, RIN-, MDCK-, A549-, PC12-, K562- und 293-Zellen. Exemplarische Protokolle für die rekombinante Expression der Notch-Fusionsproteine in Bakterien, Hefe und anderen Wirbellosen werden hierin nachstehend beschrieben.
Expressionsvektoren zur Verwendung in prokaryotischen Wirten umfassen allgemein eines oder mehrere phenotypische selektierbare Markergene. Solche Gene kodieren im allgemeinen beispielsweise ein Protein, das Antibiotikaresistenz verleiht oder das eine auxotrophe Voraussetzung liefert. Ein breiter Bereich solcher Vektoren ist ohne weiteres von kommerziellen Quellen erhältlich. Beispiele umfassen pSPORT-Vektoren, pGEM-Vektoren (Promega), pPROEX-Vektoren (LTI, Bethesda, MD), Bluescript-Vektoren (Stratagene), pET-Vektoren (Novagen) und pQE-Vektoren (Qiagen). Die DNA-Sequenz, die das gegebene Notch-Fusionsprotein kodiert, wird durch PCR amplifiziert und in einen Vektor, wie zum Beispiel pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, NJ) geklont, der so gestaltet ist, daß er ein Fusionsprotein, umfassend Glutathion-S-transferase (GST), kodiert durch den Vektor, und ein Protein, kodiert durch ein DNA-Fragment, das in die Klonstelle des Vektors eingeführt wurde, produziert. Die Primer für die PCR können beispielsweise eine geeignete Spaltstelle umfassen. Es ist davon auszugehen, daß die Behandlung des rekombinanten Fusionsproteins mit Thrombin oder Faktor Xa (Pharmacia, Piscataway, NJ) das Fusionsprotein spaltet, wodurch das Substrat oder das Substrat-enthaltende Polypeptid aus dem GST-Teil freigesetzt wird. Das pGEX-3X/Fusionspeptid-Konstrukt wird in E. coli-XL-1-Blue-Zellen transformiert (Stratagene, La Jolla CA), und einzelne Transformanten wurden isoliert und herangezogen. Die Plasmid-DNA aus einzelnen Transformanten wird gereinigt und unter Verwendung eines automatisier ten Sequenzers zur Bestätigung der Gegenwart des gewünschten Peptid- oder Polypeptidkodierenden Nukleinsäureinserts in der richtigen Richtung teilweise sequenziert.
Die Induktion des GST/Substrat-Fusionsproteins wird durch das Heranziehen der transformierten XL-1-Blue-Kultur bei 37 °C in LB-Medium (ergänzt mit Carbenicillin) auf eine optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm von 0,4, gefolgt von der weiteren Inkubation für 4 Stunden in Gegenwart von 0,5 mM Ísopropyl *-D-Thiogalactopyranosid (Sigma Chemical Co., Sr. Louis MO), herbeigeführt.
Das GST-Fusionsprotein, das erwartungsgemäß als ein unlöslicher Einschlußkörper in die Bakterien hergestellt wird, kann wie folgt gereinigt werden. Zellen werden durch Zentrifugation geerntet; in 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA gewaschen; und 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,1 mg/ml Lysozym (Sigma Chemical Co.) behandelt. Das Lysat wird durch Sonifikation geklärt, und Zelttrümmer werden durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 12.000 × g pelletiert. Das Fusionsprotein-enthaltende Pellet wird in 50 mM Tris, pH 8, und 10 mM EDTA erneut suspendiert, über 50 % Glycerin geschichtet und 30 min bei 6000 × g zentrifugiert. Das Pellet wird in Standard-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), frei von Mg++ und Ca++, erneut suspendiert. Das Fusionsprotein wird durch Fraktionierung des erneut suspendierten Pellets in einem denaturierenden SDS-Polyacrylamidgel (Sambrook et al. Hrsg. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989) weiter gereinigt. Das Gel wird in 0,4 M KCl getränkt, um das Protein zu visualisieren, das in Gel-Laufpuffer ohne SDS exzidiert und elektroeluiert wird. Wird das GST/Notch-Fusionsprotein in Bakterien als ein lösliches Protein erzeugt, kann es unter Verwendung des GST Purification Module (Pharmacia Biotech) gereinigt werden.
Das Fusionsprotein kann der Thrombindigestion unterzogen werden, um GST aus dem reifen Notch-Fusionspolypeptid abzuspalten. Die Digestionsreaktion (20–40 μg Fusionsprotein, 20–30 Einheiten humanes Thrombin (4000 U/mg (Sigma) in 0,5 ml PBS) wird 16–48 Std. bei Raumtemperatur inkubiert und auf einem denaturierenden SDS-PAGE-Gel lokalisiert, um so die Reaktionsprodukte zu fraktionieren. Das Gel wird in 0,4 M KCl getränkt, um die Proteinbanden zu visualisieren. Die Identität der Proteinbande, die dem erwarteten Molekulargewicht des Fusionspolypeptids entspricht, kann durch teilweise Aminosäuresequenzanalyse unter Verwendung eines automatisierten Sequenzers (Applied Biosystems Modell 473A, Foster City, CA) bestätigt werden.
Alternativ kann die DNA-Sequenz, die das vorhergesagte Substrat, das Fusionspolypeptid enthält, kodiert, in ein Plasmid, enthaltend einen gewünschten Promotor und gegebenenfalls eine Leader-Sequenz, geklont werden (siehe z. B. Retter et al., Science, 240: 1041–43, 1988). Die Sequenz dieses Konstrukts kann durch automatisierte Sequenzierung bestätigt werden. Das Plasmid wird dann unter Verwendung von Standardverfahren, die die CaCl₂-Inkubation und Hitzeschockbehandlung der Bakterien nutzen, in E. coli transformiert (Sambrook et al., oben). Die transformierten Bakterien werden in LB-Medium, das mit Carbenicillin angereichert ist, herangezogen, und die Produktion des exprimierten Proteins wird durch das Heranziehen in demselben Medium induziert. Sofern vorhanden, wird die Leader-Sequenz die Sekretion des reifen Notch-basierenden Fusionsproteins herbeiführen und wird während der Sekretion gespalten.
Das sekretierte rekombinante Protein wird aus den bakteriellen Kulturmedien durch die hierin beschriebenen Verfahren gereinigt.
Dem ähnlich können Hefewirtszellen der Gattungen, umfassend Saccharomyzes, Pichia und Kluveromyzes, zur Erzeugung des rekombinanten Peptids eingesetzt werden. Bevorzugte Hefewirte sind S. cerevisiae und P. pastores. Hefevektoren werden oftmals einen Ursprung der Replikationssequenz aus einem 2T-Hefeplasmid, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen zur Polyadenylierung, Sequenzen zur Transkriptionstermination und ein selektierbares Markergen enthalten. Vektoren, die sowohl in Hefe als auch E. coli replizierbar sind (Shuttle-Vektoren genannt) können auch verwendet werden. Neben den oben genannten Merkmalen von Hefevektoren wird ein Shuttlevektor auch Sequenzen zur Replikation und Selektion in E. coli umfassen. Die direkte Sekretion von Polypeptid, exprimiert in Hefewirten, kann durch den Einschluß einer Nukleotidsequenz, die die Hefe-I-Faktor-Leader-Sequenz am 5'-Ende der Substrat-kodierenden Nukleotidsequenz kodiert, herbeigeführt werden.
Im allgemeinen kann ein gegebenes Substrat unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Expressionssystems, z. B. dem Pichia Expression System (Invitrogen, San Diego, CA), gemäß den Instruktionen des Herstellers rekombinant exprimiert werden. Dieses System ist zur Lenkung der Sekretion ebenso auf die Prä-pro-alpha-Sequenz angewiesen, die Transkription des Inserts wird jedoch von dem Alkoholoxidasepromotor (AOX1-Promotor) bei der Induktion durch Methanol angetrieben.
Das sekretierte rekombinante Substrat wird aus dem Hefewachstumsmedium beispielsweise durch die Verfahren, die zur Reinigung des Substrats aus bakteriellen und Säugerzellüberständen verwendet wurden, gereinigt.
Alternativ kann eine synthetische DNA, die das neue Substrat der Erfindung kodiert, in den Baculovirus-Expressionsvektor pVL1393 (PharMingen, SanDiego, CA; Luckow and Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988)) geklont werden. Dieser Substrat-enthaltende Vektor wird dann gemäß den Anweisungen des Herstellers (PharMingen) dazu verwendet, Spodoptera frugiperda-Zellen in sF9-Protein-freien Medien zu infizieren und ein rekombinantes Protein zu erzeugen. Das Protein oder Peptid wird gereinigt und aus den Medien unter Verwendung einer Heparin-Sepharose-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) und sequentiellen molekularen Trennsäulen (Amicon, Beverly, MA) konzentriert und in PBS erneut suspendiert. Die SDS-PAGE-Analyse zeigt eine einzelne Bande und bestätigt die Größe des Proteins, und die Edman-Sequenzierung auf einem Porton-2090-Peptide-Sequenzierer bestätigt seine N-terminale Sequenz.
Alternativ kann das Notch-Fusionsproteinsubstrat in einem Insektensystem exprimiert werden. Insektensysteme für die Proteinexpression sind dem Fachmann allgemein bekannt. In einem dieser Systeme wird das Autographa californica-Nucleopolyhedrovirus (AcNPV) als ein Vektor zur Expression von Fremdgenen in Spodoptera frugiperda-Zellen oder in Trichoplusia-Larven verwendet. Die Substrat-kodierende Sequenz wird in eine nicht-essentielle Region des Virus, wie das Polyhedrin-Gen, geklont und unter Kontrolle des Polyhedrin-Promotors gesetzt. Die erfolgreiche Insertion des Substrats wird das Polyhedrin-Gen inaktiv machen und ein rekombinantes Virus erzeugen, dem es an der Hüllproteinhülle fehlt. Die rekombinanten Viren werden dann zur Infektion von S. frugiperda-Zellen oder Trichoplusia-Larven verwendet, worin das Substrat exprimiert wird (Smith et al., J Virol 46: 584, 1983; Engelhard EK et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 3224–7, 1994).
Säugerwirtssysteme zur Expression rekombinanter Proteine sind dem Fachmann ebenso allgemein bekannt. Wirtszellenstämme können hinsichtlich ihrer besonderen Fähigkeit, das exprimierte Protein zu prozessieren oder bestimmte posttranslationale Modifikationen zu erzeugen, die zur Bereitstellung von Proteinaktivität nützlich sind, ausgewählt werden. Solche Modifikationen der Polypeptide umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Acetylierung, Carboxylierung, Glycosylierung, Phosphorylierung, Lipidbeladung und Acylierung. Die posttranslationale Prozessierung, die eine „Prepro"-Form aus dem Protein spaltet, kann für eine richtige Insertion, Faltung und/oder Funktion ebenso wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen, wie CHO, HeLa, MDCK, 293,W138 und dergleichen, haben eine spezielle zelluläre Maschinerie und charakteristische Mechanismen für derartige posttranslationale Aktivitäten und können zur Sicherstellung der richtigen Modifikation und Prozessierung des eingeführten Fremdproteins ausgewählt werden.
Die transformierten Zellen werden bevorzugt für die Langzeit-Hochleistungs-Proteinproduktion verwendet, und als solches ist eine stabile Expression wünschenswert. Nach der Transformation solcher Zellen mit Vektoren, die selektierbare Marker und die gewünschte Expressionskassette enthalten, können die Zellen 1–2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen, bevor sie in selektive Medien übertragen werden. Der selektierbare Marker soll selektionsresistent machen, und seine Gegenwart ermöglicht das Wachstum und die Gewinnung von Zellen, die erfolgreich die eingeführten Sequenzen exprimieren. Resistente Klumpen stabil transformierter Zellen können unter Verwendung von Gewebekulturtechniken, die für die Zelle geeignet sind, proliferiert werden.
Zur Gewinnung der Zellen, die für die rekombinante Proteinproduktion transformiert worden sind, können zahlreiche Selektionssysteme verwendet werden. Solche Selektionssysteme umfassen, sind aber nicht beschränkt auf HSV-Thymidinkinase-, Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase- und Adeninphosphoribosyltransferase-Gene, in tk-, hgprt- beziehungsweise aprt-Zellen. Auch Anti-Metabolitresistenz kann als Grundlage der Selektion für dhfr, das Methotrexat-resistent macht; gpt, das Mycophenolsäure-resistent macht; neo, das Aminoglycosid-G418-resistent macht; ALS, das Chlorsulfuron-resistent macht, und hygro, das Hygromycin-resistent macht, verwendet werden. Zusätzliche selektierbare Gene, die nützlich sein können, umfassen trpB, durch das Zellen Indol anstelle von Tryptophan nutzen können, oder hisD, durch das Zellen Histinol anstelle von Histidin nutzen können. Marker, die ein visuelles Anzeichen für die Identifikation von Transformanten bereitstellen, umfassen Anthocyanine, b-Glucuronidase und deren Substrate, GUS und Luciferase und deren Substrat Luciferin.
