DE60303257T2

DE60303257T2 - Substanzen, Sequenzen und Methoden zur Identifizierung epidemischer Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus Stämme

Info

Publication number: DE60303257T2
Application number: DE60303257T
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Prof.Dr. Witte; Brigit Strommenger; Christa Cunny; Guido Dr. Werner
Original assignee: FED REP OF GERMANY REPR BY; Robert Koch Institute
Current assignee: FED REP OF GERMANY REPR BY; Robert Koch Institute
Priority date: 2003-11-07
Filing date: 2003-11-07
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2023-11-08
Also published as: EP1529848B1; EP1529848A1; ATE316155T1; DE60303257D1; ES2258207T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Seit seiner ersten Entdeckung in den frühen 60er Jahren des 20. Jahrhunderts (Jevons, M. P. 1961 "Celbenin" resistant staphylococci), hat sich das Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) zu einem der bedeutendsten nosomikalen pathogenen Keimen weltweit entwickelt und ist verantwortlich für ein weites Feld an Infektionen in Krankenhäusern. Es verbreitet sich weiter in neuen Gemeinschaften in denen die Methoden und Einrichtungen der modernen Medizin eingeführt werden, während es in jenen Einrichtungen in denen es seit einer Dekade oder länger endemisch ist, zu regelmäßig wiederkehrenden Epidemien führt.
Als Konsequenz hieraus haben sich der Nachweis und die Weitergabe von isolierten MRSA zu einem Schwerpunkt der Forschung seit einer Dekade oder länger entwickelt.
Resistenz gegen Medikamente und klinische Merkmale von Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus ist seit langem als einer der wichtigsten humanen pathogenen Keime bekannt, welcher für einen weiten Bereich von Beschwerden verantwortlich ist, von kleineren Infektionen der Haut bis hin zu Wundinfektionen, Wundstarrkrampf, Infektionen des zentralen Nervensystems, der Atmungsorgane und des Harntraktes, und Infektionen im Zusammenhang mit intravaskulären Vorrichtungen und Fremdkörpern.
Infektionen von Staphylococcus aureus können tödlich enden. Die meisten Stämme von Staphylococcus aureus sind opportunistische Pathogene, die Individuen befallen ohne kurzfristig oder auch über längere Zeiträume Symptome zu verursachen, welche dann Krankheiten auslösen, wenn das Immunsystem geschwächt wird. Das immense genetische Repertoire dieses Bakteriums zur Anpassung an rasch wechselnde und einheitlich feindliche Umgebungen hat sich wiederholend im Auftreten von Stämmen von Staphylococcus aureus gezeigt, welche Resistenzen gegen praktisch alle antibakteriellen Reagenzien bereits kurz nach der Einführung dieser Medikamente in die medizinische Praxis erworben haben. Eine Studie hat gezeigt, dass 97% der gewonnenen Isolate von Staphylococcus aureus das Resistenzmerkmal gegen Penicillin tragen (Sa-Leao R. et al, Microb. Drug. Res. 2001; 7: 237–245).
Auf die Einführung von Methicillin in die klinische Praxis im Jahre 1960 folgte das Auftreten des ersten aus dem Blutstrom stammenden isolierten Staphylococcus aureus welches nicht nur gegen Penicillin, Streptomycin, und Tetracyclin (und manchmal auch Erythromycin), sondern auch gegen Methicillin resistent war. Seit den frühen 60er Jahren des 20. Jahrhunderts, haben sich Stämme von MRSA über die Hospitäler in mehreren Wellen verteilt, was wiederum zu einer weltweiten Verbreitung dieser Stämme geführt hat.
Die Differenzierung der Stämme ist die Grundlage der Erforschung der Epidemiologie der Infektionskrankheiten. Sie ist wichtig zur Identifikation der Quellen von (Mikro-) Epidemien und zur Identifikation von Klonen mit speziellen Eigenschaften, wie beispielsweise erhöhte Virulenz oder erhöhte Fähigkeit, sich epidemisch zu verbreiten.
Das initiale genetische Ereignis, welches die Entstehung eines MRSA Stammes markiert ist, der Erwerb des mec Elements, welches die Determinante der Methicillinresistenz mecA in den MRSA Stamm einführt. Vier Typen von mec Elementen oder SCCmec sind bisher identifiziert worden. Typ I (34 kb) wurde im ersten MRSA Stamm, welcher im Jahre 1960 in Großbritannien isoliert worden ist (Stamm NCTC10442) nachgewiesen; Typ II (52 kb) wurde in einem in Japan im Jahre 1982 isolierten MRSA Stamm nachgewiesen (Stamm N315); Typ III (66 kb) wurde in einem in Neuseeland im Jahre 1985 isolierten MRSA Stamm nachgewiesen (Stamm 82/2082); und Typ IV (20–25 kb) wurde nachgewiesen in zwei so genannten community-acquired MRSA Stämmen, sowie in Vertretern von pädiatrischen Klonen aus Polen und Portugal. Jeder einzelne dieser mec Typen war seinerseits Ausgangspunkt für zahlreiche MRSA Klone.
In den USA wurde ein Anstieg des Auftretens von MRSA in großen US Krankenhäusern von 4% in den 80er Jahren auf 50% in den späten 90er Jahren des 20. Jahrhunderts verzeichnet. In einigen Hospitälern wurden Resistenzhäufigkeiten bis zu 80% verzeichnet (Duarte C. O., The Lancet, Vol. 2, März 2003).
Einzelne Stämme von MRSA zeichnen sich durch ihre Fähigkeit zur raschen Ausbreitung aus. Diese Stämme werden als epidemische MRSA Stämme bezeichnet und stellen eine ernste Gefahr für Patienten im Krankenhaus dar. Die rasche Identifikation eines epidemischen MRSA kann einen erheblichen Vorteil darstellen im Kampf gegen deren Ausbreitung und in Folge hierzu zu einer Verminderung der Infektionsraten und letztlich auch der Sterblichkeit führen.
Die meisten epidemischen Stämme treten in Europa und besonders in Deutschland auf. Sie werden gemäß ihrer multilocus Sequenztypen mit ST Nummern bezeichnet. Repräsentative Originalisolate von epidemischen MRSA Stämmen aus Deutschland sind der Berlin epidemic strain MRSA Nr. 1417/97 und Nr. 809/96; der Southern German epidemic strain MRSA Nr. 1155/98-2, Nr. 131/98; Nr. 2594/97; der Hannover area epidemic strain MRSA Nr. 872/98; der Northern German epidemic strain MRSA Nr. 134/93, Nr. 1450/94, Nr. 234/95, Nr. 406/98; der Barnim epidemic strain MRSA Nr. 1678-96, Nr. 1293/00, Nr. 152-00, 633/00; und der Rhine-Hessen epidemic strain MRSA Nr. 21663, Nr. 2382-00 und Nr. 2410. Diese Stämme treten erst seit kurzem auf. Es ist sehr wünschenswert, zwischen diesen neuen Stämmen unterscheiden zu können.
