DE60315847T2

DE60315847T2 - Varianten des menschliche koagulationsfaktors vii

Info

Publication number: DE60315847T2
Application number: DE60315847T
Authority: DE
Inventors: Egon Persson; Ole Hvilsted Olsen
Original assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Priority date: 2002-09-25
Filing date: 2003-09-24
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2023-09-25
Also published as: DE60330923D1; EP1546202B1; EP1908782A1; JP4597678B2; DE60315847D1; EP1908782B1; EP1546202A1; JP2006516384A; ES2339393T3; ES2293088T3; WO2004029090A1; ATE454403T1; ATE370968T1; AU2003266214A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptide des Humangerinnungsfaktors VIIa mit gerinnungsfordernder Aktivität sowie derartige Polypeptide kodierende Polynukleotidkonstrukte, die Polynukleotide umfassende und exprimierende Vektoren, Arzneimittel, Verwendungen und Behandlungsverfahren.
Hintergrund der Erfindung
bei der Blutgerinnung handelt es sich um einen Prozess, der aus einer komplexen Wechselwirkung von verschiedenen Blutbestandteilen (oder -faktoren) besteht, die letztendlich ein Fibringerinnsel verursachen. Im Allgemeinen handelt es sich bei den Blutbestandteilen, die daran teilnehmen, was als die Gerinnungs"Kaskade" bezeichnet wird, um enzymatisch inaktive Proteine (Proenzyme oder Zymogene), die durch die Einwirkung eines Aktivators (der selbst ein aktivierter Gerinnungsfaktor ist) zu proteolytischen Enzymen umgewandelt werden. Gerinnungsfaktoren, die eine derartige Umwandlung durchmachten, werden allgemein als „aktive Faktoren" bezeichnet und sind durch Hinzufügung des Buchstaben „a" zum Namen des Gerinnungsfaktors gekennzeichnet (z.B. Faktor VIIa).
Die Initiierung des Hämostaseprozesses wird durch die Bildung eines Komplexes zwischen Gewebefaktor, der infolge einer Verletzung an der Gefäßwand freigelegt ist, und Faktor VIIa vermittelt. Dieser Komplex wandelt dann die Faktoren IX und X zu ihren aktiven Formen um. Faktor Xa wandelt an den Gewebefaktor-tragenden Zellen begrenzte Mengen an Prothrombin zu Thrombin um. Thrombin aktiviert Plättchen und die Faktoren V und VIII zu Faktoren Va und VIIIa, beides Kofaktoren im weiteren Prozess, was zu einem vollständigen Thrombinausbruch führt. Dieser Prozess schließt die Bildung von Faktor Xa durch Faktor IXa (in Komplex mit Faktor VIIIa) ein und findet an der Oberfläche von aktivierten Plättchen statt. Thrombin wandelt schließlich Fibrinogen zu Fibrin um, was zur Bildung eines Fibringerinnsels führt. In den letzten Jahren stellte es sich heraus, dass es sich bei Faktor VII und Gewebefaktor um die Hauptinitiatoren der Blutgerinnung handelt.
Faktor VII ist ein Spurenplasmaglycoprotein, das im Blut als einkettiges Zymogen zirkuliert. Das Zymogen ist katalytisch inaktiv. Einkettiger Faktor VII kann in vitro durch Faktor Xa, Faktor VIIa, Faktor IXa, Faktor VII oder Thrombin zu zweikettigern Faktor VIIa umgewandelt werden. Es wird angenommen, dass Faktor Xa der physiologische Hauptaktivator von Faktor VII ist. Wie etliche andere Plasmaproteine, die an der Hämostase beteiligt sind, hängt die Aktivität von Faktor VII von Vitamin K ab, das zur gamma-Carboxylierung von mehrfachen Glutaminsäureresten erforderlich ist, die eng mit dem Aminoterminus des Proteins zusammengeballt sind. Diese gamma-carboxylierten Glutaminsäuren sind für die durch Metallionen herbeigeführte Wechselwirkung von Faktor VII mit Phospholipiden erforderlich. Die Umwandlung von Zymogen-Faktor-VII zu dem aktivierten zweikettigen Molekül erfolgt durch Spaltung einer internen Arg₁₅₂-Ile₁₅₃-Peptidbindung. In Gegenwart von Gewebefaktor, Phospholipiden und Calciumionen aktiviert der zweikettige Faktor VIIa rapide Faktor X oder Faktor IX durch eingeschränkte Proteolyse.
Es ist häufig erwünscht, die Gerinnungskaskade in einem Probanden zu stimulieren oder zu verbessern. Faktor VIIa wurde bisher zum Regulieren von Blutungsstörungen, die verschiedene Ursachen haben, wie Gerinnungsfaktormangel (z.B. Hämophilie A und B oder Mangel an Gerinnungsfaktor XI oder VII) oder Gerinnungsfaktorhemmer, verwendet. Faktor VIIa wurde bisher auch zum Regulieren einer übermäßigen Blutung verwendet, die in Probanden mit einer normal funktionierenden Blutgerinnungskaskade (kein Gerinnungsfaktormangel oder keine Hemmer für irgendwelche der Gerinnungsfaktoren) auftritt. Eine derartige Blutung kann z.B. durch eine mangelhafte Plättchenfunktion, Thrombocytopänie oder von-Willebrand-Krankheit verursacht werden. Eine Blutung ist auch das Hauptproblem in Verbindung mit einem chirurgischen Eingriff und anderen Formen einer Gewebeschädigung.

das Europäische Patent Nr. 200,421 (ZymoGenetics) betrifft die den Humanfaktor VII kodierende Nukleotidsequenz und die rekombinante Expression von Faktor VII in Säugerzellen.
Dickinson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 14379-14384) betrifft eine Faktor-VII-Variante, in welcher Leu305 durch Ala ersetzt wurde (FVII(Ala305)).
Iwanaga et al. (Thromb. Haemost. (Ergänzungsausgabe August 1999), 466, Abstract 1474) betrifft Faktor-VIIa-Varianten, in welchen die Reste 316-320 deletiert sind oder die Reste 311-322 mit den entsprechenden Resten von Trypsin ersetzt sind.

