DE60223262T2

DE60223262T2 - Verwendung von fucanen in der behandlung von adhäsion, arthritis und psoriasis

Info

Publication number: DE60223262T2
Application number: DE60223262T
Authority: DE
Inventors: John K. Vancouver JACKSON; Helen M. Vancouver Burt
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 2001-08-29
Filing date: 2002-08-29
Publication date: 2008-08-14
Anticipated expiration: 2022-08-30
Also published as: DK1420801T3; US20030064958A1; EP1420801A1; ES2295386T3; JP4758063B2; DE60223262D1; NZ532015A; ATE376835T1; WO2003018033A1; US6812220B2; US20050119216A1; CN1547478A; US20050074496A1; CN101028283A; CN1319540C; NZ547609A; US7163930B2; KR20040032992A; AU2002325113B2; JP2005508893A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Fucans für die Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln einer Adhäsion, die möglicherweise an einer erkrankten Stelle an einem Tier ist.
HINTERGRUND
Eine chirurgische Adhäsion ist ein Typ einer Narbe, die sich zwischen zwei Teilen des Körpers bildet, gewöhnlich nach einem chirurgischen Eingriff. Adhäsionen können schwere Probleme verursachen. Zum Beispiel, können Adhäsionen, die die weiblichen Reproduktionsorgane betreffen (Ovarien, Fallopianröhren) Unfruchtbarkeit, Dyspareunia (schmerzhaften Verkehr) und schwere Beckenschmerzen verursachen. Adhäsionen, die im Darm auftreten, können Darmobstruktion oder -verschluss verursachen, und Adhäsionen können sich auch an anderen Stellen, wie um das Herz, die Wirbelsäule und in der Hand bilden. Außer durch einen chirurgischen Eingriff können Adhäsionen durch Dinge, wie Endometriose, Infektion, Chemotherapie, Strahlung und Krebs verursacht werden.
Adhäsionen, wie auch andere Krankheiten mit Bezug zu Angiogenese, wie Arthritis und Psoriasis, können für Wochen, Monate oder Jahre andauern, was ausdauernde und kostspielige Pflege notwendig macht. Siehe Robbins Pathological Basis of Disease by Cotran, R. S., Kumar, V., Robbins, S. L., S. 75 (W. B. Saunders Co., 1989). Solche Krankheiten und Zustände können sich zu chronisch entzündete Zuständen mit schrecklichen Konsequenzen sowohl für das geistige als auch physische Wohlbefinden des Patienten entwickeln. Bedauerlicherweise, gibt es wenige therapeutische Optionen für Patienten mit chirurgischen Adhäsionen, Arthritis und Psoriasis. Oft werden Patienten mit Wirkstoffen, wie steroiden oder nicht steroiden Entzündungshemmern behandelt, um die Symptome der Krankheiten zu lindern. Jedoch bieten diese Therapien oft keinen geeigneten Langzeitnutzen und sie sind mit schweren Nebenwirkungen assoziiert, wenn sie zu oft angewendet werden (wie gastrische Geschwüre durch nicht steroide Entzündungshemmer oder schwerere Vergiftungen durch ein Übermaß der Verwendung von Steroiden). Andere mächtigere anti-proliferative und/oder anti-angiogenische Wirkstoffe, wie die Antikrebswirkstoffe Paclitaxel, Methotrexat, Doxorubicin, Camptothecin und Etoposid können oft aggressivere Behandlungsmodalitäten zur Verfügung stellen, aber die Verwendung dieser Wirkstoffe gegen nicht lebensbedrohende Krankheiten ist durch unerwünschte Giftigkeiten und Nebenwirkungen begrenzt. Daher blieb ein Bedarf nach Verbindungen, Zusammensetzungen, Verfahren und ähnlichem unbefriedigt (einschließlich Verabreichungsansätzen), um eine oder mehr dieser Krankheiten, vorzugsweise wirksamer bei weniger Nebenwirkungen, zu behandeln. Die vorliegenden Verbindungen, Zusammensetzung, Verfahren, usw. stellen einen oder mehr dieser Vorteile dar.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Fucans für die Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln einer Adhäsion, die möglicherweise an einer erkrankten Stelle an einem Tier ist, bereit. Die Fucane stellen einen signifikanten therapeutischen Effekt für diese Krankheiten bereit, während sie weniger Nebenwirkungen besitzen.
In einer Ausführungsform ist das Tier ein Mensch und/oder das Fucan ist ein Fucoidan. Die Krankheitsstelle kann eine chirurgische Stelle sein, und das Fucan kann zur direkten Abgabe als eine Zusammensetzung an diese erkrankte Stelle sein. Das Fucan kann für die im Wesentlichen kontinuierliche Verabreichung an eine erkrankte Stelle über die kontrollierte Freisetzung aus einer polymeren Dosierungsform sein und die polymere Dosierungsform kann ein Film, ein Pflaster, eine Paste, eine Mikrokugel, ein Implantat, Gel, Spray oder eine Flüssigkeit sein. Das Fucan kann zur Verabreichung als eine pharmazeutische Zusammensetzung in einer Form sein, die mindestens eines von Creme, Paste, injizierbaren Trägerstoff und Polymer umfasst.
Falls nicht andere angemerkt oder aus dem Kontext klar ist, können alle Ausführungsformen, Aspekte, Merkmale, usw. In jeder gewünschten Weise gemischt und aneinander angepasst, kombiniert und permutiert werden.
Das Fucan kann zur Verabreichung als eine pharmazeutische Zusammensetzung sein, die Fucan und eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem anderen Wirkstoff enthält.
Der Wirkstoff kann mindestens einer von Paclitaxel, Doxorubicin, Camptothecin, Etopsid, Mitoxantron, Methotrexat, Menadion, Plumbagin, Juglon, Beta-Laperchon Cyclosporin, Sulfasalazin, Steroid, Rapamycin, Retinoid, Docetaxel, und Colchicin, einem Antisense-Oligonukleotid, Ribozym und einem Oligonukleotid-RNA Inhibitor sein. Die therapeutisch wirksame Menge des Fucans kann zur Abgabe Teil einer Zusammensetzung sein und die Zusammensetzung kann von ungefähr 0,1% bis 35%, 5% bis 50%, 20–80%, 80% bis 100% (w/v) des Fucans umfassen.
Die Zusammensetzung kann ferner mindestens einen pharmazeutisch verträgliche Trägerstoff umfassen, wie Pluron, Zellulose, Alginat, Acrylat, Hyaluronsäure, Polyethylenglykol, einen injizierbaren Auszug und Chitosan. Das Fucan kann, je nach Wunsch direkt an die erkrankte Stelle zur oralen Verabreichung, über Injektion an die erkrankte Stelle intraokulär, intraperitoneal, intramuskulär, intraartikulär, intralesional, subkutan intravaginal, rektal oder topisch, oder anders sein.
Arthritis, Psoriasis oder angiogenische Augenkrankheiten können durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Fucans an eine erkrankte Stelle behandelt werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen können eine polymere Dosierungsform eine Fucans umfassen, die eine therapeutische wirksame Menge des Fucans umfasst und mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer pluronischen, Alignat-, Acrylat-, Hyaluronsäure, Polyethylenglykol, injizierbarem Trägerstoff und Chitosan. Die polymere Dosierungsform kann, je nach Wunsch, ein Film, eine Paste, eine Mikrokugel, Spray, Lotion, Flüssigkeit oder Implantat, oder andere Form sein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch eine therapeutische wirksame Menge mindestens eines anderen Wirkstoffs, wie eines Antisense-Oligonukleotids, Ribozyms und eines Oligonukleotid-RNA-Inhibitors sein.
Die Adhäsion kann eine chirurgische Adhäsion sein.