C. Ortsspezifische Mutagenese
Die ortsspezifische Mutagenese ist eine andere Technik, die bei der Herstellung einzelner γ-Secretase-Substratpeptide und insbesondere -Fusionspolypeptide, die als eine Komponente eines der γ-Secretase-Substrat-Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung umfassen, nützlich ist. Diese Technik nutzt die spezifische Mutagenese der zugrundeliegenden DNA (die die für die Modifikation angestrebte Aminosäuresequenz kodiert). Die Technik liefert ferner eine verfügbare Fähigkeit zur Herstellung und zum Testen von Sequenzvarianten, die ein oder mehrere der vorstehenden Betrachtungen beinhalten, durch die Einführung einer oder mehrerer Nukleotidsequenzänderungen in die DNA. Die ortsspezifische Mutagenese ermöglicht die Produktion von Mutanten durch die Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen, die die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation sowie ausreichend benachbarte Nukleotide kodieren, um so eine Primersequenz mit ausreichender Größe und Sequenzkomplexität für die Bildung eines stabilen Duplex auf beiden Seiten der zu kreuzenden Deletionsverbindung bereitzustellen. Typischerweise ist ein Primer aus etwa 17 bis 25 Nukleotiden bevorzugt, wobei etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Verbindung der Sequenz verändert sind.
Die Technik nutzt typischerweise einen Bakteriophagevektor, der sowohl in einsträngiger als auch doppelsträngiger Form existiert. Typische Vektoren, die bei der ortsspezifischen Mutagenese nützlich sind, umfassen Vektoren, wie die M13-Phage. Diese Phagevektoren sind kommerziell erhältlich, und ihre Verwendung ist dem Fachmann allgemein bekannt. Auch doppelsträngige Plasmide werden routinemäßig bei der ortsspezifischen Mutagenese eingesetzt, wodurch der Schritt des Transferierens des betreffenden Gens aus einer Phage in ein Plasmid beseitigt wird.
Im allgemeinen wird die ortsspezifische Mutagenese durchgeführt, indem zuerst ein einsträngiger Vektor erhalten wird oder zwei Stränge eines doppelsträngigen Vektors, der in seiner Sequenz eine DNA-Sequenz, die das gewünschte Protein kodiert, enthält, geschmolzen werden. Ein Oligonukleotidprimer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird synthetisch herstellt. Dieser Primer wird dann mit dem einsträngigen DNA-Präparat annealt, wobei bei der Auswahl der Hybridisierungsbedingungen (Annealing-Bedingungen) der Grad an Fehlpaarung berücksichtigt werden sollte, und DNA-polymerisierenden Enzymen, wie dem E. coli-Polymerase I Klenow-Fragment, unterzogen, um die Synthese des die Mutation tragenden Stranges zu vervollständigen. So wird ein Heteroduplex gebildet, im dem ein Strang die ursprüngliche nicht-mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplexvektor wird dann zur Transformation geeigneter Zellen, wie E. coli-Zellen, verwendet, und es werden Klone ausgewählt, die rekombinante Vektoren umfassen, die die mutierte Sequenzanordnung tragen.
Selbstverständlich ist der oben beschriebene Ansatz zur ortsspezifischen Mutagenese nicht das einzige Verfahren zur Erzeugung potentiell nützlicher Mutantenpeptidspezies und als solcher nicht einschränkend. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch andere Verfahren zur Erreichung der Mutagenese, wie beispielsweise die Behandlung rekombinanter Vektoren, die das betreffende Gen tragen, mit Mutagenen wie Hydroxylamin, um Sequenzvarianten zu erhalten.
D. Proteinreinigung
Die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung sind möglicherweise zu reinigen. Proteinreinigungstechniken sind dem Fachmann allgemein bekannt. Diese Techniken umfassen, auf einer Ebene, die Rohfraktionierung des zellulären Milieus in Polypeptid- und Nicht-Polypeptid-Fraktionen. Nach der Trennung des Peptids oder der Polypeptide der Erfindung von anderen Proteinen können die betreffenden Fusionspolypeptide oder -peptide unter Verwendung chromatographischer und elektrophoretischer Techniken weiter gereinigt werden, um so eine teilweise oder vollständige Reinigung (oder Reinigung zur Homogenität) zu erreichen. Analytische Verfahren, die besonders zur Herstellung eines reinen Peptids geeignet sind, sind Ionenaustauschchromatographie, Ausschlußchromatographie; Polyacrylamidgelelektrophorese; isoelektrische Fokussierung. Ein besonders effizientes Verfahren zur Reinigung von Fusionsproteinen ist die Schnelle-Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) oder auch die Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC). In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird die NusA-Notch-Fusion unter Verwendung immobilisierter Metallaffinitätschromatographie (IMAC) isoliert.
IMAC wird überwiegend bei der Reinigung Polyhistidin-markierter rekombinanter Proteine verwendet. In der vorliegenden Erfindung umfaßt der C-Terminus des Fusionsproteins eine Polyhistidinmarkierung, wodurch eine Reinigung durch diese leistungsstarke Technik ermöglicht wird. Diese Reinigung vertraut auf die natürliche Neigung von Histidin, zweiwertige Metalle zu chelatisieren. Durch die Plazierung eines Metallions auf einem chromatographischen Träger wird die Reinigung der Histidin-markierten Proteine möglich. Dies ist ein sehr effizientes Verfahren, das von Fachleuten für zahlreiche Proteinreinigungsverfahren eingesetzt wird. Exemplarische Bedingungen einer bevorzugten Ausführungsform zur Isolierung des Proteins der vorliegenden Erfindung sind in Beispiel 1 beschrieben. Es sollte jedoch selbstverständlich sein, daß Fachleute die Bedingungen und Medien variieren und trotzdem eine Reinigung gemäß der vorliegenden Erfindung erreichen können. Aus diesem Grund werden Fachleute auf US-Patent Nr. 4,431,546 verwiesen, das Verfahren der metallaffinitätschromatographischen Trennung biologischer oder ähnlicher Substanzen aus einem Gemisch ausführlich beschriebt. Die in dem zuvor genannten Patent beschriebenen chromatographischen Medien umfassen Bindungsmaterialen, die Liganden aufweisen, die mindestens eine der Anthrachinon-, Phthalocyanin- oder aromatischen Azogruppen, in Gegenwart von mindestens einem Metallion, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ca²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺, Al³ ⁺, Co² ⁺, Ni² ⁺, Cu²⁺ oder Zn² ⁺, enthalten. Zusätzliche Medien und Bedingungen werden beispielsweise unter http://www.affiland.com/imac/nta.htm und http://www.affiland.com/imac/pdc.htm beschrieben.
Bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen die Reinigung, und in besonderen Ausführungsformen die substantielle Reinigung, eines kodierten Polypeptids, Proteins oder Peptids. Der Ausdruck „gereinigtes Polypeptid, Protein oder Peptid", wie hierin verwendet, soll sich auf eine Zusammensetzung beziehen, die aus anderen Komponenten isoliert wurde, wobei das Polypeptid, Protein oder Peptid, bezogen auf die zellulären oder Synthesekomponenten, die zur Erzeugung des Proteins verwendet werden, in beliebigem Grad gereinigt wird. Ein gereinigtes Polypeptid, Protein oder Peptid bezieht sich daher auf ein Polypeptid, Protein oder Peptid, das frei von der Umgebung, in der es natürlich vorkommt, ist.
Im allgemeinen bezieht sich „gereinigt" auf eine Polypeptid-, Protein- oder Peptidzusammensetzung, die zur Entfernung verschiedener anderer Komponenten der Fraktionierung unterzogen worden ist, und die ihre exprimierte biologische Aktivität im wesentlichen behält. Wenn der Ausdruck „im wesentlichen gereinigt" verwendet wird, wird sich diese Bezeichnung auf eine Zusammensetzung beziehen, in der das Polypeptid, Protein oder Peptid die Hauptkomponente der Zusammensetzung bildet, wie z. B. etwa 50 %, etwa 60 %, etwa 70 %, etwa 80 %, etwa 90 %, etwa 95 % oder mehr der Proteine in der Zusammensetzung bildet.
Im Lichte der vorliegenden Offenbarung werden einem Fachmann verschiedene Verfahren zur Quantifizierung des Reinigungsgrades des Polypeptids, Proteins oder Peptids bekannt sein. Diese umfassen beispielsweise die Bestimmung der spezifischen Aktivität einer aktiven Fraktion oder die Bewertung der Menge an Polypepti den in einer Fraktion durch SDS/PAGE-Analyse. Ein bevorzugtes Verfahren zur Bewertung der Reinheit einer Fraktion ist die Berechnung der spezifischen Aktivität der Fraktion zum Vergleich dieser mit der spezifischen Aktivität des Ausgangsextraktes, um so den Reinheitsgrad zu berechnen, der hierin durch „-fache Reinigungszahl" bewertet wird. Die tatsächlich zur Darstellung der Menge an Aktivität verwendeten Einheiten werden selbstverständlich von der jeweiligen gewählten Assaytechnik, die der Reinigung folgt, und davon, ob das exprimierte Polypeptid, Protein oder Peptid eine detektierbare Aktivität zeigt oder nicht, abhängen.
Einem Fachmann werden verschiedene Techniken, die zur Verwendung bei der Proteinreinigung geeignet sind, bekannt sein. Diese umfassen beispielsweise die Präzipitation mit Ammoniumsulfat, PEG, Antikörpern und dergleichen oder Hitzedenaturierung, gefolgt von Zentrifugation; Chromatographieschritte, wie Innenaustausch-, Gelfiltrations-, Umkehrphasen-, Hydroxylapatit- und Affinitätschromatographie; isoelektrische Fokussierung; Gelelektrophorese und Kombinationen dieser und anderer Techniken. Wie in der Technik allgemein bekannt, wird angenommen, daß die Reihenfolge der Durchführung der verschiedenen Reinigungsschritte verändert werden kann oder bestimmte Schritte weggelassen werden können, und trotzdem ein geeignetes Verfahren zur Herstellung eines im wesentlichen reinen Polypeptids, Proteins oder Peptids erhalten wird.
Es gibt kein allgemeines Erfordernis, daß das Polypeptid, Protein oder Peptid immer in seinem am stärksten gereinigten Zustand bereitzustellen ist. Tatsächlich ist anzunehmen, daß weniger stark gereinigte Produkte in bestimmten Ausführungsformen nützlich sind. Die teilweise Reinigung kann unter Verwendung wenigerer Reinigungsschritte in Kombination oder durch die Nutzung verschiedener Formen desselben allgemeinen Reinigungsschemas herbei geführt werden. Beispielsweise wird angenommen, daß eine Kationenaustausch-Säulenchromatographie, die unter Nutzung eines HPLC-Gerätes durchgeführt wird, im allgemeinen zu einer höheren „-fachen" Reinigung führt, als dieselbe Technik, die ein Niedrigdruckchromatographiesystem nutzt. Verfahren, die einen geringeren relativen Reinigungsgrad zeigen, können Vorteile bei der Gesamtgewinnung des Proteinproduktes oder beim Erhalt der Aktivität eines exprimierten Proteins bieten.
Bekanntermaßen kann die Migration eines Polypeptids mit unterschiedlichen SDS/PAGE-Bedingungen, manchmal signifikant, variieren (Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425, 1977). Es ist daher anzunehmen, daß unter unterschiedlichen Elektrophoresebedingungen die scheinbaren Molekulargewichte gereinigter oder teilweise gereinigter Expressionsprodukte variieren können.
IV. Expressionskonstrukte zur Verwendung bei der Herstellung der Substrate der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung müssen die Notch-Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung exprimiert werden. Zum Erhalt einer solchen Expression wird die vorliegende Erfindung Vektoren, die Polynukleotidmoleküle zur Kodierung der Notch-Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung umfassen, sowie Wirtszellen, die mit solchen Vektoren transformiert wurden, einsetzen. Solche Polynukleotidmoleküle können zur Reproduktion in einem Wirt mit einem Vektor verbunden werden, der im allgemeinen einen selektierbaren Marker und einen Replikationsursprung umfaßt. Diese Elemente der Expressionskonstrukte, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden hierin nachstehend ausführlich beschrieben.