Die Internationalen Patentanmeldungen WO 01/83725 und WO 02/22776 betreffen Varianten von Faktor VIIa mit erhöhter Aktivität.
Es besteht Bedarf an Varianten von Faktor VIIa mit gerinnungsfordernder Aktivität, Varianten mit hoher Aktivität, die in relativ niedrigen Dosen verabreicht werden können, und Varianten, die keine unerwünschten Nebenwirkungen, wie systemische Aktivierung des Gerinnungssystems bzw. Blutung, die mit herkömmlichen Therapien verbunden sind, erzeugen.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde nun auf ein Faktor-VII-Polypeptid beschränkt, umfassend Substitutionen an F374 und K337 von SEQ ID Nr. 1. Alle anderen Varianten, die nicht mindestens diese beiden Substitutionen umfassen, sind lediglich weitere Beispiele und sind nicht erfindungsgemäß.
Es stellte sich nun überraschend heraus, dass Polypeptidvarianten des Humangerinnungsfaktors VIIa, in welchen die Aminosäure Phe374 und mindestens eine Aminosäure, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lys157, Leu305, Ser314, Lys337, Asp334, Ser336, Val158, Glu296 und Met298 von SEQ ID Nr. 1 durch andere Aminosäuren ersetzt sind, verglichen mit dem Humangerinnungsfaktor VIIa vom Wildtyp eine erhöhte gerinnungsfördernde Aktivität aufweisen.
Der Begriff „eine andere Aminosäure" bedeutet wie hier verwendet eine Aminosäure, die sich von derjenigen Aminosäure unterscheidet, die an dieser Position naturgemäß vorliegt. Dies schließt Aminosäuren, die durch ein Polynukleotid kodiert werden können, ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. In einer Ausführungsform liegt die Aminosäure in der natürlichen L-Form vor und kann durch ein Polynukleotid kodiert werden. Ein spezifisches Beispiel ist L-Cystein (Cys).
Der Begriff „Aktivität" bedeutet wie hier verwendet das Vermögen eines Faktor-VII-Polypeptids, dessen Substrat-Faktor-X zum Aktivieren von Faktor Xa umzuwandeln. Die Aktivität eines Faktor-VII-Polypeptids kann mit dem „In-Vitro-Proteolyse-Assay" (siehe Beispiel 4) gemessen werden.
Der Begriff „Eigenaktivität" schließt auch das Vermögen ein, an der Oberfläche von aktivierten Plättchen in Abwesenheit von Gewebefaktor Thrombin zu erzeugen.
Der Rest Phe374 befindet sich am Ende einer an Rest 307 beginnenden α-Helix. Diese α-Helix ist in der Gewebefaktor-komplexierten Form von Faktor VIIa zu finden. In freiem Faktor VIIa (nicht an Gewebefaktor gebundenem Faktor VIIa) ist die Helix ungeordnet und folglich möglicherweise instabil. Die Helix ist vermeintlich für die Aktivität wichtig. Die erfindungsgemäßen Varianten können die aktive Konformation erlangen, die normalerweise durch den Gewebefaktor herbeigeführt werden muss.
Die erhöhte Aktivität kann aufgrund einer Stabilisierung der an Rest 307 beginnenden α-Helix, einer Neuorientierung der Helix oder irgendeiner anderen Änderung in der Konformation vorliegen. Der Ersatz des sich am Ende der Helix befindenden Rests Phe374, führt die Neuorientierung und/oder Stabilisierung der Helix herbei.
Aufgrund der höheren Eigenaktivität der beschriebenen Faktor-VIIa-Variante im Vergleich mit nativem Faktor VIIa, wird eine geringere Dosis ausreichend sein, um eine funktionell ausreichende Konzentration an der Wirkstelle zu erhalten, und folglich wird es möglich sein, dem Probanden, der Blutungsepisoden hat oder eine Verbesserung des normalen hämostatischen Systems benötigt, eine geringere Dosis zu verabreichen.
Leu305 befindet sich am anderen Ende dieser in der Gewebefaktor-komplexierten Form von Faktor VIIa zu findenden α-Helix, die vermeintlich für die Aktivität wichtig ist. Der Ersatz des Rests Leu305 kann ebenfalls eine Neuorientierung und/oder Stabilisierung der Helix herbeifürhren.
Die Lys157, Ser314, Lys337, Asp334, Ser336, Val158, Glu296 und Met298 umfassenden Aminosäuren befinden sich in einem Bereich, der vermeintlich die Einfügung des Aminoterminus der Proteasedomäne und dadurch die Bildung der katalytisch aktiven Konformation von Faktor VIIa, die von einer Salzbrücke zwischen der endständigen Aminogruppe von Ile153 und der Seitengruppe von Asp343 abhängt, beeinflusst. Die Ersetzungen können elektrostatische Abstoßungen beseitigen, Wasserstoffbindungen hinzufügen oder sonstig die Einfügung des Aminoterminus erleichtern.
Aufgrund der höheren Eigenaktivität der beschriebenen Faktor-VIIa-Polypeptidvarianten im Vergleich mit nativen Faktor VIIa kann eine geringere Dosis ausreichend sein, um eine funktionell ausreichende Konzentration an der Wirkstelle zu erhalten, und folglich wird es möglich sein, dem Probanden, der Blutungsepisoden hat oder eine Verbesserung des normalen hämostatischen Systems benötigt, eine geringere Dosis zu verabreichen.
Die Erfinder fanden heraus, dass durch Ersetzen der Aminosäure Phe374 in Kombination mit einem oder mehreren von Lys in Position 157 und von Lys in Position 337 und von Val in Position 158 und von Glu in Position 296 und von Met in Position 298 und von Asp in Position 334 und von Ser in Position 336 und von Leu in Position 305 und von Ser in Position 314, Faktor VIIa spontan eine aktivere Konformation erlangt, die normalerweise durch Gewebefaktor herbeigeführt werden muss. Derartige Faktor-VIIa-Polypeptidvarianten weisen eine Eigenaktivität auf, die in Situationen, in welchen die gerinnungsfordernde Aktivität von Gewebefaktor unabhängig ist (die Erzeugung von Faktor Xa an der Plättchenoberfläche) therapeutisch genauso nützlich sein kann, wie bei Verabreichung von hohen Dosen z.B. an NovoSeven^®.
In einer weiteren Ausführungsform erleichtert der zusätzliche Ersatz von Aminosäuren in der Proteasedomäne weiter die Bildung der aktiven Konformation des Moleküls. Es wird allerdings angenommen, dass die am meisten ausgeprägten Wirkungen ersichtlich sind, wenn die vorstehend erwähnten Mutationen in der Umgebung (sequenziell oder dreidimensional) dieser letzteren sieben Aminosäuren durchgeführt werden.
Die Erfindung umfasst ferner, dass der Ersatz von ein paar Aminosäuren in der N-terminalen Gla-Domäne (Aminosäuren, die 1-37 von SEQ ID Nr. 1 entsprechen) von Faktor VIIa das Protein mit einer wesentlich höheren Affinität für Membranphospholipide wie Membranphospholipide von Gewebefaktor-tragenden Zellen oder Plättchen, versehen kann, wodurch Faktor-VII-Polypeptidvarianten erzeugt werden, die eine verbesserte gerinnungsfördernde Wirkung aufweisen.
So können die vorstehend erwähnten Faktor-VIIa-Polypeptidvarianten zusätzlich zu dem schon durchgeführten Aminosäureersatz in Position F374 in Kombination mit den Ersetzungen in den Positionen L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296 und M298 und den optionalen Aminosäureersetzungen andernorts in der Proteasedomäne auch mindestens eine Aminosäure aufweisen, die in der N-terminalen Gla-Domäne ersetzt ist, wodurch ein Protein mit einer erhöhten Aktivität sowie einer erhöhten Affinität für Membranphospholipide im Vergleich mit nativem Faktor VII erhalten wird. Vorzugsweise können die Aminosäuren in den Positionen 10 und 32 (in Bezug auf SEQ ID Nr. 1) von Faktor VII mit einer anderen Aminosäure ersetzt werden. Beispiele für bevorzugte Aminosäuren, die in die vorstehend erwähnten Positionen einzubringen sind, sind: Die Aminosäure Pro in Position 10 ist ersetzt durch Gln, Arg, His, Gln, Asn oder Lys; und/oder die Aminosäure Lys in Position 32 ist ersetzt durch Glu, Gln oder Asn.
Andere Aminosäuren in der Gla-Domäne auf der Basis der verschiedenen Phospholipidaffinitäten der von Vitamin K abhängigen Plasmaproteine können ebenfalls zur Substitution in betracht gezogen werden.
Der Begriff „N-terminale GLA-Domäne" bedeutet die Aminosäuresequenz 1-37 von Faktor VII.
Die dreibuchstabige Bezeichnung „GLA" bedeutet 4-Carboxyglutaminsäure (γ-Carboxyglutamat).
Der Begriff „Proteasedomäne" bedeutet die Aminosäuresequenz 153-406 von Faktor VII (die schwere Kette von Fakor VIIa).
Der Begriff „Faktor-II-Polypeptid" bedeutet wie hier verwendet ein beliebiges Protein, das die Aminosäuresequenz 1-406 von nativem Humanfaktor VII (SEQ ID Nr. 1) oder Varianten davon umfasst. Dies schließt Humanfaktor VII, Humanfaktor VIIa und Varianten davon ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Der Begriff „Faktor VII" soll wie hier verwendet das inaktive einkettige Zymogen-Gaktor-VII-Molekül, sowie das aktivierte zweikettige Faktor-VII-Molekül (Faktor VIIa) umfassen. Dies schließt Proteine ein, die die Aminosäuresequenz 1-406 von nativem Humanfaktor VII oder Faktor VIIa aufweisen. Es schließt auch Proteine mit einer leicht modifizierten Aminosäuresequenz, z.B. ein modifiziertes N-terminales Ende ein, das N-terminale Aminosäuredeletionen oder Additionen, einschließt, sofern diese Proteine die Aktivität von Faktor VIIa im Wesentlichen beibehalten. Der Begriff „Faktor VIIa", oder „FVIIa" bedeutet wie hier verwendet ein Produkt, das aus der aktivierten Form (Faktor VIIa) besteht. „Faktor VII" oder „Faktor VIIa" in der vorstehenden Definition schließt auch natürliche Allelvariationen ein, die unabhängig vorliegen und auftreten können. Auch können der Grad und der Ort der Glycosylierung oder von anderen posttranslationalen Modifikationen je nach ausgewählten Wirtszellen und der Beschaffenheit der Wirtszellenumgebung variieren.
Die Begriffe „Variante" oder „Varianten" sollen wie hier verwendet Faktor VII mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 bezeichnen, wobei eine oder mehrere Aminosäuren des Ursprungsproteins durch eine andere Aminosäure substituiert wurden und/oder wobei eine oder mehrere Aminosäuren des Ursprungsproteins deletiert wurden und/oder wobei eine oder mehrere Aminosäuren in das Protein eingefügt wurden und/oder wobei eine oder mehrere Aminosäuren an das Ursprungsprotein addiert wurden. Eine derartige Addition kann entweder am N-terminalen Ende oder am C-terminalen Ende des Ursprungsproteins oder an Beidem stattfinden. Die „Variante" oder „Varianten" in dieser Definition weisen immer noch FVII-Aktivität in ihrer aktivierten Form auf. In einer Ausführungsform ist eine Variante mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 zu 70% identisch. In einer Ausführungsform ist eine Variante mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 zu 80% identisch. In einer anderen Ausführungsform ist eine Variante mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 zu 90% identisch. In einer weiteren Ausführungsform ist eine Variante mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 zu 95% identisch.
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Faktor-VII-Polypeptid, das mindestens zwei Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 umfasst, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) Ersatz mit einer beliebigen anderen Aminosäure von einer oder mehreren Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296 und M298.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Faktor-VII-Polypeptid mit zwei Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) Ersatz mit einer beliebigen anderen Aminosäure von einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296 und M298.
In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein Faktor-VII-Polypeptid mit drei Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) Ersatz mit einer beliebigen anderen Aminosäure von zwei Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296 und M298.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Faktor-VII-Polypeptid mit vier Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) Ersatz mit einer beliebigen anderen Aminosäure von drei Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296 und M298.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Faktor-VII-Polypeptid mit fünf Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) Ersatz mit einer beliebigen anderen Aminosäure von vier Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296 und M298.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Faktor-VII-Polypeptid mit sechs Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) Ersatz mit einer beliebigen anderen Aminosäure von fünf Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296 und M298.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Faktor-VII-Polypeptid mit sieben Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) Ersatz mit einer beliebigen anderen Aminosäure von sechs Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296 und M298.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Faktor-VII-Polypeptid mit acht Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) Ersatz mit einer beliebigen anderen Aminosäure von sieben Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296 und M298.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Faktor-VII-Polypeptid mit neun Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) Ersatz mit einer beliebigen anderen Aminosäure von acht Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296 und M298.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Faktor-VII-Polypeptid mit zehn Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) Ersatz mit einer beliebigen anderen Aminosäure der Aminosäuren L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296 und M298.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Polynukleotidkonstrukt, kodierend ein Faktor-VII-Polypeptid, umfassend mindestens zwei Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) Ersatz mit einer beliebigen anderen Aminosäure von einer oder mehreren Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296 und M298.
Der Begriff „Konstrukt" soll ein Polynukleotidsegment angeben, das auf der Basis einer vollständigen oder teilweisen natürlich vorkommenden Nukleotidsequenz, die das Polypeptid von Interesse kodiert, vorliegen kann. Das Konstrukt kann wahlweise andere Polynukleotidsegmente enthalten. In einer ähnlichen Weise deckt der Begriff „Aminosäuren, die durch Polynukleotidkonstrukte kodiert werden können" Aminosäuren, die durch die vorstehend definierten Polynukleotidkonstrukte kodiert werden können, d.h. Aminosäuren wie Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp und Gln ab.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen rekombinanten Vektor bereit, der das ein Faktor-VII-Polypeptid kodierende Polynukleotidkonstrukt umfasst.
Der Begriff „Vektor" bedeutet wie hier verwendet eine beliebige Nukleinsäureeinheit, die in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu amplifizieren. So kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor, d.h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit vorliegt, deren Replikation von der Chromosomenreplikation unabhängig ist, z.B. ein Plasmid, sein. Alternativ dazu kann der Vektor einer sein, der nach dem Einbringen in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom integriert und zusammen mit dem Chromosom bzw. den Chromosomen, in welches bzw. in welche er integriert wurde, repliziert. Die Auswahl des Vektors hängt häufig von der Wirtszelle ab, in welche er einzubringen ist. Vektoren schließen Plasmidvektoren, Phagenvektoren, Viren oder Cosmidvektoren ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Vektoren enthalten gewöhnlich einen Replikationsursprung und mindestens ein selektierbares Gen, d.h. ein gen, das ein Produkt kodiert, das leicht nachweisbar ist oder dessen Gegenwart für das Zellwachstum wesentlich ist.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine rekombinante Wirtszelle bereit, die das Polynukleotidkonstrukt oder den Vektor umfasst. In einer Ausführungsform ist die rekombinante Wirtszelle eine eukaryontische Zelle. In einer anderen Ausführungsform stammt die rekombinante Wirtszelle von einem Säuger. In einer weiteren Ausführungsform ist die rekombinante Wirtszelle ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus CHO-Zellen, HEK-Zellen und BHK-Zellen.
Der Begriff „eine Wirtszelle" stellt wie hier verwendet eine beliebige Zelle, einschließlich Hybridzellen, in welchen heterologe DNA exprimiert werden kann, dar. Typische Wirtszellen schließen Insektenzellen, Hefezellen, Säugerzellen, einschließlich menschlicher Zellen, wie BHK-, CHO-, HEK- und COS-Zellen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beim Durchführen der vorliegenden Erfindung sind die zu züchtenden Zellen vorzugsweise Säugerzellen, stärker bevorzugt eine etablierte Säugerzelllinie, einschließlich, ohne Beschränkung, Zelllinien des Typs CHO (z.B. ATCC CCL 61), COS-1 (z.B. ATCC CRL 1650), von Babyhamsternieren (BHK) und des Typs HEK293 (z.B. ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977). Eine bevorzugte BHK-Zelllinie ist die tk-ts13-BHK-Zelllinie (Waechter und Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1106-1110, 1982), hier nachstehend als BHK-570-Zellen bezeichnet. Die BHK-570-Zelllinie ist von der American Type Culture Collection, 12301 Parklaven Dr., Rockville, MD 20852, unter der ATCC-Zugangsnummer CRL 10314 erhältlich. Eine tk-ts13-BHK-Zelllinie ist ebenfalls von ATCC unter der Zugangsnummer CRL 1632 erhältlich. Andere geeignete Zelllinien schließen ohne Beschränkung Zellen des Typs Rat Hep I (Rattenhepatom; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (Rattenhepatom; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), der menschlichen Lunge (ATCC HB 8065), des Typs NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) und DUKX (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad Sci. USA 77: 4216-4220, 1980) ein. Auch nützlich sind 3T3-Zellen, Namalwa-Zellen, Myelome und Fusionen von Myelomen mit anderen Zellen.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein transgenes Tier bereit, das das Polynukleotidkonstrukt enthält und exprimiert.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die das Polynukleotidkonstrukt enthält und exprimiert.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Faktor-VII-Polypeptids der Erfindung, wobei das Verfahren das Züchten einer das Polynukleotidkonstrukt umfassenden Zelle in einem geeigneten Wachstumsmedium unter die Expression des Polynukleotidkonstrukts gewährenden Bedingungen und Gewinnen des erhaltenen Polypeptids aus dem Kulturmedium umfasst.
Wie hier verwendet bedeutet der Begriff „geeignetes Wachstumsmedium" ein Medium, das Nährstoffe und andere Bestandteile, die für das Zellwachstum und die Expression der das Faktor-VII-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodierenden Nukleinsäuresequenz erforderlich sind, enthält.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Faktor-VII-Polypeptids, wobei das Verfahren das Gewinnen des Polypeptids aus durch das transgene Tier produzierter Milch umfasst.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Faktor-VII-Polypeptids, wobei das Verfahren das Züchten einer das Polynukleotidkonstrukt umfassenden Zelle einer transgenen Pflanze und Gewinnen des Polypeptids aus der erhaltenen Pflanze umfasst.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Arzneimittel, umfassend ein Faktor-VII-Polypeptid, umfassend mindestens zwei Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) Ersatz mit einer beliebigen anderen Aminosäure von einer oder mehreren Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L305, S314, K157, K337, D334, 5336, V158, E296 und M298; und wahlweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktor-VII-Polypeptids, umfassend mindestens zwei Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) Ersatz mit einer beliebigen anderen Aminosäure von einer oder mehreren Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296 und M298, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Blutungsstörungen oder Blutungsepisoden oder zur Verbesserung des normalen hämostatischen Systems. In einer Ausführungsform dient die Verwendung der Behandlung von Hämophilie A oder B.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der begriff „Behandlung" den Einschluss sowohl der Vorbeugung einer erwarteten Blutung wie bei einem chirurgischen Eingriff als auch die Regulierung einer schon auftretenden Blutung wie bei einem Trauma mit dem Zweck des Hemmens oder Minimierens der Blutung. Eine prophylaktische Verabreichung des erfindungsgemäßen Faktor-VIIa-Polypeptids ist somit im Begriff „Behandlung" eingeschlossen.
Der Begriff „Blutungsepisoden" bedeutet den Einschluss von unkontrollierter und übermäßiger Blutung. Blutungsepisoden können sowohl in Verbindung mit einem chirurgischen Eingriff als auch anderen formen der Gewebeschädigung ein Hauptproblem darstellen. Eine unkontrollierte oder übermäßige Blutung kann in Probanden mit einem normalen Gerinnungssystem und Probanden mit Gerinnungs- oder Blutungsstörungen auftreten. Wie hier verwendet, gibt der Begriff „Blutungsstörung" jeglichen angeborenen, erworbenen oder herbeigeführten Defekt zellulären oder molekularen Ursprungs, der sich in Blutungen äußert, wieder. Beispiele sind Gerinnungsfaktormangel (z.B. Hämophilie A und B oder Mangel an Gerinnungsfaktoren XI oder XII), Gerinnungsfaktorhemmer, mangelhafte Plättchenfunktion, Thrombozytopänie oder von-Willebrand-Krankheit.