Diese und andere Aspekte, Merkmale und Ausführungsformen sind in dieser Anmeldung ausgeführt, die die folgende eingehende Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm von Fucoidaninhibition der Zellproliferation in Synoviocyten und glatten Muskelzellen nach 48 Stunden Exposition.
2 ist ein Diagramm von Fucoidaninhibition von Phorbolesthermyristat (PMA) induzierter Neutrophilenaktivierung.
3 ist eine Fotographie darstellend die Fucoidaninhibierung der Collagenase und Stromelysin Expresion bei einer Konzentration von 0,5% (w/v) ohne exzessive Inhibierung der Proteoglykanexpression.
4 ist ein Diagramm der Fucoidanfreisetzung aus Ethylenvinylacetatfilm.
5 ist ein Diagramm der Fucoidanfreisetzung aus Polycaprolactonpaste.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Behandlung von Adhäsionen durch das Inhibieren von Zellproliferation, Entzündungsreaktionen und Angiogenese unter Verwendung von sulphatierten Polysacchariden, die als Fucane bekannt sind. Es scheint, dass Fucane wie Fucoidan die Neutrophilenaktivierung, die Freisetzung entzündungsfördernder Enzyme aus Athritis assoziierten Zellen, und die Angiogenes in Hühnermembranen und chirurgischen Adhäsionenen hemmen können. Da alle Zellen Fucose bindende Rezeptoren enthalten, werden in einigen Ausführungsformen die Fucane direkt an die erkrankte Stelle verabreicht, um die im Wesentlichen kontinuierliche Exposition von Zielgewebe gegenüber Fucanen (wie Fucoidan) über die kontrollierte Freisetzung aus polymeren Dosierungsformen bereitzustellen. Da Fucane in vivo multiple Effekte haben können (, die insbesondere das Blutthrombin und -komplement beeinflussen), ist eine Stellen gerichtete kontrollierte Freisetzung von Fucanen eine Alternative zur systemischen Verabreichung, die die haematologischen Toxizitäten vermindern kann.
Das Folgende wird zuerst allgemein Fucane, Adhäsionen, Arthritis und Psoriasis diskutieren, dann einige Ausführungsformen der Erfindung diskutierten, dann einige Beispiele bereitstellen.
Allgemeine Hintergrunddiskussion über Fucane, Adhäsionen, Arthritis und Psoriasis
Fucane.
Fucane (einschließlich Fucoidan) sind sulphatierte Hochmolekulargewichtspolysaccaride, die aus braunem Seetang extrahiert wurden. Diese Verbindungen besitzen laut Berichten multiple inhibitorische Wirkungen in vivo und in vitro, was Anti-Thrombin-, anti-proliferative, Anti-Komplement-, Anti-Krebs- und Anti-Neutrophilmigrationseffekte einschließt. Fucane können zahlreiche Bindungsereignisse an den Zelloberflächen blockieren, was die Zell-Zell Bindung durch Intergrin-Selektin Moleküle oder durch Bindung von Thrombin oder Komplement in dem Blut oder Fucoserezeptoren auf den Zelloberflächen einschließt.
Man denkt, dass solche Aktivität für die entzündungshemmenden Eigenschaften über (zum Beispiel) die Inhibierung von Lymphocyten oder Neutrophilenbindung und vaskuläre Endothelzellen verantwortlich ist, die vielleicht die Invasion dieser Zellen in ein Gewebekompartment mit nachfolgender Entzündung verhindert. Patankar, M. S., et al., J. Biol. Chem. 268: 21770-21776 (1993); Brandley, B. K., et al, J. Cell Biol. 105: 991-997 (1987). Kürzlich vorgenommene Studien zeigten auch, dass Fucane die Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen hemmen. Logeart, D., et al., Eur. J. Cell Biol. 74: 376-384 & 385-390 (1997), was ein mögliches Anti-Restenosepotential dieser Verbindungen andeutet (aber nicht beweist). Es wurde gezeigt, dass Fucane langsam nach Oberflächenbindung sowohl an Endothel- als auch glatten Muskelzellen in die Zellen internalisiert werden. Glabe, C. G., et al., J. Cell Science 61: 475-490 (1983); Logeart, D., et al., Eur. J. Cell Biol. 74: 376-384 (1997). Riou, D., et al., Anticancer Res., 16 (3A): 1213-1218 (1996); Itoh, H, Anticancer Res., 13 (6A): 2045-2052 (1993); Nishiro, T., et al., Thromb. Res., 62: 765-773 (1991); Blondin, C., et al., Mol. Immunol., 31: 247-253 (1994); Patankar, M. S., et al., J. Biol. Chem., 268: 21770-21776 (1993). In Japan wird Fucoidan, das aus zahlreichen Seegräsern extrahiert wird, als ein Gesundheitsnahrungsmittel vermarktet. Fucoidan wurde als eine kosmetisches oder Hautagens vorgeschlagen. JP 01031707 und JP 01085905 . Es wurde berichtet, dass Fucoidan ein potentielles Antikrebsmittel ist. Riou. D., Anticancer Res. 16: 3a 1213-18 (1996); Itoh, H., et al., Anticancer Res., 15: 5b 1937-47 (1995). Es wurde berichtet, dass Fucoidan Angiogenese nicht in vitro hemmt. Soeda, S., et al., Biochim. Biophysica Acta (1): 127-134 (2000). In ähnlicher Weise wunde gefunden, dass Fucoidan HUVE-Zellproliferation (in vitro), die durch Serum induziert wurde, stimuliert, was einen möglichen proangiogenen Effekt anzeigt (obwohl Hemmung möglich war, wenn Fibroblasten-Wachstumsfaktor vorhanden war) Giraux, J., et al., Eur. J. Cell Biol. 77 4: 352-9 (1998). Studien haben auch gezeigt, dass Fucane die Bindung an Endothelzellmonolayer hemmen. Glabe, C. G., J. Cell Science, 61: 475-490 (1983). Da die Zellen, die die Kapillaren ausmachen, Endothelzellen sind, deutet dieser Bericht an, dass in vitro einige Aspekte der Zelladhäsion gehemmt werden können, aber diese Daten beweisen keinen in vitro antiangiogenen Effekt von Fucoidan. Es wurde berichtet, dass Fucoidan die Bindung von Helicobacter an gastrische Zellen hemmt, was auf einen antigastrischen Geschwüreffekt hinweist. Shibat, H. J., Nutr. Sci. Vitaminol. 45: 325-336 (1999).
Es wird berichtet, dass andere sulphatierte Polysaccharide, die verzweigten und linearen Typen einschließend, differentielle antigerinnenden Aktivität besitzen. Pereira, M. S., J. Biol. Chem. 12: 7656-67 (1999). Es wurde berichtet, dass Dextransulphat und Derivate Krebszellwachstum hemmen, Bittoun, P., Carbohydrate Res. (3-4): 247-255 (1999) und antigerinnende Effekte besitzen, Mauray, S., J. Biomat. Sci. Poly A. 9: 373-87 (1998). Sulphatierte Polysaccharide wurden als antvirale Agenzien für die Verwendung gegen, z. B., AIDS vorgeschlagen. EP 00293826 ; JP 01313433 .
Adhäsionen
Adhäsionsbildung ist ein komplexer Prozess, in dem Gewebe, die normalerweise in dem Körper separiert sind, ineinander wachsen. Chirurgische Adhäsionen (auch bekannt als post chirurigische Adhäsionen) entwickeln sich aus der sonst normalen Wundheilungsreaktion der Gewebe auf Trauma hin und ereignen sich in über zwei Drittel aller Patienten mit abdominalen Eingriffen. Ellis, H.,, Surg. Gynecol. Obstet. 133:497 (1971); Wiebel, M-A. und Majno, G., Am. J. Surg. 126: 345 (1973). Die Konsequenzen dieser Adhäsionen variieren und hängen von der beteiligten Stelle des Eingriffs ab. Probleme können Schmerz, Unfruchtbarkeit, Obstruktion des Darms und selbst eine erhöhtes Sterblichkeitsrisiko nach einem Herzeingriff beinhalten.

diZerega, G. S., Prog. Clin. Biol. Res. 381: 1-18 (1993); diZerega, G. S., Fertil. Steril. 61: 219-235 (1994); Dobell, A. R., Jain, A. K., Ann. Thorac. Surg. 37: 273-278 (1984).