Stämme von Staphylococcus aureus können mittels pulsed field gel electrophoresis (PFGE) differenziert werden. Die Methode ist arbeitsintensiv und zeitaufwändig. Sie umfaßt die Anzucht des Organismus, gewöhnlich über Nacht in einer Nährlösung, Einbettung der gewaschenen Zellen in Agarose, eine Lyse der Zellen in situ, Verdau der DNA in situ mit einem Restriktionsenzym, Beladung eines Gels mit dem Agarblock, und anschließende Trennung der Fragmente auf dem Gel mittels PFGE. Die ganze Prozedur dauert bereits ohne Kultur 2 bis 5 Tage und diese Zeitspanne ist viel zu lange für eine in einem Hospitalumfeld dringend erwartete Identifikation eines Staphylococcus aureus. Darüber hinaus ist die Methode so anspruchsvoll, daß sie in einem gewöhnlichen Hospital nicht eingesetzt werden wird (Tang et al, J. of Clin. Microbiol. Apr. 2000, S. 1347–1351).
Stämme von Staphylococcus aureus werden traditionell durch phage typing (Blair J. E., et al, Bulletin of the WHO 1961, 24: 771–784) differenziert. Diese international anerkannte Methode ist zur Zeit und war auch in der Vergangenheit sehr hilfreich in der Aufklärung von durch Staphylococcus aureus ausgelösten Epidemien in Hospitälern (Vandenbrouck-Grauls C. M. et al, Eur. J. of Clin Micr. & Inf. Dis. 1991,10: 6–11). Einige Stämme von Staphylococcus aureus sind nur gegen einen oder zwei Phagen des internationalen Standardsets empfindlich, oder können auch komplett unempfindlich gegen diese Phagen sein (Zierdt C. H. et al J. of Clin. Micr. 1992, 30: 252–254). Insbesondere Stämme von Staphylococcus aureus welche nur gegen einen oder zwei Phagen sensitiv sind, können fälschlicherweise auf der Basis von phage typing für identisch gehalten werden.
Rasche und verläßliche Differenzierung von Stämmen ist wichtig zur Identifikation von Quellen von (Mikro-) Epidemien, insbesondere in Hospitälern. Es ist sehr wichtig, daß man Klone mit speziellen Eigenschaften, wie beispielsweise erhöhte Virulenz oder erhöhte Fähigkeit, sich epidemisch zu verbreiten, rasch identifizieren kann.
Frühere Versuche, eine Nukleinsäuresequenz zu identifizieren, welche für eine eindeutige und schnelle Differenzierung von Stämmen geeignet wäre, sind gescheitert. Einige neuere, auch kommerziell betriebene, Methoden verwenden die Sequenzierung der DNA. Jedoch ist dies langwierig und zeitaufwändig. In Frénay et al (Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1996, 15: 60–64) wurde vertreten, daß die in einem einzigen Hospital oder sogar in einem einzelnen Patienten isolierten Stämme sich unterscheiden, wenn man den Spa-Typ (das heißt die X-Region) analysiert. Bis jetzt stellt das Spa Typing keine Alternative dar, was auf dem Fakt beruht, daß eine eindeutige Identifizierung nicht möglich war. Auch wenn Spa typing im Stand der Technik als eine Methode zur Identifikation von Staphylococcus aureus bekannt ist, so ist sie doch niemals als Einzelnachweis für spezifische Stämme eingesetzt worden. Ein älteres Dokument lehrt im Gegenteil, daß die aus dieser Region abgeleiteten Sequenzen nicht für einen Stamm spezifisch wären. Die Autoren bestehen darauf, daß die X-region in vitro and in vivo stabil sei (Frénay et al, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1996, 15: 60–64). Bis jetzt stellt das Spa Typing also keine Alternative dar, was auf dem Fakt beruht, daß eine eindeutige Identifizierung nicht möglich war.
Folglich wäre es wünschenswert, Sequenzen, Substanzen und Methoden zu kennen, um besagte neue Stämme von Staphylococcus aureus in einer stärker differenzierenden und schnelleren Weise verglichen zum Stand der Technik zu identifizieren. Idealerweise würden besagte Sequenzen, Substanzen und Methoden es erlauben, die Analyse in einer verläßlichen Weise in einer durchschnittlichen Hospitalumgebung durchzuführen. Weiterhin würden besagte Sequenzen, Substanzen und Methoden keine Kultivierung der Staphylococcus aureus Isolate für längere Zeit erfordern.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise sind die Erfinder in der Lage, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, welche nun entdeckt worden sind, für die eindeutige Bestimmung verschiedener Stämme von Staphylococcus aureus zu nutzen und somit das Phage Typing und/oder die pulsed field gel Elektrophorese überflüssig zu machen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 und 20, oder ein reverses Komplement davon. (Tabelle 1 listet sowohl die Nummern und Namen der entsprechenden Sequenzen als auch die Nummer des Stammes, für die die Sequenz spezifisch ist auf). Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung dienen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur eindeutigen Bestimmung des entsprechenden Stammes.
Die Begriffe Nukleinsäuremolekül und Oligonucleotid bezeichnen hierbei sowohl Primer, Sondenmoleküle (Probes), Proben und Fragmente von Oligonucleotiden, als auch andere Erscheinungsformen von Nukleinsäuremolekülen. Die Begriffe Nukleinsäuremolekül und Oligonucleotid werden weiterhin generisch für Polydeoxribonucleotide (enthaltend 2-Deoxy-Dribose) und für Polyribonucleotide (enthaltend D-Ribose) oder auch jede andere Form von Polynucleotid, welches ein N-Glycosid einer Purinbase oder einer Pyrimidinbase oder einer modifizierten Purinbase oder Pyrimidinbase ist, verwendet. Die Begriffe umfassen ebenfalls Polyamide mit einer Purinbase oder einer Pyrimidinbase welche auch als PNAs bezeichnet werden. Hierbei sollen sowohl Nukleinsäuremolekül als auch Oligonucleotid Moleküle mit beliebiger Länge umfassen, wobei jedoch jeweils die umfaßten Moleküle ihrerseits sehr wohl eine definierte Länge besitzen. Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nukleinsäuremoleküle und Oligonucleotide können einzelsträngig, doppel- oder dreifachsträngig vorliegen oder auch in Form eines Produktes einer PCR, oder als cDNA, RNA, mRNA oder PNA.