Die Expressionsvektoren umfassen DNA, die irgendeines der oben oder nachstehend beschriebenen gegebenen Peptid- oder Fusionspolypeptid-γ-Secretasesubstrate kodiert, die funktionsfähig mit geeigneten transkriptionalen oder translationalen regulatorischen Sequenzen verknüpft sind, wie denen aus einem Säuger-, mikrobiellen, viralen oder Insektgen. Beispiele für regulatorische Sequenzen umfassen transkriptionale Promotoren, Operatoren oder Enhancer, ribosomale mRNA-Bindungsstellen und geeignete Sequenzen, die die Transkription und Translation kontrollieren.
Die Ausdrücke „Expressionsvektor", „Expressionskonstrukt" oder „Expressionskassette" werden synonym durch diese Beschreibung hindurch verwendet und sollen alle Arten geneti scher Konstrukte umfassen, die eine Nukleinsäure enthalten, die für ein Genprodukt kodiert, in dem die gesamte Nukleinsäure-kodierende Sequenz oder ein Teil davon transkribiert werden kam.
Die Wahl eines geeigneten Expressionsvektors zur Expression der Fusionspolypeptide der Erfindung wird selbstverständlich von der zu verwendenden speziellen Wirtszelle abhängen und liegt im Ermessen des Fachmanns. Beispiele geeigneter Expressionsvektoren umfassen pcDNA3 (Invitrogen) und pSVL (Pharmacia Biotech). Ein bevorzugter Vektor zur Expression in der vorliegenden Erfindung ist pcDNA3.1-Hygro (Invitrogen). Expressionsvektoren zur Verwendung in Säuger-Wirtszellen können transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen aus viralen Genomen umfassen. Üblicherweise verwendete Promotorsequenzen und Enhancersequenzen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die aus dem humanen Cytomegalovirus (CMV), dem Adenovirus 2, denn Polyoma-Virus und dem Simian-Virus 40 (SV40). Verfahren zur Konstruktion von Säuger-Expressionsvektoren werden beispielsweise in Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983); Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986); Cosman et al. (Nature 312: 768, 1984); EP-A-0367566 und WO 91/18982 beschrieben.
Das Expressionskonstrukt wird eine Nukleinsäureregion umfassen, die die jeweiligen Notch-Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung kodiert. Kodierende Regionen zur Verwendung bei der Konstruktion solcher Expressionsvektoren sollten zumindest die γ-Secretase-Spaltung der hierin beschriebenen Fusionsproteine kodieren, obgleich in Erwägung gezogen werden kann, daß größere Polypeptide kodiert werden können, so lange das erzeugte Peptid die γ-Seeretase-Spaltstellen 1731/1732 und 1743/1744 umfaßt, die für die Spaltung durch γ-Secretase zugänglich sind.
In bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung kann das Expressionskonstrukt ferner einen selektierbaren Marker umfassen, der die Detektion der Expression des Peptids oder Polypeptids ermöglicht. Für gewöhnlich unterstützt der Einschluß eines Arzneimittelselektionsmarkers das Klonen und die Selektion von Transformanten, beispielsweise Neomycin, Puromycin, Hygromycin, DHFR, Zeocin und Histidinol. Alternativ können Enzyme, wie Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase (tk) (eukaryotisch), b-Galactosidase, Luciferase oder Chloramphenicol-acetyltransferase (CAT) (prokaryotisch) eingesetzt werden. Immunologi sche Marker können auch eingesetzt werden. Beispielsweise können Epitopmarkierungen wie das FLAG-System (IBI, New Haven, CT), HA und das 6xHis-System (Qiagen, Chatsworth, CA) eingesetzt werden. Überdies können auch das Glutathion-S-Transferasesystem (GST-System) (Pharmacia, Piscataway, NJ) oder das Maltosebindungsproteinsystem (NEB, Beverley, MA) verwendet werden. Es wird nicht angenommen, daß der eingesetzte selektierbare Marker wichtig ist, so lange er gleichzeitig mit der Nukleinsäure, die ein Genprodukt kodiert, exprimiert werden kann. Weitere Beispiele für selektierbare Marker sind dem Fachmann allgemein bekannt. Besonders bevorzugte selektierbare Marker, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind Neomycinresistenz- oder ein GFP-Marker.
Die Expression erfordert, daß in den Vektoren geeignete Signale bereitgestellt werden. Dieser Abschnitt umfaßt eine Erörterung verschiedener regulatorischer Elemente, wie Enhancer/Promotoren, sowohl aus viralen als auch Säuger-Quellen, die zum Antrieb der Expression der betreffenden Nukleinsäuren in Wirtszellen verwendet werden können. Elemente, die die Messenger-RNA-Stabilität und -translationsfähigkeit in Wirtszellen optimieren sollen, werden auch definiert. Die Bedingungen zur Verwendung zahlreicher dominanter Arzneimittelselektionsmarker zur Etablierung permanenter, stabiler Zellklone, die die Produkte exprimieren, werden ebenso bereitgestellt, wie auch ein Element, das die Expression der Arzneimittelselektionsmarker mit der Expression des Mutantenphenotyps verknüpft.
In bevorzugten Ausführungsformen steht die Nukleinsäure, die das gegebene Peptid kodiert, oder die Nukleinsäure, die einen selektierbaren Marker kodiert, unter der transkriptionalen Kontrolle eines Promotors. Ein „Promotor" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die von der synthetischen Maschinerie der Zelle oder der eingeführten synthetischen Maschinerie, die die spezifische Transkription eines Gens initiieren muß, erkannt wird.
Nukleotidsequenzen sind funktionsfähig verknüpft, wenn die regulatorische Sequenz funktionell mit der DNA, die das Notch-Fusionsprotein kodiert, zusammenhängt. Daher ist eine Promotor-Nukleotidsequenz funktionsfähig mit einer gegebenen DNA-Sequenz verknüpft, wenn die Promotor-Nukleotidsequenz die Transkription der Sequenz dirigiert. Dem ähnlich bedeutet der Ausdruck „unter transkriptionaler Kontrolle", daß sich der Promotor an der richtigen Stelle und in richtiger Ausrichtung, bezogen auf die Nukleinsäure, befindet, um die RNA-Polymeraseinitiation und -expression des Gens zu kontrollieren.
Der Ausdruck Promotor bezieht sich hierin auf eine Gruppe transkriptionaler Kontrollmodule, die sich um die Initiationsstelle für die RNA-Polymerase II ballen. Viele der Erkenntnisse darüber, wie Promotoren organisiert werden, stammen aus Analysen mehrerer viraler Promotoren, einschließlich derer für die HSV-Thymidinkinase (tk) und SV40-frühe Transkriptionseinheiten. Diese Studien, verstärkt durch die derzeitige Arbeit, haben gezeigt, daß Promotoren aus einzelnen funktionalen Modulen bestehen, die alle aus ungefähr 7–20 bp DNA bestehen, und eine oder mehrere Erkennungsstellen für transkriptionale Aktivator- oder Repressorproteine enthalten.
Mindestens ein Modul in jedem Promotor positioniert die Startstelle für die RNA-Synthese. Das beste bekannte Beispiel hierfür ist die TATA-Box, aber in einigen Promotoren ohne TATA-Box, wie in dem Promotor für das terminale Säuger-Desoxynukleotidyltransferase-Gen und dem Promotor für die späten SV40-Gene, hilft ein einzelnes Element, das die Startstelle selbst überlappt, den Initiationsort zu fixieren.
Zusätzliche Promotorelemente regulieren die Häufigkeit der transkriptionalen Initiation. Typischerweise befinden sich diese in der Region 30–110 bp stromaufwärts der Startstelle, obgleich jüngst gezeigt worden ist, daß zahlreiche Promotoren auch stromabwärts der Startstelle funktionale Elemente enthalten. Der Abstand zwischen Promotorelementen ist häufig flexibel, so daß die Promotorfunktion konserviert wird, wenn Elemente, bezogen aufeinander, invertiert oder bewegt werden. In dem tk-Promotor kann der Abstand zwischen den Promotorelementen auf 50 bp erhöht werden, bevor die Aktivität beginnt nachzulassen. In Abhängigkeit des Promotors scheint es, daß einzelne Elemente zur Aktivierung der Transkription entweder kooperativ oder unabhängig fungieren können.
Es wird angenommen, daß der jeweilige, zur Kontrolle der Expression einer betreffenden Nukleinsäuresequenz eingesetzte Promotor nicht wichtig ist, so lange er die Expression der Nukleinsäure in der angestrebten Zelle lenken kann. Wenn daher eine menschliche Zelle angestrebt ist, wird die Nukleinsäure-kodierende Region bevorzugt neben einen Promotor und unter dessen Kontrolle gesetzt, der in einer menschlichen Zelle exprimiert werden kann. Allgemein gesprochen, kann ein solcher Promotor entweder einen menschlichen oder einen viralen Promotor umfassen.
In verschiedenen Ausführungsformen können der Human Cytomegalovirus (CMV) Immediate Early Gene-Promotor, der SV40-frühe Promotor, der Rous Sarcoma Virus Long Terminal Repeat-Promotor, der β-Actin-Promotor, der Ratteninsulinpromotor, der Phosphoglycerinkinase-Promotor und der Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Promotor, die alle allgemein bekannte und einem Fachmann ohne weiteres zugängliche Promotoren sind, zum Erhalt einer Expression der betreffenden kodierenden Sequenz verwendet werden. Ebenso wird die Verwendung anderer viraler oder Säuger-, zellulärer oder bakterieller Phagepromotoren, die alle in der Technik bekannt sind, zum Erhalt der Expression der betreffenden kodierenden Sequenz als geeignet erachtet, mit der Maßgabe, daß die Expressionsniveaus für den gegebenen Zweck ausreichen. Durch den Einsatz eines Promotors mit allgemein bekannten Eigenschaften kann das Niveau und das Muster der Expression des betreffenden Proteins nach der Transfektion oder Transformation optimiert werden.
Die Auswahl eines Promotors, der als Antwort auf die spezifischen physiologischen oder synthetischen Signale reguliert wird, kann die induzierbare Expression des Genprodukts ermöglichen. Zur Produktion viraler Vektoren sind mehrere induzierbare Promotorsysteme erhältlich. Ein solches System ist das Ecdysonsystem (Invitrogen, Carlsbad, CA), das die regulierte Expression eines betreffenden Gens in Säugerzellen ermöglicht. Es besteht aus einem eng regulierten Expressionsmechanismus, der im Grunde keine Grundniveauexpression des Transgens, sondern eine über 200-fache Induzierbarkeit ermöglicht.
Ein anderes nützliches induzierbares System ist das Tet-Off^TM- oder Tet-On^TM-System (Clontech, Palo Alto, CA), das ursprünglich von Gossen und Bujard entwickelt wurde (Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 15; 89 (12): 5547–51, 1992; Gossen et al., Science, 268 (5218): 1766–9, 1995).
In Säugerzellen wird oftmals der CMV Immediate Early-Promotor zur Bereitstellung einer starken transkriptionalen Aktivierung verwendet. Modifizierte Versionen des CMV-Promotors, die weniger potent sind, werden ebenso verwendet, wenn reduzierte Niveaus der Expression des Transgens gewünscht sind. Retrovirale Promotoren, wie die LTRs aus MLV oder MMTV, werden als in der vorliegenden Erfindung nützlich betrachtet. Andere virale Promotoren, die verwendet werden können, umfassen SV40, RSV LTR; HIV-1- und HIV-2- LTR, Adenoviruspromotoren, wie aus der E1A-, E2A- oder MLP-Region, AAV LTR, das Blumenkohlmosaikvirus, HSV-TK und das Vogel-Sarkom-Virus.
In einigen Ausführungsformen können sich regulierbare Promotoren als nützlich erweisen. Solche Promotoren umfassen beispielsweise die, die hormon- oder zytokinregulierbar sind. Hormon-regulierbare Promotoren umfassen MMTV-, MT-1-, Ecdyson- und RuBisco- sowie andere hormon-regulierbare Promotoren wie die, die auf Thyroid-, Hypophysen- und Nebennierenhormone reagieren.
Ein anderes regulierendes Element, das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird, ist ein Enhancer. Dabei handelt es sich um genetische Elemente, die die Transkription aus einem Promotor an einer entfernten Position auf demselben Molekül von DNA verstärken. Enhancer sind so ähnlich wie Promotoren organisiert. Das heißt, sie bestehen aus vielen einzelnen Elementen, von denen jedes an eines oder mehrere transkriptionale Proteine bindet. Der wesentliche Unterschied zwischen Enhancern und Promotoren besteht in ihrer Funktion. Eine Enhancerregion als Ganze muß die Transkription in einiger Entfernung stimulieren können; dies muß nicht für eine Promotorregion oder ihre Bestandteile gelten. Andererseits muß ein Promotor eines oder mehrere Elemente aufwiesen, das/die die Initiation der RNA-Synthese an einer bestimmten Stelle und in einer bestimmten Ausrichtung lenken, wohingegen Enhancern diese spezifischen Eigenschaften fehlen. Oftmals überlappen sich Promotoren und Enhancer und grenzen aneinander an, wodurch es oftmals scheint, als hätten sie eine sehr ähnliche modulare Organisation. Enhancer, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind dem Fachmann allgemein bekannt und werden von dem jeweiligen eingesetzten Expressionssystem abhängen (Scharf D et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20: 125–62; Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol. 153: 516–544).