Übermäßige Blutungen können auch bei Probanden mit einer normal funktionierenden Blutgerinnungskaskade (kein Gerinnungsfaktormangel oder keine ebensolche Hemmer für irgendwelche der Gerinnungsfaktoren) stattfinden und durch eine mangelhafte Plättchenfunktion, Thrombozytopänie oder von-Willebrand-Krankheit verursacht werden. In derartigen Fällen sind die Blutungen mit denjenigen Blutungen vergleichbar, die durch Hämophilie verursacht werden, da das hämostatische System wie bei Hämophilie fehlt oder abnormale essentielle Gerinnungs-"Verbindungen" (wie Plättchen oder von-Willebrand-Faktorprotein) aufweist, was starke Blutungen verursacht. bei Probanden, die eine übermäßige Gewebeschädigung in Verbindung mit einem chirurgischen Eingriff oder einem enormen Trauma durchmachen, kann der normale hämostatische Mechanismus durch die Forderung nach sofortiger Hämostase überschwemmt werden, und sie können trotz eines normalen hämostatischen Mechanismus eine Blutung entwickeln. Das Erzielen einer zufrieden stellenden Hämostase ist auf problematisch, wenn Blutungen in Organen wie im Gehirn, im Innenohrbereich und in den Augen mit einer eingeschränkten Möglichkeit für eine chirurgische Hämostase auftreten. Dasselbe Problem kann in dem Verfahren der Biopsieentnahme von verschiedenen Organen (Leber, Lunge, Tumorgewebe, Magendarmtrakt) sowie bei einem chirurgischen lapraskopischen Eingriff auftreten. Sämtliche dieser Situationen haben die Schwierigkeit gemein, durch chirurgische Techniken (chirurgische Nähte, Klips usw.) eine Hämostase bereitzustellen, was auch der Fall ist, wenn die Blutung gestreut ist (hämorrhagische Gastritis und übermäßige Gebährmutterblutung). Akute und übermäßige Blutungen können in sich einer Antigerinnungstherapie unterziehenden Probanden auftreten, bei welchen eine mangelhafte Hämostase durch die erhaltene Therapie herbeigeführt wurde. Derartige Probanden können chirurgische Maßnahmen benötigen, falls der Antigerinnungswirkung schnell entgegengewirkt werden muss. Eine radikale retropubische Prostatektomie ist eine allgemein durchgeführte Vorgehensweise für Probanden mit lokalisiertem Prostatakrebs. Die Operation wird häufig durch erheblichen und massiven Blutverlust verkompliziert. Der beträchtliche Blutverlust während einer Prostatektomie ist hauptsächlich mit der komplizierten anatomischen Lage, mit verschiedenen dicht vaskularisierten Stellen, die für eine chirurgische Hämostase nicht leicht zugänglich sind und zu einer gestreuten Blutung über einen großen Bereich (ihren können, verbunden. Eine andere Situation, die im Falle einer nicht zufriedenstellenden Hämostase Probleme verursachen kann, liegt wor, wenn Probanden mit einem normalen Hämostasemechanismus zum Verbeugen einer thromboembolischen Erkrankung eine Antigennnungstherapie erhalten. Eine derartige Therapie kann Heparin, andere Formen von Proteoglycanen, Warfarin oder andere Formen von Vitamin-K-Antagonisten, sowie Aspirin und andere Plättchenaggregationshemmer einschließen.
In einer Ausführungsform der Erfindung steht die Blutung mit Hämophilie in Zusammenhang. In einer anderen Ausführungsform steht die Blutung mit Hämophilie mit erhaltenen Hemmern in Zusammenhang. In einer anderen Ausführungsform steht die Blutung mit Thrombozytopänie in Zusammenhang. In einer anderen Ausführungsform steht die Blutung mit von-Willebrand-Krankheit in Zusammenhang. In einer anderen Ausführungsform steht die Blutung mit schwerer Gewebeschädigung in Zusammenhang. In einer anderen Ausführungsform steht die Blutung mit einem schweren Trauma in Zusammenhang. In einer anderen Ausführungsform steht die Blutung mit einem chirurgischen Eingriff in Zusammenhang. In einer anderen Ausführungsform steht die Blutung mit einem chirurgischen laparoskopieschen Eingriff in Zusammenhang. In einer anderen Ausführungsform steht die Blutung mit hämorrhagischer Gastritis in Zusammenhang. In einer anderen Ausführungsform steht die Blutung mit übermäßiger Gebährmutterblutung in Zusammenhang. In einer anderen Ausführungsform tritt die Blutung in Organen mit einer eingeschränkten Möglichkeit für eine mechanische Hämostase auf. In einer anderen Ausführungsform tritt die Blutung im Gehirn, im Innenohrbereich oder in den Augen auf. In einer anderen Ausführungsform steht die Blutung mit dem Verfahren der Biopsieentnahme in Zusammenhang. In einer anderen Ausführungsform steht die Blutung mit einer Antigerinnungstherapie in Zusammenhang.
Der Begriff „Proband" bedeutet wie hier verwendet ein beliebiges Tier, insbesondere einen Säuger, wie Menschen und kann, wo geeignet, austauschbar mit dem Begriff „Patient" verwendet werden.
Der Begriff „Verbesserung des normalen hämostatischen Systems" bedeutet eine Verbesserung des Vermögens, Thrombin zu erzeugen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Blutungsstörungen oder Blutungsepisoden bei einem Probanden oder zur Verbesserung des normalen hämostatischen Systems, wobei das Verfahren das verabreichen einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge eines Faktor-VII-Polypeptids, umfassend mindestens zwei Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) Ersatz mit einer beliebigen anderen Aminosäure von einer oder mehreren Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296 und M298; an einen dies benötigenden Probanden umfasst.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung das Faktor-VII-Polypeptid der Erfindung zur Verwendung als Medikament.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist und L305 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist und S314 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist und K157 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist und K337 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist und D334 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist und S336 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist und V158 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist und E296 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist und M298 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei mindestens eine Aminosäure in den übrigen Positionen in der Proteasedomäne mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurde. In einer Ausführungsform ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei eine Aminosäure in den übrigen Positionen in der Proteasedomäne mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei höchstens 20 zusätzliche Aminosäuren in den übrigen Positionen in der Proteasedomäne mit beliebigen anderen Aminosäuren ersetzt wurden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei mindestens eine Aminosäure, die einer Aminosäure an einer Position, ausgewählt aus 159-170 von SEQ ID Nr. 1, entspricht, mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei mindestens eine Aminosäure, die einer Aminosäure an einer Position, ausgewählt aus 290-304 von SEQ ID Nr. 1, entspricht, mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei R304 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurde. In einer Ausführungsform wurde R304 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Tyr, Phe, Leu und Met ersetzt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei mindestens eine Aminosäure, die einer Aminosäure an einer Position, ausgewählt aus 306-312 von SEQ ID Nr. 1, entspricht, mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei M306 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Asp und Asn, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei D309 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ser und Thr, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei mindestens eine Aminosäure, entsprechend einer Amino säure an einer Position, ausgewählt aus 330-339 von SEQ ID Nr. 1 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei A274 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das A274 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Met, Leu, Lys und Arg, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das K157 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Arg, His, Asp und Gln, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das K157 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp und Glu, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das K337 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Arg, His, Asp und Gln, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das K337 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp und Glu, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das D334 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His und Gln, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das D334 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gly und Glu, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das S336 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp und Gln, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das S336 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gly und Glu, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das V158 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp und Gln, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das V158 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ser, Thr, Asn, Gln, Asp und Glu, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das E296 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Lys, Arg, His, Asp und Gln, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das E296 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Arg, Lys und Val, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das M298 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp und Gln, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das M298 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lys, Arg, Gln und Asn, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das L305 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Val, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp und Gln, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das L305 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Val, Tyr und Ile, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das L305 durch Val ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das S314 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp und Gln, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das S314 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gly, Lys, Gln und Glu, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das F374 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Val, Leu, Ile, Met, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp und Gln, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das F374 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pro und Tyr, ersetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei die Aminosäure durch eine andere Aminosäure ersetzt wurde, die durch Polynukleotidkonstrukte kodiert werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das Faktor-VII-Polypeptid Human-Faktor-VII ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das Faktor-VII-Polypeptid Human-Faktor-VIIa ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das Verhältnis zwischen der Aktivität des Faktor-VII-Polypeptids und der Aktivität des in SEQ ID Nr. 1 dargestellten nativen Faktor-VIIa-Polypeptids mindestens etwa 1,25 beträgt. In einer Ausführungsform der Erfindung beträgt das Verhältnis zwischen der Aktivität des Faktor-VII-Polypeptids und der Aktivität des in SEQ ID Nr. 1 dargestellten nativen Faktor-VIIa-Polypeptids mindestens etwa 2,0. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung beträgt das Verhältnis zwischen der Aktivität des Faktor-VII- Polypeptids und der Aktivität des in SEQ ID Nr. 1 dargestellten nativen Faktor-VIIa-Polypeptids mindestens etwa 4,0.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das Verhältnis zwischen der Aktivität des Faktor-VII-Polypeptids und der Aktivität des in SEQ ID Nr. 1 dargestellten nativen Faktor-VIIa-Polypeptids beim Testen in einem Faktor-VII-Aktivitäts-Assay mindestens etwa 1,25 beträgt. In einer Ausführungsform beträgt das Verhältnis zwischen der Aktivität des Faktor-VII-Polypeptids und der Aktivität des in SEQ ID Nr. 1 dargestellten nativen Faktor-VIIa-Polypeptids beim Testen in einem Faktor-VII-Aktivitäts-Assay mindestens etwa 2,0. In einer weiteren Ausführungsform beträgt das Verhältnis zwischen der Aktivität des Faktor-VII-Polypeptids und der Aktivität des in SEQ ID Nr. 1 dargestellten nativen Faktor-VIIa-Polypeptids beim Testen in einem Faktor-VII-Aktivitäts-Assay mindestens etwa 4,0. Die Faktor-VIIa-Aktivität kann durch die in den Beispielen 3 oder 4 beschriebenen Assays gemessen werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das Verhältnis zwischen der Aktivität des Faktor-VII-Polypeptids und der Aktivität des in SEQ ID Nr. 1 dargestellten nativen Faktor-VIIa-Polypeptids beim Testen im „In-vitro-Hydrolyse-Assay" mindestens etwa 1,25 beträgt. In einer Ausführungsform beträgt das Verhältnis zwischen der Aktivität des Faktor-VII-Polypeptids und der Aktivität des in SEQ ID Nr. 1 dargestellten nativen Faktor-VIIa-Polypeptids beim Testen im „In-vitro-Hydrolyse-Assay" mindestens etwa 2,0. In einer weiteren Ausführungsform beträgt das Verhältnis zwischen der Aktivität des Faktor-VII-Polypeptids und der Aktivität des in SEQ ID Nr. 1 dargestellten nativen Faktor-VIIa-Polypeptids beim Testen im „In-vitro-Hydrolyse-Assay" mindestens etwa 4,0.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid ein Polypeptid, wobei das Verhältnis zwischen der Aktivität des Faktor-VII- Polypeptids und der Aktivität des in SEQ ID Nr. 1 dargestellten nativen Faktor-VIIa-Polypeptids beim Testen im „In-vitro-Proteolyse-Assay" mindestens etwa 1,25 beträgt. In einer Ausführungsform beträgt das Verhältnis zwischen der Aktivität des Faktor-VII-Polypeptids und der Aktivität des in SEQ ID Nr. 1 dargestellten nativen Faktor-VIIa-Polypeptids beim Testen im „In-vitro-Proteolyse-Assay" mindestens etwa 2,0. In einer weiteren Ausführungsform beträgt das Verhältnis zwischen der Aktivität des Faktor-VII-Polypeptids und der Aktivität des in SEQ ID Nr. 1 dargestellten nativen Faktor-VIIa-Polypeptids beim Testen im „In-vitro-Proteolyse-Assay" mindestens etwa 4,0. In einer weiteren Ausführungsform beträgt das Verhältnis zwischen der Aktivität des Faktor-VII-Polypeptids und der Aktivität des in SEQ ID Nr. 1 dargestellten nativen Faktor-VIIa-Polypeptids beim Testen im „In-vitro-Proteolyse-Assay" mindestens etwa 8,0.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid Human-FVII mit mindestens zwei Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) F374Y und (ii) eine oder mehrere Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus K157X¹, K337A, D334X², S336X³, V158X⁴, E296V, M298Q, L305V, S314E, wobei X¹ Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp oder Glu ist; X² Gly oder Glu ist; X³ Gly oder Glu ist; X⁴ Thr oder Asp ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158D-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/E296V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/M298Q-F VII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158T-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/K337A-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158D-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/E296V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158T-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A/V158T-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A/E296V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A/V158D-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158D/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158D/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158D/E296V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158T/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158T/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158T/E296V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/E296V/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/S314E/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/E296V/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374V/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374V/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374V/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374V/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374V/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374V/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374V/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374V/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374V/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid Human-FVII mit (i) der Aminosäuresubstitution F374Y in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 und (ii) zwei Aminosäuresubstitutionen, unabhängig ausgewählt aus einer beliebigen Kombination gemäß Tabelle 1.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid Human-FVII mit (i) der Aminosäuresubstitution F374Y in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 und (ii) drei Aminosäuresubstitutionen, unabhängig ausgewählt aus einer beliebigen Kombination gemäß Tabelle 1.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid Human-FVII mit (i) der Aminosäuresubstitution F374Y in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 und (ii) vier Aminosäuresubstitutionen, unabhängig ausgewählt aus einer beliebigen Kombination gemäß Tabelle 1.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid Human-FVII mit (i) der Aminosäuresubstitution F374Y in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 und (ii) fünf Aminosäuresubstitutionen, unabhängig ausgewählt aus einer beliebigen Kombination gemäß Tabelle 1.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid Human-FVII mit (i) der Aminosäuresubstitution F374Y in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 und (ii) sechs Aminosäuresubstitutionen, unabhängig ausgewählt aus einer beliebigen Kombination gemäß Tabelle 1.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid Human-FVII mit (i) der Aminosäuresubstitution F374Y in Bezug auf die Amino säuresequenz von SEQ ID Nr. 1 und (ii) sieben Aminosäuresubstitutionen, unabhängig ausgewählt aus einer beliebigen Kombination gemäß Tabelle 1.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid Human-FVII mit (i) der Aminosäuresubstitution F374Y in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 und (ii) acht Aminosäuresubstitutionen, unabhängig ausgewählt aus einer beliebigen Kombination gemäß Tabelle 1.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Faktor-VII-Polypeptid Human-FVII mit (i) der Aminosäuresubstitution F374Y in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 und (ii) neun Aminosäuresubstitutionen, unabhängig ausgewählt aus einer beliebigen Kombination gemäß Tabelle 1.
Tabelle 1:
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Human-Gerinnungsfaktor-VIIa-Polypeptide bereit, die verglichen mit nativem Human-Gerinnungsfaktor-VIIa eine erhöhte Gewebefaktor-unabhängige Aktivität aufweisen. In einem anderen Aspekt ist die erhöhte Aktivität nicht von Veränderungen in der Substratspezifität begleitet. In einem anderen Aspekt der Erfindung sollte die Bindung der Polypeptidvarianten an Gewebefaktor nicht beeinträchtigt sein und sollten die Polypeptidvarianten mindestens die Aktivität des Faktors-VIIa vom Wildtyp aufweisen, wenn er an Gewebefaktor gebunden ist.
Die in dieser Beschreibung verwendete Terminologie für Aminosäuresubstitutionen lautet wie folgt. Der erste Buchstabe stellt die Aminosäure dar, die naturgemäß an einer Position von SEQ ID Nr. 1 vorliegt. Die folgende Zahl stellt die Position in SEQ ID Nr. 1 dar. Der zweite Buchstabe stellt die andere Aminosäure dar, die die natürliche Aminosäure substituiert. Ein Beispiel ist L305V/K337A-FVII, das Leucin an Position 305 von SEQ ID Nr. 1 ist durch ein Valin ersetzt, und das Lysin an Position 337 von SEQ ID Nr. 1 ist durch ein Alanin ersetzt, beide Mutationen an derselben Faktor-VII-Polypeptidvariante.