Die Erfinder haben gefunden, dass im Gegensatz zu den meisten anderen von Staphylococcus aureus stammenden Spa-Sequenzen welche in dieser Erfindung offenbart werden, die erfindungsgemäßen Sequenzen hingegen tatsächlich zu einer eindeutigen Bestimmung von gewissen Stämmen von Staphylococcus aureus dienen können (Tabelle 1).
Tabelle 1:
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf bestimmte Teile der kompletten Sequenzen der SEQ ID Nr: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 und 20, oder jeweils ein reverses Komplement davon, wie sie in Tabelle 2 dargestellt sind.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die Nukleinsäuremoleküle mit den Nukleotidsequenzen gemäß SEQ ID Nr: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 und 20 oder jeweils einen reversen Komplement davon, eingesetzt werden zur Identifikation der folgenden Stämme von Staphylococcus aureus.
Bis zum heutigen Zeitpunkt ist kein System vorhanden, welches die Identifikation der folgenden Stämme von Staphylococcus aureus rasch und eindeutig erlaubt:

a) den Berlin epidemic strain MRSA Nr. 1417/97 und Nr. 809/96 (Internationale Nr. ST 45);
b) den Southern German epidemic strain MRSA Nr. 1155/98-2, Nr. 131/98; Nr. 2594/97 (Internationale Nr. 228);
c) den Hannover area epidemic strain MRSA Nr. 872/98 (Internationale Nr. ST 254);
d) den Northern German epidemic strain MRSA Nr. 134/93, Nr. 1450/94, Nr. 234/95, Nr. 406/98 (Internationale Nr. ST 247);
e) den Barnim epidemic strain MRSA Nr. 1678-96, Nr. 1293/00, Nr. 152-00, 633/00 (Internationale Nr. ST 22) und;
f) den Rhine Hesse epidemic strain MRSA Nr. 21663, Nr. 2382-00 und Nr. 2410 (Internationale Nr. ST 5).

In einer Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Oligonucleotid oder ein Molekül enthaltend ein Oligonucleotid zur Detektion von einem der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle gemäß der obigen Beschreibung. Dieses Oligonucleotid wird ausgewählt aus der Gruppe wie dargelegt in SEQ ID. Nr: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, und 29, oder jeweils die reverskomplementäre Sequenz davon (siehe auch Tabelle 2). Dem Fachmann ist hierbei bewußt, daß die Sequenzen der Oligonucleotiden von den hier genannten leicht abweichen können. Somit kann man sich Oligonucleotide vorstellen, welche geringfügig länger oder kürzer als die Sequenzen gemäß SEQ ID Nr: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 und 29 sind. Ebenso können ein oder wenige Nukleotide unterschiedlich sein. Es ist jedoch wichtig, daß die Spezifität des Oligonucleotides erhalten bleibt und sich die Schmelztemperatur nicht signifikant ändert. Dies bedeutet, daß sich bei Änderung der Sequenz des Oligonucleotids, die Schmelztemperatur vorzugsweise unverändert bleibt. Die Schmelztemperatur wird wie folgt berechnet: G/C (= 4°C) und A/T (= 2°C). Dem Fachmann ist hierbei ebenfalls bewußt, daß auch modifizierte Nukleotide einen Teil oder die Gesamtheit eines erfindungsgemäßen Oligonucleotids ausmachen können.
Tabelle 2: Erfindungsgemäße Oligonucleotide
Wie aus dem obigen Abschnitt ersichtlich, sind in einer bevorzugten Ausführungsform die Oligonucleotide an ihrem 5'-Ende mit einer Aminogruppe zur Bindung an Oberflächen wie beispielsweise sog. Capture Probes modifiziert. In einer Ausführungsform werden die in Tabelle 2 gelisteten Oligonucleotide zusammen mit einem an das 5'-Ende gebundenen 40-mer Poly T Schwanz verwendet und entweder auf Glasträger, Nylon oder einem anderen festen Träger gespotted. Hierbei kann der Schwanz auch zwischen 2 und 50 Nukleotide besitzen und bestehen aus Poly A, C, G, oder T oder einer Mischung hieraus. Längere Schwänze sind möglich aber nicht ideal.
In einer weiteren Ausführungsform werden die jeweils chemisch modifizierten Oligonukleotide ausgewählt aus der Gruppe umfassend eine chemische Modifikation zur Immobilisierung der Oligonucleotide und einer Modifikation zur Kennzeichnung des Oligonucleotids.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Oligonucleotid zusätzlich noch eine chemische Modifikation oder eine Kennzeichnungsgruppe (Markergruppe) ausgewählt aus der Gruppe umfassend einen Aminolinker, einen Fluoreszenzfarbstoff wie beispielsweise Fluorescein oder einen Cyaninfarbstoff Biotin, Digoxigenin oder andere dem Fachmann geläufige Modifikationen besitzen. Die Modifikation kann als Bindestelle für eine feste Phase dienen oder aber dazu dienen, einen Marker aufzunehmen. Beispielsweise kann ein mit Biotin markiertes Oligonucleotid mit einem Enzym nachgewiesen werden, das seinerseits wiederum an Streptavidin gebunden ist. Solch ein Enzym kann alkalische Phosphatase oder Peroxidase sein. Die Reaktion wird folglich zu einem Farbumschlag führen. Die Modifikation kann auch ein Linker wie beispielsweise ein Aminolinker sein. Der Marker kann aber auch ein Radioisotop wie beispielsweise ¹²⁵I, ³⁵C, ³²P oder ³⁵P sein. Gewöhnlich ist die Modifikation oder der Marker kovalent an das Oligonucleotid gebunden. Als Enzyme, welche in Kombination mit einer Modifikation zum Nachweis der erfindungsgemäßen Oligonucleotide dienen können, kommen beispielsweise Peroxidase, Hydrolase, Lyase, Oxido-Reduktase, Transferase, Isomerase und Ligase in Frage. Solche Methoden sind dem Fachmann allgemein bekannt ((Wetmur