DE60225844T2

DE60225844T2 - Micelle-zusammensetzungen enthaltend pegylierten phospholipide und einen photosensibilisator

Info

Publication number: DE60225844T2
Application number: DE60225844T
Authority: DE
Inventors: Theresa Mary Edmonton ALLEN; Ronald Erwin North Vancouver BOCH; Anthony S. K. Vancouver BOEY
Original assignee: University of Alberta; QLT Inc; Quadra Logic Technologies Inc
Current assignee: University of Alberta; Novelion Therapeutics Inc
Priority date: 2001-11-02
Filing date: 2002-11-01
Publication date: 2009-04-09
Anticipated expiration: 2022-11-02
Also published as: DE60225844D1; AU2002336867A1; WO2003037295A2; ATE390121T1; CA2466103A1; US20040013717A1; EP1465590A2; CA2466103C; ES2306785T3; WO2003037295A3; EP1465590B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) und lipidhältigen amphipathischen Molekülen in Mizellen und deren Verwendung zur Zufuhr von chemisch und biologisch aktiven Mitteln. Die Mizellen der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich für die rasche Freisetzung solcher Mittel. Ein Beispiel für ein Mittel, das durch die Mizellen der vorliegenden Erfindung zugeführt werden kann, ist ein Photosensibilisator (Photosensitizer), der für pharmazeutische, landwirtschaftliche oder gewerbliche Anwendungen nützlich ist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung und Anwendung der Mizellen als Zufuhrsystem für einen oder mehrere Wirkstoffe.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Während viele Wirkstoffe hydrophob oder auf andere Weise wasserunlöslich sind, werden sie oft in einem Umfeld auf Wasserbasis oder auf andere Weise wässrigen Umfeldern gebraucht. Daher wurden zahlreiche Systeme als Zufuhrträger für solche Mittel entwickelt. Diese umfassen die Verwendung von organischen Lösungsmitteln, Wasser/Detergens-Gemischen, Gemischen von wässrigen/organischen Lösungsmitteln (wie z. B. Hilfslösungsmittel), Emulsionen, Liposomen und Mizellen. Parikh et al., US-Patent Nr. 5.922.355 , offenbaren beispielsweise Mikroteilchen, die unlösliche Substanzen umfassen.
Liposomsysteme wurden auch verbessert. Liposomsysteme wurden beispielsweise modifiziert, um deren Stabilität und Zirkulationsdauer (siehe beispielsweise US-Patente Nr. 4.837.028 und 4.920.016 ) sowie deren Fähigkeit zu verbessern, auf bestimmte Zellen oder Gewebe abzuzielen (siehe beispielsweise US-Patente 5.527.528 und 5.620.689 ).
Mizellen wurden eingesetzt, um Patienten Medikamente zuzuführen (Brodin et al., Acta Pharm. Suec. 19, 267–284 (1982)), und Mizellen wurden als Arzneimittelträger und für die gerichtete Arzneimittelzufuhr verwendet (Supersaxo et al., Pharm. Res. 8, 1286–1291 (1991)), einschließlich der Zufuhr von Krebsmedikamenten (Fung et al., Biomater. Artif. Cells Artif. Organs 16, 439f. (1988), und Yokoyama et al., Cancer Res. 51, 3229–3236 (1991)). Lasic (Nature, Band 355, S. 379–380 (1992)) beschreibt die Verwendung gemischter Mizellen, die ein Arzneimittel und biologische Lipide umfassen.
Amphipathische Moleküle, die lipide und hydrophile (wie z. B. Polyethylenglykol (PEG)) Anteile umfassen, sind Tenside, die dazu neigen, in wässriger Lösung spontan kolloidale Aggregate zu bilden, die als Mizellen bekannt sind, wenn der Monomergehalt über einer bestimmten kritischen Mizellenkonzentration (CMC) liegt. Siehe beispielsweise Kwun et al., „Polymeric micelles as new drug carriers", Adv. Drug Del. Rev. 21, 107–116 (1996), und Bedu-Addo et al., „Effects of polyethyleneglycol chain length and phospholipid acyl chain composition an the interaction of polyethyleneglycol-phospholipid conjugates with phospholipid: implications in liposomal drug delivery", Pharm. Res. 13, 710–717 (1996).
Mizellen sind als langsam freisetzende und lang zirkulierende Arzneimittelzufuhrträger von großem Interesse. Siehe beispielsweise Yokoyama et al., „Toxicity and antitumor activity against solid tumors of micelle-forming polymeric anticancer drug and its extremely long circulation in blood", Cancer Res. 51, 3229–3236 (1991), und Trubetskoy et al., „Use of polyethylene-lipid conjugate as long circulating carriers for delivery of therapeutic and diagnostic agents", Adv. Drug Del. Rev. 16, 311–320 (1995).
Es gibt jedoch Situationen, in denen eine raschere Freisetzung eines hydrophoben Mittels zu bevorzugen ist. Ein Beispiel ist die herkömmliche photodynamische Therapie (PDT), die im Allgemeinen eine lokale oder systemische Verabreichung eines Photosensibilisator-Arzneimittels oder einer Photosensibilisator-Verbindung an einen Rezipienten und die anschließende Bestrahlung mit Licht umfasst, das durch den Photosensibilisator im zu behandelnden Gewebe oder Organ absorbiert werden kann. Während manche Photosensibilisatoren, wie z. B. Photofrin^® (Axcan Pharmaceuticals, Kanada), als Teil einer einfachen wässrigen Lösung zugeführt werden können, neigen andere hydrophobe Photosensibilisatoren dazu, in wässrigen Lösungen durch das Stapeln von Molekülen Aggregate zu bilden, was den folgenden Pho tosensibilisierungsprozess empfindlich beeinträchtigen kann (Siggel et al., J. Phys. Chem. 100(12), 2070–2075 (Dez. 1996)).
Hydrophobe Photosensibilisatoren von großem Interesse umfassen Verbindungen auf der Basis von Polypyrrol-Makrozyklen und insbesondere grüne Porphyrine, wie z. B. BPD-MA (Benzoporphyrinderivat-Monosäure-Ring-A). Diese Verbindungen waren eine gewisse Zeit in Kombination mit Licht als nützlich zur Behandlung und Diagnose verschiedener Erkrankungen, einschließlich Tumoren, Angiogenese und Neovaskularisation, Restenose und Atherosklerose-Plaques und rheumatoider Arthritis, bekannt. Porphyrine neigen auf natürliche Weise dazu, sich in malignem oder wucherndem Gewebe „anzuordnen", wo sie Licht mit bestimmten Wellenlängen bei Bestrahlung absorbieren. Das absorbierte Licht kann eine zytotoxische Wirkung in den Zellen, in denen sich die Porphyrine angeordnet haben, und in benachbarten Zellen hervorrufen. (Siehe z. B. Diamond et al., Lancet 2, 1175–1177 (1972); Dougherty et al., „The Science of Photo Medicine", 625–638, Regan et al. (Hrsg.) (1982), und Dougherty et al., „Cancer: Principles and Practice of Oncology", 1836–1844, DeVita Jr. et al. (Hrsg.) (1982).) Es wurde postuliert, dass die zytotoxische Wirkung von Porphyrinen auf die Bildung von Singulett-Sauerstoff bei Bestrahlung mit Licht zurückzuführen ist (Weishaupt et al., Cancer Research 36, 2326–2329 (1976)).
Eine Gruppe modifizierter Porphyrine, die als „grüne Porphyrine" (Gp) bekannt sind und ein oder mehrere Lichtabsorptionsmaxima zwischen etwa 670 und 780 nm aufweisen, sind von besonderem Interesse. Es wurde gezeigt, dass diese Gp-Verbindungen, wenn sie in Verbindung mit Licht eingesetzt werden, in einer geringeren Konzentration als jene, die für Hämatoporphyrin oder HPD erforderlich ist, Zytotoxizität gegen Zielzellen verleihen. Gp-Verbindungen können unter Einsatz von Diels-Alder-Reaktionen von Protoporphyrin mit verschiedenen Acetylen-Derivaten unter geeigneten Bedingungen erhalten werden. Bevorzugte Gp-Formen sind Hydromonobenzoporphyrin-Derivate („BPDs") sowie BPD-MA (einschließlich einer Verbindung, die unter dem generischen Namen Verteporfin bekannt ist), EA6 (einschließlich einer als QLT0074 bekannten Verbindung) und insbesondere B3. Die Herstellung und Verwendung von Gp- und BPD-Verbindungen sind in den US-Patenten Nr. 4.920.143 , 4.883.790 und 5.095.030 offenbart, die in die Offenbarung der vorliegenden Anmeldung durch Verweis aufgenommen sind. Die Herstellung und Verwendung von EA6 und B3 sind in den US-Patenten Nr. 6.153.639 bzw. 5.990.149 offenbart, die ebenfalls durch Verweis hierin aufgenommen sind.
Viele wünschenswerte Hydromonobenzoporphyrin-Photosensibilisatoren, wie z. B. BPD-MA, sind nicht nur bei physiologischen pH-Werten nicht in Wasser löslich, sondern auch in pharmazeutisch annehmbaren wässrigen organischen Hilfslösungsmitteln nicht löslich. Aus diesem Grund wurden liposomale Formulierungen von BPD-MA (Verteporfin) und Zinkphthalocyanin (CIBA-Geigy Ltd., Basel, Schweiz) eingesetzt. Das Liposom wirkt im Fall von BPD-MA als passives Zufuhrmittel, das den Photosensibilisator unmittelbar bei der Injektion in den Blutstrom auf Plasmalipoproteine, wie z. B. Lipoproteine mit geringer Dichte (LDL), überträgt. Die höhere Oberflächenexpression von LDL-Rezeptoren in rasch wuchernden Geweben liefert ein gewisses Maß an Selektivität für die Anordnung hydrophober, mit LDL assoziierter Arzneimittel an den Zielstellen für die PDT.
Auf ähnliche Weise wurden Hämatoporphyrin (HP) und Hämatoporphyrindimethylester in einschichtigen Bläschen aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Liposomen aus Dimyristoyl-(DMPC) und Distearoylphosphatidylcholin formuliert. Zhou et al., s. o.; Richelli, New Directions in Photodynamic Therapy 847, 101–106 (1987); Milanesi, Int. J. Radiat. Biol. 55, 59–69 (1989). HP, Porfimernatrium und Tetrabenzoporphyrine wurden in Liposomen aus Eiphosphatidylcholin (EPC) formuliert. Johnson et al., Proc. Photodynamic Therapy: Mechanisms II, Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 1203, 266–280 (1990).
Ferner wurden gefriergetrocknete Formulierungen hergestellt, die einen Porphyrin-Photosensibilisator, ein Disaccharid oder Polysaccharid und ein oder mehrere Phospholipide (wie z. B. EPG und DMPC) umfassen. Diese Formulierungen bilden bei Lösung in einem geeigneten wässrigen Träger Liposomen, die eine wirksame Menge Porphyrin-Photosensibilisator enthalten, und sind in Desai et al., US-Patent Nr. 6.074.666 , beschrieben, das durch Verweis hierin aufgenommen ist. Verfahren zur Herstellung von DMPC/EPG-Liposomen, die einen Photosensibilisator enthalten, in großem Ausmaß sind in US-Patent Nr. 5.707.608 beschrieben, das durch Verweis hierin aufgenommen ist, als ob es vollständig angeführt wäre.
Bei einer PDT wird die rasche Freisetzung des Photosensibilisators (PS) durch das Zufuhrsystem oft bevorzugt, um die Verabreichung einer wirksamen Dosis aktivierenden Lichts innerhalb einer angemessen kurzen Zeit nach der PS-Verabreichung zu ermöglichen. Eine rasche Freisetzung ermöglicht auch, dass die Clearance des PS aus dem Individuum stattfindet, um eine störende Aktivierung durch Umgebungslicht nach der Zufuhr von aktivierendem Licht zu minimieren.
Zusätzlich dazu ist ein PS-Zufuhrsytem für die PDT vorzugsweise einfach, nichttoxisch (biologisch abbaubar oder leicht auszuscheiden), chemisch inert, ökonomisch und leicht einzusetzen, wobei das Arzneimittel in einer relativ unaggregierten Form mit einer verlängerten Lagerungsdauer (vorzugsweise als feste Formulierung) gehalten wird. Der tatsächliche Zufuhrträger sollte wirksam zur Zufuhr des Photosensibilisators, zur Verwendung leicht zu verdünnen und für den Fall, dass Autoklavieren oder Gammastrahlung nicht geeignet sind, für eine Sterilisation mittels Filtration geeignet sein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Mizellenzusammensetzungen, die kovalent an Phospholipide gebundenes Polyethylenglykol (PEG) umfassen, sowie Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung bereit. Während die Zusammensetzungen als Träger dienen können, um ein beliebiges chemisch oder biologisch aktives Mittel zu enthalten oder zuzuführen, dienen sie vorzugsweise als Träger für Photosensibilisatoren. Im Gegensatz zu einigen PEG-Mizellen-Systemen, die nach dem Stand der Technik beschrieben wurden, wurde herausgefunden, dass die Mizellenzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, einen Wirkstoff in vivo in Abhängigkeit von dem ausgewählten Photosensibilisator relativ rasch freizusetzen, und somit ein Potential aufweisen, zahlreichen Bedürfnissen und Formulierungsanforderungen von Photosensibilisator-Zufuhrsystemen gerecht zu werden. Es wurde auch herausgefunden, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen hydrophobe Mittel bei einem geringen Lipid-Wirkstoff-Verhältnis (Gesamtverhältnis) in nicht aggregierter Form und in einer relativ hohen Konzentration halten. Die Lipide der Mizellen können selbstverständlich zusätzlich zu einem PEG-hältigen Phospholipid andere Lipide oder Phospholipide enthalten.
Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Herstellung der zuvor genannten Zusammensetzungen bereit. Diese Verfahren umfassen die Kombination eines Wirkstoffs, wie z. B. eines Photosensibilisators (PS), und eines oder mehrerer PEG-hältiger Phospholipide, die in der Lage sind, Mizellen zu bilden, worauf bei Wunsch die Umwandlung in eine feste Form folgt. Die Zusammensetzungen in fester Form, die den Wirkstoff (wie z. B. einen PS) und die PEG-hältigen Phospholipide enthalten, können zur Lagerung und Verwendung in fester Form verbleiben oder mit einer wässrigen Lösung hydratisiert werden, ohne dass es zu einem Verlust der physikalischen Eigenschaften der Mizellen kommt. Die Zusammensetzungen in fester Form können so formuliert sein, dass sie eine oder mehrere hydratationsverbessernde Verbindungen umfassen, die die Hydratation der Mizellen einfacher, rascher und/oder effizienter machen. Eine schematische Darstellung der Mizellen der vorliegenden Erfindung ist in 1 angeführt.
Die Zusammensetzungen können vor oder nach der Hydratation ferner mit anderen pharmazeutisch annehmbaren Mitteln kombiniert werden. Die feste oder hydratisierte Form der Zusammensetzung kann in Dosen aufgeteilt werden, die zur Verabreichung einer wirksamen Menge des Photosensibilisators an ein Individuum geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Verabreichung von Mizellen an Individuen, die bestimmter Wirkstoffe bedürfen, bereit. Im Fall von Photosensibilisatoren werden die Mizellen an Individuen verabreicht, die einer photodynamischen Therapie unterzogen werden.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung der reversiblen Wechselwirkung eines hydrophoben Arzneimittels mit konjugierten Polyethylenglykol-Lipid-Mizellen.
2 ist ein Diagramm, das die Messung der kritischen Mizellenkonzentration (CMC) von P2K-DSPE vor und nach der Integration von QLT0069 zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
DEFINITIONEN
Vor der Beschreibung der Erfindung ist es für das Verständnis derselben hilfreich, zunächst Definitionen bestimmter Bezeichnungen anzuführen, die nachstehend verwendet werden.
Die Bezeichnung „amphipathisch" oder „amphipathisches Molekül" bezieht sich auf das Vorhandensein einer hydrophoben und einer hydrophilen Gruppierung in einem einzigen Molekül. Die hydrophobe Gruppierung kann lipophil sein und die hydrophile Gruppierung polar und/oder geladen. Hydrophob bezieht sich auf eine Substanz oder einen Teil davon, die/der in einem nicht polaren Lösungsmittel besser löslich ist als in einem polaren Lösungsmittel. Hydrophil bezieht sich auf eine Substanz oder einen Teil davon, die/der in einem polaren Lösungsmittel besser löslich ist als in einem nicht polaren Lösungsmittel. Bevorzugte amphipathische Moleküle der vorliegenden Erfindung sind jene, die in der Lage sind, selbst Mizellen auszubilden. Ein bevorzugter hydrophiler Teil für die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung umfasst Polyethylenglykol (PEG).
„Mizelle" bezieht sich auf ein kolloidales Aggregat aus amphipathischen Molekülen in einer Konzentration über der kritischen Mizellenkonzentration (CMC). Mizellen unterscheiden sich dadurch von Liposomen, dass die Liposomen eine oder mehrere Lipiddoppelschichten umfassen, während das bei Mizellen nicht der Fall ist. Weiters ist der hydrophobe (lipophile) „Schwanz"-Abschnitt des Phospholipids im Allgemeinen in Richtung des Inneren der Mizelle ausgerichtet. Vorzugsweise weisen Mizellen einen „Schwanz"-Abschnitt auf, der im Allgemeinen in Richtung des Zentrums der Mizelle ausgerichtet ist. Mizellen weisen keine Doppelschichtstruktur auf und werden deshalb nicht als Bläschen oder Liposomen erachtet. Mizellen können auch in umgekehrter Ausrichtung ausgebildet werden, wobei die hydrophoben Teile der amphipathischen Moleküle in Richtung des Äußeren der Mizelle ausgerichtet sind, während die hydrophilen Teile des Moleküls in Richtung des Inneren der Mizelle ausgerichtet sind. Mizellen der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise klein (weniger als 200 nm) und enthalten hohe Konzentrationen eines Wirkstoffs, wie z. B. annähernd oder etwa 2 mg/ml, in einem geringen (molaren) Lipid:Wirkstoff-Verhältnis. Mizellen mit mittleren Durchmessern von weniger als etwa 30 nm sind noch bevorzugter. Noch bevorzugter weisen sie mittlere Durchmesser von weniger als etwa 20 nm auf. Mizellen der vorliegenden Erfindung enthalten einen Photosensibilisator, wie z. B. QLT0069, vorzugsweise in Konzentrationen von etwa 2 mg/ml.
„Lipid" bezieht sich auf eine hydrophobe Substanz. Vorzugsweise handelt es sich um Fettsäuren mit zumindest 10 Kohlenstoffatomen, noch bevorzugter etwa 12, etwa 14, etwa 16, etwa 18, etwa 20, etwa 22 oder etwa 24 Kohlenstoffatomen. Fettsäureketten mit mehr als 24 Kohlenstoffatomen sowie andere hydrophobe Substanzen, wie z. B., aber nicht ausschließlich, Cholesterin, können ebenfalls eingesetzt werden. Die Fettsäureketten können vollständig oder teilweise gesättigt sein. Bestimmte Fettsäureketten haben Namen (gefolgt von der Anzahl der Kohlenstoffatome, die sie aufweisen) wie z. B. Laurat (12C), Myristat (14C), Palmitat oder Palmitoleat (16C), Stearat oder Oleat oder Linoleat oder Linolenat (18C), Arachidat oder Arachidonat (20C) oder Behenat (22C) und Lignocerat (24C).
„Phospholipid" bezieht sich auf amphipathische Moleküle, die einen Lipidteil und einen phosphorhältigen hydrophilen Teil umfassen. In Molekülen, die Glycerin umfassen, handelt es sich bei dem hydrophilen Teil vorzugsweise um Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin oder Phosphatidylinosit. in besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Phospholipid um Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE).
Wie hierin verwendet bezieht sich Polyethylenglykol oder PEG auf Verbindungen mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 100 und 10.000 Dalton, abhängig von der Anzahl der Ethylenoxideinheiten in der Polymerkette. Bevorzugte Molekulargewichte (MG) liegen im Bereich von etwa 500 bis etwa 10.000, etwa 1000 bis 10.000 (oder etwa 22 bis 220 Ethylenoxideinheiten), etwa 2000 bis 10.000 und etwa 3000 oder 4000 bis 10.000. Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind PEG mit einem Molekulargewicht von etwa 2000, wenngleich Molekulargewichte von etwa 5000, etwa 6000, etwa 7000 und etwa 8000 in der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung auch eingesetzt werden können. In besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird PEG mit einem MG von 2000 mit DSPE eingesetzt.
„Grüne Porphyrine" sind Porphyrin-Derivate, die durch das Umsetzen eines Porphyrin-Nucleus mit einem Alkin in einer Diels-Alder-Reaktion zum Erhalt eines Monohydrobenzoporphyrins erhalten werden.
Zusätzlich zu der Mizelle und den mizellenhältigen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Formulierung der Mizellen bereit. In einer Ausführungsform umfassen diese Verfahren das Lösen des amphipathischen Moleküls, wie z. B. PEG₂₀₀₀-DSPE, und eines oder mehrerer Wirkstoffe in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. Dichlormethan, worauf das Entfernen des Lösungsmittels zur Ausbildung eines Dünnfilms folgt. Der Dünnfilm kann mit einem wässrigen Lösungsmittel zur Bildung einer Mizellen umfassenden Lösung zur Verabreichung oder Anwendung oder Sterilisation mittels eines 0,22-μm-Filters hydratisiert werden. Der Film kann auch in mehrere Teile geteilt werden, bevor diese dann einzeln hydratisiert werden. Alternativ dazu können die Mizellen durch die Zugabe eines mischbaren flüchtigen Lösungsmittels, das einen PS und PEG-Lipid enthält, zu einer wässrigen Phase so erhalten werden, dass die organische Phase entfernt wird (z. B. durch Erhitzen des Gemischs), wobei der wässrige mizellenhältige PS in Lösung zurückbleibt. Verschiedene Wirkstoffmengen können innerhalb geeigneter Bereiche des (molaren) Lipid:Wirkstoff-Verhältnisses eingesetzt werden. Bevorzugte Verhältnisse liegen im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 10 oder etwa 20. Verhältnisse von etwa 0,5, etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 8 und etwa 9, etwa 10 bis etwa 19 können eingesetzt werden. Bevorzugte Verhältnisse für die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung liegen im Bereich von etwa 2 bis etwa 6 oder etwa 6 bis etwa 10. Zusätzlich dazu sind die dazwischen liegende Verhältnisse innerhalb des Bereichs, wie z. B. von etwa 4,1:1 bis 4,9:1, etwa 5,1:1 bis 5,9:1, etwa 6,1:1 bis 6,9:1, etwa 7,1:1 bis 7,9:1 und etwa 8,1:1 bis 8,9:1, ebenfalls Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Die Hydratation erfolgt mit einer beliebigen geeigneten wässrigen Lösung, einschließlich gepufferter und nicht gepufferter Lösungen (wie z. B. destilliertes Wasser oder Wasser für Injektionen). Wenn gepufferte Lösungen eingesetzt werden, sind sie vorzugsweise bei einem pH von etwa 5 bis etwa 9, noch bevorzugter bei einem pH von etwa 5,5, etwa 6,0, etwa 6,5, etwa 7,0, etwa 7,5, etwa 8,0 und etwa 8,5 gepuffert. Beispiele für gepufferte Lösungen umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, 2 oder 20 mM phosphatgepufferte Lösungen.
Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen ferner die Verabreichung wirkstoffhältiger Mizellen als Zufuhrträger an ein Individuum, das des Wirkstoffs bedarf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Wirkstoff nicht um ein Polypeptidmolekül oder ein Polypeptid, das mehr als etwa 15 oder etwa 25 Aminosäuren umfasst. Stattdessen ist der Wirkstoff vorzugsweise ein kleines organisches Molekül mit einem Molekulargevvicht von mehr als 600 Dalton. Mizellen der vorliegenden Erfindung können beispielsweise eingesetzt werden, um Rezipienten, die einer PDT-Behandlung unterzogen werden, Photosensibilisator-Verbindungen zuzuführen.
Photosensibilisatoren (Photosensitizer)
Die Erfindung kann unter Verwendung einer Vielzahl synthetischer und natürlich vorkommender Photosensibilisatoren auf Pyrrolbasis umgesetzt werden, einschließlich Prodrugs, wie z. B. 5-Aminolävulinsäure, Porphyrinen und Porphyrin-Derivaten, wie z. B. Chlorinen, Bacteriochlorinen, Isobacteriochlorinen, Phthalocyanin und Naphthalocyaninen und anderen tetra- oder polymakrozyklischen Verbindungen, sowie verwandter Verbindungen (z. B. Pyropheophorbiden, Sapphyrinen und Texaphyrinen) und Metallkomplexen (wie z. B., ohne auf diese beschränkt zu sein, Zinn, Aluminium, Zink, Lutetium). Tetrahydrochlorine, Purpurine, Porphycene und Phenothiazinium sind auch Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Besonders bevorzugte Photosensibilisatoren umfassen grüne Porphyrine, wie z. B. BPD-MA, EA6 und B3. Im Allgemeinen kann jede makrozyklische photosensible Polypyrrol- oder Tetrapyrrolverbindung, die hydrophob ist, in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Beispiele für diese und weitere Photosensibilisatoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, Agelicine, einige biologische Makromoleküle, wie z. B. Lipofuscin, Photosystem-II-Reaktionszentren und D1-D2-cyt-b-559-Photosystem-Il-Reaktionszentren, Chalcogenapyrriliumfarbstoffe, Chlorine, Chlorophylle, Cumarine, Cyanine, Kerstin-DNA und verwandte Verbindungen, bestimmte Arzneimittel, wie z. B. Adriamycin, Afloqualon, Amodiaquin, Daunomycin, Daunomycinon, bestimmte Flavine, Riboflavine, Fullerene, Metalloporphyrine, Metallphthalocyanine, Methylenblau-Derivate, Naphthalimide, Naphthalocyanine, bestimmte natürliche Verbindungen, wie z. B. Kynurenine; Sanguinarin, Berberin, Carman und 5,7,9(11),22-Ergostatetraen-3-ol, Nilblau-Derivate, NSAID (nicht steroide, entzündungshemmende Arzneimittel), Perylenchinone, Phenole, Pheophorbide, Pheophytine, Photosensibilisator-Dimere und -Konjugate, Phthalocyanine, Porphycene, Prophyrine, Psoralene, Purpurine, Chinone, Retinoide, Rhodamine, Thiophene, Verdine, Vitamine und Xanthen-Farbstoffe (Redmond und Gamlin, Photochem. Photobiol. 70(4), 391–475 (1999)).
