DE60219419T2

DE60219419T2 - Flt4 (vegfr-3) als ein ziel für krebsdarstellung und anti-krebs-behandlung

Info

Publication number: DE60219419T2
Application number: DE60219419T
Authority: DE
Inventors: Kari P.O.Box 63 ALITALO; Taija Dept. of Mo MAKINEN
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Licentia Oy; Ludwig Cancer Research
Current assignee: Vegenics Pty Ltd
Priority date: 2001-01-19
Filing date: 2002-01-22
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2022-01-23
Also published as: CN1494552A; US20060177901A1; EP1353952B1; JP2004532004A; JP4669984B2; WO2002060950A2; US20160200793A1; ATE359300T1; NO20033285D0; US8940695B2; WO2002060950B1; JP2010088433A; WO2002060950A3; US20150141622A1; US9260526B2; CA2435503C; AU2002248372B2; CA2435503A1; EP1353952A2; DE60219419D1

Description

Diese Anmeldung ist eine Fortsetzungsanmeldung, die die Priorität der US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 09/169.079, eingereicht am 9. Oktober 1998, und der US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 08/901.710, eingereicht am 28. Juli 1997, nunmehr US-Patent Nr. 6.107.046, und der US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 08/340.011, eingereicht am 14. November 1994, nunmehr US-Patent Nr. 5.776.755, und der US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 08/257.754, eingereicht am 9. Juni 1994, nunmehr fallen gelassen, beansprucht; die letzteren beiden sind ihrerseits Teilfortsetzungsanmeldungen der US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 07/959.951, eingereicht am 9. Oktober 1992, nunmehr fallen gelassen. All diese Anmeldungen sind hier vollständig durch Inbezugnahme aufgenommen.
TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Gene für Rezeptoren, insbesondere Gene für Rezeptortyrosinkinasen, deren Insertion in rekombinante DNA-Vektoren und die Herstellung des resultierenden Proteins in Wirtsstämmen von Mikroorganismen und eukaryotischen Wirtszellen. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf Flt4, eine Rezeptortyrosinkinase; auf Flt4-kodierende Nukleotidsequenzen; auf Verfahren zur Erzeugung von Flt4-kodierenden DNAs und deren Genprodukten; auf Nukleinsäuresonden, die spezifisch Nukleinsäuren erkennen (damit hybridisieren), die solche Rezeptoren kodieren; auf Antikörper, die solche Rezeptoren spezifisch erkennen; und auf Verfahren zur Verwendung solcher Sonden und Antikörper und anderer Flt4-bindender Verbindungen, zum Beispiel zur Identifizierung von Lymphgefäßen und Hochendothelvenolen (HEV) in tierischen und menschlichen Geweben und zur Verstärkung oder Verhinderung des Wachstums von Flt4-exprimierenden Zellen bei krankhaften Zuständen.
HINTERGRUND
Das für Entwicklung, Erhaltung und Reparatur differenzierter Zellen und Gewebe verantwortliche Zellverhalten wird zu einem großen Teil durch interzelluläre Signale reguliert, die über Wachstumsfaktoren und ähnliche Liganden und deren Rezeptoren vermittelt werden. Die Rezeptoren sind auf der Zelloberfläche von reagierenden Zellen angeordnet, und sie binden Peptide oder Polypeptide, die als Wachstumsfaktoren bekannt sind, sowie andere hormonartige Liganden. Die Ergebnisse dieser Wechselwirkung sind rasche biochemische Änderungen in der reagierenden Zelle sowie eine rasche und eine langfristige Neujustierung der zellulären Genexpression. Etliche Rezeptoren, die mit verschiedenen Zelloberflächen verbunden sind, können spezifische Wachstumsfaktoren binden.
Die Tyrosinphosphorylierung ist eine der Schlüsselmechanismen der Signalübertragung über die Plasmamembran. Etliche Tyrosinkinasegene kodieren Transmembranrezeptoren für Polypeptid-Wachstumsfaktoren und Hormone wie beispielsweise den Epidermiswachstumsfaktor (EGF), Insulin, den insulinähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-I), Plättchenwachstumsfaktoren (PDGF-A und -B) und Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs) [Heldin et al., Cell Regulation, 1: 555–566 (1990); Ullrich et al., Cell, 61: 243–54 (1990)]. Die Rezeptoren von etlichen hämatopoetischen Wachstumsfaktoren sind Tyrosinkinasen; diese beinhalten c-fms, welches der Koloniestimulierender-Faktor-1-Rezeptor ist [Sherr et al., Cell, 41: 665–676 (1985)] und c- kit, ein ursprünglicher hämatopoetischer Wachstumsfaktorrezeptor [Huang et al., Cell, 63: 225–33 (1990)].
Diese Rezeptoren unterscheiden sich in ihrer Spezifität und Affinität. Im allgemeinen sind Rezeptortyrosinkinasen Glykoproteine, die aus einer extrazellulären Domäne, die in der Lage ist, (einen) spezifische(n) Wachstumsfaktor(en) zu binden, einer Transmembrandomäne, die üblicherweise ein alphahelikaler Bereich des Proteins ist, einer Juxtamembrandomäne (wo der Rezeptor z.B. durch Proteinphosphorylierung reguliert werden kann), einer Tyrosinkinasedomäne (welche die enzymatische Komponente des Rezeptors ist) und einem carboxyterminalen Schwanz, der bei vielen Rezeptoren bei der Erkennung und Bindung der Substrate für die Tyrosinkinasen beteiligt ist, bestehen.
Bei etlichen Rezeptortyrosinkinasen sind die Prozesse des alternativen Spleißens und der alternativen Polyadenylierung in der Lage, mehrere unterschiedliche Polypeptide aus dem selben Gen herzustellen. Diese können die verschiedenen oben aufgezählten Domänen enthalten, oder auch nicht. In der Folge können einige extrazelluläre Domänen als separate, von der Zelle ausgeschiedene, Proteine exprimiert werden, und einigen Formen der Rezeptoren kann die Tyrosinkinasedomäne fehlen, so dass sie nur die über die Transmembrandomäne in die Plasmamembran inserierte extrazelluläre Domäne enthalten, plus einem kurzen carboxyterminalen Schwanz.
An der Physiologie des Gefäßsystems, der embryonalen Vaskulogenese und Angiogenese, der Blutgerinnung, Wundheilung und Reproduktion sowie etlichen Krankheiten ist das Gefäßendothel, das die Blutgefäße auskleidet, beteiligt. Die Entwicklung des Gefäßbaums erfolgt durch Angiogenese, und, nach einigen Theorien, beginnt die Bildung des Lymphsystems kurz nach der Entwicklung von Arterien und Venen durch Sprossung von Venen. Siehe Sabin, F. R., Am. J. Anat., 9: 43 (1909); und van der Putte, S. C. J, Adv. Anat. Embryol. Cell Biol., 51: 3 (1975).
Nach der fötalen Periode proliferieren Endothelzellen sehr langsam, ausgenommen während der mit der Neovaskularisierung verbundenen Angiogenese. Wachstumsfaktoren, die die Angiogenese stimulieren, üben ihre Wirkung über spezifische endotheliale Zelloberflächen-Rezeptortyrosinkinasen aus.
Es wurde gezeigt, dass unter den Liganden für Rezeptortyrosinkinasen der Plättchenwachstumsfaktor (Platelet Derived Growth Factor, PDGF) in der Hühner-Chorioallantoismembran angiogen ist, wenn auch schwach. Der transformierende Wachstumsfaktor α (TGFα) ist ein angiogener Faktor, der durch mehrere Tumorzelltypen und durch Makrophagen ausgeschieden wird. Der Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF), der Ligand des c-met-Protoonkogen-kodierten Rezeptors, ist ebenfalls stark angingen und induziert ähnliche Reaktionen wie die von TGFα in kultivierten Endothelzellen.
Hinweise zeigen, dass endothelzellspezifische Wachstumsfaktoren und Rezeptoren vorhanden sind, die primär für die Stimulation des Endothelzellwachstums, Differenzierung sowie bestimmte differenzierte Funktionen verantwortlich sein können. Der am besten untersuchte Wachstumsfaktor ist der Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF), ein Mitglied der PDGF-Familie. Der Gefäßendothelwachstumsfaktor ist ein dimeres Glykoprotein aus Disulfid-verknüpften 23-kDa-Untereinheiten, der aufgrund seiner mitogenen Aktivität gegenüber Endothelzellen und seiner Fähigkeit zur Induktion von Gefäßpermeabilität (daher sein alternativer Name Gefäßpermeabilitätsfaktor) entdeckt wurde. Andere berichtete Wirkungen von VEGF beinhalten die Mobilisierung von intrazellulärem Ca²⁺, die Induktion der Plasminogenaktivator- und Plasminogenaktivatorinhibitor-1-Synthese, die Stimulation des Hexose-Transports in Endothelzellen und die Förderung der Monozytenmigration in vitro. Vier VEGF-Isoformen, kodiert durch unterschiedliche mRNA-Spleißvarianten, scheinen gleichermaßen in der Lage zu sein, die Mitogenese von Endothelzellen zu stimulieren. Die 121- und 165-Aminosäuren-Isoformen von VEGF werden in löslicher Form ausgeschieden, wohingegen die Isoformen mit 189- und 206 Aminosäureresten mit der Zelloberfläche verbunden bleiben und eine starke Affinität für Heparin aufweisen. Lösliche nicht-heparinbindende und heparinbindende Formen sind ebenfalls für den verwandten Plazentawachstumsfaktor (PlGF; 131 beziehungsweise 152 Aminosäuren) beschrieben worden, der in der Plazenta, trophoblastischen Tumoren und kultivierten menschlichen Endothelzellen exprimiert wird.
Das Muster der VEGF-Expression legt seine Beteiligung an der Entwicklung und Erhaltung des normalen Gefäßsystems und bei der Tumorangiogenese nahe. Während der murinen Entwicklung, exprimiert das gesamte 7,5-Tage-Postcoital-Endoderm VEGF, und das ventrikuläre Neuroektoderm produziert VEGF im Stadium des Kapillareneinwuchses. An Tag zwei der Wachtel-Entwicklung zeigen sowohl der vaskularisierte Bereich des Dottersacks als auch der gesamte Embryo eine Expression von VEGF. Darüber hinaus zeigen Epithelzellen in der Nähe von fenestrierten Endothelien bei erwachsenen Mäusen anhaltende VEGF-Expression, was eine Rolle bei der Erhaltung dieses/dieser spezifischen Endothelien-Phänotyps und -Funktion nahelegt.
Zwei hochaffine Rezeptoren für VEGF sind charakterisiert worden, VEGFR-1/Flt1 (fms-ähnliche Tyrosinkinase-1) und VEGFR-2/Kdr/Flk-1 (Kinaseinsertionsdomäne, enthaltend Rezeptor/fötale-Leberkinase-1). Diese Rezeptoren werden in die PDGF-Rezeptorfamilie klassifiziert. Die VEGF-Rezeptoren haben jedoch sieben immunglobulinähnliche Schlaufen in ihren extrazellulären Domänen gezeigt (im Gegensatz zu fünf bei anderen Mitgliedern der PDGF-Familie) und ein längeres Kinase-Insert. Die Expression von VEGF-Rezeptoren tritt hauptsächlich in Gefäßendothelzellen auf, obwohl einige auch auf Monozyten und Melanomzellinien zugegen sein mögen. Nur von Endothelzellen wurde berichtet, dass sie in Reaktion auf VEGF-proliferieren, und Endothelzellen aus verschiedenen Quellen zeigen verschiedene Reaktionen. Die Signale, die durch VEGFR-1 und VEGFR-2 vermittelt werden, erscheinen daher zelltypspezifisch.
VEGFR-1 und VEGFR-2 binden VEGF165 mit hoher Affinität (K_d etwa 20 pM beziehungsweise 200 pM). Vom Flk-1-Rezeptor ist gezeigt worden, dass er in Reaktion auf VEGF eine Autophosphorylierung durchmacht, eine Phosphorylierung von Flt1 war jedoch kaum nachweisbar. VEGFR-2-vermittelte Signale verursachen auffallende Änderungen in der Morphologie, Aktinreorganisation und Membrankräuselung ("membrane ruffling") von Schweine-Aortaendothelzellen, die diesen Rezeptor überexprimieren. In diesen Zellen vermittelte VEGFR-2 auch die Liganden-induzierte Chemotaxis und Mitogenität, wohingegen VEGFR-1-transfizierten Zellen mitogene Reaktionen auf VEGF fehlten. Im Gegensatz dazu besaß VEGF eine starke wachstumsstimulierende Wirkung auf sinusoidale Endothelzellen von Ratten, die VEGFR-1 exprimierten. Phosphoproteine, die mit VEGFR-1 und VEGFR-2 copräzipitieren, sind unterschiedlich, was darauf hindeutet, dass verschiedene Signalmoleküle mit rezeptorspezifischen intrazellulären Sequenzen wechselwirken.
Bei In-vitro-Hybridisierungsstudien wurde Maus-VEGFR-2-mRNA-Expression im Dottersack und intraembryonalen Mesoderm (geschätzte 7,5-Tage-post-coitum(p.c.)-Embryos gefunden, aus dem sich das Endothel ableitet, und später in mutmaßlichen Angioblasten, im Endokard und Endothel großer und kleiner Gefäße (12,5 Tage p.c.). Reichlich vorhandene VEGFR-2-mRNA in proliferierenden Endothelzellen von Gefäßsprossen und sich verzweigenden Gefäßen von embryonalem und frühem postnatalen Hirn und eine verminderte Expression in adultem Hirn deuteten darauf hin, dass VEGFR-2 ein bedeutender Regulator der Vaskulogenese und Angiogenese ist. Die VEGFR-1-Expression war gleichermaßen assoziiert mit der frühen Gefäßentwicklung in Mausembryos und mit der Neovaskularisierung in heilenden Hautwunden. Hohe Niveaus der VEGFR-1-Expression wurden jedoch in adulten Organen detektiert, was darauf hindeutet, dass VEGFR-1 eine Funktion im ruhenden Endothel reifer Gefäße hat, die nicht mit dem Zellwachstum verbunden ist. Das Vogel-Homologon von VEGFR-2 wurde mit Beginn der Gastrulation im Mesoderm beobachtet, wohingegen das VEGFR-1-Homologon erstmals in Zellen gefunden wurde, die endotheliale Marker co-exprimieren. Bei In-vitro-Wachtel-Epiblasten-Kulturen regulierte FGF-2, der für die vaskulogene Differenzierung dieser Zellen erforderlich ist, die VEGFR-2-Expression herauf. Es zeigte sich, dass die Expression beider VEGF-Rezeptoren später in der Entwicklung stärker beschränkt wird. In menschlichen fötalen Geweben zeigten VEGFR-1 und VEGFR-2 überlappende, jedoch leicht unterschiedliche, Expressionsmuster. Diese Daten deuten darauf hin, dass VEGF und dessen Rezeptoren in einer parakrinen Weise agieren, um die Differenzierung von Endothelzellen und die Neovaskularisierung von Geweben zu regulieren.
Kürzlich ist gezeigt worden, das VEGF ein Hypoxie-induzierter Stimulator des Endothelzellwachstums und der Angiogenese ist, und es wurde gezeigt, dass die Hemmung der VEGF-Aktivität unter Verwendung spezifischer monoklonaler Antikörper das Wachstum von experimentellen Tumoren und deren Blutgefäßdichte vermindert. [Ferrara et al., Endocrine Reviews, 18: 4–25 (1997); Shibuya et al., Adv. Cancer Res., 67: 281–316 (1995); Kim et al., Nature, 362: 841–844 (1993).]
Das Wachstum solider Tumoren über wenige Kubikmillimeter Größe hinaus hängt von der Gefäßversorgung ab, was die Angiogenese zu einem attraktiven Ziel für die Antikrebstherapie macht. Es sind ermutigende Ergebnisse berichtet worden mit endogenen angiogenen Inhibitoren oder "Statinen", die Angiostatin, ein Fragment, von Plasminogen, und Endostatin, ein Fragment von Kollagen 18, beinhalten. [O'Reilly et al., Cell, 79: 315–328 (1994); O'Reilly et al., Cell, 88: 277–85 (1997).] Beide Faktoren werden normal durch primäre Tumoren produziert und halten die Metastase ruhend. Von der systemischen Verabreichung beider Statine ist gezeigt worden, dass sie das Ruhen primärer Tumoren in Tiermodellen induziert und aufrechterhält. Die Rezeptoren und die Signalwirkung durch Statine sowie die Proteasen, die sie aktivieren, müssen noch identifiziert werden. Es besteht ein Bedarf für weitere therapeutische Moleküle zur Kontrolle der Angiogenese bei der Behandlung von Krebs und anderen pathologischen Krankheitszuständen.
Es wurde gezeigt, dass primäre Brustkrebse etliche angiogene Polypeptide exprimieren, von denen VEGF der am meisten verbreitete ist. [Siehe z.B. Relf et al., Cancer Res., 57: 963–969 (1997).] Tumorzellen enthielten hohe Niveaus von VEGF-mRNA in sowohl invasiven als auch nicht-invasiven, duktalen (In-situ-)Brustkarzinomen. [Brown et al., Hum. Pathol., 26: 86–91 (1995).] Die den In-situ-Karzinomen benachbarten Endothelzellen exprimierten VEGFR-1- und VEGFR-2-mRNA. VEGF und dessen Rezeptoren können zur angiogenen Entwicklung von malignen Brusttumoren beitragen, da in etlichen unabhängigen Studien Korrelationen gefunden wurden zwischen der Gefäßdichte des Tumors und der Prognose der Krankheit. [Weidner et al., J. Natl. Cancer Inst., 84: 1875–1887 (1992).] Es besteht ein Bedarf für zusätzliche Marker für Brustkrebs und Brustkrebs-bezogene Angiogenese, um die Diagnose und das Screening zu verbessern und um als Ziel für einen therapeutischen Eingriff zu dienen.
Eine Hauptfunktion des Lymphsystems besteht darin, für einen Rückfluss von Flüssigkeit aus Geweben zu sorgen und viele extravaskulären Substanzen zurück in das Blut zu transportieren. Während des Reifungsprozesses verlassen darüber hinaus Lymphozyten das Blut, wandern durch lymphoide Organe und andere Gewebe und treten in die Lymphgefäße ein, und kehren durch den Milchbrustgang zum Blut zurück. Spezialisierte Venolen, Hochendothelvenolen (HEVs), binden Lymphozyten erneut und bewirken deren Extravasation in Gewebe. Die Lymphgefäßen, und insbesondere die Lymphknoten, spielen daher eine wichtige Rolle bei der Immunologie und bei der Metastaseentwicklung verschiedener Tumoren.
Seit Beginn des 20. Jahrhunderts wurden drei verschiedene Theorien hinsichtlich des embryonalen Ursprungs des Lymphsystems vorgestellt. Lymphgefäße sind jedoch aufgrund der Abwesenheit von für sie erhältlichen bekannten spezifischen Markern schwer zu identifizieren.
Lymphgefäße werden am häufigsten mit Hilfe der Lymphografie untersucht. Bei der Lymphografie wird ein Röntgenkontrastmittel direkt in das Lymphgefäße injiziert. Dieses Kontrastmittel wird entlang der efferenten Drainagegefäße des Lymphsystems verteilt. Das Kontrastmittel wird in Lymphknoten gesammelt, wo es für die Zeit von bis zu einem halben Jahr verbleibt, währenddessen eine Röntgenanalyse die Nachverfolgung der Lymphknotengröße und -architektur ermöglicht. Diese Diagnose ist bei Krebspatienten mit Metastasen in den Lymphknoten und bei lymphatischen Malignitäten, wie beispielsweise einem Lymphom, besonders wichtig. Verbesserte Materialien und Verfahren zur Abbildung von Lymphgeweben werden in der Fachwelt benötigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein auf Chromosom 5 lokalisiertes Gen für eine neue Rezeptortyrosinkinase, identifiziert als ein unbekanntes Tyrosinkinase-homologes PCR-cDNA-Fragment aus menschlichen Leukämiezellen [Aprelikova et al., Cancer Res., 52: 746–748 (1992)]. Dieses Gen und dessen kodiertes Protein werden als Flt4 bezeichnet. Die Abkürzung kommt von dem Wort fms-ähnliche Tyrosinkinase 4 (fms-like tyrosinkinase 4).
Flt4 ist eine Rezeptortyrosinkinase, die in der Struktur mit den Produkten der VEGFR-1- und VEGFR-2-Gene verwandt ist. Aufgrund dieser Ähnlichkeit und der nachfolgend entdeckten Ähnlichkeiten zwischen Liganden für diese drei Rezeptoren ist der Flt4-Rezeptor darüber hinaus als VEGFR-3 bezeichnet worden. Die Bezeichnungen Flt4 und VEGFR-3 werden hier austauschbar verwendet. Trotz der Ähnlichkeit zwischen diesen drei Rezeptoren unterscheidet sich die reife Form von Flt4 von den VEGFRs darin, dass sie in der extrazellulären Domäne proteolytisch in zwei Disulfid-verknüpfte Polypeptide von 125/120 kD und 75 kD gespalten wird. Das Flt4-Gen kodiert 4,5- und 5,8-kb-mRNAs, die alternative 3'-Exons zeigen und Polypeptide von 190 kD beziehungsweise 195 kD kodieren.
Ein weiterer Anhaltspunkt für eine Unterscheidung besteht darin, dass VEGF keine spezifische Bindung an Flt4 zeigt und dessen Autophosphorylierung nicht induziert.
Ein Vergleich von Flt4-, Flt1- und KDR/Flk-1-Rezeptor-mRNA-Signalen zeigte überlappende, jedoch unterschiedliche Expressionsmuster in den untersuchten Geweben. Kaipainen, et al., J. Exp. Med., 178: 2077 (1993). Die Flt4-Genexpression scheint stärker beschränkt zu sein als die Expression von VEGFR-1 oder VEGFR-2. Die Expression von Flt4 wird erst detektierbar durch In-situ-Hybridisierung in den Angioblasten des Kopfmesenchyms, der Kardinalvene und extraembryonal in der Allantois von 8,4-Tage-Postcoital-Mausembryos. In 12,5-Tage-Postcoital-Embryos wird das Flt4-Signal auf sich entwickelnden venösen und mutmaßlichen lymphatischen Endothelien beobachtet, arterielle Endothelien scheinen jedoch negativ zu sein. Während späterer Stadien der Entwicklung wird die Flt4-mRNA beschränkt auf sich entwickelnde Lymphgefäße. Nur die lymphatischen Endothelien und einige Hochendothelvenolen exprimieren Flt4-mRNA in adulten menschlichen Geweben, und eine erhöhte Expression tritt in lymphatischen Sinus in metastatischen Lymphknoten und im Lymphangiom auf. Die Ergebnisse stützen die Theorie des venösen Ursprungs von Lymphgefäßen.
Das Proteinprodukt der Flt4-Rezeptortyrosinkinase-cDNA, kloniert aus einer menschlichen Erythroleukämie-Zellinie, ist N-glykosyliert und enthält sieben immunglobulinähnliche Schlei fen in ihrer extrazellulären Domäne. Die zytoplasmatische Tyrosinkinasedomäne von Flt4 ist auf dem Aminosäureniveau zu etwa 80% identisch mit den entsprechenden Domänen von Flt1 und KDR und zu etwa 60% identisch mit den Rezeptoren für den Plättchenwachstumsfaktor, koloniestimulierenden Faktor 1, Stammzellfaktor und Flt1-Rezeptor. Siehe Pajusola et al., Cancer Res., 52: 5738 (1992).
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Polynukleotide (z.B. DNA- oder RNA-Segmente definierter Struktur) bereit, die eine Flt4-Rezeptortyrosinkinase kodieren, die für die Herstellung von Flt4-Protein und Peptidfragmenten davon, und zur Gewinnung verwandter Gene aus anderen Quellen nützlich ist.
Die vorliegende Erfindung stellt einen rekombinanten DNA-Vektor bereit, der einen die Flt4-Rezeptortyrosinkinase oder ein verwandtes Protein kodierenden heterologen Abschnitt enthält, der in der Lage ist, in einen Mikroorganismus oder eine eukaryotische Zelle inseriert zu werden, und der in der Lage ist, das kodierte Protein zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung stellt eukaryotische Zellen bereit, die in der Lage sind, geeignete Mengen der Flt4-Rezeptortyrosinkinase und Proteine von ähnlicher Funktion aus vielen Arten bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt Peptide bereit, die synthetisch im Labor oder durch Mikroorganismen hergestellt werden können, wobei die Peptide die Aktivität des natürlichen Flt4-Rezeptortyrosinkinaseproteins imitieren. In einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf Peptide gerichtet, die die Aktivität des Flt4-Rezeptor-Tyrosinkinaseproteins hemmen.
Besonders bevorzugt sind sie die Peptide ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer Flt4-Kurzform, deren Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz in den SEQ ID NO: 1 und 2 wiedergegeben sind; und (b) eine zweite Form mit anderen Nukleotid- und entsprechenden Aminosäureresten an deren Carboxylterminus, d.h. eine Flt4-Langform, deren Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz in den SEQ ID NO: 3 und 4 wiedergegeben sind. Die Flt4-Langform weist eine Länge von 1363 Aminosäureresten auf.
DNA- und RNA-Moleküle, rekombinante DNA-Vektoren und modifizierte Mikroorganismen oder eukaryotische Zellen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die jedwedes der oben angegebenen Proteine oder Peptide kodiert, sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung. Insbesondere sind Sequenzen besonders bevorzugt, die sämtliche oder einen Teil der folgenden zwei DNA-Sequenzen, eine komplementäre DNA- oder RNA-Sequenz oder eine entsprechende RNA-Sequenz umfassen: (a) eine DNA-Sequenz wie SEQ ID NO: 1, kodierend Flt4-Kurzform [SEQ ID NO: 2], und (b) eine DNA-Sequenz wie SEQ ID NO: 3, kodierend ein Flt4, wobei die Nukleotide 3913–4416 der SEQ ID NO: 1 geändert sind, kodierend Flt4-Langform [SEQ ID NO: 4].
DNA- und RNA-Moleküle, die Abschnitte der größeren Sequenz enthalten, werden auch zur Verwendung bei der Ausführung bevorzugter Aspekte der Erfindung hinsichtlich der Produktion solcher Peptide durch die Techniken der Gentechnik und die Herstellung von Oligonukleotidsonden bereitgestellt.
Da die das Flt4-Protein kodierende DNA-Sequenz hier identifiziert wird, kann die das Flt4-Protein kodierende DNA zum Beispiel durch Polymerasekettenreaktion oder durch Syntheseche mie unter Verwendung kommerziell erhältlicher Geräte hergestellt werden, wonach das Gen in jeden der vielen verfügbaren DNA-Vektoren und unter Verwendung bekannter Techniken der rekombinanten DNA-Technologie inseriert werden kann. Darüber hinaus sind auch automatisierte Geräte erhältlich, die die direkte Synthese jedes der hier offenbarten Proteine leicht verfügbar macht.
Die vorliegende Erfindung ist auch gerichtet auf Flt4-Peptide und andere Konstrukte und die Verwendung von Flt4 als spezifischen Marker für lymphatische Endothelzellen.
In einer besonderen Ausführungsform ist die Erfindung gerichtet auf Nukleinsäuresonden und Antikörper, die Flt4 erkennen, insbesondere auf monoklonale Antikörper und Zusammensetzungen, die solche Antikörper enthalten.
Ebenfalls in einer besonderen Ausführungsform ist die Erfindung gerichtet auf ein Verfahren zur Überwachung von Lymphgefäßen in Gewebeproben und in Organismen. Darüber hinaus ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, klinische Detektionsverfahren bereitzustellen, die den Zustand des Lymphgewebes und insbesondere von Lymphgefäßen (Entzündung, Infektion, Traumata, Wachstum etc.) beschreiben, und Verfahren zur Detektion von Lymphgefäßen, und somit der lymphatischen Vaskularisierung, in einem Organismus bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, monoklonale Antikörper bereitzustellen, die das Flt4-Rezeptorprotein oder verschiedene Epitope davon spezifisch erkennen. Es ist eine Aufgabe der Erfindung, diese monoklonalen Antikörper für diagnostische Zwecke zur Detektion und Messung der Menge von Flt4-Rezeptoren in Geweben, insbesondere in Lymph geweben, zu verwenden. Im Zusammenhang mit Anti-Flt4-Antikörpern bedeuten die Ausdrücke "Flt4 spezifisch erkennen", "spezifisch an Flt4 binden", "spezifisch für Flt4" und dergleichen, dass ein Antikörper gegenüber anderen endothelialen Zelloberflächenrezeptoren, einschließlich VEGFR-2/Kdr/Flk-1 und VEGFR-1/Flt1, bevorzugt an Flt4 bindet (und damit eine Immunreaktion eingeht). Somit sind Anti-Flt4-Antikörper oder andere Flt4-bindende Verbindungen, die "spezifisch für" Flt4 sind, nützlich zur Identifikation und/oder Markierung von Flt4 in Geweben oder biologischen Proben gemäß den hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren (zum Beispiel medizinische Abbildung, Detektion, Screening oder zielgerichtete Therapie), weil sie überhaupt nicht an Epitope von anderen Antigenen binden, oder andere Antigene lediglich mit einer Affinität binden, die ausreichend niedriger als ihre Flt4-Bindungsaffinität ist, um in diesen praktischen Zusammenhängen unwesentlich sein.
Ein anderer Aspekt der vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit von Flt4-Rezeptoren in einer Zellprobe, umfassend die Schritte des: (a) Exponierens einer Zellprobe gegenüber einem Antikörper, insbesondere einem monoklonalen Antikörper, gemäß der vorliegenden Erfindung; und (b) Detektierens der Bindung des monoklonalen Antikörpers an Flt4-Rezeptoren. Wie aus der folgenden ausführlichen Beschreibung ersichtlich sein wird, hat die Information hinsichtlich der Anwesenheit, Quantität, Dichte und Lokalisierung des Flt4-Rezeptors in Gewebeproben diagnostische und prognostische Relevanz hinsichtlich des Typs und der Schwere eines Krankheitszustandes; und hat therapeutische Relevanz, wo es wünschenswert ist, Anti-Flt4-basierte Behandlungsschemata spezifisch ausschließlich an jene Patienten anzupassen, die Krankheiten aufweisen, die ge kennzeichnet sind durch Flt4-Expression in Tumoren oder in Blut- oder Lymphgefäßen und -geweben, die einen Tumor umgeben, versorgen oder stützen. Das Screening auf die Anwesenheit des Flt4-Rezeptors kann somit einen ersten Schritt in einem therapeutischen Schema und/oder einen Überwachungsschritt im Verlauf der Therapie bilden.
Die Erfindung ist ferner gerichtet auf ein Verfahren zum Modulieren (zum Beispiel Entgegenwirken oder Verstärken) der Funktion von Flt4 bei der lymphatischen Vaskularisierung und bei entzündlichen, infektiösen und immunologischen Zuständen. Zum Beispiel umfasst in einer Ausführungsform ein solches Verfahren das Hemmen der Flt4-vermittelten lymphatischen Vaskularisierung durch Bereitstellen von Mengen einer Flt4-bindenden Verbindung, die ausreichen, die Flt4-Endothelzellorte, die an einer solchen Reaktion beteiligt sind, zu blockieren, insbesondere wenn die Flt4-Funktion mit einer Krankheit wie beispielsweise metastatischen Krebsen, Lymphomen, Entzündung (chronisch oder akut), Infektionen und Immunkrankheiten, verbunden ist. Da viele Tumoren durch die Lymphgefäße metastasieren, wird von der Therapie, die die Wechselwirkung zwischen Flt4-Liganden und Flt4 direkt blockiert, erwartet, eine breite Anwendung für die Hemmung der Tumormetastase als Teil eines Antikrebsbehandlungschemas zu haben.
Die Erfindung ist ferner gerichtet auf einen spezifischen Flt4-stimulierenden Liganden und monoklonale Antikörper und deren Verwendung zur Stimulierung lymphatischer Endothelien und Fragmente und Peptide sowie Antikörper, die durch Erforschung des Liganden erhalten werden, zur Hemmung der Flt4-Funktion, falls erwünscht, wie beispielsweise bei verschiedenen Krankheitszuständen, die eine Flt4-Funktion beinhalten.
Die Erfindung stellt eine Zellinienquelle für die Flt4-Rezeptortyrosinkinase bereit. Unter Verwendung des konditionierten Mediums aus diesen Zellen kann der Flt4-Ligand gereinigt werden oder unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik Standard sind, kloniert werden. Unter Verwendung dieses konditionierten Mediums oder des gereinigten Liganden werden ein Testsystem für den Flt4-Liganden und Dimerisierungsinhibitoren sowie Inhibitoren der Flt4-Signalübertragung erhalten, die die Identifikation und Herstellung solcher Inhibitoren ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst konditioniertes Medium von der PC-3-Zellinie ein Protein oder ein Fragment davon, das in der Lage ist, den Flt4-Rezeptor zu stimulieren und das Wachstum und die Differenzierung sowie die differenzierten Funktionen bestimmter Endothelzellen zu regulieren. Der Flt4-Ligand oder dessen Peptide oder Derivate sind nützlich bei der Regulation des Wachstums und der Differenzierung von Endothelzellen und deren differenzierter Funktionen, und bei der Erzeugung von Agonisten und Antagonisten für den Liganden. Insbesondere ist der Flt4-Ligand nützlich bei der Regulation lymphatischer Endothelien. Aufgereinigt oder aus einer rekombinanten Quelle hergestellt, kann der Flt4-Ligand jedoch auch den verwandten KDR/Flk-1-Rezeptor stimulieren.
Die Identifikation von Flt4-stimulierenden Liganden macht es direkt möglich, auf Inhibitoren dieses Liganden oder Inhibitoren der Flt4-Funktion zu testen. Solche Inhibitoren werden einfach zu dem den Flt4-Liganden enthaltenden konditionierten Medium zugegeben, und wenn sie die Autophosphorylierung hemmen, agieren sie als Flt4-Signalübertragungsinhibitoren. Zum Beispiel können rekombinante oder synthetische Peptide (ein schließlich, aber nicht beschränkt auf Fragmente der extrazellulären Domäne von Flt4) auf Hemmung der Flt4-Liganden-Wechselwirkung oder Flt4-Dimerisierung getestet werden. Solche mutmaßlichen Inhibitoren von Flt4 und, zusätzlich, Antikörper gegen den Flt4-Liganden, Peptide oder andere die Flt4-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung blockierende Verbindungen sowie Antisinn-Oligonukleotide, die komplementär sind zu der Sequenz der mRNA, die den Flt4-Liganden kodiert, sind nützlich bei der Regulation von Endothelzellen und bei der Behandlung von Krankheiten, die mit der Endothelzellfunktion verbunden sind.
Eine detaillierte Charakterisierung des Flt4-Liganden, bezeichnet als VEGF-C, ist in der PCT-Patentanmeldungen Nr. PCT/US98/01973, eingereicht am 2. Februar 1998, und veröffentlicht als internationale Veröffentlichung Nr. WO 98/33917, in der PCT-Patentanmeldungen PCT/FI96/00427, eingereicht am 1. August 1996 und veröffentlicht als internationale Veröffentlichung WO 97/05250, und in den Prioritätsdokumenten zu den US-Patentanmeldung, deren Priorität dort in Anspruch genommen wird, bereitgestellt, die hier sämtlich durch Inbezugnahme aufgenommen sind. Die abgeleitete Aminosäuresequenz für Präpro-VEGF-C ist hier in SEQ ID NO: 21 wiedergegeben.
Eine detaillierte Beschreibung des zweiten Flt4-Liganden, bezeichnet als VEGF-D, ist in Achen, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 95 (2): 548–553 (1998) und in der Genbank-Zugriffsnummer AJ000185 bereitgestellt, die beide durch Inbezugnahme hier aufgenommen sind. Die abgeleitete Aminosäuresequenz für Präpro-VEGF-D ist hier in der SEQ ID NO: 22 wiedergegeben.
Die Erfindung ist auch gerichtet auf ein Verfahren zur Behandlung eines Säugetierorganismus, der an einer Krankheit leidet, die gekennzeichnet ist durch Expression von Flt4-Tyrosinkinase (Flt4) in Zellen, umfassend den Schritt der Verabreichung einer Zusammensetzung an einen Säugetierorganismus, wobei die Zusammensetzung eine Verbindung umfasst, die wirksam ist, die Bindung eines Flt4-Ligandenproteins an Flt4, das in Zellen des Organismus exprimiert wird, zu hemmen, wodurch die Flt4-Funktion gehemmt wird. Die Krankheit können Krankheiten sein, die bereits oben erwähnt wurden, wie beispielsweise Krankheiten, die gekennzeichnet sind durch unerwünschte lymphatische Vaskularisierung. Darüber hinaus ist entdeckt worden, dass die Flt4-Expression auch in der Blutgefäß-Vaskulatur auftritt, die verbunden ist mit zumindest einigen Brustkrebsen und möglicherweise anderen Krebsen (d.h bei einem Niveau, das die kaum detektierbaren oder undetektierbaren Expressionsniveaus in der Blutgefäß-Vaskulatur von entsprechendem normalen (gesunden) Gewebe deutlich übersteigt). In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Zellen somit Endothelzellen (lymphatisch oder vaskulär). In anderen Ausführungsformen umfassen die Zellen neoplastische Zellen wie beispielsweise bestimmte Lymphome, die Flt4 exprimieren. Die Behandlung von Menschen ist speziell vorgesehen.
Unter einer "Verbindung, die wirksam ist, die Bindung eines Flt4-Ligandenproteins an in Zellen des Organismus exprimiertem Flt4 zu hemmen" wird jede Verbindung verstanden, die die Bindung des hier als vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor C beschriebenen Flt4-Liganden, wie er aus PC-3-konditioniertem Medium isolierbar ist, hemmt. Es wird davon ausgegangen, dass solche Verbindungen auch wirksam sein werden zur Hemmung der Bindung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors D an Flt4. Beispielhafte Verbindungen bein halten die folgenden Polypeptide: (a) ein Polypeptid, umfassend ein antigenbindendes Fragment eines Anti-Flt4-Antikörpers; (b) ein Polypeptid, umfassend ein lösliches Flt4-Fragment (z.B. ein Fragment der extrazellulären Domäne), wobei das Fragment und das Polypeptid in der Lage sind, an einen Flt4-Liganden zu binden; (c) ein Polypeptid, umfassend ein Fragment oder ein Analogon eines Vertebraten-Gefäßendothelwachstumsfaktor-C(VEGF-C)Polypetids, wobei das Polypeptid und das Fragment oder Analogon den in nativen Wirtszellen (d.h. Zellen des Organismus, die das native Flt4-Protein auf ihrer Oberfläche exprimieren) exprimierten Flt4 binden, jedoch nicht aktivieren; und (d) ein Polypeptid, umfassend ein Fragment oder ein Analogon eines Vertebraten-Gefäßendothelwachstumsfaktor-D(VEGF-kD)-Polypeptids, wobei das Polypeptid und das Fragment oder Analogon den auf nativen Wirtszellen exprimierten Flt4 binden, jedoch nicht aktivieren. Kleinmolekulare Inhibitoren, die durch Standard-In-vitro-Screeningtests, z.B. unter Verwendung von VEGF-C und rekombinant exprimierten Flt4 identifizierbar sind, sind ebenfalls vorgesehen. Polypeptide, die ein antigenbindendes Fragment eines Anti-Flt4-Antikörpers umfassen, sind stark bevorzugt. Solche Polypeptide beinhalten zum Beispiel polyklonale und monoklonale Antikörper, die Flt4 spezifisch binden; Fragmente solcher Antikörper; chimäre und humanisierte Antikörper; bispezifische Antikörper, die spezifisch an Flt4 binden und auch spezifisch an ein anderes Antigen und dergleichen binden. Die Verwendung solcher Verbindungen, die an zirkulierenden Flt4-Liganden binden und dadurch die Bindung des Liganden an Flt4 hemmen, ist ebenfalls vorgesehen. Solche Verbindungen beinhalten Anti-VEGF-C- oder Anti-VEGF-D-Antikörper oder Polypeptide, die Antigen bindende Fragmente davon umfassen. In einer verwandten Variante sieht die Erfindung Behandlungsverfahren vor, die die intrazelluläre Flt4- Signalübertragung stromabwärts unterbrechen, wodurch die Flt4-Funktion gehemmt wird.