JG. Crit Rev Biochem Mol Biol 1991; (3–4): 227–59; Temsamani J. et al. Mol Biotechnol 1996 Jun; 5(3): 223–32). In einigen Fällen, in denen Enzyme als Konjugate reagieren, müssen farbändernde Substanzen vorhanden sein (Tijssen, P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds. R. H. Burton and P. H. van Knippenberg (1998). Marker oder Modifikationen können in das Oligonukleotid durch Verwendung von beispielsweise einer T4 Polynukleotidkinase oder einer Terminaltransferase eingebracht werden. Diese Enzyme können beispielsweise einen Fluoreszenzfarbstoff oder einen radioaktiven Marker einführen. Zur Ausführung der Erfindung ist es nötig, daß entweder die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder aber die erfindungsgemäßen Oligonukleotide nachweisbar sind. Die Markierung kann wie im Stand der Technik, beispielsweise in US-Patent 6,037,127 beschrieben, durchgeführt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Oligonukleotid an einer festen Phase immobilisiert. Die Erfinder haben gezeigt, daß besonders gute Ergebnisse erzielbar sind, wenn das erfindungsgemäße Oligonukleotid immobilisiert ist und das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül in Lösung vorliegt, wenn die Hybridisierungsreaktion durchgeführt wird. Das Oligonukleotid ist bevorzugt an einer der folgenden festen Phasen immobilisiert: Nylon, Nitrocellulose, Polystyrol oder Silikate, wie beispielsweise Glas. Die feste Phase kann auch ein Strip oder eine Mikrotiterplatte sein. Gewöhnlich ist das Oligonukleotid entweder über sein 5'-Ende oder sein 3'-Ende gebunden, wobei das Molekül frei in der Lösung schwingen kann. Dem Fachmann sind verschiedenste Arten der Anbindung eines Oligonukleotids an eine feste Phase bekannt. Dies kann mittels einer Modifikation, wie beispielsweise eines Aminolinkers, einer Thiolgruppe, Carboimide, Succinimid oder einer anderen Modifikation geschehen. Bevorzugt wird eine kovalente Bindung, jedoch ist auch eine nicht-kovalente Bindung gleichfalls möglich. Im letzteren Falle werden Materialien wie beispielsweise geladenes oder ungeladenes Nylon, Nitrozellulose oder Zelluloseacetat verwendet. Die feste Phase kann mit einer Substanz beschichtet sein, welche die Bindung des Oligonukleotide erleichtert, wie beispielsweise Avidin, welches ein mit Biotin modifiziertes Oligonukleotid bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die feste Phase ein Mikroarray bestehend aus einem silikatischen Material wie beispielsweise Glas. Zahlreiche Typen von Mikroarray sind dem Fachmann bekannt (McGlenn et al, (2001) Miniaturization technologies for molecular diagnostics. Clin. Chem. 47(3), 393–402). Das Oligonukleotid kann an die feste Phase über einen zusätzlichen dazwischen gesetzten Linker gebunden sein. Solch ein Binder wäre beispielsweise ein Polynukleotid, entweder ein Homopolymer wie beispielsweise multiple Adeninnukleotide oder ein Heteropolymer in dem eine Nukleotidsequenz mit variabler Zusammensetzung gewählt wird, welche die Hybridisierung nicht beeinflußt.
Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf eine Methode zur Identifikation eines klinisch relevanten Stammes von Staphylococcus aureus, welche wenigstens den Schritt des Nachweises eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküles mittels der Hybridisierung mit einer sequenzspezifischen Sonde wie beispielsweise der erfindungsgemäßen Oligonukleotide unter stringenten Bedingungen umfaßt.
Die klinisch relevanten Stämme von Staphylococcus aureus gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein:

a) den Berlin epidemic strain MRSA Nr. 1417/97 und Nr. 809/96 (internationale Nr. ST 45);
b) den Southern German epidemic strain MRSA Nr. 1155/98-2, Nr. 131/98; Nr. 2594/97 (internationale Nr. 228);
c) den Hannover area epidemic strain MRSA Nr. 872/98 (internationale Nr. ST 254);
d) den Northern German epidemic strain MRSA Nr. 134/93, Nr. 1450/94, Nr. 234/95, Nr. 406/98 (internationale Nr. ST 247);
e) den Barnim epidemic strain MRSA Nr. 1678-96, Nr. 1293/00, Nr. 152-00, 633/00 (internationale Nr. ST 22) und
f) den Rhine Hesse epidemic strain MRSA Nr. 21663, Nr. 2382-00 und Nr. 2410 (internationale Nr. ST 5).

Hybridisierungssonden reagieren selektiv mit komplementären Abschnitten einer Gensequenz oder einer Probe oder einer cDNA unter Ausbildung von Duplexmolekülen. Die Selektivität des Prozesses kann durch die Variation der Bedingungen während der Hybridisierung gesteuert werden.
Stringente Bedingungen werden für die Hybridisierung eingesetzt, z. B. geringe Salzkonzentration im Bereich von 0,02 M bis 0,15 M Salz und/oder hohe Temperaturen im Bereich von 50°C bis 70°C. Die Stringenz kann weiter gesteigert werden durch die Zugabe von Formamid zur Hybridisierungslösung. Der Einsatz von stringenten Bedingungen, das bedeutet daß nur geringe Fehlübereinstimmungen oder aber eine komplette Übereinstimmung zu einem Hybridisierungsprodukt führen wird, ist wichtig für die Erfindung. Somit sind die im Rahmen der Erfindung eingesetzten stringenten Bedingungen solche, bei denen Salzkonzentrationen im Bereich von 0,02 M bis 0,15 M Salz und/oder hohe Temperaturen im Bereich von 50°C bis 70°C eingesetzt werden in Verbindung mit langen Sonden, das sind Sonden mit mehr als 30 Nukleotiden Länge.