Nutzt ein Expressionskonstrukt ein cDNA-Insert, wird man typischerweise eine Polyadenylierungssignalsequenz aufnehmen, um so die richtige Polyadenylierung des Gentranskripts herbeizuführen. Für die Praxis der Erfindung ist irgendeine Polyadenylierungssignalsequenz, die von Zellen der ausgewählten transgenen Tierspezies erkannt wird, geeignet, wie humane oder Rinderwachstumshormon- und SV40-Polyadenylierungssignale.
Als ein Element der Expressionskassette wird auch ein Terminator in Betracht gezogen. Diese Elemente können die Mitteilungsniveaus erhöhen und das Hindurchlesen aus der Kassette in andere Sequenzen minimieren. Die primär eingesetzte Terminationsregion wird eine sein, die bequemlichkeitshalber ausgewählt wurde, da Terminationsregionen für die von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogenen Anwendungen relativ austauschbar erscheinen. Die Terminationsregion kann mit der transkriptionalen Initiation oder der betreffenden DNA-Sequenz nahe verwandt sein oder kann aus einer anderen Quelle stammen.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die Verwendung interner Ribosomeintrittsstellen (IRES) in Betracht gezogen, um Multigen- oder polycistronische Mitteilungen zu erzeugen. IRES-Elemente können das Ribosomen-Scanningmodell der 5'-methylierten Capabhängigen Translation umgehen und die Translation an internen Stellen beginnen (Pelletier und Sonenberg, Nature, 334: 320–325, 1988). IRES-Elemente aus zwei Mitgliedern der Picornavirusfamilie (Poliovirus und Enzephalomyokarditis) (Pelletier und Sonenberg, 1988, oben) sowie eine IRES aus einem Säuger-Nachricht (Macejak and Sarnow, Nature, 353: 90–94, 1991) sind beschrieben worden. IRES-Elemente können mit heterologen offenen Leserastern verknüpft sein. Es können mehrere offene Leseraster zusammen transkribiert werden, jedes getrennt durch eine IRES, wodurch polycistronische Mitteilungen erzeugt werden. Aufgrund des IRES-Elements ist jeder offene Leseraster für Ribosomen für eine effiziente Translation zugänglich. Unter Verwendung eines einzelnen Promotors/Enhancers können mehrere Gene effizient exprimiert werden, um so eine einzelne Mitteilung zu transkribieren.
Jeder heterologe offene Leseraster kann mit IRES-Elementen verknüpft werden. Diese umfassen Gene für sekretierte Proteine, Multi-Untereinheit-Proteine, kodiert durch unabhängige Gene, intrazelluläre oder Membran-gebundene Proteine und selektierbare Marker. Auf diese Weise kann die Expression mehrerer Proteine gleichzeitig in eine Zelle mit einem einzelnen Konstrukt und einem einzelnen selektierbaren Marker erreicht werden.
V. Verwendung der Substrate in γ-Secretaseassays
In speziellen Ausführungsformen umfaßt die vorliegende Erfindung Assays zur Überwachung der Aktivität und/oder Funktion von γ-Secretase und genauer gesagt der γ–Secretaseaktivität und/oder Funktion von γ-Secretase. Diese Assays werden das Inkubieren in Lösung eines γ-Secretasekomplexes (oder gereinigten Polypeptids) mit einem geeigneten Substrat der vorliegenden. Erfindung unter Verwendung der Spaltung des Notch-Fusionsproteins als ein Maß der proteolytischen γ-Secretaseaktivität umfassen.
A. Assay-Formate
In speziellen Ausführungsformen bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Identifizierung von Mitteln, die die Aktivität humaner γ-Secretase modulieren. Ein Aspekt dieser Assays ist die Überwachung der Notch-Spaltungsaktivität der γ-Secretase an der ε-Spaltstelle 1743/1744 in Gegenwart und Abwesenheit der/des mutmaßlichen Modulatorverbindung oder -mittels. Beispielsweise würde ein solches Verfahren zur Bestimmung der Notch-Spaltung im allgemeinen die folgenden Schritte umfassen:

(a) Kontaktieren irgendeines der Notch/NusA-Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung in vitro mit einer Zusammensetzung, die eine γ-Secretaseaktivität umfaßt;
(b) Bestimmen der Spaltung des Notch/NusA-Fusionsproteins an der γ-Secretase-Spaltstelle von Notch durch diese γ-Secretase.

Die Zusammensetzung, die γ-Secretaseaktivität umfaßt, ist im allgemeinen irgendeine isolierte Zusammensetzung, die eine γ-Secretaseaktivität umfaßt. Als solche kann die Zusammensetzung eine Membranfraktion sein, die aus einer Zelle isoliert wurde (einer natürlichen Zelle, die γ-Secretaseaktivität aufweist, oder einer rekombinanten Wirtszelle, die so verändert wurde, daß sie eine solche Aktivität exprimiert). Alternativ kann die Zusammensetzung ein isoliertes und gereinigtes γ-Secretaseprotein, das im wesentlichen frei von anderen Proteinen ist, umfassen.
Zur Identifizierung von Modulatoren der Notch-Spaltungsaktivität von γ-Secretase werden die obigen Schritte (a) und (b) in Gegenwart oder Abwesenheit des in Frage kommenden Modulators durchgeführt und die Modulationsaktivität des Modulators durch den Vergleich der Notch-Spaltungsaktivität der γ-Secretase in Gegenwart des Testmittels mit der Aktivität in Abwesenheit des Testmittels zur Identifizierung eines Mittels, daß eine Spaltung durch die γ-Secretase moduliert, bewertet. Jegliche Veränderung der Menge oder des Grades der Notch-Spaltung in Gegenwart des in Frage kommenden Modulators ist ein Anzeichen für eine Veränderung der γ-Secretaseaktivität in Gegenwart des Testmittels, wodurch ein Mittel, das ein Modulator der γ-Secretaseaktivität identifiziert ist.
Mittel, die, bezogen auf die Kontrolle (kein Testmittel), eine stärkere Spaltung verursachen, werden als Agonisten oder Stimulatoren der proteolytischen γ-Secretaseaktivität eingestuft, während Mittel, die an Aβ 1–40 und/oder Aβ 1–42 eine geringere Spaltung verursachen, als Inhibitoren eingestuft werden. Die Inhibitoren der γ-Secretase sind von besonderere Interesse, da Inhibitoren von γ-Secretaseaktivität therapeutische und prophylaktische Indikationen für die Behandlung und Vorbeugung von AD oder ihrer Symptome oder Progression aufweisen.
Da wünschenswerterweise Testverbindungen gesucht sind, die vorzugsweise die gamma-Secretase-vermittelte Spaltung eines APP oder CT-100 inhibieren, im Vergleich zur Spaltung eines Fusionsproteins der Erfindung, können die Testverbindungen hinsichtlich der Bestimmung ihrer Fähigkeit, die APP-Spaltung zu modulieren, parallel zu oder vor der Nutzung der Assays der Erfindung bewertet werden. Verfahren zur Messung der gamma-Secretasevermittelten APP- oder CT-100-Spaltung sind in der Technik allgemein bekannt. Als ein Beispiel lehrt WO/01/83811 Substrate und In-vitro-Assays, die zur Messung der APP- oder CT-100-Spaltung nützlich sind. WO/01/83811 lehrt ein gamma-Secretasesubstrat, das ein M-terminales Met (M), APP597-695 und eine Flag-Markierung umfaßt, und Verfahren und Bedingungen für deren Spaltung und zur Detektion der Spaltprodukte (M-Aβ40 und M-Aβ40).
Inhibitoren, die die APP/CT-100-Spaltaktivität an Aβ 1–40 und/oder Aβ 1–42 inhibieren, jedoch nicht die gemessene Notch-Spaltaktivität der γ-Secretase, sind am stärksten bevorzugt.
Bei der γ-Secretase kann es sich um ein gereinigtes γ-Secretase-Polypeptid oder einen Komplex oder um biologisch aktive Fragmente, Analoga oder Varianten davon handeln. In bevorzugten Ausführungsformen stammt die γ-Secretase aus einer Membranfraktion aus einer Zelle, die γ-Secretaseaktivität zeigt. Bevorzugt enthält eine solche Membranfraktion alle Komponenten, die für den γ-Secretasekomplex benötigt werden. Nicht-humane Orthologa humaner γ-Secretase können in den Assays ebenso verwendet werden.
Die Assays der vorliegenden Erfindung werden mit γ-Secretase-Polypeptid in einem zellfreien System durchgeführt. In einem zellfreien System kann beispielsweise der Kontaktierungs schritt durch Mischen des γ-Secretaseenzyms oder einer Membranfraktion, die dieses Enzym enthält, mit dem Peptid oder Proteinsubstrat der Erfindung in Gegenwart oder Abwesenheit des Testmittels erfolgen. Für optimale Ergebnisse sind das Enzym und das γ-Secretasesubstrat bevorzugt im wesentlichen gereinigt und in definierten und kontrollierten Mengen sowie in geeigneten Puffern, die die enzymatische Aktivität optimieren und/oder physiologische Bedingungen nachahmen, gemischt.
Der Bestimmungsschritt kann die Messung eines N-terminalen Fragments, eines C-terminalen Fragments, oder beiden umfassen, oder kann die Messung eines anderen Parameters, der für die Spaltung indikativ ist, umfassen. Beispielsweise kann das Notch-basierende oder ein anderes γ-Secretasesubstrat eine gelöschte Markierung umfassen, die nur bei der Spaltung stärker detektierbar wird, wodurch die Markierung von der Löscheinheit getrennt werden kann. Alternativ kann das Notch-basierende oder ein anderes γ-Secretasesubstrat an dem N-terminalen oder C-terminalen Ende an einem festen Träger fixiert werden. In dieser Anordnung kann die Spaltung durch die Freisetzung eines Spaltfragments aus dem festen Träger gemessen werden. Die Freisetzung kann durch die verstärkte Markierung in den Medien oder die verminderte Markierung an dem festen Träger gemessen werden. Alternativ kann die Freisetzung durch quantitatives Einfangen des freigesetzten Peptids gemessen werden (z. B. mit einem Antikörper).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das gespaltene Notch-Protein unter Verwendung eines Antikörpers, der für Val-1744 spezifisch ist, detektiert. In noch stärker bevorzugten Ausführungsformen wird das gespaltene Notch-Protein unter Verwendung eines ELISA, entwickelt, basierend auf Anti-Val-1744- und Anti-Flag-Antikörpern, detektiert. Die Anti-Val-1744-Antikörper werden zur Detektion eines Spaltfragments verwendet, während die Anti-Flag-Antikörper das Fragment (C-terminal) des Notch-Proteins, das durch die Wirkung des γ-Secretaseenzyms produziert wurde, detektieren. Dieser Assay wird in den Beispielen ausführlich beschrieben.
Selbstverständlich ist der obige Assay nur exemplarisch, und es können auch andere Assays verwendet werden. Beispielsweise kann der obige Assay folgendermaßen aufgebaut sein. 384-Loch-Mikrotiterplatten werden mit BSA blockiert, das γ-Secretaseenzym und 50 μM der zu testenden γ-Secretaseinhibitorverbindung werden 1 Stunde inkubiert, und die Reaktion wird durch Zugabe des Notch/NusA-Fusionsproteinsubstrats initiiert. In den endgültigen Assaybedingungen beträgt das Volumen 30 μl/Loch; 50 μM Verbindung; 15 ng Enzym/Loch; 250 nM Substrat; 5 % DMSO und 0,001 % TWEEN-20. Der Assay wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von Tris-HCl, pH 8,3, beendet. Ein Aliquot, enthaltend 6,25 pmol Substrat, wird entfernt, und das gespaltene und/oder nicht-gespaltene Substrat wird auf einer Streptavidin-beschichteten Platte gefangen. Die Platte wird dreimal gewaschen, und es wird Puffer zugegeben. Der Einfangassay wird durch das Auslesen der Fluoreszenzemission von Oregon green auf einem LJL Analyst (Ex 485/Em 530) überwacht.