Im vorliegenden Zusammenhang wurden die dreibuchstabigen oder einbuchstabigen Angaben für die Aminosäuren in ihrer wie in Tabelle 2 angegebenen herkömmlichen Bedeutung verwendet. Wenn nicht anders ausdrücklich angegeben, sind die hier erwähnten Aminosäuren L-Aminosäuren. Ferner handelt es sich bei dem linken und rechten Ende einer Aminosäuresequenz eines Peptids, wenn nicht anders spezifiziert, um den N- bzw. den C-Terminus. Tabelle 2: Abkürzungen für Aminosäuren:

Aminosäure	Dreibuchstabencode	Einbuchstabencode
Glycin	Gly	G
Prolin	Pro	P
Alanin	Ala	A
Valin	Val	V
Leucin	Leu	L
Isoleucin	Ile	I
Methionin	Met	M
Cystein	Cys	C
Phenylalanin	Phe	F
Tyrosin	Tyr	Y
Tryptophan	Trp	W
Histidin	His	H
Lysin	Lys	K
Arginin	Arg	R
Glutamin	Gln	Q
Asparagin	Asn	N
Glutaminsäure	Glu	E
Aspartamsäure	Asp	D
Serin	Ser	S
Threonin	Thr	T

Herstellung von Faktor-VII-Polypeptidvarianten
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von wie vorstehend erwähnten Human-Faktor-VII-Polypeptidvarianten. Die hier beschriebenen Faktor-VII-Polypeptidvarianten können mithilfe von rekombinanten Nukleinsäuretechniken hergestellt werden. Im Allgemeinen wird eine klonierte Faktor-VII-Nukleinsäuresequenz vom Wildtyp derart modifiziert, dass sie das gewünschte Protein kodiert. Diese modifizierte Sequenz wird dann in einen Expressionsvektor eingefügt, der wiederum in Wirtszellen transformiert oder transfiziert wird. Höhere eukaryontische Zellen, insbesondere gezüchtete Säugerzellen sind als Wirtszellen bevorzugt. Die vollständigen Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für Human-Faktor-VII sind bekannt (siehe U.S. 4,784,950 , in welcher das Klonieren und die Expression von rekombinantem Human-Faktor-VII beschrieben ist). Die Rinder-Faktor-VII-Sequenz ist in Takeya et al., J. Biol. Chem. 263: 14868-14872 (1988) beschrieben.
Die Aminosäuresequenzabänderungen können ebenfalls durch eine Vielfalt von Techniken erzielt werden. Eine Modifikation der Nukleinsäuresequenz kann durch stellenspezifische Mutagenese erfolgen. Techniken zur stellenspezifischen Mutagenese sind auf dem Fachgebiet bekannt und z.B. in Zoller und Smith (DNA 3: 479-488, 1984) oder „Splicing by extension overlap", Horton et al., Gene 77, 1989, S. 61-68 beschrieben. So kann man unter Verwendung der Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Faktor VII (eine) Abänderung(en) der Wahl einbringen. Gleichermaßen sind Vorgehensweisen zur Herstellung eines DNA-Konstrukts unter Verwendung von Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von spezifischen Primern dem Fachmann bekannt (vgl. PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA).
Das die Faktor-VII-Polypeptidvariante kodierende Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung kann geeigneterweise genomischen oder cDNA-Ursprungs, z.B. erhalten durch Herstellen einer genomischen oder cDNA-Bibliothek und Durchmustern auf DNA-Sequenzen, die für das gesamte oder einen Teil des Polypeptids kodieren, durch Hybridisierung unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidsonden gemäß Standardtechniken, sein (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Das die Faktor-VII-Polypeptidvariante kodierende Nukleinsäurekonstrukt kann auch durch etablierte Standardverfahren, z.B. das Phosphoamiditverfahren, beschrieben von Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, oder das Verfahren, beschrieben von Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805, synthetisch hergestellt werden. Gemäß dem Phosphoamiditverfahren werden Oligonukleotide z.B. in einer automatischen DNA-Syntheseapparatur synthetisiert, gereinigt, ausgeheilt, ligiert und in geeignete Vektoren kloniert. Die die Human-Faktor-VII-Polypeptidvarianten kodierenden DNA-Sequenzen können auch durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von spezifischen Primern, z.B. wie beschrieben in US 4,683,202 , Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491, oder Sambrook et al., vorstehend, hergestellt werden.
Weiterhin kann das Nukleinsäurekonstrukt gemischten synthetischen und genomischen, gemischten synthetischen und cDNA- oder gemischten genomischen und cDNA-Ursprungs sein, die gemäß Standardtechniken durch Ligieren von Fragmenten synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (nach Eignung) hergestellt werden, wobei die Fragmente verschiedenen Teilen des gesamten Nukleinsäurekonstrukts entsprechen.
Das Nukleinsäurekonstrukt ist vorzugsweise ein DNA-Konstrukt. DNA-Sequenzen zur Verwendung bei der Herstellung von erfindungsgemäßen Faktor-VII-Polypeptidvarianten kodieren typischerweise ein Präpro-Polypeptid am Aminoterminus von Faktor VII, um eine richtige posttranslationale Verarbeitung (z.B. gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten) und Sekretion von der Wirtszelle zu erhalten. Das Präpro-Polypeptid kann dasjenige von Faktor VII und ein anderes Vitamin-K-abhängiges Plasmaprotein, wie Faktor IX, Faktor X, Prothrombin, Protein C oder S, sein. Wie es für den Fachmann einleuchtend ist, können zusätzliche Modifikationen in der Aminosäuresequenz der Faktor-VII-Polypeptidvarianten durchgeführt werden, wobei solche Modifikationen das Vermögen des Proteins, als gerinnungsförderndes Mittel zu wirken, nicht merklich beeinträchtigen. Zum Beispiel können die Faktor VII-Polypeptidvarianten auch bei der Aktivierung der Spaltungsstelle modifiziert werden, um die Umwandlung von Zymogen-Faktor-VII zu seiner aktivierten zweikettigen Form zu Hemmen, wie allgemein beschrieben in U.S. 5,288,629 , hier unter Bezugnahme eingebracht.
Die die Humanfaktor-VII-Polypeptidvarianten kodierenden DNA-Sequenzen werden gewöhnlich in einen rekombinanten Vektor eingefügt, bei welchem es sich um einen beliebigen Vektor handeln kann, der bequem rekombinanten DNA-Prozeduren unterzogen werden kann, und die Wahl des Vektors hängt häufig von der Wirtszelle ab, in welche er einzubringen ist. So kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor, d.H. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit vorliegt, deren Replikation, von der Chromosomenreplikation unabhängig ist, z.B. ein Plasmid, sein. Alternativ dazu kann der Vektor einer sein, der nach dem Einbringen in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in welche er integriert wurde, repliziert.
Der Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor, in welchem die die Humanfaktor-VII-Polypeptidvarianten kodierende DNA-Sequenz funktionsfähig mit zusätzlichen zur Transkription der DNA erforderlichen Sequenzen verknüpft ist. Im Allgemeinen ist der Expressionsvektor von einem Plasmid oder viraler DNA abgeleitet oder kann Elemente von beidem enthalten. Der Begriff „funktionsfähig verknüpft" weist darauf hin, dass die Segmente derart angeordnet sind, dass sie zu ihren beabsichtigten Zwecken zusammenarbeiten, d.h. die Transkription initiiert einen Promotor und verläuft durch die für das Polypeptid kodierende DNA-Sequenz.
Expressionsvektoren zur Verwendung beim Exprimieren von Faktor-VIIa-Polypeptidvarianten umfassen einen Promotor, der in der Lage ist, die Transkription eines klonierten Gens oder einer klonierten cDNA zu lenken. Der Promotor kann eine beliebigen DNA-Sequenz sein, die in der Wirtszelle der Wahl transkriptionelle Aktivität zeigt und kann von Genen abgeleitet werden, die Proteine entweder homolog oder heterolog zur Wirtszelle kodieren.
Bei Beispielen für geeignete Promotoren zum Lenken der Transkription der die Humanfaktor-VII-Polypeptidvariante kodierenden DNA-Sequenz in Säugerzellen handelt es sich um den SV40-Promotor (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864), den Promotor MT-1 (Metallothioneingen) (Palmiter et al., Science 222 (1983), 809-814), den CMV-Promotor (Boshart et al., Cell 41: 521-530, 1985) oder den Adenvirus-2-majorspätpromotor (Kaufman und Sharp, Mol. Cell. Biol, 2: 1304-1319, 1982).
Bei einem Beispiel für einen geeigneten Promotor zur Verwendung in Insektenzellen handelt es sich um den Polyhedrinpromotor ( US 4,745,051 ; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7-11), den P10-Promotor (J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, S. 765-776), den Polyhedrosevirusbasisproteinpromotor von Autographa californica ( EP 397 485 ), den Sofortfrühgen-1-Promotor von Baculovirus ( US 5,155,037 ; US 5,162,222 ) oder den 39K-Verzögerungsfrühgenpromotor von Baculovirus ( US 5,155,037 ; US 5,162,222 ).
Beispiele für geeignete Promotoren zur Verwendung in Hefewirtszellen schließen Promotoren von Hefe-glycolytischen Genen (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434) oder Alkoholdehydrogenasegenen (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al, eds.), Plenum Press, New York, 1982), oder die Promotoren TPI1 ( US 4,599,311 ) oder ADH2-4c (Russell et al., Nature 304 (1983), 652-654) ein.
Bei Beispielen für geeignete Promotoren zur Verwendung in Fadenpilzwirtszellen handelt es ich z.B. um den ADH3-Promotor (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) oder den tpiA-Promotor. Bei Beispielen für andere nützliche Promotoren handelt es sich um diejenigen, die von dem Gen abgeleitet sind, das TAKA-Amylase von A. oryzae, Aspartamproteinase von Rhizomucor miehei, neutrale α-Amylase von A. niger, säurestabile α-Amylase von A. niger, Glucoamylase (gluA) von A. niger oder A. awamori, Lipase von Rhizomucor miehei, alkalische Protease von A. oryzae, Triosephosphatisomerase von A. oryzae oder Acetamidase von A. nidulans kodiert. Bevorzugt sind die TAKA-Amylase- und gluA-Promotoren. Geeignete Promotoren sind z.B. in EP 238 023 und EP 383 779 erwähnt.
Die die Humanfaktor-VII-Polypeptidvarianten kodierenden DNA-Sequenzen können gegebenenfalls auch an einen geeigneten Terminator wie den Humanwachstumshormonterminator (Palmiter et al., Science 222, 1983, S. 809-814) oder die Terminatoren von TPI1 (Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, S. 419-434) oder ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, S. 2093-2099) funktionsfähig gebunden sein. Expressionsvektoren können auch einen Satz von RNA-Spleißsstellen enthalten, die sich stromabwärts des Promotors und stromaufwärts der Einfügungsstelle für die Faktor-VII-Sequenz selbst befinden. Bevorzugte RNA-Spleißstellen können von Adenovirus- und/oder Immunglobulingenen erhalten werden. Auch im Expressionsvektor enthalten ist ein Polyadenylierungssignal, das sich stromabwärts der Einfügungsstelle befindet. Besonders bevorzugte Polyadenylierungssignale schließen das Früh- oder Spätadenylierungssignal von SV40 (Kaufman und Sharp, ebd.), das Polyadenylierungssignal von der Adenvirus-5-Elb-Region, den Humanwachstumshormongenterminator (DeNoto et al. Nucl. Acids Res. 9: 3719-3730, 1981) oder das Polyadenylierungssignal vom Humanfaktor-VII-Gen oder Rinderfaktor-VII-Gen ein. Die Expressionsvektoren können auch eine nicht-kodierende virale Leadersequenz wie den Adenovirus-2-tripartitleader, der sich zwischen dem Promotor und den RNA-Spleißstellen befindet; und Verstärkersequenzen wie den SV40-Verstärker einschließen.
Zum Lenken der Humanfaktor-VII-Polypeptidvarianten der vorliegenden Erfindung in den sekretorischen Weg der Wirtszellen kann eine sekretorische Signalsequenz (auch bekannt als Leadersequenz, Präprosequenz oder Präsequenz) im rekombinanten Vektor bereitgestellt sein. Die sekretorische Signalsequenz ist im korrekten Leseraster an die die Humanfaktor-VII-Polypeptidvarianten kodierenden DNA-Sequenzen gebunden. Sekretorische Signalsequenzen sind im Allgemeinen an der 5'-Stelle der das Peptid kodierenden DNA-Sequenz positioniert. Die sekretorische Signalsequenz kann diejenige sein, die normalerweise mit dem Protein verbunden ist oder kann von einem Gen stammen, das ein anderes sekretiertes Protein kodiert.