In einer bevorzugten Variante umfasst die Verbindung ferner eine detektierbare Markierung wie hier andernorts beschrieben, oder ein zytotoxische Mittel. Beispielhafte zytotoxische Mittel beinhalten Pflanzentoxine (z.B. Ricin, Saporin), Bakterien- oder Pilztoxine, Radioisotope (z.B. 211-Astatin, 212-Wismut, 90-Yttrium, 131-Iod, 99m-Technetium und andere hier beschriebene), Antimetabolit-Arzneimittel (z.B. Methotrexat, 5-Fluordesoxyuridin), alkylierende Mittel (z.B. Chlorambucil), antimitotische Mittel (z.B. Vincaalkaloide) und DNA-interkalierende Mittel (z.B. Adriamycin). Andere beispielhafte Mittel beinhalten Verbindungen oder Behandlungen, die DNA-Schäden induzieren, wenn sie bei einer Zelle angewendet werden. Solche Mittel und Faktoren beinhalten Strahlung und Wellen, die DNA-Schäden induzieren, wie beispielsweise Gammastrahlung, Röntgenstrahlen, UV-Strahlung, Mikrowellen, elektronische Emissionen und dergleichen. Eine Vielzahl chemischer Verbindungen, die auch als "chemotherapeutische Mittel" beschrieben werden, fungieren dahingehend, eine DNA-Schädigung zu induzieren, und sind sämtlich dazu gedacht, in den hier offenbarten kombinierten Behandlungsverfahren verwendet zu werden. Chemotherapiemittel, die als nützlich angesehen werden, beinhalten zum Beispiel Adriamycin, 5-Fluoruracil (5FU), Etoposid (VP-16), Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin C, Cisplatin (CDDP) und selbst Wasserstoffperoxid. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung einer Kombination einer oder mehrerer DNA-schädigender Mittel, ob Strahlen-basiert oder tatsächliche Verbindungen, wie beispielsweise die Verwendung von Röntgenstrahlen mit Cisplatin oder die Verwendung von Cisplatin mit Etoposid. Noch weitere Mittel sind Adriamycin (auch bekannt als Doxorubicin), VP-16 (auch bekannt als Etoposid) und dergleichen, Daunorubicin (interkäliert in DNA, blockiert die DNA-gerichtete RNA-Polymerase und hemmt die DNA-Synthese); Mitomycin (auch bekannt als Mutamycin und/oder Mitomycin-C); Aktinomycin D; Vincristin und Cyclophosphamid; Bleomycin, VP16 (Etoposid); Tumornekrosefaktor [TNF]; Taxol; Melphalan; Cyclophosphamid, Chlorambucil. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Peptide kann der Behandlung mit anderen Mitteln in Intervallen im Bereich von Minuten bis Wochen vorangehen oder folgen. In Ausführungsformen, in denen das andere Mittel und Expressionskonstrukt getrennt verabreicht werden, würde man im allgemeinen sicherstellen, das zwischen den Zeiten der jeweiligen Verabreichung keine wesentliche Zeitdauer abläuft, so dass das Mittel und das Peptid-basierte Therapeutikum noch in der Lage sind, eine vorteilhafte Kombinationswirkung zu zeigen. In solchen Fällen ist es vorgesehen, dass man beide Modalitäten innerhalb von etwa 12–24 Stunden voneinander, bevorzugt innerhalb von etwa 6–12 Stunden voneinander verabreicht, wobei eine Verzögerungszeit von nur etwa 12 Stunden am meisten bevorzugt ist. In einigen Situationen kann es jedoch wünschenswert sein, die Zeitdauer für die Behandlung wesentlich zu verlängern, wobei mehrere Tage (2, 3, 4, 5, 6 oder 7) bis mehrere Wochen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8) zwischen den entsprechenden Verabreichungen vergehen. Wiederholte Behandlungen mit einem oder beiden Mitteln sind besonders vorgesehen.
Gleichermaßen umfasst die Zusammensetzung bevorzugt ein pharmazeutisch annehmbares Diluens, Adjuvans oder Trägermedium, um die Verabreichung zu verbessern.
Wie hier im Detail erklärt, ist die Flt4-Expression, obwohl sie großenteils auf die lymphatischen Endothelien von gesunden Erwachsenen beschränkt ist, im Blutgefäßsystem identifi ziert worden, das zumindest bestimmte Tumoren umgibt. Die Erfindung beinhaltet daher ferner ein Verfahren zur Behandlung eines Säugetierorganismus, der an einer neoplastischen Krankheit leidet, die gekennzeichnet ist durch Expression von Flt4-Tyrosinkinase (Flt4) in vaskulären Endothelzellen, umfassend die Schritte des: Verabreichens einer Zusammensetzung an einen Säugetierorganismus, der einer solchen Behandlung bedarf, wobei die Zusammensetzung eine Verbindung umfasst, die wirksam ist zur Hemmung der Bindung eines Flt4-Ligandenproteins an in vaskulären Endothelzellen des Organismus exprimiertem Flt4, wodurch die Flt4-vermittelte Proliferation der vaskulären Endothelzellen gehemmt wird. Die Behandlung neoplastischer Krankheiten, die ausgewählt sind aus Karzinomen (z.B. Brustkarzinomen), Plattenepithelkarzinomen, Lymphomen, Melanomen und Sarkomen, ist insbesondere vorgesehen. Es wird jedoch leicht ersichtlich sein, dass die hier im Detail beschriebenen Screeningtechniken andere Tumoren, die durch Flt4-Expression in vaskulären Endothelzellen gekennzeichnet sind, identifizieren werden, wobei die Tumoren Kandidaten sind, die für ein hier beschriebenes Anti-Flt4-Behandlungsschema empfänglich sind. Die Behandlung von Brustkarzinomen, die durch Expression von Flt4 in vaskulären Endothelzellen gekennzeichnet sind, ist insbesondere vorgesehen. Unter einer durch Expression von Flt4-Tyrosinkinase in vaskulären Endothelzellen gekennzeichneten neoplastischen Krankheit wird eine Krankheit verstanden, bei der Flt4 im Blutgefäßsystem in einem viel höheren Titer identifizierbar ist, als die undetektierbaren oder kaum nachweisbaren Titer, die normalerweise im Blutgefäßsystem von gesundem Gewebe beobachtet werden, wie hier beispielhaft gezeigt.
Therapeutisch wirksame Mengen von Verbindungen werden empirisch unter Verwendung von fachlich anerkannten Dosiseskala tions- und Dosiswirkungstests ermittelt. Mit therapeutisch wirksam zur Behandlung von Tumoren ist eine Menge gemeint, die wirksam ist, das Tumorwachstum zu vermindern, oder eine Menge, die wirksam ist, das Tumorwachstum zu stoppen, oder eine Menge, die wirksam ist, Tumoren zu verkleinern oder gänzlich zu eliminieren, ohne unannehmbare Ausmaße von Nebenwirkungen für Patienten, die eine Krebstherapie durchmachen. Wenn die Verbindung einen Antikörper oder ein anderes Polypeptid umfasst, sind Dosen in der Größenordnung von 0,1 bis 100 mg Antikörper pro Kilogramm Körpergewicht, und besonders bevorzugt 1 bis 10 mg/Kilogramm bevorzugt vorgesehen. Für humanisierte Antikörper, die typischerweise eine lange Zirkulationshalbwertszeit aufweisen, ist eine Dosierung in Intervallen im Bereich von täglich bis jeden zweiten Monat, und besonders bevorzugt jede Woche oder jede zweite Woche oder jede dritte Woche, bevorzugt vorgesehen. Die Überwachung des Therapiefortschritts, Nebenwirkungen beim Patienten und die zirkulierenden Antikörpertiter stellen zusätzliche Richtwerte für ein optimales Dosierungsschema bereit. Die Daten aus publizierten und laufenden klinischen Versuchen für andere Antikörperbasierte Krebstherapeutika (z.B. Anti-HER2, Anti-EGF-Rezeptor) stellen ebenfalls nützliche Dosierungsschema-Richtwerte bereit.
Für die hier beschriebenen therapeutischen Verfahren beinhalten bevorzugte Verbindungen Polypeptide, die ein antigenbindendes Fragment eines Anti-Flt4-Antikörpers umfassen, und Polypeptide, die ein lösliches Flt4-Extrazellulardomänenfragment umfassen. Menschliche und humanisierte Anti-Flt4-Antikörper sind besonders bevorzugt. Besonders bevorzugte Flt4-Extrazellulardomänenfragmente umfassen ligandenbindende Bereiche der extrazellulären Domäne von Flt4. Beispielsweise ist ein lösliches Fragment, das die ersten drei immunglobuli nähnlichen Domänen der extrazellulären Domäne von Flt4 umfasst, besonders bevorzugt. Kleinere Fragmente, die Flt4-Liganden allein oder wenn sie an andere Peptide (wie beispielsweise Immunglobulin-artige Domänen von VEGFR-1 oder VEGFR-2) fusioniert sind, binden, sind ebenfalls vorgesehen. Gleichermaßen sind Modifikationen, die die Löslichkeit und/oder Stabilität, die Serumhalbwertszeit oder andere Eigenschaften verbessern, um die therapeutische Wirksamkeit zu verbessern, vorgesehen. Beispielsweise sind Polypeptide, die Fusionen zwischen der Flt4-Extrazellulardomäne und einem Immunglobulin-Fc-Peptid (insbesondere einem IgG1-Fc-Isotypen) umfassen, um die Löslichkeit und Serumhalbwertszeit zu verbessern, vorgesehen. [Vergleiche Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 548–553 (1998)].
Ein erwarteter Vorteil der erfindungsgemäßen therapeutischen Verfahren besteht in der Tatsache, dass Flt4 normalerweise nicht in einem nennenswerten Niveau im Blutgefäßsystem von gesunden Geweben exprimiert wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die therapeutische Verbindung einen bispezifischen Antikörper, oder ein Fragment davon, wobei der Antikörper oder das Fragment Flt4 spezifisch bindet und ein Blutgefäßendothel-Markerantigen spezifisch bindet. Unter einem "Blutgefäßendothel-Markerantigen" ist jedes Zelloberflächenantigen zu verstehen, das auf proliferierenden vaskulären Endothelzellen exprimiert wird, und das vorzugsweise nicht auf lymphatischen Endothelzellen exprimiert wird. Beispielhafte Blutgefäßendothelmarker beinhalten PAL-E [de-Waal, et al., Am. J. Pathol., 150: 1951–1957 (1994)], VEGFR-1 und VEGFR-2 [Ferrara et al., Endocrine Reviews, 18: 4–25 (1997], Tie [Partanen et al., Mol. Cell. Biol., 12: 1698–1707 (1992)], Endoglin [US-Patent Nr. 5.776.427, das hier durch Inbezugnahme vollständig aufgenommen ist] und Von- Willebrandt-Faktor. Von solchen bispezifischen Antikörpern wird erwartet, dass sie sich bevorzugt der Tumor-assoziierten Vaskulatur zuordnen, die sowohl Flt4 als auch den Blutgefäßendothelmarker exprimieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Verbindung ferner ein an den spezifischen Antikörper konjugiertes antineoplastisches oder zytotoxisches Mittel zu den Zwecken der Abtötung der Tumorzellen und/oder der Abtötung der Gefäßversorgung für die Tumorzellen. Beispielhafte Mittel beinhalten die oben beschriebenen und auch therapeutische Proteine, wie beispielsweise Statine, Zytokine, Chemokine und dergleichen, um eine Immunreaktion auf den Tumor in dem Wirt zu stimulieren.
In einer alternativen Ausführungsform umfasst die Verbindung einen Antikörper (oder bispezifischen Antikörper), der ein Epitop (oder Epitope) erkennt, die aus einem Flt4-/Flt4-Liganden-Komplex (z.B. einem Komplex, bestehend aus Flt4, gebunden an VEGF-C oder VEGF-D) bestehen.
Es ist ferner vorgesehen, dass die therapeutische Verbindung mit Breitbandmitteln konjugiert oder gemeinsam verabreicht wird, die ein Potenzial zur Hemmung angiogener Faktoren aufweisen. Solche Mittel beinhalten zum Beispiel Heparinbindende Arzneimittel (wie zum Beispiel Pentosan und Suramin-Analoga), die angiogene Faktoren hemmen können, die Heparin binden; und chemische Mittel, die das Wachstum und die Migration von Endothelzellen blockieren, wie beispielsweise Fumagillin-Analoga. Andere Mittel, die gegenwärtig untersucht werden, beinhalten Marimastat (British Biotech, Annapolis MD, indiziert für nicht-kleinzellige Lungen-, kleinzellige Lungen- und Brustkrebse); AG3340 (Agouron, LaJolla, CA; für Glioblastoma multiforme) COL-3 (Collagenex, Newtown PA; für Brusttumoren); Neovastat (Aeterna, Quebec, Kanada; für Nie ren- und nicht-kleinzelligen Lungenkrebs) BMS-275291 (Bristol-Myers-Squibb, Wallingford CT, für metastatischen nicht-kleinzelligen Lungenkrebs); Thalidomid (Celgen; für Melanom, Kopf- und Nackenkrebs, Eierstock-, metastatisches Prostata- und Kaposi-Sarkom; rezidivierenden oder metastatischen kolorektalen Krebs (mit Adjuvanzien); gynäkologische Sarkome, Leberkrebs; Multiples Myelom; CLL, rezidivierenden oder progressiven Hirnkrebs, Multiples Myelom, nicht-kleinzelliges Lungen-, nicht-metastatisches Prostata-, refraktäres multiples Myelom, und Nierenkrebs); Squalamin (Magainin Pharmaceuticals Plymouth Meeting, PA; nicht-kleinzelligen Krebs und Eierstockkrebs); Endostatin (EntreMEd, Rockville, MD; für solide Tumoren); SU5416 (Sugen, San Francisco, CA, rezidivierende Kopf- und Nacken-, fortgeschrittene solide Tumoren, Stufe-IIIB- oder -IV-Brustkrebs; rezidivierender oder progressiver Hirn- (pädiatrisch); Ovar-, AML; Gliom, fortgeschrittene Malignitäten, fortgeschrittene kolorektale Von-Hippel-Lindau-Krankheit, fortgeschrittener Weichgewebe-; Prostatakrebs, kolorektaler Krebs, metastatisches Melanom, multiples Myelom, malignes Mesotheliom; metastatischer Nieren-, fortgeschrittener oder rezidivierenden Kopf- und Nacken-, metastatischer kolorektaler Krebs); SU6668 (Sugen, San Francisco, CA; fortgeschrittene Tumoren); Interferon-α; Anti-VEGF-Antikörper (National Cancer Institute, Bethesda MD; Genentech San Francisco, kCA; refraktäre solide Tumoren; metastatischer Nierenzellkrebs, bei unbehandeltem fortgeschrittenen kolorektalen); EMD121974 (Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland; HIV-bedingtes Kaposi-Sarkom, progressives oder rezidivierendes anaplastisches Gliom); Interleukin 12 (Genetics Institute, Cambridge, MA; Kaposi-Sarkom) und IM862 (Cytran, Kirkland, WA; Eierstockkrebs, unbehandelte metastatische Krebse des Kolons und rektalen Ursprungs und Kaposi-Sarkom).
Die Konjugation der Anti-Flt4-Verbindung an ein Propharmakon, das durch die Anti-Flt4-Verbindung zielgerichtet zu Tumorgefäßen gebracht und dann (z.B. durch Bestrahlung) lokal an der Stelle des Tumorwachstums aktiviert würde, ist ebenfalls vorgesehen. Die Verwendung solch einer Propharmakastrategie hat die erwarteten Vorteile einer Minimierung von Nebenwirkungen des Arzneimittels auf gesunde Lymphgefäße, die Flt4 exprimieren.
Gleichermaßen beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Säugetierorganismus, der an einer neoplastischen Krankheit leidet, die gekennzeichnet ist durch Expression von Flt4-Tyrosinkinase (Flt4) in vaskulären Endothelzellen, umfassend die Schritte des: Identifizierens eines Säugetierorganismus, der an einem neoplastischen Krankheitszustand leidet, der gekennzeichnet ist durch Expression von Flt4 in vaskulären Endothelzellen, und Verabreichens einer Zusammensetzung an den Säugetierorganismus, der einer solchen Behandlung bedarf, wobei die Zusammensetzung eine Verbindung umfasst, die wirksam ist, die Bindung eines Flt4-Ligandenproteins an in vaskulären Endothelzellen des Organismus exprimiertem Flt4 zu hemmen, wodurch die Flt4-vermittelte Proliferation der vaskulären Endothelzellen gehemmt wird.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Screening einer biologischen Probe auf die Anwesenheit von Flt4-Rezeptortyrosinkinaseprotein (Flt4) bereit, umfassend die Schritte des: (a) Inkontaktbringens einer biologischen Probe, von der angenommen wird, dass sie Flt4 enthält, mit einer eine Flt4-bindende Verbindung umfassenden Zusammensetzung unter Bedingungen, bei denen die Verbindung in der biologischen Probe an Flt4 binden wird; (b) Waschens der biologischen Probe unter Bedingungen, welche die nicht an Flt4 in der Probe gebundene Flt4-bindende Verbindung entfernen wird; und (c) Screenens der Probe auf die Anwesenheit von Flt4 durch Detektieren von nach dem Waschschritt an Flt4-Rezeptortyrosinkinase in der Probe gebundener Flt4-bindender Verbindung. Vorzugsweise umfasst die Verbindung ein Polypeptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Polypeptid, das ein antigenbindendes Fragment eines Anti-Flt4-Antikörpers umfasst; und (b) ein Polypeptid, das einen Flt4-Liganden oder ein Flt4-bindendes Fragment oder Analogon davon umfasst. Antikörper, die Flt4 spezifisch binden, und die ferner eine detektierbare Markierung umfassen, sind besonders bevorzugt.
Die Erfindung ist auch gerichtet auf ein Verfahren zum Abbilden von Vertebratengewebe, von dem angenommen wird, dass es Zellen enthält, die Flt4-Rezeptortyrosinkinaseprotein (Flt4) exprimieren, umfassend die Schritte des: (a) Inkontaktbringens von Vertebratengewebe mit einer Zusammensetzung, die eine Flt4-bindende Verbindung umfasst; und (b) Abbilden des Gewebes durch Detektieren der an das Gewebe gebundenen Flt4-bindenden Verbindung. Bevorzugt ist das Gewebe menschliches Gewebe, und das Verfahren umfasst ferner den Schritt des Waschens des Gewebes nach dem Kontaktierungsschritt und vor dem Abbildungsschritt unter Bedingungen, die Flt4-Verbindung, die nicht an Flt4 in dem Gewebe gebunden ist, aus dem Gewebe entfernt.
In einer verwandten Variante stellt die Erfindung ein Verfahren zur Abbildung von Tumoren in Gewebe aus einem Vertebraten-Organismus bereit, umfassend die Schritte des: (a) Inkontaktbringens von Vertebratengewebe, von dem angenommen wird, dass es einen Tumor enthält, mit einer Zusammensetzung, die eine Flt4-bindende Verbindung umfasst; (b) Detektierens der an Zellen in dem Gewebe gebundenen Flt4-bindenden Verbindung; und (c) Abbildens solider Tumoren durch Identifizieren von durch die Flt4-bindende Verbindung gebundenen Blutgefäßendothelzellen, wobei Flt4 exprimierende Blutgefäße mit der Anwesenheit und Lage eines Tumors in dem Gewebe korreliert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner Schritte des Inkontaktbringens des Gewebes mit einer zweiten Verbindung (wie beispielsweise einem Antikörper), der an einen Blutgefäßendothelmarker (z.B. PAL-E, VEGFR-1, VEGFR-2) spezifisch bindet, der in lymphatischen Endothelien im Wesentlichen abwesend ist; und Detektierens der zweiten an Zellen in dem Gewebe gebundenen Verbindung; wobei der Abbildungsschritt das Identifizieren von Blutgefäßen umfasst, die sowohl mit der Flt4-bindenden Verbindung als auch der zweiten Verbindung markiert sind, und wobei die sowohl mit der Flt4-bindenden Verbindung als auch der zweiten Verbindung markierten Blutgefäße mit der Anwesenheit und Lage eines Tumors in Gewebe korrelieren. Es wird davon ausgegangen, dass die Verwendung der zweiten Verbindung dem Praktiker hilft, schneller zwischen Blutgefäßen, die Flt4 exprimieren, und normalen Lymphgefäßen, die Flt4 auf ihrer Oberfläche exprimieren, zu unterscheiden.
Die Erfindung ist ferner gerichtet auf ein Verfahren zum Screening auf einen neoplastischen Krankheitszustand, umfassen die Schritte des: (a) Inkontaktbringens von Geweben aus einem Säugetierorganismus, von dem angenommen wird, das er einen neoplastischen Krankheitszustand aufweist, mit einer Zusammensetzung, die einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, der/das spezifisch Flt4-Rezeptortyrosinkinase bindet, umfasst; (b) Detektierens des an Zellen in dem Säugetierorganismus gebundenen Antikörpers oder Antikörperfragments; und (c) Screenens auf eine neoplastische Krankheit aus der an Zellen in dem Säugetierorganismus gebundenen Menge oder Verteilung des Antikörpers. Wie hier beschrieben, wird Flt4 (die im Blutgefäßsystem normalerweise undetektierbar oder kaum detektierbar ist) im Blutgefäßsystem von zumindest einigen Tumoren stark gefärbt. In einer Ausführungsform ist daher in dem Screening-Schritt die Detektion des an die Blutgefäßendothelzellen gebundenen Antikörpers oder Antikörperfragments mit dem Vorliegen einer neoplastischen Krankheit korreliert. Bei diesem Verfahren wird es ersichtlich sein, das "Detektion" die Detektion bei einem Niveau bedeutet, das signifikant höher ist als die kaum nachweisbaren oder undetektierbaren Niveaus, die in entsprechendem normalen (gesunden) Gewebe auftreten würden, wie hier beschrieben. Solch eine unterschiedliche Expression kann durch Vergleich einer Kontrolle, die mit Gewebe von einem gesunden Organismus vorgenommen wird, bestätigt werden. Das Screening von Brustgewebe auf Neoplasmen ist besonders vorgesehen. Wie oben beschrieben, kann die Durchführung dieser Verfahren weiter durch Verabreichung einer zweiten Verbindung, die spezifisch an einen Blutgefäßendothelmarker bindet, an das Säugetier erleichtert werden, wobei der Detektionsschritt die Detektion der ersten und der zweiten Verbindung, gebunden an neovaskuläre Endothelzellen, umfasst.
Aus dem Vorstehenden wird ferner ersichtlich, dass die verschiedenen Verbindungen, die zur Verwendung in erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben werden, ebenfalls als Erfindungsaspekte gedacht sind. Solche Verbindungen beinhalten zum Beispiel die oben beschriebenen Anti-Flt4-Antikörper und bispezifischen Antikörper. Gleichermaßen ist auch die Verwendung jeder der hier beschriebenen Verbindungen (allein oder in Kombination) zur Herstellung eines Arzneimittels für therapeutische oder diagnostische oder Abbildungszwecke auch als ein Aspekt der Erfindung gedacht. Das Arzneimittel kann ferner pharmazeutisch annehmbarer Diluentien, Adjuvantien, Träger oder dergleichen umfassen.
Gleichermaßen beinhaltet die Erfindung Kits, die erfindungsgemäße Verbindungen oder Zusammensetzungen umfassen, die in einer Weise verpackt sind, die deren Verwendung zur Ausführung der erfindungsgemäßen Verfahren erleichtert. In einer einfachsten Ausführungsform beinhaltet solch ein Kit eine erfindungsgemäße Verbindung oder Zusammensetzung verpackt in einem Behälter wie beispielsweise einer/einem verschlossenen Flasche oder Gefäß, mit einem an dem Behälter befestigten oder in dem Paket enthaltenen Etikett, das die Verwendung der Verbindung oder Zusammensetzung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beschreibt. Vorzugsweise ist die Verbindung oder Zusammensetzung in einer Einheitsdosierform verpackt. In einer weiteren Ausführungsform beinhaltet ein erfindungsgemäßes Kit eine Flt4-bindende Verbindung, die zusammen mit einer zweiten Verbindung verpackt ist, die an einen Marker (Antigen) bindet, der auf der Oberfläche von Blutgefäßendothelzellen exprimiert wird, jedoch bei lymphatischen Endothelien im Wesentlichen abwesend ist.
Darüber hinaus sind viele Aspekte der Erfindung im Zusammenhang mit der Verwendung von Peptiden oder Polypeptiden zur Bildgebung oder Therapie und/oder zur Verwendung der Flt4-Proteinexpression auf Zelloberflächen als Ziel für die Detektion, das Screening, die Abbildung oder dergleichen, unter Verwendung von Antikörpern beschrieben worden. Die therapeutische Zufuhr von Proteintherapeutika, wie beispielsweise Polypeptiden, die ligandenbindende lösliche Flt4-Fragmente umfassen, kann auch mit Gentherapiematerialien und -verfahren bewerkstelligt werden. Zum Beispiel wird ein nacktes DNA- Konstrukt oder ein Gentherapie-Expressionsvektor-Konstrukt, das ein das interessierende therapeutische Peptid kodierendes Polynukleotid umfasst, an ein Säugetiersubjekt, das einer solchen Therapie bedarf, zugeführt. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt einen Promotor oder eine andere Expressionskontrollsequenz, die funktionsfähig mit der das therapeutische Peptid kodierenden Sequenz verknüpft ist, um die Expression des therapeutischen Peptids in vivo zu fördern. In einer Variante ist die Nukleinsäure in ein Liposom eingeschlossen. In einer anderen Variante ist die Nukleinsäure ein viraler Vektor wie beispielsweise ein Retrovirus, Adenovirus, ein adenoassoziierter Virus, Vakzinevirus, Herpesvirus oder anderer Vektor, der für Gentherapie-Protokolle bei Säugetieren entwickelt wurde. Beispielhafte Behandlungsverfahren beinhalten Schritte der Verabreichung einer das Gentherapiekonstrukt umfassenden pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten, oder einen Schritt des Transformierens oder Transfizierens von Zellen ex vivo und die Einführung der transformierten Zellen in den Patienten. Gleichermaßen kann die Detektion der Flt4-Expression durch Zellen oder Gewebe unter Verwendung von Polynukleotidsonden durchgeführt werden, die spezifisch mit Flt4-mRNA-Sequenzen bei Northern-Hybridisierungs- oder In-situ-Hybridisierungstests hybridisieren; oder durch Ausführung quantitativer PCR oder anderer Techniken zur Messung von Flt4-mRNA in Proben.
Weitere Merkmale und Varianten der Erfindung werden für den Fachmann aus der Gesamtheit dieser Anmeldung, einschließlich der ausführlichen Beschreibung, ersichtlich sein, und all diese Merkmale sind als Aspekte der Erfindung gedacht. Gleichermaßen können Merkmale der hier beschriebenen Erfindung zu weiteren Ausführungsformen rekombiniert werden, die, unabhängig davon, ob die Merkmalskombination oben ausdrücklich als ein Aspekt oder eine Ausführungsform der Erfindung erwähnt ist, ebenfalls als Aspekte der Erfindung angesehen werden. Darüber hinaus sollten nur solche Beschränkungen, die hier als kritisch für die Erfindung beschrieben sind, als solche betrachtet werden; Varianten der Erfindung, denen Beschränkungen fehlen, die hier nicht als kritisch beschrieben wurden, werden als Aspekte der Erfindung angesehen.
Zusätzlich zu dem Vorstehenden beinhaltet die Erfindung als einen weiteren Aspekt alle Ausführungsformen der Erfindung, die in irgendeiner Weise im Bereich enger sind als die Varianten, die oben ausdrücklich genannt sind. Obwohl der/die Anmelder den gesamten Bereich der hier angefügten Ansprüche erfunden haben, sollen die hier angefügten Ansprüche die Arbeit anderer aus dem Stand der Technik nicht umfassen. Für den Fall, dass dem/den Anmelder(n) durch ein Patentamt oder eine andere Stelle oder eine andere Person gesetzlicher Stand der Technik innerhalb des Bereichs eines Anspruchs zur Kenntnis gebracht wird, behält/behalten sich der/die Anmelder das Recht vor, Änderungsrechte unter den anwendbaren Patentgesetzen auszuüben, um den Gegenstand eines solchen Anspruchs neu zu definieren, um diesen gesetzlichen Stand der Technik oder offensichtliche Varianten von gesetzlichem Stand der Technik aus dem Bereich solch eines Anspruchs auszunehmen. Varianten der Erfindung, die durch solch einen geänderten Anspruch definiert sind, sind ebenfalls als Aspekte der Erfindung gedacht.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A ist eine schematische Darstellung der Struktur von Flt4-cDNA-Klonen;
1B ist eine fotografische Wiedergabe eines Northern-Hybridisierungsgels;
2A–F stellen eine schematische Darstellung von strukturellen Merkmalen von Flt4 und einen Vergleich mit der Flt1-Tyrosinkinasesequenz dar;
3A ist eine schematische Darstellung des 3'-Endes der cDNA-Insertion Klone J.1.1 und I.1.1;
3B ist eine fotografische Wiedergabe von Autoradiogrammen von Hybridisierungen mit Antisinn-RNA-Sonde und den Lang- und Kurzformen von Flt4-RNA;
3C ist eine fotografische Wiedergabe von Autoradiogrammen von Hybridisierungen mit Antisinn-RNA-Sonde und den Lang- und Kurzformen von Flt4-RNA;
4 ist eine fotografische Wiedergabe eines Gels, das eine Hybridisierungsanalyse von Flt4-Sequenzen in DNA-Proben aus verschiedenen Spezies veranschaulicht;
5A–5H stellt eine immunhistochemische Charakterisierung von VEGFR-3-exprimierenden Gefäßen beim intraduktalen Karzinom dar. In benachbarten Schnitten (5A, B), dekorierten VEGFR-3 und PAL-E ein ähnliches Muster von "Halsband"("necklace")-Gefäßen (Pfeilspitzen) um den mit Karzinomzellen gefüllten Kanal herum. Eine andere Gruppe von benachbarten Schnitten wurde mit Färbung für VEGFR-3 (5C), Laminin (5D), Kollagen XVIII (5E) und SMA (5F) verglichen. Doppelfärbung auf PAL-E und VEGFR-3 (5G) und Vergleich mit nur auf VEGFR-3 gefärbtem benachbarten Schnitt (5H). Die den betroffenen Kanälen benachbarten Gefäße sind doppelt positiv (Pfeilspitzen), wohingegen ein VEGFR-3-positives Gefäß in kurzer Entfernung von dem betroffenen Kanal in dem interduktalen Stroma (Pfeile) vorhanden ist. Es ist es zu beachten, dass die Basalmembran beim Doppelfärbungsverfahren positiv für PAL-E ist. Vergrößerungen: 5A, B 400 ×, 5C, D, E, F 320 ×, 5E, F 480 ×.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die Klonierung, Sequenzierung und Expression einer als Flt4 bezeichneten neuen Rezeptortyrosinkinase ist unten beschrieben. Das Flt4-Gen liegt in dem Chromosomenbereich 5q35, wo viele Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktorrezeptoren lokalisiert sind. Die extrazelluläre Domäne von Flt4 besteht aus sieben immunglobulinähnlichen Schleifen, die zwölf potentielle Glykosylierungsstellen beinhalten. Auf Grundlage struktureller Ähnlichkeiten dürften Flt4 und die vorher bekannten Flt1- und KDR/FLK1-Rezeptoren eine Unterfamilie der Klasse-III-Tyrosinkinasen bilden. Das Flt4-Gen wird exprimiert als 5,8-kb- und 4,5-kb-mRNAs, von denen sich gezeigt hat, dass sie sich in ihren 3'-Sequenzen unterscheiden und in HEL- und DAMI-Leukämiezellen unterschiedlich exprimiert werden.
Eine Wilms-Tumorzelllinie, eine Retinoblastom-Zellinie und eine undifferenzierte Teratokarzinom-Zellinie exprimierten Flt4, wohingegen differenzierte Teratokarzinom-Zellen negativ waren. Die meisten fötalen Gewebe exprimierten ebenfalls die Flt4-mRNA, wobei die Milz, die intermediäre Zone des Hirns und die Lunge die höchsten Niveaus zeigten. In Geweben von menschlichen Erwachsenen wurden die höchsten Expressionsniveaus in Plazenta, Lunge, Niere, Herz und Leber in absteigender Reihenfolge der Expression gefunden. Bei der In-situ-Hybridisierung dekorierten die Flt4-Autoradiographie-Körnchen Endothelzellen der fötalen Lunge. Immunhistochemische Färbung von Flt4 in fötalen Geweben bestätigte die Färbung der Endothelzellen. Das Expressionsmuster von Flt4 unterscheidet sich im Vergleich zu Flt1 und KDR stark in Geweben von 18 Wochen alten menschlichen Föten. Siehe Kaipainen et al., J. Exp. Med., 178: 2077 (1993).
Expressionsvektoren, die Flt4-cDNA enthalten, sind wie in den Beispielen 4 und 11 beschrieben hergestellt und in COS- und NIH3T3-Zellen exprimiert worden.
Die erfindungsgemäßen Flt4-DNAs und -Polypeptide können bei der Reinigung des Flt4-Liganden und bei der Regulation des Wachstums und der Differenzierung von Endothelzellen in verschiedenen Organen nützlich sein. Sie können sich auch als nützlich für die Diagnose/Behandlung bestimmter Krankheiten erweisen.
In der folgenden Beschreibung wird eine Reihe von Begriffen extensiv verwendet, die in der rekombinanten DNA-(rDNA)Technologie verwendet werden. Um ein klares und konsistentes Verständnis der Beschreibung und Ansprüche, einschließlich des Umfangs, der diesen Begriffen zukommt, zu geben, werden die folgenden Definitionen bereitgestellt.
Gen. Eine DNA-Sequenz, die eine Matrize für eine RNA-Polymerase beinhaltet. Die von diesem Gen transkribierte RNA kann für ein Protein kodieren oder nicht. RNA, die für ein Protein kodiert, wird als "Messenger"-RNA (mRNA) bezeichnet und wird, bei Eukaryoten, durch RNA-Polymerase-II transkribiert. Es ist jedoch auch bekannt, ein Gen zu konstruieren, dass eine RNA-Polymerase-II-Matrize enthält, wobei eine RNA-Sequenz transkribiert wird, die eine Sequenz aufweist, die zu einer bestimmten mRNA komplementär ist, normalerweise jedoch nicht translatiert wird. Solch ein Genkonstrukt wird hier als "Antisinn-RNA-Gen" bezeichnet, und solch ein RNA-Transkript wird als "Antisinn-RNA" bezeichnet. Antisinn-RNAs sind normalerweise aufgrund der Anwesenheit translationaler Stopkodons in der Antisinn-RNA-Sequenz nicht translatierbar.
Ein "Komplementär-DNA"- oder "cDNA"-Gen beinhaltet rekombinante Gene, die durch reverse Transkription von mRNA synthetisiert werden, der intervenierende Sequenzen (Introns) fehlen.
Klonierungsvehikel. Eine Plasmid- oder Phagen-DNA oder eine andere DNA-Sequenz, die in der Lage ist, sich in einer Wirtszelle autonom zu replizieren, und die gekennzeichnet ist durch eine oder eine kleine Zahl von Endonuklease-Erkennungsstellen, an denen solche DNA-Sequenzen in einer bestimmbaren Weise ohne Verlust einer wichtigen biologischen Funktion des Vehikels geschnitten werden können, und in die DNA hineingespleißt werden kann, um deren Replikation und Klonierung zu bewirken. Das Klonierungsvehikel kann ferner einen Marker beinhalten, der zur Verwendung bei der Identifikation von mit dem Klonierungsvehikel transformierten Zellen geeignet ist. Marker sind zum Beispiel Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz. Das Wort "Vektor" wird manchmal für "Klonierungsvehikel" verwendet.
Expressionsvektor. Ein Vehikel oder Vektor ähnlich einem Klonierungsvehikel, welcher in der Lage ist, ein darin hineinkloniertes Gen nach Transformation in einen Wirt zu exprimieren. Das klonierte Gen wird üblicherweise unter die Kontrolle von bestimmten Kontrollsequenzen wie beispielsweise Promotorsequenzen gestellt (d.h. funktionsfähig damit verknüpft). Ex pressionskontrollsequenzen variieren in Abhängigkeit davon, ob der Vektor dazu vorgesehen ist, das funktionsfähig verknüpfte Gen in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt zu exprimieren, und kann darüber hinaus Transkriptionselemente wie beispielsweise "Enhancer"-Elemente, Terminationssequenzen, gewebespezifische Elemente und/oder translationale Initiations- und Terminationsstellen beinhalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft sowohl die Expression rekombinanter Flt4-Proteine (Kurz- und Langform) als auch die funktionellen Derivate dieser Proteine.
Funktionelle Derivate. Ein "funktionelles Derivat" von Flt4-Proteinen ist ein Protein, welches eine biologische Aktivität (entweder funktionell oder strukturell) besitzt, die einer biologischen Aktivität von nicht-rekombinanten Flt4-Proteinen im Wesentlichen ähnelt. Ein funktionelles Derivat des Flt4-Proteins kann posttranslationale Modifikationen wie beispielsweise kovalent verknüpfte Kohlenhydrate enthalten oder nicht, in Abhängigkeit von der Notwendigkeit solcher Modifikationen für die Leistungsfähigkeit einer spezifischen Funktion. Der Begriff "funktionelles Derivat" soll die "Fragmente", "Varianten", "Analoga" und "chemischen Derivate" eines Moleküls beinhalten.
Wie hier verwendet, wird von einem Molekül gesagt, es sei ein "chemisches Derivat" eines anderen Moleküls, wenn es weitere chemische Reste enthält, die normalerweise kein Bestandteil des Moleküls sind. Solche Reste können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit etc. des Moleküls verbessern. Die Reste können alternativ die Toxizität des Moleküls vermindern oder unerwünschte Nebenwirkungen des Moleküls eliminieren oder abmildern etc. Reste, die in der Lage sind, solche Wirkungen zu vermitteln, sind in Remingtons Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart. Verfahren zur Kopplung solche Reste an ein Molekül sind im Stand der Technik gut bekannt.
Fragment. Ein "Fragment" eines Moleküls wie Flt4-Protein soll sich auf jeden Bereich des Moleküls beziehen, wie beispielsweise den Peptidkern, oder eine Variante des Peptidkerns.
Variante. Eine "Variante" eines Moleküls wie Flt4-Protein soll sich auf ein Molekül beziehen, dass entweder dem vollständigen Molekül oder einem Fragment davon in Struktur und biologischer Aktivität im Wesentlichen ähnlich ist. Vorausgesetzt, dass zwei Moleküle eine ähnliche Aktivität besitzen, werden sie daher als Varianten angesehen, da dieser Begriff hier selbst dann verwendet wird, wenn die Zusammensetzung oder Sekundär-, Tertiär- oder Quartärstruktur von einem der Moleküle nicht identisch zu der ist, die bei dem anderen gefunden wird, oder wenn die Sequenz der Aminosäurereste nicht identisch ist.
Analogon. Ein "Analogon" des Flt4-Proteins oder der -Gensequenz bedeutet eine Bezugnahme auf ein Protein oder eine Gensequenz, die in der Funktion dem Flt4-Protein oder der -Gensequenz im Wesentlichen ähnlich ist.
BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf das, was die Anmelder "Flt4" genannt haben, einen Rezeptor für Tyrosinkinase, Flt4-kodierende Nukleinsäuremoleküle (z.B. cDNAs, genomische DNAs, RNAs, Antisinn-RNAs, etc.), die Herstellung von Flt4-Peptiden oder Flt4-Protein aus einer Flt4-Gensequenz und dessen Produkt, rekombinante Flt4-Expressionsvektoren, Flt4-Analoga und -Derivate, und diagnostische und/oder therapeutische Verwendungen von Flt4 und verwandten Proteinen, Flt4-Liganden, Flt4-Antagonisten und Anti-Flt4-Antikörper.
HERSTELLUNG VON REKOMBINANTEM FLT4
Biologisch aktiver Flt4 kann hergestellt werden durch die Klonierung und Expression der Flt4-kodierenden Sequenz oder deren funktioneller Äquivalente in einer geeigneten Wirtszelle.
Die Herstellung von Flt4 unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie kann zum Zweck der Beschreibung in einen schrittweisen Prozess aufgeteilt werden: (1) Isolieren oder Erzeugen der kodierenden Sequenz (des Gens) für den gewünschten Flt4; (2) Konstruieren eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, die Synthese des gewünschten Flt4 zu steuern; (3) Transfizieren oder Transformieren geeigneter Wirtszellen, die in der Lage sind, das Flt4-Gen zu replizieren und zu exprimieren und/oder das Genprodukt zu prozessieren, um den gewünschten Flt4 herzustellen; und (4) Identifizieren und Reinigen des gewünschten Flt4-Produkts.
ISOLATION ODER ERZEUGUNG DES FLT4-GENS
Die kodierende Nukleotidsequenz von Flt4 oder funktionelle Äquivalente davon können verwendet werden, um rekombinante Expressionsvektoren zu konstruieren, die die Expression des gewünschten Flt4-Produkts steuern. Bei der Ausübung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die darin beschriebene Nukleotidsequenz, oder Fragmente oder funktionelle Äquivalente davon, verwendet werden, um die rekombinanten Moleküle zu er zeugen, die die Expression des rekombinanten Flt4-Produkts in geeigneten Wirtszellen steuern. Flt4-kodierende Nukleotidsequenzen können aus verschiedenen Zellquellen erhalten werden, die Flt4-ähnliche Aktivitäten erzeugen und/oder die Flt4-kodierende mRNA exprimieren. Die Anmelder haben eine Reihe geeigneter menschlicher Zellquellen für Flt4 identifiziert, einschließlich menschlicher Plazenta, Leukämiezellen und einiger Tumorzelllinien.
Die kodierende Sequenz von Flt4 kann durch cDNA-Klonierung aus RNA, die aus solchen Zellquellen isoliert und gereinigt wurde, oder durch genomische Klonierung erhalten werden. Die Flt4-Sequenz kann beispielsweise durch Polymerasekettenreaktion aus cDNA oder genomischem DNA-Material unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Techniken amplifiziert werden. Sowohl cDNA- als auch genomische Bibliotheken von Klonen können unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Techniken hergestellt werden, und können mit Nukleotidsonden auf bestimmte Flt4-DNAs gescreent werden, die zu einem beliebigen Bereich des Flt4-Gens im wesentlichen komplementär sind. Volllängenklone, d.h. solche, die die vollständige kodierende Region des gewünschten Flt4 enthalten, können zur Konstruktion von Expressionsvektoren ausgewählt werden. Alternativ können Flt4 kodierende DNAs vollständig oder teilweise durch chemische Synthese unter Verwendung von Standardtechniken gemäß dem Stand der Technik synthetisiert werden. Aufgrund der inhärenten Degeneration der kodierenden Nukleotidsequenzen können andere DNA-Sequenzen, die im wesentlichen dieselbe oder eine funktionell äquivalente Aminosäuresequenz kodieren, bei der Ausübung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden. Solche Abänderungen von Flt4-Nukleotidsequenzen beinhalten Deletionen, Additionen oder Substitutionen verschiedener Nukleotide, was zu einer Sequenz führt, die dasselbe oder ein funktionell äquivalentes Genprodukt kodiert. Das Genprodukt kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der Sequenz enthalten, die zu stillen Austauschen führen und auf diese Weise ein bioaktives Produkt erzeugen. Solche Aminosäuresubstitutionen können auf Basis einer Ähnlichkeit in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität und/oder der amphipathischen Natur des jeweiligen Restes vorgenommen werden. Zum Beispiel beinhalten negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren beinhalten Lysin und Arginin; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen oder unpolaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophobizitätswerten beinhalten die folgenden: Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Phenylalanin, Tyrosin.
KONSTRUKTION VON FLT4-EXPRESSIONSVEKTOREN
Unter Verwendung dieser Information wird eine Vielfalt rekombinanter DNA-Vektoren bereitgestellt, die in der Lage sind, die Flt4-Rezeptortyrosinkinase in angemessenen Mengen bereitzustellen. Weitere rekombinante DNA-Vektoren von verwandter Struktur, die für synthetische Proteine kodieren, die die hier identifizierten entscheidenden strukturellen Eigenschaften aufweisen, sowie für Proteine derselben Familie aus anderen Quellen können unter Einsatz von Standardtechniken der rekombinanten DNA-Technologie aus der Flt4-Rezeptortyrosinkinase-cDNA hergestellt werden. Ein die Flt4-Rezeptortyrosinkinase exprimierender Transformant ist als ein Beispiel dieser Technologie hergestellt worden (siehe Beispiele 3 und 4). Die neu entdeckte Sequenz- und Strukturinformation kann durch Transfektion von eukaryotischen Zellen verwendet werden, um die Flt4-Rezeptortyrosinkinase und ihre verschiedenen Domänen für biologische Zwecke herzustellen.
IDENTIFIKATION VON TRANSFEKTANTEN ODER TRANSFORMANTEN, DIE FLT4-GENPRODUKTE EXPRIMIEREN
Die Wirtszellen, die die rekombinante kodierende Sequenz enthalten und das biologisch aktive, reife Produkt exprimieren, können durch mindestens vier allgemeine Herangehensweisen identifiziert werden: (a) DNA-DNA-, DNA-RNA- oder RNA-Antisinn-RNA-Hybridisierung; (b) die Anwesenheit oder Abwesenheit von "Marker"-Gen-Funktionen; (c) Feststellen des Transkriptionsniveaus, gemessen durch Expression von Flt4-mRNA-Transkripten in der Wirtszelle; und (d) Detektion des reifen Genprodukts, gemessen durch Immunassay und, schließlich, durch ihre biologische Aktivitäten.
Bei der ersten Herangehensweise kann die Anwesenheit der in Expressionsvektoren inserierten kodierenden Sequenzen von Flt4 detektiert werden durch DNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, die Nukleotidsequenzen umfassen, die homolog zu der kodierenden Sequenz von Flt4 sind.
Bei der zweiten Herangehensweise kann das System aus rekombinantem Expressionsvektor/Wirtssystem auf Basis der Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter "Marker"-Gen-Funktionen (z.B. Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegenüber Antibiotika, Resistenz gegenüber Methotrexat, Transformationsphänotyp, Einschlusskörperbildung in Baculovirus etc.) identifiziert und ausgewählt werden. Wenn die kodierende Sequenz von Flt4 zum Beispiel innerhalb einer Markergensequenz des Vektors inseriert ist, können Rekombinanten, die die kodierende Sequenz enthalten, durch die Abwesenheit der Markergenfunkti on identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen im Tandem mit der Flt4-Sequenz unter die Kontrolle desselben oder verschiedener zur Kontrolle der Expression der kodierenden Sequenz von Flt4 verwendeter Promotoren gestellt werden. Die Expression des Markers in Reaktion auf die Induktion oder Selektion zeigt die Expression der kodierenden Sequenz von Flt4 an.
Bei der dritten Herangehensweise kann die transkriptionelle Aktivität der kodierenden Region von Flt4 durch Hybridisierungstests festgestellt werden. Zum Beispiel kann polyadenylierte RNA durch Northern-Blotting unter Verwendung einer Sonde isoliert und analysiert werden, die zu der kodierenden Sequenz von Flt4 oder bestimmten Bereichen davon homolog ist. Alternativ können die gesamten Nukleinsäuren der Wirtszelle extrahiert und auf Hybridisierung mit solchen Sonden getestet werden.
Bei der vierten Herangehensweise kann die Expression von Flt4 immunologisch festgestellt werden, zum Beispiel durch Western-Blots, Immunassays wie beispielsweise Radioimmunpräzipitation, enzymgekoppelten Immunassay und dergleichen. Der ultimative Test hinsichtlich des Erfolgs des Expressionssystems beinhaltet jedoch die Detektion des biologisch aktiven Flt4-Genprodukts. Wenn die Wirtszelle das Genprodukt ausscheidet, kann das zellfreie Medium, das aus der kultivierten Transfektanten-Wirtszelle erhalten wurde, auf Flt4-Aktivität getestet werden. Wenn das Genprodukt nicht ausgeschieden wird, können Zelllysate auf eine solche Aktivität untersucht werden. In jedem Falle können Tests verwendet werden, die die Ligandenbindung an Flt4 oder andere Bioaktivitäten von Flt4 messen.
FLT4-DERIVATE, -ANALOGA UND -PEPTIDE
Die Herstellung und Verwendung Flt4-bezogener Derivate, Analoga und Peptide sind ebenfalls vorgesehen und liegen innerhalb des Bereichs der Erfindung. Solche Derivate, Analoga oder Peptide können, in Abhängigkeit von der jeweiligen Anwendung, im Vergleich zu nativem Flt4 verbesserte oder verminderte biologische Aktivitäten aufweisen. Erfindungsgemäße Flt4-bezogene Derivate, Analoga und Peptide können durch eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannter Mittel hergestellt werden. Verfahren und Manipulationen auf dem Gen- und Proteinniveau liegen innerhalb des Bereichs der Erfindung. Die Peptidsynthese, die im Stand der Technik Standard ist, kann verwendet werden, um Flt4-Peptide zu erhalten. Auf dem Proteinniveau können zahlreiche chemische Modifikation verwendet werden, um Flt4-ähnliche Derivate, Analoga oder Peptide durch im Stand der Technik bekannte Techniken herzustellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf spezifische chemische Spaltung durch Endopeptidasen (zum Beispiel Bromcyane, Trypsin, Chymotrypsin, V8-Protease und dergleichen) oder Exopeptidasen, Acetylierung, Formylierung, Oxidation etc.
Bevorzugte Derivate, Analoga und Peptide sind solche, die die Flt4-Ligandenbindungsaktivität bewahren. Diese Derivate, Analoga und Peptide, die Flt4-Ligand binden, jedoch in Reaktion hierauf kein Signal übertragen, sind als Flt4-Inhibitoren nützlich. Solche Derivate, Analoga und Peptide, die Flt4-Ligand binden und in Reaktion hierauf ein Signal übertragen, zum Beispiel durch einen Vorgang, der eine intrazelluläre Flt4-Autophosphorylierung beinhaltet, sind in gleicher Weise wie nativer Flt4 nützlich. Ein bevorzugter Flt4-Ligand zur Verwendung bei einem solchen Bindungs- und/oder Autophosphorylierungstest ist ein Ligand, der ein ungefähr 23-kD-Polypeptid umfasst, das aus PC-3-konditioniertem Medium wie hier beschriebenen isolierbar ist. Dieser als vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor C (VEGF-C) bezeichnete Ligand ist im Detail in der PCT-Patentanmeldung PCT/FI96/00427, eingereicht 1. August 1996 und veröffentlicht als internationale Veröffentlichung WO 97/05250, und in den US-Prioritätspatentanmeldungen, deren Priorität hier in Anspruch genommen wird, die sämtlich in ihrer Gänze durch Inbezugnahme hier aufgenommen sind, charakterisiert worden.
ANTI-FLT4-ANTIKÖRPER
Ebenfalls innerhalb des Bereichs der Erfindung liegt die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, die Flt4 oder verwandte Proteine erkennen.
Verschiedene im Stand der Technik bekannte Verfahren können für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen Epitope von Flt4 verwendet werden. Für die Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere (einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kaninchen, Mäuse, Ratten etc.) durch Injektion mit Flt4 oder einem synthetischen Flt4-Peptid immunisiert werden. Verschiedene Adjuvanzien können in Abhängigkeit von der Wirtsspezies, verwendet werden, um die Immunantwort zu verstärken, einschließlich, aber nicht beschränkt auf (vollständiges und unvollständiges) Freund-Adjuvans, mineralische Gele wie beispielsweise Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie beispielsweise Lysolezithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Ölemulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Dinitrophenol, potentiell nützliche humane Adjuvanzien wie beispielsweise BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Ein monoklonaler Antikörper gegen ein Epitop von Flt4 kann hergestellt werden durch Einsatz jeder Technik, die die Herstellung eines Antikörpermoleküls durch kontinuierliche Zellinien in Kultur ermöglicht. Dies beinhaltet, ist jedoch nicht beschränkt auf die ursprünglich von Köhler et al., Nature, 256: 495–497 (1975), beschriebene Hybridomtechnik und die neuere Human-B-Zell-Hybridomtechnik [Kosbor et al., Immunology Today, 4: 72 (1983)] und die EBV-Hybridomtechnik [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., S. 77–96 (1985)]. Antikörper gegen Flt4 können auch in Bakterien aus klonierten Immunglobulin-cDNAs hergestellt werden. Unter Verwendung des rekombinanten Phagenantikörpersystems kann es möglich sein, Antikörper in Bakterienkulturen rasch herzustellen und zu selektieren, und deren deren Struktur genetisch zu manipulieren.
Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Solche Fragmente beinhalten zum Beispiel, sind aber nicht beschränkt auf: das F(ab')₂-Fragment, das durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')₂-Fragments erzeugt werden können, und die zwei Fab-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können.
Antikörper gegen Flt4 können bei der qualitativen und quantitativen Detektion von reifem Flt4 und Flt4-Vorläufer und Subkomponentenformen, bei der Affinitätsreinigung von Flt4-Polypeptiden und bei der Aufklärung von Flt4-Biosynthese, -Stoffwechsel und -Funktion verwendet werden. Die Detektion der Flt4-Tyrosinkinaseaktivität kann als enzymatisches Mittel zur Erzeugung und Amplifikation eines Flt4-spezifischen Sig nals bei solchen Tests verwendet werden. Antikörper gegen Flt4 können auch als diagnostische und therapeutische Mittel nützlich sein.
VERWENDUNG VON FLT4, FLT4-KODIERENDEN NUKLEINSÄUREMOLEKÜLEN UND ANTI-FLT4-ANTIKÖRPERN
Die Anmelder sehen eine große Vielzahl von Verwendungen für die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung vor, einschließlich diagnostischer und/therapeutischer Verwendungen von Flt4, Flt4-Analoga und -Derivaten, Flt4-kodierenden Nukleinsäuremolekülen, Antisinn-Nukleinsäuremolekülen und Anti-Flt4-Antikörpern.
Flt4-kodierende Nukleinsäuremoleküle oder Fragmente davon können als Sonden verwendet werden, um mRNAs, die Flt4 kodieren, zu detektieren und zu quantifizieren. Tests, die Nukleinsäuresonden einsetzen, um Sequenzen zu detektieren, die eine vollständige oder einen Teil einer bekannten Gensequenz umfassen, sind im Stand der Technik gut bekannt. Flt4-mRNA-Titer können entstehende und/oder existierende Neoplasien sowie das Einsetzen und/oder das Fortschreiten anderer menschlicher Erkrankungen anzeigen. Tests, die Flt4-mRNA detektieren und quantifizieren können, können daher ein wertvolles Diagnosewerkzeug sein.
Antisinn-Flt4-RNA-Moleküle sind therapeutisch nützlich zur Hemmung der Translation von Flt4-kodierenden mRNAs, wenn die therapeutische Aufgabe ein Bestreben beinhaltet, die Anwesenheit von Flt4 zu eliminieren oder dessen Niveau herunterzuregeln. Flt4-Antisinn-RNA könnte beispielsweise als ein Flt4-Antagonismusmittel bei der Behandlung von Krankheiten nütz lich sein, bei denen Flt4 zum Beispiel aufgrund seiner Überexpression als verursachendes Mittel beteiligt ist.
Darüber hinaus sind Flt4-Antisinn-mRNAs bei der Aufklärung funktioneller Mechanismen von Flt4 nützlich. Flt4-kodierende Nukleinsäuremoleküle können zur Herstellung von rekombinanten Flt4-Proteinen und verwandten Molekülen verwendet werden, wie in dieser Anmeldung gesondert beschrieben ist.
Anti-Flt4-Antikörper können verwendet werden, um Flt4 in verschiedenen Zusammenhängen zu diagnostizieren und zu quantifizieren. Zum Beispiel können Antikörper gegen verschiedene Domänen von Flt4 als Basis für Flt4-Immunassays oder die immunhistochemische Feststellung von Flt4 verwendet werden. Tyrosinkinase-Aktivität von Flt4 kann in diesen Tests als eine enzymatische Verstärkungsreaktion für die Erzeugung eines Flt4-Signals verwendet werden. Anti-Flt4-Antikörper können auch zur Untersuchung der Menge von Flt4 auf Zelloberflächen nützlich sein.
Es können Antikörper hergestellt werden, die als Flt4-Liganden-Agonisten oder -Antagonisten fungieren, wodurch die Regulation der Flt4-Aktivität möglich wird. Es können auch Zufallspeptide durch synthetische Mittel oder durch rekombinante Mittel aus Zufallsoligonukleotiden hergestellt werden, und diejenigen, die eine spezifische Bindung an den Flt4-Rezeptor zeigen, können mit Hilfe der extrazellulären Domäne von Flt4 selektiert werden. Solche Peptidsegmente können auch aus einer Phagendisplaybibliothek unter Verwendung der extrazellulären Domäne von Flt4 unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik Standard sind, selektiert werden. Solche Peptide können agonistische oder antagonistische Aktivität aufweisen. Flt4-Antikörper können auch nach Konjugation an verschiedene Verbindungen wertvolle Diagnosewerkzeuge für die In-vivo-Abbildung von Flt4-exprimierenden Zellen und Geweben oder Tumoren bereitstellen.
Monoklonale Antikörper gegen Flt4 können entweder kovalent oder nichtkovalent an geeignete supramagnetische, paramagnetische, elektrondichte, echogene oder radioaktive Mittel gekoppelt werden, um ein zielgerichtetes Bildgebungsmittel herzustellen. Antikörperfragmente, die durch Proteolyse oder chemische Behandlung erzeugt werden, oder Moleküle, die unter Verwendung der Epitop-bindenden Domäne des monoklonalen Antikörpers hergestellt wurden, könnten an die Stelle des intakten Antikörper gesetzt werden. Dieses Bildgebungsmittel würde dann als Kontrastreagenz für die Röntgen-, Magnetresonanz-, Sonografie- oder Szintigraphie-Bildgebung des menschlichen Körpers für diagnostische Zwecke dienen.
MOLEKULARBIOLOGIE VON FLT4
Die vollständigen Sequenzen der in den SEQ ID NO: 1 und 3 angegebenen Flt4-cDNA-Klone erstrecken sich über 4195 oder 4795 Nukleotide und enthalten offene Leserrahmen von 1298 oder 1363 Aminosäuren, abhängig vom alternativen Spleißen. Die Nukleotid- und abgeleitete Flt4-Aminosäuresequenz (Kurzform) ist in den SEQ ID NO: 1 und 2 dargestellt. 2 stellt einen Vergleich der Flt4-Aminosäuresequenz mit der der Flt1-Tyrosinkinase-Aminosäuresequenz wieder. Siehe Shibuya et al., Oncogene, 5: 519–524 (1990).
Eine mutmaßliche Signalpeptidsequenz von meist hydrophoben Aminosäuren folgt dem Initiator Methionin. Die das entsprechende ATG umgebende Sequenz befindet sich in Übereinstimmung mit der Konsensus-Translationsinitiationssequenz [Kozak, Nucl. Acids Res. 15: 8125–8135 (1987)]. Der vorhergesagte extrazelluläre Bereich beider Flt4-Polypeptide ist 775 Aminosäuren lang und enthält 12 potentielle Stellen für die Asparagin-gebundene Glykosylierung (NXS/T). Er enthält auch etliche Aminosäurereste, die ein Beabstandungsmuster zeigen, das für Mitglieder der Immunglobulin-Überfamilie von Proteinen beschrieben ist [Williams et al., Annu. Rev. Immunol., 6: 381–405 (1988)]. Er weist 12 Cysteinreste auf und kann in sieben immunglobulinähnlichen Domänen organisiert sein. Wie in 2 dargestellt, sind die immunglobulinähnlichen Domänen ungefähr wie folgt definiert: Ig-I (SEQ ID NO: 1, Positionen 158–364; SEQ ID NO: 2, Aminosäuren 47–115); Ig-II (SEQ ID NO: 1, Positionen 479–649; SEQ ID NO: 2, Aminosäuren 154–210); Ig-III (SEQ ID NO: 1, Positionen 761–961; SEQ ID NO: 2, Aminosäuren 248–314); Ig-IV (SEQ ID NO: 1, Positionen 1070–1228; SEQ ID NO: 2, Aminosäuren 351–403); Ig-V (SEQ ID NO: 1, Positionen 1340–1633; SEQ ID NO: 2, Aminosäuren 441–538); Ig-VI (SEQ ID NO: 1, Positionen 1739–1990; SEQ ID NO: 2, Aminosäuren 574–657); und Ig-VII (SEQ ID NO: 1, Positionen 2102–2275; SEQ ID NO: 2, Aminosäuren 695–752). Der vorausgesagten Ig-ähnlichen Domäne IV fehlen Cysteinreste. 2 zeigt auch die extrazelluläre Domäne von Flt1 (SEQ ID NO: 5), welche das nächste menschliche Homologon von Flt4 ist. Aus dieser Figur kann man die Alinierung der Cysteinreste und die sehr ähnliche Zusammensetzung der Ig-ähnlichen Regionen ersehen.
Die zytoplasmatische Domäne von Flt4 ist durch eine mutmaßliche Transmembranregion von 23 hydrophoben Aminosäureresten von dem extrazellulären Teil getrennt. Diese Sequenz wird auf der zytoplasmatischen Seite flankiert von einer basischen Region, die auf die Verbindung zwischen der Transmembran- und der Zytoplasmadomäne schließen lässt. Die zur Tyrosinkinase homologe Domäne beginnt am Rest 843 und beinhaltet eine ATP- bindende Tasche und eine mutmaßliche Autophosphorylierungsstelle, die homolog ist zu Y416 von c-src bei Y1068 (2). Die katalytische Tyrosinkinase-Domäne von Flt4 ist in zwei Unterdomänen aufgeteilt durch eine Sequenz von 65 Aminosäuren (As 944–1008), die hauptsächlich hydrophil ist und keine Homologie zu Flt1 zeigt. Anders als Flt1 enthält Flt4 keine Tyrosinreste in seinem Kinase-Insert.
Eine zweite Spezies von Flt4-mRNA weist ein alternatives 3'-Ende auf, dass eine längere Form des Flt4-Proteins kodiert.
In den 3A–C ist die Herstellung von Kurz- und Langformen der Flt4-mRNA durch alternatives Spleißen dargestellt. 3A zeigt die schematische Struktur des 3'-Endes des cDNA-Inserts der Klone J.1.1 und I.1.1. Das TAG-Stopkodon des Klons J.1.1 sowie die Polyadenylierungsstelle (PolyA) sind angegeben. Klon I.1.1 unterscheidet sich vom Klon J.1.1 in dem schattierten Abschnitt (die Lang- beziehungsweise Kurzformen von Flt4-mRNA). TAA und PolyA zeigen das Stopkodon und die Polyadenylierungsstelle des Klons I.1.1. an. Darüber hinaus sind die Restriktionsendonuklease-Schnittstellen für EcoRI und AvaI angegeben. Unten ist das 256-Bp-EcoRI-AvaI-Insert des Klons I.1.1. gezeigt, der für die cRNA-Protektionsanalyse verwendet wurde. Der am stärksten schattierte Bereich zeigt die Sequenzen aus dem Polylinker in der linearisierten Sinn-RNA-Matrize für die Transkription des Antisinnstrangs in vitro an. Ebenfalls dargestellt sind die schematischen Strukturen der geschützten Fragmente nach RNAse-Protektionsanalyse. Die 3B und 3C zeigen Autoradiogrammen der ³⁵S-markierten 256-Bp-Antisinn-RNA-Sonde und der verdauten 211- und 124-Bp-Fragmente, die die Lang- und Kurzformen von Flt4-RNA repräsentieren, wenn diese durch polyadenylierte RNA aus den angegebenen Zellinien (Tera-2 ist eine Teratokarzinom-Zell linie, die hier mit und ohne Retinolsäure(RS)-Behandlung für 10 Tage analysiert wurde) geschützt wurden. Die (Negativ-)Kontroll-Spur zeigt Ergebnisse des Schutzes mit Transfer-RNA. Die Herabregulation der Flt4-mRNAs während der Differenzierung der Tera-2-Zellen ist zu beachten. Tera-2-Zellen des Klons 13 wurden von Dr. C. F. Graham (Fachbereich Zoologie, Universität Oxford, VK) bereitgestellt. In dieser Studie wurden Zellen zwischen den Passagen 18–40 verwendet. Die Zellen wurden in Eagle-Minimalmedium (minimum essential medium, MEM), versetzt mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika, gehalten. Zur Induktion der Differenzierung wurden die Zellen auf gelatinebeschichteten Schalen von Gewebekulturqualität zu einer Dichte von 1,5 × 10³ Zellen/cm² ausplattiert. Am folgenden Tag wurde 2 × 10^–6 M RS zu dem Medium zugegeben. Die Zellen wurden in Gegenwart von RS für bis zu 10 Tage kultiviert.
Die in den 3A–C dargestellten Ergebnisse veranschaulichen die Erzeugung von Carboxyltermini dieser beiden Flt4-(Kurz- und Lang-)Formen, die durch alternatives Spleißen erzeugt wurden.
Nach seiner abgeleiteten Aminosäuresequenz gehört Flt4 zu den Klasse-III-RTKs. Insbesondere gehört Flt4 zu einer Unterfamilie von RTKs, die sieben Ig-Schleifen in ihrem extrazellulären Teil enthalten, und unterscheidet sich daher von anderen Mitgliedern der Klasse-III-RTKs, die fünf Ig-Schleifen enthalten. Flt4 ist am engsten homolog mit dem Prototyprezeptor der FLT-Familie, Flt1, der als eine v-ros-bezogene DNA aus einer menschlichen genomischen DNA-Bibliothek kloniert wurde [Shibuya et al., Oncogene, 5: 519–524 (1990)], und mit dem Maus-FLK1-Rezeptor, der aus mit hämatopoetischen Stammzellen angereicherten Fraktionen der Mausleber kloniert wurde [Mat thews et al., Cell, 65: 1143–1152 (1991); Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9026–9030 (1991)]. Die extrazelluläre Domäne von Flt4 zeigt 33% und 37% Aminosäuresequenz-Identität mit menschlichem Flt1 beziehungsweise Maus-FLK1. Flt1 und FLK1 werden wie Flt4 weithin in verschiedenen normalen Geweben wie beispielsweise Lunge, Herz und Niere exprimiert. Darüber hinaus zeigt eine kürzlich identifizierte menschliche Endothelzell-Rezeptortyrosinkinase KDR [Terman et al., Oncogene, 6: 1677–1683 (1991)] beträchtliche Homologie mit Flt4- und Flt1-Familienmitgliedern. Aus den erhältlichen Sequenzdaten kann man berechnen, dass KDR in der Tyrosinkinase(TK)-Domäne zu 81% identisch mit Flt4 ist. Darüber hinaus weist die extrazelluläre Domäne von KDR auch die aus sieben Ig-Schleifen bestehende Struktur auf und seine TK1- und TK2-Domänen sind 95% und 97% identisch mit den entsprechenden Domänen des Maus-FLK1-Rezeptors. Dies legt nahe, das KDR das menschliche Homologon von Maus-FLK1 ist.
Obwohl die Flt4-TK-Domäne zu etwa 80% mit den TK-Domänen von Flt1 und FLK1/KDR identisch ist, ist sie lediglich zu etwa 60% identisch mit den TK-Domänen anderer Rezeptoren der RTK-Klasse III. Da diese anderen Rezeptoren auch nur fünf Ig-ähnliche Domänen in der extrazellulären Region aufweisen, kann man Flt4, Flt1 und FLK1/KDR in eine separate FLT-Unterfamilie innerhalb der Klasse-III-RTKs klassifizieren.
Der in der Sequenz D/E-D/E-Y-M/V-P/D/E-M [(Cantley, et al., Cell, 64: 281–302 (1991)] (SEQ ID NO: 6) in Kinase-Insertionen von PDGFRs, c-fms und c-kit angeordnete Tyrosinrest ist eine Autophosphorylierungsstelle, die, wenn sie phosphoryliert wurde, die SH2-Domäne der Phosphatidylinositol-3'-Kinase (PI-3K) [Reedijk et al., EMBOJ. 11: 1365–1372 (1992)] bindet. Interessanterweise enthalten die Mitglieder der FLT- Unterfamilie oder der Flt3/FLK2-Rezeptor, anders als diese Klasse-III-RTKs, keine solchen Konsensusmotive.
Die acht humanen Klasse-III-RTK-Gene sind in drei verschiedenen Chromosomen gebündelt. Chromosom 4 enthält die c-kit-, PDGRF-α- und KDR-Gene [Yarden et al., EMBO J. 6: 3341–3351 (1987); Stenman et al., Genes, Chromosomes, Cancer, 1: 155–158 (1989); Terman et al., Oncogene, 6: 1677–1683 (1991)]. Die Flt1- und Flt3-Gene sind in Chromosom 13q12 lokalisiert [Satoh et al., Jpn. J. Cancer Res., 78: 772–775 (1987); Rosnet et al., Genomics, 9: 380–385 (1991)], während Flt4 in Bande q35 von Chromosom 5 lokalisiert ist [Aprelikova et al., Cancer Res., 52: 746–748 (1992)], in der Nähe der fms- und PDGFR-β-Gene [Warrington et al., Genomics, 11: 701–708 (1991]. Der lange Arm von Chromosom 5 ist an Translokationen beteiligt, die in Leukämiezellen gefunden werden. Deletionen eines Teils des langen Arms von Chromosom 5 werden in Knochenmarkszellen von Patienten mit refraktärer Anämie und Makrozytose gefunden [Van Den Berghe et al., Nature, 251: 437–439 (1974)]. Ein abnormales 5q-Chromosoms wird in einigen anderen myeloproliferativen Krankheiten wie beispielsweise refraktärer Anämie mit überschüssigen Blasten [Swolin et al., Blood, 58: 986–993 (1981)], idiopathischer Myelofibrose ("agnogenic myeloid metaplasie") [Whang-Peng et al., Leuk. Res. 2: 41–48 (1978)], chronischer myelogener Leukämie [Tomiyasu et al., Cancer Genet. Cytogenet. 2: 309–315 (1980)], Polyzythämia vera [Van Den Berghe et al., Cancer Genet. Cytogenet. 1: 157–162 (1979)] und essentieller Thrombozythämie [Nowell et al., Cancer 42: 2254–2260 (1978)] gefunden.
Die Befunde hinsichtlich der Flt4-mRNA-Expression legen nahe, dass dieses Proteinprodukt für bestimmte Leukämiezellen charakteristisch ist. Es wurde gezeigt, dass etliche Differen zierungsantigene existieren, die Megakaryoblasten- und Endothelzellen gemeinsam sind, wobei ein Beispiel das Plättchenglykoprotein IIIa ist [Ylänne et al., Blood, 72: 1478–1486 (1988); Kieffer et al., Blood, 72: 1209–1215 (1988); Berridge et al., Blood, 66: 76–85 (1985)]. Darüber hinaus wird Flt4 durch bestimmte Endothelzellen von zum Beispiel Lunge und Niere während der fötalen Periode exprimiert.
Um die Rolle von Flt4 während der Entwicklung besser zu verstehen, wurden partielle cDNAs für Maus-Flt4 kloniert. Unter Verwendung dieser Sonden bei der In-situ-Hybridisierung wurde die mRNA-Expression während der Maus-Entwicklung analysiert. Es wurde festgestellt, dass Flt4 während der Vaskulogenese und Angiogenese des lymphatischen Systems exprimiert wird. Die Relevanz dieser Befunde wurde auch in normalen und krankhaften menschlichen adulten Geweben bestätigt, da Flt4 in lymphatischen Endothelzellen von menschlichen adulten Geweben sowohl bei normalen als auch krankhaften Zuständen sowie in einigen Hochendothelvenolen (HEVs) gefunden wurde.
Die Klonierung von Maus-Flt4-cDNA-Fragmenten zeigte, dass deren abgeleitete Aminosäuresequenz nahezu identisch ist mit der entsprechenden menschlichen Sequenz (Aminosäureidentität etwa 96% in beiden untersuchten Segmenten). Weitere Hinweise auf die Identität der Maus-Flt4-cDNA wurde aus Northern-Hybridisierungsstudien erhalten, wobei Sonden aus beiden Spezies das typische 5,8-kb-mRNA-Signal aus Mausgeweben ergaben. Die Analyse von RNA, die aus verschiedenen Geweben von adulten Mäusen isoliert wurde, zeigte eine Flt4-Expression in Leber, Lunge, Herz, Milz und Niere, mit keiner oder einer sehr geringen Hybridisierung im Hirn und den Hoden. Dieses Muster entspricht dem Muster, das früher von Galland et al., Oncogene, 8: 1233 (1993), berichtet wurde. Die Ergebnisse der RNA se-Protektion legten nahe, dass das Flt4-Gen während der Maus-Entwicklung, beginnend mit 8,5-Tage-P.C.-Embryos, benötigt wird, und die relativen Expressionsniveaus erschienen ziemlich stabil.
Für die In-situ-Hybridisierung wurden zwei Fragmente von Maus-Flt4-cDNA ausgewählt, die Sequenzen der extrazellulären Domäne kodieren. Diese ermöglichte eine klare Unterscheidung der Hybridisierungsmuster von den verwandten FLK-1- und Flt1-Rezeptor-Mustern, die nur ein sehr geringes Maß von Sequenzidentität mit Flt4 in der extrazellulären Region zeigen. Siehe Millauer et al., Cell, 72: 835 (1993); Yamaguchi et al., Development, 118: 489 (1993); Peters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8915 (1993); Finnerty et al., Oncogene, 8: 2293 (1993).
Flt4 wurde, ähnlich wie die endothelialen FLK-1-, Flt1-, Tie- und Tek-Rezeptortyrosinkinase-Gene, in 7,5-Tage-Post-Coitum(P.C.)-Embryos nicht exprimiert. In einem 8,5-Tage-P.C.-Embryo wurden die stärksten Flt4-Signale in der Allantois, den Angioblasten des Kopfmesenchyms, der dorsalen Aorta und der Kardinalvene lokalisiert. Schwache Signale wurden im Endokard beobachtet. Im Gegensatz dazu waren Angioblasten des Dottersacks negativ, anders als für FLK-1 und Flt1, Tie und Tek. Siehe Korhonen et al., Oncogene, 8: 395 (1993); und Peters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8915 (1993). Die Beschränkung der Flt4-Expression auf das venöse System war in Proben aus 11,5-Tage-Mausembryos noch deutlicher, wo die Tie-mRNA auch in Arterien exprimiert wurde. In 12,5-Tage-P.C.-Embryos dekorierte das Flt4-Signal sich entwickelnde venöse und mutmaßliche lymphatische Endothelien, aber, anders als für die endotheliale Tie-Rezeptortyrosinkinase, waren arterielle Endothelien negativ. Während der späteren Stadien der Entwicklung wurde die Flt4-mRNA auf vaskuläre Plexus ohne Blutzellen beschränkt, die sich entwickelnde Lymphgefäße repräsentieren. Lediglich das lymphatische Endothel und einige Hochendothelvenolen exprimierten Flt4-mRNA in adulten menschlichen Geweben. Erhöhte Expression trat in lymphatischen Sinus und Hochendothelvenolen, in metastatischen Lymphknoten und im Lymphangiom auf.
Aufgrund von Schwierigkeiten bei der Interpretation der Daten aus Mausembryos wurden menschliche Endothelien untersucht, da das Lymphsystems in Menschen sehr viel besser definiert ist. Es konnten auch Zellen, die aus verschiedenen Endothelien etabliert wurden, in Zellkultur untersucht werden, um zu sehen, ob die Spezifität der Flt4-Expression unter In-vitro-Bedingungen erhalten bleibt. Endothelzelllinien sind bekannt dafür, dass sie Differenzierungseigenschaften auf In-vitro-Kultur verlieren. Es war daher nicht unerwartet, dass sie negativ auf Flt4-mRNA waren. Kultivierte Aorta-Endothelzellen waren ebenfalls ohne Flt4-mRNA. Es wurden jedoch Signale aus menschlichen Endothelzellen erhalten, die aus der Mikrovaskulatur und aus femoralen und umbilikalen Venen herangezogen wurden. Somit blieb zumindest einiges von der Spezifität der Flt4-Expression in Zellkultur erhalten.
In-situ-Hybridisierungsanalyse von adulten menschlichen Geweben bestätigte die bei sich entwickelnden Mausembryos beobachtete Beschränkung von Flt4 auf das Lymphsystem. Die Flt4-Expression wurde in den lymphatischen Endothelien und in den Sinus von menschlichen Lymphknoten beobachtet. Interessanterweise waren auch einige der HEVs, die kuboidales Endothel aufweisen, von dem gezeigt wurde, dass es beim Transport von Leukozyten zu den Lymphknoten eine Funktion ausübt, Flt4-positiv. Darüber hinaus zeigte eine parallele Hybridi sierungsanalyse, dass Flt4-mRNA-Niveaus in diesen Strukturen bei metastatischen im Vergleich zu normalen Lymphknoten erhöht waren. Flt4 war auch sehr prominent in Lymphangiomen, die benigne Tumoren sind, die aus Bindegewebesstroma und wachsenden, mit Endothel ausgekleideten, lymphatischen Kanälen bestehen. Flt4-mRNA war beschränkt auf das lymphatische Endothel dieser Tumoren und fehlte in deren Arterien, Venen und Kapillaren. In der menschlichen Lunge waren lymphatische Strukturen die einzigen identifizierten Flt4-positiven Gefäße.
Die vorstehenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass Flt4 ein neuer Marker für lymphatische Gefäße und einige Hochendothelvenolen in menschlichen adulten Geweben ist. Die Ergebnisse stützen auch die Theorie des venösen Ursprungs von Lymphgefäßen. Flt4 kann als Wachstumsfaktorrezeptor an der Differenzierung und den Funktionen dieser Gefäße beteiligt sein. Eine genaue Charakterisierung von biologischen Wirkungen, die durch Flt4 über den Flt4-Liganden, VEGF-C, vermittelt werden, ist in der PCT-Patentanmeldung PCT/FI96/00427, eingereicht am 1. August 1996 und veröffentlicht als internationale Veröffentlichung WO 97/05250 bereitgestellt.
Diese Ergebnisse, kombiniert mit den Flt4-bindenden Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung, ermöglichen eine selektive Markierung von lymphatischem Endothel, insbesondere unter Verwendung von erfindungsgemäßen an visualisierbaren radioaktiven, elektronendichten oder anderen Reporter-Substanzen gebundenen Antikörpern. Es kann möglich sein, Substanzen in das Lymphsystems zu injizieren, die Flt4-Rezeptor internalisierende-induzierende monoklonale Antikörper oder Liganden beinhalten, und dadurch vorgegebene Moleküle in das lymphatische Endothel transportieren. Es kann auch möglich sein, Flt4-bindende Verbindungen gemäß der Erfindung zur Detektion von Hochendothelvenolen, insbesondere aktivierten HEVs, die erhöhte Niveaus des Flt4-Rezeptors exprimieren, zu verwenden. Nach unserer Kenntnis sind gegenwärtig keine solchen spezifischen Marker für lymphatisches Endothel erhältlich.