Ein anderer Assay, der hierin verwendet werden kann, ist ein Fluoreszenzpolarisationsassay. Die Fluoreszenzpolarisation ist ein empfindlicher, leichter und nicht-destruktiver Assay, der zur Überwachung der Wirkungen der in Frage kommenden Mittel auf den γ-Secretasekomplex der vorliegenden Erfindung genutzt werden kann. Er kann zur Überwachung der Interaktion dieser Substrate mit dem γ-Secretaseenzym verwendet werden. Unter kontrollierten Bedingungen können Fluoreszenzpolarisationsmessungen das Ausmaß der „molekularen Bewegung" eines fluoreszierenden Moleküls in Lösung aufdecken. Beispielsweise ist anzunehmen, das sich cm kleines Molekül mit einem kompakten molekularen Volumen schnell bewegen wird. Bei Bestrahlung mit polarisiertem Licht kann die schnelle Bewegung des Moleküls in Lösung zu einer starken Depolarisation des Lichts und zur Auslesung eines „niedrigen" Polarisationswertes führen. Unter denselben Bedingungen kann das erhöhte molekulare Volumen eines großen Moleküls oder eines großen Komplexes den Vorgang der molekulare Rotation (Bewegen) verlangsamen. Dies würde zu einer geringeren Polarisation des einfallenden ebenen polarisierten Lichtes und zur Messung eines höheren Polarisationswertes führen.
Durch die Markierung eines kleinen Liganden mit einer fluoreszierenden Sonde können Veränderungen der Fluoreszenzpolarisation, die aus der Interaktion des Liganden mit einer anderen Systemkomponente resultieren, gemessen werden. Solch ein Verfahren kann zur Messung der Stärke der Interaktion zwischen einem Enzym (γ-Secretase) und einem fluoreszierenden Enzymsubstrat verwendet werden.
In einem exemplarischen Fluoreszenzpolarisationsassay werden ein vorblockiertes Schwarzplatten-Enzym mit geringer Affinität und eine inhibierende/modulierende Verbindung 30 Minuten inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von 150 nM Substrat (z. B. ein fluoreszierend markiertes Notch/NusA-Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung) auf ein Endvolumen von 30 μl/Loch initiiert. Die Platte wird dann bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubiert und die Fluoreszenzpolarisation auf einem LJL Acquest (Ex 485/Em 530) gemessen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, der zur Isolierung und Charakterisierung der γ-Secretase nützlich sein könnte, wird in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Dieser Aspekt umfaßt einen Bindungsassay zur Detektion von Verbindungen, die an die aktive Stelle oder an eine allosterische Stelle des Enzyms binden. Für solche Bestimmungen kann von nicht-hydrolysierbaren Derivaten der Notch-Substrate der vorliegenden Erfindung Gebrauch gemacht werden. Beispielsweise macht die Gegenwart eines Statinderivats an der Verbindungsstelle der zu spaltenden Bindung das Notch der vorliegenden Erfindung an der Spaltstelle nicht-hydrolysierbar. Die Substrate können ferner unter Zugabe einer geeigneten fluoreszierenden Markierung, z. B. BODIPY FL, zur Erleichterung der Detektion modifiziert werden.
Ein Substrat der vorliegenden Erfindung kann mit einer fluoreszierenden Markierung markiert und zur Entwicklung eines Fluoreszenzpolarisations-Bindungsassays für die γ-Secretase verwendet werden. Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) für die Interaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat wird durch die Messung der Fluoreszenzpolarisationsveränderungen, die aus der Titrierung des Substrats mit dem Enzym resultieren, bestimmt.
Zur Bestimmung der KD für die Interaktion eines Substrats der vorliegenden Erfindung mit γ-Secretase können verschiedene Mengen γ-Secretase mit 3,1 nM fluoreszierendem Substrat kombiniert und bei Raumtemperatur 3 Stunden inkubiert werden. Nach der Inkubation wird die Fluoreszenzpolarisation unter Verwendung eines LJL Analyst (96-Loch-Format) oder eines PanVera Beacon (Einzelküvetten-Format) bestimmt. Ein exemplarischer Assay wird in 25 mM Natriumacetat, 20 % Glycerin, pH 4,75, durchgeführt. Ein graphischer Plot der erhaltenen Daten, der die Polarisationswerte auf der vertikalen Achse und die Konzentration an Enzym auf der horizontalen Achse liefert, stellt die Bindungsisotherme zur Bestimmung der KD für die Interaktion des Enzyms mit dem Substrat bereit. Die Daten können dann unter Verwendung der Beziehung Px = PF + (PB – PF)·[B]/(KD + [E]), worin P = Polarisationswert, x = Probe, F = freier Inhibitor, B = gebundener Inhibitor, E = γ-Secretase (Fluorescence Polarization Applications Guide, 1998; PanVera, Madison, WI), zum Erhalt der KD analysiert werden. Dieser Assay kann zum Screenen der Verbindungen, die an die aktive Stelle des Enzyms oder allosterisch binden, verwendet werden.
Es wird zu erkennen sein, daß die Aktivitätsmessungen in Gegenwart und Abwesenheit eines Testmittels parallel oder nacheinander vorgenommen werden können. Überdies ist es nicht notwendig, die Kontrollmessungen (d. h., die Messungen der Spaltung in Abwesenheit eines Testmittels) parallel zu jedem Testmittel zu wiederholen, sobald eine verläßliche Grundlage für die enzymatische Aktivität für die jeweiligen Reaktionsbedingungen erhalten wurde. Erworbenes Wissen über die enzymatische Aktivität von γ-Secretase gegen ein bestimmtes Substrat (z. B. die Notch-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung oder eine Zusammensetzung aus APP) in Abwesenheit von Inhibitoren kann als Grundlage für die Durchführung des Vergleichsschrittes verwendet werden.
B. In Frage kommende Substanzen
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „in Fragen kommende Substanz" oder „Testsubstanz" auf irgendein Molekül, daß die γ-Secretaseaktivität und bevorzugt die humane γ-Secretaseaktivität modulieren kann. Die in Fragen kommende Substanz kann ein Protein oder Fragment davon, ein kleiner Molekülinhibitor oder sogar ein Nukleinsäuremolekül sein. Möglicherweise sind die nützlichsten pharmakologischen Verbindungen zur Identifizierung durch die Anwendung des Screeningassays Verbindungen, die mittels Screening großer Verbindungsbibliotheken identifiziert werden oder die strukturell mit anderen bekannten Modulatoren zur APP-Prozessierung, Notch-Prozessierung oder beiden verwand sind. Beispielsweise beschreibt US-Patent Nr. 6,448,229 , hierin durch Verweis aufgenommen, eine spezielle Klasse von Verbindungen, die γ-Secretase ohne Beeinträchtigung der Notch-Signalgebung inhibieren und daher bei der Behandlung oder Vorbeugung von AD Anwendung finden. Verbindungen wie die in US-Patent Nr. 6,448,229 beschriebenen können unter Verwendung der Assays der vorliegenden Erfindung verifiziert werden. Überdies können solche Verbindungen als Ausgangsmaterialien bei der rationalen Arzneimittelgestaltung dienen, um so zusätzliche in Frage kommende Modulatoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu identifizieren. Andere inhibierende Mittel, die für eine solche rationale Arzneimittelgestaltung ver wendet werden können, umfassen DAPT (PHA-568638) und Fenchylamin (PHA-512088), sind aber nicht darauf beschränkt.
Die in Frage kommenden Substanzen können Fragmente oder Teile natürlich vorkommender Verbindungen umfassen oder sind nur als aktive Kombinationen bekannter Verbindungen, die ansonsten inaktiv sind, anzutreffen. Vor dem Testen solcher Verbindungen bei Menschen oder in Tiermodellen ist es jedoch notwendig verschiedene Kandidaten zu testen, um bestimmen zu können, welche davon Potential haben.
Demgemäß kann die in Frage kommende Substanz Fragmente oder Teile natürlich vorkommender Verbindungen umfassen oder als aktive Kombinationen bekannter Verbindungen, die ansonsten inaktiv sind, anzutreffen sein. Demgemäß liefert die vorliegende Erfindung Screeningassays zur Identifizierung von Mitteln, die die γ-Secretase-vermittelte zelluläre APP-Prozessierung vorzugsweise über die Stimulation oder Inhibierung von Notch durch dieses Enzym stimuliert oder inhibiert. Es wird vorgeschlagen, Verbindungen, isoliert aus natürlichen Quellen, wie Tier-, Bakterien-, Pilz-, Pflanzenquellen, einschließlich Blättern und Borke, und Meeresproben, als Kandidaten auf die Gegenwart potentiell nützlicher pharmazeutischer Mittel zu analysieren.
Es ist selbstverständlich, daß zu screenende pharmazeutische Mittel auch aus chemischen Zusammensetzungen oder künstlichen Verbindungen stammen oder synthetisiert werden können. Daher sollte klar sein, daß der durch die vorliegende Erfindung identifizierte Modulator Polypeptid, Polynukleotid, kleine Molekülinhibitoren oder irgendeine andere anorganische oder organische chemische Verbindung sein kann, die durch rationale Arzneimittelgestaltung, ausgehend von bekannten Stimulatoren oder Inhibitoren von γ-Secretaseaktivität und/oder APP-Prozessierung, gestaltet werden können.
Die in Frage kommenden Screeningassays sind einfach aufzubauen und durchzuführen. Daher kann man bei der Analyse auf einen Modulator nach dem Erhalt einer Zelimembranfraktion, die eine funktionale γ-Secretase umfaßt (z. B. eine Zellmembranfraktion, die einen solubilisierten γ-Secretasekomplex enthält), eine in Frage kommende Substanz mit einer solchen γ-Secretase-Zusammensetzung in Gegenwart der neuen Substrate der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, bei denen eine meßbare γ-Secretaseaktivität, durch Spaltung des Sub strats, auftreten kann, mischen. So kann man die Fähigkeit der in Frage kommenden Substanz, die Aktivität der γ-Secretase in Abwesenheit der in Fragen kommenden Substanz zu stimulieren, messen. Auf ähnliche Weise wird in Assays für Inhibitoren nach dem Erhalt einer Zellmembranfraktion, die funktionale γ-Secretase exprimiert, die in Frage kommende Substanz mit dieser Fraktion gemischt. So kann die Fähigkeit der in Frage kommenden inhibierenden Substanz, eine biologische Wirkung, vermittelt durch γ-Secretase, zu reduzieren, aufzuheben oder anderweitig zu verkleinern, detektiert werden.
„Effektive Mengen" der Substanz sind unter bestimmten Umständen die Mengen, die zur reproduzierbaren Veränderung einer gegebenen CT-100-spaltenden γ-Secretaseaktiviät oder APP-Prozessierung effektiv sind. Diese effektiven Mengen sind die, die den Grad oder die Menge der Spaltung des APP CT-100 verändern, die Spaltung der Notch-Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung an der γ-Secretase-Spaltstelle im Vergleich zur Spaltung, die in Abwesenheit der in Frage kommenden Substanz zu beobachten ist, nicht verändern. Verbindungen, die als therapeutische Mittel und/oder für die weitere Charakterisierung besonders nützlich sind, sind die Verbindungen, die vorzugsweise die APP-Spaltung durch die γ-Secretase im Vergleich zur Notch-Spaltung inhibieren. Unter „vorzugsweise inhibieren" ist zu verstehen, daß das Mittel eine stärkere inhibierende Wirkung auf die γ-Secretase-vermittelte Spaltung von APP als auf Notch hat. Während das Mittel bevorzugt eines ist, das keine inhibierende Wirkung auf die Notch-Spaltung hat, ist etwas Inhibierung der Notch-Spaltung akzeptabel, so lange sie kleiner ist als die APP-Spaltung, die durch das Wildtyp-γ-Secretaseenzym zu beobachten ist.
Die oben beschriebenen Assays, die die neuen γ-Secretasesubstrate der Erfindung einsetzen, sind für zahlreiche Hochdurchsatz-Screening-Verfahren (HTS-Verfahren) zugänglich (für einen Überblick siehe Jayawickreme and Kost, Curr. Opin. Biotechnol. 8: 629–634, 1997). Automatisierte und miniaturisierte HTS-Assays werden ebenso in Betracht gezogen, wie beispielsweise in Houston and Banks, Curr. Opin. Biotechnol. 8: 734–740, 1997, beschrieben.