Zur Sekretion von Hefezellen kann die sekretorische Signalsequenz jedes beliebige Signalpeptid kodieren, das ein effizientes Lenken der exprimierten Humanfaktor-VII-Polypeptidvarianten in den sekretorischen Weg der Zelle sicherstellt. Das Signalpeptid kann ein natürlich vorkommendes Signalpeptid oder ein funktioneller Teil davon oder ein synthetisches Peptid sein. Es stellte sich heraus, dass es sich bei geeigneten Signalpeptiden um das α-Faktorsignalpeptid (vgl. US 4,870,008 ), das Signalpeptid des Mäuseptyalins (mouse salivary amylase, Mäusespeichelamylase) (vgl. O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, S. 643-646), ein modifiziertes Carboxypeptidasesignalpeptid (vgl. L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, S. 887-897), das Hefe-BAR1-Signalpeptid (vgl. WO 87/02670 ) oder das Signalpeptid von Hefeaspartamprotease 3 (YAP3) (vgl. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, S. 127-137) handelt.
Für eine effiziente Sekretion in Hefe kann auch eine ein Leaderpeptid kodierende Sequenz stromabwärts der Signalsequenz und stromaufwärts der die Humanfaktor-VII-Polypeptidvarianten kodierenden DNA-Sequenz eingefügt werden. Bei der Funktion des Leaderpeptids handelt es sich darum, es dem exprimierten Peptid zu ermöglichen, von dem endoplasmatischen Retikulum zur Golgi-Apparatur und weiter zu einem sekretorischen Vesikulum zur Sekretion in das Kulturmedium (d.h. Export der Humanfaktor-VII-Polypeptidvarianten über die Zellwand oder zumindest durch die Zellmembran in den periplasmatischen Raum der Hefezelle) gelenkt zu werden. Das Leaderpeptid kann der Hefe-alpha-Faktor-Leader sein (dessen Verwendung z.B. in US 4,546,082 , US 4,870,008 , EP 16 201 , EP 123 294 , EP 123 544 und EP 163 529 ) beschrieben ist. Alternativ dazu kann das Leaderpeptid ein synthetisches Leaderpeptid sein, das als in der Natur nicht zu findendes Leaderpeptid gilt. Synthetische Leaderpeptide können z.B. wie in WO 89/02463 oder WO 92/11378 beschrieben konstruiert werden.
Zur Verwendung in Fadenpilzen kann das Signalpeptid günstigerweise von einem Gen, das eine Amylase oder Glucoamylase von Aspergillus sp. kodiert, einem Gen, das eine Lipse oder Protease von Rhizomucor miehei oder eine Lipase von Humicola lanuginosa kodiert, abgeleitet sein. Das Signalpeptid ist vorzugsweise von einem Gen abgeleitet, das TAKA-Amylase von A. oryzae, neutrale α-Amylase von A. niger, säurestabile Amylase von A. niger oder Glucoamylase von A. niger kodiert. Geeignete Signalpeptide sind z.B. in EP 238 023 und EP 215 594 offenbart.
Zur Verwendung in Insektenzellen kann das Signalpeptid günstigerweise von einem Insektengen (vgl. WO 90/05783 ) abgeleitet sein, wie das Vorläufersignalpeptid des adipokinetischen Hormons der lepidopteranen Manduca sexta (vgl. US 5,023,328 ).
Die Vorgehensweisen, die zum Ligieren der für jeweils die Humanfaktor-VII-Polypeptidvarianten, den Promotor und wahlweise den Terminator und/oder die sekretorische Signalsequenz kodierenden DNA-Sequenzen und zu deren Einfügen in geeignete die die zur Replikation nötigen Informationen enthaltende Vektoren verwendet werden, sind dem Fachmann bekannt (vgl. z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Verfahren zum Transfizieren von Säugerzellen und Exprimieren von in die Zellen eingebrachten DNA-Sequenzen sind z.B. beschrieben in Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham und van der Eb, Virology 52 (1973), 456; und Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841-845.
Klonierte DNA-Sequenzen werden z.B. durch Calciumphosphat-vermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 14: 725-732, 1978; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603-616, 1981; Graham und Van der Eb, Virology 52d: 456-467, 1973) oder Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982) in gezüchtete Zellen eingebracht. Zum Identifizieren und Selektieren von exogene DNA exprimierenden Zellen wird im Allgemeinen ein Gen, das einen selektierbaren Phenotyp (einen selektierbare Marker) verleiht, zusammen mit dem Gen oder der cDNA von Interesse in Zellen eingebracht. Bevorzugte selektierbare Markierungen schließen Gene ein, die Resistenz gegen Arzneistoffe wie Neomycin, Hygromycin und Methotrexat verleihen. Der selektierbare Marker kann ein amplifizierbarer selektierbarer Marker sein. Ein bevorzugter amplifizierbarer selektierbarer Marker ist eine Dihydrofolatreduktase(DHFR)-Sequenz. Selektierbare Marker sind von Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, hier unter Bezugnahme eingebracht) besprochen. der Fachmann ist leicht in der Lage, geeignete selektierbare Marker auszuwählen.
Selektierbare Marker können in die Zelle an einem separaten Plasmid gleichzeitig mit dem Gen eingebracht werden, oder sie können am selben Plasmid eingebracht werden. Am selben Plasmid können sich der selektierbare Marker und das Gen von Interesse unter der Steuerung von verschiedenen Promotoren oder desselben Promotors befinden, wobei letztere Anordnung eine dicistronische Botschaft erzeugt. Konstrukte dieses Typs sind auf dem Fachgebiet bekannt (zum Beispiel Levinson und Simonsen, U.S. 4,713,339 ). Es kann auch vorteilhaft sein, zusätzliche DNA, bekannt als „Träger-DNA", dem Gemisch, das in die Zellen eingebracht wird, hinzuzufügen.
Nach der Aufnahme der Zellen in der DNA lässt man sie in einem geeigneten Wachstumsmedium typischerweise für eine Dauer von 1-2 Tagen wachsen, um mit dem Exprimieren des Gens von Interesse zu beginnen. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „geeignetes Wachstumsmedium" ein Medium, das Nährstoffe und andere für das Wachstum von Zellen und die Expression der Humanfaktor-VII-Polypeptidvarianten von Interesse erforderliche Bestandteile enthält. Medien schließen im Allgemeinen eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, essentielle Aminosäuren, essentielle Zucker, Vitamine, Salze, Phospholipide, Protein und Wachstumsfaktoren ein. Zur Herstellung von gamma-carboxylierten Proteinen enthält das Medium Vitamin K, vorzugsweise mit einer Konzentration von etwa 0,1 μg/ml bis etwa 5 μg/ml. Eine Arzneistoffselektion wird angewandt, um auf das Wachstum von den selektierbaren Marker in stabiler Weise exprimierenden Zellen zu selektieren. Für mit einem amplifizierbaren Marker transfizierte Zellen kann die Arzneistoffkonzentration erhöht werden, um für eine erhöhte Kopieanzahl von klonierten Sequenzen zu selektieren und dadurch den Expressionsgrad zu erhöhen. Klone von stabil transfizierten Zellen werden dann zur Expression der Humanfaktor-VII-Polypeptidvariante von Interesse durchgemustert.
Bei der Wirtszelle, in welche die die Humanfaktor-VII-Polypeptidvarianten kodierenden DNA-Sequenzen einzubringen sind, kann es sich um jede beliebige Zelle handeln, die in der Lage ist, die posttranslationalen modifizierten Humanfaktor-VII-Polypeptidvarianten herzustellen, und sie schließt Hefe, Pilze und höhere eukaryontische Zellen ein.
Bei Beispielen für Säugerzelllinien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung handelt es sich um die Zelllinien des Typs COS-1 (ATCC CRL 1650), von Babyhamsternieren (BHK) und des Typs 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977). Eine bevorzugte BHK-Zelllinie ist die tk-ts13-BHK-Zelllinie (Waechter und Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1106-1110, 1982, hier unter Bezugnahme eingebracht), hier nachstehend als BHK-570-Zellen bezeichnet. Die BHK-570-Zelllinie wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklaven Dr., Rockville, Md. 20852, unter der ATCC-Zugangsnummer CRL 10314 hinterlegt. Eine tk-ts13-BHK-Zelllinie ist ebenfalls von ATCC unter der Zugangsnummer CRL 1632 erhältlich. Zusätzlich kann eine Anzahl von anderen Zelllinien in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich Zellen des Typs Rat Hep I (Rattenhepatom; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (Rattenhepatom; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), der menschlichen Lunge (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), des Typs CHO (ATCC CCL 61) und DUKX (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, 1980).
Beispiele für geeignete Hefezellen schließen Zellen von Saccharomyces spp. oder Schizosaccharomyces spp., insbesondere der Stämme Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces kluyveri ein. Verfahren zum Transformieren von Hefezellen mit heterologer DNA und Herstellen von Polypeptiden darausd sind z.B. in US 4,599,311 , US 4,931,373 , US 4,870,008 , 5,037,743 und US 4,845,075 beschrieben, wobei alle hiervon hier unter Bezugnahme eingebracht sind. Transformierte Zellen werden durch einen Phenotyp selektiert, der durch einen selektierbaren Marker, üblicherweise Arzneistoffresistenz oder das Vermögen, in Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffs, z.B. von Leucin, zu wachsen, bestimmt wird. Ein bevorzugter Vektor zur Verwendung in Hefe ist der in US 4,931,373 offenbarte POT1-Vektor. Den die Humanfaktor-VII-Polypeptidvarianten kodierenden DNA-Sequenzen kann eine Signalsequenz und wahlweise eine Leadersequenz, z.B. wie vorstehend beschrieben, vorangehen. Weitere Beispiele für geeignete Hefezellen sind Stämme von Kluyveromyces, wie K lactis, Hansenula, z.B. H. polymorpha, oder Pichia, z.B. P. pastoris (vgl. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, S. 3459-3465; US 4,882,279 ).
Bei Beispielen für andere Pilzzellen handelt es sich um Zellen von Fadenpilzen, z.B. Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. oder Trichoderma spp., insbesondere der Stämme A. oryzae, A. nidulans oder A. niger. Die Verwendung von Aspergillus spp. zur Expression von Proteinen ist z.B. in EP 272 277 , EP 238 023 , EP 184 438 beschrieben. Die Transformation von F. oxysporum kann z.B. wie beschrieben von Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 durchgeführt werden. Die Transformation von Trichoderma spp. kann z.B. wie beschrieben in EP 244 234 durchgeführt werden.
Wird ein Fadenpilz als Wirtszelle verwendet kann er mit dem DNA-Konstrukt der Erfindung, günstigerweise durch Integrieren des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom zum Erhalt einer rekombinanten Zelle transformiert werden. Diese Integration wird im Allgemeinen als vorteilhaft betrachtet, da die DNA-Sequenz mit größerer Wahrscheinlichkeit in der Zelle stabil gehalten wird. Die Integration der DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom kann gemäß herkömmlichen Verfahren, z.B. durch homologe oder heterologe Rekombination durchgeführt werden.
Die Transformation von Insektenzellen und die Herstellung von heterologen Polypeptiden darin kann wie in US 4,745,051 ; US 4,879,236 ; US 5,155,037 ; 5,162,222 ; EP 397,485 ), wobei alle hiervon hier unter Bezugnahme eingebracht sind, durchgeführt werden. Bei der als die Wirtszelle verwendete Insektenzelllinie kann es sich geeigneterweise um eine Lepidoptera-Zelllinie wie Zellen von Spodoptera frugiperda oder Zellen von Trichoplusia ni (vgl. US 5,077,214 ) handeln. Bei den Züchtungsbedingungen kann es sich geeigneterweise um solche, wie z.B. beschrieben in WO 89/01029 oder WO 89/01028 oder beliebigen der vorstehend erwähnten Quelltexte, handeln.
Die vorstehend beschriebene transformierte oder transfizierte Zelle wird dann in einem geeigneten Nährmedium unter die Expression der Humanfaktor-VII-Polypeptidvariante gewährenden Bedingungen gezüchtet, wonach das gesamte Peptid oder ein Teil des erhaltenen Peptids aus der Kultur gewonnen wird. Bei dem zum Züchten der Zellen verwendeten Medium kann es sich um jedes beliebige zum Wachsen der Wirtszellen geeignete Medium wie geeignete Ergänzungsstoffe enthaltendes Minimal- oder Komplexmedium handeln. Geeignete Medien sind von Händlern erhältlich oder können gemäß veröffentlichten (z.B. in Katalogen der American Type Culture Collection) Rezepturen hergestellt werden. Die durch die Zellen hergestellteHumanfaktor-VII-Polypeptidvariante kann dann durch herkömmliche Vorgehensweisen, einschließlich Abtrennen der Wirtszellen vom Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Ausfällen der proteinhaltigen Bestandteile des Überstands oder Filtrats mithilfe eines Salzes, z.B. von Ammoniumsulfat, Reinigung durch eine Vielfalt von chromatografischen Vorgehensweisen, z.B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatografie, Affinitätschromatographie oder dergleichen, je nach dem fraglichen Polypeptidtyp aus dem Kulturmedium gewonnen werden.