GENBASIERTE THERAPIEN
Die vorliegende Erfindung sieht auch Gentherapieverfahren vor. Insbesondere kann die Vaskulatur der Krebszelle oder die Krebszelle selbst mit einem Expressionskonstrukt in Kontakt gebracht werden, das in der Lage ist, der Vaskulatur der Zelle ein therapeutisches Peptid, wie zum Beispiel die erfindungsgemäßen VEGFR-3-Fragmente, in einer Weise bereitzustellen, die ein therapeutisches Ergebnis bewirkt. Solch ein therapeutisches Ergebnis kann zum Beispiel die Hemmung von VEGFR-3 in der Vaskulatur des Tumors, eine Hemmung der Angiogenese, eine Hemmung der Lymphangiogenese, eine Ablation, Regression oder andere Hemmung des Tumorwachstums, eine Induktion der Apoptose des Blut- oder Lymphgefäßsystems des Tumors oder tatsächlich der Tumorzellen selbst sein.
Für diese Ausführungsform umfasst ein beispielhaftes Expressionskonstrukt einen Virus oder ein technisch hergestelltes Konstrukt, das von einem viralen Genom abgeleitet ist. Das Expressionskonstrukt umfasst im allgemeinen eine das zu exprimierende Gen kodierende Nukleinsäure und weitere regulatorische Bereiche, die die Expression des Gens in der Zelle bewirkt, an die sie zu verabreichen ist. Solche regulatorischen Bereiche beinhalten zum Beispiel Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen.
Es ist nunmehr weithin anerkannt, dass DNA unter Einsatz verschiedener viraler Vektoren in eine Zelle eingebracht werden kann. In solchen Ausführungsformen können Expressionskonstrukte, die virale Vektoren umfassen, die die interessierenden Gene enthalten, ein adenoviraler (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5.824.544; U.S.-Patent Nr. 5.707.618; U.S.-Patent Nr. 5.693.509; U.S.-Patent Nr. 5.670.488; U.S.-Patent Nr. 5.585.362; jedes durch Inbezugnahme hier aufgenommen), retroviraler (siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 5.888.502; U.S.-Patent Nr. 5.830.725; U.S.-Patent Nr. 5.770.414; U.S.-Patent Nr. 5.686.278; U.S.-Patent Nr. 4.861.719 jedes durch Inbezugnahme hier aufgenommen), adenoassoziierter viraler (siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 5.474.935; U.S.-Patent Nr. 5.139.941; U.S.-Patent Nr. 5.622.856; U.S.-Patent Nr. 5.658.776; U.S. Patent Nr. 5.773.289; U.S.-Patent Nr. 5.789.390; U.S.-Patent Nr. 5.834.441; U.S.-Patent Nr. 5.863.541; U.S.-Patent Nr. 5.851.521; U.S.-Patent Nr. 5.252.479 jedes durch Inbezugnahme hier aufgenommen), ein adenoviral-adenoassoziierter viraler Hybrid- (siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 5.856.152, durch Inbezugnahme hier aufgenommen) oder ein vakzineviraler oder ein herpesviraler (siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 5.879.934; U.S.-Patent Nr. 5.849.571; U.S.-Patent Nr. 5.830.727; U.S.-Patent Nr. 5.661.033; U.S.-Patent Nr. 5.328.688, jedes durch Inbezugnahme aufgenommen) Vektor sein.
In anderen Ausführungsformen ist die nichtvirale Zufuhr vorgesehen. Diese beinhaltet Kalziumphosphat-Präzipitation (Graham und Van Der Eb, Virology, 52: 456–467, 1973; Chen und Okayama, Mol. Cell Biol., 7: 2745–2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10: 689–695, 1990) DEAE-Dextran (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188–1190, 1985), Elektroporation (Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6: 716–718, 1986; Potter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 7161–7165, 1984), direkte Mikroinjektion (Harland und Weintraub, J. Cell Biol., 101: 1094–1099, 1985.), DNA-beladene Liposomen (Nicolau und Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185–190, 1982; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3348–3352, 1979; Felgner, Sci Am. 276 (6): 102–6, 1997; Felgner, Hum Gene Ther. 7 (15): 1791–3, 1996), Zell-Ultrabeschallung (Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8463–8467, 1987), Genbeschuss unter Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilen (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87: 9568–9572, 1990), und rezeptorvermittelte Transfektion (Wu und Wu, J. Biol. Chem., 262: 4429–4432, 1987; Wu und Wu, Biochemistry, 27: 887–892, 1988; Wu und Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12: 159–167, 1993).
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann das Expressionskonstrukt (oder tatsächlich die oben beschriebenen Peptide) in ein Liposom eingeschlossen werden. Liposome sind vesikuläre Strukturen, die durch eine Phospholipid-Doppelschichtmembran und ein inneres wässriges Medium gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposome weisen mehrere durch wässriges Medium getrennte Lipidschichten auf. Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide in einem Überschuss von wässriger Lösung suspendiert werden. Die Lipidkomponenten machen vor der Bildung von geschlossenen Strukturen eine Selbst-Umlagerung durch und schließen Wasser und gelöste Solute zwischen den Lipid-Doppelschichten ein (Ghosh und Bachhawat, In: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands, Wu G, Wu C Hrsg., New York: Marcel Dekker, S. 87–104, 1991). Die Zugabe von DNA zu kationischen Liposomen verursacht eine topologische Transition von Liposomen zu optisch doppelbrechenden flüssigkristallinen verdichteten Globuli (Radler et al., Science, 275 (5301): 810–4, 1997). Diese DNA-Lipidkomplexe sind mögliche nichtvirale Vektoren zur Verwendung in Gentherapie und -zufuhr.
Die Liposomen-vermittelte Nukleinsäurezufuhr und -expression von Fremd-DNA in vitro ist sehr erfolgreich gewesen. Bei der vorliegenden Erfindung sind auch verschiedene kommerzielle Ansätze vorgesehenen, die eine "Lipofektions"-Technologie beinhalten. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann das Liposom mit hämagglutinierenden Virus (HVJ) komplexiert sein. Es hat sich gezeigt, dass dies die Fusion mit der Zellmembran erleichtert und den Zelleintritt von Liposomenverkapselter DNA fördert (Kaneda et al., Science, 243: 375–378, 1989). In anderen Ausführungsformen kann das Liposom in Verbindung mit nukleären chromosomalen Nichthistonproteinen (HMG-1) komplexiert oder eingesetzt werden (Kato et al., J. Biol. Chem., 266: 3361–3364, 1991). In noch weiteren Ausführungsformen kann das Liposom in Verbindung mit sowohl HVJ als auch HMG-1 komplexiert oder eingesetzt werden. Da solche Expressionskonstrukte beim Transfer und der Expression von Nukleinsäuren in vitro und in vivo erfolgreich eingesetzt wurden, sind sie für die vorliegende Erfindung anwendbar.
Andere Vektor-Zufuhrsysteme, die eingesetzt werden können, um Zellen eine ein therapeutisches Gen kodierende Nukleinsäure zuzuführen, beinhalten rezeptorvermittelte Zufuhrvehikel. Diese machen sich die selektive Aufnahme von Makromolekülen durch rezeptorvermittelte Endozytose in nahezu allen eukaryotischen Zellen zunutze. Aufgrund der Zelltyp-spezifischen Verteilung verschiedener Rezeptoren kann die Zufuhr hochspezifisch sein (Wu und Wu, 1993, oben).
Rezeptorvermittelte Genzufuhrvehikel bestehen im Allgemeinen aus zwei Komponenten: einem Zellrezeptor-spezifischen Ligan den und einem DNA-bindenden Mittel. Etliche Liganden sind für den rezeptorvermittelten Gentransfer verwendet worden. Die am umfangreichsten charakterisierten Liganden sind Asialoorosomucoid (ASOR) (Wu und Wu, 1987, oben) und Transferin (Wagner et al., Proc. Nat'l. Acad Sci. USA, 87 (9): 3410–3414, 1990). Kürzlich ist ein synthetisches Neoglykoprotein, das denselben Rezeptor wie ASOR erkennt, als Genzufuhrvehikel verwendet worden (Ferkol et al., FASEB J., 7: 1081–1091, 1993; Perales et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 4086–4090, 1994), und epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) ist ebenfalls verwendet worden, um Gene an Plattenepithelkarzinomzellen zuzuführen (Myers, EP 0273085 ).
In anderen Ausführungsformen kann das Zuführvehikel einen Liganden und ein Liposom umfassen. Zum Beispiel setzten Nicolau et al. (Methods Enzymol. 149: 157–176, 1987) in Liposomen aufgenommenes Laktosylceramid, ein Galaktose-terminales Asialogangliosid, ein und beobachteten einen Anstieg in der Aufnahme des Insulingens durch Hepatozyten. Es ist somit machbar, dass eine ein therapeutisches Gen kodierende Nukleinsäure durch eine beliebige Zahl von Rezeptor-Liganden-Systemen mit oder ohne Liposome spezifisch in einen bestimmten Zelltyp gebracht werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Expressionskonstrukt einfach aus nackter rekombinanter DNA oder Plasmiden bestehen. Der Transfer des Konstrukts kann durch jedes der oben genannten Verfahren vorgenommen werden, das die Zellmembran physikalisch oder chemisch permeabilisiert. Dies ist insbesondere für den Transfer in vitro anwendbar, kann jedoch auch für die In-vivo-Verwendung eingesetzt werden. Dubensky et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 7529–7533, 1984) injizierten erfolgreich Polyomavirus-DNA in Form von CaPO₄-Präzipitate in Leber und Milz von adulten und neugeborenen Mäusen, und zeigten eine aktive virale Replikation und eine akute Infektion. Benvenisty und Neshif (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83: 9551–9555, 1986) zeigten ebenfalls, dass eine direkte intraperitoneale Injektion von CaPO₄-präzipitierten Plasmiden zu einer Expression der transfizierten Gene führt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung zum Transfer eines nackten DNA-Expressionskonstrukts in Zellen kann Partikelbeschuss beinhalten. Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit ab, DNA-beschichtete Mikroprojektile auf eine hohe Geschwindigkeit zu beschleunigen, was es ihnen ermöglicht, Zellmembranen zu durchdringen und in die Zellen einzudringen, ohne sie zu töten (Klein et al., Nature, 327: 70–73, 1987). Etliche Vorrichtungen für die Beschleunigung kleiner Partikel sind entwickelt worden. Eine solche Vorrichtung beruht auf einer Hochspannungsentladung zur Erzeugung eines elektrischen Stroms, der wiederum die Antriebskraft liefert (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87: 9568–9572, 1990). Die verwendeten Mikroprojektile haben aus biologisch inerten Substanzen wie beispielsweise Wolfram- oder Goldkügelchen bestanden.
Dem Fachmann ist gut bekannt, wie er die Genzufuhrvehikel bei In-vivo- und Ex-vivo-Situationen anwendet. Für virale Vektoren wird man im Allgemeinen einen viralen Vektorvorrat herstellen. In Abhängigkeit von der Art des Virus und des erreichbaren Titers führt man dem Patienten 1 × 10⁴, 1 × 10⁵, 1 × 10⁶, 1 × 10⁷, 1 × 10⁸, 1 × 10⁹, 1 × 10¹⁰, 1 × 10¹¹ oder 1 × 10¹² infektiöse Partikel zu. Entsprechende Zahlen können für liposomale oder andere nichtvirale Formulierungen durch Vergleich der relativen Aufnahmeeffizienzen extrapoliert werden.
Die Formulierung als pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung ist unten beschrieben.
Für verschiedene Tumortypen sind verschiedene Routen vorgesehen. Der Abschnitt unten über Routen enthält eine ausführliche Liste von möglichen Routen. Für praktisch jeden Tumor ist eine systemische Zufuhr vorgesehen. Dies erweist sich als besonders wichtig für den Angriff auf mikroskopische oder metastatische Krebse. Wenn eine diskrete Tumormasse identifiziert werden kann, kann eine Vielzahl von direkten, lokalen und regionalen Herangehensweisen gewählt werden. Zum Beispiel kann dem Tumor der Expressionsvektor oder das Protein direkt injiziert werden. Ein Tumorbett kann vor, während oder nach einer Resektion behandelt werden. Im Anschluss an die Resektion wird man den Vektor im allgemeinen durch einen nach einer Operation an Ort und Stelle belassenen Katheter zuführen. Man kann die Tumorvaskulatur verwendeten, um den Vektor durch Injektion in eine Versorgungsvene oder -arterie in den Tumor einzuführen. Eine mehr distale Blutversorgungsroute kann ebenfalls verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform ist eine Ex-vivo-Gentherapie vorgesehen. Bei einer Ex-vivo-Ausführungsform werden Zellen aus dem Patienten entnommen und zumindest für eine Zeitdauer außerhalb des Körpers gehalten. Während dieser Zeitdauer wird eine Therapie zugeführt, nach der die Zellen wieder in den Patienten eingeführt werden; vorzugsweise sind alle Tumorzellen in der Probe getötet worden.
Die folgenden Beispiele werden lediglich gegeben, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, und nicht, um deren Bereich in irgendeiner Weise zu beschränken
BEISPIEL 1
Isolation und Charakterisierung von Flt4-kodierenden cDNA Klonen
Materialien und Methoden
Eine Oligo-dT-"primed" menschliche HEL-Zell-cDNA-Bibliothek im Bakteriophagen Lambda gt11 [freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Mortimer Poncz, Childrens Hospital of Philadelphia, PA; Poncz et al., Blood, 69: 219–223 (1987)]. wurde mit einem cDNA-Fragment gescreent, das aus der selben Bibliothek PCR-amplifiziert wurde [Aprelikova et al., Cancer Res., 52: 746–748 (1992)]. Positive Plaques wurden wie beschrieben [Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)] identifiziert und gereinigt. cDNA-Insertionen des Bakteriophagen Lambda wurden als EcoRI-Fragmente isoliert und in das GEM3Zf(+)-Plasmid (Promega) subkloniert. Die vollständige kodierende Region des Flt4-Proteins wurde isoliert. Drei aus der HEL-Bibliothek isolierte überlappende Klone (wie in 1 dargestellt) wurden unter Verwendung des Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens mit Oligonukleotid-Primern, die nach den erhaltenen Sequenzen gestaltet wurden, sequenziert. Alle Bereiche der cDNAs wurden auf beiden Strängen sequenziert. Sequenzanalysen wurden unter Verwendung des GCG-Paket-Programms [Devereux et al., Nucleic Acids Res., 12: 387–395 (1984)] und des Prosite-Programms für Apple Macintosh durchgeführt.
1A veranschaulicht eine schematische Struktur der analysierten Flt4-cDNA-Klone. Pfeile skizzieren subklonierte Restriktionsfragmente (deren Größen in kb angegeben sind), die zur Sondierung der in 1B dargestellten Northern-Blots verwendet wurden. E = EcoRI-Stelle, S = SphI-Stelle. 1B veranschaulicht Northern-Hybridisierungsanalysen von DAMI- und HEL-Leukämiezell-RNAs mit den in 1A dargestellten Sonden.
Ergebnisse
Ein 210 bp langes Flt4-cDNA-Fragment, isoliert durch ein PCR-Klonierungsverfahren aus einer HEL-Zell-cDNA-Bibliothek, wurde als molekulare Sonde verwendet, um eine menschliche Oligo-dT-"primed" Erythroleukämiezell-cDNA-Bibliothek zu screenen.
Nukleotidsequenzanalysen der Klone ergaben einen offenen Leserrahmen von 1298 Aminosäure(RS)-Resten (SEQ ID NO: 2, 2). Der in der Figur markierte Translationsinitiator Methionin ist von einer typischen Konsensussequenz [Kozak, Nucleic Acids Res., 12: 857–872 (1984)] umgeben und wird gefolgt von einer hydrophoben Aminosäuresequenz, die charakteristisch für Signalsequenzen zur Translokation in das endoplasmatische Retikulum ist.
Die extrazelluläre Domäne von Flt4 kann zu sieben immunglobulinähnlichen Schleifen (2) angeordnet werden. Die Figur zeigt auch den Vergleich von Flt4 mit Flt1, der sehr ähnliche Strukturen enthält. Die Aminosäuresequenz von Flt1 ist als SEQ ID NO: 5 angegeben.
Die Aminosäurereste 775–798 bilden eine hydrophobe Sequenzstrecke, die wahrscheinlich als Transmembrandomäne des Rezeptors fungiert, gefolgt von mehreren basischen Resten auf der mutmaßlichen zytoplasmatischen Seite des Polypeptids. Die Juxtamembrandomäne ist 44 Reste lang vor dem Beginn einer Tyrosinkinase-Sequenzhomologie bei AS 842. Mit der Unterbre chung der Homologie in der Kinase-Insertionssequenz von 65 AS geht diese Homologie erst bei 1175 AS am carboxyterminalen Schwanz des Rezeptors verloren. Eine Suche nach verwandten Tyrosinkinasedomänen in der Aminosäuresequenz-Datenbank (Swissprot und NBRF) identifiziert die Flt1- und PDGFRB-Tyrosinkinasen mit einer Homologie von etwa 80 bzw. 60% in den katalytischen Tyrosinkinaseregionen.
BEISPIEL 2
Herstellung von Anti-Flt4-Antiseren
Ein EcoRI-Fragment von 657 Basenpaaren, das den vorhergesagten C-Terminus der Flt4-Kurzform kodiert, wurde "in-frame" mit der kodierenden Region der Glutathion-S-Transferase in dem bakteriellen Expressionsvektor pGEX-1λT (Pharmacia) kloniert, um ein GST-Flt4-Fusionsprotein in E. coli herzustellen. Das erhaltene Fusionsprotein wurde in Bakterien hergestellt und teilweise durch Glutathion-Affinitätschromatographie nach Herstelleranweisungen gereinigt. Dieses Protein wurde bei der Immunisierung von Kaninchen verwendet, um polyklonale Antikörper gegen Flt4 herzustellen. Die Antiseren wurden nach der dritten "Booster"-Immunisierung verwendet.
BEISPIEL 3
Expression von Flt4 in COS-Zellen
Materialien und Methoden
Die kodierende Volllängensequenz des Flt4-Proteins (kombiniert aus drei Klonen, 1) wurde in die HindIII-BamHI-Stelle des Kontrukts SV14-2 aus dem Säugetier-Expressions vektor SVpoly [Stacey et al., Nucleic Acids Res., 18: 2829 (1990)] inseriert. Die Expressionsvektoren (SV-FLT4 kurz und SV-FLT4 lang, die die entsprechenden Formen von Flt4-cDNA enthalten) wurden durch DEAE-Dextran-Transfektionsverfahren [McCutchanetal., J. Natl. CancerInst., 41: 351–357 (1968)] in COS-Zellen eingeführt. Zwei Tage nach der Transfektionen wurden die Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und in Immunpräzipitationspuffer (10 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,5% Nonidet P40, 0,1% SDS, 0,1 TIU/ml Aprotinin) überführt. Die Lysate wurden einer Ultraschallbehandlung unterzogen, 15' bei 10.000 × g zentrifugiert und über Nacht auf Eis mit 3 ml der Antiseren inkubiert. Protein-A-Sepharose (Pharmacia) wurde zugegeben und die Inkubationen wurde für 30' unter Rotation fortgesetzt. Die Präzipitate wurden vor der Analyse in SDS-PAGE vier Mal mit dem Immunpräzipitationspuffer, einmal mit PBS und einmal mit Wasser gewaschen.
Ergebnisse
Die Strukturvorhersagen der Flt4-cDNA-Sequenz wurden durch Klonieren der vollständigen kurzen und langen Protein-kodierenden Regionen von Flt4 in HindIII-BamHI-Stellen des pSVpoly-Expressionsvektors und Transfizieren dieses Expressionsvektors in COS Zellen getestet. Die durch diese zwei Konstrukte produzierten Proteine unterscheiden sich in ihrem C-Terminus: die längere Form enthält zusätzliche 65 Aminosäuren. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und unter Verwendung von gegen das GST-Flt4-Fusionsprotein, das carboxyterminale Aminosäurereste der Kurzform des vorhergesagten Flt4-Proteins (d.h. einen Teil, der sowohl der kurzen als auch der langen Form von Flt4 gemeinsam ist) enthält, erzeugten Antikörpern immunpräzipitiert. Die im munpräzipitierten Polypeptide wurden durch SDS-Polyakrylamidgelelektrophorese analysiert. Das Präimmunserum ergab keine spezifischen Banden, wohingegen die Flt4-spezifischen Antikörper zwei Banden von etwa 170 und 190 kD erkennen. Diese zwei Banden können unterschiedlich glykosylierte Formen des Flt4-Proteins repräsentieren.
BEISPIEL 4
Expression von Flt4 in NIH3T3-Zellen
Materialien und Methoden
Die Vollängen-Flt4-cDNA (Kurzform) wurde in den LTRpoly-Vektor (siehe Makela, et al., Gene, 118: 293–294 (1992), die den Plasmidvektor pLTRpoly mit der ATCC-Zugriffsnummer 77109 und der GeneBank-Zugriffsnummer X60280 offenbaren), enthaltend den "Long-terminal-repeat"-Promotor des murinen Moloney-Leukämievirus, subkloniert. Dieser LTR-FLT4-Expressionsvektor wurde mit pSV2neo-Markerplasmid zur Kotransfektion von NIH3T3-Zellen verwendet, und G418-resistente Klone wurden auf Flt4-Expression untersucht.
Für Western-Immunblotting-Analysen wurden Zellen auf einer großen konfluenten Platte in 2,5% SDS, 125 mM Tris, pH 6,5, lysiert. Die Zelllysate wurden durch SDS-PAGE einer Elektrophorese unterzogen und durch Elektroblotting auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membran wurde mit den Antiseren, die gegen das Flt4-Carboxyterminus-Peptid erzeugt wurden, inkubiert und gebundene Antikörper wurden unter Verwendung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Schweine-Anti-Kaninchen-Antiserum (Dako) und ECL-Reagenzien (Amersham) sichtbar gemacht. Für die metabolische Markierung wurden die Kulturen für eine Stunde mit 100 μCi/ml ³⁵S-Methionin markiert. Nach der Markierung wurden die Zellen zweimal gewaschen und in ihrem Wachstumsmedium für 1 oder 2 Stunden inkubiert, lysiert, mit Anti-Flt4-Antikörpern immunpräzipitiert und durch SDS-PAGE und Autofluorographie analysiert.
Ergebnisse
Die 170- und 190-kD-Polypeptide konnten in den Flt4-Kurzform-transfizierten NIH3T3-Zellen, nicht jedoch in den nur mit pSV2neo transfizierten Zellen detektiert werden. Über diese zwei Banden hinaus wurde eine bedeutende Bande bei etwa 120 kD in den Klonen beobachtet, die Flt4 produzieren. Metabolische Markierungs- und Pulsexperimente zeigten, dass dieses Protein als Ergebnis des posttranslationalen Processings der Kurzform-Flt4-Polypeptide erzeugt wird.
BEISPIEL 5
Chromosomale Kartierung des Flt4-Lokus
Da einige Clusterung von Klasse-III-Rezeptorgenen beobachtet wurde, ist es von großem Interesse, die chromosomale Lokalisierung von Flt4 festzustellen. Daher wurden Nager-Mensch-Zellhybride analysiert, was auf eine Verknüpfung von Flt4 mit dem menschlichen Chromosom 5 hindeutete.
Die Lokalisierung des Flt4-Gens in dem Bereich 5q33->5qter wurde bestimmt unter Verwendung von Hybriden, die partielles Chromosom 5s tragen. Diese Hybriden wurden durch Filterhybridisierung auf Anwesenheit des Flt4-Lokus getestet. Der Bereich des Chromosoms 5, der Flt4-positiven Hybriden gemeinsam war und Flt4-negativen Hybriden fehlte, war 5q33.1-qter. Die Anwesenheit von menschlichem Chromosom 5q33-qter in den Hybriden ist somit mit der Anwesenheit von Flt4-Sequenzen korreliert. Die Bereichskartierungsergebnisse zeigten, dass sich der Flt4-Lokus telomer zum Lokus des CSF1R/Plättchenwachstumsfaktorrezeptors β (PDGFRB) sowie dem Lokus des β-adrenergen Rezeptors (ADRBR) befindet, da diese Lokus sämtlich in dem Hydrid GB13, der negativ für Flt4 war, vorhanden sind.
BEISPIEL 6
Expression der Flt4-mRNA in Tumorzelllinien und Endothelzellen
Die in dieser Studie verwendeten Leukämiezelllinien (K562) sind in etlichen vorhergehenden Veröffentlichungen beschrieben worden; [Lozzio et al., Blood, 45: 321–334 (1975)], HL-60 [Collins et al., Nature, 270: 347–349 (1977)], HEL [Martin et al., Science, 216: 1233–1235 (1982)], DAMI [Greenberg et al., Blood, 72: 1968–1977 (1988)], MOLT-4 [Minowada et al., J. Natl. Cancer Inst., 49: 891–895 (1972)], Jurkat [Schwenk et al., Blut, 31: 299–306 (1975)], U937 [Sundstrom et al., Int. J. Cancer, 17: 565–577 (1976)], KG-1 [Koeffler et al., Science, 200: 1153–1154 (1978)], JOK-1 [Andersson et al., 1982, in R. F. Revoltella (ed.), Expression of Differentiated Functions in Cancer Cells, 239–245, Raven Press, New York] und ML-2 [Gahmberg et al., 1985, in L. C. Anderson, et al. (Hrsg.), Gene Expression During Normal and Malignant Differentiation, 107–123, Academic Press, London]. Die folgenden Tumorzelllinien, erhalten von der American Type Cultur Collection, wurden ebenfalls analysiert: JEG-3, ein Chorionkarzinom; A204, ein Rhabdomyosarkom; SK-NEP-1, ein Nephroblastom; BT-474, ein Brustkarzinom; Y79, ein Retinoblastom.
Die Leukämiezellen wurden in RPMI, enthaltend 10% fötales Kälberserum (FCS) und Antibiotika, angezogen. Dami-Zellen wurden in Iscoves modifiziertem DMEM mit 10% Pferdeserum kultiviert. Eine permanente endotheliale Hybrid-Zelllinie (EAhy926), die durch Fusion von endothelialen Erstpassagenzellen mit den A549-Lungenkarzinomzellen [Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 50: 3734–3737 (1983)] erhalten wurde, wurde in DMEM-HAT-Medium, enthaltend 10% FCS und Antibiotika, kultiviert.
Poly(A)⁺-RNA wurde wie beschrieben [Sambrook et al., siehe oben] aus den Zelllinien extrahiert. 5 μg der Poly(A)⁺-RNA-Proben wurden in Formaldehyd-haltigen Agarosegelen einer Elektrophorese unterzogen und unter Verwendung von Standardbedingungen geblottet. Die Insertionen der Flt4-cDNA-Klone wurden durch "Random-priming"-Verfahren markiert und zu den Blots hybridisiert. Die Hybridisierung wurde durchgeführt in 50% Formamid, 5 × Denhardt-Lösung (100 × Denhardt Lösung ist jeweils 2% Ficoll, Polyvinylpyrrolidon und Rinderserumalbumin), 5 × SSPE (3 M NaCl, 200 mM NaH₂PO₄·H₂O, 20 mM EDTA, pH 7,0), 0,1% SDS (Natriumlaurylsulfat), und 0,1 mg/ml ultraschallbehandelter Lachssperma-DNA bei 42°C für 18–24 h. Die Filter wurden bei 65°C in 1 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0), 0,1% SDS gewaschen und einem Kodak-XAR-S-Film ausgesetzt.
Northern-Analysen wurden mit der extrahierten Poly(A)⁺-RNA aus acht Leukämiezelllinien (HEL, K562, DAMI, U937, MOLT4, HL60, Jurkat und KG-1) und der endothelialen Hybridzelllinie (EAhy926) durchgeführt. Hybridisierung mit der GAPDH-Sonde wurde als interne Kontrolle für die Beladung mit einheitlichen Mengen von RNA bei der Analyse eingesetzt. Lediglich die HEL-Erythroleukämiezellen und DAMI-Megakaryoblasten-Leukämie zellen exprimierten 5,8-kb- und 4,5-kb-Flt4-mRNA. Die K562-Erythroleukämiezellen, Jurkat- und MOLT-4-T-Zell-Leukämien sowie HL-60-Promyelozytenleukämie-, U937-Monozytenleukämie- und KG-1-Myeloidleukämiezellen waren negativ für Flt4-mRNA.
Northern-Analysen wurden mit der extrahierten Poly(A)⁺-RNA aus fünf Tumorzelllinien (JEG-3, A-204, SK-NEP-1, BT-474 und Y79) und zwei der oben genannten Leukämiezelllinien (JOK-1, MOLT4) durchgeführt. Der markierte S2,5-cDNA-Klon (siehe 1) wurde als Hybridisierungssonde verwendet. Hybridisierung mit einer β-Aktin-Sonde wurde als interne Kontrolle für die Beladung mit einheitlichen Mengen von RNA bei der Analyse verwendet. Nur für die SK-NEP-1-Nephroblastom- und Y79-Retinoblastom-Zellen wurde beobachtet, dass sie Flt4-Transkripte enthalten.
Tera-2-Teratokarzinomzellen wurden nach 10 Tagen Behandlung mit Vehikel (–) oder Retinolsäure (+) zur Induktion der neuronalen Differenzierung analysiert [Thompson et al., J. Cell Sci., 72: 37–64 (1984)]. In der Northern-Blotting-Analyse von aus den Zellen isolierter Poly(A)⁺-RNA wurde gefunden, dass die undifferenzierten Zellen 5,8-kb- und 4,7-kb-mRNAs für Flt4 exprimierten, nach der 10-tägigen Differenzierung bei Northern-Blotting und Hybridisierung jedoch keine Flt4-mRNA festgestellt werden konnte. Diese Ergebnisse zeigen, das Flt4 während der Differenzierung dieser Zellen heruntereguliert wurde.
Die Flt4-mRNA-Expression wurde auch in undifferenzierten und TPA-differenzierten HEL-Zellen analysiert. Sowohl die HEL- als auch die DAMI-Zelllinien besitzen einen dualen Erythroid/Megakaryoblasten-Phänotyp und können durch Behandlung mit dem Tumorpromotor 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) zur weiteren Expression von Megakaryoblastenmarkern veranlasst werden. Wir analysierten, ob die Flt4-Expression in diesen Zellen während der Differenzierung stimuliert wird. HEL-Zellen wurden 2 Tage nach Behandlung mit TPA oder mit zu dessen Lösung verwendetem DMSO analysiert. Nach Entfernen des Flt4-Signals wurde der Filter mit Rb-1- und β-Aktin-cDNAs sondiert, um eine einheitliche Beladung der Spuren zu bestätigen. Auf Basis von densitometrischen Rasteranalysen des Autoradiogramms und Normalisierung gegen die konstitutive Expression des GAPDH-Gens wurde festgestellt, dass das Flt4-mRNA-Niveau in TPA-induzierten HEL-Zellen um etwa das 3,4fache erhöht war, wenn die Zellen eine Megakaryoblasten-Differenzierung durchmachten.
BEISPIEL 7
Expression von Flt4 in der fötalen Lunge
In-situ-Hybridisierung: Lungengewebe von einem 15 Wochen alten menschlichen Fötus wurde mit Erlaubnis der gemeinsamen Ethikkommission des universitären Zentralkrankenhauses und der Universität von Turku, Finnland, erhalten. Die Probe wurde für 18 Stunden bei 4°C in 10% Formalin fixiert, dehydriert, in Wachs eingebettet und in 6-μm-Abschnitte geschnitten. Die RNA-Sonden mit 206 und 157 Basen (Antisinn und Sinn) wurden aus linearisierter Plasmid-DNA unter Verwendung von SP6- und T7-Polymerasen und [³⁵S]-UTP erzeugt. Die In-situ-Hybridisierung der Abschnitte wurde nach Wilkinson et al., Development, 99: 493–500 (1987); Wilkinson, Cell, 50: 79–88 (1987) mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: 1) Toluol wurde statt Xylol vor der Einbettung in Paraffinwachs verwendet; 2) 6-μm-Abschnitte wurden geschnitten, auf eine Schicht von Diethylpyrocarbonat-behandeltem Wasser auf der Oberfläche von Glasobjektträgern angeordnet, die mit 2% 3-Aminopropyltriethoxysilan (Sigma) vorbehandelt wurden; 3) eine alkalische Hydrolyse der Sonden wurde ausgelassen; 4) die Hybridisierungsmischung enthielt 60% entionisiertes Formamid; 5) die hochstringente Waschung wurde für 80 Minuten bei 65°C in einer Lösung, die 50 mM DTT und 1 × SSC enthielt, durchgeführt; 6) die Abschnitte wurden mit NTB-2-Emulsion (Kodak) bedeckt und bei 4°C gelagert. Nach einer Expositionszeit von 14 Tagen wurden die Objektträger für 2,5 Minuten in einem Kodak-D-19-Entwickler entwickelt und für 5 Minuten mit Unifix (Kodak) fixiert. Die Abschnitte wurden mit Hämatoxylin in Wasser gefärbt.
Bei den Hybridisierungsstudien unter Verwendung der Antisinn-Sonde wurde Flt4-mRNA hauptsächlich in bestimmten Endothelzellen der Lunge eines 15 Wochen alten Fötus beobachtet. Kontrollhybridisierungen mit der Sinnstrang-Sonde und mit RNAse-A-behandelten Abschnitten ergaben kein sich vom Hintergrund abhebendes Signal.
Für eine Immunperoxidase-Färbung wurden eine 1:100-Verdünnung des Anti-Flt4-Antikörpers, Peroxidase-konjugierte Schweine-Anti-Kaninchen-Antikörper und Standardverfahren gemäß dem Stand der Technik verwendet. Kontrollfärbungen mit Präimmunserum oder Immunogen-blockiertem Serum ergaben kein Signal. Lungengewebe von 17 Wochen alten menschlichen Föten wurden analysiert, und die Ergebnisse stimmten mit denen der mRNA-In-situ-Hybridisierungsexperimente überein: das Endothel von bestimmten großen Gefäßen der Lunge wurde positiv mit dem Kaninchen-Anti-Flt4-Antiserum gefärbt.
BEISPIEL 8
Identifikation von Flt4-Genen in nichtmenschlichen Säugetierspezies
In 4 sind die Ergebnisse eines Versuchs zur Untersuchung der Anwesenheit von Flt4-Sequenzen in DNA aus unterschiedlichen Spezies dargestellt. Um festzustellen, wie gut das Flt4-Gen während der Evolution konserviert wurde, wurde das 2,5-kb-cDNA-Fragment (siehe 1) mit genomischen DNAs hybridisiert, die aus unterschiedlichen Tieren und aus Hefe gereinigt wurden, und mit EcoRI verdaut. Die Hybridisierungslösung umfasste 50% Formamid, 5 × Denhardt-Lösung (100 × Denhardt-Lösung entspricht jeweils 2% Ficoll, Polyvinylpyrrolidon und Rinderserumalbumin), 5 × Salzlösung-Natriumphosphat-EDTA (3 M NaCl, 200 mM NaH₂PO₄·H₂O, 20 mM EDTA, pH 7,0), 0,1% Natriumlaurylsulfat und 0,1 mg/ml ultraschallbehandelte Lachssperma-DNA. Die Hybridisierung wurde für 24 Stunden bei 42°C durchgeführt. Der Filter wurde bei 65°C in 1 × Standard-Salzlösung-Citrat (150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0) und 0,1% Natriumlaurylsulfat gewaschen und einem Kodak-XAR5-Film gegenüber exponiert. Spezifische Banden wurden in Affen-, Ratten-, Maus-, Hunde-, Rinder-, Kaninchen- und Hühner-DNAs gefunden, die Hefe-DNA ergab jedoch kein Signal. Die Flt4-cDNA wurde aus Wachteln isoliert. Siehe Eichmann et al., Gene, 174(1): 3–8 (26. September 1996) und Genbank-Zugriffsnummer X83287.
BEISPIEL 9
Flt4-Genexpression in adulten menschlichen Geweben
Die Flt4-mRNA-Expression in adulten menschlichen Geweben wurde unter Verwendung von 2 μg Poly(A)⁺-RNA aus Herz-, Hirn-, Plazenta-, Lungen-, Leber-, Skelettmuskel-, Nieren- und Pank reasgeweben ("Multiple Tissue Northern Blot", Clontech Inc.) durch Hybridisierung mit der Flt4-cDNA-Sonde analysiert. Kontrollhybridisierungen mit Sonden für konstitutiv exprimierte Gene zeigten eine gleichmäßige Beladung der Spuren.
Die Hybridisierung von Poly(A)⁺-RNA aus verschiedenen menschlichen Geweben mit dem Flt4-cDNA-Fragment zeigte mRNA-Banden von 5,8 und 4,5 kb Mobilität und eine schwach markierte Bande von 6,2 kb in Plazenta, Lunge, Herz und Niere. Schwache mRNA-Banden wurden in der Leber und im Skelettmuskel beobachtet, wohingegen der Pankreas und das Hirn, wenn überhaupt, nur sehr wenig Flt4-RNA enthalten.
BEISPIEL 10
Flt4-Expression in menschlichen fötalen Geweben

Um die Flt4-mRNA-Expression in menschlichen fötalen Geweben zu untersuchen, wurde ein Northern-Blot, enthaltend Gesamt-mRNA aus den unten aufgeführten Geweben von 16–19 Wochen alten menschlichen Föten, mit dem 1,9-kb-Flt4-cDNA-Fragment (siehe 1) hybridisiert und das erhaltene Autoradiogramm wurde mit einem Densitometer gerastert. Die Ergebnisse wurden auf die Menge der RNA normalisiert, die anhand eines UV-Bildes des entsprechenden Ethidiumbromid(EtBr)-gefärbten Gels veranschlagt wurde. Die folgenden Symbole bezeichnen mRNA-Niveaus in einer aufsteigenden Reihenfolge: –, +, ++, +++. TABELLE 1

Fötales Gewebe	mRNA
Hirn
Hirnhaut	+
kortikale Platte	++
intermediäre Zone	+++
Ependymale Zone	+
Zerebellum	++
Plexus choroideus	+
Leber	+
Pankreas	+
Dünndarm	–
Herz	+
Lunge	+++
Niere	++
Nebenniere	++
Haut	++
Milz	+++
Thymus	–

Die Analyse menschlicher fötaler Gewebe zeigte, dass alle, mit Ausnahme des Thymus und des Dünndarms, Flt4-Transkripte enthalten. Die höchsten Expressionsniveaus wurden in Lunge und Milz gefunden.
BEISPIEL 11
Flt4-Expressionsvektor
Vollängen-Flt4-cDNA (Kurzform) wurde hergestellt durch a) Ligation eines SphI-geschnittenen Flt4-PCR-Fragments [amplifi ziert aus dem S2,5-kb-Klon (siehe 1) unter Verwendung der Primer-Oligonukleotide 5'-ACATGCATGC CACCATGCAG CGGGGCGCCG CGCTGTGCCT GCGACTGTGG CTCTGCCTGG GACTCCTGGA-3' (SEQ ID NO: 7) (vorwärts) und 5'-ACATGCATGC CCCGCCGGT CATCC-3' (rückwärts)] (SEQ ID NO: 8) an das 5'-Ende des S2,5-kb-Fragments, subkloniert in den pSP73-Vektor (Promega), unter Verwendung von zwei SphI-Stellen; b) Ligation eines PCR-Fragments, enthaltend die letzten Basenpaare amplifiziert aus dem 0,6-kb-EcoRI-Fragment (siehe 1) mit den Oligonukleotid-Primern 5'-CGGAATTCCC CATGACCCCA AC-3' (SEQ ID NO: 9) (vorwärts) und 5'-CCRTCGATGG ATCCTACCTG AAGCCGCTTT CTT-3' (SEQ ID NO: 10) (rückwärts) an das 3'-Ende von Konstrukt a) unter Verwendung der EcoRI- und BamHI-Stellen; c) Ligation eines 1,2-kb-EcoRI-Fragments in die EcoRI-Stelle von Konstrukt b); d) Ligation des erhaltenen Vollängen-HindIII-BamHI-Fragments in den HindIII-BamHI-geschnittenen SV-poly-Expressionsvektor [Stacey et al., Nucl. Acids Res., 18: 2829 (1990)].