Es gibt viele verschiedene Bibliotheken, die zur Identifizierung kleiner Molekülmodulatoren verwendet werden, einschließlich chemischer Bibliotheken, Naturprodukt-Bibliotheken und kombinatorischer Bibliotheken, umfassend zufällige oder gestaltete Peptide, Oligonukleotide oder organische Moleküle. Chemische Bibliotheken bestehen aus Strukturanaloga bekannter Verbindungen oder Verbindungen, die über Naturproduktscreening oder Screening gegen ein potentielles therapeutisches Target als Treffer oder Hinweise identifiziert wurden. Naturprodukt-Bibliotheken sind Sammlungen von Produkten aus Mikroorganismen, Tieren, Pflanzen, Insekten oder Meeresorganismen, die zur Erzeugung von Screening-Gemischen beispielsweise durch Fermentation und Extraktionen von Nährlösungen aus Boden-, Pflanzen- oder Meeresorganismen verwendet werden. Naturprodukt-Bibliotheken umfassen Polypeptide, nicht-ribosomale Peptide und nicht natürlich vorkommende Varianten davon. Für einen Überblick siehe Science 282: 63–68, 1998.
Kombinatorische Bibliotheken bestehen aus vielen Peptiden, Oligonukleotiden oder organischen Verbindungen als ein Gemisch. Sie sind relativ einfach durch herkömmliche automatisierte Syntheseverfahren, PCR-Klon- oder andere synthetische Verfahren herzustellen. Von besonderem Interesse sind Bibliotheken, die Peptid-, Protein-, peptidomimetische, multiparallele synthetische Sammlungs-, rekombinatorische und Polypeptid-Bibliotheken umfassen. Für einen Überblick über kombinatorische Bibliotheken und daraus erzeugte Bibliotheken siehe Myers Curr. Opin. Biotechnol. 8: 701–707, 1997. Ein unter Verwendung verschiedener beschriebener Bibliotheken identifizierter Modulator kann dann so optimiert werden, daß er die Aktivität von γ-Secretase moduliert, beispielsweise durch rationale Arzneimittelgestaltung.
Natürlich wird klar sein, daß alle Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung an sich nützlich sind, ungeachtet der Tatsache, daß eventuell keine effektiven Kandidaten zu finden sind. Die Erfindung liefert Verfahren zum Screenen auf solche Kandidaten und nicht nur Verfahren, um diese zu finden.
C. In-vivo-Assays
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenso die Verwendung verschiedener Tiermodelle. Nach dem Screenen der Modulatoren in einer In-vitro-Umgebung, wie oben erörtert, kann irgendein nicht-humanes Modell der APP-Prozessierung und/oder AD zur Bestimmung der In-vivo-Wirkungen der Modulatoren verwendet werden. Dies bietet eine hervorragende Möglichkeit zur Überprüfung der Funktion von γ-Secretase in einem Volltiersystem, in dem sie normalerweise exprimiert wird.
Behandlung von Tieren mit Testverbindungen, die als Modulatoren von γ-Secretaseaktivität identifiziert worden sind, wird die Verabreichung der Verbindung in einer geeigneten Form an ein Tier umfassen. Die Verabreichung erfolgt auf irgendeinem Weg, der für klinische oder nicht klinische Zwecke genutzt werden kann, einschließlich, aber nicht beschränkt auf oral, nasal, bukkal, rektal, vaginal oder topisch. Alternativ kann die Verabreichung durch intratracheale Instillation, bronchiale Instillation, intradermale, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale oder intravenöse Injektion erfolgen. Besonders erwogen werden systemische intravenöse Injektion, regionale Verabreichung über das Blut, Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) oder Lymphzufuhr und intratumorale Injektion.
Die Bestimmung der Effektivität einer Verbindung in vivo kann viele verschiedene Kriterien umfassen. Solche Kriterien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Überleben, erhöhtes Aktivitätsniveau und verbesserte Futteraufnahme. Andere Verfahren zur Bewertung umfassen pathologische Untersuchung, insbesondere von Hirngewebe, um nach Indizien veränderter γ-Secretaseaktivität, wie die reduzierte Produktion von Amyloid-beta oder Amyloid-beta-Plaques und die reduzierte Atrophie des Gehirns, zu suchen.
D. Herstellung von Medikamenten
Die Assays der Erfindung werden γ-Secretase-Modulatoren identifzieren, die in Frage kommende Therapeutika zur Behandlung von Krankheiten, die durch abnorme Niveaus von γ-Secretaseaktivität gekennzeichnet sind, einschließlich AD, darstellen. Daher umfassen die Verfahren der Erfindung nach der Identifizierung von Modulatormitteln gegebenenfalls den/die zusätzlichen Schritt oder Schritte der Herstellung/Synthetisierung der Mittel und Formulierung des Mittels in eine Zusammensetzung unter Verwendung pharmazeutisch akzeptabler Verdünnungsmittel, Adjuvantien oder Träger. Pharmazeutische Zusammensetzungen werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
VI. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die Modulatoren der Notch-Prozessierung, APP-Prozessierung und/oder γ-Secretase-Spaltung, die durch die vorliegende Erfindung identifiziert wurden, können schließlich in pharmazeutische Zusammensetzungen, d. h. in eine Form, die für In-vivo-Anwendungen geeignet ist, formuliert werden. Im allgemeinen wird dies die Herstellung von Zusammenset zungen, die im wesentlichen frei von Pyrogenen sowie anderen Verunreinigungen, die für Menschen und Tiere schädlich sein können, zur Folge haben.
Im allgemeinen wird man geeignete Salze und Puffer einsetzen, um die identifizierten Modulator-Zusammensetzungen stabil zu machen und deren Aufnahme von Targetzellen zu ermöglichen. Der Ausdruck „pharmazeutisch oder pharmakologisch akzeptabel" bezieht sich auf molekulare Gebilde und Zusammensetzungen, die keine nachteiligen, allergischen oder anderen ungünstigen Reaktionen hervorrufen, wenn sie einem Tier oder einem Menschen verabreicht werden. Wie hierin verwendet, umfaßt „pharmazeutisch akzeptabler Träger" irgendwelche und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakteriellen und fungiziden Mittel, isotonischen und absorptionsverzögernden Mittel und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist in der Technik allgemein bekannt. Außer insofern, daß herkömmliche Medien oder Mittel mit den durch die vorliegende Erfindung identifizierten Modulatoren inkompatibel sind, wird deren Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Es können auch ergänzende aktive Inhaltsstoffe in die Zusammensetzungen eingeführt werden.
Die Modulator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen klassische pharmazeutische Präparate. Die Verabreichung dieser Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung wird auf herkömmliche Weise erfolgen, so lange das Zielgewebe über diesen Weg zugänglich ist. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in ein Individuum durch irgendein herkömmliches Verfahren eingeführt werden, z. B. durch intravenöse, intradermale, intramuskuläre, intramammäre, intraperitoneale, intrathekale, intraokulare, retrobulbare, intrapulmonare (z. B. zeitversetzt); orale, sublinguale, nasale, anale, vaginale oder transdermale Zufuhr oder durch chirurgische Implantation an einer besonderen Stelle, z. B. eingebettet unter der Milzkapsel, dem Gehirn oder in der Augenhornhaut. Die Behandlung kann aus einer Einzeldosis oder mehreren Dosen über einen gewissen Zeitraum bestehen.
Die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung identifizierten Modulatorverbindungen können zur Verabreichung als Lösungen der freien Base oder pharmakologisch akzeptablen Salze in Wasser, geeigneterweise gemischt mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie Hydroxypropylcellulose, hergestellt werden. Es können ebenso Dispersionen in Glycerin, flüssigen Polyethylenglykolen und Gemischen davon und in Ölen hergestellt werden. Unter normalen Lager- und Gebrauchsbedingungen enthalten diese Präparate ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die pharmazeutischen Formen, die injizierbar sind, umfassen sterile wässerige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die improvisierte Herstellung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muß die Form steril und so flüssig sein, daß sie leicht gespritzt werden kann. Sie muß unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil sein und gegen die verunreinigende Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, geschützt werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium, das beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenlycol und dergleichen), geeignete Gemische davon und pflanzliche Öle sein. Die richtige Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung einer Beschichtung wie Lecithin, durch den Erhalt der erforderlichen Teilchengröße im Falle einer Dispersion und durch die Verwendung oberflächenaktiver Mittel aufrechterhalten werden. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kannt durch verschiedene antibakterielle und fungizide Mittel, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dergleichen, bewirkt werden. In vielen Fällen werden bevorzugt isotonische Mittel, beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid, eingeführt. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Mitteln, die die Absorption verzögern, beispielsweise Aluminummonostearat und Gelatine, in den Zusammensetzungen bewirkt werden.
Sterile injizierbare Lösungen werden durch die Einführung der aktiven Verbindungen in der erforderlichen Menge in das geeignete Lösungsmittel mit verschiedenen der oben aufgezählten anderen Inhaltsstoffe, gefolgt von Filtersterilisation, hergestellt. Im allgemeinen werden Dispersionen durch die Einführung der verschiedenen sterilisierten Wirkstoffe in ein steriles Vehikel, daß das Grunddispersionsmedium und die erforderlichen anderen Inhaltsstoffe der oben aufgezählten enthält, hergestellt. Im Falle eines sterilen Pulvers zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechniken, die ein Pulver aus dem Wirkstoff und der zusätzlichen gewünschten Inhaltsstoffe aus einer zuvor steril filtrierten Lösung davon ergeben.
Wie hierin verwendet, umfaßt „pharmazeutisch akzeptabler Träger" irgendwelche und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und fungizide Mittel, isotonische und die Absorption verzögernde Mittel und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist in der Technik allgemein bekannt. Die Verwendung der herkömmlichen Medien oder Mittel in den therapeutischen Zusammensetzungen wird in Betracht gezogen, außer wenn sie mit dem Wirkstoff inkompatibel sind. Auch ergänzende Wirkstoffe können in die Zusammensetzungen eingeführt werden.
Für die orale Verabreichung können die durch die vorliegende Erfindung identifizierten Modulatoren mit Trägerstoffen eingeführt werden und in Form nicht-aufzunehmender Mundwäschen und Zahncremes verwendet werden. Eine Mundwäsche kann durch die Einführung des Wirkstoffes in der erforderlichen Menge in ein geeignetes Lösungsmittel, wie eine Natriumboratlösung (Dobell-Lösung), hergestellt werden. Alternativ kann der Wirkstoff in eine antiseptische Wäsche, enthaltend Natriumborat, Glycerin und Kaliumbicarbonat, eingeführt werden. Der Wirkstoff kann auch in Zahncremes dispergiert sein, einschließlich Gels, Pasten, Pulvern und Aufschlämmungen. Der Wirkstoff kann in einer therapeutisch wirksamen. Menge zu einer pastenartigen Zahncreme, die Wasser, Bindemittel, Abriebmittel, Aromastoffe, Schäumungsmittel und Feuchthaltemittel umfaßt, zugegeben werden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in neutraler oder Salzform formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze umfassen die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Proteins), die mit anorganischen Säuren wie beispielsweise Salz- oder Phosphorsäuren oder organischen Säuren, wie Essig-, Oxal-, Wein-, Mandelsäure und dergleichen gebildet wurden. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet wurden, können auch aus anorganischen Basen wie beispielsweise Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium oder Eisen(III)hydroxid und organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Prokain und dergleichen, stammen.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in neutraler oder Salzform formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze umfassen die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Proteins), die mit anorganischen Säuren wie beispielsweise Salz- oder Phosphorsäuren oder organischen Säuren, wie Essig-, Oxal-, Wein-, Mandelsäure und dergleichen, gebildet wurden. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet wurden, können auch aus anorganischen Basen wie beispielsweise Natrium, Kalium, Ammoni um, Calcium oder Eisen(III)hydroxid und organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Prokain und dergleichen, stammen.
Nach der Formulierung werden Lösungen kompatibel mit der Dosierungsformulierung und in einer Menge, die therapeutisch wirksam ist, verabreicht. Die Formulierungen sind in zahlreichen Dosierungsformen wie injizierbaren Lösungen, Arzneimittel freisetzenden Kapseln und dergleichen verabreichbar. Beispielsweise sollte die Lösung zur parenteralen Verabreichung in einer wässerigen Lösung wenn notwendig gepuffert und das flüssige Verdünnungsmittel zuerst mit ausreichend Kochsalzlösung oder Glucose isotonisch gemacht werden. Diese besonderen wässerigen Lösungen sind insbesondere zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen und intraperitonealen Verabreichung geeignet.