Der Einsatz von hoch-stringenten Bedingungen oder Bedingungen von " hoher Stringenz" bedeutet, daß nur sehr geringe Fehlübereinstimmungen oder aber eine komplette Übereinstimmung zu einem Hybridisierungsprodukt führen werden. Somit sind die im Rahmen der Erfindung eingesetzten hoch-stringenten Bedingungen solche, bei denen Salzkonzentrationen im Bereich von 0,02 M bis 0,3 M Salz und 65°C über ungefähr 5 bis 18 Stunden Hybridisierungszeitraum eingesetzt werden und zusätzlich die Probenfilter zweimal für jeweils ungefähr 15 Minuten bei Temperaturen zwischen 60°C bis 65°C gewaschen werden, wobei die erste Waschlösung ungefähr 0,1 M Salz (NaCl und/oder Natriumcitrat) und die zweite Waschlösung nur ungefähr 0,02 M Salz (NaCl und/oder Natriumcitrat) enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die folgenden Bedingungen als hoch-stringent angesehen:
Hybridisierung in einer Pufferlösung enthaltend 2 × SSC (0,03 M Natriumcitrat, 0,3 M NaCl) bei 65°C bis 68°C für 12 Stunden, gefolgt von einem 15-minütigen Waschschritt in 0,5 × SSC, 0,1 SDS und einem 15-minütigen Waschschritt bei 65°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Hybridisierung mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden in einem H1-Puffer (5× Puffer H1: 0,55 g Na₂HPO₄, 0,1 g NaHaPO₄, 0,625 ml 20 × SSC, 0,045 g EDTA, 0,8 g SPS, 0,25 ml Aq. bidest) bei einer Temperatur zwischen 35°C und 45°C, insbesondere bei 42°C für 1 bis 8 Stunden, ganz besonders für 4 Stunden. Das Waschen wird in 1 × SSC bis 3 × SSC, besonders bevorzugt in 2 × SSC mit 0,1% SDS bis ungefähr 3% SDS, ganz besonders 0,5% SDS bei ungefähr Raumtemperatur durchgeführt.
Weniger stringente Bedingungen während der Hybridisierung, z. B. 0,15 M Salz–1 M Salz und/oder Temperaturen von 22°C bis 56°C führen nicht zu guten Resultaten.
Unspezifische Produkte der Hybridisierung werden durch wiederholtes Waschen der Reaktionsprodukte in 2 × SSC Lösung und Erhöhung der Temperatur entfernt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Sequenz-spezifische Sonde eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Oligonukleotide (SEQ ID Nr. 21–29).
In einer weiteren Ausführungsform wird vor der Hybridisierung eine DNA Extraktion und Amplifikation durchgeführt. Dies kann auf eine dem Fachmann bekannte Art und Weise geschehen, wie beispielsweise mittels dem DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany) unter Befolgung der Herstellerhinweise und unter Verwendung von Lysostaphin (100 μg/ml, Sigma, Germany) um die bakterielle Lyse zu bewirken.
In einer weiteren Ausführungsform wird mehr als ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid simultan in einer Reaktion eingesetzt. Der große Vorteil der Erfindung liegt in der Tatsache, dass es tatsächlich möglich war, alle Oligonukleotide in einer Reaktion unter für alle erfindungsgemäße Oligonukleotide gleich gut geeigneten Bedingungen einzusetzen.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Erfindung auf einem Trocken-Schnelltest eingesetzt. In diesem Fall enthält die Erfindung ein Chromatographiematerial enthaltend eine Zone zur Probenaufgabe, einer Trennzone einschließlich einer Bindungszone, in der eine oder mehrere Sequenz-spezifische Nukleinsäuren immobilisiert sind, und eine der besagten Trennzone einschließlich besagter Bindungszone nachgeschaltete Zone, die eine Flüssigkeit absorbiert. In dieser Ausführungsform sind die Sequenz-spezifischen Nukleinsäuren über einen polymeren Linker immobilisiert. Die Methode umfaßt die folgenden Schritte i) im Falle von doppelsträngigen Nukleinsäuren, Denaturierung der nachzuweisenden Nukleinsäure und anschließende Neutralisation, ii) Aufbringung der nachzuweisenden Nukleinsäure auf die Zone zur Probenaufgabe in einem Laufpuffer, welcher sanft-denaturierende Agenzien enthält, iii) Bewegung der Nukleinsäure von der Zone zur Probenaufgabe in Richtung der Flüssigkeitsabsorbierenden Zone, (iv) in Kontakt bringen der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Bindungszone des Trennweges mit der Sequenz-spezifische Nukleinsäuresonde und ihre Hybridisierung mit der Sequenz-spezifischen Nukleinsäuresonde, v) Nachweis der Nukleinsäure oder der Hybridisierung der Nukleinsäure mit der Sequenz-spezifischen Nukleinsäuresonde mittels einem an die nachzuweisende Nukleinsäure angebundenen Marker oder mittels Nachweis eines Markers am Doppelstrang der Nukleinsäure (WO 03/039703).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt zum Nachweis einer Nukleinsäure und/oder einem Organismus ausgewählt aus der Gruppe umfassend den Berlin epidemic strain MRSA Nr. 1417/97 und Nr. 809/96 (Internationale Nr. ST 45), den Southern German epidemic strain MRSA Nr. 1155/98-2, Nr. 131/98; Nr. 2594/97 (Internationale Nr. 228), den Hannover area epidemic strain MRSA Nr. 872/98 (Internationale Nr. ST 254), den Northern German epidemic strain MRSA Nr. 134/93, Nr. 1450/94, Nr. 234/95, Nr. 406/98 (Internationale Nr. ST 247), den Barnim epidemic strain MRSA Nr. 1678-96, Nr. 1293/00, Nr. 152-00, 633/00 (Internationale Nr. ST 22) und den Rhine Hesse epidemic strain MRSA Nr. 21663, Nr. 2382-00 und Nr. 2410 (Internationale Nr. ST 5).
Gewöhnlich wird das erfindungsgemäße Verfahren eine der Hybridisierung voraus gehende PCR Amplifikationsreaktion umfassen, in der die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein Teil hiervon amplifiziert wird und Sequenz-spezifische Primer eingesetzt werden. PCR Reaktionen sind dem Fachmann bekannt. Einige Details werden im weiteren Verlauf genannt.
In solch einer PCR Amplifikationsreaktion werden die folgenden Schritte durchgeführt a) Kombination der die Zielregion enthaltenden Probe, hier das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül mit wenigstens einem Nukleotidtriphosphat, einer thermisch stabilen Polymerase, einem Puffer und zwei Sequenz-spezifischen Primern, b) Durchführung von wenigstens einem Temperaturzyklus mit der Reaktionsmischung, wobei der Temperaturzyklus wenigstens eine Denaturierungsphase bei hoher Temperatur und eine Verlängerungsphase bei niedrigerer Temperatur umfaßt, wobei wenigstens ein teilweise amplifiziertes Produkt hergestellt wird. Idealerweise werden die Zyklen wiederholt und somit eine größere Menge des gewünschten Produktes hergestellt.