BEISPIEL 12
Identifikation eines Flt4-Liganden
Konditionierte Medien von der Prostata-Adenokarzinom-Zellinie PC-3 (ATCC CRL 1435), kultiviert für 7 Tage in F12-Medium in Abwesenheit von fötalem Rinderserum (FBS), wurde durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 20 Minuten geklärt und auf die Fähigkeit gescreent, eine Tyrosinphosphorylierung von Flt4 zu induzieren.
Flt4 rekombinant exprimierende NIH3T3-Zellen (siehe Beispiel 13) wurden erneut auf 5-cm-Durchmesser-Zellkulturplatten geimpft und bis zur Konfluenz in Dulbeccos modifiziertem Mini malmedium (DMEM) enthaltend 10% fötales Rinderserum und Antibiotika angezogen. Die konfluenten Zellen wurden zweimal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und in DMEM/0,2% Rinderserumalbumin über Nacht ausgehungert. Für die Stimulation wurde das Hungermedium durch 1 ml des konditionierten Mediums ersetzt und die Zellen wurden bei 37°C für 5 Minuten inkubiert.
Nach Stimulation mit dem PC-3-konditionierten Medium wurden die die Zellen enthaltenden Kulturschalen auf Eis gegeben und zweimal mit Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl enthaltend 100 mM NaVO₄ gewaschen. Die Waschlösung wurde aus den Schalen entfernt und die Zellen wurden in RIPA-Puffer [10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,5% Nonidet P40, 0,1% Natriumlaurylsulfat (SDS)], enthaltend Aprotinin, 1 mM PMSF und 1 mM NaVO₄ lysiert, und die Lysate wurden zweimal für 10 Sekunden einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt. Die Lysate wurden dann bei 16.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert und die Überstände wurden in neue Reaktionsgefäße transferiert und für die Immunpräzipitation verwendet.
Die polyklonalen Antikörper gegen den Flt4-C-Terminus (oben beschrieben) wurden für die Immunpräzipitation verwendet. Überstände von den Zelllysaten wurden für 2 Stunden auf Eis mit 2 bis 4 μl polyklonalem Kaninchen-Anti-Flt4-Antiserum inkubiert. Etwa 30 μl einer 50%igen (Vol./Vol.) Lösung von Protein-A-Sepharose (Pharmacia) in PBS wurden zugegeben und die Inkubation wurde für 45 Minuten unter Rotation bei +4°C fortgesetzt. Die Immunpräzipitate wurden dreimal mit dem RIPA-Puffer und einmal mit PBS gewaschen. Die Immunpräzipitate wurden dann einer SDS-Polyakrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) in einem 7,5%-Gel ausgesetzt und auf Nitrozellulose geblottet. Diese Western-Blots wurden mit monoklonalen Anti- Phosphotyrosin(Anti-P-Tyr)-Antikörpern (1:2000-Verdünnung von PT-66 Sigma, Kat. P-3300) inkubiert, gefolgt durch Detektion mit Peroxidase-konjugierten Kaninchen-Anti-Maus-Antikörpern (1:1000-Verdünnung, Dako, Kat. P161) unter Verwendung des Chemilumineszenzdetektionsystems (Amersham). In einigen Fällen wurden die Blots für 30 Minuten bei 50°C in 100 mM 2-Mercaptoethanol, 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,7 mit gelegentlicher Umwälzung entfärbt, um vorhergehende Signale zu löschen, erneut mit Anti-Flt4-Antikörpern (1:1000-Verdünnung) gefärbt, gefolgt von einer Färbung mit Peroxidase-konjugierten Schweine-Anti-Kaninchen-Antikörpern (1:1000-Verdünnung, Dako, P217). Als Positivkontrolle für die Tyrosinphosphorylierung von Flt4 wurden Anti-Flt4-Immunpräzipitate von den Flt4-exprimierenden NIH3T3-Zellen, die für 20 Minuten mit 100 mM des Tyrosinphosphatasehemmers Natriumpervanadat (PerVO4) behandelt wurden, verwendet. Die Behandlung von Zellen mit Natriumpervanadat wurde durchgeführt durch Zugabe von 100 mM (Endkonzentration) Natriumorthovanadat und 2 mM (Endkonzentration) Wasserstoffperoxid zu dem Zellmedium und Inkubation der Zellen für 20 Minuten bei 37°C 5% CO₂. Dieses Verfahren führte zur Erzeugung der peroxidierten Form von Vanadat (Vanadylhydroperoxid), welches ein sehr potenter Hemmer der Proteintyrosinphosphatasen in lebenden Zellen ist.
Das PC-3-konditionierte Medium stimulierte die Tyrosinphosphorylierung eines 120-kDa-Polypeptid, das mit der tyrosinphosphorylierten, prozessierten reifen Form von Flt4 komigrierte. Komigration wurde nach Neufärbung des Blots mit Anti-Flt4-Antikörpern bestätigt.
Um nachzuweisen, dass das 120-kD-Polypeptid keine unspezifische Komponente des konditionierten Mediums ist, wurden 15 ml des konditionierten Mediums durch SDS-PAGE getrennt, auf Nit rozellulose geblottet, und der Blot wurde mit Anti-Tyr-Antikörpern gefärbt. Etliche Polypeptide wurden detektiert, keines von ihnen komigrierte jedoch mit Flt4, was darauf hindeutet, dass die 120-kD-Bande in der Tat tyrosinphosphoryliertes Protein ist, das aus den stimulierten Zellen immunpräzipitiert wurde. Die Analyse der Stimulation durch PC-3-konditioniertes Medium, das mit Heparin-Sepharose CL-6B (Pharmacia) für 2 Stunden bei Raumtemperatur (Spur 3) vorbehandelt wurde, zeigt, dass der Flt4-Ligand nicht an Heparin bindet.
Unkonditioniertes Medium induzierte die Flt4-Autophosphorylierung nicht. Darüber hinaus zeigten weder nichttransfizierte NIH3T3-Zellen noch NIH3T3-Zellen, die mit dem FGFR-4 transfiziert wurden, eine Tyrosinphosphorylierung des 120-kD-Polypeptids auf Stimulation mit dem konditionierten Medium von PC-3-Zellen. Die Stimulationsaktivität war beträchtlich erhöht, wenn das PC-3-konditionierte Medium wurde unter Verwendung eines Centricon-10-Konzentrators (Amicon) vierfach aufkonzentriert wurde. Auch der nach der Konzentration erhaltene Durchfluss, der Proteine mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 (< 10.000) enthielt, stimulierte nicht die Phosphorylierung von Flt4. Die Vorbehandlung des konzentrierten konditionierten Mediums von PC-3-Zellen mit 50 ml der extrazellulären Domäne von Flt4 (Flt4EC-6xHis, siehe unten), nach Herstelleranweisungen an CNBr-aktivierte Sepharose (1 mg/ml) gekoppelt, beseitigte die Tyrosinphosphorylierung von Flt4 vollständig. Analoge Vorbehandlung des konditionierten Mediums mit Sepharose CL-4B beeinflusste dessen stimulatorische Wirkung nicht.
Diese Daten beweisen, dass PC-3-Zellen einen löslichen Liganden für Flt4 produzieren. Die obigen Experimente belegen, dass der Ligand an die rekombinante Flt4-EC-Domäne bindet. Somit kann der Ligand unter Verwendung der rekombinanten Flt4-EC-Domäne mittels Affinitätschromatographie gereinigt werden. Das gereinigte Protein kann mittels SDS-PAGE einer Elektrophorese unterzogen werden, auf Polyvinylidendifluorid(PVDF)-Membranen geblottet werden, und seine aminoterminale Sequenz kann durch Standardverfahren des Standes der Technik festgestellt werden. Alternativ kann der gereinigte Ligand zu Peptiden für deren aminoterminale Sequenzbestimmung abgebaut werden. Peptidsequenzen, die von dem gereinigten Protein erhalten wurden, werden für die Synthese einer Mischung von Oligonukleotiden verwendet, die solche Sequenzen kodieren. Solche Oligonukleotide und deren komplementäre DNA-Strang-Gegenstücke können radioaktiv markiert und für das Screening von aus den PC-3-Zellen hergestellten cDNA-Bibliotheken verwendet werden, um eine cDNA zu erhalten, die den Liganden kodiert, alles durch Standardverfahren des Standes der Technik (Wen et al., Cell 69: 559–572 (1992)). Alternativ können solche Oligonukleotide und deren Gegenstücke als Primer in der Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet werden, um den Liganden kodierende Sequenzen unter Verwendung von cDNA, die aus PC-3-Zell-RNA als Matrize hergestellt wurde, zu amplifizieren. Solch ein Verfahren der cDNA-Synthese und PCR (RT-PCR) ist im Stand der Technik Standard (Innis et al., 1990, PCR protocols, Academic Press; McPherson, M. J. et al., 1991, PCR, a practical approach, IRL Press; Partanen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 8913–8917 (1990)). Eine weitere Alternative besteht darin, den Flt4-Liganden von den PC-3-Zellen unter Verwendung von cDNAs zu klonieren, die in einen eukaryotischen Expressionsvektor kloniert wurden (z.B. unter Verwendung des "Librarian clining kit" von Invitrogen und den bereitgestellten Vektoren, wie beispielsweise pcDNA I oder pcDNA III), und dem Screening solcher Bibliotheken, die z.B. in COS-Zellen mit Flt4-alkalischer Phosphatase (Cheng and Flanagan, Cell, 79: 157–168, (1994)), Flt4-Immunglobulin (Flt4-Ig) (Lymanetal., Cell, 75: 1157–1167 (1993)) oder ähnlichen Affinitätsreagenzien durch Standardverfahren des Standes der Technik transfiziert wurden.
BEISPIEL 13
Zellinien und Transfektionen
NIH3T3-Zellen und 293-EBNA-Zellen (Invitrogen) wurden in DMEM, enthaltend 10% FCS, kultiviert. Für eine stabile Expression wurden NIH3T3-Zellen durch das Lipofektionsverfahren unter Verwendung des DOTAP-Transfektionsreagenzes (Boehringer-Mannheim) mit dem LTR-Flt41-Vektor zusammen mit dem pSVneo-Vektor (siehe Beispiel 4, oben) transfiziert, wobei die Flt4-cDNA unter der Kontrolle des murinen Moloney-Leukämie-Virus-LTR-Promotors exprimiert wird. COS-1-Zellen wurden durch das DEAE-Dextran-Verfahren (McClutchan and Pagano, J. Natl. Cancer Inst., 41: 351–35 (1968)) transfiziert. Transfizierte Zellen wurden in 500 mg/ml Neomycin selektiert.
BEISPIEL 14
Konstruktion und Expression von Flt4-Fusionsproteinen
Das pVTBac-FLT4EC-6xHis-Fusionsprotein.
Die Enden von Flt4 kodierender cDNA wurden wie folgt modifiziert: das 3'-Ende der die extrazelluläre Domäne (EC) kodierenden Flt4-cDNA-Sequenz wurde amplifiziert unter Verwendung der Oligonukleotide 5'-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3' (SEQ ID NO: 13, SalI-Stelle unterstrichen, enthaltend eine Sequenz, die den Nukleotiden 2184–2204 der SEQ ID NO: 1 entspricht) und 5'CGCGGATCCCTAGTGATGGTGATGGTGATGTCTACCTTCGATCATGCTGCCCTTATCCTC-3' Sequenz (SEQ ID NO: 14, BamHI-Stelle unterstrichen, enthaltend eine Sequenz, die zu den Nukleotiden 2341–2324 der SEQ ID NO: 1 komplementär ist), kodierend sechs Histidinreste für die Bindung an eine Ni-NTA-Säule (Quiagen, Hilden Deutschland), gefolgt von einem Stopkodon. Das amplifizierte Fragment wurde mit SalI und BamHI verdaut und als SalI-BamHI-Fragment in den LTR-FLT41-Vektor ligiert (siehe Beispiel 4), ein einzigartiges SalI-BamHI-Fragment, das Sequenzen enthält, die die Flt4-Transmembran- und Zytoplasmadomäne kodieren, ersetzend.
Das 5'-Ende der Flt4-cDNA ohne die kodierende Region der Flt4-Signalsequenz wurde durch PCR amplifiziert unter Verwendung der Oligonukleotide 5'-CCCAAGCTTGGATCCAAGTGGCTACTCCATGACC-3' (SEQ ID NO: 11, HindIII- und BamHI-Stellen unterstrichen, enthaltend eine Sequenz, die den Nukleotiden 86–103 der SEQ ID NO: 1 entspricht) und 5'-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3' (SEQ ID NO: 12, enthaltend eine Sequenz, die zu den Nukleotiden 700–681 der SEQ ID NO: 1 komplementär ist). Dieses amplifizierte Fragment (welches die Nukleotide 86–700 der SEQ ID NO: 1 enthielt) wurde mit HindIII und SphI (SphI-Stelle, entsprechend den Nukleotiden 588–593 der SEQ ID NO: 1, die innerhalb der amplifizierten Region der Flt4-cDNA liegt) verdaut.
Das erhaltene HindIII-SphI-Fragment wurde verwendet, um ein HindIII-SphI-Fragment in dem unmittelbar oben beschriebenen modifizierten LTR-FLT41-Vektor zu ersetzen (die HindIII-Stelle liegt innerhalb der 5'-Verbindung des Flt4-Inserts mit dem pLTRpoly-Bereich des Vektors, die SphI-Stelle liegt in der Flt4-cDNA und entspricht den Nukleotiden 588–593 der SEQ ID NO: 1). Das erhaltene Flt4EC-6xHis-Insert wurde dann als ein BamHI-Fragment in die BamHI-Stelle des pVTBac-Plasmids (Tessier et al., Gene 98: 177–183 (1991) ligiert. Das Konstrukt wurde zusammen mit genomischer Baculovirus-DNA durch Lipofektion in SF-9 Zellen transfiziert. Rekombinante Viren wurden erzeugt und zur Infektion von "High-Five"-Zellen (in Vitrogen) verwendet.
Das Flt4-AP-Fusionskonstrukt.
Das 3'-Ende der die Flt4-EC-Domäne kodierenden Sequenz wurde amplifiziert unter Verwendung der Oligonukleotide 5'-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3' (SEQ ID NO: 15) und 5'-CGGGATCCCTCCATGCTGCCCTTATCCT-3' (SEQ ID NO: 16) und als SalI-BamHI-Fragment in den LTR-FLT41-Vektor ligiert, Sequenzen ersetzend, die die Transmembran- und Zytoplasmadomänen kodieren. Das resultierende Insert wurde dann als ein HindIII-BamHI-Fragment in die HindIII-BglII-Stellen des Plasmids AP-tag-1 "in-frame" mit der kodierenden Region für alkalische Phosphatase ligiert (Flanagan und Leder, 1990, Cell 63, 185–194). NIH3T3-Zellen wurden durch Lipofektion unter Verwendung des DOTRP-Transfektionsreagenz (Boehringer) mit diesem Flt4-AP-Konstrukt und pSV2neo kotransfiziert (Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327–341 (1982)), und die transfizierten Zellen wurden in Gegenwart von 500 mg/ml Neomycin selektiert. Das in dem Medium hergestellte rekombinante Protein wurde durch kolorimetrische Färbungsreaktion auf Aktivität alkalischer Phosphatase bestimmt (Cheng und Flanagan, Cell 79: 157–168 (1994))
Das Flt4-Ig-Konstrukt
Eine eine Flt4-Immunglobulin-Chimäre kodierende rekombinante DNA wurde wie folgt konstruiert. Das 5'-Ende der Flt4 kodierenden cDNA, einschließlich Flt4-Nukleotiden, die die Signalsequenz kodieren, wurde durch PCR amplifiziert unter Verwendung der Primer 5'-GGCAAGCTTGAATTCGCCACCATGCAGCGGGGCGCC-3' (SEQ ID NO: 17) und 5'-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3' (SEQ ID NO: 18) und als HindIII-SphI-Fragment in den LTR-FLT41-Vektor ligiert. Das 3'-Ende der Flt4-EC-kodierenden Sequenz wurde amplifiziert unter Verwendung der Oligonukleotide 5'-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3' (SEQ ID NO: 19) und 5'-CGCGGATCCAAGCTTACTTACCTTCCATGCTGCCCTTATCCTCG-3' (SEQ ID NO: 20) und als SalI-BamHI-Fragment in den LTR-FLT41-Vektor ligiert, die Sequenzen ersetzend, die die Transmembran- und Zytoplasmadomänen kodieren. Dieses eine Spleißdonorstelle enthaltende Flt4EC-Insert wurde zunächst in pHγCE2-haltige Exons ligiert, die die Exons der Gelenk- und der konstanten Region der schweren Kette des menschlichen Immunglobulins kodieren (Karjalainen, K., TIBTECH, 9: 109–113 (1991). Das EcoRI-BamHI-Insert, enthaltend die Flt4-Ig-Chimäre wurde dann durch Verfahren gemäß dem Stand der Technik (Klenow) mit stumpfen Enden versehen und an die stumpfe HindIII-Stelle in pREP7 (Invitrogen) ligiert. Das Konstrukt wurde durch das Kalziumphosphat-Präzipitationsverfahren in 293-EBNA-Zellen transfiziert und das konditionierte Medium wurde für die Isolierung des Flt4-Ig-Proteins durch Protein-Art-Sepharose-Affinitätschromatographie verwendet.
BEISPIELE 15–17
Reinigung und Sequenzierung des Flt4-Liganden
Zellkulturüberstände, hergestellt durch PC-3-Zellen unter serumarmen Bedingungen, werden unter Verwendung von Centriprep- Filterkartuschen 30–50fach aufkonzentriert und auf eine Säule immobilisierter extrazellulärer Domäne von Flt4 geladen. Zwei Affinitätsmatrizes wurden unter Verwendung der alternativen Konstrukte und Verfahren hergestellt. Im ersten Fall wird das Flt4EC6xHis-Fusionsprotein an CnBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) quervernetzt und im zweiten Fall wird das Flt4-Ig-Fusionsprotein unter Verwendung von die Dimethylpimelimidat an Protein-A-Sepharose gekoppelt (Schneider et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 10766–10769). Das von der Affinitätsäule eluierte Material wurde unter Verwendung von Ionenaustausch- und Umkehrphasen-Hochdruckchromatographie und SDS-Polyakrylamidgelelektrophorese einer weiteren Reinigung unterzogen. Die Chromatographie-Fraktionen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Tyrosinphosphorylierung von Flt4 zu stimulieren. Das gereinigte biologisch aktive Ligandenprotein wird mirosequenziert und die degenerierten Oligonukleotide werden auf Basis der erhaltenen Aminosäuresequenz zum Zwecke der Isolierung und Klonierung einer Liganden-kodierenden cDNA hergestellt; z.B. aus einer cDNA-Bibliothek, die aus poly(A)⁺-RNA erzeugt wurde, die aus PC-3-Zellen isoliert wurde.
Eine detaillierte Charakterisierung eines als vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor C (VEGF-C) bezeichneten Flt4-Liganden sowie nativer menschlicher, nichtmenschlicher Säugetier- und Affen-Polynukleotidsequenzen, die VEGF-C und VEGF-C-Varianten und -Analoga kodieren, ist bereitgestellt in der internationalen Patentanmeldung Nummer PCT/US98/01973, eingereicht am 2. Februar 1998 (veröffentlicht am 6. August 1998 als internationale Veröffentlichung Nummer WO 98/33917); in in Joukov et al., J. Biol. Chem., 273 (12): 6599–6602 (1998); in Joukov et al., EMBO J., 16 (13): 3898–3911 (1997); und in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/FI96/00427, eingereicht am 1. August 1996 (veröffentlicht als internationale Veröffentlichung Nr. WO 97/05250), die hier alle durch Inbezugnahme und vollständig aufgenommen sind. Wie dort im Detail erklärt, wird VEGF-C anfänglich in menschlichen Zellen als ein Präpro-VEGF-C-Polypeptid von 419 Aminosäuren hergestellt. Eine Aminosäuresequenz für Human-Präpro-VEGF-C ist in SEQ ID NO: 21 wiedergegeben, und eine menschliche VEGF-C kodierende cDNA ist bei der Amerikanischen Zellkultursammlung (American Type Cultur Collection, ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110–2209 (USA), nach den Vorschriften des Budapester Vertrages hinterlegt worden (Hinterlegungsdatum 24. Juli 1995 und ATCC-Zugriffsnummer 97231). VEGF-C-Sequenzen aus anderen Spezies sind ebenfalls bekundet worden. Siehe zum Beispiel die Genbank-Zugriffsnummern MMU73620 (Mus musculus); und CCY15837 (Coturnix coturnix), die hier durch Inbezugnahme aufgenommen sind.
Das Präpro-VEGF-C-Polypeptid wird in mehreren Stufen prozessiert, um ein reifes und am meisten aktives VEGF-C-Polypeptid von etwa 21–23 kD (bestimmt durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen) herzustellen. Solch ein Prozessing beinhaltet die Abspaltung eines Signalpeptids (SEQ ID NO: 21, Reste 1–31); Abspaltung eines carboxyterminalen Peptids (das ungefähr den Aminosäuren 228–419 der SEQ ID NO: 21 entspricht und ein Muster von beabstandeten Cysteinresten aufweist, das an eine Balbianiring-3-Protein(BR3P)-Sequenz [Dignam et al., Gene, 88: 133–40 (1990); Paulsson et al., J. Mol. Biol., 211: 331–49 (1990)] erinnert), um eine teilweise prozessierte Form von etwa 29 kD herzustellen; und die Abspaltung (offenbar extrazellulär) eines aminoterminalen Peptids (entsprechend ungefähr den Aminosäuren 32–103 der SEQ ID NO: 21), um eine vollständig prozessierte reife Form von etwa 21–23 kD herzustellen. Experimentelle Hinweise zeigen, dass die teilweise prozessierten Formen von VEGF-C (z.B. die 29-kD-Form) in der Lage sind, den Flt4 (VEGFR-3)-Rezeptor zu binden, wohingegen eine hochaffine Bindung an VEGFR-2 nur mit den vollständig prozessierten Formen von VEGF-C auftritt. Es scheint, dass VEGF-C-Polypeptide natürlicherweise als Nicht-Disulfid-verknüpfte Dimere assoziieren.
Darüber hinaus ist gezeigt worden, dass die Aminosäuren 103–227 der SEQ ID NO: 2 nicht alle kritisch für die Beibehaltung der VEGF-C-Funktionen sind. Ein aus den Aminosäuren 113–213 (und ohne die Reste 103–112 und 214–227) der SEQ ID NO: 2 bestehendes Polypeptid behält die Fähigkeit, VEGF-C-Rezeptoren zu binden und zu stimulieren, und es wird erwartet, dass ein Polypeptid, das sich von etwa Rest 131 bis etwa Rest 211 erstreckt, die biologische Aktivität von VEGF-C behält. Der Cysteinrest an Position 156 hat sich als wichtig für die VEGFR-2-Bindungsfähigkeit erwiesen. VEGF-C-ΔC₁₅₆-Polypeptide (d.h. Analoga, denen dieses Cystein aufgrund von Deletion oder Substitution fehlt) bleiben jedoch potente Aktivatoren von VEGFR-3. Das Cystein an Position 165 der SEQ ID NO: 2 ist essenziell für die Bindung eines Rezeptors, wohingegen Analoga, denen die Cysteine an den Positionen 83 oder 137 fehlen, mit dem nativen VEGF-C um die Bindung mit beiden Rezeptoren konkurrieren und beide Rezeptoren stimulieren.
Eine Alinierung von menschlichem VEGF-C mit VEGF-C aus anderen Spezies (durchgeführt unter Anwendung eines allgemein akzeptierten Alinierungsalgorithmus) legt weitere Reste nahe, an denen Modifikationen eingeführt werden können (z.B. Insertionen, Substitutionen und/oder Deletionen), ohne die biologische Aktivität VEGF-C-Aktivität zu zerstören. Jede Position, an der alinierte VEGF-C-Polypeptide von zwei oder mehr Spezies unterschiedliche Aminosäuren aufweisen, insbesondere unterschiedliche Aminosäuren mit Seitenketten unterschiedli chen chemischen Charakters, ist eine voraussichtliche Position, die einer Modifikation zugänglich ist, ohne gleichzeitige Eliminierung der Funktion. Eine beispielhafte Alinierung von menschlichem, murinem und Wachtel-VEGF-C ist in 5 der PCT/US98/01973 wiedergegeben.
Abgesehen von den vorstehenden Überlegungen wird es ersichtlich sein, dass unzählige konservative Aminosäureaustausche an einer Wildtyp-VEGF-C-Sequenz vorgenommen werden können, die wahrscheinlich zu einem Polypeptid führen, das die biologische VEGF-C-Aktivität bewahrt, insbesondere wenn die Zahl dieser Austausche klein ist. Mit einem "konservativen Aminosäureaustausch" ist eine Substitution einer Aminosäure durch eine Aminosäure gemeint, die eine Seitenkette von ähnlichem chemischen Charakter aufweist. Ähnliche Aminosäuren für die Herstellung konservativer Austausche beinhalten solche, die eine saure Seitenkette (Glutaminsäure, Asparaginsäure); eine basische Seitenkette (Arginin, Lysin, Histidin); eine polare Amid-Seitenkette (Glutamin, Asparagin); eine hydrophobe, aliphatische Seitenkette (Leucin, Isoleucin, Valin, Alanin, Glycin); eine aromatische Seitenkette (Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin); eine kleine Seitenkette (Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin); oder eine aliphatische Hydroxyl-Seitenkette (Serin, Threonin) aufweisen. Hinzufügung oder Deletion einer oder mehrerer innerer Aminosäuren ohne Zerstörung der biologischen VEGF-C-Aktivitäten ist ebenfalls vorgesehen.
Anhand des Vorstehenden wird erkannt werden, dass viele VEGF-C-Polypeptide und -Varianten Flt4 (VEGFR-3) mit hoher Affinität binden werden und daher als Flt4-bindende Verbindungen in Aspekten der Erfindung nützlich sind, die die Abbildung oder das Screening von Gewebeproben unter Verwendung einer Flt4- bindenden Verbindung beinhalten. Von besonderem Interesse sind Formen von VEGF-C, die Veränderungen beinhalten, die die VEGFR-2-Bindungsaffinität verringern oder eliminieren, so dass das erhaltene Polypeptid eine erhöhte Bindungsspezifität für VEGFR-3 aufweist. Wie oben beschrieben, können solche Veränderungen die Deletion oder Ersetzung von Cys₁₅₆ beinhalten, was die VEGFR-3-Bindungsaffinität im wesentlichen eliminiert, oder Veränderungen der Aminosäuresequenz, die natürliche Präpro-VEGF-C-Proteolyse-Prozessierungsstellen zerstören (da die VEGFR-2-Affinität bei vollständig prozessiertem VEGF-C am höchsten ist). Darüber hinaus sind VEGF-C-Moleküle, die dahingehend modifiziert wurden, dass sie die Flt4-Bindungsaffinität bewahren, jedoch die Flt4-Autophosphorylierung nicht aktivieren, nützliche Flt4-Antagonisten bei den hier beschriebenen Behandlungsverfahren. Es wird ferner aus den vorstehenden Lehren ersichtlich sein, dass der hier beschriebene Flt4-Ligand in Tests als zusätzliches Indiz verwendet werden kann, um die Identität von menschlichen allelischen Flt4-Varianten zu bestätigen, und um zu bestätigen, dass nichtmenschliche Gensequenzen, die eine Homologie zu der hier gelehrten Flt4-Sequenz aufweisen (siehe z.B. Beispiel 8 und 4) tatsächlich die nichtmenschlichen Gegenstücke zu Flt4 sind. Die abgeleitete Aminosäuresequenz für Präpro-VEGF-C ist hier in SEQ ID NO: 21 wiedergegeben.
Eine detaillierte Beschreibung eines zweiten, als vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor D (VEGF-D) bezeichneten, Flt4-Liganden sowie menschlicher Polynukleotid-Sequenzen, die VEGF-D und VEGF-D-Varianten und -Analoga kodieren, ist in der internationalen Patentanmeldung PCT/US97/14696, eingereicht am 21 August 1997 und veröffentlicht am 26 Februar 1998 als internationale Veröffentlichung Nummer WO 98/07832, und in Achen, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U. S. A., 95 (2: 548– 553 (1998), die ebenfalls durch Inbezugnahme aufgenommen sind, bereitgestellt. Wie dort im Detail erklärt, wird menschlicher VEGF-D in menschlichen Zellen anfänglich als ein Präpro-VEGF-D-Polypeptid von 354 Aminosäuren hergestellt. Die cDNA- und abgeleitete Aminosäuresequenz für Präpro-VEGF-D sind hier in SEQ ID NO: 22 wiedergegeben. VEGF-D-Sequenzen aus anderen Spezies sind ebenfalls bekundet worden. Siehe zum Beispiel die Genbank-Zugriffsnummern D89628 (Mus musculus) und AF014827 (Rattus norvegicus), durch Inbezugnahme hier aufgenommen.
Das Präpro-VEGF-D-Polypeptid besitzt ein mutmaßliches Signalpeptid von 21 Aminosäuren und wird offenbar proteolytisch in einer Weise prozessiert, die zu dem Prozessing von Präpro-VEGF-C analog ist. Ein "rekombinant gereiftes" VEGF-D, dem die Reste 1–92 und 202–354 der SEQ ID NO: 22 fehlen, bewahrt die Fähigkeit zur Aktivierung der Rezeptoren VEGFR-2 und VEGFR-3 und scheint scheint als nichtkovalent verknüpfte Dimere zu assoziieren. Die Eignungen für VEGF-D-Polypeptide als Flt4-bindende Verbindungen in der Erfindung sind analog zu denen, die oben für VEGF-C beschrieben wurden. Gleichermaßen wird erwartet, dass analoge Veränderungen an VEGF-D (die Eliminierung des zweiten von acht konservierten Cysteinen in der VEGF-Homologiedomäne, Cys₁₃₆, oder die Eliminierung proteolytischer Prozessierungsstellen) zu Polypeptiden führen werden, die eine verminderte oder eliminierte VEGFR-2-Bindungsaffinität und damit eine erhöhte Flt4-Spezifität aufweisen. VEGF-D-Moleküle, die dahingehend modifiziert wurden, die Flt4-Bindungsaffinität zu bewahren, jedoch die Flt4-Autophosphorylierung nicht aktivieren, sind als Flt4-Antagonisten in den hier beschriebenen Behandlungsverfahren nützlich.
BEISPIEL 18
Klonierung von Maus-Flt4-cDNA-Sonden
Ungefähr 10⁶ Plaques von einer genomischen λFIX^®II-Bibliothek von 129SV-Mäusen (Stratagene) wurden mit dem oben beschriebenen menschlichen S2,5-Flt4-Rezeptor-cDNA-Fragment, das die extrazellulären Domäne abdeckt, gescreent. Siehe auch Pajusola et al., Cancer Res., 52: 5738 (1992). Ein 12,5-kb-BamHI-Fragment wurde aus einem positiven Plaque subkloniert und von beiden Enden sequenziert. Bei diesem Subklon wurde Polymerasekettenreaktion verwendet, um ein Exon-Fragment, das die Nukleotide 1745–2049 der Maus-Flt4-cDNA-Sequenz abdeckte, zu amplifizieren und in den pBluescript-KSH⁺/_–-Vektor (Stratagene) zu klonieren. Siehe Finnerty et al., Oncogene, 8: 2293 (1993).
Ein zweites, die Nukleotide 1–192 abdeckendes Fragment wurde gleichermaßen kloniert.
BEISPIEL 19
Analyse von Flt4-mRNA in Mausgeweben
Gesamt-RNA wurde aus sich entwickelnden Embryos (8–18 Tage p.c. und einen Tag alte Mäuse) nach Chomczynski et al., Anal. Biochem., 162: 156 (1987) isoliert. Die Probe von 8-Tage-P.C.-Embryos beinhaltete auch die Plazenta.
Für die RNAse-Protektionsanalyse wurde eine RNA-Sonde aus dem linearisierten murinen Flt4-Plasmid erzeugt, das gemäß Beispiel 18 unter Verwendung von [³²P]-UTP und T7-Polymerase für die Antisinn-Orientierung erhalten wurde. Die verwendete β- Aktin-Sonde entspricht den Nukleotiden 1188–1279 der veröffentlichten Maus-β-Aktin-Sequenz. Siehe Tokunaga, et al., Nucleic. Acid. Res., 14: 2829 (1986). Nach Reinigung in einem 6% Polyakrylamid/7 M Harnstoff-Gel wurden die markierten Transkripte mit 30 μg Gesamt-RNA über Nacht bei 52°C hybridisiert. Unhybridisierte RNA wurde mit RNAse A (10 U/ml) und T1 (1 mg/ml) bei 37°C, pH 7,5, für 1 Stunde verdaut. Die RNAse wurde durch Proteinase-K-Verdau bei 37°C für 15 Minuten inaktiviert und die Proben wurden in einem 6%-Polyakrylamid/7 M-Harnstoff-Gel analysiert.
Das in diesem Experimente analysierte Expressionsmuster von Flt4 zeigte, dass sehr schwache RNA-Signale aus Lunge, Leber, Herz, Niere, Skelettmuskel und Milz erhalten wurden, wohingegen Hoden und Hirn offenbar ohne ein spezifisches Signal waren. Die Analyse einer Reihe von RNAs, die während unterschiedlicher Phasen der Mausentwicklung genommen wurden, durch RNAse-Protektionstest zeigte, dass die Flt4-mRNA über die Embryogenese von Tag 8 p.c. bis zu neugeborenen Mäusen ohne große Variationen in der Signalintensität exprimiert wurde.
BEISPIEL 20
In-situ-Hybridisierung für Flt4 in Mausembryos
Um Flt4-Transkripte Zellen und Geweben besser zuordnen zu können, wurden Schnitte von 7,5- und 8,5-Tage-P.C.-Mausembryos mit markierten Flt4-RNAs hybridisiert. Mausembryos wurden aus Paarungen von CDA- und NMRI-Mäusen erlangt. Trächtige Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet, und die Embryos wurden entweder sofort eingefroren oder über phosphatgepufferte Salzlösung in 4% Paraformaldehyd über führt. Die Embryos und entnommenen Mausorgane wurden für 18 Stunden bei 4°C fixiert, dehydriert, in Paraffin eingebettet und in 6-μm-Abschnitte geschnitten.
RNA-Sonden (Antisinn und Sinn) von 192 und 305 Nukleotiden (siehe Beispiel 18) wurden aus linearisierter Plasmid-DNA unter Verwendung von [³⁵S]-UTP erzeugt. Die In-situ-Hybridisierung der Abschnitte wurde nach Wilkinson et al., Development, 99: 493 (1987) und Wilkinson et al., Cell, 50: 79 (1987), durch Inbezugnahme hier aufgenommen, mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: 1) Statt Toluol wurde Xylol vor der Einbettung in Paraffinwachs verwendet; 2) 6-μm-Abschnitte wurden geschnitten, auf eine Schicht von Diethylpyrocarbonat-behandeltem Wasser auf der Oberfläche von Glasobjektträgern angeordnet, die mit 2% 3-Triethoxysilylpropylamin vorbehandelt wurden; 3) eine alkalische Hydrolyse der Sonden wurde ausgelassen; 4) die hochstringente Waschung wurde für 80 Minuten bei 65°C in einer Lösung, die 30 mM DTT und 1 × SSC enthielt, durchgeführt. Die Schnitte wurden mit ein NTB-2-Emulsion (Kodak) bedeckt und bei 4°C gelagert. Die Objektträger wurden für 14 Tage exponiert, entwickelt und mit Hämatoxylin gefärbt. Kontrollhybridisierungen mit Sinnstrang- und RNAse-A-behandelten Schnitten ergaben kein spezifisches Signal oberhalb des Hintergrundes
In 7,5-Tage-P.C.-Mausembryos wurde keine Flt4-mRNA-Expression festgestellt, jedoch wurden in den sich entwickelnden Aorten am Tag 8,5 der Entwicklung helle Signale festgestellt. Im Gegensatz dazu war der sich entwickelnde Dottersack Flt4-negativ. In extraembryonalem Gewebe wurde Flt4 in der Allantois markant exprimiert, wohingegen sich entwickelnde Blutinseln des Dottersacks negativ waren. Auf der anderen Seite waren Angioblasten des Kopfmesenchyms stark Flt4-positiv. In der sich entwickelnden Plazenta wurde das Flt4-Signal zuerst in peripheren sinusoidalen Venen beobachtet. In 9,5-Tage-P.C.-Plazenta exprimierten das Endothel von venösen Lakunen und die teilweise an die Reichertsche Membran fusionierten Riesenzellen Flt4-mRNA.
Obwohl die Flt4-Expression somit in den frühesten Endothelzellvorläufern, den Angioblasten, sehr markant war, schien sie nur auf bestimmte Gefäße von 8,4-Tage-P.C.-Embryos beschränkt zu sein. Von dem Tie-Rezeptor ist bekannt, dass er in allen Endothelzellen von sich entwickelnden Mausembryos exprimiert wird und daher einen Marker für diese Zellen bildet. Siehe Korhonen, et al. Oncogene, 8: 395 (1993), und Korhonen et al., Blood, 80: 2548–2555 (1992). Insbesondere hybridisierte die Flt4-Sonde im Gegensatz zur Tie-Sonde sehr schwach, wenn überhaupt, mit arteriellen Endothelien von 11,5-Tage-P.C.-Embryos, zum Beispiel mit dem Endothel der sich entwickelnden dorsalen Aorta oder den Karotisarterien. Statt dessen war das Flt4-Signal in den sich entwickelnden Venen sehr viel markanter. Zum Beispiel wurde das Flt4-Signal in Venen detektiert, die den sich entwickelnden Metanephros umgeben, während die Tie-Sonde vornehmlich Kapillaren innerhalb Metanephros erkannte.
Es wurde beobachtet, dass die Flt4-mRNA in etlichen Regionen eines 12,5-Tage-P.C.-Mausembryos verteilt war, wobei sie besonders in den erweiterten Gefäßen der axillären Region auffiel. Eine ähnliche Flt4-positive Gefäßsstruktur wurde in dem mittsagittalen Schnitt im jugularen Bereich (Daten nicht dargestellt) beobachtet. Ein plexusartiges Muster von Flt4-exprimierenden Gefäßen erschien im periorbitalen Bereich und um die sich entwickelnden Wirbel. Auch knapp unter der sich entwickelnden Haut war ein Flt4-positives Gefäßnetzwerk nach weisbar. Schwächere kapilläre Signale wurden aus etlichen Regionen erhalten, einschließlich dem sich entwickelnden Gehirn. Flt4-mRNA konnte auch in kleinen Gefäßen der Nackenregion, der sich entwickelnden Schnauze und an der Basis der sich entwickelnden Zunge sowie in der Schwanzregion detektiert werden. Darüber hinaus war die Leber stark positiv auf Flt4-mRNA in einem punktartigen Muster.