Der Prozess der Adhäsionsbildung beinhaltet anfänglich die Etablierung eines Fibrinnetzes und normale Gewebereparatur. Der normale Reparaturprozess ermöglicht Fibrinolyse neben mesothelialer Reparatur. Jedoch reift bei chirurgischer Adhäsionsbildung die Fibrinmatrix während Fibroblasten in das Netzwerk proliferieren und es zu Angiogenese kommt, was in der Ausbildung einer organisierten Adhäsion innerhalb von 3 bis 5 Tagen resultiert. Buckman, R. F., et al., J. Surg. Res. 21: 67-76 (1976); Raferty, A. T., J. Anat. 129: 659-664 (1979).
Inflammatorische Prozesse beinhalten Neutrophilenaktivierung in dem traumatisierten Geweben, Fibrinablagerung und Bindung von neben einander liegenden Geweben, Macrophageninvasion, Fibroblastenproliferation in das Gebiet, Collagenablagerung, Angiogenese und die Ausbildung von permanenten Adhäsionsgeweben. Gegenwärtig schließen preventative Therapien die Prävention von Fibrinablagerung, Verminderung der Entzündung (steroide und nicht steroide entzündungshemmende Wirkstoffe) und Entfernung der Fibrinablagerung ein.
Versuchen zum Eingreifen, um die Bildung von post-Eingriffsadhäsionen zu verhindern, schlossen die Verwendung von Hydrofloationstechniken oder Barrierevorrichtungen ein. Hydroflotaiton involviert die Instillation von großen Volumina von Polymerlösungen wie Dextran, Adhesion study group, Fertil. Steril. 40: 612-619 (1983), oder Carboxymethylzellulose, Elkins, T. E., et al., Fertil. Steril. 41: 926-928 (1984) in die Stelle des Eingriffs ein, um zu versuchen die Organe getrennt zu haken. Synthetische Barrieremembranen, die aus oxidierter regenerierter Zellulose (Interceed^TM) herstellt wurden, Polytetrafluroethylen (Gore-tex Membran für chirurigische Eingriffe) und vollständig resorbierbare Membranen, die aus einer modifizierten Hyaluronsäure/Carboxymethylzellulose (HA/CMC) Kombination (Seprafilm^TM) hergestellt wurden, wurden auch verwendet, um die Bildung von post-Eingriffsadhäsionen sowohl bei Tieren als auch Menschen zu vermindern. Burns, J. W., et al., Eur. J. Surg. Suppl. 577: 40-48 (1997); Burns, J. W., et al., Fertil. Steril. 66: 814-821 (1996); Becker, J. M., et al., J. Am. Coll. Surg. 183: 297-306 (1996). Der Erfolg dieser HA/CMC Membran kann von ihrer Fähigkeit stamen, Trennung des Gewebes während des peritonealen Wundreparaturprozesses sicher zu stellen, wenn sich die Adhäsionen bilden. Es wurde beobachtet, dass die Membranen eine klare visköse Schicht auf dme verletzten Gewebe nach Applikation für 3–5 Tage bildeten, eine Zeitperiode, die compatible ist mit dem Zeitverlauf der Bildung von post Eingriffsadhäsionen. Ellis, H.,, Br. J. Surg. 50: 10-16 (1963). Die intraperitonale Verabreichung von entzündungshemmenden Agenzien, wie Dexamethason oder Corticosteroiden führte zu marginaler Hemmung der Adhäsionsbildung diZerega, G. S., Fertil. Steril. 61: 219-235 (1994); Hockel, M, Ann. Chir. Gynecol. 76: 306-313 (1987).
Arthritis.
Arthritis, wie rheumatoide Arthritis (RA), ist eine lähmenden chronisch entzündliche Krankheit, die fast 2% der Weltbevölkerung betrifft. Dieser Zustand ist gekennzeichnet durch Schmerz, Anschwellen, synoviale Zellproliferation (Pannusbildung), Angiogenese und Zerstörung des Gelenkgewebes. In dem fortgeschrittenen Stadium schädigt die Krankheit wichtige Organe und kann tödlich sein. Die Krankheit involviert mehrere Mitglieder des Immunsystems (Macrophagen/Monocyten, Neutrophile, B-Zellen und T-Zellen), komplexe Zytokininteraktionen und synoviale Zellfehlfunktion und Proliferation. Eine frühe aggressive Behandlung wird nun mit die Krankheit modifizierenden antirheumatischen Wirkstoffen (DMARDS) empfohlen, wie Methotrexat und Kombinationen mit Cyclosporin oder Azathioprin. Arthritis and Rheumatism, 39(5): 713-722 (1996).
Kristall induzierte Arthritis betrifft fast 1% der Bevölkerung und ist gekennzeichnet durch Kristall induzierte Aktivierung von Macrophagen und Neutrophilen in den Gelenken und löst für viele Tage sehr schweren Schmerz aus. Die Krankheit schreitet fort, so dass die Intervalle zwischen den Episoden kürzer werden und die Schwere der Krankheit für den Patienten auf unakzeptable Niveaus ansteigt. Diese Krankheit wird im Allgemeinen symptomatisch mit NSAIDs behandelt. Für eine eingehendere Diskussion der Pathophysiologie dieser Krankheit oder anderer Formen von entzündlicher Arthritis siehe McCarty, et al., Arthritis and Allied Conditions by Lea and Febiger, Philadelphia 1495 (1985).
Psoriasis.
Psoriasis ist eine übliche, chronisch entzündliche Hautkrankheit, gekennzeichnet durch erhobene, verdickte und schuppige Läsionen, die jucken, brennen, stechen oder leicht bluten. Mehr als 2% der Amerikaner leiden an Psoriasis und Patienten besitzen oft begleitende arthritische Symptome. Die Ursache der Krankheit ist unbekannt und es gibt keine Heilung für die Krankheit gegenwärtig. Es gibt Beweise, die das Konzept einer Autoimmunkrankheit unterstützen. Die Krankheit ist ferner gekennzeichnet durch Neutrophilenaktivierung, Zellproliferation und Angiogenese.
Hautzellen können zwei Routen des Wachstums folgen, normalem Wachstum oder Wundheilung. Bei normalem Wachstum, werden Zellen in der Basalschicht erzeugt, und bewegen sich durch die Epidermis an die Hautoberfläche. Tote Zellen werden von der Oberfläche mit der gleichen Geschwindigkeit abgeworfen, wie sich neue unten bilden. Während der Wundheilung, wird verschnellertes Wachstum und Reparatur ausgelöst, was in einem raschem Durchlauf der Hautzellen, erhöhter Blutversorgung und Entzündung resultiert. In einiger Hinsicht ist Psoriasis ein überschießender Wundheilungsprozess. Wenn die Haut die Hautzellen (Keratinocyten) nicht so schnell abwirft, wie sie erzeugt werden, dann kann es zu einem Aufbau kommen. Dies kann zu schuppigen Läsionen und Angiogenese führen (um die Blutzufuhr zu erhöhen). Zur gleichen Zeit können Lymphocyten, Neutrophile und Macrophagen Wundheit, Anschwellen und Entzündung erzeugen. Gegenwärtige Wirkstofftherapien schließen die Verwendung von steroiden und nicht steroiden entzündungshemmenden Agenzien ein, um Entzündungssymptome zu behandeln. Methotrexat und Cyclosporin werden auch mit marginaler Wirksamkeit verwendet. Die gegenwärtigen Kosten zum Behandeln von Psoriais in den USA betragen mehr als 3 Milliarden $ pro Jahr.
Allgemeine Diskussion