Beispiele für Angelicine umfassen jene, die mit Aceto- oder Methylgruppen an der 3-, 4'-, 4-, 5' und/oder 6-Position modifiziert sind.
Beispiele für Chalcogenapyrilium-Farbstoffe umfassen Pyrilium-, Selenopyrilium-, Thiopyrilium- und Telluropyriliumperchlorate.
Beispiele für Chlorin-Farbstoffe umfassen 5-Azachlorindimethylester-Derivat; 5,10,15,20-Tetrakis(m-hydroxyphenyl)bacteriochlorin; Benzoporphyrinderivat-Monosäure-Ring-A; Benzoporphyrinderivat-Monosäure-Ring-A; 7-[2-(Dimethylamino)-2-oxoethyl]-8-ethyliden-7,8-dihydro-3,7,12,17-tetramethylporphin-2,18-dipropansäuredimethylester; Z-7-[2-(Dimethylamino)-2-oxoethyl]-8-ethyliden-8-ethyl-7,8-dihydro-3,7,12,17-tetramethylporphin-2,18-dipropansäuredimethylester; Z-ECHL-7-[2-(Dimethylamino)-2-oxoethyl]-8-ethyliden-8-ethyl-7,8-dihydro-3,7,12,17-tetramethylporphin-2,18-dipropansäuredimethylester; Z-7-[2-(Dimethylamino)-2-oxoethyl]-8-ethyliden-8-n-heptyl-7,8-dihydro-3,7,12,17-tetramethylporphin-2,18-dipropansäuredimethylester; Zinn(II)-Z-7-[2-(dimethylamino)-2-oxoethyl]-8-ethyliden-8-n-heptyl-7,8-dihydro-3,7,12,17-tetramethylporphin-2,18-diprcipansäuredimethylester; Chlorin-e₆; Chlorin-e₆-dimethylester; Chlorin-e₆-k₃; Chlorin-e₆-monomethylester; Chlorin-e₆-Na₃; Chlorin-p₆; Chlorin-p₆-trimethylester; Z-7-[2-(Dimethylamino)-2-oxoethyl]-8-ethyliden-8-n-heptyl-7,8-dihydro-3,7,12,17-tetramethylchlorinderivatzink(III)-porphin-2,18-dipropansäuredimethylester; 13¹-Desoxy-20-formyl-vic-dihydroxybacteriochlorin-di-tert-butylaspartat; 13¹-Desoxy-20-formyl-4-ketobacteriochlorin-di-tert-butylaspartat; Di-L-aspartylchlorin-e₆; Mesochlorin; 5,10,15,20-Tetrakis-(m-hydroxypehnyl)chlorin; meta-(Tetrahydroxyphenyl)chlorin; Methyl-13¹-desoxy-20-formyl-4-ketobacteriochlorin; Mono-L-aspartylchlorin-e₆; Photoprotoporphyrin-IX-dimethylester; Phycocyanobilindimethylester; Protochlorphyllid a; Zinn(IV)-chlorin-e₆; Zinnchlorin-e₆; Zinn-L-aspartylchlorines; Zinnoctaethylbenzochlorin; Zinn(IV)-chlorin; Zinkchlorin-e₆ und Zink-L-aspartylchlorin e6.
Beispiele für Chlorophyll-Farbstoffe umfassen die Chlorophylle a und b; die Bacteriochlorophylle a, b, c oder d und amphiphile Derivate davon.
Beispiele für Cumarine umfassen Methoxycumarine; Thenoylcumarine; Khellin; RG 708; RG277 und Visnagin.
Beispiele für Cyanine umfassen Benzoselenazol-Farbstoff; Benzoxazol-Farbstoff; Oxacarbocyanine; Thiacarbocyanine; Selenacarbocyanine; Kryptocyanin; Benzoxazol-Derivate; Chinolin-Derivate und Merocyanine.
Beispiele für Fullerene umfassen C₆₀; C₇₀; C₇₆; Dihydrofullerene; Buckminster-Fullerene und Tetrahydrofullerene.
Beispiele für Metalloporphyrine umfassen Chlortexaphyrinnitrate; Cadmium- oder Cobalt- oder Kupfer- oder Europium- oder Gallium- oder Lutetium- oder Magnesium- oder Mangan- oder Nickel- oder Palladium- oder Platin- oder Samarium- oder Silber- oder Zinn- oder Zinkporphyrine, Tetrabenzoporphyrine, Porphine, Texaphyrine, Hämatoporphyrine, Tetrabenzoporphyrine, Tetraphenylporphyrine, Chlortexaphyrine, Porphyrazine; Zinkprotoporphyrin und Zinkprotoporphyrin IX.
Beispiele für Metallophthalocyanine umfassen Aluminium-, Chloraluminium-, Cobalt- oder Kupfer- oder Dichlorsilicium- oder Gallium- oder Germanium- oder Blei- oder Magnesium- oder Nickel- oder Palladium- oder Ruthenium- oder Silicium- oder Zinn- oder Vanadiumphthalocyanine (gegebenenfalls Sulfonate, Disulfonate, Trisulfonate und Tetrasulfonate davon).
Beispiele für Naphthalimidblau-Derivate umfassen N,N'-Bis(hydroperoxy-2-methoxyethyl)-1,4,5,8-naphthaldiimid; N-(Hydroperoxy-2-methoxyethyl)-1,8-naphthalimid; 1,8-Naphthalimid; N,N'-Bis(2,2-dimethoxyethyl)-1,4,5,8-naphthaldiimid und N,N'-Bis(2,2-dimethylpropyl)-1,4,5,8-naphthaldiimid.
Beispiele für Naphthalocyanine umfassen Aluminium- oder Silicium- oder Zinknaphthalocyanine, Chlornaphthalocyanine, t-Butylnaphthalocyanine, Amidonaphthalocyanine, Tetraaminonaphthalocyanine, Tetrabenzamidonaphthalocyanine, Tetrahexylamidonaphthalocyanine, Tetramethoxyebenzamidonaphthalocyanine, Tetramethoxy naphthalocyanine, Naphthalocyanintetrasulfonate und Tetradodecylamidonaphthalocyanine.
Beispiele für Nilblau-Derivate umfassen Benzo[a]phenothiazinium.
Beispiele für Perylenchinone umfassen Hypericine, Calphostin C, Cercosporine, Elsinochrome, Phleichrome und Rubellin A.
Beispiele für Phenole umfassen 2-Benzylphenol; 2,2'-Dihydroxybiphenyl; 2,5-Dihydroxybiphenyl; 2-Hydroxybiphenyl; 2-Methoxybiphenyl und 4-Hydroxybiphenyl.
Beispiele für Pheophorbide umfassen Pheophorbid a; Methyl-13¹-desoxy-20-formyl-7,8-vic-dihydrobacterio-meso-pheophorbid a; Methyl-2-(1-dodecyloxyethyl)2-devinylpyropheophorbid a; Methyl-2-(1-heptyloxyethyl)-2-devinylpyropheophorbid a; Methyl-2-(1-hexyloxyethyl)-2-devinylpyropheophorbid a; Methyl-2-(1-methoxyethyl)-2-devinylpyropheophorbid a; Methyl-2-(1-pentyloxyethyl)-2-devinylpyropheophorbid a; Magnesiummethylbacteriopheophorbid d; Methylbacteriopheophorbid d und Pheophorbid.
Beispiele für Pheophytine umfassen Bacteriopheophytin a; Bacteriopheophytin b; Bacteriopheophytin c; Bacteriopheophytin d; 10-Hydroxypheophytin a; Pheophytin; Pheophytin a und Protopheophytin.
Beispiele für Porphyrine umfassen 5-Azaprotoporphyrindimethylester; bis-Porphyrin; Coproporphyrin III; Coproporphyrin-III-tetramethylester; Deuteroporphyrin; Deuteroporphyrin-IX-dimethylester; Diformyldeuteroporphyrin-IX-dimethylester; Dodecaphenylporphyrin; Hämatoporphyrin; Hämatoporphyrin IX; Hämatoporphyrin-Monomer; Hämatoporphyrin-Dimer; Hämatoporphyrin-Derivate; Hämatoporphyrin-IX-dihydrochlorid; Hämatoporphyrin-IX-dimethylester; Mesoporphyrindimethylester; Monoformylmonovinyldeuteroporphyrin-IX-dimethylester; Monohydroxyethylvinyldeuteroporphyrin; 5,10,15,20-Tetra(o-hydroxyphenyl)porphyrin; 5,10,15,20-Tetra(m-hydroxyphenyl)porphyrin; 5,10,15,20-Tetrakis-(m-hydroxyphenyl)porphyrin; 5,10,15,20-Tetra(p-hydroxyphenyl)porphyrin; 5,10,15,20-Tetrakis(3-methoxyphe nyl)porphyrin; 5,10,15,20-Tetrakis(3,4-dimethoxyphenyl)porphyrin; 5,10,15,20-Tetrakis(3,5-dimethoxyphenyl)porphyrin; 5,10,15,20-Tetrakis(3,4,5-trimethoxyphenyl)porphyrin; 2,3,7,8,12,13,17,18-Octaethyl-5,10,15,20-tetraphenylporphyrin; Photofrin^®; Photofrin^® II; Porphyrin c; Protoporphyrin; Protoporphyrin IX; Protoporphyrindimethylester; Protoporphyrin-IX-dimethylester; Protoporphyrinpropylaminoethylformamidiodid; Protoporphyrin-N,N-dimethylaminopropylformamid; Protoporphyrinpropylaminopropylformamidiodid; Protoporphyrinbutylformamid; Protoporphyrin-N,N-diemthylaminoformamid; Protoporphyrinformamid; Sapphyrine; Porphine; Tetrakis(4-sulfonatophenyl)porphyrin; meso-Tetra(4-N-trimethylanilinium)porphin; Uroporphyrin; Uroporphyrin IX und Uroporphyrin I.
Beispiele für Psoralene umfassen Methoxypsoralene; Dimethoxypsoralene; Carbethoxypsoralene; Pseudopsoralene; Hydroxypsoralene; Trimethylpsoralene; Allopsoralene; Isopseudopsoralene; Acetoisopseudopsoralene; Pseudoisopsoralene und Acetopseudoisopsoralene.
Beispiele für Purpurine umfassen Octaethylpurpurin; Octaethylpurpurinzink; oxidiertes Octaethylpurpurin; reduziertes Octaethylpurpurin; reduziertes Octaethylpurpurinzinn; Purpurin 18; Purpurin-18; Purpurin-18-methylester; Purpurin; Zinnethyletiopurpurin I; Zn(II)-aetiopurpurinethylester und Zinketiopurpurin.
Beispiele für Chinone umfassen Anthrachinone, Benzochinone, Hydrochinone, Chlorhydrochinone, Resorcin und 4-Chlorresorcin.
Beispiele für Retinoide umfassen All-trans-Retinal; C₁₇-Aldehyd; C₂₂-Aldehyd; 11-cis-Retinal; 13-cis-Retinal; Retinal und Retinalpalmitat.
Beispiele für Thiophene umfassen Terthiophene, Bithiophene, Diphenyltiophen; Quaterthiophene; Quaterthienyl; Tetrathiophen; Pentathiophen; Hexathiophen und Heptathiophen.
Beispiele für Verdine umfassen Kupfer(II)-verdintrimethylester; Deuteroverdinmethylester; Mesoverdinmethylester und Zinkmethylpyroverdin.
Beispiele für Vitamine umfassen Ergosterol (Provitamin D2); Hexamethyl-Co-a-Co-b-dicyano-7-de(carboxymethyl)-7,8-didehydrocobyrinat (Pyrocobester); Pyrocobester und Vitamin D3.
Bespiele für Xanthen-Farbstoffe umfassen Eosine und Eosin-Derivate, Erythrosine, Fluoresceine, Phloxine und Bengalrot.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei den bevorzugten Verbindungen für die Formulierung um die stark hydrophoben Tetrapyrrol-A- und -B-Ring-Verbindungen, wie z. B. BPD-DA, -DB, -MA und -MB. Besonders bevorzugt sind die B-Ring-Verbindungen: BPD-MB, B-EA6, B-B3, die A-Ring-Verbindungen BPD-MA, A-EA6 und A-B3 sowie Dihydroxychlorine.
Diese Verbindungen sind Porphyrinderivate, die durch das Umsetzen eines Porphyrin-Nucleus mit einem Alkin in einer Diels-Alder-Reaktion erhalten werden, um ein Monohydrobenzoporphyrin zu erhalten, und sind detailliert in dem ausgegebenen US-Patent Nr. 5.171.749 beschrieben sind, das durch Verweis vollständig hierin aufgenommen ist. Selbstverständlich kann auch eine Kombination von Photosensibilisatoren eingesetzt werden. Vorzugsweise liegt das Absorptionsspektrum des Photosensibilisators im sichtbaren Bereich, typischerweise zwischen 350 nm und 1200 nm, noch bevorzugter zwischen 400 und 900 nm und noch bevorzugter zwischen 600 und 900 nm.
BPD-MA wird beispielsweise in den US-Patenten 5.171.749 und 5.095.030 beschrieben; EA6 und B3 werden in US-Patent Nr. 5.929.105 bzw. 5.880.145 beschrieben, die alle durch Verweis hierin aufgenommen sind. Bevorzugte grüne Porphyrine weisen folgende Grundstruktur auf:
worin R⁴ Vinyl oder 1-Hydroxyethyl und R¹, R² und R³ H oder Alkyl oder substituiertes Alkyl sind und n eine ganze Zahl zwischen 0 und 6 und vorzugsweise 2 ist.
BPD-MA (Verteporfin) weist die in Formel 1 dargestellte Struktur auf, worin R¹ und R² Methyl sind, R⁴ Vinyl ist und eines der R³ H und das andere Methyl ist und n = 2 ist. B-EA6 hat die Formel 2, worin R¹ und R² Methyl sind und beide R³ 2-Hydroxyethyl (d. h. Ethylenglykolester) sind. B3 hat die Formel 2, worin R¹ Methyl ist, R² H ist und beide R³ Methyl sind und n = 2 ist. Sowohl in EA6 als auch in B3 ist R⁴ auch Vinyl.
Die Darstellungen von BPDA-MA_C und BPD-MA_D, die enantiomere Komponenten von Verteporfin sind, sowie die Darstellungen von A- und B-Ring-Formen von EA6 und B3 (worin n = 2 ist) sehen wie folgt aus:
Verwandte Verbindungen der Formeln 3 und 4 sind auch nützlich; im Allgemeinen ist R⁴ Vinyl oder 1-Hydroxyethyl, und R¹, R² und R³ sind H oder Alkyl oder substituiertes Alkyl.
Zusätzliche Beispiele für hydrophobe BPD-B-Ring-Verbindungen, die schwierig zu formulieren sind und besonders zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind untenstehend angeführt. Die Verbindung QLT0069 wird hierin in verschiedenen Beispielen eingesetzt.
Dimere Formen von grünem Porphyrin und dimere oder multimere Formen von Kombinationen von grünem Porphyrin und Porphyrin können ebenfalls eingesetzt werden.
Die dimeren und oligomeren Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Einsatz von Reaktionen hergestellt werden, die analog zu jenen zur Dimerisierung und Oligomerisierung von Porphyrinen an sich ablaufen. Die Bindungen zwischen grünen Porphyrinen und grünem Porphyrin und Porphyrin können direkt hergestellt werden, oder Porphyrine können verbunden werden, worauf eine Diels-Alder-Reaktion eines oder beider endständigen Porphyrine folgt, um diese in die entsprechenden grünen Porphyrine umzuwandeln.