Im Laufe der weiteren Entwicklung schien Flt4-mRNA stärker auf bestimmte Gefäße des Embryos beschränkt zu werden. Ein 14,5-Tage-P.C.-Embryo zeigt dieses beschränkte Expressionsmuster sehr schön. In dem mittsagittalen Schnitt eines solchen Embryos wurde das markanteste Flt4-Signal entlang der sich entwickelnden Wirbelsäule in ihrem anterioren Teil beobachtet. Es wurde angenommen, dass dieses Signal von Endothelzellen des Milchbrustgangs herrührt, der das größte Lymphgefäß ist, das zu dieser Zeit der Entwicklung gebildet wird. Im Gegensatz dazu waren die dorsale Aorta und inferiore Vena cava negativ. Erweiterte Gefäße in der mesenterialen Region waren ebenfalls stark positiv für Flt4. Darüber hinaus enthielten, wie bei den 12,5-Tage-P.C.-Embryos, Gefäßnetzwerke entlang anatomischer Grenzen in der periorbitalen, unteren Kiefer- sowie in der Nackenregion Flt4-positive Endothelien. Ähnliche Strukturen waren im Perikardspalt und im ganzen Unterhautgewebe vorhanden. Insbesondere waren alle Flt4-positiven Gefäße, im Gegensatz zu Flt4-negativen Gefäßen, in ihren Lumen frei von Blutzellen. Diese Expressionsmuster legen nahe, das Flt4 zu diesem Zeitpunkt der Entwicklung auf die Endothelien von Lymphgefäße begrenzt wird. Eine weitere Stelle, wo wir Flt4-Expression beobachtet haben, war in den Sinusoiden des sich entwickelnden Knochenmarks.
Ein mit der Flt4-Sonde hybridisierter Querschnitt des oberen Thorax eines 16,5-Tage-P.C.-Embryos wurde ebenfalls analysiert. Eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung wurde vorgenommen, um verschiedene Arten von Gefäßen in diesem Bereich zu visualisieren. Dies beinhaltet die Karotis- und die brachiocephalen Arterien, die Vena cava und den Milchbrustgang, der geringer in der Größe ist und kein umgebendes Muskel- und Bindegewebe aufweist. Unter höherer Auflösung wurde von Zellen des Milchbrustgangs sowie eines kleinen Gefäßes in der Nähe beobachtet, dass sie mit der Flt4-Sonde hybridisieren.
BEISPIEL 21
Analyse von Flt4-mRNA in kultivierten Endothelzellen
Die in Beispiel 20 beschriebenen In-situ-Hybridisierungsergebnisse zeigten, dass Flt4 in venösen Endothelzellen und später in Lymphgefäßen und einigen venösen Endothelzellen, nicht jedoch in arteriellen Endothelien exprimiert wird. Um festzustellen, ob eine solche Regulation in vitro aufrechterhalten wird, untersuchten wir kultivierte Endothelzellen unter Verwendung von Northern-Blotting und Hybridisierungsanalysen.
Endothelzellen aus menschlicher Aorta, Oberschenkelvene, Nabelvene und aus Vorhautmikrogefäßen wurden isoliert, kultiviert und, wie früher im Stand der Technik beschrieben, charakterisiert. Siehe Van Hinsberg et al., Arteriosclerosis, 7: 389 (1987); und Van Hinsberg, et al., Thromb. Haemostas, 57: 148 (1987). Sie wurden bei konfluenter Dichte nach fünf bis acht Passagen (Aufspaltungsverhältnis 1:3) für die Isolierung polyadenylierter RNA verwendet.
Die Endothelzelllinien EAhy926 (Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 3734–3737 (1983)), BCE (Folkman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 76: 5217–5221 (1979)) und LEII (Schreiber et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 6138 (1985)) exprimierten Flt4 nicht. Kultivierte menschliche Mikrovaskulär-, Venen- und Nabelvenen-Endothelzellen waren jedoch positiv auf die Flt4-spezifischen 5,8- und 4,5-kb-mRNAs, wohingegen die Aorta-Endothelzellen negativ waren. Im Gegensatz dazu wurde ein anderes endotheliales Rezeptortyrosinkinasegen, tie, als 4,4-kb-mRNA in allen untersuchten Endothelzelltypen exprimiert.
Beispiel 22
Flt4-mRNA in adulten menschlichen Geweben
Die in Beispiel 20 erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die Flt4-mRNA im Laufe der Entwicklung großenteils auf das Endothel von Lymphgefäßen begrenzt wird. Aufgrund der möglichen Bedeutung dieses Befundes beim Menschen untersuchten wir auch die Flt4-Expression in adulten menschlichen Geweben unter Verwendung einer Human-Flt4-Sonde. Die verwendete Human-Flt4-Sonde war ein EcoRI-SphI-Fragment, das die Basenpaare 1–595 der cDNA (SEQ ID NO: 1) abdeckte. Siehe auch Pajusola et al., CancerRes., 52: 5738 (1992). Die Von-Willebrandt-Faktor-Sonde war ein EcoRI-HindIII-Fragment, das die Basenpaare 1–2334 abdeckte. Bonthron, et al., Nucleic Acids Res., 141: 7125 (1986).
Wir verwenden routinemäßig für die histopathologische Diagnose versendetes fixiertes Material. Normales Lungengewebe wurde von einer Resektion des von einem epidermoiden Krebs befallenen linken inferioren Lungenflügels erhalten. Mesenterium und mesenteriale Lymphknoten wurden von einem Patienten erhalten, der ein Dickdarm-Adenokarzinom aufwies. Ein normaler der Speicheldrüse benachbarter Lymphknoten wurde aufgrund seiner abnormalen Größe entkernt. Die Tonsillen von zwei Patienten und die zwei Appendices wiesen keine diagnostischen Änderungen auf. Zwei Lymphangiome und drei zystische Lymphangiome wurden mit gleichen Ergebnissen untersucht.
Für menschliche Gewebe, die mit 10% Formalin für die histopathologische Diagnose fixierte Routineproben waren, ergab das normale In-situ-Protokoll nur Hintergrund, wohingegen Mikrowellen-Behandlung an Stelle von Proteinase-K eine spezifische Hybridisierung ermöglichte. Shi, et al., J. Biol. Chem., 266: 5774 (1991); Catoretti, et al., J. of Pathol., 168: 357 (1992).
Im Mesenterium ergaben lymphatische Lungen- und Appendix-Endothelien Flt4-Signale, während Venen, Arterien und Kapillaren negativ waren. Zur Untersuchung, ob Flt4 in den HEVs exprimiert wird, wurden die Tonsillen untersucht. Tatsächlich wurden Flt4-spezifische Autoradiographiekörner in einigen HEVs detektiert.
BEISPIEL 23
Analyse von Flt4-mRNA in normalen und metastatischen Lymphknoten und im Lymphangiom
Ein Teil eines menschlichen mesenterialen Lymphknotens (siehe Beispiel 22) wurde auf Flt4-Expression analysiert. Flt4-Expression wurde in den lymphatischen Sinus und afferenten und efferenten Lymphgefäßen beobachtet. Dasselbe Muster wurde in einem Lymphknoten beobachtet, der Adenokarzinom-Metastasen enthielt. Einige HEVs in sowohl normalen als auch metastati schen Lymphknoten waren ebenfalls positiv. Die Flt4-Expression in einem zystischen Lymphangiom war spezifisch für lymphatische Endothelien, wie aus einem Vergleich mit den In-situ-Signalen für den Von-Willebrandt-Faktor in allen Blutgefäßen ersichtlich war.
In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen war die Immunfärbung für Flt4 stark positiv im Endothel von Hautlymphangiomatose, einer seltenen Fehlfunktion, die durch Proliferation von mutmaßlich lymphatischem Endothel gekennzeichnet ist. Siehe Lymboussaki et al., Am. J. Pathol., 153(2): 395–403 (August, 1998), hier vollständig durch Inbezugnahme aufgenommen.
Darüber hinaus identifizierte die Immunfärbung auf Flt4 Spindelzellen innerhalb von Gewebeproben kutaner knotenförmiger Läsionen des Kaposi-Sarkoms. Siehe Jussila et al., Cancer Res., 58: 1599–1604 (April, 1958). Angesichts der offensichtlichen lymphatischen Spezifität von Flt4, können diese Ergebnisse als mit Vorschlägen konsistent betrachtet werden, dass bestimmte Zellen beim Kaposi-Sarkom von Lymphendothelursprung sind. Siehe z.B. Beckstead et al, Am J. Pathol., 119: 294–300 (1985); und Dictor et al., Am J. Pathol., 130: 411–417 (1988).
BEISPIEL 24
Lokalisierung von Flt4 in fötalen Endothelzellen
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde ein Flt4-cDNA-Fragment, das die carboxyterminalen Aminosäuren der Kurzform kodiert, als ein 657-bp-EcoRI-Fragment "in-frame" mit der kodierenden Region der Glutathion-S-Transferase in den bakteriellen Ex pressionsvektor pGEX-1λT (Pharmacia) kloniert. Das erhaltene GST-Flt4-Fusionsprotein wurde in E. coli produziert und durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Glutathion-Sepharose-4B-Säule gereinigt. Das gereinigte Protein wurde lyophylisiert, in PBS gelöst, mit Freund-Adjuvans gemischt und für die Immunisierung von Kaninchen verwendet. Antiseren wurden nach der dritten "Booster"-Immunisierung verwendet.
Gewebe von 17 und 20 Wochen alten menschlichen Föten wurden von legalen Schwangerschaftsabbrüchen erhalten, die mit Prostaglandinen induziert wurden. Die Studie wurde durch die Ethikkommission des Zentralkrankenhauses der Universität Helsinki genehmigt. Das Gestationsalter wurde aus der fötalen Fußlänge bestimmt. Die fötalen Gewebe wurden in Tissue-Tek (Miles) eingebettet, sofort gefroren und bei –70°C gelagert.
Anti-Flt4-Antiseren wurde auf eine GST-Sepharose-Säule kreuzabsorbiert, um Anti-GST-Antikörper zu entfernen, und dann durch GST-Flt4-Affinitätschromatographie gereinigt. Mehrere 6-μm-dicke Kryostatschnitte des Gewebes wurden mit Aceton fixiert und mit 0,3% H₂O₂ in Methanol für 30 Minuten behandelt, um endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit 5%igem normalen Schweineserum inkubiert. Die Schnitte wurden dann mit Antikörpern gegen Flt4 inkubiert und gewaschen. Gebundene Antikörper wurden mit Peroxidase-konjugiertem Schweine-Anti-Kaninchen-IgG, gefolgt von Färbung durch Peroxidaseaktivität unter Verwendung von 0,2% 3,3-Diaminobenzidin (Amersham) als Substrat detektiert. Die Schnitte wurden in Meyers Hämatoxylin gegengefärbt.
Anti-Flt4-Immunperoxidase-Färbung von menschlichem fötalen Mesenterium zeigte Flt4-Protein im Endothel von mehreren Gefäßen, während Kontrollfärbungen mit antigenblockierten Anti- Flt4-Antikörpern und Präimmunseren negativ waren. Zum Vergleich wurden Schnitte mit einem Antiserum gegen das Faktor-VIII-bezogene Antigen gefärbt, der spezifisch für vaskuläre Endothelzellen ist. Immunperoxidasefärbung auf Flt4 wurde über Endothelzellen von Gefäßen beobachtet, die keine roten Blutkörperchen enthielten, während Blutgefäße negativ waren. Die Gefäße ohne rote Blutkörperchen sind wahrscheinlich lymphatische Endothelzellen; solche Gefäße sind im Mesenterium besonders häufig. Die Antikörper gegen Faktor VIII-bezogenes Antigen färbten Endothelzellen in allen Gefäßen.
BEISPIEL 25
Herstellung von monoklonalen Antikörper gegen Flt4
Fusion I:
Rekombinantes Flt4-Extrazellulardomänenprotein wurde hergestellt durch Expression des Flt4Ec-6xHis-pVTBac-Plasmidkonstrukts (Beispiel 14) in "High-Five"-Zellen. Die Flt4-Extrazellulardomäne (Flt4EC) wurde aus dem Kulturmedium der infizierten "High-Five"-Zellen unter Verwendung von Ni-NTA-Affinitätschromatographie nach Herstellerangaben (Quiagen) zur Bindung und Elution der im COOH-Termins der rekombinanten Flt4-Extrazellulardomäne kodierten 6xHis-Markierung gereinigt.
Vier Monate alte männliche Balb/c-Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion des gereinigten, rekombinant hergestellten Flt4-Extrazellulardomänenproteins (150 μg/Maus), emulgiert mit vollständigem Freund-Adjuvans, immunisiert. "Booster"-Injektionen von 150 μg wurden in drei- bis vierwöchigen Intervallen gegeben und eine letzte "Booster"- Injektion (10 μg Flt4-EC in PBS, intraperitoneal verabreicht) wurde nach einem weiteren dreiwöchigen Intervall gegeben. Vier Tage nach der letzten "Booster"-Dosis wurden die Mäuse getötet und lymphoide Milzzellen der Maus wurden mit SP-2/0-Plasmazytomzellen in einem Verhältnis von 2:1 fusioniert.
Die fusionierten Zellen wurden in 96-Napf-Kulturplatten (NUNC) in Ex-Cell-320-Medium (SERALAB), enthaltend 20% fötales Kälberserum und HAT-Zusatz (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin; GIBCO, 043-01060H; 50fach verdünnt), geerntet. Die Zellen wurden bei +37°C in einer 5% CO₂-Atmosphäre kultiviert. Nach 10 Tagen wurde das HAT-ergänzte Medium gegen HT-ergänztes Zellkulturmedium (GIBCO; 043-01065H, 50fach verdünnt) ersetzt. HT-Medium ist bis auf das fehlende Aminopterin identisch mit HAT-Medium.
In drei Wochen wurde eine Produktion spezifischer Antikörper durch den unten in Beispiel 26 beschriebenen antigenspezifischen immunfluorometrischen Assay (IFMA), festgestellt. Die Masterklone wurden durch "Limited Dilution", wie von Staszewski et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 57: 865–868 (1984) beschriebenen, kloniert. Positive Klone wurden auf 24-Napf-Gewebekulturplatten (NUNC) expandiert, erneut geklont und erneut durch dasselbe Verfahren getestet. Positive Klone wurden mittels Durchflußzytometrie (FACS) getestet.
Die stabilen Klone schieden Immunglobuline aus, die zur IgG₁-Klasse gehörten, mit Ausnahme von einem, der IgG produzierte, der möglicherweise zur Klasse IgA gehörte. Die Unterklasse monoklonaler Antikörper wurde unter Verwendung von monoklonalen Rattenantikörpern gegen Maus-Unterklasse als Biotinkonjugat (SEROTEC) im IFMA bestimmt.
Balb/c-Mäuse wurden verwendet, um monoklonale Antikörper in Aszites-Flüssigkeit herzustellen. Die oben beschriebenen Hybridome wurden nach Vorbehandlung der Tiere mit Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadekan 98%, ALDRICH-CHEMIE D7924 Steinheim, Kat.-Nr. T2280-2) intraperitoneal in Mäuse injiziert. 0,5 ml Pristan (i.v.) wurden etwa zwei Wochen vor den Hybridomzellen injiziert. Die Menge injizierter Zellen betrug ungefähr 7,5 bis 9 × 10⁶ pro Maus. Aszites wurde 10 bis 14 Tagen nach Injektion der Hybridome gesammelt.
Fusion II:
Zwei Monate alte Balb/c-Mäuse (weiblich) wurden durch intraperitoneale Injektion des gereinigten, rekombinant hergestellten Flt4-Extrazellulardomänenproteins (20 μg/Maus), emulgiert mit vollständigem Freund-Adjuvans, immunisiert. "Booster"-Injektionen von 20 μg wurden in drei- bis vierwöchigen Intervallen gegeben und eine letzte "Booster"-Injektion (10 μg Flt4-EC in PBS, i.v.) wurde nach einem weiteren dreiwöchigen Intervall gegeben. Vier Tage nach der letzten "Booster"-Dosis wurden die Mäuse getötet und lymphoide Milzzellen der Maus wurden mit SP-2/0-Plasmazytomzellen in einem Verhältnis von 2:1 fusioniert.
Die fusionierten Zellen wurden in 96-Napf-Kulturplatten (FALCON) in OptiMEM-1-Medium (mit Glutamax, 1, 51985-026, GIBCO BRL), enthaltend 20% fötales Kälberserum und HAT-Zusatz (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin, GIBCO BRL, 21060-017; 1:50-fach verdünnt), geerntet. Die Zellen wurden bei 37°C in einer 5% CO₂-Atmosphäre kultiviert. Nach 10 Tagen wurde das HAT-ergänzte Medium zu HT-Supplement-Zellkulturmedium (GIBCO BRL; 41065-012, 1:50-fach verdünnt) geändert.
In drei Wochen wurde eine Produktion spezifischer Antikörper durch den unten in Beispiel 26 beschriebenen antigenspezifischen immunfluorometrischen Assay (IFMA), festgestellt. Die Masterklone wurden durch "Limited Dilution", wie von Staszewski (1984) beschriebenen, kloniert. Positive Klone wurden auf 24-Napf-Gewebekulturplatten (FALCON) expandiert, erneut geklont und erneut durch dasselbe Verfahren getestet. Positive Klone wurden mittels FACS getestet.
Die 2E11- und 6B2-Klone schieden Immunglobuline aus, die zur IgG₁-Klasse gehörten und 2B12-Klone produzierten Ig, die zur Unterklasse IgM gehörten. Die Maus-Unterklasse IgG₁ wurde bestimmt unter Verwendung von monoklonalem Ratten-Antikörper gegen die schwere Kette der Maus-Unterklasse als Biotin-Konjugat (SEROTEC) im IFMA, und die Maus-Unterklasse IgM wurde bestimmt durch den monoklonalen Maus-Antikörper-Isotypisierungskit (Messstab-Format) (19663-012, Life Technologies Inc.)
BEISPIEL 26
Spezifität von monoklonalen Antikörpern gegen Flt4
Das gereinigte rekombinante Flt4-Extrazellulardomänen-6xHis-Fusionsprodukt (hergestellt wie in den Beispielen 14 und 25 beschrieben) wurde mit Europium nach Mukkala et al., Anal. Biochem, 1 76 (2): 319–325 (1989), mit den folgenden Modifikationen markiert: ein 250facher molarer Überschuss von Isothiocyanat DTTA-Eu (N1-Chelat, WALLAC, Finnland) wurde zu der Flt4-Lösung (0,5 mg/ml in PBS) zugegeben und der pH wurde durch Zugabe von 0,5 M Natriumcarbonatpuffer, pH 9,8, auf etwa 9 eingestellt. Die Markierung wurde über Nacht bei +4°C durchgeführt. Ungebundene Markierung wurde unter Verwendung von PD-10 (PHARMACIA, Schweden) mit TSA-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,8, enthaltend 0,15 M NaCl) als Eluent entfernt.
Nach der Reinigung wurde 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) zu dem markierten Flt4 zugegeben und die Markierung wurde bei +4°C aufbewahrt. Die durchschnittliche Zahl von Europiumionen, die pro Flt4-Molekül aufgenommen wurden, betrug 1,9, wie durch Messung der Fluoreszenz im Verhältnis zu der von bekannten EuCl₃-Standards festgestellt wurde (Hemmila et al., Anal. Biochem., 137: 335–343 (1984)).
Die in Beispiel 25 hergestellten Antikörper wurden unter Verwendung eines imunfluorometrischen Assays vom Sandwichtyp, unter Verwendung von mit Kaninchen-Anti Maus-IgG (Z259, DAKOPATTS) beschichteten und Mikrotitrations-Streifennäpfen (NUNC, Polysorb) gescreent. Die vorbeschichteten Näpfe wurden einmal durch Platewash 1296-024 (WALLACE) mit DELFIA-Waschlösung gewaschen. Der DELFIA-Assaypuffer wurde als Verdünnungspuffer für Zellkulturüberstände und für Serum der Milz-ektomierten Mäuse (bei Verdünnungen zwischen 1:1000 bis 1:100.000) in den vorläufigen Screening-Assays als Positivkontrolle verwendet.
Eine Übernacht-Inkubation bei +4°C (oder alternativ für 2 Stunden bei Raumtemperatur) wurde begonnen durch Schütteln auf einem Plattenschüttler (1296-001, WALLAC) für 5 Minuten, gefolgt von viermaligem Waschen mit Waschlösung wie oben beschrieben.
Der Europium-markierte Flt4 wurde bei einer Verdünnung von 1:500 in 100 μl des Assay-Puffers gegeben. Nach 5 Minuten auf einem Plattenschüttler und einer Stunde Inkubation bei Raum temperatur wurden die Streifen wie oben beschrieben gewaschen.
"Enhancement"-Lösung (DELFIA) wurde zu 200 μl/Napf zugegeben. Die Platten wurden dann für 5 Minuten auf einem Plattenschüttler geschüttelt und die Intensität der Fluoreszenz wurde durch ARCUS-1230 (WALLAC) für 10–15 Minuten gemessen. (Lovgren et al., In: Collins W. P. (Hrsg.) Alternative Immunoassays, John Wiley & Sons Ltd. (1985), S. 203–216)). Die DELFIA-Ergebnisse zeigen, dass alle getesteten monoklonalen Antikörper das Flt4-EC-Antigen banden. Monoklonale Antikörper, die mit dem Flt4 (und den Hybridomen, die die Antikörper bilden) reagieren, wurden für das weitere Screening ausgewählt.
Die erhaltenen monoklonalen Antikörper wurden bei der Doppel-Antikörper-Immunfluoreszenzfärbung von NIH3T3-Zellen, die das LTR-Flt41-Konstrukt exprimieren, und Neomycin-resistenten transfizierten NIH3T3-Zellen verwendet. Die Zellen wurden unter Verwendung von EDTA von den Kulturplatten abgelöst, gefärbt und in einem Durchflußzytometer (FACS) analysiert. Die Ergebnisse der FACS-Analyse sind als Prozentanteile von Zellen, die positiv mit dem angegebenen monoklonalen Antikörper gefärbt wurden, angegeben (siehe Tabelle 2, unten) Tabelle 2

a) FACS-Ergebnisse mit LTR-transfizierten Zellen
b) FACS-Ergebnisse mit NEO-Zellen (Kontrolle)

Die FACS-Ergebnisse mit LTR-Flt41-tranfizierten Zellen zeigen, dass die Antikörper Flt4-exprimierende Zellen wirksam erkennen. Dieselben Antikörper ergeben bei Neomycin-Phosphotransferase-transfizierten NIH3T3-Zellen lediglich Hintergrundfärbung. Somit erkennen die Antikörper Flt4-Tyrosinkinase auf der Zelloberfläche spezifisch.
Es wurde gefunden, dass ein als Anti-Flt4-Hybridom-9D9F9 bezeichneter Klon einen monoklonalen Antikörper stabil ausschied, von dem mittels IFMA festgestellt wurde, dass er zur Immunglobulinklasse IG₁ gehört. Das Hybridom 9D9F9 wurde am 23. März 1995 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Abteilung menschliche und tierische Zellkulturen und Viren, Mascherorder Weg 1b, 3300 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt und erhielt die Zugriffsnummer ACC2210.
Fusion-II-Antikörper
Das oben beschriebene Europium-markierte Flt4-Extrazellulardomänenprotein wurde auch verwendet, um die in Beispiel 25 beschriebenen Fusion-II-Antikörper zu screenen. Die Antikörper wurden unter Verwendung eines Flt4-spezifischen IFMA unter Verwendung von mit Kaninchen-Anti-Maus-Ig (Z259, DAKO) beschichteten Mikrotitrationsnäpfen (Nunc, Polysorb) gescreent. Die vorbeschichteten Näpfe wurden einmal mit Waschlösung (Wallac) durch Verwendung von DELFIA-Plattenwaschlösung gewaschen.
Der DELFIA-Assaypuffer wurde als Verdünnungspuffer für Zellkulturüberstände (Verdünnung 1:2 beim vorläufigen Screening) und für Serum von Milz-ektomierten Mäusen (Verdünnungen 1:1000 bis 1:100.000), die als Positivkontrolle verwendet wurden, verwendet. Als Standard wurde der gereinigte Anti-Flt4-9D9F9 (Maus-Unterklasse Ig₁) bei Konzentrationen zwischen 1,0 ng/ml und 250 ng/ml verwendet. Proben wurden zunächst bei Raumtemperatur für 5 Minuten auf einem Plattenschüttler geschüttelt und dann ungefähr 18 Stunden bei +4°C inkubiert. Die Rahmen wurden zunächst viermal gewaschen, dann wurde der Eu-markierte Flt4 (1:2000, in 100 μl Assaypuffer) zugegeben, und schließlich wurden die Rahmen für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem beschriebenen Waschen wurde die "Enhancement"-Lösung (200 μl/Napf, Wallac) zugegeben und die Rahmen wurden für 5 Minuten auf dem Platten schüttler geschüttelt. Die Intensität der Fluoreszenz wurde durch ARCUS-1230 (Wallac) gemessen. Monoklonale Antikörper, die mit Flt4 reagierten, wurden für das weitere Screening in dem Doppel-Antikörper-Immunfluoreszenzfärbungsassay unter Einsatz von Flt4-exprimierenden NIH3T3-Zellen, wie oben beschrieben, selektiert.
Die erhaltenen monoklonalen Fusion-II-Antikörper gegen Flt4 und entsprechende Ergebnisse der FACS-Analyse (ausgedrückt als Prozentanteile von Zellen, die mit den angegebenen monoklonalen Antikörpern positiv gefärbt wurden) sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Für die Quantifizierung von Anti-Flt4-Antikörpern wurde eine Standardkurve mit affinitätsgereinigtem Anti-Flt4-9D9F9 hergestellt. Der lineare Bereich reichte von 1,0 ng/ml bis 250 ng/ml.
Zelllysate von mit dem pLTRFlt41-Konstrukt kotransfizierten den Vollängen-Flt4 auf ihrer Oberfläche exprimierenden NIH3T3-Zellen wurden in 6,5% SDS-Page einer Elektrophorese unterzogen, die Proteine wurden auf Nitrozellulosemembran (0,45 μm, SCHLEICHER & SCHUELL) übertragen und einem Immunblot mit Monoklonalantikörper-haltigen Hybridom-Zellkulturüberständen unterzogen (1:10,50 mM TRIS – 40 mM Glycinpuffer, enthaltend Methanol 4%, SDS 0,04%). Die Spezifitäten der monoklonalen Antikörper wurden unter Inkubation mit HRP-konjugiertem Kaninchen-Anti-Maus-Ig festgestellt (P161, DAKO, verdünnt 1:1000 in 20 mM Tris-Puffer, 7,5, enthaltend 150 mM Salzlösung, 5% Milchpulver) und ECL ("Enhanced chemiluminiscence", AMERSHAM) bestimmt. TABELLE 3

a) FACS-Ergebnisse mit LTR-transfizierten Zellen
b) FACS-Ergebnisse mit NEO-Zellen (Kontrolle)
c) Quantifizierung der Mak-Produktion, auf Basis von als Standard verwendetem affinitätsgereinigtem Anti-FLT-9D9F9-Antikörper

NF: Bei FACS nicht funktionierend
WB: Erfolgreich beim Western-Immunblotting eingesetzt

BEISPIEL 27
Verwendung von Anti-Flt4-Antikörpern zur Identifizierung von Flt4 in Zelllysaten und exprimiert in Lymphendothelzellen in menschlichen Geweben
Die durch das in den vorhergehenden Beispielen beschriebene Hybridom 9D9 hergestellten monoklonalen Antikörper wurden bei der Immunpräzipitation und dem Western-Blot von Lysaten von HEL-Zellen eingesetzt. Wie in Beispiel 6 berichtet, war Flt4- mRNA-Expression in HEL-Zellen bereits früher beobachtet worden worden. Etwa 2 × 10⁷ kultivierte HEL-Zellen wurden in RIPA-Puffer, näher beschrieben in Beispiel 11, lysiert und mit etwa 2 Mikrogramm des 9D9-Antikörpers immunpräzipitiert (wie für polyklonale Antikörper in Beispiel 11 beschrieben). Für die Western-Analyse wurden Immunpräzipitate über SDS-PAGE (6% Gel) einer Elektrophorese unterzogen und durch Elektroblotting auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Polypeptidbanden von 175 kD und 125 kD, entsprechend Flt4-Polypeptiden, wurden in der Western-Blot-Analyse der Immunpräzipitate unter Verwendung einer 1-Mikrogramm/ml-Verdünnung des 9D9-Antikörpers detektiert.
Die Immunfärbung von menschlichem Unterhautgewebe wurde unter Verwendung des monoklonalen 9D9-Antikörpers und eines Alkalische-Phosphatase-ABC-AP-Kits (Dako) durchgeführt. Kurz gesagt, wurden 6-μm-Proben von adulter menschlicher Haut enthaltende Objektträger für 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) getrocknet, für zehn Minuten mit kaltem Aceton fixiert und dann einmal für fünf Minuten mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Die Proben wurden dann für 30 Minuten bei RT mit 2% Pferdeserum inkubiert und dreimal für fünf Minuten in PBS gewaschen.
Für die Immunfärbung wurden die Proben für eine Stunde bei RT mit dem primären 9D9-Antikörper inkubiert und dreimal für fünf Minuten mit PBS gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Proben für dreißig Minuten bei RT mit dem biotinylierten Kaninchen-Anti-Maus-Sekundärantikörpern inkubiert und erneut dreimal für füng Minuten mit PBS gewaschen.
Gebundene Antikörper wurden durch Inkubation der Proben für dreißig Minuten bei RT mit ABC-AP-Komplex, dreimaligem Wa schen mit PBS, Inkubieren für fünfzehn Minuten bei RT mit AP-Substrat (Sigma Fast Red TR/Naphto, AS-MX (Kat.-Nr. F-4648)) und Spülen mit Wasser detektiert. Die Proben wurden dann mit Mayers Hämatoxylin für dreißig Sekunden gegengefärbt und mit Wasser gespült. Aquamount und ein Deckgläschen wurden aufgebracht und die Proben wurden unter einem Mikroskop analysiert. Die 9D9-Antikörperfärbung wurde bei diesen menschlichen Hautschnitten in lymphatischen Endothelzellen beobachtet. Blutgefäßendothelien zeigten extrem schwache oder keine Färbung. Weitere Analysen dienten dazu, die offensichtliche Spezifität für lymphatische Endothelien zu bestätigen. Siehe Lymboussaki et al., Am. J. Pathol., 153 (2): 395–403 (August, 1998); und Jussila et al., Cancer Res., 58: 1599–1604 (April, 1998), die beide durch Inbezugnahme hier in ihrer Gänze aufgenommen sind.
Diese Ergebnisse sind einer weitere Bestätigung für die Nützlichkeit von Flt4 als geeigneten Marker für lymphatische Endothelien und die Nützlichkeit von Anti-Flt4-Antikörpern zur Identifizierung und Visualisierung von in diesen Zellen exprimiertem Flt4 in einer Gewebeprobe.
BEISPIEL 28
Hochregulation des VEGF-C/VEGFR-3-Signalwegs bei der Brustkrebs-Angiogenese
Die vorangegangenen Beispiele zeigen, das Flt4 (VEGFR-3) als spezifischer Antigenmarker für lymphatische Endothelien in normalen Geweben nützlich ist. Die folgenden Verfahren zeigen zusätzlich, dass VEGFR-3 als antigener Marker (zum Beispiel für Diagnose und Screening) und als therapeutisches Ziel in malignen Brusttumoren nützlich ist. Beim invasiven Brustkrebs wurde eine starke erhöhte Zahl von VEGFR-3-positiven Gefäßen im Vergleich zu histologisch normalem Brustgewebe gefunden (P < 0,0001).
Materialien und Methoden
Frisch eingefrorene Brustgewebeproben wurden von der Kartei der Abteilung für Pathologie, Universität Helsinki, bezogen. Die Proben bestanden aus duktalem Karzinom (n = 6), lobulärem Karzinom (n = 6), intraduktalem Karzinom (n = 8), Fibroadenom (n = 4) und histologisch normalem Brustgewebe (n = 12). Alle Proben wurden sofort nach der chirurgischen Entfernung in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –70°C gelagert.
Monoklonale Maus-Antikörper (Maks) gegen menschlichen Flt4 (VEGFR-3) wurden im Wesentlichen wie in den vorangegangenen Beispielen, z.B. Beispiel 25, beschrieben, hergestellt. Die VEGFR-3-Extrazellularproteindomäne (VEGFR-3EC) wurde über einen rekombinanten Baculovirus in Insektenzellen exprimiert, aus dem Kulturmedium aufgereinigt. Monoklonale Maus-Antikörper gegen VEGFR-3EC wurden dann unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt, und die Immunglobulinfraktion wurde durch Protein-A-Affinitätschromatographie aus Hybridom-Aszites-Flüssigkeit oder Tecnomouse^®-Kulturüberständen gereinigt.
Fünf-μm-Kryoschnitte der Gewebeproben wurden luftgetrocknet und in kaltem Aceton für 10 Minuten fixiert. Die Schnitte wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) rehydriert und für 30 Minuten in 5% normalem Pferdeserum bei Raumtemperatur inkubiert. Die Schnitte wurden dann für 2 Stunden in einer feuchten Atmosphäre bei Raumtemperatur mit den Maks 9D9F9 (Beispiel 26) bei einer Konzentration von 1,0 μg/ml inku biert. Andere Anti-VEGFR-3-Maks gegen bestimmte Epitope der VEGFR-3EC wurden ebenfalls untersucht; die Klone 2E11D11 (Beispiel 26) und 7B8F9 (im wesentlichen hergestellt wie in Beispiel 26 beschrieben) wurden bei den Konzentrationen 9,5 beziehungsweise 8,5 μg/ml verwendet. Einer nachfolgenden Inkubation für 30 Minuten in biotinyliertem Anti-Mausserum schloss sich eine 60-minütige Inkubation unter Verwendung von Reagenzien des Vectastain-Elite-Maus-IgG-ABC-Kits (Vector laboratories, Burlingame, USA) an. Peroxidaseaktivität wurde mit 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC, Sigma, St. Louis, USA) für 10 Minuten entwickelt. Schließlich wurden die Schnitte mit Hämatoxylin für 20 Sekunden gefärbt. Negativkontrollen wurden durch Weglassen des primären Antikörpers oder durch Verwendung irrelevanter primärer Antikörper desselben Isotyps durchgeführt. Das gereinigte Baculovirus-Immunogenen wurde verwendet, um die Bindung des 9D9-Antikörpers als weitere Negativkontrolle zu blockieren. In diesen Versuchen wurden die Antikörper über Nacht mit einem 10fachen molaren Überschuss des VEGFR-3EC-Proteins in PBS inkubiert. Nach Zentrifugation für 4 Minuten bei 4000 UPM, +4°C, wurde der Überstand sorgfältig gesammelt und dann als primärer Antikörper verwendet. Die 5-μm-Kryoschnitte, die denen mit den Anti-VEGFR-3-Antikörpern gefärbten benachbart waren, wurden auf den Blutgefäßendothelmarker PAL-E (0,15 μg/ml Monosan, Uden, Niederlande), Laminin (1:4000-Verdünnung des Überstands von Klon LAM-89, Sigma, St. Louis, MO), Kollagen XVIII (1,9 μg/ml), Glattmuskel-α-Aktin (SMA, 0,5 μg/ml, Klon 1A4, Sigma), VEGFR-1 (1:200-Verdünnung des Überstands von Klon 19) oder VEGFR-2 (Verbindung 1:100) immungefärbt.
Die pathologische Untersuchung dieser Proben wurde nach den Färbungsprozeduren durchgeführt. Die Blutgefäßdichten wurden von den Objektträgern erhalten, die auf PAL-E gefärbt wurden [de Waal et al., Am. J. Pathol., 150: 1951–1957 (1997)], entsprechend den von Gasparini und Harris. [Gasparini G, und Harris A, J Clin. Oncol., 13: 765–782 (1995).] empfohlenen Richtlinien. Die Dichte VEGFR-3-positiver Gefäße wurden auf die gleiche Weise untersucht. Ein Objektträger wurde zunächst bei geringer Vergrößerung untersucht und die intratumorale Gefäßdichte wurde dann durch Zählen der Anzahl von gefärbten Gefäßen pro Gesichtsfeld bei 400 × Vergrößerung (high power field, HPF) in den Bereichen mit der höchsten Gefäßdichte ("vaskuläre Hotspots") oder in den Bereichen mit der höchsten Dichte VEGFR-3-positiver Gefäße ermittelt. Mindestens 5 Felder wurden pro Objektträger ausgezählt, wonach die 3 höchsten Zählungen gemittelt wurden.
Eine Doppelfärbung wurde durchgeführt, um die immunhistochemische Färbung von Lymph- und Blutgefäßen bei zwei intraduktalen Karzinomen zu unterscheiden. Acetonfixierte 5-μm-Kryoschnitte wurden für 1 Stunde mit Anti-PAL-E-Antikörpern, mit biotinyliertem Pferde-Anti-Maus-Antikörper (Vectastain-Elite-Mouse-IgG-ABC-Kit, Vector laboratories, Burlingame, USA) für 30 Minuten, mit ABC-Peroxidase (Vectastain, 1:100) für 45 Minuten inkubiert und schließlich mit AEC für 10 Minuten entwickelt. Für den zweiten Schritt wurden die Schnitte inkubiert mit Anti-VEGFR-3 Antikörpern für 1 Stunde (0,14 μg/ml), gefolgt von biotinyliertem Anti-Maus-Antikörper für 30 Minuten (1:200-Verdünnung vom Überstand des Klons), biotinylierter Tyramin-Lösung (1:2000), enthaltend 0,01% Peroxid, für 5 Minuten, ABC-alkalische-Phosphatase (1:100) für 20 Minuten und mit Fast Blue entwickelt (Sigma, St. Louis, USA) nach einem vorher in der Literatur für die ISH-Signalverbesserung beschriebenen Verfahren. [Kerstens et al., J. Histochem. Cytochem., 43: 347–352 (1995).] Kryoschnitte (5 μm), die den doppelt gefärbten Schnitten benachbart waren, wurden ebenfalls nur mit VEGFR-3-Antikörpen, wie oben beschrieben, immungefärbt.
Polyklonale Antikörper wurden in Kaninchen gegen ein synthetisches Peptid erzeugt, entsprechend den Aminosäureresten 2–18 des N-Terminus von reifem, sekretiertem menschlichen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor C (VEGF-C) (Reste 104–120 des VEGF-C-Präpro-VEGF-C-Polypeptids), wie in der Literatur beschriebenen. [Joukov et al., EMBO J., 16: 3898–3911 (1997), durch Inbezugnahme hier zur Gänze aufgenommen]. Die Antiseren wurden unter Verwendung des immunogenen Polypeptids, gekoppelt an eine epoxyaktivierte Sepharose-6B-Säule, affinitätsgereinigt und auf spezifische Färbung von VEGF-C unter Verwendung von Zellen, die mit einem adenoviralen VEGF-C oder Kontroll-β-Galaktosidase exprimierenden Vektor infiziert waren, getestet.
Die acht intraduktalen Karzinome und alle invasiven Karzinome, die auf VEGFR-3 analysiert wurden, wurden für die weiteren Analysen der Expression von VEGF-C ausgewählt. Fünf-Mikrometer-Kryoschnitte, benachbart zu den Schnitten, die mit den Anti-VEGFR-3-Antikörpern gefärbt wurden, wurden luftgetrocknet und in kaltem Aceton für 10 Minuten fixiert. Die Schnitte wurden in PBS rehydriert und für 30 Minuten in 5% normalen Ziegenserum und dann für 2 Stunden in einer feuchten Atmosphäre bei Raumtemperatur mit den polyklonalen Kaninchen-Antikörpern gegen menschlichen VEGF-C, 1:200 in PDS verdünnt, inkubiert. Einer anschließenden Inkubation für 30 Minuten in biotinyliertem Anti-Kaninchen-Serum schloss sich eine 60minütige Inkubation unter Verwendung von Reagenzien des Vectastain-Elite-Kaninchen-IgG-ABC-Kits (Vector laboratories, Burlingame, USA) an. Die Schnitte wurden wie oben beschrieben weiterverarbeitet. Als Negativkontrolle wurde das gereinigte Immunogenen verwendet, um die Bindung der VEGF-C-Antikörper zu unterbinden. In diesen Versuchen wurden VEGF-C-Antikörper über Nacht mit einem 10fachen molaren Überschuss des VEGF-C-Proteins in PBS inkubiert. Nach Zentrifugation für 4 Minuten bei 4000 UPM bei +4°C wurde der Überstand sorgfältig gesammelt und in den Immunfärbungen verwendet.