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von Fucanen (einschließlich von Derivaten und Analogen davon) für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von chirurgischen Adhäsionen bereit (wobei wie hier verwendet Behandlung sowohl die Behandlung von bestehenden Zuständen als auch die Hemmung potentieller Zustände umfasst). Wie in den Beispiel unten demonstriert, hemmen Fucane (und insbesondere, Fucoidan) die Zellproliferation, inflammatorische Reaktionen/Ereignisse und Angiogenese, einschließlich zum Beispiel bei chirurgischen Adhäsionen. In einer Ausführungsform werden Fucane, wie Fucoidan, verwendet, um Angiogenese zu hemmen oder ihr vorzubeugen. In einer anderen Ausführungsform werden Fucane, wie Fucoidan, verwendet, um inflammatorische Zellaktivierung zu hemmen oder ihr vorzubeugen, so dass die Zellen, die entzündliche Reaktionen bei solchen erkrankten Stellen initiieren, gehemmt werden können. Das ist, zum Beispiel, wichtig, da viele Krankheiten, wie zum Beispiel, Osteoarthritis nicht notwendigerweise mit inflammatorischen Zellanhäufung an den erkrankten Stellen einhergehen. Somit kann solche Verwendung von Fucanen die langwierigere Aktivierung von residenten Macrophagen, Neutrophilen und anderen entzündungsauslösenden Zellen hemmen oder ihr vorbeugen, die die chronischen unerwünschten Effekte der Krankheit verursacht. Solche Fucanaktivitäten werden hier auf chirurgische Adhäsionen angewendet.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung können Fucane, einschließlich Derivate und Analoge davon, in einer Formulierung zur kontrollierten Freisetzung formuliert werden, um anhaltende effektive Konzentrationen des Agens bereitzustellen, die an den erkrankten Stellen bereitzustellen sind. In einer anderen Ausführungsform wird Fucoidan für die Behandlung von chirurgischen Adhäsionen verwendet. Beispiele werden hier gegeben. Solche Beispiele demonstrieren die inhibitorische Wirkung von Fucoidan gegen primäre Chondrocyten (in rheumatischer Arthritis involvierte Zellen), die von frischem Knorpel abgeleitet sind Dies zeigt an, dass das Agens ein Potential als ein anti-arthritisches Agens besitzt. Insbesondere bietet die offenbare Fähigkeit von Fucoidan, die Collagenase und Stromylesin Produktion zu hemmen, therapeutische Ansätze an, bei denen die Freisetzung dieser und/oder anderer Metalloproteinasen medizinischen Probleme verursacht.
In anderen Ausführungsformen kann Fucoidan in Kombination mit anderen therapeutischen Agenzien verwendet werden, um eine gute Wirksamkeit gegen den Krankheitsprozess bei geringer Toxizität zu ermöglichen. Zum Beispiel können bei der Behandlung von chirurgischen Adhäsionen mächtige antiproliferative Wirkstoffe, wie Doxorubicin, Camptothecin, Etoposid, Mitoxantron, Methotrexat, Menadion, Plumbagin, Juglon, Beta-Laperchon Cyclosporin, Sulfasalazin, Steriode, Rapamycin, Retinoid, Paclitaxel, Docetaxel, Colchicin und andere Miktrotubuli-Inhibitoren, und andere Analoge und Derivate davon, unerwünschte Toxizitäten bei Konzentrationen des Wirkstoffs besitzen, die für die Hemmung der Adhäsionsprozesse ohne Fucan benötigt werden, aber sie können bei niedrigeren Konzentrationen in Kombination mit Fucanen, wie Fucoidan, nützlich sein, um die erwünschten Ergebnisse zu erreichen.
In einer anderen Ausführungsform wird vorgeschlagen, dass das Fucan selbst die Dosierungsform des Agens sein kann. Zum Beispiel können die Fucane als dünne Filme hergestellt sein, die direkt auf eine chirurgische Traumaregion platziert werden können, so dass die langsame Auflösung des Fucans die Gewebe gegenüber einer anhaltenden und wirksamen Konzentration des Agens exponiert. In der Tat kann solch eine Formulierung als ein Verabreichungssystem für die kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs für sich selbst (als das aktive Agens) oder für andere Agenzien (wie Paclitaxel) agieren, die in die Formulierung platziert werden können. Die Fucane können auch in Tabletten, Kapseln, Mikrokugeln, Pasten, Gele, Puder, Aerosole geformt werden oder oral, rektal, als ein Feststoff oder als eine Lösung gegeben werden.
Im Allgemeinen, können Fucane allein oder als Teil einer Zusammensetzung durch Applikation oder Injektion als eine Paste, Gel, Spray, Partikel, Film, Lösung, Flüssigkeit, Lotion, Creme oder Implant verabreicht werden. Verabreichungswege und -stellen beinhalten oral, systemisch, intraokulär, subkutan, intraperitoneal, intramuskulär, intraartikulär, inralesional, intravaginal, rektal oder topisch, wie in einem Pflaster. Diese Wege können auch, in bestimmten Fällen, die vorgeschlagene Wirkungsstelle der Fucan oder Fucan-Wirkstoffkombinationsdosierungsform sein. Die therapeutisch wirksame Menge des Fucans kann als ein Teil einer Zusammensetzung verabreicht werden und kann 5% bis 50%, 20–80%, 80% bis 100% (w/v) der Zusammensetzung umfassen. Die Fucane können in geeigneten Gefäßen oder Containern bereitgestellt werden, die selbst in Kits bereitgestellt werden können und auch mit einer Beschriftung bereitgestellt werden, vorzugsweise mit einer Beschriftung, die durch eine Regierungszulassungsbehörde wie der „Fond and Drug Administration" in den Vereinigten Staaten von Amerika genehmigt wurde.
Für die Behandlung von Adhäsionen können die Fucane oder Fucan enthaltenden Zusammensetzung direkt an die erkrankte oder chirurgische Stelle als eine Lösung, Partikel, Suspension, Film, Paste, Gel, Spray, Flüssigkeit, Lotion, Implantat oder andere gewünschte Form verabreicht werden. Adhäsionen können auch durch die systemische Verabreichung des Funcans auf intravenösem, subkutanem, intramuskulärem, intraperitonealem, oralem oder anderem Verabreichungswege, je nach Wunsch, behandelt werden.
Fucane können zu Behandlung von Angiogenese-Krankheiten des Auges verwendet werden. Zum Beispiel ist diabetische Retinopathie eine potentiell zur Erblindung führenden Komplikation von Diabetes, die die Blutgefäße der Retina schädigt, gefolgt von neuem Blutgefäßwachstum (Angiogenese), die verschwommene Sicht oder retinale Zerstörung verursacht. Maculardegeneration wird durch die Invasion von neuen Blutgefäßen unterhalb der Retina verursacht und ist die Hauptursache von Blindheit in den USA und Europa mit 200.000 neuen Fällen pro Jahr in den USA und nur 15% dieser sind mit gegenwärtigen Lasertherapien behandelbar. Ein pharmakologischer Ansatz für die Behandlung dieser Krankheiten kann mit den Verfahren und Zusammensetzungen, die hier diskutiert wunden, wenn sie für die Verwendung mit dem Auge adaptiert wurden, bereitgestellt werden. Zum Beispiel können die Fucane direkt an die Oberfläche oder in das Auge injiziert werden. Modifikationen an solchen Systemen schließen chemisches Quervernetzen ein, um die Geschwindigkeit der Auflösung der Dosierungsform abzubremsen, oder Mischung mit anderen Trägerstoffen, wie Pluronen, Aliginaten, Acrylaten, Zellulose, Hyaluronsäure, Polytethylenglykolen, Chitosan, einschließlich Analoge oder Derivate davon, und zahlreiche andere pharmazeutischen verträgliche Formulierungsagenzien.