„Dosierungseinheit" wird als eine Einzelmenge einer therapeutischen Zusammensetzung, dispergiert in einem geeigneten Träger, definiert. Beispielsweise kann die parenterale Verabreichung mit einem Anfangsbolus, gefolgt von der kontinuierlichen Infusion zur Aufrechterhaltung therapeutischer zirkulierender Konzentrationen des Arzneimittelproduktes, durchgeführt werden. Ein Fachmann wird die durch die gute medizinische Praxis und den klinischen Zustand des einzelnen Patienten bestimmten wirksamen Dosen und Verabreichungsregime ohne weiteres optimieren können. Genauer gesagt, sollte die Dosis so ausgewählt werden, daß die Bildung des Aβ-Peptids und speziell die Plaquebildung im Gehirn eines Individuums, das AD zeigt, reduziert, inhibiert, verringert oder anderweitig aufgehoben wird. Hierfür kann ein Fachmann Tiermodelle von AD einsetzen (wie z. B. in US-Patent Nr. 5,877,399 ; US-Patent Nr. 5,387,742 ; US-Patent Nr. 5,811,633 offenbart), um die Dosisverabreichungsprotokolle zu optimieren und die relevanten Mengen pharmazeutischer Mittel, die zur Intervention bei AD in einem menschlichen Individuum erforderlich sind, vorherzusagen.
Die Häufigkeit der Dosierung wird von den pharmakokinetischen Parametern des Mittels und den Verabreichungswegen abhängen. Die optimale pharmazeutische Formulierung wird von einem Fachmann in Abhängigkeit des Verabreichungsweges und der gewünschten Dosis bestimmt. Siehe zum Beispiel Remington's Pharmaceutic Sciences, 18. Aufl. (1990, Mack Publ. Co, Easton PA 18042) S. 1435–1712, hierin durch Verweis aufgenommen. Solche Formulierungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Freisetzungsrate in vivo und die Clearance-Rate in vivo der verabreichten Mittel beeinflussen. In Abhängigkeit des Verab reichungsweges kann eine geeignete Dosis gemäß dem Körpergewicht, der Körperoberflächen oder der Organgröße errechnet werden. Eine weitere Verbesserung der Berechnungen, die zur Bestimmung der geeigneten Behandlungsdosis erforderlich sind, kann von einem Fachmann routinemäßig ohne unnötiges Experimentieren, insbesondere im Hinblick auf die hierin offenbarten Dosierungsinformationen und Assays sowie die pharmakokinetischen Daten, die in klinischen Versuchen an Tieren und Menschen zu beobachten sind, vorgenommen werden.
Geeignete Dosierungen können durch die Verwendung etablierter Assays zur Bestimmung von Blutkonzentrationen in Verbindung mit relevanten Dosis-Wirkungs-Daten ermittelt werden. Das endgültige Dosierregime wird vom behandelnden Arzt unter Berücksichtigung von Faktoren, die die Wirkung von Arzneimitteln modifizieren, bestimmt, z. B. die spezifische Aktivität des Arzneimittels, die Schwere der Schädigung und die Reaktionsfähigkeit des Patienten, Alter, Zustand, Körpergewicht, Geschlecht und Ernährung des Patienten, die Schwere der Infektion, Zeit der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Bei der Durchführung von Studien werden weitere Informationen hervorgebracht, die die geeigneten Dosierniveaus und die Dauer der Behandlung für spezielle Krankheiten und Zustände betreffen.
Es ist davon auszugehen, daß die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Behandlungsverfahren der Erfindung in Bereichen der menschlichen Medizin und Veterinärmedizin nützlich sind. Daher kann das zu behandelnde Individuum ein Säuger, bevorzugt ein Mensch, oder ein anderes Lebewesen sein. Für veterinäre Zwecke umfassen die Individuen beispielsweise Farmtiere, einschließlich Kühe, Schafe, Schweine, Pferde und Ziegen, Haustiere wie Hunde und Katzen, exotische und/oder Zootiere, Versuchstiere, einschließlich Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen und Hamster; und Geflügel wie Hühner, Truthahn, Enten und Gänse.
VI. Beispiele
Die folgenden Beispiele sollen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung veranschaulichen. Ein Fachmann sollte im Lichte der vorliegenden Offenbarung jedoch erkennen, daß zahlreiche Veränderungen an den speziellen offenbarten Ausführungsformen vorgenommen werden können, und trotzdem das gleiche oder ein ähnliches Ergebnis erhalten werden kann, ohne vom Sinn und Umfang der Erfindung abzuweichen.
Beispiel 1
Materialien und Verfahren
Das vorliegende Beispiel liefert die Lehre der allgemeinen Techniken, Reagenzien und Assays, die zum Erhalt der hierin erörterten Ergebnisse eingesetzt wurden. Die allgemeinen Laborchemikalien wurden von Sigma Chemical Co (St. Louis, Mo) erworben. Der pET 43.1a-Vektor stammten von Novagen (Madison, WI), und die Restriktionsenzyme stammten von Invitrogen (Carlsbad, Ca). Die Oligonukleotide stammten von Sigma Genosys (The Woodlands, Tx). Der Val-1744-Antikörper stammte von Cell Signaling Technology (Beverly, Ma). Die PHA/PNU-Verbindungen wurden aus der Pharmacia-Verbindungssammlung (New Jersey, USA) erhalten.
Klonen des Notch-Substrats: Notch-Substrat, enthaltend die Aminosäuren N1703–D1860 des Maus-Notch-1-Proteins (DNA-Sequenz-Zugriffszahl Z11886) wurde in den pET 43.1a-Vektor als ein EcoRI/HindIII-Insert zusammen mit einer Nukleinsäure, die das NusA kodiert, geklont. Das Expressionskonstrukt zur Kodierung des NusA/Notch-Fusionsproteins hatte die Sequenz von. SEQ ID Nr.: 1. Dieses Konstrukt enthielt C-terminale Flag- und 8His-Markierungen, erzeugt durch PCR, was die Erweiterung (DYKDDDDKHHHHHHHH, SEQ ID Nr.: 15) nach der Aminosäure 1860 von Notch ergab. Die DNA wurde in BL21(DE3)-kompetentes E. coli (Stratagen) transformiert, und die Klone wurden auf die Gegenwart des korrekten Inserts unter Verwendung des DNA Concert-Miniprep-Kits (Gibco/BRL) gescreent. Der Klon Notch-F6 enthielt die korrekte DNA-Sequenz von SEQ ID Nr.: 1.
Expression und Reinigung des Notch/NusA-Fusionsproteins. E. coli wurde mit dem Klon Notch-F6 transformiert, in LB/Amp inokuliert und über Nacht bei 37 °C in einem Schüttelinkubator herangezogen. Am nächsten Tag wurden 35 ml der Über-Nacht-Kultur zur Inokulierung von 2 Litern LB/Amp verwendet. E. coli wurde bei 37 °C in einem Schüttelinkubator herangezogen, bis A₆₀₀ 0,4 erreicht hatte, und wurde dann 3 Stunden mit 1 mM IPTG induziert und zentrifugiert. Die Pellets aus zwei Litern Kultur wurden in 5 ml/g Pellet von 50 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl, umfassend Proteaseinhibitoren, erneut suspendiert und dreimal mit einer French-Presse aufgearbeitet, wodurch ein roher Extrakt erhalten wurde. Der pH des Extraktes wurde unter Verwendung von 2M Tris auf 8,0 eingestellt, und er wurde bei 11.000 g 45 min zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine 4 ml Nickel-IMAC- Chromatographiesäule, äquilibriert in 50 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl und mit Proteaseinhibitoren geladen. Die Säule wurde mit demselben Puffer, gefolgt von einem Puffer, der 50 mM Imidazol enthielt, gewaschen. Das NusA-Notch-Fusionsprotein wurde mit Puffer, der 300 mM Imidazol enthielt, eluiert, und 0,8 ml Fraktionen wurden gesammelt und durch A₂₈₀ und SDS-PAGE analysiert. Fraktionen, die NusA-Notch enthielten, wurden gesammelt und in 50 mM Pipes, pH 7,0, 100 mM NaCl, dialysiert.
Spaltung von Notch, bestimmt durch Western-Blot-Analyse. Die NusA-Notch-Fusion (1,7 μM) wurde mit 70 μg/ml solubilisierter γ-Secretase in 50 mM Pipes, pH 7,0, 0,25 % CHAPSO, in einem Gesamtvolumen von 50 μl über Nach bei 37 °C inkubiert. DAPT (PHA-568638) wurde in variierenden Konzentrationen zugegeben. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 12,5 μl 5X Laemmli-Puffer (Laemmli 1970) gestoppt, und 30 μl des Gemisches wurden auf einer 15-%-SDS-PAGE der Elektrophorese unterzogen. Die Proteine wurden unter Verwendung eines Halbtrocken-Blotgerätes (Millipore) in Nitrocellulose überführt und 2 Stunden unter Verwendung von 4 % BSA in PBS/0,5 % Tween-20 blockiert. Der Val-1744-Antikörper wurde der Blockierlösung in einer Verdünnung von 1: 1000 zugegeben und 1 Stunde inkubiert. Die Membran wurde dreimal mit PBS/0,5 % Tween-20 gewaschen, gefolgt von Inkubation mit Anti-Kaninchen-IgG-HRP (1: 5000 verd. in 4 % BSA in PBS/0,5 % Tween-20). Die Membran wurde erneut dreimal gewaschen und unter Verwendung von ECL-Reagenzien entwickelt (Amersham, Piscataway, New Jersey).
In-vitro-Notch-Spaltungs-ELISA. Die Notch-Spaltung wurde ebenso unter Verwendung einer ELISA-Technik bewertet. Vor dem Aufbau einer Reaktion wurde die erforderliche Anzahl an Löchern in einer 96-Loch-Halbflächenplatte (Costar) mit 50 μl Val-1744-Antikörper, verdünnt 1: 200 in 0,1M NaHCO₃, pH 8,2, beschichtet. Die Platten wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Notch-Spaltungsreaktion war wie folgt aufgebaut. NusA-Notch (0,9 μM) wurde mit 70 μg/ml solubilisierter γ-Secretase in 50 mM Pipes, pH 7,0, 0,25 % CHAPSO, in einem Gesamtvolumen von 25 μl über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Platte mit Val-1744-Antikörper beschichtet, dreimal mit PBS/0,05 % Tween-20 gewaschen und unter Verwendung von 4 % BSA in PBS/0,05 % Tween-20 1 Stunde blockiert. Das Spaltungsreaktionsgemisch wurde unter Verwendung von 4% BSA in PBS/0,05 % Tween-20 um das 14-fache verdünnt, und 50 μl wurden in dreifacher Ausfertigung plattiert und 3 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS/0,05 % Tween-20 gewaschen, und 50 μl Anti-FLAG-HRP-Antikörper (Sigma, St. Louis, Mo), verwendet bei einer Verdünnung von 1: 60000 in 4 % BSA/PBS/0,5 % Tween-20, wurden zugegeben. Dieser Antikörper wurde 45 min inkubiert und die Platte dreimal mit PBS/0,5 % Tween-20 gewaschen. TMB-Reagens (Kirkegaard & Perry) wurde 1: 1 gemischt, und 50 μl wurden in die Löcher gegeben. Die Farbe konnte sich eine Stunde entwickeln, und 50 μl 1M H₃PO₄ wurden zugegeben und die Platten bei 450 nm auf einem SpectraMax Plus-Plattenleser ausgelesen. Bei der Variierung der Notch-Substratkonzentration wurden 0,11 bis 3,6 μM NusA-Notch verwendet. Wurde die Enzymkonzentration variiert, wurden 2,1 bis 68 μg/ml solubilisierte γ-Secretase verwendet.
Inhibierung der Notch-Spaltung. Die Inhibitoren (1 μl) wurden der Spaltreaktion als 25-fache Konzentrationen in 50 % DMSO vor der Zugabe des Enzyms zugegeben. Blindproben und Kontrollen ohne Inhibitor enthielten dieselbe DMSO-Endkonzentration. Die IC₅₀-Werte wurden für die Inhibitoren unter Verwendung des logistischen 4-Parameter-Modells im GraFit-4.0-Programm berechnet.
Beispiel 2
Ergebnisse und Erörterung
Zur Herstellung eines löslichen Notch-Substrats stellten die Erfinder zahlreiche Konstrukte in E. coli her (3a). Diese umfassen die Verwendung von Caspase-Leader, Ubiquitin, N-terminalem tau und der Nus-Markierung. Die lösliche Expression war nur bei der Nus-Fusion zu beobachten (Wilkinson et al., Bio/Technology 9: 443–448, 1991). 3b zeigt Klondetails für dieses Konstrukt. Zur Erleichterung der Reinigung und Assayentwicklung wurden eine His- und eine Flag-Markierung am C-Terminus von Notch errichtet.