Monoklonale Antikörper gegen menschliches Typ-XVIII-Kollagen wurden erzeugt von der DiaBor Ltd. (Oulu, Finnland) durch Immunisierung von Mäusen mit dem rekombinanten Polypeptid QH48.18 [Saarela et al., Matrix Biology, 16: 319–28 (1998)], entsprechend der gemeinsamen Region in der N-terminalen NC1-Domäne von menschlichem Typ-XVIII-Kollagen. Die Klone wurden durch ELISA-Test und Western-Analyse gescreent unter Verwendung des Polypeptids QH48.18, und auch durch Immunfluoreszenzfärbung von gefrorenen menschlichen Gewebeschnitten. Das Screening der Hybridom-Klone führte zu drei monoklonalen Antikörpern, die in allen drei oben genannten Tests (ELISA, Western, Immunfluoreszenzfärbung) positiv waren. Einer der Antikörper, der die stärksten Signale ergab, DB144-N2, wurde in den nachfolgenden Experimenten verwendet. Er gab ein identisches Färbungsmuster (z.B. in adulten menschlichen Haut- und Nierenproben) zu dem des polyklonalen Anti-"allhu" (XVIII).
Ergebnisse
A. VEGFR-3 in histologisch normalem Brustgewebe und in benignen Fibroadenomen
Die immunhistochemische Färbung von VEGFR-3 in normalem Gewebe zeigte eine sehr schwache Färbung in Kapillaren des interduktalen Stroma. Diese Gefäße bildeten keine spezifischen Muster, sondern waren über das ganze Stroma verteilt. Die Dichte der VEGFR-3-positiven Gefäße in den Proben normalen Brustgewebes lag im Bereich von 6 bis 17 HPF, Median 9 (n = 1). Die meisten dieser Gefäße wurden auf den Blutgefäßendothelmarker PAL-E und auf die Basalmembrankomponente Kollagen XVIII stark gefärbt, was darauf hindeutet, dass VEGFR-3 in den Blutgefäßen von normalem Brustgewebe schwach exprimiert wurde. Einige dünne Gefäße in dem Stroma, die eindeutig auf VEGFR-3 gefärbt wurden, waren jedoch negativ für PAL-E und lediglich schwach positiv für das Kollagen Typ XVIII, was darauf hindeutet, dass sie Lymphgefäße waren. VEGFR-3-positive Gefäße wurden auch einheitlich in benignen Fibroadenomen gefunden, wo ihre Dichte (Median 8 Gefäße pro HPF; Bereich 3–19; n = 4) sich von der des histologisch normalen Gewebes (Median 8 gg. 9; P > 0,1, Mann-Whitney-Test) nicht unterschied.
B. VEGFR-3-positive Gefäße in intraduktalen Karzinomen
In intraduktalen Karzinomen wurde ein ausgeprägtes Muster von stark gefärbten VEGFR-3 positiven Gefäßen beobachtet. Die Gefäße bildeten bogenartige Strukturen um die betroffenen Kanäle (5A). Dieses "Halsband"-Muster wurde auch bei der Färbung von benachbarten Schnitten auf den Blutgefäßendothelmarker PAL-E (5B) beobachtet, was darauf hindeutet, dass die VEGFR-3-Expression in kapillarem Endothel verstärkt war. Um deutlicher zwischen Blut- und Lymphgefäßen unterscheiden zu können und um nach der Anwesenheit von glatten Muskelzellen und Perizyten in den Gefäßwänden zu suchen, wurden weitere Färbungen unter Verwendung von Antikörpern gegen Glattmuskel-α-Aktin (SMA) und die Basalmembrankomponenten Laminin und Typ-XVIII-Kollagen vorgenommen. Gemäß diesen Färbungen exprimierten die kleinen Gefäße dicht an den intraduktalen Karzi nomen gleichzeitig VEGFR-3 und die Basalmembranproteine, färbten jedoch schwächer auf SMA, was darauf hindeutet, dass sie unvollständig von Perizyten/Glattmuskelzellen in der Gefäßwand bedeckt waren (schwarze Pfeile in den 5C–5F). Im Gegensatz dazu waren die größeren Blutgefäße in einigem Abstand von den intraduktalen Läsionen im allgemeinen negativ für VEGFR-3, jedoch positiv für Laminin, Kollagen XVIII und SMA (rote Pfeile). Darüber hinaus wurden Gefäße gefunden, die positiv für VEGFR-3 waren, jedoch sehr schwach auf die Basalmembranproteine Laminin und Typ-XVIII-Kollagen und überhaupt nicht auf SMA (grüne Pfeile) gefärbt wurden. Von diesen wurde angenommen, dass sie Lymphgefäße repräsentieren.
C. Differentielle Doppelfärbung von Blut- und Lymphgefäßen
Zwei intraduktale Karzinome wurden für das immunhistochemische Doppelfärbungsverfahren ausgewählt, um Lymphgefäße eindeutiger von Blutgefäßen zu unterscheiden [siehe de Waal et al., Am. J. Pathol., 150: 1951–1957 (1997)]. Unter Verwendung dieser Methode wurden die VEGFR-3-positiven Gefäße blau gefärbt, während die PAL-E-positiven Gefäße und die Basalmembran braun gefärbt wurden. Beide getesteten Proben zeigten ein ähnliches Färbungsmuster: die die tumorgefüllten Kanäle auskleidenden Gefäße waren vornehmlich PAL-E-positiv (Pfeilspitze in den 5G und 5H), während die mutmaßlichen lymphatischen, VEGFR-3-positiven Gefäße eine kurze Strecke entfernt in dem interduktalen Stroma PAL-E-negativ waren (schwarze Pfeile in den 5G und 5H). Um eine Fehlinterpretation aufgrund möglicher Doppelfärbungsartefakte auszuschließen, wurden benachbarte 5-μm-Schnitte mit Anti-VEGFR-3 allein gefärbt. Diese Färbung bestätigte, dass etliche der PAL-E-positiven Blutgefäße auch positiv für VEGFR-3 sind.
D. VEGF-C, VEGFR-1 und VEGFR-2 in den intraduktalen Karzinomzellen und deren Rezeptoren in benachbarten Gefäßen
Polyklonale affinitätsgereinigte Antikörper gegen menschlichen VEGF-C wurden verwendet, um die 8 intraduktalen Karzinomproben zu färben. Alle getesteten Proben enthielten zumindest einiges VEGF-C, es wurde jedoch eine beträchtliche Heterogenität hinsichtlich der Intensität der Färbung und in den Expressionsmustern beobachtet. In einigen Fällen waren die meisten der Karzinomzellen stark positiv für VEGF-C, während in anderen lediglich einige Karzinomzellen ein Färbungssignal ergaben. Im Gegensatz dazu wurde in den normalen Geweben, die die betroffenen Kanäle umgeben, sehr wenig oder gar keine Färbung beobachtet, obwohl ein schwaches Signal auch in unbefallenem normalen duktalen Epithel erhalten wurde. Antigen-Blockierungsversuche zeigten, dass die Färbung für VEGF-C spezifisch war. Der andere VEGF-C-Rezeptor, VEGFR-2, sowie der andere VEGF-Rezeptor (VEGFR-1) wurden beide in denselben zu den intraduktalen Karzinomzellen benachbarten "Halsband"-Gefäßen exprimiert.
E. VEGFR-3-positive Gefäße und VEGF-C bei invasivem Brustkarzinom
Stark gefärbte VEGFR-3-positive Gefäße waren auch in allen untersuchten invasiven duktalen Karzinomen und lobulären Karzinomen anwesend. Die VEGFR-3-positiven Gefäße schienen kein spezifisches Verteilungsmuster zu bilden; die meisten dieser Gefäße waren auch immunreaktiv für das PAL-E-Antigen. Die intratumorale Dichte VEGFR-3-positiver Gefäße (Median 21, Bereich 9–56 Gefäße pro HPF; n = 12) war in den invasiven Brustkarzinomen im Vergleich zu normalem Gewebe (Median 21 gg. 9; P < 0,0001, Mann-Whitney-Test) signifikant erhöht. Gelegentlich konnte eine Invasion der Karzinomzellen in die VEGFR-3-positiven Lymphgefäße beobachtet werden.
Die Immunfärbung auf VEGFR-C variierte unter den untersuchten invasiven Karzinomen (n = 12) stark. Einige Karzinomzellen wurden stark auf VEGF-C gefärbt, während andere nur schwach gefärbt wurden oder, in einigen Fällen, keine Färbung beobachtet wurde. Wie bei den intraduktalen Karzinomen wurde eine nur geringe oder keine Färbung im Bindegewebe bei diesen Schnitten beobachtet.
Die vorstehenden Daten ergaben, dass VEGFR-3, der ansonsten ein vornehmlich lymphatischer Endothelmarker in den meisten adulten Geweben zu sein schien, sehr schwach auch in kapillärem Endothel von normalem Brustgewebe exprimiert wird. Bedeutsamer ist, dass bei intraduktalen Karzinomen ein "Halsband"-Muster von stark gefärbten VEGFR-3-positiven Gefäßen detektiert wurde, die die tumorgefüllten Kanäle auskleiden. Die meisten dieser Gefäße exprimierten den Blutgefäßendothelmarker PAL-E und die Basalmembrankomponenten Laminin und Kollagen XVIII, wiesen augenscheinlich jedoch weniger Perizyten/Glattmuskelzellen als Blutgefäße auf, die weiter weg von den Tumorzellen lokalisiert waren, wie durch Färbung unter Verwendung von Antikörpern gegen SMA gezeigt wurde. Diese Eigenschaften legen nahe, dass die "Halsband"-Gefäße eine Angiogenese durchmachten. Eine zweite Gruppe von Gefäßen, die in einem Abstand von den betroffenen Kanälen entfernt lagen, waren positiv für VEGFR-3, jedoch sehr schwach positiv für die Basalmembrankomponenten und negativ für PAL-E, was darauf hindeutet, dass sie Lymphgefäße sind. Diesen Gefäßen fehlten auch SMA-positive perizytische Komponenten. Auch bei invasiven Brustkarzinomen wurde VEGFR-3 in PAL-E-positiven Blutgefäßen hochreguliert, obwohl die beobachteten Gefäßmuster in dem Bindegewebsstroma um die Tumorzellen herum stärker zufällig angeordnet waren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die VEGFR-3-Expression in Brustkarzinomen während der Angiogenese, die mit dem Tumorwachstum verbunden ist, hochreguliert wird. Die stark erhöhte Zahl von VEGFR-3-positiven Gefäßen, die in situ bei Karzinomen gefunden wurde, ist kompatibel mit der Hypothese, dass die Karzinomzellen Faktoren produzieren, die das Wachstum von Blutgefäßen in der unmittelbaren Nähe der Karzinomzellen aktivieren.
Da VEGF-C sowohl VEGFR-3 als auch VEGFR-2 mit hoher Affinität bindet, und da sowohl intraduktale als auch invasive Karzinomzellen oftmals positiv auf VEGF-C-Protein gefärbt wurden, kommt dieser Wachstumsfaktor als Wachstumsfaktor für die VEGFR-3- und VEGFR-2-positiven Gefäße in den Karzinomen in Frage. Diese Daten stimmen überein mit einer anderen Studie, bei der nahezu die Hälfte von fünfundreißig unselektierten malignen invasiven Tumoren (einschließlich Brustkarzinomen, Plattenepithelkarzinomen, Lymphomen, Melanomen und Sarkomen) VEGF-C-mRNA in Northern-Plot-Analysen enthielten [siehe Salven et al., Am. R Pathol., 153 (1): 103–108 (Juli 1998), durch Inbezugnahme hier vollständig aufgenommen]. Zusammengenommen geben die hier vorgestellten Daten einen Hinweis auf die Behandlung von Brustkarzinomen und möglicherweise anderen, nicht lymphatischen Karzinomen mit Mitteln, die die VEGF-C-vermittelte Stimulation von VEGFR-3 und/oder VEGFR-2 stimulieren. Vorgesehene Blockierungsmittel beinhalten: Anti-VEGF-C-Antikörper; Anti-VEGFR-3-Antikörper; Anti-VEGFR-2-Antikörper; bispezifische Antikörper, die an VEGFR-3 und entweder VEGFR-2 oder VEGFR-2 binden; lösliche Extrazellulardomänenfragmente von VEGFR-3, die an zirkulierenden VEGF-C binden; VEGF-C-Fragmente und -Analoga, die VEGFR-3 und/oder VEGFR-2 binden und die Aktivierung solcher Rezeptoren hemmen; VEGF-C-Polypeptide, -Fragmente und -Analoga, die VEGFR-3 und/oder VEGFR-2 binden und mit einem geeigneten therapeutischen Mittel konjugiert sind; VEGFR-3-Tyrosinkinaseinhibitoren; und kleine Moleküle, die diese Rezeptoren binden und hemmen. Da VEGF-C sowohl VEGFR-3 als auch VEGFR-2 bindet, ist darüber hinaus vorgesehen, dass Anti-VEGF-D-Antikörper und hemmende VEGF-D-Fragmente und -Analoga geeignete Blockierungsmittel sind. Menschliche und humanisierte Antikörper und Fragmente davon sind bevorzugt, soweit Antikörpermittel für die Therapie von Menschen selektiert werden. Darüber hinaus ist als weiterer Aspekt der Erfindung vorgesehen, jedes der vorstehend genannten Mittel zu verwenden, um Säugetiergewebe in vitro oder in vivo zu beurteilen, zum Beispiel für Zwecke der Diagnose und des Screenings von Malignitäten und der Streuung von Malignitäten.
Für jedes der vorstehend genannten Mittel ist es vorgesehen, dass das Mittel ferner für die Diagnose und das Screening verbessert sein kann durch Anheftung eines detektierbaren Markers, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Radioisotope (zum Beispiel ¹⁴C, ¹³³I und ¹²⁵I), Chromophore (z.B. Fluoreszein, Phycobiliprotein, Tetraethylrhodamin; Enzyme, die ein Fluoreszenz oder ein gefärbtes Produkt erzeugen zur Detektion durch Fluoreszenz; Absorption, sichtbare Färbung, oder Agglutination, wodurch ein elektronendichtes Produkt für die Detektion durch Elektronenmikroskopie erzeugt wird); oder elektronendichte Moleküle wie beispielsweise Ferritin, Peroxidase oder Goldkügelchen. Gleichermaßen können die Mittel für therapeutische Zwecke verbessert werden durch Anheftung (zum Beispiel Konjugation) oder gemeinsame Verabreichung von Molekülen, die antineoplastische Eigenschaften aufweisen, wie beispielsweise Toxine von pflanzlicher, tierischer, Mikroorganismen- oder Pilzherkunft; Radioisotope; Arzneimittel; En zyme; und/oder Zytokine und andere therapeutische Proteine. Siehe Pietersz & McKenzie, "Antibody Conjugates for the treatment of Cancer," Immunological Reviews, 129: 57–80 (1992), durch Inbezugnahme hier aufgenommen.
BEISPIEL 29
Anti-Flt4-Antikörper zur Verabreichung als Therapeutikum an Menschen
A. Humanisierung von monoklonalen Anti-Flt4-Antikörpern
Die hier, z.B. in Beispiel 28, dargelegte Biologie von Flt4 zeigt therapeutische Verwendungen für Flt4-Inhibitoren (-Antagonisten) auf, die die Liganden-vermittelte Signalgebung des Flt4-Rezeptors blockieren. Flt4-neutralisierende Antikörper umfassen eine Klasse von Therapeutika, die als Flt4-Antagonisten nützlich sind. Im folgenden werden Protokolle zur Verbesserung der Eignung von monoklonalen Anti-Flt4-Antikörpern als Therapeutika beim Menschen durch "Humanisierung" der monoklonalen Antikörper angegeben, um deren Serumhalbwertszeit zu verbessern und sie in menschlichen Wirten weniger immunogen zu machen (d.h. eine menschliche Antikörperantwort auf nichtmenschliche Anti-Flt4-Antikörper zu verhindern).
Die Prinzipien der Humanisierung sind in der Literatur beschrieben worden und werden durch den modularen Aufbau von Antikörperproteinen erleichtert. Um die Möglichkeit der Bindung von Komplement zu verringern, ist ein humanisierter Antikörper vom IgG4-Isotyp bevorzugt.
Ein Humanisierungsniveau kann zum Beispiel erreicht werden durch Erzeugen chimärer Antikörper, die die variablen Domänen von interessierenden nichtmenschlichen Antikörperproteinen umfassen, wie beispielsweise die hier beschriebenen monoklonalen Anti-Flt4-Antikörper mit den konstanten Domänen von menschlichen Antikörpermolekülen. (Siehe z.B. Morrison und Oi, Adv. Immunol., 44: 65–92 (1989)). Die variablen Domänen von Flt4-neutralisierenden Anti-Flt4-Antikörpern werden aus der genomischen DNA eines B-Zell-Hybridoms oder aus cDNA, die aus mRNA von dem interessierenden Hybridom isoliert wurde, kloniert. Die V-Region-Genfragmente werden mit Exons verknüpft, die konstante Domänen menschlicher Antikörper kodieren, und das erhalte Konstrukt wird in geeigneten Säugetier-Wirtszellen (z.B. Myelom- oder CHO-Zellen) exprimiert.
Um ein noch größeres Humanisierungsniveau zu erreichen, werden nur jene Bereiche der Genfragmente der variablen Region, die die antigenbindenden komplementaritätsbestimmenden Regionen (complementary determining regions, "CDR") der nichtmenschlichen monoklonalen Antikörpergene kodieren, in menschliche Antikörpersequenzen kloniert [siehe z.B. Jones et al., Nature, 321: 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534–36 (1988); und Tempest et al., Bio/Technology, 9: 266–71 (1991)]. Falls erforderlich, wird auch das β-Faltblatt-Gerüst des menschlichen Antikörpers, der die CDR3-Regionen umgibt, modifiziert, um die dreidimensionale Struktur der antigenbindenden Domäne des ursprünglichen monoklonalen Antikörpers besser widerzuspiegeln. (Siehe Kettleborough et al., Protein Engin., 4: 773–783 (1991); und Foote et al., J. Mol. Biol., 224: 487–499 (1992)).
In einem alternativen Ansatz wird die Oberfläche eines interessierenden nichtmenschlichen monoklonalen Antikörpers humanisiert durch Verändern ausgewählter Oberflächenreste des nichtmenschlichen Antikörpers, z.B. durch ortsgerichtete Mutagenese, während alle inneren und kontaktierenden Reste des nichtmenschlichen Antikörpers erhalten bleiben. Siehe Padlan, Molecular Immunol., 28 (4/5): 489–98 (1991).
Die vorstehenden Ansätze werden eingesetzt unter Verwendung von Flt4-neutralisierenden monoklonalen Anti-Flt4-Antikörpern und der Hybridome, die sie produzieren, wie beispielsweise den Antikörpern 9D9F9, um humanisierte Flt4-neutralisierende Antikörper zu erzeugen, die als Therapeutika zur Behandlung oder Linderung von Zuständen geeignet sind, bei denen die Flt4-Expression nachteilig ist.
B. Menschliche Flt4-neutralisierende Antikörper aus Phagendisplay
Menschliche Flt4-neutralisierende Antikörper wurden durch Phagendisplay-Techniken erzeugt, wie sie beispielsweise in Aujame et al., Human Antibodies, 8 (4): 155–168 (1997); Hoogenboom, TIBTECH, 15: 62–70 (1997); und Rader et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8: 503–508 (1997), beschrieben sind, die sämtlich durch Inbezugnahme aufgenommen sind. Zum Beispiel werden die variablen Regionen in Form von Fab-Fragmenten oder verknüpften Einzelketten-Fv-Fragmenten an den Aminoterminus des kleinen Hüllproteins pIII des filamentösen Phagen fusioniert. Die Expression des Fusionsproteins und die Aufnahme desselben in die Hülle des reifen Phagen führt zu Phagenpartikeln, die einen Antikörper auf ihrer Oberfläche präsentieren und das genetische Material enthalten, das den Antikörper kodiert. Eine Phagenbibliothek, die solche Konstrukte um fasst, wird in Bakterien exprimiert, und die Bibliothek wird nach Flt4-spezifischen Phagen-Antikörpern unter Verwendung von markiertem oder immobilisiertem Flt4 als Antigensonde durchsucht (gescreent).
C. Menschliche Flt4-neutralisierende Antikörper aus transgenen Mäusen
Menschliche Flt4-neutralisierende Antikörper werden, wie im wesentlichen in Bruggemann und Neuberger, Immunol. Today, 17 (8): 391–97 (1996) und Bruggemann und Taussig, Curr. Opin. Biotechnol., 8: 455–58 (1997), beschrieben, in transgenen Mäusen erzeugt. Transgene Mäuse, die V-Genabschnitte in Keimbahn-Konfiguration enthalten, und die diese Gene in ihrem lymphoiden Geweben exprimieren, werden mit einer Flt4-Zusammensetzung unter Verwendung konventioneller Immunisierungsverfahren immunisiert. Hybridome werden unter Verwendung von B-Zellen von den immunisierten Mäusen unter Verwendung konventioneller Protokolle erzeugt und gescreent, um Hybridome zu identifizieren, die menschliche Anti-Flt4-Antikörper ausscheiden (z.B. wie oben beschrieben).
D. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper, die spezifisch an Flt4 binden, und die spezifisch an andere Antigene binden, die für die Pathologie und/oder Behandlung relevant sind, werden unter Verwendung von Standardverfahren, die in der Literatur beschrieben wurden, hergestellt, isoliert und getestet. Siehe z.B. Pluckthun & Pack, Immunotechnology 3: 83–105 (1997); Carter et al., J. Hematotherapy, 4: 463–470 (1995); Renner & Pfreundschuh, Immunological Reviews, 1995, No. 145, S. 179–209; Pfreundschuh U.S.-Patent Nr. 5,643,759; Segal et al., J. Hematotherapy, 4: 377–382 (1995); Segal et al.. Immunobiology, 185: 390–402 (1992); und Bolhuis et al., Cancer Immunol. Immunother., 34: 1–8 (1991), die sämtlich durch Inbezugnahme zur Gänze hier aufgenommen sind.
BEISPIEL 30
Tiermodelle zur Demonstration der Wirksamkeit von Anti-Flt4-Therapien für die Behandlung von Krebsen
Es ist vorgesehen, dass jedes für Krebstherapien akzeptierte Tier zur Demonstration der Wirksamkeit von Anti-Flt4-Therapien für die Krebsbehandlung nützlich sein würde. Beispielhafte Modelle für die Demonstration der Wirksamkeit für die Behandlung von Brustkrebsen unter Verwendung von Standard-Dosis-Wirkungsstudien beinhalten jene, die in Tekmal und Durgam, Cancer Lett., 118 (1): 21–28 (1997); Moshakis et al., Br. J. Cancer, 43: 575–580 (1981); und Williams et al., J. Nat. Cancer Inst., 66: 147–155 (1981), beschrieben sind. Zusätzlich zu Mausmodellen, sind Hunde- und Schweinemodelle vorgesehen, da zumindest einige Anti-Human-Flt4-Antikörper (z.B. die 9D9-Antikörper) auch Flt4 von Hund und Schwein erkennen. Tumorgröße und Nebenwirkungen werden überwacht, um die therapeutische Wirksamkeit gegenüber den Kontrollen zu demonstrieren.
BEISPIEL 31
Lösliches Flt4 hemmt VEGF-C-vermitteltes Tumorwachstum und Metastase
Um die Rolle von VEGF C bei der Tumorigenese in vivo zu demonstrieren, wurden menschliche MCF-7-Bustkarzinomzellen, die rekombinanten VEGF C überexprimierten, orthotopisch in SCID-Mäusen implantiert. Die VEGF-C-Überexpression erhöhte das Tumorwachstum, hatte jedoch, anders als die VEGF-A-Überexpression, wenig Wirkung auf die Tumorangiogenese. Auf der anderen Seite förderte VEGF-C stark das Wachstum von tumorassoziierten Lymphgefäße, die in der Tumorperipherie üblicherweise mit den Tumorzellen infiltriert wurden. Diese Wirkungen von VEGF C wurden durch ein lösliches VEGFR-3-Fusionsprotein gehemmt. Diese Daten zeigen, dass VEGF-C Tumorwachstum und/oder -metastase über die Lymphgefäße hochregulieren kann, und dass diese Wirkungen durch Blockierung der Wechselwirkung zwischen VEGF-C und dessen Rezeptor(en) gehemmt werden kann. Insbesondere kann ein löslicher VEGFR-3/Flt4 verwendet werden, um diese Wechselwirkung zu blockieren.
Materialien und Methoden
A. Herstellung von Plasmid-Expressionsvektoren
Die für den menschlichen VEGF-C oder VEGF₁₆₅ kodierenden cDNAs wurden in den pEBS7-Plasmid eingeführt (Peterson und Legerski, Gene, 107: 279–84, 1991). Derselbe Vektor wurde verwendet für die Expression der löslichen Rezeptorchimären VEGFR-3-Ig, enthaltend die ersten drei Immunglobulinhomologiedomänen von VEGFR-3, fusioniert an die Fc-Domäne der menschlichen Immunglobulin-β-Kette, und VEGFR-1-Ig, enthaltend die ersten fünf Ig-Homologiedomänen von VEGFR-1 in einem ähnlichen Konstrukt (Achen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95: 548–53, 1998).
B. Herstellung und Analyse von transfizierten Zellen
Der MCF-7S1-Subklon der menschlichen MCF-7-Brustkarzinomzellinie wurde durch Elektroporation mit der Plasmid-DNA transfiziert und stabile Zellpools wurden wie vorher beschrieben (Egeblad und Jaattela, Int J Cancer, 86: 617–25, 2000) selektiert und kultiviert. Die Zellen wurden in methionin- und cysteinfreiem MEM (Gibco), versetzt mit 100 μCi/ml [³⁵S]-Methionin und [³⁵S]-Cystein (Redivue Pro-Mix, Amersham Pharmacia Biotech), metabolisch markiert. Die markierten Wachstumsfaktoren wurden unter Verwendung von Antikörpern gegen VEGF-C (Joukov, et al., EMBO J, 16: 3898–911, 1997) oder VEGF (MAB293, R&D Systems) aus dem konditionierten Medium immunpräzipitiert. Die Immunkomplexe und die VEGFR-Ig-Fusionsproteine wurden unter Verwendung von Protein-A-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) präzipitiert, zweimal in 0,5% BSA, 0,02% Tween 20 in PBS und einmal in PBS gewaschen und durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert.
C. Zellproliferations- und Tumorigenesetests
Zellen (20.000/Napf) wurden in vier Parallelen in 24-Näpfen plattiert, auf parallelen Platten nach 1, 4, 6 oder 8 Tagen trypsinisiert und unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt. Frisches Medium wurde nach 4 und 6 Tagen bereitgestellt. Für den Tumorigenesetest wurden subkonfluente Kulturen durch Trypsinisierung geerntet, zweimal gewaschen, und 10⁷ Zellen in PBS wurden in die Fettpolster der zweiten (axillären) Milchdrüse von ovarektomisierten SCID-Mäusen inokuliert, die subkutane 60-Tage-Retard-Pellets, enthaltend 0,72 17β-Estradiol (Innovative Research of America), trugen. Die Ovarektomie und die Implantation der Pellets wurde 4–8 Tage vor der Tumorzellinokulation durchgeführt. Tumorlänge und -breite wurden zweimal wöchentlich in blinder Weise gemesse nen und das Tumorvolumen wurde als Länge × Breite × Tiefe × 0,5 berechnet, wobei angenommen wurde, das der Tumor ein halbellipsoid ist und die Tiefe dieselbe wie die Breite ist (Benz et al., Breast Cancer Res Treat, 24: 85–95, 1993).
D. Histologie und Quantifizierung der Blutgefäße
Die Tumoren wurden exzidiert, für 24 Stunden in 4% Paraformaldehyd (pH 7,0) fixiert und in Paraffin eingebettet. Schnitte (7 μm) wurden mit monoklonalen Antikörpern gegen PECAM-1 (Pharmingen), VEGFR-3 (Kubo et al., Blood, 96: 546–553, 2000) oder PCNA (Zymed Laboratories) oder polyklonalen Antikörpern gegen LYVE-1 (Banerji et al., JCell Biol 144: 789–801, 1999), VEGF-C (Joukov et al., EMBO J, 16: 3898–911, 1997) oder Laminin nach veröffentlichten Protokollen (Partanen et al., Cancer, 86: 2406–12, 1999) immungefärbt. Die Durchschnitt der Anzahl PECAM-1-positiver Gefäße wurde an Hand dreier Flächen (60 × Vergrößerung) mit der höchsten Gefäßdichte (Gefäß-"Hotspots") in einem Schnitt bestimmt. Alle histologischen Analysen wurden unter Verwendung von Blind-Tumorproben durchgeführt.
E. Adenoviral Expression von löslichem VEGFR-3 und Evans-Blau-Dränagetest
Die für das VEGFR-3-Ig-Fusionsprotein kodierende cDNA wurde in das pAdBgIII-Plasmid subkloniert und die Adenoviren wurden wie vorher beschrieben hergestellt (Laitinen et al., Hum Gene Ther., 9: 1481–6, 1998). Die VEGFR-3-Ig- oder LacZ-Kontroll-Adenoviren (Laitinen et al., Hum Gene Ther., 9: 1481–6, 1998), 10⁹ PFU/Maus, wurden 3 Stunden vor der Tumorzellinokulation intravenös in die SCID-Mäuse injiziert. Nach 3 Wochen wurden vier Mäuse aus jeder Gruppe narkotisiert, die ventrale Haut wurde geöffnet und wenige Mikroliter 3% Evans-Blau-Farbstoff (Sigma) in PBS wurden in den Tumor injiziert. Die Dränage des Farbstoffes aus dem Tumor wurde makroskopisch verfolgt.
Ergebnisse
A. Expression von VEGF-C oder VEGFR-3-Ig beeinflusst das MCF-7-Zellwachstum in vitro nicht
Die menschlichen MCF-7-Brustkarzinomzellen wurden mit Expressionsplasmiden, die den menschlichen Vollängen-VEGF-C oder ein lösliches VEGFR-3-Fusionsprotein (VEGFR-3-Ig) kodieren, wie oben beschrieben transfiziert, und stabile Zellpools wurden selektiert. Zum Vergleich wurden menschlicher VEGF₁₆₅ oder VEGFR-1-Ig in denselben Zellen exprimiert. Immunpräzipitation wurde verwendet, um die konditionierten Medien dieser Zellen auf die effiziente Produktion und Sekretion des Proteins zu analysieren. Immunpräzipitate von VEGF-C, VEGF oder der löslichen Rezeptorproteine aus metabolisch markierten MCF-7-Zellen wurden unter reduzierenden Bedingungen analysiert.
Diese Untersuchung ergab, dass eine Überexpression von VEGF-C, VEGF, löslichem VEGFR-3-Fusionsprotein oder löslichem VEGFR-1-Fusionsprotein die Proliferation der MCF-7-Brustkarzinomzellen in vivo nicht beeinflusst. Wenn die Zellen in 24-Napf-Platten geimpft wurden und das Wachstum unter Verwendung eines Hämozytometers gemessen wurde, wurde gefunden, dass die Wachstumsrate der transfizierten Zellen nicht beeinflusst wurde.
B. VEGF-C erhöht das Tumorwachstum, ohne die Tumorangiogenese zu beeinflussen.
Um die In-vivo-Wirkungen von VEGF-C festzustellen, wurden die MCF-7-Zellpools in die Brustdrüsen-Fettgewebepolster von ovarektomierten SCID-Mäusen implantiert, die Retard-Estrogen-Pelletes trugen, um ein konstantes Niveau des Hormons bereitzustellen, das erforderlich ist, um das Wachstum des MCF-7-Tumors zu unterstützen.
Die Überexpression von VEGF-C erhöhte das Tumorwachstum signifikant (VEGF-C: 545 mm³ ± 110 mm³, Kontrolle: 268 mm³ ± 69 mm³ an 13 Tagen, n = 8, p < 0,0001, t-Test nach Student) die Wirkung einer VEGF-C-Überexpression auf das Tumorwachstum war jedoch weniger dramatisch als die von VEGF-A (VEGF-A: 1136 mm³ ± 339 mm³, Kontrolle: 189 mm³ ± 57 mm³ an 13 Tagen, n = 6, p < 0,0001, t-Test nach Student). Das erhöhte Tumorwachstum wurde neutralisiert durch Mischen der VEGF-C oder VEGF überexprimierenden MCF-7-Zellen mit Zellen, die die löslichen VEGFR-3- beziehungsweise VEGFR-1-Fusionsproteine exprimierten. Darüber hinaus wurde gefunden, dass das erhöhte Wachstum der VEGF-C überexprimierenden Tumoren auch durch ein zirkulierendes lösliches VEGFR-3-Ig gehemmt wurde, das durch einen intravenös injizierten rekombinanten Adenovirus in der Leber exprimiert wurde.
Um die Wirkung von VEGF-C auf die Tumorangiogenese zu untersuchen, wurden Schnitte des Tumors mit PECAM-1 gefärbt, einem endothelialen Antigen, das primär in Blutgefäßen und nur schwach in Lymphgefäßen exprimiert wird. Die Quantifizierung der PECAM-1-positiven Gefäße in den Tumoren ergab, dass eine Überexpression von VEGF-C nur eine sehr geringe Wirkung auf die Dichte der Tumor-Blutgefäße hatte (40,2 ± 12,2 Gefäße/mikroskopischem Gesichtsfeld für VEGF-C-Tumoren, n = 18 und 36,6 ± 11,6 für Kontroll-Tumoren, n = 23, Durchschnitt aus drei verschiedenen Experimenten). Im Gegensatz dazu erhöhte die Überexpression von VEGF-A die Gefäßdichte ungefähr um das zweifache.
C. Die VEGF-C-Überexpression ist verbunden mit der Lymphangiogenese und dem intralymphatischen Wachstum von Tumorzellen
Die Wirkung von VEGF-C auf tumorassoziierte Lymphgefäße wurde analysiert durch Immunfärbung auf den lymphspezifischen Marker LYVE-1 (Banerjiet al., J Cell Biol, 144: 789–801, 1999). Dieser Marker ergab stark hyperplastische Lymphgefäße in der Peripherie der VEGF-C-überexprimierenden Tumoren. Das "Proliferating-Cell-Nuclear-Antigen" (PCNA) wurde in vielen der LYVE-1-positiven Endothelzellen detektiert, was zeigt, dass diese Lymphgefäße aktiv proliferierten. Die Bestätigung der lymphatischen Identität der Gefäße wurde erhalten durch Färbung auf VEGFR-3 und durch das Fehlen einer Färbung auf die Basalmembrankomponente Laminin. Dünne Lymphgefäße waren auch innerhalb einiger der VEGF-C-überexprimierenden Tumoren vorhanden.
Die Lymphgefäße in der Tumorperipherie wurden im allgemeinen von den VEGF-C-positiven Tumorzellen infiltriert. In einem deutlichen Gegensatz dazu enthielten die VEGF-überexprimierenden und die Kontroll-Tumoren keine oder nur wenige Lymphgefäße.
D. Die VEGF-C-induzierte Lymphangiogenese wird durch ein zirkulierendes lösliches VEGFR-3-Fusionsprotein gehemmt
Bei menschlichem Brustkrebs wird das Sentinelknoten-Verfahren verwendet, um die Lymphdränage und Metastasenstreuung zu untersuchen (für eine Übersicht siehe Parker et al., Radiol Clin North Am, 38: 809–23, 2000). Um die Lymphdränage der MCF-7-Tumoren zu verfolgen, wurde der Evans-Blau-Farbstoff in VEGF-C-überexprimierenden oder Kontroll-Tumoren in Mäusen injiziert, die mit VEGFR-3-Ig oder Kontroll-Adenovirus infiziert waren. Kontrollexperimente zeigten, dass die Infektion kultivierter menschlicher embryomaler Nierenzellen mit dem VEGFR-3-Ig-Adenovirus zur Sekretion großer Mengen des löslichen VEGFR-3-Ig-Fusionsproteins führte und die intravenöse Infektion von Mäusen zu hohen systemischen Niveaus des VEGFR-3-Ig-Fusionsproteins im Serum führte. Die Injektion von Evans-Blau-Farbstoff in die Tumoren führte zu einer Färbung der Lymphgefäße, nicht jedoch der Blutgefäße, und ergab im Vergleich zu Kontroll-Tumoren eine erhöhte Zahl von erweiteren Lymphgefäßen, die die VEGF-C-überexprimierenden Tumoren umgaben. Die meisten der erweiterten Lymphgefäße waren bei VEGF-C-überexprimierenden Tumoren in Mäusen, die mit dem VEGFR-3-Ig-Adenovirus behandelt wurden, nicht vorhanden.
Die vorstehenden Daten zeigen, dass die VEGF-C-Überexpression in MCF-7-Brustdrüsentumoren stark und spezifisch das Wachstum von tumorassoziierten Lymphgefäßen induzieren, jedoch keine wesentlichen Effekte auf die Tumorangiogenese ausüben. Darüber hinaus wird gezeigt, dass das VEGF-C-vermittelte verstärkte Tumorwachstum und die tumorassoziierte Lymphangiogenese durch ein lösliches VEGFR-3-Fusionsprotein, d.h., ein Mittel, das ausgewählt wurde, um die VEGF-C-vermittelte Stimulation von Endothelzellen, die VEGFR-3 exprimieren, zu blockieren, gehemmt wurden.
Aufgrund des Fehlens eines spezifischen Markers ist es in der Vergangenheit schwierig gewesen, festzustellen, ob Tumoren die Lymphangiogenese aktiv induzieren können oder eher die bereits existierenden Lymphgefäße durch übermäßiges Wachstum überwachsen und aufgrund des hohen Drucks in der intersti tiellen Flüssigkeit innerhalb des Tumors zusammenpressen. Daten von verschiedenen Versuchsmodellen haben kürzlich nahe gelegt, dass das Letztere auftritt (Leu et al., Cancer Res, 60: 4324–7, 2000; Stohrer et al., Cancer Res, 60: 4251–5, 2000). Hier wird zum ersten Mal gezeigt, dass die Überexpression von VEGF-C das Wachstum von Lymphgefäßen in Assoziation mit experimentellen Tumoren induzieren kann. Die VEGF-C-induzierten Lymphgefäße in der Tumorperipherie waren stark hyperplastisch und größtenteils mit Tumorzellen gefüllt, wohingegen die Lymphgefäße innerhalb des Tumors abgeflacht waren und kein Lumen aufwiesen. Anders als lymphatische Endothelzellen in normalen adulten Geweben waren die lymphatischen Endothelzellen, die mit den MCF-7-Tumoren assoziiert waren, aktiv proliferierend. Es scheint daher, dass die meisten der peri- und intratumoralen Lymphgefäße durch Proliferation der Endothelzellen von vorher existierenden Lymphgefäßen erzeugt wurden.