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung bilden die Fucane ein geladenes wässriges Gel mit positiv geladenen Trägerstoffen wie zum Beispiel Chitosan oder Poly-1-Lysin. Wirkstoffe wie zum Beispiel eine Antisense-Oligonuldeotid, Ribozym und eine Oligonukleotid RNA-Inbibitor, können in ein solches Gel zur Applikation an eine erkankte Stelle aufgenommen werden. Alternativ kann ein einen solchen Wirkstoff enthaltendes Gel, oder der Wirkstoff, gelöst in eine Lösung des Fucans, vollständig getrocknet werden und in Partikel zermahlen werden. Diese Partikel können dann auf eine erkrankte Stelle appliziert werden, um als eine Dosierungsform zur kontrollierten Freisetzung zu agieren, oder diese Partikel können als ein Transfektionsagenz agieren, da Oberflächen gebundene Fucane in Zellen aufgenommen werden. Die Applikation solcher Partikel kann durch die Verwendung von pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen, wie Trägerstoffen, wie Plurone, Zellulose, Aliginaten, Acrylaten, Hyaluronsäure, Polytethylenglykolen, Chitosan, injizierbaren Trägerstoffen, einschließlich Analoge oder Derivate davon, und zahlreichen Polymer basierten Vehikeln ermöglicht werden.
In Hinsicht auf Transfektion und die Verwendung von Fucanen mit Nukleinsäureagenzien wird das voranschreitende Gebiet der Medizin, das als Gentherapie bekannt ist, durch Wirkstoffverabreichungsschwierigkeiten eingeschränkt, wobei Genfragmente oder Nukleinsäureketten, wie Oligonukleotide einschließlich Riboyzmen, Antisense-Nukleotiden und Oligonukleotid RNA Inhibitoren, wegen der großen Ladung und des großen Molekulargewichts dieser Verbindungen eine verminderte Zellaufnahme haben. Vor kurzem wurde die Verwendung von Mikropartikeln (wie Kalziumphosphat), enthaltend das Gen oder die Nukleinsäure als Transfektionsagenzien, vorgeschlagen, so dass sie an die Zelloberfläche binden und durch Endocytose oder Einfaltung aufgenommen werden, was zu zellulärem Eintritt des Gens oder der Nukleinsäure führt. Die meisten Zellen enthalten Fucose-Rezeptoren auf der Membranoberfläche. Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von Fucanen als Transfektionsagenzien für Nukleinsäureketten bereit. In einer Ausführungsform kann die Nukleinsäurekette innerhalb eines Fucoidan-Mikropartikels gebunden oder eingekapselt werden und der Partikel kann chemisch quervernetzt werden, um die Auflösung vor der Applikation auf die Targetzellstelle zu hemmen.
Die Fucane, entweder allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen, können in Kombination mit Materialien verwendet werden, die in den Körper implantiert werden. Diese Materialien können zahlreiche medizinische Geräte wie Katheter, Shunts, Membranen, Sterns, Schwämme, Füllungen, künstliche Ersatzgelenke und Teile davon und andere orthopädisch bezogene Implantate einschließen. Solche Implantate können Fucane enthalten oder mit Fucanen beschichtet werden, entweder allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen und Trägerstoffen.
Falls nicht anders angezeigt, außer in den Patentansprüchen, schließt die Verwendung von „oder" „und" ein, und umgekehrt. Nicht einschränkende Begriffe sind nicht als einschränkend zu verstehen, falls nicht explizit anders angemerkt, oder der Kontext dies klar anzeigt. (Zum Beispiel, zeigt „einschließend", „besitzend" und „umfassend" typischerweise „ohne Beschränkung einschließend" an). Die Einzahlformen, was die Patentansprüche mitumfasst, wie „ein/eine/einer", und „der/die/das" schließen den Bezug auf die Mehrzahl mit ein, falls es nicht anders angemerkt wurde, oder Kontext es klar anzeigt.
BEISPIELE
Beispiel 1: Der Effekt von Fucoidan auf die Synoviocyten- und glatten Muskelzell-Proliferation in vitro.
Proliferation wurde mit dem Dimethylthiazol Diphenyltetrazolium-bromidsalz (MTT) Proliferation/Zytotoxizitätsassay bestimmt.
An Tag eins wurden 1500–2000 glatte Muskelzellen (A7r5 Embryo-Ratten-Thorax-Aorta) oder Synoviocyten (HIG.82 Kaninchen) pro Nocke einer 96 Nockenplatte plattiert, wobei die erste Spalte frei von Zellen gelassen wurde (frei). Die Platte wurde in den 37°C, CO₂ Inkubator gestellt. Am folgenden Tag wurde Fucoidan bei verschiedenen Konzentrationen hinzugegeben. Kein Fucoidan wurde zu der ersten Spalte (frei) und der zweiten Spalte (unbehandelte Spalte) als Kontrolle gegeben. Die Zellen wurden für 48 Stunden exponiert. Am Ende der Expositionsperiode wurden 50 μl Dimethylthiazol Diphenyltetrazolium-bromidsalz (MTT), in Medien gelöst, hinzugegeben und für 4 Stunden bei 37° inkubiert. Das Medium wurde dann abgesaugt und 200 μl Dimethyl-sulfoxid (DMSO) wurden hinzugefügt. Die Platte wurde für 30 Minuten geschüttelt und die Absorption bei 562 nm gelesen. Die Messung der optischen Dichte wurde in Zellzahlen umgewandelt mit einem Standartplot für optische Dichte mit einer bekannten Anzahl von Zellen und die Zellviabilität wurde als % Wachstum ausgedrückt (dieser Wert ist der %-Wert verglichen mit den Kontrollzellen).
Wie in 1 gezeigt induzierte das Fucoidan eine Konzentrationsabhängige Hemmung der Zellproliferation nach 48 Stunden Exposition für sowohl Synoviozyten als auch glatte Muskelzellen. Die inhibitorischen Konzentrationen, die eine 50% Effekt auf die Proliferation (IC50) ergaben, waren 15 μM bzw. 6 μM.
Beispiel 2: Der Effekt von Fucoidan auf Phorbolestermyristat (PMA) induzierte Neutrophilenchemilumineszenz.
Dieses Experiment inkubierte frische präparierte humane Neutrophile mit Fucoidan bei 0.5% w/v gefolgt von Stimulation der Zellen mit dem PMA. Stimulierung (oder Aktivierung) der Zellen induzierte die Superoxid-Anion-Erzeugung, die durch die Emission von Licht (Chemilumineszenz) gemessen werden konnte. Hemmung der Neutrophilenfunktion wurde dann durch die Hemmung der Chemilumineszenz gemessen. Hanks gepufferte Salzlösung (HBSS) pH 7.4 wurde während der ganzen Studie verwendet. Alle Chemikalien wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erworben, falls nicht anders angemerkt. Alle Experimente wurde bei 37°C durchgeführt. Neutrophile wurde am frisch gesammeltem humanem zitriertem Vollblut präpariert. Kurz gesagt wurden 400 ml Blut mit 80 ml 4% Dextran T500 (Pharmacia LKB, Biotechnology AB Uppsala, Sweden) in HBSS gemischt und für 1 h absetzen gelassen. Plasma wurde kontinuierlich gesammelt und 5 ml auf 5 ml Ficoll Paque (Pharmacia) in 15 ml Polypropylen-Röhrchen (Corning, NY) appliziert. Nach Zentrifugieren bei 500 × g für 30 min, wurden die Neutrophilenpellets von Erythrocyten durch 20 s hypotonischem Schock frei gewaschen. Neutrophile wurden in HBSS resuspendiert, auf Eis gehalten und innerhalb von 3 h für Experimente verwendet. Neutrophilen Viabilität und Reinheit war immer höher als 90%.