In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, daß die erfindungsgemäßen Primer bevorzugt zwischen 3 und 60 Nukleotide, besonders bevorzugt zwischen 10 und 50 Nukleotide, ganz besonders bevorzugt zwischen 12 und 25 Nukleotide für jede Nukleinsäureeinheit enthalten. Es ist in diesem Zusammenhang unverzichtbar, daß die Primer eine ausreichende Länge für die Bindung an das Zielnukleinsäuremolekül mit ausreichender Stringenz besitzen. PNA-DNA Hybridoligonukleotide (siehe Finn, P. J. et al., N.A.R. 24, 3357–3363 (1996), Koch, T. et al., Tetrahedron Letters 36, 6933–6936 (1995), Stetsenko, D. A. et al., Tetrahedron Letters 37, 3571–3574 (1996), Bergmann, F et al., Tetrahedron Letters 36 6823–6826 (1995) und Will, D. W. et al., Tetrahedron 51, 12069–12082 (1995)) kommen ebenfalls als Primer zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren in Betracht.
Als thermisch stabile Polymerase kann eine DNA Polymerase aus der Gruppe enthaltend Taq DNA Polymerase, T. th. DNA Polymerase oder Klentaq (Taq DNA Polymerase (-exo 5'-3'), Korolev et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9246–9268) ausgewählt werden. Die Verwendung von Taq DNA Polymerase im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist hierbei besonders bevorzugt. Dem Fachmann ist bekannt, dass zahlreiche, unterschiedliche thermisch stabile Polymerasen eingesetzt werden können.
Alternativ kann als thermisch stabile Polymerase auch eine DNA Polymerase welche eine verringerte Diskriminierungsneigung gegen markierte Nukleotide aufweist, verwendet werden.
Die Zahl der thermischen Zyklen kann im Bereich von ungefähr 10 bis ungefähr 45 liegen, abhängig von der Menge an Templat-DNA und deren Reinheit. Da die Verfügbarkeit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens hoch ist, kann die Zykluszeit ihrerseits kurz sein.
Gewöhnlich besteht der Zyklus aus (i) einem Denaturierungszyklus, (ii) einem Anlagerungszyklus und (iii) einem Verlängerungszyklus. Alternativ können auch nur zwei Zyklen durchgeführt werden, (i) ein Denaturierungszyklus und (ii) ein Anlagerungs- und Verlängerungszyklus.
Bevorzugt wird der Denaturierungszyklus durchgeführt bei Temperaturen zwischen 100°C und 85°C, besonders bevorzugt bei Temperaturen zwischen 98°C und 90°C, ganz besonders bevorzugt bei Temperaturen zwischen 96°C und 92°C.
Bevorzugt wird der Anlagerungszyklus durchgeführt bei Temperaturen zwischen 80°C, und 45°C, besonders bevorzugt bei Temperaturen zwischen 70°C und 50°C, ganz besonders bevorzugt bei Temperaturen zwischen 60°C und 55°C.
Bevorzugt wird der Verlängerungszyklus durchgeführt bei Temperaturen zwischen 80°C und 50°C, besonders bevorzugt bei Temperaturen zwischen 75°C und 60°C, ganz besonders bevorzugt bei Temperaturen zwischen 73°C and 68°C.
Bevorzugt wird der Denaturierungszyklus innerhalb von 3 Minuten durchgeführt, besonders bevorzugt innerhalb von 30 Sekunden.
Bevorzugt wird der Anlagerungszyklus innerhalb von 3 Minuten durchgeführt, besonders bevorzugt innerhalb von 30 Sekunden. Bevorzugt wird der Verlängerungszyklus innerhalb von 4 Minuten durchgeführt, besonders bevorzugt innerhalb von 30 Sekunden, jedoch variiert die Verlängerungszeit mit der Länge des Templates, insbesondere kann die Verlängerungszeit gesteigert werden wenn die Länge des Templates zunimmt.
Einsetzbare Pufferkomponenten können, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, umfassen Tris-HCl bei einem pH von ungefähr 7,0 bis 10 und einer Konzentration von ungefähr 2 bis 60 mM, Ammoniumsulfat bei einer Konzentration von ungefähr 10–20 mM, bevorzugt 15 mM, MgCl₂ bei einer Konzentration von ungefähr 1 bis 10 mM, und gegebenenfalls ungefähr 0,05 mM Mercaptoethanol, ungefähr 0,28% Tween^® 20 und/oder ungefähr 0,02% Nonidet^® 40.
Nukleotidtriphosphate sind bevorzugt Deoxynukleotide und können, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, ausgewählt sein aus dGTP, dATP, dTTP und dCTP. Zusätzlich können gemäß der vorliegenden Erfindung auch Derivate von Deoxynukleotiden, welche ihrerseits definiert sind als solche Deoxynukleotide welche mittels einer thermisch stabile Polymerase in einer thermischen Zyklusreaktion synthetisierte naszierende DNA Moleküle eingebaut werden können, eingesetzt werden. Solche Derivate umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Thionukleotide, 7-Deaza-2'-dGTP, 7-Deaza-2'-dATP sowie auch Deoxyinosintriphosphate, welche ihrerseits gleichzeitig auch als Ersatzdeoxynukleotide für dATP, dGTP, dTTP oder dCTP verwendet werden können. Die oben genannten Deoxynukleotide und deren Derivate werden bevorzugt in einer Konzentration von ungefähr 50 μM bis ungefähr 4 mM eingesetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind ein oder mehrere eingebaute Nukleotide markiert. Zum Beispiel können einzelne und unterschiedliche Marker bestehen aus der Gruppe umfassend Enzyme wie beispielsweise beta-Galactosidase, alkalische Phosphatase und Peroxidase, Enzymsubstrate, Coenzyme, Farbstoffe, Chromophore, fluoreszierende, chemilumineszierende und biolumineszierende Marker wie beispielsweise FITC, Cy5, Cy5.5, Cy7, Texas-Rot und IRD40 (Chen et al. (1993), J. Chromatog. A 652: 355–360 und Kambara et al. (1992), Electrophoresis 13: 542–546), Liganden oder Haptenden wie beispielsweise Biotin und radioaktive Isotope wie beispielsweise ³H, ³⁵S, ³²P, ¹²⁵I und ¹⁴C.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das zu amplifizierende Nukleinsäuremolekül in der Form einer total genomischen DNA vorliegen. Bevorzugt hat die genomische DNA eine Länge oberhalb oder gleich 2 kb. Grundsätzlich können alle Formen von Templaten eingesetzt werden, wie z. B. gereinigte Nukleinsäuren, das sind Nukleinsäuren in denen eine Fraktion entweder angereichert sein kann oder auch nicht, wobei ein Beispiel hierfür Plasmid-DNA darstellt und ein anderes Beispiel gereinigte genomische DNA. Das Verfahren kann auch durchgeführt werden, was in der Tat bevorzugt ist, in dem einfach Zellen von Staphylococcus aureus oder auch direkt die vom Patienten stammende Probe der PCR Reaktion unterworfen wird. Es ist auch möglich, die vom Patienten stammende Probe auf [x] Platten anzuziehen, bevor ein Aliquot von dieser Platte direkt der PCR Reaktionsmischung zugegeben wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die PCR Reaktionen durchgeführt unter Verwendung von Ready-to-go PCR Beads (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) in einer 25 μl Reaktion enthaltend ungefähr 10 ng an Templat-DNA und 2,5 pmol eines jeden Primers. Der initialen Denaturierung bei 94°C für 3 Min. folgen 30 Amplifikationszyklen bei 94°C für 30 Sek., Anlagerung bei 55°C für 30 Sek. und Verlängerung bei 72°C für 30 Sek. (mit Ausnahme des letzten Zyklus mit einem Verlängerungsschritt von 4 Min.).