Die Streuung von Krebs durch die Lymphgefäße in die regionalen Lymphknoten ist lange Zeit ein wichtiger prognostischer Indikator für die klinische Praxis gewesen. Das in diesem Beispiel demonstrierte Wachstum von Tumorzellen innerhalb der mit den VEGF-C-überexprimierenden Tumoren assoziierten erweiterten Lymphgefäße ähnelt sehr der peritumoralen lymphatischen Invasion, die mit der metastatischen Streuung zu den Lymphknoten und der geringen Überlebensrate beim menschlichem Brustkrebs korreliert ist (Lauria et al., Cancer, 76: 1772–8, 1995). Die hier berichteten Daten geben daher einen Hinweis, dass die Expression von VEGF-C die Tumormetastase über das lymphatische System fördert. Während Beispiel 28 und andere Daten darauf hindeuten, das VEGFR-3 in den Blutgefäßen vieler Arten solider Tumoren (Valtola et al., Am JPathol, 154: 1381–90, 1999; Partanen et al., Cancer, 86: 2406–12, 1999; Kubo et al., Blood, 96: 546–553, 2000) hochreguliert wird, zeigt das vorliegende Beispiel ein Tumormodell, bei dem die Wirkungen der Überexpression von VEGF-C hauptsächlich lymphangiogen waren.
Die Wirkung von VEGF-C auf das Tumorwachstum war nicht einfach auf die Variation zwischen den Zellpools zurückzuführen, wie durch die Fähigkeit des VEGFR-3-Fusionsproteins gezeigt wird, das Wachstum von VEGF-C-überexprimierenden Tumoren zu hemmen. Durch Injektion von Evans-Blau-Farbstoff in die Tumoren wurde gezeigt, dass eine erhöhte Zahl von großen dränierenden Lymphgefäßen mit den VEGF-C-überexprimierenden Tumoren assoziiert war. Es ist möglich, dass die höhere Zahl von funktionsfähigen Lymphgefäßen zu einer besseren Lymphdränage und somit zu einem niedrigeren interstitiellen Druck und verbesserter Blutperfusion der VEGF-C-überexprimierenden Tumoren führen kann. Unabhängig davon, ob die VEGF-C-/D-VEGFR-3-vermittelte Tumorprogression für einen bestimmten Tumor durch Angiogenese, Lymphangiogenese oder beides abläuft, sollten die erfindungsgemäßen therapeutischen Verfahren diese Prozesse hemmen.
Schließlich zeigen die obigen Ergebnisse, das durch Tumorzellen hergestelltes VEGF-C das Wachstum von Lymphgefäßen um Tumoren herum induzieren und somit die intralymphatische Streuung von Krebs erleichtern kann. Die Daten deuten darauf hin, dass die Hemmung der tumorassoziierten Lymphangiogenese, zum Beispiel durch Gentherapie, die lösliche VEGFR-3-Proteine einsetzt, einen wertvollen Weg zur Hemmung der Tumormetastase bildet.
BEISPIEL 32
Hemmung der Lymphangiogenese in Mäusen, die löslichen VEGFR-3/Flt4 exprimieren
Das vorstehende Beispiel zeigte, das VEGF-C das Tumorwachstum in vivo verstärkte und diese Förderung des Tumorwachstum mit Lymphgefäßen assoziiert war. Diese Wirkungen von VEGF-C werden durch ein lösliches VEGFR-3-Fusionsprotein gehemmt. Das vorliegende Beispiel gibt einen weiteren Hinweis, dass löslicher VEGFR-3 ein potenter Inhibitor der VEGF-C/VEGF-D-Signalgebung ist und bei Expression in der Haut von transgenen Mäusen die Lymphangiogenese hemmt und eine Rückbildung von bereits gebildeten Lymphgefäßen induziert, während die Blutvaskulatur intakt bleibt.
Insbesondere zeigt das vorliegende Beispiel, dass ein chimäres Protein, bestehend aus einem ligandenbindenden Bereich des extrazellulären Bereichs von VEGFR-3, angefügt an die Fc-Domäne der Immunglobulin(Ig)-γ-Kette (VEGFR-3-If), die Aktivität von VEGF-C und VEGF-D bei Expression in der Maus-Epidermis unter dem Keratin-14(K14)-Promotor neutralisiert und die Bildung der dermalen lymphatischen Vaskulatur hemmt. Da das Blutgefäßnetzwerk in diesen Mäusen normal bleibt, scheint die Hemmung spezifisch für die Lymphgefäße zu sein. VEGFR-3-Ig induzierte die Rückbildung von Lymphgefäßen während der embryonalen Entwicklung, was darauf hinweist, dass die kontinuierliche Signalgebung durch diesen Rezeptor für die Aufrechterhaltung der lymphatischen Vaskulatur wesentlich ist.
Materialien und Methoden
A. Herstellung von VEGF-C-, VEGF-D- und VEGFR-Ig-Fusionsproteinen
Die reife Form von menschlichem VEGF-C ist in Beispiel 31 und durch Joukov et al., (EMBO J. 16: 3898–3911, 1997) beschrieben worden. VEGF-D wurde erhalten von R&D Systems (Minneapolis, Minnesota). Die VEGFR-1-Ig- und VEGFR-3-Ig-Proteine, bestehend aus den an menschliche IgG1-Fc-Domäne fusionierten ligandenbindenden Domänen von menschlichen VEGFRs, wurden in Drosophila-S2-Zellen (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien) hergestellt.
B. VEGFR-3-Biotests
Die VEGFR-3/EpoR-Chimäre exprimierende Ba/F3-Zellen (Achen, Eur. J. Biochem. 267, 2505–2515, 2000) wurden in drei Parallelen in 96-Napf-Mikrotiterplatten zu 15.000 Zellen/Napf, versetzt mit 100 ng/ml VEGF-C und den angegebenen Konzentrationen von VEGFR-Ig-Proteinen, angeimpft. Nach 48 Stunden wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch Zugabe von MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (Sigma), 0,5 mg/ml) bestimmt, gefolgt von weiteren 2 h Kultivierung, Zugabe einer gleichen Menge Zelllyselösung (10% SDS, 10 mM HCl) und Inkubation über Nacht bei 37°C. Die Absorption wurde bei 540 nm gemessen.
C. Erzeugung von transgenen Mäusen
Die Sequenz, die die menschlichen VEGFR-3-Ig-Homologiedomänen 1–3 kodiert, wurde mittels PCR amplifiziert. Die für diesen Zweck eingesetzten Primer waren: 5'-TACRAAGCTTTTCGCCACCATGCAG-3' (SEQ ID NO: 23) und '5-TACAGGATCCTCATGCACAATGACCTC-3' (SEQ ID NO: 24).
Das PCR-Produkt wurde "in frame" mit dem menschlichen IgGI-Fc-Schwanz in den Vektor plg-plus (Ingenius, R&D Systems) kloniert. Das VEGFR-3-Ig-Konstruct wurde dann in den menschlichen Keratin-14-Promotor-Expressionsvektor transferiert. Das Expressionskassettenfragment wurde in befruchtete Maus-Oozyten der FVB/NIH- und DBAxBalbC-Hybridstämme injiziert, um sieben Linien von K14-VEGFR-3-Ig-Mäusen zu erzeugen. Die transgene Expression wurde analysiert und der Phänotyp von allen drei das Transgen exprimierenden Gründerlinien wie unten beschrieben bestätigt.
D. Analyse der Transgen-Expression
Für das Northern-Blotting wurden 10 μg aus Haut extrahierter Gesamt-RNA in 1% Agarose einer Elektrophorese unterzogen, auf Nylonfilter (Nytran) übertragen, mit den entsprechenden [³²P]-markierten cDNA-Sonden hybridisiert und einer Autoradiographie ausgesetzt. Für das Western-Blotting wurden Hautbiopsien in dem Lysepuffer (20 mM Tris, pH 7,6, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 50 mM NaF, 1% Triton-X100), versetzt mit 1 mM PMSF, 1 mU/ml Aprotinin, 1 mM Na₃V0₄ und 10 μg/ml Leupeptin, homogenisiert. Die Ig-Fusionsproteine wurden aus 1 mg Gesamt-Protein präzipitiert und in SDS-PAGE getrennt, auf Nitrozellulose übertragen und unter Verwendung von Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Kaninchenantikörpern gegen menschliches IgG (DAKO, Carpinteria, Kalifornien) und dem "Enhanced-Chemiluminescence"-System detektiert.
E. Immunhistochemie und TUNEL-Färbung
Paraffinschnitte (5 μm) von mit 4% Paraformaldehyd (PFA) fixierten Geweben wurden unter Verwendung von monoklonalen Ratten-Antikörpern gegen Maus-VEGFR-3 (Kubo et al., Blood 96: 546–553, 2000) oder CD31/PECAM-1 (PharMingen, San Diego, Kalifornien), polyklonalen Kaninchenantikörpern gegen Maus-LYVE-1 (Banerji et al., J Cell Biol, 144: 789–801, 1999), oder biotinylierten monoklonalen Mausantikörpern gegen menschliche IgG-Fc-Domäne (Zymed, San Diego, Kalifornien) gefärbt. Für die TUNEL-Färbung wurde eine Detektion der DNA-Fragmentierung unter Verwendung des In-situ-Zelltod-Detektionskits (Fluoreszein; Roche, Indianapolis, IN) durchgeführt.
F. Visualisierung von Blut- und Lymphgefäßen
Für die Visualisierung von Blutgefäßen (Thurston et al. Science 286, 2511–2514 (1999) wurden 100 μl 1 mg/ml biotinyliertes Lycopersicon-esculentum-Lektin (Sigma) durch die Oberschenkelvenen (IV) injiziert und für 2 Min zirkulieren gelassen. Nach Fixierung durch Perfusion mit 1% PFA/0,5% Glutaraldehyd in PBS wurde gebundenes Lektin durch die ABC-3,3'-diaminobenzidinperoxidasereaktion sichtbar gemacht. In VEGFR-3-+/LacZ-Mäusen wurden die Lymphgefäße anschließend mit dem β-Galaktosidasesubstrat X-Gal (Sigma, St. Louis, MO) gefärbt. Für die Sichtbarmachung funktionsfähiger Lymphgefäße wurde Evans-Blau-Farbstoff (5 mg/ml; Sigma, St. Louis, MO) in die Fußballen der hinteren Gliedmaßen injiziert, oder TRITC-Dextran (Sigma, 8 mg/ml) wurde in das Ohr oder den Schwanz injiziert und die Lymphgefäße wurden durch Licht- beziehungsweise Fluoreszenzmikroskopie untersucht.
G. Detektion des VEGFR-3-Ig-Proteins in Serum
ELISA-Platten (Nunc Maxisorp, Kopenhagen, Dänemark) wurden mit Mausantikörpern gegen menschliches IgG (Zymed, 2 μg/ml in PBS) oder menschlichen VEGFR-3 (Klon 7B8, 4 μg/ml) beschichtet. Die Maus-Seren wurden in dem Inkubationspuffer (5 mg/ml BSA, 0,05% Tween 20 in PBS) verdünnt und die Bindung wurde für 2 h bei Raumtemperatur ermöglicht. Die Platten wurden dann 3mal mit Inkubationspuffer vor der Zugabe von Maus-Anti-Human-IgG1 (Zymed, 1:500) für 1 h gewaschen. Streptavidin, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Zymed, 1:5000), wurde dann in den Näpfen für 30 min inkubiert, gefolgt von der Zugabe des Substrats (1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0,1 M Diethanolamin, pH 10.3) und Absorptionsmessung bei 405 nm.
H. Magnetresonanzbildgebung
MRI-Daten wurden unter Verwendung von einer s.m.i.s.-Konsole (Surrey Medical Imaging Systems, Guildford, UK), über eine Schnittstelle verknüpft mit einem 9,4-T-Vertikalmagneten (Oxford Instruments, Oxford, UK), erfasst. Eine Oberflächenspule mit einer einzelnen Schleife (Durchmesser 35 mm) wurde für die Signalübertragung und die Detektion verwendet. Eine T2-gewichtete (TR 2000 ms, TE 40 ms, 4 Abtastungen/Linie) Mehrschicht-Spin-Echo-Sequenz wurde mit einem Gesichtsfeld ("field of view, FOV) von 25,6 mm² (Matrixgröße: 256 × 128) und einer Schichtdicke von 1,3 mm in Querorientierung verwendet. Bei 1,2 ppm zentrierte Sättigungsimpulse wurden verwendet, um die Fettsignale in den T2-Bildern zu verringern. Diffusionsgewichtete MRI wurde erlangt unter Verwendung monopolarer Diffusionsgradienten (b-Wert ≈ 800 s/mm²) entlang der Schichtachsen in der Spin-Echo-Sequenz (TR 2000 ms, TE 40 ms), und der apparente Wasserdiffusionskoeffizient (ADC) wurde errechnet durch Anpassung der MRI-Daten als Funktion der b-Werte in eine einzelne Exponentialfunktion.
Ergebnisse
A. Lösliches VEGFR-3 hemmt die VEGF-C-vermittelte Signalgebung in vitro
Um die VEGF-C-Signalgebung durch VEGFR-3 zu hemmen, wurde ein aus den ersten drei Ig-Homologiedomänen von VEGFR-3 und der IgG-Fc-Domäne bestehendes Fusionsprotein eingesetzt. Das VEGFR-3-Ig band VEGF-C und VEGF-D mit derselben Effizienz wie die Vollängen-Extrazellulardomäne und hemmte die VEGF-C-induzierte VEGFR-3-Phosphorylierung und die anschließende p42/p44-Mitogenen-aktivierte-Proteinkinase(MAPK)-Aktivierung in VEGFR-3-exprimierenden Endothelzellen. Im Gegensatz dazu beeinflusst ein ähnliches VEGFR-1-Ig-Fusionsprotein, das VEGF-C nicht bindet, die p42/p44-MAPK-Aktivierung nicht.
Die Wirkung von löslichem VEGFR-3 auf die VEGF-C-Signalgebung wurde auch in einem Biotest unter Verwendung eines chimären VEGFR-3/Erythropoietin(Epo)-Rezeptors bestimmt, der in der Lage ist, VEGF-C-abhängige Überlebens- und Proliferationssignale für die IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen in Abwesenheit von IL-3 zu übertragen (Achen et al., Eur. J. Biochem., 267: 2505–2515, 2000). In diesem Zelltest trat eine vollständige Hemmung des VEGF-C-abhängigen Zellüberlebens bei einem molaren Verhältnis von 0,5:1 (VEGFR-3-Ig:VEGF-C) auf, wohingegen VEGFR-1-Ig keine Wirkung hatte. Gleichermaßen beseitigt VEGFR-3-Ig auch das VEGF-D-induzierte Überleben der VEGFR-3/EpoR-Zellen. Im Gegensatz dazu beseitigte selbst ein zehnfacher Überschuss an VEGFR-2-Ig das VEGF-C-abhängige Überleben nur teilweise, möglicherweise aufgrund einer geringeren Affinität von VEGF-C gegenüber VEGFR-2.
B. Lösliches VEGFR-3 hemmt die Bildung von Lymphgefäßen in vivo
Um die hemmende Wirkung von VEGFR-3-Ig in vivo zu bestimmen, wurde das Fusionsprotein unter Kontrolle des K14-Promotors exprimiert, welcher die Transgenexpression zu den basalen Epidermiszellen der Haut lenkt. Die VEGFR-3-Ig-Expression wurde in Mäusen durch Northern-Blotting von Haut-RNA und durch Western-Blotting von Proteinextrakten aus der Haut detektiert. Diese Mäuse schienen gesund und fruchtbar, und wiesen eine normale Lebensspanne auf. Die histologische Untersuchung der Haut ergab eine verdickte Dermis und Unterhautschicht. Antikörperfärbung bestätigte die VEGFR-3-Ig-Expression in den basalen Keratinozyten. Wenn die Hautschnitte auf Marker für das lymphatische Endothel, VEGFR-3 (Jussila et al., Cancer Res. 58: 1599–1604, 1998; Kubo et al., Blood 96: 546–553, 2000) und LYVE-1 (Banerji et al., J Cell Biol, 144: 789–801, 1999) gefärbt wurden, wurden in den transgenen Mäusen keine Lymphgefäße beobachtet, obwohl in der Haut von normalen Mäusen Lymphgefäße gefärbt wurden. Im Gegensatz dazu wurden sowohl in der transgenen als auch in der Wildtyp-Haut Blutgefäß auf den panendothelialen Marker PECAM-1/CD31 gefärbt.
C. Lösliches VEGFR-3 unterdrückt die Lymphangiogenese, nicht jedoch die Angiogenese
Um die Lymphgefäße besser sichtbar zu machen wurden die K14-VEGFR-3-Ig-Mäuse mit heterozygoten VEGFR-3+/LacZ-Mäusen gepaart, die p-gal am Flt4-Lokus exprimieren (Dumont et al. Science 282, 946–949, 1998). Wenn "Whole-Mount"-Gewebepräparate der Ohrhaut unter Verwendung des Substrats X-gal gefärbt wurden, wurden keine Lymphgefäße detektiert, wohingegen bei den Kontrollmäusen eine Blaufärbung von Lymphgefäßen sichtbar gemacht wurde. Bei Gefäß-Perfusionsfärbung unter Verwendung von biotinmarkiertem Lektin (Thurston et al. Science 286, 2511–2514, 1999) erschienen die Blutgefäße in den K14-VEGFR-3-Ig-Mäusen normal.
Die Abwesenheit von Lymphgefäßen wurde auch bestätigt unter Verwendung eines Funktionsfähigkeitstests, der das Schicksal von in die Haut injiziertem Evans-Blau-Farbstoff oder TRITC-Dextran verfolgt. Der Farbstoff wurde nach Injektion in die Fußballen der hinteren Gliedmaßen von Wildtyp-Mäusen rasch in den Lymphgefäßen um die Ischiasvene herum angesammelt, wohingegen kein Farbstoff in den Gefäßen in den transgenen Mäusen beobachtet wurde, wo sammelnde Lymphgefäße entweder fehlten oder rudimentär waren. Die Lymphgefäße in den Kontrollmäusen wurden auch unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie für intradermal in das Ohr oder den Schwanz injiziertes TRITC-Dextran sichtbar gemacht, wohingegen solche Gefäße in den transgenen Mäusen nicht beobachtet wurden.
D. Zirkulierender VEGFR-3 ist mit einem vorübergehenden Verlust von Lymphgewebe in inneren Organen verbunden
Im Alter von zwei Wochen besaßen die VEGFR-3-Ig/VEGFR-3+/LacZ-Mäuse im Vergleich zu den Kontroll-VEGFR-3+/LacZ-Wurfgeschwistermäusen, falls überhaupt, lediglich einige wenige dünne und rudimentäre Lymphgefäße in Organen wie dem Zwerchfell, dem Herzen, der Lunge, dem Blinddarm, dem Pankreas, dem Mesenterium und der Speiseröhre. Solche durch X-Gal-Färbung erhaltenen Befunde wurden durch Immunfärbung auf VEGFR-3 und LYVE-1 bestätigt. Darüber hinaus war das Fehlen von Lymphgefäßen im Herzperikard zumindest bei einigen der Mäuse mit einer Ansammlung von perikardialer Flüssigkeit verbunden. In einem Alter von drei Wochen war erneutes Wachstum der Lymphgefäßen ersichtlich. In adulten transgenen Mäusen wiesen lediglich einige Organe wie beispielsweise Herz und Zwerchfell abnormal gemusterte und unvollständig entwickelte Lymphgefäße auf.
Die in den inneren Organen beobachteten Effekte deuten darauf hin, dass das lösliche VEGFR-3-Ig-Protein im Blutstrom zirkuliert. In der Tat wurde das Fusionsprotein im Serum der transgenen Mäusen unter Verwendung eines spezifischen enzymgekoppelten Immunabsorptionstests detektiert; die Titer lagen im Bereich zwischen 100–200 ng/ml, wobei sie in jungen Mäusen am höchsten waren. Auf Grundlage unseres In-vitro-Experiments würden solche Konzentrationen etwa 20–40 ng/ml VEGF-C neutralisieren. Das VEGFR-3-Ig-Protein war im Blutstrom relativ stabil, da intravenös injiziertes VEGFR-3-Ig für mindestens neun Stunden im Serum vorhanden war.
E. Der transgene Phänotyp weist Eigenschaften des Lymphödems beim Menschen auf
Die K14-VEGFR-3-Ig-Mäuse wurden von ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern durch die Schwellung ihrer Füße, die bereits bei Geburt erkennbar war, unterschieden. Ältere Mäuse zeigten eine Verdickung der Haut, eine dermale Fibrose und eine verstärkte Ablagerung von Unterhautfett. Magnetresonanzbildgebung (MRI) ergab prominente T₂-hyperintensive Bereiche in der Fußhaut und im Unterhautgewebe der transgenen Mäuse, was auf verstärkte Flüssigkeitsansammlung hinweist, wohingegen ähnliche Bereiche in den Wurfgeschwister-Kontrollen fehlten. Der apparente Diffusionskoeffizient (ABC) für diese hyperintensiven Flächen betrug 1,99 [0,60] × 10^–3 mm²/s, was höher ist als für normales Gewebe, bei dem der ADC 1,32 [0,21] × 10^–3 mm²/s betrug, und etwa 1–2 Größenordnungen größer als die Werte für Fett (Thurston, et al. Science 286, 2511–2514 (1999). Darüber hinaus variierte die Größe und das Erscheinungsbild der Lymphknoten, insbesondere in den großen paraaortischen Lymphknoten, die die inferiore Vena cava umgeben. Mesentere Lymphknoten und Peyer-Plaques wurden jedoch in den VEGFR-3-Ig-Mäusen beobachtet.
F. Rückbildung der sich entwickelnden Lymphgefäße durch Endothelzellapoptose
Während der Embryogenese tritt ein dramatischer Anstieg der K14-getriebenen Transgenexpression bei E14,5 auf, und bei E16,5 umfasst die Expression die gesamte embryonale Haut (Byrne, et al., Development 120, 2369–2383, 1994). Bei Analyse im VEGFR-3+/LacZ-Hintergrund durch X-Gal-Färbung waren die lymphatischen Netzwerke der Haut zwischen transgenen und Wildtyp-Embryos bei E15 nicht unterscheidbar. Bei E15,5–16,5 hatten sich die Lymphgefäße der transgenen Embryos in einigen Bereichen zurückgebildet. Bei E17,5 bildeten die Lymphgefäße nach wie vor ein kontinuierliches Netzwerk, waren jedoch dünner als in den Kontrolle-Embryos. Bei E18,5 war das lymphatische Netzwerk der Haut bei den transgenen Embryos vollständig zerstört, und nach der Geburt existierten keine oder nur wenige einzelne zerstörte Lymphgefäße in der Haut, die hauptsächlich die großen dermalen Blutgefäße begleiteten. Während der Embryogenese bilden sich die Lymphgefäße daher anfangs in der Haut, bilden sich jedoch zurück, wenn die Expression des Transgens angeschaltet wird. Die Bildung der dermalen Blutvaskulatur wurde jedoch in den K14-VEGFR-3-Ig-Embryos nicht gehemmt, wie durch X-Gal-Färbung im Tie-Promotor-LacZ-Hintergrund gezeigt wurde (Korhonen et al. Blood 86, 1828–1835 (1995).
TUNEL-Färbung wurde verwendet, um Apoptose in Endothelzellen zu detektieren, die durch gleichzeitige Färbung auf PECAM-1 identifiziert wurden. Apoptische Endothelzellen wurden in der Dermis der transgenen Embryos zuerst bei E17,5 und E18,5 beobachtet. In den Wildtyp-Embryos wurde keine Endothelzellapoptose beobachtet. Die TUNEL-positiven Zellen wurden nahezu ausschließlich in VEGFR-positiven Endothelien in der transgenen Haut detektiert, was darauf hindeutet, dass die VEGFR-3-Ig-vermittelte Apoptose auf das lymphatische Endothel gerichtet war.
Das vorliegende Beispiel zeigt, dass lösliches VEGFR-3-Fusionsprotein die Lymphangiogenese hemmt und zu einer Rückbildung existierender fötaler Gefäße in vivo führt. Eine kontinuierliche VEGFR-3-Signalgebung ist daher essenziell für die fötale Entwicklung und Aufrechterhaltung des Lymphgefäßsystems.
Die Abwesenheit von Lymphgefäßen in der Haut von K14-VEGFR-3-Ig-Mäusen war verbunden mit einer Verdickung der Dermis und insbesondere der Unterhautfettschicht wie beim menschlichen Lymphödem – einer Fehlfunktion, die durch Insuffizienz des lymphatischen Systems verursacht wird und durch Schwellung der Extremitäten mit ansteigender Schwere gekennzeichnet ist (Witte et al., Lymphangiogenesis: Mechanisms, significance and clinical implications. in Regulation of Angiogenesis (Hrsg. Goldberg, I. D. & Rosen, E. M.) 65–112 (Birkräuser Verlag, Basel, Schweiz) 1997; Mortimer, Cancer 83, 2798–2802 (1998). Beim primären Lymphödem, das eine ererbte Krankheit ist, sind die oberflächlichen oder subkutanen Lymphgefäße üblicherweise hyperplastisch oder aplastisch, und sie sind nicht in der Lage, Lymphflüssigkeit in den venösen Kreislauf zu transportieren. Das nichterbliche sekundäre oder erworbene Lymphödem entwickelt sich, wenn die Lymphgefäße durch Operation, Strahlung, Infektion oder Trauma geschädigt werden.
Beim Lymhödem sammelt sich eine proteinreiche Flüssigkeit im interstitiellen Raum an, was zu Gewebefibrose und Verfettung, Störung der Wundheilung und Empfänglichkeit gegenüber Infektionen führt. Bei K14-VEGFR-3-Ig-Mäusen gab es einen Mangel hinsichtlich des Tranports von Makromolekülen in der Dermis und, insbesondere bei älteren Mäusen, Zeichen von dermaler Fibrose. Darüber hinaus waren die Schwellung der Füße und die verstärkte Flüssigkeitsansammlung in der Haut und im Unterhautfettgewebe bei den transgenen Mäusen den Symptomen des Lymphödems beim Menschen ähnlich. Der Hautphänotyp der K14-VEGFR-3-Ig-Mäuse hat daher etliche Eigenschaften mit dem menschlichen Lymphödem gemeinsam. Bei Untersuchungen einiger Lymphödemfamilien sind heterozygote, inaktivierende Fehlsinn("Missense")-Mutationen in der Tyrosinkinase-kodierenden Region von Flt4 detektiert worden (Karkkainen et al., Nature Genet., 25: 153–159, 2000; Irrthum et al., Am. J. Hum. Gen. 67: 259–301 2001). Zumindest einige Lymphödempatienten haben aufgrund defekter VEGFR-3-Signalgebung dysfunktionale Lymphbahnen. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtung zeigen die Ergebnisse in diesem Beispiel, dass die Unterbrechung der VEGFR-3-Signalgebung durch das lösliche VEGFR-3-Protein das lymphatische Netzwerk vollständig zerstören und zu einem Lymphödem-ähnlichen Phänotyp führen kann. Darüber hinaus war die Größe und das Erscheinungsbild bestimmter regionaler Lymphknoten, wie in einigen Fällen von Lymphödem, variabel, was darauf hindeutet, das der Lymphfluss und eine funktionsfähige lymphatische Vaskulatur essenziell sind für die Bildung normaler Lymphknoten.
VEGFR-3-Ig induzierte auch die Rückbildung von bereits gebildeten Lymphbahnen. Die Hemmung der VEGF-C- und/oder VEGF-D-Bindung an VEGFR-3 während der Entwicklung führt daher zur Apoptose der lymphatischen Endothelzellen und zur Zersetzung des lymphatischen Netzwerks, was zeigt, dass die kontinuierliche VEGFR-3-Signalgebung für das Überleben der lymphatischen Endothelzellen erforderlich ist. In Zellkultur aktiviert VEGFR-3 biochemische Signalgebungskaskaden, die mit dem Überleben von Endothelzellen verbunden sind. Obwohl transgene Mäuse, die entweder VEGF-C (Jeltsch et al., Science, 276: 1423–1425, 1997) oder VEGF-D in der Haut überexprimieren, eine hyperplastische dermale Lymphvaskulatur entwickeln, bilden sich ihre dermalen Lymphgefäße ebenfalls zurück, wenn sie mit K14-VEGFR-3-Ig-Mäusen gepaart werden. Da beide VEGFR-3-Liganden auch in der Haut exprimiert werden, kann der bei K14-VEGFR-3-Ig-Mäusen beobachtete Phänotyp auch auf eine gleichzeitige Hemmung sowohl von VEGF-C als auch VEGF-D zurückzuführen sein.
Obwohl VEGF-C und VEGF-D für Blutgefäßendothelzellen sowohl in vitro als auch in vivo mitogen sind (Joukov et al. EMBO J. 16, 3898–3911, 1997; Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 548–553, 1998; Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14389–14392, 1998; Witzenbichler et al., Am. J.. Pathol. I 53, 381–394, 1998; Marconcini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9671–9676, 1999) schien VEGFR-3-Ig die Blutgefäße nicht zu beeinflussen. Das späte Einsetzen der K14-Promotor-Expression erklärt möglicherweise die lymphatische Spezifität des VEGFR-3-Ig-Proteins. Ein nennenswerter Anstieg der K14-Promotoraktivität ist bis etwa E14.5–16.5 nicht zu erkennen (Byrne et al., Development 120: 2369–2383, 1994). Obwohl die Expression von endogenem VEGFR-3 in sich entwickelnden Blutgefäßen zuerst bei E8.5 detektiert wird, ist sie in gesundem Blutgefäßendothel bis E14.5–16.5 großenteils herunterreguliert (Dumont et al., Science 282, 946–949 1998; Kaipainen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3566–3570, 1995). Während der Entwicklungsperiode, wenn VEGFR-3 in Blutgefäßen dothel von gesunden Geweben normalerweise nicht mehr auftritt, spielt die VEGFR-3-Signalgebung eine eher geringere Rolle bei der Angiogenese in der Haut als andere Rezeptoren.
Bei jungen VEGFR-3-Ig-Mäusen waren etliche innere Organe nahezu vollständig ohne Lymphgefäße, sie wuchsen jedoch in adulten Mäusen erneut, wenn auch in einigen Organen in einem abnormalen Muster. Das Wachstum und die Aufrechterhaltung der lymphatischen Vaskulatur kann daher in adulten Organen reaktiviert werden. Abnehmende Niveaus der VEGFR-3-Hemmung oder unabhängige Signale aus reifender Bindegewebsmatrix zum Beispiel könnten die Lymphangiogenese reaktiviert haben, es wurde jedoch kein Hinweis erhalten, der nahelegen würde, das erhöhte VEGF-C- oder VEGF-D-Niveaus hierfür verantwortlich waren. Die Verabreichung von VEGF-C durch einen Adenovirus-Vektor in Mengen, die diejenigen übersteigen, die normalerweise in interstitiellen Flüssigkeiten gefunden werden, kann in adulten Geweben zu lymphatischem Wachstum führen. Die Verwendung eines modifizierten VEGF-C, der VEGFR-2 nicht nicht mehr bindet, in der Gentherapie (U.S.-Patent Nr. 6.130.071 Joukev et al., J. Biol. Chem., 273: 6599–6602) kann dessen potentielle Wirkungen auf das Blutgefäßendothel verhindern.
Löslicher VEGFR-3 ist daher ein potenter und spezifischer Inhibitor der Lymphangiogenese in vivo. Der lösliche VEGFR-3 kann das extrazelluläre Fragment von Flt4 umfassen, wie andernorts in der Beschreibung beschrieben. Wie oben gesehen wurde, ist ein bevorzugter löslicher VEGFR-3 einer, der die ersten drei Domänen von VEGFR-3 umfasst, es sollte jedoch verstanden werden, das der lösliche VEGFR-3 ein Fragment von VEGFR-3 sein kann, das mehr oder weniger von der Wildtyp-Sequenz von VEGFR-3, die in 2 angegeben ist, umfasst. Zum Beispiel kann das lösliche Peptid auch einen oder mehrere von IgIV, IgV, IgVI, IgVII umfassen. Alternativ kann es sein, dass ein löslicher VEGFR-3 lediglich IgI in jeder Kombination mit ein oder mehreren der Domänen, umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus IgII, IgIII, IgIV, IgV, IgVI and IgVII.
Darüber hinaus etabliert das vorliegende Beispiel auch ein Mausmodell, das Eigenschaften von menschlichem Lymphödem aufweist. Da bein Lymphödem immer die Haut involviert ist, ist dieses Mausmodell nützlich zum Verständnis und zur Charakterisierung dieser Erkrankung und beim Testen von neuen Therapien, die bei menschlichen Patienten angewendet werden könnten.
Während die Erfindung hier in Verbindung mit bestimmten Ausführungsformen davon beschrieben wurde, wird es ersichtlich sein, dass sie weiter modifiziert werden kann, und diese Anmeldung alle Variationen, Verwendungen oder Adaptationen der Erfindung abdecken soll, die grundsätzlich den Prinzipien der Erfindung folgen, einschließlich solcher Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, wie sie innerhalb der bekannten und üblichen Praxis des Fachgebietes, zu dem die Erfindung gehört, aufkommen, und wie sie auf die wesentlichen hier vorstehend beschriebenen Merkmale angewendet werden mögen und wie sie im Bereich der angefügen Ansprüche liegen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gereinigtes Polypeptid umfassend einen Teil einer extrazellulären Domäne (EC) eines Säuger-Gefäße-Endothelwachstumsfaktorrezeptors-3 (VEGFR-3); wobei der Teil sich an mindestens einen VEGFR-3-Liganden bindet und mindestens die ersten, zweiten und dritten immunoglobulinähnlichen Domänen der VEGFR-3-EC umfasst und wobei dem Polypeptid die VEGFR-3-Immunoglobulindomänen IV–VII fehlen; und wobei das Polypeptid ein lösliches Polypeptid ist, dem jegliche Transmembrandomäne fehlt.
Gereinigtes Polypeptid nach Anspruch 1, wobei der Teil der Säuger-VEGFR-3-EC im Wesentlichen aus den ersten, zweiten und dritten Immunoglobulindomänen der VEGFR-3-EC besteht.
Gereinigtes Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei der VEGFR-3 ein menschlicher VEGFR-3 ist.
Gereinigtes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–3, wobei das Polypeptid des weiteren eine immunoglobulinähnliche Domäne von VEGFR-2 umfasst.
Gereinigtes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–4, wobei der VEGFR-3 eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 umfasst.
Gereinigtes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–4, wobei der VEGFR-3 eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einem Polynukleotid oder Oligonukleotid kodiert ist, das unter Hybridisierungsbedingungen zu einem Komplement eines menschlichen Gens hybridisiert, das einen VEGFR-3 kodiert, wobei das Polynukleotid oder Oligonukleotid nicht an ein Komplement eines menschlichen Gens hybridisiert, das VEGFR-1 kodiert, wobei die Hybridisierungsbedingungen Folgendes umfassen: a) eine Hybridisierungslösung umfassend 50% Formamid, 5 × Denhardt-Lösung, 5 × SSPE, 0,1% SDS und 0,1 mg/ml beschallte Lachssperma-DNA; b) Hybridisierung bei einer Temperatur von 42°C für eine Zeitspanne von 18 bis 24 Stunden und c) Waschen auf die Hybridisierung hin bei einer Waschtemperatur von 65°C mit einer Waschlösung umfassend 1 × SSC und 0,1% SDS.
Fusionsprotein umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–6, das an ein Immunoglobulin-Fc-Peptid fusioniert ist.
Polypeptid oder Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1–7, des Weiteren umfassend ein zytotoxisches Mittel, das an das Polypeptid angeheftet ist.
Polypeptid oder Fusionsprotein nach Anspruch 8, wobei das zytotoxische Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Pflanzengiften, Bakteriengiften, Pilzgiften, Radioisotopen, Antimetaboliten, Alkyliermitteln, Antimitotika und DNA interkalierenden Mitteln.
Polynukleotid umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid oder Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1–7 kodiert.
Polynukleotid nach Anspruch 10, des Weiteren umfassend eine Expressionsreguliersequenz, die funktionsfähig mit der Sequenz verknüpft ist, die das Polypeptid oder Fusionsprotein kodiert.
Expressionsvektor umfassend eine Expressionsreguliersequenz, die funktionsfähig mit einem Polynukleotid nach Anspruch 10 verknüpft ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 12, wobei die Expressionsreguliersequenz einen Promotor umfasst, der die Expression in einer Säugerzelle fördert.
Expressionsvektor nach Anspruch 13, der ein viraler Vektor ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Retrovirus, Adenovirus, adenoassoziiertem Virus, Vakzinevirus und Herpesvirus.
Zusammensetzung umfassend ein Polypeptid oder Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1–9 oder ein Polynukleotid oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 10–14 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Zelle, die mit einem Polynukleotid oder Vektor nach einem der Ansprüche 10–14 transformiert oder transfiziert ist.
Zusammensetzung umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–6, 8 und 9, Fusionsprotein nach Anspruch 7, Polynukleotid nach Anspruch 10 oder 11, Vektor nach einem der Ansprüche 12–24, Zelle nach Anspruch 16 oder Zusammensetzung nach Anspruch 15 zur Verwendung beim Diagnostizieren oder Behandeln eines Tumorleidens.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das Tumorleiden Brustkrebs oder ein Tumor ist, der durch Blutgefäß- oder Lymphgefäßrevaskularisation gekennzeichnet ist, wobei die Revaskularisation Endothelzellen umfasst, die VEGFR-3 exprimieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Verwendung beim Diagnostizieren oder Verhindern von Tumormetastase.
Verwendung eines Polynukleotids, Vektors, einer Zusammensetzung oder Zelle nach einem der Ansprüche 10–16 zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen des Krebswachstums oder der Metastase.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Polynukleotid in einem Liposom eingekapselt ist oder sich in einem Vektor befindet.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei der Vektor einen viralen Vektor umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Retrovirus, Adenovirus, adenoassoziiertem Virus, Vakzinevirus und Herpesvirus.
Verwendung eines Polypeptids, Fusionsproteins oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–10 zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen der Ausbreitung der Metastase oder Reduzieren des Wachstums eines Krebses bei einem Säugerpatienten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20–23, wobei das Medikament mindestens eine unter Angiogenese und Lymphangiogenese bei dem Patienten hemmt.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei der Krebs einen Tumor umfasst, gekennzeichnet durch Blutgefäß- oder Lymphgefäßrevakularisation und wobei die Revakularisation Endothelzellen umfaßt, die VEGFR-3 exprimieren und wobei das Medikament mindestens eine unter Angiogenese und Lymphangiogenese bei dem Patienten hemmt.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei die Krebszellen mindestens ein Polypeptid exprimieren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus VEGFR-3, VEGF-C und VEGF-D.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20–26, wobei der Krebs Brustkrebs ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20–27, wobei das Medikament des Weiteren ein zweites Krebstherapiemittel umfasst oder zur Verwendung in Verbindung damit bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei das zweite Krebstherapiemittel ein chemotherapeutisches Mittel, eine Nukleinsäure, die ein Krebstherapiemittel und ein antilymphangiogenes Mittel kodiert, oder ein antiangiogenes Mittel umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20–29, wobei der Krebs einen operierbaren Tumor umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20–30, wobei das Medikament zur Behandlung eines Patienten bestimmt ist, der an Krebs eines Gewebes, Organs oder einer Zelle leidet ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gehirn, Lunge, Leber, Milz, Niere, Lymphknoten, Dünndarm, Blutzellen, Bauchspeicheldrüse, Kolon, Magen, Brust, Gebärmutter, Prostata, Hoden, Ovarium, Haut, Kopf und Hals, Speiseröhre, Knochenmark und Blut.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17–19, wobei das Polynukleotid in einem Liposom eingekapselt ist und/oder die Zusammensetzung ein zweites Krebstherapiemittel umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 32, wobei das zweite Krebstherapiemittel ein chemotherapeutisches Mittel, eine Nukleinsäure, die ein Krebstherapiemittel und ein antilymphangiogenes Mittel kodiert, oder ein antiangiogenes Mittel umfasst.