Weitere nicht einschränkende Beispiele für Photosensibilisatoren, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sein können, sind photosensibilisierende Diels-Alder-Porphyrin-Derivate, die in US-Patent Nr. 5.308.608 beschrieben sind; porphyrinähnliche Verbindungen, die in den US-Patenten Nr. 5.405.957 , 5.512.675 und 5.726.304 beschrieben sind; Bacteriochlorophyll-A-Derivate, die in den US-Patenten Nr. 5.171.741 und 5.173.504 beschrieben sind; Chlorine, Isobacteriochlorine und Bacteriochlorine, die in US-Patent Nr. 5.831.088 beschrieben sind; meso-monoiodsubstituierte und meso-substituierte Tripyrranverbindungen, die in US-Patent Nr. 5.831.088 beschrieben sind; Polypyrrolmakrozyklen von meso-substituierten Tripyrranverbindungen, die in den US-Patenten 5.703.230 , 5.883.246 und 5.919.923 beschrieben sind; sowie Ethylenglykolester, die in US-Patent Nr. 5.929.105 beschrieben sind. Alle in diesem Absatz angeführten Patente sind hiermit durch Verweis hierin aufgenommen, als ob sie vollständig angeführt wären. Im Allgemeinen wären beliebige hydrophobe Photosensibilisatoren, die im UV-, sichtbaren und Infrarot-Spektralbereich absorbieren, nützlich für die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung.
Derzeit ist eine Reihe von Photosensibilisator-Arzneimitteln von Interesse hydrophob mit einer Struktur auf Tetrapyrrolbasis. Diese Arzneimittel weisen eine inhärente Tendenz auf, zu aggregieren, was die Photosensibilisierungsverfahren schwerwiegend beeinträchtigen kann (Siggel et al., J. Phys. Chem. 100(12), 2070–2075 (Dez. 1996)). Der Syntheseweg für BPD liefert beispielsweise A- und B-Ring-Zwischenprodukte in etwa äquimolaren Mengen, die dann weiter derivatisiert werden können. Es wurde festgestellt, dass die A-Ring-Derivate, wie z. B. BPD-MA (Vertepor fin), für die Zufuhr unter Einsatz herkömmlicher Mittel, wie z. B. von Liposomen, formuliert werden konnten, während sich die Formulierung von B-Ring-Verbindungen aufgrund ihrer Neigung zur Selbstbindung als schwieriger erwies. Diese Selbstbindung von BPD-B-Ring-Derivaten zu Dinieren ist in D. Delmarre et al., Can. J. Chem. 79, 1069–1074 (2001), beschrieben, das durch Verweis hierin aufgenommen ist, als ob es vollständig angeführt wäre. Während monomere B-Ring-BPD eine Hauptabsorptionsbande bei 692 nm aufweisen, absorbiert das Dinier bei 724 nm. Demnach kann die Tendenz zur Selbstbindung von B-Ring-BPD in einer bestimmten Formulierung anhand des A692/A720-Verhältnisses bewertet werden. Die in den Absorptionsspektren beobachtete Rotverschiebung ist wahrscheinlich eine Folge der Dimerbildung, wobei die Dimere aus zwei Kopf-an-Schwanz-angeordneten B-Ring-BPD-Molekülen bestehen.
In einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung können die Photosensibilisatoren der vorliegenden Erfindung vor der Formulierung der Photosensibilisatoren mit amphipathischen Molekülen an verschiedene Liganden konjugiert werden, die die Ausrichtung auf Gewebe und Zellen erleichtern. Diese Liganden umfassen solche, die rezeptorspezifisch sind, sowie Immunglobuline und Fragmente davon. Bevorzugte Liganden umfassen Antikörper im Allgemeinen und monoklonale Antikörper sowie immunologisch reaktive Fragmente davon.
Mizellen
Die Mizellen der vorliegenden Erfindung enthalten ein oder mehrere PEG-konjugierte Phospholipide. PEG-konjugierte Phospholipide sind im Handel erhältliche Reagenzien (Avanti Polar Lipis, Genzyme Pharmaceuticals, Lipoid) oder können gemäß den auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren hergestellt werden. Diese PEG-Lipid-Konjugate und deren Synthese wurden detailliert in T. M. Allen, C. Hansen, F. Martin, C. Redemann und A. Yau-Young (1991) beschrieben. Liposomen, die synthetische Lipidderivate von Poly(ethylenglykol) enthalten, weisen in vivo verlängerte Zirkulationshalbwertszeiten auf. Biochim. Biophys. Acta 1066, 29–36, das durch Verweis vollständig hierin aufgenommen ist, als ob es hier angeführt wäre. Phospho lipide, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können beliebige natürlich vorkommende oder synthetische Phospholipide sein, unabhängig davon, ob sie im Lipidabschnitt des Moleküls gesättigt oder ungesättigt sind. Diese umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, Folgende: DSPE, Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE), Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit, Phosphatidylglycerin, Phosphatidinsäure, Lysophospholipide, Ei- oder Sojaphospholipid oder Kombinationen davon. Die Phospholipide können in beliebiger Form vorliegen, einschließlich gesalzt oder entsalzt, hydriert oder teilweise hydriert oder natürlich, semisynthetisch (modifiziert) oder synthetisch.
Gesättigte Phosphatidylglycerine, Phosphatidylethanolamine oder Phosphatidylcholine sind besonders zu bevorzugen.
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen und in Anbetracht der Eigenschaft zur raschen Freisetzung der Mizellen der vorliegenden Erfindung wird angenommen, dass die Kombination von hydrophoben Wirkstoffen mit PEG-hältigen Phospholipiden dazu führt, dass der hydrophobe Wirkstoff, wenn die Formulierung verdünnt wird, bis die kritische Mizellenkonzentration (CMC) des Gemischs unterschritten ist, von den amphipathischen Molekülen weg bewegt wird. Bei intravenöser Injektion wird somit die Formulierung im Blut verdünnt, wobei diese Verdünnung demnach zu einer Unterschreitung der CMC führen sollte, um die Arzneimittelfreisetzung sicherzustellen.
Phosphatidylglycerine (PG) können ebenfalls in Mizellen der vorliegenden Erfindung vorhanden sein. Beispiele für solche PG umfassen Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG), DLPG und dergleichen.
Weitere Arten geeigneter Lipide, die verwendet werden können, umfassen Phosphatidylethanolamine (PE), Phosphatidinsäuren (PA), Phosphatidylserine und Phosphatidylinosite.
Antioxidationsmittel
In Ausführungsformen, die die Verwendung ungesättigter Phospholipide umfassen, kann die Erfindung die Verwendung von Antioxidationsmitteln umfassen, um die Oxidation der Phospholipide zu verhindern. Die Autooxidation ungesättigter Acylketten kann ein Problem für die Langzeitlagerung von Liposomformulierungen darstellen. Wenn es nicht gelingt, die oxidative Aufspaltung ungesättigter Phospholipide zu verhindern, führt das zur Entstehung von Subkomponenten, wie z. B. Lysolipiden und Fettsäuren, die in manchen Mizellenzusammensetzungen unerwünscht sein können. Antioxidationsmittel, die zur Integration in phospholipidhältige Mizellen zur Verbesserung der Langzeithaltbarkeit geeignet sind, sind als solche auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele für solche Antioxidationsmittel umfassen butyliertes Hydroxytoluol (BHT), α-Tocopherol und Ascorbylpalmitat (AP) sowie pH-Puffermittel, wie z. B. Phosphate und Glycin. Vorzugsweise ist BHT in einer Menge von etwa 0,01 bis 0,02 Gew.-% und AP in einer Menge von etwa 0,1 bis 0,2 Gew.-% vorhanden.
BHT ist hydrophob, und erwartungsgemäß sollte es in den lipophilen Bereichen der Mizellen der vorliegenden Erfindung verbleiben. BHT hat die Fähigkeit, das Kettenwachstum während der Autooxidation zu verhindern, indem es die während der oxidativen Spaltung von Lipiden gebildeten Radikale aufnimmt. Ascorbinsäure hat die Fähigkeit, als Antioxidationsmittel zu wirken und mit anderen Antioxidationsmitteln, wie z. B. α-Tocopherol, zusammenzuwirken. Es wurde gezeigt, dass das BHT/Ascorbinsäure-System eine BHT-Regeneration nach dessen Umwandlung in einen Phenoxylrest nach der Aufnahme von freien Radikalen von oxidierten Lipiden ermöglicht, wodurch es zum Auftreten von Ascorbylresten kommt. Der zuletzt angeführte Faktor rechtfertigt das oben beschriebene relative Gewichtsverhältnis von AP zu BHT. AP wurde anstelle von Ascorbinsäure eingesetzt, da die hydrophobe Natur von Ascorbinsäure erwartungsgemäß zu einer Konzentration des Antioxidationsmittels in lipophilen Umfeldern führen würde.
Eine weitere Überlegung in Zusammenhang mit Antioxidationsmitteln ist das Befüllen des Kopfraumes in Behältern mit Stickstoffgas und das Abdichten dieser Behälter. Zusätzlich dazu und aufgrund der Fähigkeit von Metallionen, oxidative Prozesse zu katalysieren, sind die Verwendung von qualitativ hochwertigen Arzneimitteln, Exzipienten und Behältern, die sorgfältige Reinigung der Herstellungsgeräte und der angemessene Einsatz von Metallionenchelatbildnern zu bevorzugen.
Kälteschutzmittel und isotone Mittel
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Mizellen mittels Lyophilisieren weiter stabilisiert werden. Erfindungsgemäße Mizellen können ein Kälteschutzmittel zur Stabilisierung während des Lyophilisierens enthalten. Alternativ dazu können die physikalischen Strukturen der Mizellen durch das Vorhandensein von ausreichend Wasser nach dem Lyophilisieren erhalten werden. Das kann durch eine geeignete Steuerung des Ausmaßes der Lyophilisierung erzielt werden.
Ein beliebiges Kälteschutzmittel, das auf dem Gebiet der Herstellung gefriergetrockneter Formulierungen als nützlich bekannt ist, wie z. B. Di- oder Polysaccharide oder andere Verdickungsmittel, wie z. B. Lysin, können in der beanspruchten Erfindung eingesetzt werden. Ferner können isotone Mittel verwendet werden, die gewöhnlicherweise zugesetzt werden, um die Isoosmolarität mit Körperflüssigkeiten aufrechtzuerhalten. In bevorzugten Ausführungsformen wird ein Di- oder Polysaccharid eingesetzt und fungiert sowohl als Kälteschutzmittel als auch als isotones Mittel. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Di- oder Polysaccharid aus der aus Lactose, Trehalose, Maltose, Maltotriose, Platinose, Lactulose oder Saccharose bestehenden Gruppe ausgewählt, wobei Lactose oder Trehalose zu bevorzugen sind. Wirksame Zucker, wie z. B. Trehalose und Lactose, sind in der Lage, anstelle von Wasser an die Phospholipid-Kopfgruppe Wasserstoffbrückenbindung zu bilden.
Die Zugabe eines Disaccharids oder Polysaccharids kann während der Herstellung des Dünnfilms erfolgen, oder alternativ dazu kann das Di- oder Polysaccharid nach der Ausbildung des trockenen Lipidfilms als Teil der wässrigen Lösung zugesetzt werden, die zur Hydratation der Mizellen eingesetzt wird.
Disaccharide oder Polysaccharide sind zu diesem Zweck gegenüber Monosacchariden vorzuziehen. Um den osmotischen Druck der erfindungsgemäßen Mizellenzusammensetzung so zu halten, dass er jenem von Blut ähnlich ist, sollten nicht mehr als 4 bis 5% Monosaccharide zugesetzt werden. Im Gegensatz dazu können etwa 9 bis 10% eines Disaccharids verwendet werden, ohne einen unannehmbaren osmotischen Druck zu erzeugen. Wenn vorhanden wird das Di- oder Polysacharid in einem bevorzugten Gewichtsverhältnis von etwa 10 bis 20 Saccharid zu 0,5 bis 0,6 Gesamtphospholipide formuliert, noch bevorzugter in einem Verhältnis von etwa 10 zu 1,5 bis 4,0. In einer Ausführungsform umfasst eine bevorzugte, aber nicht einschränkende Formulierung Lactose oder Trehalose und Gesamtphospholipide in einem Verhältnis von etwa 10 zu 0,94 bis 1,88 bzw. etwa 0,65 bis 1,30.
Gefriertrocknen