Eine Technologie mit transgenen Tieren kann eingesetzt werden, um die Faktor-VII-Polypeptidvarianten der Erfindung herzustellen. Es ist bevorzugt, die Proteine in den Milchdrüsen eines weiblichen Säugerwirts herzustellen. Durch die Expression in der Milchdrüse und die anschließende Sekretion des Proteins von Interesse in die Milch werden viele Schwierigkeiten überwunden, die beim Isolieren von Proteinen aus anderen Quellen angetroffen werden. Milch ist leicht zu entnehmen, in großen Mengen erhältlich und biochemisch gut charakterisiert. Weiterhin liegt der Hauptteil der Milchproteine mit hohen Konzentrationen (typischerweise von etwa 1 bis 15 g/l) in der Milch vor.
Von wirtschaftlichem Gesichtspunkt her ist es deutlich bevorzugt, als Wirt eine Spezies zu verwenden, die einen großen Milchertrag liefert. Wenngleich kleinere Tiere wie Mäuse und Ratten verwendet werden können und zum Nachweis der Hauptstufe bevorzugt sind, ist es bevorzugt, Viehsäuger, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Schweine, Ziegen, Schafe und Rinder, zu verwenden. Schafe sind aufgrund derartiger Faktoren wie der Vorgeschichte der Transgenese in dieser Spezies, Milchertrag, Kosten und der leichten Verfügbarkeit der Ausrüstung zum Auffangen von Schafsmilch, besonders bevorzugt (siehe z.B. WO 88/00239 für einen Vergleich von Faktoren, die die Auswahl der Spezies beeinflussen. Es ist im Allgemeinen erwünscht, eine Rasse eines Wirtstiers, das zur Verwendung in der Milchindustrie gezüchtet wurde, wie Ostfrieslandschafe, auszuwählen oder Milchbestand durch Züchten der transgenen Linie zu einem späteren Zeitpunkt einzubringen. In jedem Fall sollten Tiere mit bekanntem gutem Gesundheitszustand verwendet werden.
Zum Erhalt einer Expression in der Milchdrüse wird ein Transkriptionspromotor von einem Milchproteingen verwendet. Milchproteingene schließen diejenigen Gene ein, die Kaseine (siehe U.S. 5,304,489 ), beta-Lactoglobulin, a-Lactalbumin und Molkesäureprotein kodieren. Der Promotor von beta-Lactoglobulin (BLG) ist bevorzugt. Im Falle des Schafs-beta-Lactoglobulingens wird im Allgemeinen ein Bereich zumindest der nahen 406 Bp der 5'-Seitensequenz des Gens verwendet, wenngleich größere Abschnitte der 5'-Seitensequenz bis zu etwa 5 kBp bevorzugt sind, wie ein DNA-Segment mit ~4.25 kbp, das die 5'-Seitensequenz und den nicht-kodierenden Abschnitt des beta-Lactoglobulingens umfasst (siehe Whitelaw et al., Biochem. J. 286: 31-39 (1992)). Ähnliche Fragmente der Promotor-DNA von anderen Spezies sind ebenfalls geeignet.
Andere bereiche des beta-Lactoglobulingens wie genomische Bereiche des zu exprimierenden Gens können ebenfalls in Konstrukte eingebracht werden. Es ist auf dem Fachgebiet allgemein anerkannt, dass Konstrukte, welchen es z.B. an Intronen mangelt, im Vergleich mit denjenigen, die DNA-Sequenzen enthalten, schlecht exprimieren (siehe Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836-840 (1988); Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478-482 (1991); Whitelaw et al., Transgenic Res. 1: 3-13 (1991); WO 89/01343 ; und WO 91/02318 , jedes hiervon ist hier unter Bezugnahme eingebracht). In dieser Hinsicht ist es im Allgemeinen bevorzugt, wo möglich, genomische Sequenzen zu Verwenden, die sämtliche oder einige der nativen Intronen eines das Protein oder Polypeptid von Interesse kodierenden Gens zu verwenden, wodurch der weitere Einschluss zumindest einiger Intronen z.B. vom beta-Lactoglobulingen bevorzugt ist. Ein derartiger Bereich ist ein DNA-Segment, das ein Spleißen von Intronen und eine RNA-Polyadenylierung vom 3'-nicht-kodierenden Bereich des Schafs-beta-Lactoglobulingens bereitstellt. Wird es für die natürlichen 3'-nicht-kodierenden Sequenzen eines Gens substituiert, kann dieses Schafs-beta-Lactoglobulinsegment Expressionsgrade des Proteins oder Polypeptids von Interesse sowohl verbessern als auch stabilisieren. In anderen Ausführungsformen wird der Bereich, der die Inittierungs-ATG der Faktor-VII-Variantensequenz umgibt, mit entsprechenden Sequenzen eines milchspezifischen Proteingens ersetzt. Ein derartiger Ersatz stellt eine vermeintlich gewebespezifische Initiierungsumgebung zum Verbessern der Expression bereit. Es ist günstig, die gesamten Faktor-VII-Präpro- und 5'-nicht-kodierenden Variantensequenzen mit denjenigen z.B. des BLG-Gens zu ersetzen, wenngleich kleinere Bereiche ersetzt werden können.
Zur Expression von Faktor-VII-Polypeptidvarianten in transgenen Tieren wird ein die Faktor-VII-Variante kodierendes DNA-Segment mit zusätzlichen DNA-Segmenten, die zu deren Expression erforderlich sind, funktionsfähig verknüpft, um Expressionseinheiten herzustellen. Derartige zusätzliche Segmente schließen den vorstehend erwähnten Promotor sowie Sequenzen, die eine Beendigung der Transkription und Polyadenylierung von mRNA bereitstellen, ein. Die Expressionseinheiten schließen ferner ein DNA-Segment ein, das eine sekretorische Signalsequenz kodiert, die mit dem den modifizierten Faktor VII kodierenden Segment funktionsfähig verknüpft ist. Die sekretorische Signalsequenz kann eine sekretorische Signalsequenz des nativen Faktors VII oder diejenige eines anderen Proteins, wie eines Milchproteins sein (siehe z.B. von Heijne, Nucl. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986); und Meade et al., U.S. 4,873,316 , die hier unter Bezugnahme eingebracht sind).
Die Konstruktion von Expressionseinheiten zur Verwendung in transgenen Tieren wird günstigerweise durch Einfügen einer Faktor-VII-Variantensequenz in einen Plasmid- oder Phagenvektor, der zusätzliche DNA-Segmente enthält, durchgeführt, wenngleich die Expressionseinheit durch im Wesentlichen jede beliebige Sequenz von Ligationen konstruiert werden kann. Es ist besonders günstig, einen Vektor bereitzustellen, der ein ein Milchprotein kodierendes DNA-Segment enthält, um die kodierende Sequenz für das Milchprotein mit derjenigen einer Faktor-VII-Variante zu ersetzen; wodurch eine Genfusion erzeugt wird, die die Expressionssteuerungssequenzen des Milchproteingens einschließt. In jedem Fall erleichtert das Klonieren der Expressionseinheiten in Plasmiden oder anderen Vektoren die Amplifikation der Faktor-VII-Variantensequenz. Die Amplifikation wird günstigerweise in Bakterien-(z.B. E. coli) Wirtszellen durchgeführt, wodurch die Vektoren typischerweise einen Replikationsursprung und einen selektierbaren Marker, der in Bakterienwirtszellen funktionell ist, einschließen. Die Expressionseinheit wird dann in befruchtete Eier (die Embryos im Frühstadium einschließen) der ausgewählten Wirtsspezies eingebracht. Das Einbringen von heterologer DNA kann durch einen von etlichen Wegen, einschließlich Mikroinjektion (z.B. ( U.S. Patent Nr. 4,873,191 ), retrovirale Infektion (Jaenisch, Science 240: 1468-1474 (1988)) oder stellengerichtete Integration unter Verwendung von Embryonenstamm(ES)-Zellen (besprochen von Bradley et al., Bio/Technology 10: 534-539 (1992)) erzielt werden. Die Eier werden dann in die Eileiter oder Gebärmütter von scheinschwangeren Weibchen eingepflanzt, und man lässt sie weiter entwickeln. Nachkommen, die die eingebrachte DNA in ihrer Keimbahn tragen, können die DNA an ihre Nachkommenschaft in normaler Mendel-Weise weitergeben, wodurch die Entwicklung von transgenen Herden ermöglicht wird. Allgemeine Vorgehensweisen zur Herstellung von transgenen Tieren sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6: 179-183 (1988); Wall et al., Biol. Reprod. 32: 645-651 (1985); Buhler et al., Bio/Technology 8: 140-143 (1990); Ebert et al., Bio/Technology 9: 835-838 (1991); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9: 844-847 (1991); Wall et al., J. Cell. Biochem. 49: 113-120 (1992); U.S. 4,873,191 ; U.S. 4,873,316 ; WO 88/00239 , WO 90/05188 , WO 92/11757 ; und GB 87/00458 ). Techniken zum Einbringen von fremden DNA-Sequenzen in Säuger und deren Keimzellen wurden ursprünglich in der Maus entwickelt (siehe z.B. Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384 (1980); Gordon und Ruddle, Science 214: 1244-1246 (1981); Palmiter und Brinster, Cell 41: 343-345 (1985); Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442 (1985); und Hogan et al. (ebd.)). Diese Techniken wurden im Wesentlichen auf die Verwendung mit größeren Tieren, einschließlich Viehspezies angepasst (siehe z.B. WO 88/00239 , WO 90/05188 und WO 92/11757 und Simons et al., Bio/Technology 6: 179-183 (1988)). Zusammengefasst werden auf dem effizientesten Weg, der bis heute bei der Bgildung von transgenen Mäusen oder Vieh verwendet wird, etliche hundert Moleküle der DNA von Interesse in einen der Vorkerne eines befruchteten Eis gemäß etablierten Techniken injiziert. Die Injektion von DNA in das Zytoplasma einer Zygote kann ebenfalls eingesetzt werden.
Die Herstellung in transgenen Pflanzen kann ebenfalls eingesetzt werden. Die Expression kann allgemein erfolgen oder auf ein bestimmtes Organ, wie die Knolle gelenkt werden (siehe Hiatt, Nature 344: 469-479 (1990); Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12: 449-453 (1992); Sijmons et al., Bio/Technology 8: 217-221 (1990); und EP 0 255 378 ).
Die Faktor-VII-Polypeptidvarianten der Erfindung werden aus dem Zellkulturmedium oder der Milch gewonnen. Die Faktor-VII-Polypeptidvarianten der vorliegenden Erfindung können durch eine Vielfalt an auf dem Fachgebiet bekannten Vorgehensweisen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Chromatografie (z.B. Ionenaustausch, Affinität, hydrophob, chromatofokussierend und Größenausschluss), elektrophoretischer Vorgehensweisen (z.B. präparatives isoelektrisches Fokussieren (IEF), Löslichkeitsunterschied (z.B. Ammoniumsulfatfällung) oder Extraktion, gereinigt werden (siehe z.B. Protein Purification, J.-C. Janson und Lars Ryden, Hrsg., VCH Publishers, New York, 1989). Vorzugsweise können sie durch Affinitätschromatografie auf einer Anti-Faktor-VII-Antikörpersäule gereinigt werden. Die verwendung von calciumabhängigen monoklonalen Antikörpern, wie beschrieben von Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261: 11097-11108, (1986) und Thim et al., Biochemistry 27: 7785-7793, (1988), ist besonders bevorzugt. Eine zusätzliche Reinigung kann durch herkömmliche chemische Reinigungsmittel, wie Hochleistungsflüssigchromatographie erzielt werden. Andere Reinigungsverfahren, einschließlich Bariumcitratfällung, sind auf dem Fachgebiet bekannt und können bei der Reinigung der neuen hier beschriebenen Faktor-VII-Polypeptidvarianten angewandt werden (siehe z.B. Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982).
Für therapeutische Zwecke ist es bevorzugt, dass die Faktor-VII-Polypeptidvarianten der Erfindung im Wesentlichen rein sind. So werden in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Faktor-VII-Polypeptidvarianten der Erfindung auf eine Homogenität von mindestens etwa 90 bis 95%, vorzugsweise eine Homogenität von mindestens 98% gereinigt. Die Reinheit kann z.B. durch Gelelektrophorese und aminoterminales Aminosäuresequenzieren überprüft werden.
Die Faktor-VII-Variante wird an ihrer Aktivierungsstelle gespalten, um sie zu ihrer zweikettigen Form umzuwandeln. Die Aktivierung kann gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Vorgehensweisen, wie denjenigen, offenbart von Osterud, et al., Biochemistry 11: 2853-2857 (1972); Thomas, U.S. Patent Nr. 4,456,591 ; Redner und Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841 (1983); oder Kisiel und Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73: 29-42 (1983) durchgeführt werden. Alternativ dazu, wie beschrieben von Bjoern et al. (Research Disclosure, 269 September 1986, S. 564-565), kann Faktor VII aktiviert werden, indem er durch eine Ionenaustauschchromatografie säule, wie Mono Q^® (Pharmacia fine Chemicals) oder dergleichen geleitet wird. Die erhaltene aktivierte Faktor-VII-Variante kann dann wie nachstehend beschrieben formuliert und verabreicht werden.
Assays