Die Zellen wurden bei zahlreichen Konzentrationen von Fucoidan für 15 Minuten bei 37°C vor Zugabe von PMA inkubiert.
Chemilumineszenz-Studien wurden bei einer Zellkonzentration von 5 × 10⁶ Zellen pro ml in HBSS mit PMA bei 0.5 μM durchgeführt. Zu den Röhrchen wurden 10 μl Luminol, gelöst in 25% DMSO in HBSS gelöst, gegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu ergeben und die Proben wurden gemischt, um Neutrophilenaktivierung zu initiieren. Chemilumineszenz wurde mit einem LKB Luminometer (Model 1250) bei 37°C, wobei direkt vor den Messungen geschüttelt wurde, beobachtet. Kontrollröhrchen enthielten Zellen, Fucoidan und Luminol.
Fucoidan hemmt stark PMA induzierte Neutrophilenaktivierung, wie in 2 gezeigt wird. Die Daten sind für drei separate PMA-Neutrophilen Inkubationen. Diese Daten demonstrieren einen entzündungshemmenden Effekt von Fucoidan.
Beispiel 3: Der Effekt von Fucoidan auf die IL-1 induzierte Kollagenasegen- und Stromelysingenexpression in Chondrocyten.
Dieser Assay misst die RNA-Niveaus für zwei Metalloproteinasen, Collagenase und Stromelysin. Überexpression dieser Gene resultiert in Sekretion dieser zwei Enzyme aus artikulären Chondrocyten und kann einen Teil der Pathophysiologie von rheumatischer Arthritis darstellen. Agenzien, die die Überexpression von Collagenase und Stromelysin hemmen, sind potentielle antiarthritische Agenzien. Dieses antiarthritische Potential kann vermindert sein, wenn das Agenz auch signifikant die Proteolglycan Genexpression hemmt. Proteoglycan Genexpression ist Teil der normalen Physiologie von Chondrocyten. Primäre Chondrocytenkulturen wurden frisch aus Kälberknorpel isoliert. Die Zellen wurden plattiert (bei 2.5 × 10⁶/ml) in 100 × 20 mm Kulturschalen und übernacht bei 37°C inkubiert in Ham's F12 Medium enthaltend 5% fötales Rinderserum (FBS). Die Zellen wunden mit serumfreien Medium über Nacht hungern gelassen. Die Zellen wurden für 6 Stunden mit Camptothecin bei Konzentrationen von 10^–6 M 10^–7 M and 10^–8 M vorbehandelt. Dann wurde IL-1 (20 ng/ml) zu jeder Schale hinzu gegeben und die Schalen wurden für zusätzliche 18 Stunden inkubiert. Gesamt-RNA wurde durch das saure Guanidine Isothiocyanat Verfahren isoliert und der Elektrophorese auf einem denaturierenden Gel unterzogen. Denaturierte RNA Proben (15 μg) wurden durch Gelelektrophorese in einem 1% denaturierendem Gel analysiert, auf eine Nylonmembran transferiert, und mit der ³²P markierten Collagenase cDNA Sonde, ³²P markierten Stromelysin cDNA Sonde, ³²P markierten Proteoglykan cDNA Sonde bzw. ³²P markierten Glyzerinaldehyphosphatdehydogenase (PAGDH) cDNA Sonde hybridisiert. Die PAGDH Niveaus fungierten als interner Standart, um grob gleiche Ladung sicher zu stellen. Die experimentellen Ergebnisse auf Röntgenfilmen wurden gescannt und mit HP ScanJet analysiert.
Fucoidan hemmt vollständig Collagenase und Stromelysin Expression bei einer Konzentration von 0,5% w/v ohne übermäßige Hemmung von Proteoglycan Expression, wie es in 3 gezeigt wird. Bei einer Konzentration von 0,1% w/v, gab es eine mächtige Hemmung von Collagenase und Stromelysin Expression ohne jeden hemmenden Effekt auf die Proteoglykan Expression. Diese Daten demonstrieren einen entzündungshemmenden Effekt von Fucoidan.
Beispiel 4: Der Effekt von Fucoidan auf Angiogenese in der chorioallantoischen Membran des Hühnerembryos (CAM Assay).
Befruchtete Hühnereier wurden von einer örtlichen Schlüpfeinrichtung erhalten und in einen Inkubator mit einem automatischen Rotor bei 37°C für 3,5 Tage vor dem Schlüpfen oder Fenster machen platziert.
Blätter von sterilem gewachstem Papier wurden auf das Fenster platziert, das in dem Luftraum angebracht wurde, und wurden verwendet um Kontamination oder Dehydrierung der Eiinhalte zu verhindern. Diese Blätter, in der Größe 4 cm × 4 cm, wurden durch Besprühen mit 70% Ethanol und Trocknen lassen in einer Laminarfluss Sicherheitsbank sterilisiert. Nach drei Tagen wurden die Eier manuell in dem Inkubator gedreht, so dass ihr spitzes Ende für 5–10 Minuten nach oben gerichtet war, um die Ablösung der Eininhalte von der inneren Membran zu ermöglichen. Mit 70% Ethanol und Kimwipes wurde die gesamte Eierschale abgewischt, um die Außenseite des Eis zu säubern und zu reinigen. In einer Laminarfluss Sicherheitsbank wurde das Ei mit dem stumpfen Ende nach oben gehalten und ein Loch wurde in das stumpfe Ende des Eis gemacht, indem vorsichtig die Schale mit dem Ende von einer Pinzette geknackt wurde. Die Schalenreste wurden vorsichtig mit der Pinzette entfernt, um ein Loch in dem stumpfen Ende zu bilden. Dieses runde Loch wurde 2 bis 3 cm Durchmesser groß gemacht, ohne die innere Membran zu beschädigen. Nachdem das Loch in die Schale gemacht wurde, wurde die innere Schalenmembran (die die Eiinhalte beinhaltet) vorsichtig abgerissen und mit der Pinzette entfernt, wobei Sorge getragen wurde, die chorioallantoische Membran (CAM) nicht zu beschädigen (die den Eidotter und den sich entwickelnden Embryo beinhaltet).
Das Loch wurde dann mit dem Blatt sterilisiertem Parafilm Wachspapier bedeckt, indem der Parafilm vorsichtig gestreckt und dann um das Loch gelegt wurde. Das Ei wurde dann in den Eiständer in dem Inkubator (37°C) platziert und in solch einer Weise positioniert, das Rotation verhindert wunde. Nach 6 Tagen wurde jedes Ei eines nach dem anderen aus dem Inkubator (stumpfe Seite nach oben) entfernt, und der Parafilm, der das Fenster bedeckt, wurde für direkten Zugang zu der CAM entfernt, die von dem hinteren Darm des Embryos stammt. Fucoidan geladene Poly(epsilon-caprolacton) (PCL) Pellets wurden hergestellt, indem PCL bei 60°C geschmolzen wurde und das Fucoidan in das PCL physikalisch gemischt wurde und den Pellets ermöglicht wurde, durch Abkühlen auf Raumtemperatur zu erhärten. Die Fucoidanpellets wurden auf das wachsende Kapillarbett der CAM platziert. Die Eiinhalte wurden dann mit dem Parafilmblatt wieder versiegelt und zurück in den 37°C Inkubator platziert. Nach 2 weiteren Tagen, wurde die Analyse des CAM Gefäßsystems aufgezeichnet (48 Stunden nach Platzieren des Wirkstoffs auf das CAM Kapillarbett). Die Wirkung des Wirkstoffes auf die CAM wurden mit einem avaskulärem Maßstab bewertet, der die Effekte des Wirkstoffes als 0, 1, 2 oder 3 bewertet. Die Werte des avaskulärem Maßstabes beschreiben das folgende:

0 Keine antiangiogene Aktivität
1 Mikrogefäß-Reduzierung
2 Kleine avaskuläre Zone, in der Größe des Wirkstoffpellets (2 mm Durchmesser)
3 Avaskuläre Zone in der Größe von 4–5 mm im Durchmesser.

Fucoidan hemmt potent die Angiogenese in der CAM, wie es in Tabelle 1 gezeigt wird. Konzentrationen von Fucoidan, so niedrig wie 2% w/w in PCL, hemmen entweder teilweise oder vollständige die Angiogenese in 4 bzw. 2 CAMs. Tabelle 1: Antiangiogenische Aktivität von Fucoidan. Die Zahl in jeder Säule zeigt die Anzahl der Eier an (CAMs), die keine, partielle oder maximale Inhibierung der Angiogenese zeigen.

Wirkstoffkonzentration	Antiangiogenische Aktivität
	Keine (0)	Partielle (1–2)	Maximale (3)
Fucoidan 2.0%	-	4	2
Fucoidan 5.0%	-	1	4
Fucoidan 15.0%	-	2	3
Fucoidan 30.0%	-	2	1
Kontrolle	11	-	-

Diese Daten demonstrieren eine antiangiogene Aktivität von Fucoidan und zeigen, das seine Polymerformulierung mit langsamer Freisetzung ein wirksames Verfahren zum Freisetzen von therapeutisch wirksamen Konzentrationen des Wirkstoff ohne nicht gewollte Toxizität zu induzieren ist.
Beispiel 5: Die Einkapselung von Fucoidan in Ethylenvinylacetatfilme und Polycaprolacton-Paste
Fünf mg Fucoidan (Sigma) und 45 mg Ethylenvinylacetat (EVA, Molekulargewicht ungefähr 50 k, Polysciences) wurden in 1 ml Dichlormethan gelöst/suspendiert. Zweihundert μl der Lösung wurde auf 1 cm Diameter Teflonscheiben pipettiert und über Nacht trocknen gelassen (Lösungmittelverflüchtigung), um dünne elastische Filme zu bilden, um ungefähr 10 mg Filme mit einer ungefähren Dicke von 100 μm zu ergeben.
Die Geschwindigkeit der Wirkstofffreisezung von diesen Filmen wurde gemessen, indem 5 mg Abschnitte der Filme in 20 ml geschlossene Glasröhren platziert wurden, enthaltend 10 ml Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) pH 7.4. Die Röhren wurden verschlossen, und in einen Kreisschüttler bei 37°C platziert. Zu spezifizierten Zeitpunkten wurden die Röhren entfernt und die Menge des freigesetzten Wirkstoffes wurde durch Absorptionsspektroskopie analysiert. Das Freisetzungsprofil von Fucoidan (4) war gekennzeichnet durch einen anfänglich starken Anstieg der Wirkstofffreisetzung gefolgt durch eine langsame anhaltende Freisetzung. Diese Dosierungsform von Fucoidan stellt eine biokompatible, biologisch abbaubare, injizierbare Formulierung des Wirkstoffes dar, die den Wirkstoff in einer kontrollierten Weise freisetzt.
PCL Paste: Fucoidan wurde in Polycaprolacton gemischt (PCL, Birmingham polymer, Molekular gewicht 54K) bei 60°C durch Verreiben mit einem Spatel bei einer Konzentration von 10% w/w. Diese Mischung wurden dann in 1 ml Plastikspritzen pipettiert und abkühlen gelassen. Diese Formulierung könnte durch eine 18 Gauge Nadel bei 56°C injiziert werden.
Um die Wirkstofffreisetzung aus der PCL Paste zu messen, wurden 10 mg Aliquots geschmolzener Paste auf den Boden von 15 ml Glassröhren injiziert und ihr ermöglicht, sich abzukühlen und sich abzusetzen. Fünfzehn ml PBS wurde zu jeder Röhre hinzu gefügt und die Röhren wurden verschlossen, und über Kopf in einen 37°C Ofen gedreht. Zu spezifizierten Zeitpunkten wurden die Röhren entfernt und die Menge des freigesetzten Wirkstoffes wurde durch Absorptionsspektroskopie analysiert. Das Freisetzungsprofil von Fucoidan wird in 5 gezeigt. Das Freisetzungsprofil von Fucoidan war gekennzeichnet durch einen anfänglich starken Anstieg der Wirkstofffreisetzung gefolgt durch eine langsame anhaltende Freisetzung. Diese Dosierungsform von Fucoidan stellt eine biokompatible, biologisch abbaubare, injizierbare Formulierung des Wirkstoffes dar, die den Wirkstoff in einer kontrollierten Weise freisetzt.
Beispiel 6: Fucoidan beladene Membranen zur Behandlung von chirurgischen Adhäsionen in Ratten.
Das Ratten Darmseitenwandmodell chirurgischer Adhäsionen wurde verwendet, um die Wirkung von Fucoid auf chirurgische Adhäsionen zu untersuchen. In diesem Modell wurden 16 Ratten in zwei Gruppen von 8 aufgespalten. Nach Eingriffs-induziertem Trauma wurden die Ratten sofort mit quervernetzten Hyaluronsäure (HA) Filmen behandelt, die Fucoidan enthielten oder wurden nicht behandelt (Kontrollgruppe).
Materialien und Methoden: Natrium-hyaluronat mit medizinischem Reinheitsgrad wurde von Lifecore Scientific erhalten. Alle Lösungsmittel hatten HPLC Reinheitsgrad und wurden von Fisher erhalten. Plastik Petrischalen wurden von Fisher Scientific erhalten. Ethyl-3-(dimethylamino) carbodiimid (EDAC) und Fucoidan wurden von Sigma (St. Louis. Mo) erhalten.
Herstellung der Filme. Fucoidan geladene Filme wurden hergestellt, in dem eine Lösung mit f 0,6% w/v Fucoidan, 0,4% w/v Natrum-hyaluronat und 0,15% w/v Glyzerin in Wasser zubereitet wurde. Kontrollfilme (keine Fucoidan) wurden hergestellt indem eine Lösung oder Mischung aus 0,4% w/v Natrum-hyaluronat und 0,15% w/v Glyzerin in Wasser zubereitet wurde. Fucoidan geladene Filme und Kontrollfilme wurden aus diesen Lösungen gegossen, indem 4 g jeder Lösung in separate 2,5 cm Durchmesser Plastik Petrischalen pipetiert wurden und für 24 Stunden bei 60°C getrocknet wurden. Das quervernetzende Agens EDAC wurde bei 4 mM mit eingeschlossen (Endkonzentration). Jeder getrocknete Film wurde dann vorsichtig von den Petrischalen mit einer chirurgischen Klinge entfernt.
Sterilisierung. Filme wurden zwischen 5 cm × 5 cm Wägepapier (Fisher scientific) gepackt und in Plastikbeuteln hitzeversiegelt. Filme wurden dann endsteriliert mit Gammastrahlung aus einer Cobalt-60 Quelle und gegenüber 2,5 Mrad Strahlung exponiert, wobei die versiegelte Röhre auf Eis gekühlt wurde.
Tierstudien. Chirurgische Traumata wurden wie folgt induziert 16 erwachsene Sprague Dawley Ratten, jede 225–350 g wiegend, wurden von den Charles River Laboratories, Wilmington, MA, erhalten. Nur Tiere, die im Ganzen normal wirkten (d. h. eine sauberes ordentliches Fell, helle klare Augen und eine aktive Haltung zeigten) wurden in der Studie verwendet. Die Tiere wurden per Zufall eine der zwei Gruppen zugewiesen, gewogen und mit einer einzelnen Injektion Ketaminhydrochlorid (6 mg/kg) betäubt, die in den großen Hüftmuskel verabreicht wurde. Das Abdomen wurde rasiert und mit Alkohol gereinigt. Ein 4 cm Einschnitt wurzle in die Haut gemacht, der ungefähr 2 cm caudal der Linea alba begann, während der Muskel mit Pinzetten gehalten wurde. Der Darm wurden vier mal auf den ventralen und dorsalen Oberflächen mit einem mechanischem Schabgerät abgeschabt, das vom Anwender unabhängigen, kontrollierten Abrieb auf einem definiertem Gebiet ermöglicht. Adhäsionen an den Darm wurden evaluiert und gemäß einem vordefinierten Bewertungssystem bewertet.