Nach deren Formulierung können die erfindungsgemäßen Mizellen bei Wunsch für die Langzeitlagerung gefriergetrocknet oder lyophilisiert werden. BPD-MA, ein bevorzugter Hydromonobenzoporphyrin-Photosensibilisator, konnte seine Wirksamkeit beispielsweise in einer gefriergetrockneten Zusammensetzung über einen Zeitraum von zumindest 9 Monaten hinweg bei Raumtemperatur aufrechterhalten, und eine Lagerungsfähigkeit von zumindest 2 Jahren wurde vorhergesagt. Wenn die Zusammensetzung gefriergetrocknet wurde, kann sie für die spätere Verdünnung mit einer geeigneten wässrigen Lösung, wie z. B. sterilem Wasser oder sterilem Wasser, das ein Saccharid und/oder andere geeignete Exzipienten enthält, die unmittelbar vor dem Einsatz erfolgt, in Phiolen verpackt werden. Die Verdünnung kann beispielsweise einfach durch die Zugabe von Wasser zur Injektion unmittelbar vor der Verabreichung erfolgen.
Verschiedene Lyophilisierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Mizellenhältige Phiolen der vorliegenden Erfindung können beispielsweise zunächst auf –45°C gefroren werden und dann über einen Zeitraum von bis zu 90 min hinweg bei dieser Temperatur gehalten werden. Darauf kann ein primärer Hochvakuumtrockenzyklus folgen, wobei die Temperatur über einen Zeitraum hinweg, der gewöhnlicherweise in der Größenordnung von etwa 50 h liegt, langsam auf bis zu etwa 10°C gesteigert wird. Darauf kann ein zweiter Trockenzyklus mit 20°C von bis zu 24 h folgen. Sobald sich der Druck der Lyophilisierungsanlage bei etwa 55 bis 65 mTorr (73–87 μbar) stabilisiert, wird der Zyklus beendet. Danach können die Phiolen nach dem Überlagern mit Stickstoffgas abgedichtet werden. Eine allgemeine Regel für das Gefriertrocknen besagt, dass für eine erfolgreiche Rehydratation ein fester, brüchiger, nicht zusammengefallener und homogener Kuchen zu bevorzugen ist.
Zusätzlich dazu kann eine Anwendung der Lyophilisierung die Hydrolyse von hydrophoben Mitteln, die für solche Reaktionen anfällig sind, verhindern. Der Photosensibilisator BPD-MA kann beispielsweise zu BPD-DA hydrolyisiert werden.
Verabreichung und Verwendung
Die in die Mizellen der vorliegenden Erfindung integrierten hydrophoben Mittel können für beliebige geeignete pharmazeutische, landwirtschaftliche oder gewerbliche Anwendungen eingesetzt werden. Mit integrierten Photosensibilisatoren können die Mizellen für Erkrankungen oder Verfahren eingesetzt werden, bei denen der Einsatz von Photosensibilisatoren in Kombination mit der Bestrahlung mit Licht oder einer anderen elektromagnetischen Strahlung angemessen ist. Diese umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, die Diagnose oder Behandlung von Krebs, die Reduktion des Spiegels aktivierter Leukozyten, die Behandlung von Augenleiden, die Behandlung und Prävention von Neovaskularisation und Angiogenese, die Zerstörung von Viren und von durch diese infizierten Zellen, die Behandlung von Atherosklerose-Plaques, die Behandlung von Restenose und dergleichen. Zusätzlich dazu können zahlreiche Photosensibilisatoren durch geeignete Anregungswellenlängen photoaktiviert werden, um sichtbar zu fluoreszieren. Diese Fluoreszenz kann dann eingesetzt werden, um einen Tumor oder ein anderes Zielgewebe zu lokalisieren. Durch die Integration hydrophober Mittel in die Mizellen der vorliegenden Erfindung kann ein effi zienteres Verpacken, eine effizientere Zufuhr und somit eine effizientere Verabreichung der Mittel erzielt werden.
Im Allgemeinen können die Mizellen der vorliegenden Erfindung so auf dieselbe oder auf ähnliche Weise eingesetzt werden wie Mizellen und Liposomen verabreicht werden. Die Konzentration des hydrophoben Mittels in den Mizellen der vorliegenden Erfindung hängt von der Natur des Mittels sowie der Art der gewünschten Verabreichungsweise ab.
Die Mizellenzusammensetzungen und -formulierungen der vorliegenden Erfindung können parenteral oder mittels Injektion verabreicht werden. Die Injektion kann intravenös, subkutan, intramuskulär, intrathekal, intratumoral oder auch intraperitoneal erfolgen. Die Mizellen können auch in Form eines Aerosols intranasal oder intrapulmonal oder topisch verabreicht werden. Formulierungen, die für eine verzögerte Freisetzung geeignet sind, sind ebenfalls Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Die zu verabreichende Menge der Mizellenformulierung mit dem hydrophoben Mittel hängt von der Wahl des Wirkstoffs, der zu behandelnden Erkrankung, der Verabreichungsart, dem jeweiligen Individuum sowie dem fachlichen Können, der Erfahrung und dem Urteil des behandelnden Arztes ab. Im Allgemeinen können Dosierungen im Bereich von 0,05 bis 10 mg/kg angemessen sein. Der zuvor angeführte Bereich stellt selbstverständlich nur einen Vorschlag dar, da die Anzahl der Variablen für eine individuelle Behandlung groß ist. Aus diesem Grund ist zu erwarten, dass es zu beträchtlichen Abweichungen von diesen empfohlenen Werten kommt. Die Menge der Mizellenformulierung mit photosensiblem Mittel, die in vivo zu verabreichen ist, kann durch einfache Untersuchungen in Bezug auf den Dosierungsbereich, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, einfach bestimmt werden.
Unter Verwendung von Photosensibilisatoren als Diagnosemittel zur Lokalisierung von Tumorgewebe oder zur Lokalisierung von Atherosklerose-Plaques werden die Mizellenzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung beispielsweise systemisch auf dieselbe allgemeine Weise verabreicht, die in Bezug auf die photodynamische Therapie bekannt ist. Die Wartezeit, um die Entfernung der Arzneimittel aus Geweben zu ermöglichen, in denen sie nicht akkumulieren, ist etwa dieselbe und beträgt beispielsweise etwa 30 min bis etwa 10 h. Nachdem eine Lokalisierung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ermöglicht wurde, wird die Stelle, an der sich das Zielgewebe befindet, durch die Detektion des Vorhandenseins des Photosensibilisators bestimmt.
Zur Diagnose können in Mizellen integrierte Photosensibilisatoren gemeinsam mit oder markiert mit einem Radioisotop oder anderen Detektionsmitteln eingesetzt werden. Wenn das der Fall ist, hängt die Wahl des Detektionsmittels von der Art der Markierung ab. Szintigraphische Markierungen wie Technetium oder Indium können unter Verwendung von Scannern ex vivo detektiert werden. Spezifische fluoreszierende Markierungen können ebenfalls eingesetzt werden, wobei es sein kann, dass diese Markierungen wie eine Detektion, die auf der Fluoreszenz der Photosensibilisatoren selbst beruht, zuvor eine Bestrahlung erfordern.
Zur Aktivierung der durch die Mizellen der vorliegenden Erfindung angewandten Photosensibilisatoren wird eine beliebige geeignete Absorptionswellenlänge eingesetzt. Diese kann unter Einsatz verschiedener Verfahren, die auf dem Gebiet der Vermittlung von Zytotoxizität oder Fluoreszenzemission bekannt sind, wie z. B. sichtbare Strahlung, einschließlich weißglühender oder fluoreszenter Lichtquellen oder Photodioden, wie z. B. Leuchtdioden, zugeführt werden. Laserlicht kann ebenfalls zur In-situ-Zufuhr von Licht zu einem lokalisierten Photosensibilisator eingesetzt werden. In einer typischen Arbeitsvorschrift werden beispielsweise wenige Minuten bis mehrere Stunden vor der Bestrahlung etwa 0,5 bis 1,5 mg/kg Mizellen, die grünen Porphyrinphotosensibilisator enthalten, intravenös injiziert und dann durch Licht mit einer angemessenen Wellenlänge – d. h. Licht mit einer Wellenlänge, die durch den Photosensibilisator absorbiert wird – angeregt.
Vorzugsweise wird elektromagnetische Strahlung, wie z. B. von ultraviolettem bis sichtbarem und infrarotem Licht, nach der Verabreichung der Zusammensetzungen und Formulierungen der vorliegenden Erfindung zugeführt. Im Allgemeinen gibt es drei bedeutende Variablen – die Konzentration des photosensibilisierenden Arzneimittels, die Intensität der eingesetzten Strahlung und die Dauer der Bestrahlung mit Licht, die die Gesamtenergiemenge bestimmt, die letztlich dem Zielgewebe zugeführt wird. Im Allgemeinen ermöglicht eine Steigerung eines dieser Faktoren eine Reduktion der anderen.
Wenn es beispielsweise wünschenswert ist, dass die Bestrahlung nur über einen kurzen Zeitraum hinweg erfolgt, kann die Strahlungsenergie oder die Arzneimittelkonzentration gesteigert werden. Wenn umgekehrt längere Bestrahlungszeiträume möglich sind, sind eine geringere Strahlungsintensität und eine geringere Arzneimittelkonzentration wünschenswert. In manchen Fällen liefert die Kombination von 0,15 mg BPD-MA/kg Körpergewicht als Arzneimitteldosierung und etwa 1–25 J/cm² Gesamtstrahlung von einer geeigneten Strahlungsquelle erfolgreiche Ergebnisse, wenn gering dosierte PDT ausreicht, um die gewünschte therapeutische Wirkung hervorzurufen. Niedrig dosierte PDT ist nützlich für Indikationen wie die Behandlung von Autoimmunerkrankungen und die Prävention von Entzündungen. Der Einsatz von niedrig dosierter PDT bietet einen zusätzlichen Vorteil in Form einer Senkung der Wahrscheinlichkeit des Auftretens von PDT-Nebenwirkungen, wie z. B. der Schädigung von Nicht-Zielgeweben. Höhere PDT-Dosierungen werden, wie in Beispiel 4 gezeigt wird, im Allgemeinen zur Zerstörung von Zielgeweben eingesetzt, wie z. B. von Tumorzellen.
Es ist klar, dass die Manipulation dieser Parameter in Abhängigkeit von der Art des zu behandelnden Gewebes und der Art des eingesetzten Photosensibilisators (PS) variiert. Im Allgemeinen wird bei einer niedrig dosierten PDT eine Kombination von Arzneimittelkonzentration, Strahlungsintensität und Gesamtenergiewerten eingesetzt, die um ein Vielfaches niedriger ist als die Kombinationen, die herkömmlicherweise zur Zerstörung von Zielgeweben, wie z. B. Tumoren oder ungewollter Gefäßneubildungen, eingesetzt werden. Ein Maß kann das Produkt von PS-Konzentration (z. B. in ng/ml) × Intensität (z. B. in mW/cm²) × Zeit (z. B. in s) sein. Es ist jedoch schwierig, absolute Werte für dieses Produkt festzulegen, da jeder der Parameter einzeln Einschränkungen unterliegt. Wenn die Intensität beispielsweise zu gering ist, wird der PS nicht kontinuierlich aktiviert; wenn die Intensität zu hoch ist, kann es zu hyperthermischen und anderen schädlichen Auswirkungen kommen. Zusätzlich dazu kann in manchen Fällen das Umgebungslicht, das an der Zielzelle oder dem Zielgewebe verfügbar ist, die/das einer PDT unterzogen wird, ausreichend sein, ohne dass zusätzliche Bestrahlung vorsätzlich zugeführt wird.
Auf ähnliche Weise können die PS-Konzentrationen nicht in einem willkürlichen Bereich variieren. Es können auch Einschränkungen in Bezug auf den Zeitraum bestehen, währenddessen Strahlung verabreicht wird. Dementsprechend stellt das Produkt der oben angeführten Gleichung nur ein grobes Maß dar. Dieser Ansatz kann jedoch einen angemessenen Index bereitstellen, der gemäß der relativen Potenz des eingesetzten PS angepasst werden kann, und im Allgemeinen würde eine Steigerung der Intensität eine kürzere Bestrahlungsdauer ermöglichen etc.
Nach der allgemeinen Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die zur Veranschaulichung bereitgestellt werden und, wenn nicht anders angegeben, nicht zur Einschränkung der vorliegenden Erfindung dienen sollen, ein besseres Verständnis derselben ermöglicht.
BEISPIEL 1
Herstellung von Dünnfilmen und Hydratation
Zur Herstellung einer 2-mg/ml-Wirkstoffformulierung wurde PEG₂₀₀₀-DSPE-Konjugat (das von Avanti Polar Lipids bezogen wurde, 1–20 mg/ml) in 15 ml Dichlormethan in einem 100-ml-Rundkolben gelöst. Dias Lipid-zu-Arzneimittel-Molverhältnis variierte von 0,5:1 bis 6:1. Das PEG₂₀₀₀-DSPE löste sich sehr rasch zu einer klaren, farblosen Lösung, wenn es einige Minuten lang händisch verwirbelt wurde. 5 mg QLT0069 oder Verteporfin wurde dann gefolgt von 10 bis 25 ml Dichlormethan zu dem Rundkolben zugesetzt. Der Kolben wurde dann zumindest 5 min lang händisch gewirbelt, bis mit freiem Auge keine ungelösten Teilchen mehr sichtbar waren. Ein Dünnfilm wurde durch das Verdampfen von Dichlormethan unter Einsatz eines Rotationsverdampfers hergestellt.
Folgende Parameter wurden zur Herstellung des Dünnfilms eingesetzt:

Wasserbadtemperatur: 35°C

Kolbenrotation: 35 U/min

Ausgangsvakuum: 600 mbar
Im Allgemeinen wurde das Vakuum in Schritten von etwa 25 mbar erhöht. Bei 300 mbar war der Großteil des Dichlormethans verdampft und der Dünnfilm ausgebildet.
Nach der Ausbildung der Dünnfilme wurden alle dünnfilmhältigen Kolben 1 h lang unter Hochvakuum (10 mbar) gehalten. In Abhängigkeit von dem pKa des PS wurden die Dünnfilme mit verschiedenen wässrigen Lösungen, wie z. B. 2,5 ml 20 mM Phosphatpuffer mit pH 8,5 oder 2,5 ml 9,2% (Gew./Vol.) Lactose, wie in den Tabellen 1, 2, 3 und 4 angeführt, hydratisiert. Die Kolben wurden in einem Rundschüttler platziert und durchschnittlich 40 min lang mit 200 U/min geschüttelt.
Alternativ dazu kann die Lösung aliquotiert und anschließend lyophilisiert werden. Vor der Hydratation kann das feste Material geschützt vor Licht auf Raumtemperatur erwärmt werden.
Hydratisierte Mizellen können sterilisiert werden, indem sich durch einen 0,22-μm-Filter oder einen kleineren Filter geleitet werden.