Hier sind die Produkte der PCR markiert unter Verwendung von entweder Digoxigenin-Markierung für die Hybridisierung an Nitrozellulose-gebundene Capture probes oder von zufällig geprimter Markierung mit Fluorescein und Verwendung des Flourescein High Prime* Kits (Roche, Mannheim, Deutschland) im Falle von Mikroarrays.
In einer ganz bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt mit Primern bestehend im wesentlichen aus den folgenden Nukleotidsequenzen a) PRIMER 1 (SEQ ID Nr. 30): 5'-CAA GCA CCA AAA GAG GAA-3', b) PRIMER 2 (SEQ ID Nr. 31): 5'-CAC CAG GTT TAA CGA CAT '-3' und gegebenenfalls wird das Produkt der PCR während der Amplifikationsreaktion markiert mittels Einbau eines markierten Nukleotids, oder das Produkt der PCR wird markiert nach der PCR Reaktion vor der Hybridisierung und gegebenenfalls erden einer oder beide Primer vor dem Start der PCR Reaktion markiert.
Im Falle der Bindung an Nitrozellulose und Markierung des Produktes der PCR stellt die Verwendung des Nucleic Acid Detection Kit Roche (Mannheim, Deutschland) eine bevorzugte Ausführungsform dar. Im Falle des spotting auf Glasflächen und Markierung des Produktes der PCR mit Fluorescein kann der Nachweis auf einem Array Wox Biochipreader (Applied Precision, Marlborough, UK) unter Verwendung des Alexa 488 nm Filter durchgeführt werden.
Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Identifikation eines klinisch relevanten Stammes von Staphylococcus aureus umfassend eine feste Phase mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Oligonukleotiden. Die Vorrichtung kann zusätzlich noch eine feste Phase und/oder ein Gerät zum Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Vorrichtung eine feste Phase an die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle fest gebunden sind. Solch eine Vorrichtung kann umfassen eine Glasplatte, eine Nylonmembran, eine andere Membran, welche fähig ist Nukleinsäuren zu binden, oder eine Trocken-Schnelltest-Membran wie in WO 03/039703 offenbart. Die feste Phase kann ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend einen Nukleinsäurearray, Membran, Nitrozellulose, geladene Nitrozellulose, ungeladene Nitrozellulose, Nylonmembran, geladene Nylonmembran, ungeladene Nylonmembran und Glasarray.
Die Erfindung betrifft ebenfalls auch einen Kit zur Identifikation eines klinisch relevanten Stammes von Staphylococcus aureus umfassend wenigstens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid oder eine erfindungsgemäße Vorrichtung. Das Kit kann auch andere Reagenzien oder Enzyme wie beispielsweise Puffer, Nukleotide oder ähnliches umfassen.
Während die oben beschriebene Lehre im Detail ausgeführt ist, dienen die folgenden Beispiele nur zur weiteren Erläuterung und stellen in keiner Weise eine Einschränkung der Erfindung dar. Modifikationen und Verbesserungen der offenbarten erfindungsgemäßen Stoffe und Verfahren welche im Rahmen des fachmännischen Könnens und Verstehens liegen, sind im Schutzumfang der Ansprüche enthalten.
Beispiele
1
1 zeigt Amplimere der X-Region von Spa für verschiedene epidemische Stämme von MRSA; wobei Reihen 2 und 3 den Berlin epidemic strain (1155/93, 809/96) zeigen, Reihen 4 und 5 den Southern German epidemic strain (538/95, 131/98) zeigen, Reihen 6 und 7 den Northern German epidemic strain (134/93, 1450/94) zeigen, Reihen 8 und 9 den Barnim epidemic strain (1678/96, 2378/00) zeigen und Reihen 10, 11 und 12 den Hannover area epidemic strain (1000/93, 872/00) zeigen.
2
2 zeigt Markierung mit Digoxigenin und Exposition mit alkalischer Phosphatase, welche wie in Experiment 1 beschrieben, durchgeführt wurde. Die Abbildung zeigt, daß das positive Kontrollexperiment das erwartete positive Ergebnis ergibt und die Barnim Stämme von MRSA wie auch der Hannover area epidemic strain mit großer Spezifität nachgewiesen werden. 2A zeigt den Ort der erfindungsgemäßen Probes auf der Nylonmembran als Unterlage. Der nachzuweisende relevante Stamm von Staphylococcus aureus ist gelistet in Form der Stammnummer. 2B zeigt Ergebnisse der Anwendung der Erfindung zum Nachweis des Barnim MRSA strain. 2C zeigt Ergebnisse der Anwendung der Erfindung zum Nachweis des Hannover area epidemic strain.
Beispiel 1
Die initiale Extraktion der DNA wurde wie folgt durchgeführt: DNA wurde aus ungefähr 10 einzelnen auf Blutagar bei 37°C für ungefähr 18 Stunden kultivierten Kolonien mittels des DNeasy Tissue Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) unter Befolgung der Hinweise und Anweisungen des Herstellers und Verwendung von Lysostaphin (100 μg/ml, Sigma, Deutschland) um bakterielle Lyse zu erreichen. Die Primer 1 und 2 wurden eingesetzt (SEQ ID Nr. 30: 5'-CAA GCA CCA AAA GAG GAA und SEQ ID Nr: 31: 5'-CAC CAG GTT TAA CGA CAT). Die PCR Reaktionen wurden durchgeführt mittels Ready-to-go PCR Beads (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) in einer 25 μl Reaktion enthaltend ungefähr 10 ng an Templat-DNA und 2,5 pmol eines jeden Primers. Einer initialen Denaturierung bei 94°C für 3 Min. folgten 30 Amplifikationszyklen mit 94°C für 30 Sek., Anlagerung bei 55°C für 30 Sek. und Verlängerung bei 72°C für 30 Sek. (mit Ausnahme des letzten Zyklus mit einem Verlängerungsschritt von 4 Min.)