Die Erfindung stellt auch geeignete Assays zum Selektieren von bevorzugten erfindungsgemäßen Faktor-VIIa-Varianten bereit. Diese Assays können als einfacher vorausgehender in-vitro-Test durchgeführt werden.
So offenbart hier Beispiel 3 einen einfachen Test (mit dem Titel "In-Vitro-Hydrolysassay") für die Aktivität von Faktor-VIIa-Varianten der Erfindung. Auf dessen Basis sind Faktor-VII-Varianten, die von besonderem Interesse sind, derartige Varianten, in welchen das Verhältnis zwischen der Aktivität der Variante und der Aktivität von nativem Faktor VII, dargestellt in 1, beim Testen im „In-Vitro-Hydrolyseassay" über 1,0, z.B. mindestens etwa 1,25, vorzugsweise mindestens etwa 2,0, wie mindestens etwa 3,0 oder noch stärker bevorzugt mindestens etwa 4,0 beträgt.
Die Aktivität der Varianten kann auch unter Verwendung eines physiologischen Substrats wie Faktor X („In-Vitro-Proteolyseassay") (siehe Beispiel 4) geeigneterweise mit einer Konzentration von 100-1000 nM gemessen werden, wobei der gebildete Faktor Xa nach der Zugabe eines geeigneten chromogenen Substrats (z.B. S-2765) gemessen wird. Zudem kann der Aktivitätstest bei physiologischer Temperatur ablaufen.
Das Vermögen der Faktor-VIIa-Varianten, Thrombin zu bilden, kann auch in einem Assay, umfassend alle relevanten Gerinnungsfaktoren und Hemmer mit physiologischen Konzentrationen (minus Faktor VIII, wenn Hämophilie-A-Bedingungen nachgeahmt werden) und aktivierte Plättchen (wie beschrieben auf S. 543 in Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547, hier unter Bezugnahme eingebracht), gemessen werden.
Verabreichung und Arzneimittel
Die erfindungsgemäßen Faktor-VII-Polypeptidvarianten können zum Regulieren von Blutungsstörungen verwendet werden, die verschiedene Ursachen wie Blutgerinnungsfaktormangel (z.B. Hämophilie A und B oder Mangel an Gerinnungsfaktoren XI oder VII) oder Blutgerinnungsfaktorhemmer, haben, oder sie können zum Regulieren von übermäßiger Blutung, die in Probanden mit einer normal funktionierenden Blutgerinnungskaskade (kein Blutgerinnungsfaktormangel oder keine ebensolche Hemmer gegen irgendwelche Gerinnungsfaktoren) auftritt. Die Blutungen können durch eine mangelhafte Plättchenfunktion, Thrombozytopänie oder von-Wellebrand-Krankheit verursacht werden. Sie sind auch in Probanden zu sehen, in welchen eine erhöhte fibrinolytische Aktivität durch verschiedene Stimuli herbeigeführt wurde.
In Probanden, die eine übermäßige Gewebeschädigung in Zusammenhang mit einem chirurgischen Eingriff oder einem enormen Trauma durchmachen kann der hämostatische Mechanismus durch den Bedarf an sofortiger Hämostase überschwemmt werden, und sie können trotz eines normalen hämostatischen Mechanismus Blutungen entwickeln. Das Erzielen von zufrieden stellender Hämostase ist ebenfalls problematisch, wenn Blutungen in Organen wie dem Gehirn, dem Innenohrbereich und den Augen auftreten, und kann auch in Fällen von gestreuten Blutungen (hämorrhager Gastritis und übermäßiger Gebärmutterblutung) problematisch sein, wenn es schwierig ist, die Quelle zu identifizieren. Selbiges Problem kann im Verfahren der Biopsientahme von verschiedenen Organen (Leber, Lunge, Tumorgewebe, Magendarmtrakt), sowie bei einem chirurgischen laparoskopischen Eingriff auftreten. Diesen Situationen ist die Schwierigkeit des Bereitstellens einer Hämostase durch chirurgische Techniken (Wundnähte, Klips usw.) gemein. Akute und übermäßige Blutungen können auch in Probanden mit einer Antigerinnungstherapie auftreten, bei welchen eine mangelhafte Hämostase durch die erhaltene Therapie herbeigeführt wurde. Derartige Probanden können in dem Falle chirurgische Eingriffe benötigen, in welchem der Antigerinnungswirkung schnell entgegengewirkt werden muss. Eine andere Situation, die im Falle einer nicht zufrieden stellenden Hämostase Probleme verursachen kann, liegt dann vor, wenn Probanden mit einem normalen Hämostasemechanismus eine Antigerinnungstherapie erhalten, um eine thromboembolische Erkrankung zu verhindern. Eine derartige Therapie kann Heparin, andere Formen von Proteoglycanen, Warfarin oder andere Formen von Vitamin-K-Antagonisten, sowie Aspirin und andere Plättchenaggregationshemmer einschließen.
Eine systemische Aktivierung der Gerinnungskaskade kann zu einer disseminierten intravaskulären Gerinnung (DIC) führen. Allerdings waren derartige Komplikationen in Probanden, die mit hohen Dosen an rekombinantem Faktor-VIIa behandelt wurden, aufgrund eines lokalen hämostatischen Prozesses der Art, die durch die Komplexbildung zwischen Faktor VIIa und TF, freigelegt an der Stelle der Gefäßwandverletzung, herbeigeführt wird, bisher nicht zu sehen. Die erfindungsgemäßen Faktor-VII-Polypeptidvarianten können folglich in ihrer aktivierten Form zum regulieren derartiger übermäßiger Blutungen, die mit einem normalen Hämostasemechanismus in Zusammenhang stehen, verwendet werden.
Für eine Behandlung in Verbindung mit überlegten Eingriffen werden die Faktor-VII-Polypeptidvarianten der Erfindung typischerweise innerhalb etwa 24 Stunden vor dem Durchführen des Eingriffs und für eine Dauer von so viel wie 7 Tagen oder mehr danach verabreicht. Die Verabreichung als gerinnungsförderndes Mittel kann durch eine Vielfalt von wie hier beschriebenen Wegen erfolgen.
Die Dosis der Faktor-VII-Polypeptidvarianten liegt je nach dem Gewicht des Probanden und der Schwere des Zustands im Bereich von etwa 0,05 mg bis 500 mg/Tag, vorzugsweise etwa 1 mg bis 200 mg/Tag und stärker bevorzugt etwa 10 mg bis etwa 175 mg/Tag für einen Probanden mit 70 kg als Beladungs- und Versorgungsdosis.
Die Arzneimittel sind hauptsächlich zur parenteralen Verabreichung zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung vorgesehen. Vorzugsweise werden die Arzneimittel parenteral, d.h. intravenös, subkutan oder intramuskulär verabreicht oder können durch kontinuierliche oder rhythmische Infusion verabreicht werden. Die Arzneimittel zur parenteralen Verabreichung umfassen die Faktor-VII-Variante der Erfindung im Kombination mit, vorzugsweise gelöst in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger. Eine Vielfalt von wässrigen Trägern, wie Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4%ige Kochsalzlösung, 0,3%iges Glycin und dergleichen, kann verwendet werden. Die Faktor-VII-Polypeptidvarianten der Erfindung können auch zu Liposompräparaten zur Abgabe an oder zum Zielen auf die Verletzungsstellen formuliert werden. Liposompräparate sind allgemein z.B. in U.S. 4,837,028 , U.S. 4,501,728 und U.S. 4,975,282 beschrieben. Die Arzneimittel können durch herkömmliche, bekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Die erhaltenen wässrigen Lösungen können zur Verwendung verpackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen wässrigen Lösung kombiniert wird. Die Arzneimittel können nach Bedarf pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, um sich den physiologischen Bedingungen anzunähern, wie pH-einstellende Mittel und Puffermittel, Tonizität-einstellende Mittel und dergleichen, z.B. Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid usw. enthalten.
Die Konzentration der Faktor-VII-Variante in diesen Formulierungen kann breit, d.h. von weniger als etwa 0,5 Gew.-%, gewöhnlich weniger als oder mindestens etwa 1 Gew.-% bis so viel wie als 15 oder 20 Gew.-% variieren und wird hauptsächlich durch Fluidvolumina, Viskositäten usw. gemäß dem jeweiligen ausgewählten Verabreichungsmodus ausgewählt.
So kann ein typisches Arzneimittel zur intravenösen Verabreichung derart hergestellt werden, dass es 250 ml Ringer-Lösung und 10 mg der Faktor-VII-Variante enthält. Gegenwärtige Verfahren zur Herstellung von parenteral verabreichbaren Arzneimitteln sind dem Fachmann bekannt oder einleuchtend und detaillierter z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl., Mack Publishing Company, Esston, PA (1990) beschrieben.
Die die Faktor-VII-Polypeptidvarianten der vorliegenden Erfindung enthaltenden Arzneimittel können zu prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlungen verabreicht werden. Bei therapeutischen Anwendungen werden die Arzneimittel einem schon an einer wie vorstehend beschriebenen Erkrankung leidenden Probanden in einer Menge verabreicht, die zum Ausheilen, Lindern oder teilweisen Aufhalten der Erkrankung und ihrer Komplikationen ausreichend ist. Eine zum Erzielen dessen angemessene Menge ist als „therapeutisch wirksame Menge" definiert. Es ist dem Fachmann klar, dass für diesen Zweck wirksame Mengen von der Schwere der Erkrankung oder Verletzung, sowie von dem Gewicht und dem Allgemeinzustand des Probanden abhängen. Im Allgemeinen allerdings liegt die wirksame Menge im Bereich von etwa 0,05 bis zu 500 mg der Faktor-VII-Variante pro Tag für einen Probanden mit 70 kg, wobei Dosierungen von etwa 1,0 mg bis etwa 200 mg der Faktor-VII-Variante pro Tag üblicher verwendet werden.
Die FVIIa-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können im Allgemeinen bei ernsthaften Erkrankungen oder Verletzungszuständen, d.h. lebensbedrohlichen oder potentiell lebensbedrohlichen Situationen eingesetzt werden. In derartigen Fällen kann der behandelnde Arzt im Hinblick auf die Minimierung von Fremdsubstanzen und das allgemeine Fehlen von Immunogenität den Wunsch verspüren, einen beträchtlichen Überschuss dieser Faktor-VII-Variantenarzneimittel zu verabreichen.
Bei prophylaktischen Anwendungen werden die Faktor-VII-Variante der Erfindung enthaltende Arzneimittel einem Probanden verabreicht, der für einen Krankheitszustand oder eine Verletzung empfänglich ist oder ansonsten ein Risiko dafür darstellt, um die Eigengerinnungsfähigkeit des Probanden zu verbessern. Eine derartige Menge ist als „prophylaktisch wirksame Dosis" definiert. Bei prophylaktischen Anwendungen hängen die genauen Menge wiederum vom Gesundheitszustand und Gewicht des Probanden ab, allerdings liegt die Dosis im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,05 mg bis etwa 500 mg pro Tag für einen Probanden mit 70 kg, üblicher etwa 1,0 mg bis etwa 200 mg pro Tag für einen Probanden mit 70 kg.
Einzelne oder mehrfache Verabreichungen der Arzneimittel können durchgeführt werden, wobei Dosisgehalte und -muster durch den behandelnden Arzt ausgewählt werden. Für ambulante Probanden, die tägliche Versorgungsgehalte benötigen, können die Faktor-VII-Polypeptidvarianten durch kontinuierliche Infusion unter Verwendung z.B. eines tragbaren Pumpsystems verabreicht werden.
Die örtliche Abgabe der Faktor-VII-Variante der vorliegenden Erfindung, wie z.B. die topische Verabreichung kann z.B. mithilfe eines Sprays, einer Perfusion, von Doppelballonkathetern, eines Stents, eingebracht in Gefäßimplantate oder -stents, von Hydrogelen, die zum Beschichten von Ballonkathetern verwendet werden, oder von anderen weithin etablierten Verfahren durchgeführt werden. In jedem Falle sollte das Arzneimittel eine Menge an Faktor-VII-Variante bereitstellen, die zum wirksamen Behandeln des Probanden ausreichend ist.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die jedoch nicht als Beschränkung des Schutzumfangs betrachtet werden sollen. Die in der vorangehenden Beschreibung und in den folgenden Beispielen offenbarten Merkmale können sowohl getrennt als auch in beliebiger Kombination davon Stoff zum Verwirklichen der Erfindung in ihren diversen Formen sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz von nativem (Wildtyp) Humangerinnungsfaktor VII (SEQ ID Nr. 1).
BEISPIELE
Die in den folgenden Beispielen verwendete Terminologie für Aminosäuresubstitutionen lautet wie folgt. Der erste Buchstabe stellt die Aminosäure dar, die naturgemäß an einer Position von SEQ ID Nr. 1 vorkommt. Die folgende Zahl stellt die Position in SEQ ID Nr. 1 dar. Der zweite Buchstabe stellt die andere Aminosäure dar, die die natürliche Aminosäure ersetzt. Ein Beispiel ist L305V/F374Y-FVII, das Leucin an Position 305 von SEQ ID Nr. 1 ist durch ein Valin ersetzt, und das Phenylalanin an Position 374 von SEQ ID Nr. 1 ist durch ein Tyrosin ersetzt, beide Mutationen in derselben Faktor-VII-Variante.
Beispiel 1