Die Probeergebnisse sind in den Tabellen 1, 2, 3 und 4 angeführt. Das A692/A720-Verhältnis wurde eingesetzt, um die relative Menge von QLT0069 in Monomerform (A692) im Vergleich mit der aggregierten Dimerform (A720) zu bestimmen (Tabellen 1 und 2). Die Tendenz von B-Ring-BPD zur Selbstbindung zur Bildung von Dimeren ist in D. Delmarre et al., Can. J. Chem. 79, 1069–1074 (2001), beschrieben. Talelle 1. Hydratation von PEG₂₀₀₀-DSPE/QLT0069-Mizellen mit Puffern mit verschiedenen pH-Puffern.

Lipid:Arzneimittel (mol:mol)	[Arzneimittel] (mg/ml)	Hydratationslösung	% filtriert (0,22-μm-Filter)	A692/A720
5:1	1	5DW pH 4,0	Filter blockiert	0,68
5:1	1	destilliertes Wasser	87,8	1,03
5:1	1	Salzlösung pH 5,5	95,5	1,02
5:1	1	Phosphatpuffer 20 mM pH 5,5	87,5	1,75
5:1	1	Phosphatpuffer 20 mM pH 7,0	87,8	2,74
5:1	1	Phosphatpuffer 20 mM pH 7,5	98,3	3,90
5:1	1	Phosphatpuffer 20 mM pH 8,0	97,6	29,9
5:1	1	Phosphatpuffer 20 mM pH 8,5	99,7	24,8
5:1	2	Phosphatpuffer 20 mM pH 7,5	97,1	2,40
5:1	2	Phosphatpuffer 20 mM pH 7,5	105,3	1,29
5:1	2	destilliertes Wasser	91,0	0,85
7:1	2	Phosphatpuffer 20 mM pH 7,5	97,7	4,33
7:1	2	destilliertes Wasser	90,7	2,04

Tabelle 2. Hydratation von PE:G₂₀₀₀-DSPE/QLT0069-Mizellen mit Phosphatpuffer mit pH 8,5

Lipid:Arzneimittel (mol:mol)	[Arzneimittel] (mg/ml)	Hydratationslösung	% filtriert (0,22-μm-Filter)	A692/A720
2:1	2,2	Phosphatpuffer 20 mM pH 8,5	37,5	0,134
4:1	2,2	Phosphatpuffer 20 mM pH 8,5	79,6	1,49
6:1	0,74	Phosphatpuffer 20 mM pH 8,5	105,1	10,24
6:1	2,2	Phosphatpuffer 20 mM pH 8,5	102,1	3,88
8:1	0,74	Phosphatpuffer 20 mM pH 8,5	100,0	27,65
8:1	2,2	Phosphatpuffer 20 mM pH 8,5	88,1	18,13

Ausgewählte Proben aus Tabelle 2 wurden in Bezug auf die Stabilität bei Lagerung bei Raumtemperatur über 24 oder 48 h hinweg oder bei 4°C über 24 oder 48 h hinweg oder über 1 bis 4 Wochen hinweg getestet. Die Proben wurden als stabil erachtet, wenn weder Ablagerungen noch Niederschlag durch einen 0,22-μm-Filter zurückgehalten wurden.
Gegebenenfalls können Lactose oder andere Zucker in der Hydratationslösung oder der Kombination von amphipathischen Molekülen und Wirkstoff(en) enthalten sein, um die Hydratationszeit zu verkürzen.

Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse vor und nach der Filtration mit Verteporfin-hältigen Mizellen nach der Hydratation in 20 mM Phosphatpuffer mit pH 8,5 (wobei sich „5DW" auf 5% Dextrosewasser bezieht). Die Mizellen wurden, wie durch ihre Filtrierbarkeit durch 0,22-μm-Filter gezeigt wurde, vollständig solubilisiert. Tabelle 3. Analyse hydratisierter Formulierungen (Verteporfin, 2 mg/ml) + PEG₂₀₀₀-DSPE + 20 mM Phosphatpuffer, pH 8,5 bei verschiedenen Lipid:Arzneimittel-Verhältnissen.

Lipid:Arzneimittel-Verhältnis (mol:mol)	0,5:1	1:1	2:1	4:1	6:1
UV-Analyse (mg/ml) (Unfiltriert/0,22-μm-filtriert)
Stammlösung	1,93/1,87	1,99/1,95	1,87/1,84	2,03/1,95	1,96/1,90
Stammlösung	n.b./1,89		1,88/1,84	1,94/1,98	n.b./1,91
über Nacht 4°C		nb/178^a
Verdünnt 1:20 in 5DW	0,090/0,080	0,10/0,09	0,094/0,090	0,11/0,10	0,090/0,090
Verdünnt 1:20 in 5DW	n.b./0,080		0,091/0,088	0,10/0,09	n.b./0,092
über Nacht 4°C		n. b./0,08^a

^a Diese Proben wurden 3 Tage lang bei 4°C gelagert, nicht nur über Nacht.
n. b. = nicht bestimmt

Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse vor und nach der Filtration mit Mizellen, die Verteporfin enthalten, nach der Hydratation in einer Lösung, die 9,2% Lactose enthält. Tabelle 4. Formulierungen aus Verteporfin (2 mg/ml) + PEG₂₀₀₀-DSPE, enthaltend 9,2% Lactose (nicht gepuffert).

Lipid:Arzneimittel-Verhältnis (mol:mol)	0,5:1	2:1	6:1
UV-Analyse (mg/ml) (Unfiltriert/0,22-μm-filtriert)
Stammlösung	2,12/1,53	2,15/2,08	2,01/1,97
Stammlösung	n. b.	2,15/2,12	2,01/2,00
über Nacht 4°C
Verdünnt 1:20 in 5DW	0,96/0,52	0,10/0,10	0,10/0,10
Verdünnt 1:20 in 5DW		0,10/0,10	0,10/0,10
über Nacht 4°C	n. b.

Es ist anzumerken, dass im Allgemeinen für QLT0069 und andere B-Ring-BPD ein (molares) Lipid:Photosensibilisator-Verhältnis von etwa 6:1 erforderlich ist, um eine Konzentration des Photosensibilisators von etwa 2 mg/ml zu erhalten, während für A-Ring-BPD, wie z. B. Verteporfin, ein Verhältnis von nur etwa 2:1 erforderlich ist.
Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl A-Ring- als auch B-Ring-Benzoporphyrinderivate bei Arzneimittelkonzentrationen von 1–2 mg/ml einfach in PEG₂₀₀₀-DSPE-Mizellen eingeschlossen werden können. Die Integrationseffizienz des B-Ring-Benzoporphyrinderivats QLT0069 hing sowohl von dem Lipid:Arzneimittel-Molverhältnis als auch von dem pH des zur Herstellung eingesetzten Hydratationsmediums ab. Es ist anzumerken, dass B-Ring-BPD-Mizellen nach der Rehydratation in wässrigen Medien mit einem pH-Wert im Bereich von 5,5 bis 8,5 löslich blieben (wie anhand der Filtrierbarkeit durch einen 0,22-μm-Filter bestimmt wurde). Es bestand jedoch die Tendenz zur Selbstaggregation des Arzneimittels, wenn der pH des Rehydratationsmediums nicht über dem pKa der Carboxylgruppe in dem Molekül gehalten wurde.
BEISPIEL 2
Kritische Mizellenkonzentration (CMC) von PEG-Phospholipid-Mizellen mit und ohne QLT0069
Die Erhöhung der Konzentration eines Tensids in der wässrigen Lösung verursacht eine Veringerung der Oberflächenspannung der Lösung bis zu einer bestimmten Konzentration, bei der sie dann mit steigender Konzentration im Wesentlichen konstant wird. Die Veränderung erfolgt bei der CMC. Die sinnvollste Erklärung für diese Wirkung ist, dass das Tensidmolekül sich selbst zur Bildung eines löslichen Aggregats bindet, das als Mizelle bekannt ist. Während des Prozesses der Mizellenbildung bilden die hydrophoben Gruppen den Kern der Mizelle und werden von dem Wasser abgeschirmt, um einen Zustand mit minimaler freier Energie zu erreichen. Die Mizellen stehen in dynamischem Gleichgewicht mit freien Molekülen (Monomeren) in der Lösung; das bedeutet, dass die Mizellen fortlaufend zerfallen und sich neu bilden. Mehrere physikalische Eigenschaften verändern sich, wenn die Tensidkonzentration über die CMC steigt, wie z. B. die Oberflächenspannung, die Intensität der Lichtbre chung, der osmotische Druck, die Äquivalentleitfähigkeit, die Löslichkeit eines wasserunlöslichen gelösten Stoffs. Alle diese Eigenschaften könnten herangezogen werden, um die CMC eines Tensids zu bestimmen. Hierin verwendeten die Erfinder die CMC von P2K-DSPE (PEG₂₀₀₀-DSPE) in destilliertem Wasser oder Phosphatpuffer.
P2K-DSPE wurde anfangs in Konzentrationen zwischen 4 und 80 μM in destilliertem Wasser gelöst. Die Absorption bei 211 nm wurde unter Einsatz eines UV-Vis-Spektrometers (Ultrospec^® 3000, Pharmacia Biotech) abgelesen und als Funktion der P2K-DSPE-Konzentration dargestellt. Die Konzentration, bei der sich der Anstieg ändert, hängt mit der CMC zusammen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Absorption durch P2K-DSPE bei einer Konzentration von 24 bis 32 μM anstieg (2). Diese Daten entsprechen annähernd der CMC (20 μM), die aus früheren Untersuchungen in dem Labor der Erfinder hervorgeht. 2 zeigt auch den abrupten Anstieg der Absorption durch P2K-DSPE-Mizellen, die QLT0069 enthalten. Die Integration von QLT0069 in P2K-DSPE scheint demnach die CMC nicht merklich zu beeinflussen.
BEISPIEL 3
Auswirkung verschiedener Diacylkettenlängen und -sättigungen;
Molekulargewicht von PEG
Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Integration von QLT0069, einem B-Ring-BPD, in Mizellen aus verschiedenen PEG-Lipid-Konjugaten zu bewerten. Diese umfassten Folgende:

• Poly(ethylenglykol)₂₀₀₀-Dioleoylphosphatidylethanolamin (P2K-DOPE) (18:1) (Kat. 880130) von Avanti Polar Lipids, Inc.
• Poly(ethylenglykol)₂₀₀₀-Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (P2K-DPPE) (16:0) (Kat. 880160) von Avanti Polar Lipids, Inc.
• Poly(ethylenglykol)₅₀₀₀-Dimyristoylphosphatidylethanolamin (P5K-DMPE) (14:0) (Kat. 880210) von Avanti Polar Lipids, Inc.
• Poly(ethylenglykol)₅₀₀₀-Dioleoylphosphatidylethanolamin (P5K-DOPE) (18:1) (Kat. 880230) von Avanti Polar Lipids, Inc.
• Poly(ethylenglykol)₅₀₀₀-Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (P2K-DPPE) (16:0) (Kat. 880200) von Avanti Polar Lipids, Inc.
• Poly(ethylenglykol)₅₀₀₀-Distearoylphosphatidylethanolamin (P2K-DSPE) (18:0) (Kat. 880220) von Avanti Polar Lipids, Inc.
• Poly(ethylenglykol)₇₅₀-Distearoylphosphatidylethanolamin (PEG₇₅₀-DSPE) (18:0) (Kat. 880620) von Avanti Polar Lipids, Inc.
• Poly(ethylenglykol)₁₇₅₀-Stearinsäure (PEG₁₇₅₀-Stearinsäure).