Die Produkte der PCR wurden markiert unter Verwendung von entweder Digoxigenin-Markierung für die Hybridisierung an Nitrozellulose-gebundene Capture probes oder von zufällig geprimter Markierung mit Fluorescein und Verwendung des Flourescein High Prime* Kits (Roche, Mannheim, Deutschland) im Falle von Mikroarrays.
Caputure probes wie in Tabelle 2 aufgelistet wurden eingesetzt mit einem 40 mer Poly-T Schwanz welcher an das 5'-Ende gebunden war und entweder auf Glasflächen oder Nylon gespotted. Die Hybridisierung und das Waschen erfolgte in einem H1-Puffer bei 42°C für 4 Stunden, sowie weiterem Waschen in 2 × SSC mit 0,5% SDS bei Raumtemperatur.
Der Nachweis erfolgte mit dem Nucleic Acid Detection Kit von Roche (Mannheim, Deutschland). Im Falle des spotting auf Glasflächen und Markierung des Produktes wurde der Nachweis auf einem Array Wox Biochipreader (Applied Precision, Marlborough, UK) unter Verwendung des Alexa 488 nm Filter durchgeführt.
Die in der Beschreibung, den Ansprüchen und/oder Abbildungen offenbarten Merkmale können alleine oder auch in verschiedenen Kombinationen wesentlich für die Umsetzung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen sein.
SEQUENCE LISTING

Claims

Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe von, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 und 20, oder ein reverses Komplement davon.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches DNA, cDNA, ein PCR Produkt oder RNA ist.
Oligonukleotid oder ein Molekül umfassend ein Oligonukleotid, zur Detektion eines der Nukleinsäuremoleküle nach Anspruch 1 oder 2, ausgewählt aus der Gruppe wie dargelegt in SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, und 29, oder die reverskomplementäre Sequenz davon.
Oligonukleotid nach Anspruch 3, zusätzlich umfassend, eine chemische Modifikation ausgewählt aus der Gruppe umfassend, Modifikationen die zur Immobilisierung des Oligonukleotides dienen und Modifikationen die zur Markierung des Oligonukleotids dienen.
Oligonukleotid nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Oligonukleotid auf einer festen Phase immobilisiert ist.
Verfahren zur Identifikation eines klinisch relevanten Staphylococcus aureus Stammes umfassend wenigstens den Schritt der Detektion eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 mittels Hybridisierung mit einer sequenzspezifischen Probe unter stringenten Bedingungen.
Verfahren nach Anspruch 6 wobei die sequenzspezifische Probe ein Oligonukleotid nach Ansprüchen 3 bis 5 ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7 wobei die Hybridisierung mit einem chromatigraphischen Matrerial durchgeführt wird umfassend (i) eine Probenaufnahmezone, (ii) eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind und (iii) eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone, und wobei die sequenzspe zifischen Nukleinsäuresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind und wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Falle doppelsträngiger Nukleinsäuren denaturiert und anschließend neutralisiert, b) die nachzuweisende Nukleinsäure wird auf die Probenaufnahmezone in einem Laufpuffer, welcher mild denaturierende Agenzien enthält, aufgetragen, c) die nachzuweisende Nukleinsäure bewegt sich von der Probenaufnahmezone in Richtung Flüssigkeit absorbierende Zone, d) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Bindungsbereich der Trennstrecke mit der sequenzspezifischen Nukleinsäuresonde in Kontakt gebracht und hybridisiert an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde e) die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde wird detektiert über eine Markierung, die an der nachzuweisenden Nukleinsäure angebracht ist oder über die Detektion einer Markierung des Nukleinsäuredoppelstranges.
Verfahren nach Anspruch 6 bis 8, wobei der Staphylococcus aureus Stamm der identifiziert wird, ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend, die epidemischen Stämme: a) Berlin epidemic strain MRSA Nr. 1417/97 und Nr. 809/96 (internationale Nr. ST 45); b) Southern German epidemic strain MRSA Nr. 1155/98-2, Nr. 131/98; Nr. 2594/97 (internationale Nr. ST 228); c) Hannover area epidemic strain MRSA Nr. 872/98 (internationale Nr. ST 254); d) Northern German epidemic strain MRSA Nr. 134/93, Nr. 1450/94, Nr. 234/95, Nr. 406/98 (internationale Nr. ST 247); e) Barnim epidemic strain MRSA Nr. 1678-96, Nr. 1293/00, Nr. 152-00, 633/00 (internationale Nr. ST 22) und; f) Rhine Hesse epidemic strain MRSA Nr. 21663, Nr. 2382-00 und Nr. 2410 (internationale Nr. ST 5).
Verfahren nach Ansprüchen 6 bis 9, wobei vor der Hybridisierung eine PCR Amplifikation durchgeführt wird, wobei eine Sequenz nach Anspruch 1 oder ein Abschnitt davon amplifiziert wird und, wobei sequenzspezifische Primer angewendet werden.
Verfahren nach Anspruch 10 wobei die PCR Amplifikation mit sequenzspezifischen Primern durchgeführt wird, die im wesentlichen aus folgender Nukleotidsequenz bestehen: a) PRIMER 1: 5'-CAA GCA CCA AAA GAG GAA-3' b) PRIMER 2: 5'-CAC CAG GTT TAA CGA CAT-3' und wobei optional das PCR-Produkt markiert wird durch die Inkorporation eins markierten Nukleotides, oder das PCR-Produkt nach der Amplifikation vor der Hybridisierung markiert wird, oder optional einer oder beide markiert sind bevor die PCR-Reaktion initiiert wird.
Vorrichtung zur Identifikation eines klinisch relevanten Staphylococcus aureus Stammes umfassend eine feste Phase, mit einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen nach den Ansprüchen 3 oder 4.
Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die feste Phase ausgewählt ist aus der Gruppe, welche Nukleinsäure Array Mebranen, Nitrozellulose, geladene Nitrozellulose, ungeladene Nitrozellulose, Nylonmembranen, geladene Nylonmembranen, ungeladene Nylonmembranen, Glass-Arrays, umfasst.
Kit zur Identifikation klinisch relevanter Staphylococcus aureus Stämme umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach den Ansprüchen 3 bis 5 oder eine Vorrichtung nach den Ansprüchen 12 bis 13.