0 = keine Adhäsionen
1 = filmartige Adhäsion mit leicht identifizierbarer Ebene
2 = milde Adhäsion mit frei trennbarer Ebene
3 = moderate Adhäsion mit schwieriger Trennung der Ebene
4 = dichte Adhäsion mit nicht trennbarer Ebene
(Grad 1 Adhäsionen sind die niedrigsten Ebenen von erkennbarer Adhäsion (filmartige Adhäsion mit identifizierbarer Ebene)).

Nach Abschabung des Darms, erhielten Tiere in Gruppe 1 keine Behandlung. Tiere in Gruppen 2 erhielten die oben diskutierten Fucoidan-HA Filme. Die Filme wurden um den Darm gewickelt. Die Einschnitte wurden dann mit 3.0 Dexon Nahtmaterial geschlossen. Sieben Tage nach Operation, wurde die Tiere euthanisiert und auf das Vorliegen von Grad 2 (oder höheren) postoperativen Adhäsionen evaluiert. Grad 2 Adhäsionen wurden als milde Adhäsionen mit einer frei trennbaren Ebene definiert.
Ergebnisse:
Tabelle 2.

Gruppe % Mit Adhäsionen = 2 Mittlere Inzidenz ± SA % Ohne Adhäsionen

Kontrolle 75 1.4 ± 0.4 25

Fucoidan geladene Membran 38 0.5 ± 0.2 50

• Die Membranen bedeckten nur die Hälfte des Darms.
• Keine Abnormalitäten nach der Untersuchung der toten Tiere bemerkt (keine Materialreste, keine Ascites, keine Anzeichen von abnormaler Heilung, weder auf dem Darm noch auf dem mittleren Einschnitt)

Die Ergebnisse demonstrieren die wirksame Hemmung der Adhäsionsbildung durch Fucoidan geladene Filme, da die mittlere Inzidenz der Adhäsionen vermindert war und der %-Wert der Ratten ohne Adhäsionen in Fucoidan behandelten Ratten erhöht war. Fucoidan geladene Filme, die den Darm vollständig bedecken, können vielleicht noch wirksamer beim Hemmen von Adhäsionsbildung sein.

Claims

Verwendung eines Fucans für die Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln einer Adhäsion, die möglicherweise an einer erkrankten Stelle in einem Tier ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Krankheit eine chirurgische Stelle ist, und das Fucan zur direkten Abgabe als eine Zusammensetzung an diese erkrankte Stelle ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Fucan zur oralen Verabreichung ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Fucan zur Verabreichung über Injektion an die erkrankte Stelle ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Fucan zur intraokulären, subkutanen, intraperitonealen, intramuskulären, intraartikulären, intralesionalen, intravaginalen, rektalen oder topischen Verabreichung ist.
Die Verwendung gemäß jedem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Fucan Fucoidan ist.
Die Verwendung gemäß jedem der vorstehenden Ansprüche, wobei für die im Wesentlichen kontinuierliche Verabreichung an eine Erkrankte Stelle über die kontrollierte Freisetzung aus einer polymeren Dosierungsform ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die polymere Dosierungsform ein Film, ein Pflaster, eine Paste, eine Mikrokugel, ein Implantat, Gel, Spray oder eine Flüssigkeit ist.
Die Verwendung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Fucan zur Verabreichung als eine pharmazeutische Zusammensetzung in einer Form ist, die mindestens eines von Creme, Paste, injizierbaren Trägerstoff und Polymer umfasst.
Die Verwendung gemäß jedem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Fucan zur Verabreichung als eine pharmazeutische Zusammensetzung ist, die Fucan und eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem anderen Wirkstoff enthält.
Die Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei der Wirkstoff mindestens eines von Paclitaxel, Doxorubicin, Camptothecin, Etopsid, Mitoxantron, Methotrexat, Menadion, Plumbagin, Juglon, Beta-Laperchon Cyclosporin, Sulfasalazin, Steroid, Rapamycin, Retinoid, Docetaxel, Colchicin, einem Antisense-Oligonukleotid, Ribozym und einem Oligonukleotid-RNA-Inhibitor umfasst.
Die Verwendung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Fucan zur Abgabe als Teil einer Zusammensetzung ist und die Zusammensetzung 0.1% bis 35% (Gewicht/Volumen) des Fucan umfasst.
Die Verwendung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Fucan zur Abgabe als Teil einer Zusammensetzung ist und die Zusammensetzung 80% bis 100% (Gewicht/Volumen) des Fucan umfasst.
Die Verwendung gemäß jedem der Anprüche 1 bis 11, wobei das Fucan zur Abgabe als Teil einer Zusammensetzung ist und die Zusammensetzung 5% bis 50% (Gewicht/Volumen) des Fucan umfasst.
Die Verwendung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Fucan zur Abgabe als Teil einer Zusammensetzung ist und die Zusammensetzung 20% bis 80% (Gewicht/Volumen) des Fucan umfasst.
Die Verwendung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Fucan Teil einer Zusammensetzung ist, die ferner wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei der pharmazeutisch verträgliche Trägerstoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pluronic, Zellulose, Alginat, Acrylat, Hyaluronsäure, Polyethylenglykol und Chitosan.
Die Verwendung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Fucan zur Verabreichung direkt an die erkrankte Stelle ist.
Die Verwendung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 18, wobei das Tier ein Mensch ist.
Die Verwendung gemäß jedem der Anprüche 1 bis 19, wobei die Adhäsion eine chirurgische Adhäsion ist.