Wenn das Nus-markierte Notch-Fusionsprotein in E. coli exprimiert wurde, war eine hohe Expression des Fusionsproteins, die einer 90 kDa-Bande entspricht, auf einer SDS-PAGE (4, Bahn 1) zu beobachten, eine Größe, die für das Fusionsprotein erwartet wurde. Wurde das gesamte Lysat zentrifugiert, verblieb das Fusionsprotein in der löslichen Fraktion (4, Bahn 2). Das Notch-enthaltende Fusionsprotein wurde aus der löslichen Fraktion durch IMAC unter Verwendung von Nickel als das immobilisierte Metallion gereinigt. 4 (Bahnen 5–9) zeigt verschiedene Fraktionen, eluiert aus der IMAC-Säule durch 300 mM Imidazol. Diese Fraktionen wurden gesammelt, dialysiert und dann als eine Quelle für das Substrat für die γ-Secretase-Spaltung verwendet.
Die Technik zur Verfolgung einer speziellen Spaltung in dem Notch-Protein basiert auf der Spezifität des Val-1744-Antikörpers (Cell Signaling Technology). Sie ist speziell für das gespaltene Notch und kreuzreagiert nicht mit dem ungespaltenen Notch-Protein. Wie in 5 (Bahn 3) gezeigt, wurde das gespaltene Notch-Protein auf einem Western-Blot mit einem Antikörper, der für Val-1744 spezifisch ist, detektiert. Wie in Bahn 1 gezeigt, war keine Kreuzreaktivität mit dem ungespaltenen Notch-Fusionsprotein zu beobachten. Überdies wurde diese spezielle Spaltung in dem Notch-Protein dosisabhängig durch DAPT (Dovey et. al., J. Neurochem. 76: 173–181, 2001), einem allgemein bekannten starken Inhibitor von γ-Secretase inhibiert (Bahn 4–8, 5).
Um zu bestimmen, ob es in dem Notch-Protein noch eine weitere Spaltung gibt, wurde die Spaltreaktion außerdem durch einen Western-Blot unter Verwendung des C-terminalen Flag-Antikörpers überwacht. Außerhalb der drei immunoreaktiven Banden war nur ein Spaltprodukt durch DAPT inhibierbar. Alles in allem lassen diese Ergebnisse darauf schließen, daß die γ-Secretase-vermittelte In-vitro-Spaltung zu einer speziellen Spaltung an 1743/1744 zu führen scheint, was mit zellbasierenden Studien übereinstimmt, die die Produktion von NICD aus Notch zeigen (Kopan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 1683–1688, 1996; Schroeter et al., Nature, 393: 382–386, 1998).
Die obigen Ergebnisse zeigten, daß das Notch-Fusionsprotein für eine γ-Secretase-vermittelte spezifische Spaltung, die auf einem Western-Blot durch einen hoch spezifischen monoklonalen Val-1744-Antikörper detektiert werden kann, empfänglich ist. Da Western-Blots nicht quantitativ sind, sind Verbindungen für die Notch-Inhibierung nur schwer zu bewerten und die Inhibierungspotentiale mit dem Aβ ELISA zu vergleichen.
6 zeigt eine Strategie zur Entwicklung eines quantitativen ELISA für die Notch-Spaltung zum Vergleich des Inhibierungspotentials von Verbindungen mit dem CT-100-basierenden ELISA. Sie basiert auf einem Sandwich-ELISA unter Verwendung der hoch spezifischen Anti-Val-1744- und Anti-Flag-Antikörper zum Einfangen des N- und C-Terminus des NICD-Fragments aus dem Notch-Fusionsprotein in Gegenwart von γ-Secretase. Dieser Assay wird wie in Beispiel 1 unter der Überschrift "In-vitro-Notch-Spaltungs-ELISA" durchgeführt. Im wesentlichen wird in diesem Sandwich-ELISA die Mikrotiterplatte mit Val-1744-Antikörper beschichtet. Während dessen wird die NusA-Notch-Spaltreaktion durchgeführt, in der NusA-Notch mit γ-Secretase inkubiert wird. Die mit Val-1744-Antikörper beschichtete Platte wird mit Puffer gewaschen und mit BSA blockiert. Das Spaltreaktionsgemisch wird dann zu der Mikrotiterplatte gegeben und für einen geeigneten Zeitraum bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, der Anti-FLAG-HRP-Antikörper (Sigma, St. Louis, Mo) wurde zugegeben und erneut für einen geeigneten Zeitraum inkubiert. Das chromogene Substrat für HRP, TMB-Reagens (Kirkegaard & Perry), wurde zugegeben und die entwickelte Farbe wurde bei 450 nm auf einem SpectraMax Plus-Plattenleser ausgelesen. 7 zeigt die Spaltung des NusA-Notch-Fusionsproteins, detektiert durch ELISA. In dem ELISA wurde ein 5-facher Signal-Rausch-Abstand beobachtet.
Die enzymatische Aktivität solubilisierter γ-Secretase für die Notch-Spaltung wurde in dem ELISA unter definierten experimentellen Bedingungen weiter charakterisiert. 8A zeigt die Substratabhängigkeit der Produktbildung. Die Reaktion folgt Michaelis-Menten-Kinetiken und der scheinbare Km für die Hydrolyse des Notch-Fusionsproteinsubstrats durch solubilisierte γ-Secretaseaktivität beträgt unter definierten Bedingungen etwa 0,7 μM. Die beobachtete Notch-Spaltaktivität war auch linear mit der Proteinkonzentration eines solubilisierten Membranpräparats, das γ-Secretaseaktivität enthält (8B).
Eine weitere Bestätigung für die γ-Secretase-vermittelte Notch-Spaltung in dem ELISA war durch Inhibierungsstudien unter Verwendung spezieller Inhibitoren für dieses Enzym, die in der Literatur berichtet werden, erhältlich. Ein starker Inhibitor von γ-Secretase, genannt DAPT, ist berichtet worden (Dovey et al., J. Neurochem. 76: 173–181, 2001). Wie in 9 gezeigt, inhibiert DAPT (PHA-568638) die Notch-Spaltung dosisabhängig mit einem IC₅₀ 2,4 nM. Andererseits ist von Fenchylaminsulfonamid (PHA-512088) berichtet worden (Rishton et al., J. Med. Chem. 43: 2297–2299, 2000), daß es die γ-Secretaseaktivität im unteren μM-Bereich in dem CT-100-in-vitro-Assay inhibiert. Wie in 9 gezeigt, inhibierte PHA-512088 die γ-Secretase-vermittelte Notch-Spaltung mit einem IC₅₀ von 0,7 μM in dem ELISA unter definierten Bedingungen. Wie gezeigt, arbeiteten die Inhibitoren (PHA-568638; PHA-512088) im unteren nM- bis in den unteren μM-Bereich in dem Assay sehr gut. Alles in allem zeigen diese Ergebnisse, daß die enzymatische Aktivität in vitro, die ein NICD-Fragment aus einem Notch-Fusionsproteinsubstrat erzeugt, γ-Secretase zuzuschreiben ist.
Kürzlich sind zellbasierende Assays zur parallelen Verfolgung der APP- und Notch-Spaltung berichtet worden (Karlstrom et al., J. Biol. Chem. 277: 6763–6766, 2002). Die vorliegende Erfindung demonstriert jedoch zum ersten Mal einen quantitativen In-vitro-ELISA zur Verfolgung der spezifischen Notch-Spaltung (G1743-V1744) durch γ-Secretase. Die vorliegende Erfindung demonstriert zum ersten Mal, daß γ-Secretaseaktivität aus HeLa-Zellen spezifisch das Notch-Protein an der 1743-1744-Verbindung spaltet.
Alle hierin offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und/oder Verfahren können ohne unnötige Experimente im Lichte der vorliegenden Offenbarung hergestellt und ausgeführt werden. Während die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen beschrieben worden sind, wird ein Fachmann erkennen, daß Variationen an den Zusammensetzungen und/oder Verfahren und in den Schritten oder der Folge von Schritten der hierin beschriebenen Verfahren vorgenommen werden können, ohne vom Konzept, Sinn und Umfang der Erfindung abzuweichen. Genauer gesagt wird zu erkennen sein, daß bestimmte Mittel, die sowohl chemisch als auch physiologisch verwandt sind, gegen die hierin beschriebenen Mittel ausgetauscht werden können, während trotzdem die gleichen oder ähnliche Ergebnisse erreicht werden. Alle diese ähnlichen Substituenten und Modifikationen, die einem Fachmann ersichtlich sein werden, werden als im Umfang der Erfindung, wie er durch die anhängenden Ansprüche definiert wurde, liegend betrachtet. Sequenzprotokoll

Claims

Lösliches Fusionsprotein, umfassend ein rekombinantes Notch-Protein, fusioniert an den C-Terminus einer NusA-Proteinsequenz.
Lösliches Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das rekombinante Notch-Protein die S3-Spaltstelle von Notch umfaßt.
Lösliches Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das rekombinante Notch-Protein ein vertebrales Notch-Protein ist.
Lösliches Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das rekombinante Notch-Protein ein invertebrales Notch-Protein ist.
Lösliches Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das rekombinante Notch-Protein aus dem Maus-Notch-Protein mit der Sequenz von SEQ ID NO: 5 stammt.
Lösliches Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das rekombinante Notch-Protein die Aminosäuren 1703 bis 1860 des Maus-Notch-Proteins umfaßt.
Lösliches Fusionsprotein nach Anspruch 6, wobei das rekombinante Notch-Protein die Aminosäuren 1703 bis 1860 des Maus-Notch-Proteins, wie in SEQ ID NO: 5 angegeben, umfaßt, und wobei die NusA-Proteinsequenz SEQ ID NO: 17 umfaßt.
Lösliches Fusionsprotein nach Anspruch 7, wobei das rekombinante Notch-Protein im wesentlichen aus den Aminosäuren 1703 bis 1860 des Maus-Notch-Proteins, wie in SEQ ID NO: 5 angegeben, besteht, und wobei die NusA-Proteinsequenz im wesentlichen aus SEQ ID NO: 17 besteht.
Lösliches Fusionsprotein nach Anspruch 8, kodiert durch die Nukleotidsequenz, angegeben durch SEQ ID NO: 1.
Lösliches Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ferner umfassend eine C-terminale His-Markierung.
Lösliches Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ferner umfassend eine C-terminale Flag-Markierung.
Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 11 kodiert.
Polynukleotidsequenz, die ein Fusionsprotein nach Anspruch 1 kodiert, wobei die Polynukleotidsequenz eine Sequenz, angegeben in SEQ ID NO: 1, umfaßt.
In-vitro-Verfahren zum Test auf die γ-Secretase-vermittelte ε-Spaltung (1743/1744) des Notch-Proteins, umfassend: a. Kontaktieren einer ersten Zusammensetzung, umfassend einen Säuger-γ-Secretasekomplex oder ein biologisch aktives Fragment davon, mit einer zweiten Zusammensetzung, umfassend ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 11; und b. Messen der Spaltung des Fusionsproteins.
In-vitro-Verfahren zum Screenen auf Modulatoren der γ-Secretase-vermittelten ε-Spaltung (1743/1744) des Notch-Proteins, umfassend die folgenden Schritte: (a) Kontaktieren einer ersten Zusammensetzung, umfassend einen Säuger-γ-Secretasekomplex oder ein biologisch aktives Fragment davon, mit einer zweiten Zusammensetzung, umfassend ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 11, in Gegenwart und in Abwesenheit einer putativen Modulatorverbindung; (b) Messen der Spaltung des Fusionsproteins in Gegenwart und Abwesenheit einer mutmaßlichen Modulatorverbindung und (c) Identifizieren von Modulatoren, die die γ-Secretase-vermittelte Spaltung des Fusionsproteins modulieren; wobei eine mutmaßliche Modulatorverbindung einen Unterschied bei der γ-Secretasespaltung in Schritt (b) erzeugt.
Kit zur Durchführung eines γ-Secretaseassays, umfassend ein γ-Secretasesubstrat, umfassend ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
Fusionsprotein, umfassend ein an ein Notch-Polypeptid fusioniertes NusA-Polypeptid, umfassend 90 bis 95 % Sequenzidentität mit der NusA-Sequenz von SEQ ID NO: 17, wobei das Notch-Polypeptid die Transmembrandomäne von Notch umfaßt und wobei das Fusionsprotein in einer wässerigen Lösung löslich ist.
Verfahren zum Screenen auf einen selektiven Inhibitor der γ-Secretaseprozessierung eines Amyloidpräkursorproteins (APP), umfassend: a) Bereitstellen einer Testverbindung, die die γ-Secretase-vermittelte Spaltung eines Polypeptids, umfassend eine APP-gamma-Secretasestelle, inhibiert; und b) Messen der gamma-Secretasespaltung eines Fusionsproteins nach Anspruch 1 in Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung, wobei eine Testverbindung, die bevorzugt die gamma-Secretasespaltung des Polypeptids im Vergleich zu der Spaltung des Fusionsproteins inhibiert, ein selektiver Inhibitor der gamma-Secretaseprozessierung von APP ist.