DNA, kodierend L305V/S314E/F374Y-FVII, L305V/K337A/F374Y-FVII, L305V/S314E/K337A/F374Y-FVII und
V158D/E296V/M298Q/L305V/S314E/K337A/F374Y-FVII.

DNA-Konstrukte, kodierend L305V/S314E/F374Y-FVII, L305V/K337A/F374Y-FVII, L305V/S314E/K337A/F374Y-FVII und
V158D/E296V/M298Q/L305V/S3I4E/K337A/F374Y-FVII kodieren, wurden durch stellengerichtete Mutagenese unter Verwendung eines superspiralisierten Doppelstrang-DNA-Vektors mit einer Einfügung von Interesse und zwei synthetischen Primern, die dieselbe Mutation enthalten, hergestellt. Die folgenden Primer wurden verwendet (gegebenenfalls in anschließenden PCR-Reaktionen, um die gewünschte FVII-Variante zu erhalten):

Für L305V-FVII:

5'-CGT GCC CCG GGT GAT GAC CCA GGA C-3' (SEQ ID Nr. 2)
5'-GTC CTG GGT CAT CAC CCG GGG CAC G-3' (SEQ ID Nr. 3)

Für K337A-FVII:

5'-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3' (SEQ ID Nr. 4)
5'-CCC TTG CAG GAG TCC GCG CTG CCA TCC G-3' (SEQ ID Nr. 5)

Für V158D-FVII:

5'-GTG GGG GGC AAG GAC TGC CCC AAA GGG G-3' (SEQ ID Nr. 6)
5'-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3' (SEQ ID Nr. 7)

Für E296V/M298Q-FVII:

5'-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3' (SEQ ID Nr. 8)
5'-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3' (SEQ ID Nr. 9)

Für S314E-FVII:

5'-GCC TGC AGC AGG AAC GGA AGG TGG GAG ACT CC-3' (SEQ ID Nr. 10)
5'-GGA GTC TCC CAC CTT CCG TTC CTG CTG CAG GC-3' (SEQ ID Nr. 11)

Für F374Y-FVII:

5'-CGC AAC CGT GGG CCA CTA TGG GGT GTA CAC C-3' (SEQ ID Nr. 12)
5'-GGT GTA CAC CCC ATA GTG GCC CAC GGT TGC G-3' (SEQ ID Nr. 13)

Die Oligonukleotidprimer, jeweils komplementär zu entgegengesetzten Strängen des Vektors, wurden während des Temerpaturzyklisierens mithilfe von Pfu-DNAPolymerase verlängert. Durch Einbringen der Primer wurde ein mutiertes, versetzte Kerben enthaltendes Plasmid gebildet. nach dem temperaturzyklisieren wurde das Produkt mit DpnI, das für methylierte und hemimethylierte DNA spezifisch ist, behandelt, um das Ursprungs-DNA-Templat zu verdauen und auf mutationenhaltige synthetisierte DNA zu selektieren.
Vorgehensweisen zur Herstellung eines DNA-Konstrukts für sämtliche der erfindungsgemäßen FVII-Varianten unter Verwendung von Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von spezifischen Primern zum Erzielen der gewünschten FVII-Variante sind dem Fachmann bekannt (vgl. PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA).
Beispiel 2
Herstellung von L305V/S314E/F374Y-FVII, L305V/K337A/F374Y-FVII und L305V/S314E/K337A/F374Y-FVII.
BHK-Zellen wurden im Wesentlichen wie früher beschrieben (Thim et al. (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson und Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) transfiziert, um eine Expression der spezifischen FVII-Variante zu erhalten. Die Faktor-VII-Variante wurde wie folgt gereinigt:
Konditioniertes Medium wurde auf eine Säule mit 25 ml des Typs Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) nach Zugabe von 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 und 10 mM Tris, Einstellung des pH-Werts auf 8,0 und Einstellung der Leitfähigkeit auf 10-11 mS/cm durch Zugabe von Wasser, geladen.
Die Elution des Proteins wurde durch stufenweises Zugeben von 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,0 to 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl₂, 0,1% Triton X-100, pH 8,0, erzielt. Die die spezifische FVII-Variante enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und auf eine Säule mit 25 ml, enthaltend monoklonalen Antikörper F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dänemark), gekuppelt an CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia Biotech), aufgebracht.
Die Säule wurde mit 50 mM Hepes, pH 7,5, enthaltend 10 mM CaCl₂, 100 mM NaCl und 0,02% Triton X-100, äquilibriert. Nach Waschen mit Äquilibrie rungspuffer und Äquilibrierungspuffer, enthaltend 2 M NaCl, wurde gebundenes Material mit Äquilibrierungspuffer, enthaltend 10 mM EDTA statt CaCl₂, eluiert. Vor der Verwendung oder Lagerung wurde überschüssiges CaCl₂ über EDTA zugesetzt, oder die spezifische FVII-Variante wurde in einen Ca²⁺-haltigen Puffer überführt. Die Ausbeute von jedem Schritt wurde durch ELISA-Messungen des Faktor VII verfolgt, und das gereinigte Protein wurde durch SDS-PAGE analysiert. Andere FVII-Varianten gemäß Beispiel 1 und alle anderen erfindungsgemäßen Varianten können durch dasselbe Verfahren hergestellt werden.
Beispiel 3
In-Vitro-Hydrolysassay
Nativer (Wildtyp) Faktor-VIIa und Faktor-VIIa-Variante (beide hier nachstehend als „Faktor VIIa" bezeichnet) werden parallel einem Assay unterzogen, um deren spezifische Aktivitäten direkt zu vergleichen. Der Assay wird in einer Mikrotiterplatte (MaxiSorp, Nunc, Dänemark) durchgeführt. Das chromogene Substrat D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilid (S-2288, Chromogenix, Schweden), Endkonzentration 1 mM, wird zu Faktor VIIa (Endkonzentration 100 nM) in 50 mM Hepes, pH 7,4, enthaltend 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl₂ und 1 mg/ml Rinderserumalbumin, zugesetzt. Die Absorption bei 405 nm wird kontinuierlich in einem Plattenlesegerät des Typs SpectraMax^TM 340 (Molecular Devices, USA) gemessen. Die während einer 20-minütigen Inkubation entwickelte Absorption nach Subtraktion der Absorption in einer kein Enzym enthaltenden Blindmulde wird zum Berechnen des Verhältnisses zwischen den Aktivitäten von Faktor-VIIa-Variante und -Wildtyp verwendet: Verhältnis = (A405 nm Faktor-VIIa-Variante)/(A405 nm Faktor-VIIa-Wildtyp).
Beispiel 4
In-Vitro-Proteolyseassay
Nativer (Wildtyp) Faktor VIIa und Faktor-VIIaVariante beide hier nachstehend als „Faktor VIIa" bezeichnet) werden parallel einem Assay unterzogen, um deren spezifische Aktivitäten direkt zu vergleichen. Der Assay wird in einer Mikrotiterplatte (MaxiSorp, Nunc, Dänemark) durchgeführt. Faktor VIIa (10 nM) und Faktor X (0,8 μM) in 100 μl 50 mM Hepes, pH 7,4, enthaltend 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl₂ und 1 mg/ml Rinderserumalbumin, werden für eine Dauer von 15 Mm. inkubiert. Die Faktor-X-Spaltung wird dann durch die Zugabe von 50 μl Hepes, pH 7,4, enthaltend 0,1 M NaCl, 20 mM EDTA und 1 mg/ml Rinderserumalbumin, gestoppt. Die gebildete Menge an Faktor Xa wird durch die Zugabe des chromogenen Substrats Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilid (S-2765, Chromogenix, Schweden), Endkonzentration 0,5 mM, gemessen. Die Absorption bei 405 nm wird kontinuierlich in einem Plattenlesegerät des Typs SpectraMax^TM 340 (Molecular Devices, USA) gemessen. Die innerhalb von 10 Minuten Inkubation entwickelte Absorption, nach Subtraktion der Absorption, in einer kein Enzym enthaltenden Blindmulde wird zum Berechnen des Verhältnisses zwischen den Aktivitäten von Faktor-VIIa-Variante und -Wildtyp verwendet: Verhältnis = (A405 nm Faktor-VIIaVariante)/(A405 nm Faktor-VIIaWildtyp). Beispiel 5 RELATIVE AKTIVITÄTEN VON FVII-VARIANTEN, GEMESSEN IN DEN IN BEISPIEL 3 UND 4 BESCHRIEBENEN TESTS

Variante Verhältnis in Beispiel 3 Verhältnis in Beispiel 4

L305V/S314E/F374Y-FVIIa 3 3

L305V/K337A/F374Y-FVIIa L305V/S314E/K337A/F374Y-FVIIa wt-FVIIa 12 23 1,0 8 11 1,0
Sequenzliste

Claims

Faktor-VII-Polypeptid, umfassend mindestens zwei Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) wobei K337 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
Faktor-VII-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei K157 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-2, wobei D334 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, wobei S336 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-4, wobei V158 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-5, wobei E296 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-6, wobei M298 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-7, wobei L305 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-8, wobei 5314 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-9, wobei mindestens eine Aminosäure in den übrigen Positionen in der Proteasedomäne mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach Anspruch 10, wobei höchstens 20 zusätzliche Aminosäuren in den übrigen Positionen in der Proteasedomäne mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurden.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 10-11, wobei mindestens eine Aminosäure, die einer Aminosäure an einer Position, ausgewählt aus 159-170 von SEQ ID Nr. 1, entspricht, mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 10-12, wobei mindestens eine Aminosäure, die einer Aminosäure an einer Position, ausgewählt aus 290-304 von SEQ ID Nr. 1, entspricht, mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach Anspruch 13, wobei R304 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Tyr, Phe, Leu und Met, ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 10-14, wobei mindestens eine Aminosäure, die einer Aminosäure an einer Position, ausgewählt aus 306-312 von SEQ ID Nr. 1, entspricht, mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach Anspruch 15, wobei M306 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Asp und Asn, ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach Anspruch 15, wobei D309 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ser und Thr, ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 10-17, wobei mindestens eine Aminosäure, die einer Aminosäure an einer Position, ausgewählt aus 330-339 von SEQ ID Nr. 1, entspricht, mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 10-18, wobei A274 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach Anspruch 19, wobei das A274 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Met, Leu, Lys und Arg, ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2, wobei das K157 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp und Glu, ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, wobei das K337 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp und Glu, ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 3, wobei das D334 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gly und Glu, ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 4, wobei das S336 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gly und Glu, ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 5, wobei das V158 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ser, Thr, Asn, Gln, Asp und Glu, ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 6, wobei das E296 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Arg, Lys, Ile, Leu und Val, ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 7, wobei das M298 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lys, Arg, Gln und Asn, ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 8, wobei das L305 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Val, Tyr und Ile, ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 9, wobei das S314 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gly, Lys, Gln und Glu, ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-9, wobei das F374 durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pro und Tyr, ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach Anspruch 30, wobei das F374 durch Tyr ersetzt wurde.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-13, 15, 18-19, wobei die Aminosäure mit einer beliebigen anderen Aminosäureersetzt wurde, die durch Polynukleotidkonstrukte kodiert werden kann.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-32, wobei das Faktor VII-Polypeptid Human-Faktor-VII ist.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-32, wobei das Faktor VII-Polypeptid Human-Faktor-VIIa ist.
Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-34, wobei das Verhältnis zwischen der Aktivität des Faktor-VII-Polypeptids und der Aktivität des in SEQ ID Nr. 1 dargestellten nativen Faktor-VIIa-Polypeptids mindestens etwa 1,25 beträgt.
Faktor-VII-Polypeptid nach Anspruch 35, wobei das Verhältnis mindestens etwa 2,0, vorzugsweise mindestens etwa 4,0 beträgt.
Faktor-VII-Polypeptid, bei welchem es sich um F374Y/L305V/S314E/K337A-FVII handelt.
Faktor-VII-Polypeptid, bei welchem es sich um F374Y/L305V/K337A-FVII handelt.
Polynukleotidkonstrukt, das ein Faktor-VII-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-38 kodiert.
Polynukleotidkonstrukt nach Anspruch 39, bei welchem es sich um einen Vektor handelt.
Wirtszelle, umfassend das Polynukleotidkonstrukt nach einem der Ansprüche 39-40.
Wirtszelle nach Anspruch 41, bei welcher es sich um eine eukaryontische Zelle handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 42, welche von einem Säuger stammt.
Wirtszelle nach Anspruch 43, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus CHO-Zellen, HEK-Zellen und BHK-Zellen.
Transgenes, nicht-menschliches Tier, das das wie in Anspruch 39 definierte Polynukleotidkonstrukt enthält und exprimiert.
Transgene Pflanze, die das wie in Anspruch 39 definierte Polynukleotidkonstrukt enthält und exprimiert.
Verfahren zur Herstellung des in einem der Ansprüche 1-38 definierten Faktor-VII-Polypeptids, wobei das Verfahren das Züchten einer wie in einem der Ansprüche 41-44 definierten Zelle in einem geeigneten Wachstumsmedium unter die Expression des Polypeptidkonstrukts gewährenden Bedingungen und Gewinnen des erhaltenen Polypeptids aus dem Kulturmedium umfasst.
Verfahren zur Herstellung des in einem der Ansprüche 1-38 definierten Faktor-VII-Polypeptids, wobei das Verfahren das Gewinnen des Faktor-VII-Polypeptids aus Milch, die durch das in Anspruch 45 definierte transgene Tier produziert wird, umfasst.
Verfahren zur Herstellung des in einem der Ansprüche 1-38 definierten Faktor-VII-Polypeptids, wobei das Verfahren das Züchten einer Zelle einer wie in Anspruch 46 definierten transgenen Pflanze und Gewinnen des Faktor-VII-Polypeptids aus der Pflanze umfasst.
Arzneimittel, umfassend ein Faktor-VII-Polypeptid, das mindestens zwei Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) wobei K337 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist, umfasst, und wahlweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Arzneimittel, umfassend ein wie in einem der Ansprüche 1-38 definiertes Faktor-VII-Polypeptid und wahlweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung eines Faktor-VII-Polypeptids, umfassend mindestens zwei Substitutionen in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei es sich bei den Substitutionen um Folgendes handelt: (i) Ersatz von F374 mit einer beliebigen anderen Aminosäure und (ii) wobei K337 mit einer beliebigen anderen Aminosäure ersetzt ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Blutungsstörungen oder Blutungsepisoden oder zur Verbesserung des normalen hämostatischen Systems.
Verwendung eines wie in einem der Ansprüche 1-38 definierten Faktor-VII-Polypeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Blutungsstörungen oder Blutungsepisoden oder zur Verbesserung des normalen hämostatischen Systems.