Mizellen wurden unter Einsatz des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens hergestellt, nur dass in manchen Proben P2K-DSPE durch verschiedene andere PEG-Lipid-Konjugate ersetzt wurde. Die Arzneimittelkonzentrationen variierten von 0,02 bis 0,2 mg/ml. Die Dünnfilmproben wurden alle in einem wässrigen Puffer mit physiologischem pH und physiologischer Osmolarität unter Einsatz von 20 mM MOPS, 5% Dextrose USP, pH 7,0, hydratisiert. Die Wirksamkeit der verschiedenen Mizellenformulierungen bei der Verhinderung von Selbstaggregation von PS-BPD-MB (gemessen als A692/A720) ist in Tabelle 5 angeführt. Das Vorhandensein von Dimer- (A720) oder Monomerformen (A692) von BPD-MB in den Mizellen wurde mit dem Ausmaß der Fettacylkettensättigung und -kettenlänge in Zusammenhang gebracht. Bei einem Lipid-Arzneimittel-Molverhältnis von 5:1 war das entweder in P5K-DSPE- oder P5K-DPPE-Mizellen integrierte Arzneimittel beispielsweise in Form von Monomeren vorhanden, während Arzneimitteldimere in Mizellen vorhanden waren, die entweder aus P5K-DMPE oder P5K-DOPE bestanden. Arzneimittel, die in PEG₁₇₅₀-Stearinsäure-Mizellen formuliert wurden, hydratisierten sehr rasch, auch wenn das Arzneimittel hauptsächlich in Form von Dimeren vorhanden war.

Wenn QLT0069 in PEG-Lipid-Mizellen geladen wurde, wurde die homogenste monomerhältige Formulierung dann erhalten, wenn lange, gesättigte Acylketten in dem hydrophoben Mizellenkern verwendet wurden. PEG-DSPE mit einem PEG-Molekulargewicht von 2000 oder 5000 bildete ebenso effizient Mizellen. Da P2K- DSPE bereits als Exzipient in liposomalen Formulierungen (Doxil^®, Alza Corporation) zugelassen ist, stellt es einen guten Kandidaten für Mizellen dar, die für den klinischen Einsatz gedacht sind. Tabelle 5. Bestimmung des optimalen mPEG-Lipids für das Beladen von QLT0069

mPEG-Lipide	mPEG-Lipid:Arzneimittel-Verhältnis (mol:mol)	Monomer/Dimer-Verhältnis (A692/A720)
P5K-DSPE	5:1 10:1 20:1	47 57 50
P5K-DPPE	5:1 10:1 20:1	15 38 62
P5K-DMPE	5:1 10:1 20:1	2,1 68 53
P5K-DOPE	5:1 10:1 20:1	1,7 34 54
P2K-DSPE	5:1 10:1 20:1	36 63 56
P2K-DOPE	5:1 10:1 20:1	1 10 67
PEG₁₇₅₀-Stearinsäure	5:1 10:1 20:1	0,4 0,9 2,6

Monomer/Dimer-Verhältnisse wurden für Proben bestimmt, die in Hydratationspuffer auf eine Endkonzentration von 10–30 μM verdünnt wurden.

BEISPIEL 4
In-vivo-Einsatz von Mizellen

Die Fähigkeit von PDT mit PEG2000-DSPE-Formulierungen von Photosensibilisatoren, Tumorwachstum zu kontrollieren, wurde in DBA-2-Mäusen unter Einsatz eines M1-Tumormodells bewertet. Männlichen Mäusen wurden 2 × 10⁴ M1-Tumorzellen in einem 50-μl-Volumen implantiert und erhalten, bis der Tumor auf einen Durchmesser von 4 bis 6 mm angewachsen war. Den DBA-Mäusen wurde entweder eine einzige intravenöse Dosis von 1,4 μmol/kg oder eine einzige intratumorale Injektion von 0,09 mg PS (Wirkstoff) verabreicht. Nach einem Zeitraum von 15 bis 60 min wurde der Tumorstelle 50 J/cm² Licht mit 690 nm mit einer Flussrate von 90 mW/cm² zugeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angeführt. QLT0069-PEG₂₀₀₀-DSPE war zur Kontrolle von Tumoren bei intratumoraler Verabreichung ebenso wirksam wie das liposomal formulierte A-Ring-BPD QLT0074. Verteporfin-PEG₂₀₀₀-DSPE war bei intravenöser Verabreichung äußerst wirksam zur Tumorkontrolle. Tabelle 6. Ergebnisse des Tumorbiotests – Anzahl der tumorfreien Tiere

Arzneimittel (Formulierung)	Bestrahlungsdauer	Anzahl der tumorfreien Mäuse
Arzneimittel (Formulierung)	Bestrahlungsdauer	Tag 3	Tag 7	Tag 14	Tag 20
QLT0069^a-IV 6:1 PEG₂₀₀₀-DSPE:Arzneimittel	30 min 60 min 180 min	0/3^b 0/3 0/3	0/3 0/3 0/3	0/3 0/3 0/3	0/3 0/3 0/3
Verteporfin^a-IV 6:1 PEG₂₀₀₀-DSPE:Arzneimittel	15 min 30 min 60 min	3/3 3/3 3/3	3/3 3/3 3/3	3/3 3/3 3/3	3/3 3/3 2/3
Verteporfin^a-IV 2:1 PEG₂₀₀₀-DSPE:Arzneimittel	15 min 30 min 60 min	3/3 3/3 3/3	3/3 3/3 3/3	3/3 3/3 2/3	3/3 2/3 1/3
QLT0069^b-intratumoral 6:1 PEG₂₀₀₀-DSPE:Arzneimittel	30 min 45 min 60 min	3/3 3/3 3/3	3/3 3/3 2/3	0/3 0/3 0/3	0/3 0/3 0/3
QLT0074^b -intratumoral (liposomale Formulierung)	30 min 45 min 60 min	3/3 3/3 3/3	3/3 3/3 2/3	0/3 0/3 0/3	0/3 0/3 0/3

^a M1-Tumoren in DBA/2-Mäusen wurden mit PDT behandelt: 50 J/cm² 690-nm-Licht über 30–60 min hinweg nach der IV-Verabreichung von QLT0069 oder Verteporfin in einer Menge von 1,4 μmol/kg.
^b M1-Tumoren in DBA/2-Mäusen wurden mit PDT behandelt: 50 J/cm² 690-nm-Licht über 30-60 min hinweg nach einer einzigen intratumoralen Injektion von 0,094 mg QLT0069 oder QLT0074.

BEISPIEL 5
Besonders bevorzugte Ausführungsformen
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine mizellenhältige Zusammensetzung, die einen oder mehrere Photosensibilisatoren und einen oder mehrere PEG-hältige Phospholipide umfasst, die Mizellen bilden. Solche Zusammensetzungen umfassen vorzugsweise einen grünen Porphyrinphotosensibilisator, bei dem es sich vorzugsweise um Verteporfin oder QLT0069 handelt. Besonders bevorzugte Zusammensetzungen können auch PEG-2000, zumindest Distearoyiphosphatidylethanolamin (DSPE) als das eine oder die mehreren Phospholipide oder PEG₂₀₀₀-DSPE als das eine oder die mehreren Phospholipide enthalten.
Besonders bevorzugte Zusammensetzungen weisen vorzugsweise ein Lipid:Photosensibilisator-Molverhältnis zwischen etwa 0,5 und etwa 10 auf. Noch bevorzugter umfasst die Zusammensetzung QLT0069 und PEG₂₀₀₀-DSPE, wobei das Lipid-Photosensibilisator-Molverhältnis zwischen etwa 6 und etwa 10 liegt. Eine Zusammensetzung, die Verteporfin und PEG₂₀₀₀-DSPE umfasst, worin das Lipid-Photosensibilisator-Molverhältnis im Bereich zwischen etwa 1 und etwa 6 liegt, ist ebenfalls zu bevorzugen. In allen besonders bevorzugten Zusammensetzungen beträgt die Photosensibilisatorkonzentration 1–2 mg/ml und/oder diese sind lyophilisiert.
LITERATURVERZEICHNIS

1. K. Sou, T. Endo, S. Takeoka, E. Tsuchida: Poly(ethylene glycol)-modification of the Phospholipid vesicles by using the spontaneous incorporation of poly(ethylene glycol)-lipid into the vesicles, Bioconjug. Chem. 11(3), 372–379 (2000).
2. D. D. Lasic: Liposomes: from Physics to Applications, Elsevier, New York, NY (1993).
3. W. R. Perkins, I. Ahmad, X. Li et al.: Novel therapeutic nano-particles (lipocores): trapping poorly water soluble compounds, Int. J. Pharm. 200(1), 27–39 (2000).
4. V. S. Trubetskoy, V. P. Torchilin: Use of polyoxyethylene-lipid conjugates as long-circulating carriers for delivery of therapeutic and diagnostic agents, Adv. Drug Deliv. Rev. 16, 311–320 (1995).
5. H. Onyuksel, H. Ikezaki, M. Patel, X. P. Gao, I. Rubinstein: A Novel Formulation of VIP in Sterically Stabilized Micelles Amplifies Vasodilation In Vivo, Pharm. Res. 16(1), 155–160 (1999).
6. A. Gabizon, R. Isacson, E. Libson et al.: Clinical studies of liposomeencapsulated doxorubicin, Acta Oncol. 33(7), 779–786 (1994).
7. B. Aveline, T. Hasan, R. Redmond: Photophysical and photosensitizing properties of benzoporphyrin derivative monoacid ring A (BPD-MA), Photochem. Photobiol. 59(3), 328–335 (1994).

Claims

Mizellenhältige Zusammensetzung, umfassend a) einen oder mehrere Photosensitizer, sowie b) ein oder mehrere PEG-hältige Phospholipide, die Mizellen bilden.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Photosensitizer ein grünes Porphyrin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das grüne Porphyrin Verteporfin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das grüne Porphyrin QLT 0069 ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die PEG₂₀₀₀ umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die weiters ein Phospholipid umfasst, das Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE) ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin ein PEG-hältiges Phospholipid PEG₂₀₀₀-DSPE ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Molverhältnis Lipid:Photosensitizer zwischen etwa 0,5 und etwa 10 beträgt.
Mizellenhältige Zusammensetzung, die einen grünen Porphyrin-Photosensitizer und ein oder mehrere PEG-hältige Phospholipide enthält, die Mizellen bilden.
Mizellenhältige Zusammensetzung, die QLT-0069 als Photosensitizer und PEG₂₀₀₀-DSPE enthält, worin das Molverhältnis Lipid:Photosensitizer zwischen etwa 6 und etwa 10 beträgt.
Mizellenhältige Zusammensetzung, die Verteporfin als Photosensitizer und PEG₂₀₀₀-DSPE enthält, worin das Molverhältnis Lipid:Photosensitizer zwischen etwa 2 und etwa 6 beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, worin die Photosensitizer-Konzentration etwa 2 mg/ml beträgt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in lyophilisierter Form.