DE60214118T2

DE60214118T2 - Verfahren zum Nachweis eines Analyten

Info

Publication number: DE60214118T2
Application number: DE60214118T
Authority: DE
Inventors: Filip Frederix; Gustaaf Borghs; Jean-Michel Friedt
Original assignee: Interuniversitair Microelektronica Centrum vzw IMEC
Current assignee: Interuniversitair Microelektronica Centrum vzw IMEC
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2022-12-21
Also published as: EP1321761A1; DE60214118D1; ATE337546T1; EP1321761B1; JP2003240710A; US20080131869A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf verschiedene Typen von Biosensoren, die zusammen mit ihren spezifischen Vorteilen und Nachteilen bekannt sind. Elektrochemische Biosensoren, Oberflächenakustikwellen-Sensoren und Oberflächenplasmonresonanz-Biosensoren sind Beispiele von Biosensoren, die keine Markierungstechniken erfordern.
Stand der Technik
US 5,641,640 offenbart ein Verfahren zum Untersuchen eines Analyten in einer flüssigen Probe unter Verwendung der Oberflächenplasmonresonanz. Das Vorhandensein eines Analyten wird bestimmt durch die Veränderung bei dem Brechungsindex, wenn der Analyt mit einer Spezies in Wechselwirkung tritt, welche den Brechungsindex herauf setzt. Messungen der Oberflächenplasmonresonanz weisen einige größere Nachteile auf, etwa folgende:

1) die meisten Systeme sind eher teuer. Das System erfordert einen Quarzprisma und eine Strahlungsquelle, welche in der Lage ist, polarisiertes Licht zu erzeugen;
2) eine SPR (Surface Plasmon Resonance) Antwortreaktion hängt von dem Volumen und von dem Brechungsindex des gebundenen Analyten ab. Für sehr kleine Moleküle führt dies zu sehr kleinen Veränderungen bei dem Brechungsindex.

Die Rezeptoren sollten auf der Oberfläche immobilisiert sein.
US 6,330,464 offenbart eine auf der Optik beruhende sensorische Vorrichtung zum Nachweis des Vorhandenseins einer gewissen Menge eines Analyten unter Verwendung sowohl von einem Indikators als auch von Referenzkanälen. Der Sensor verfügt über einen Sensorkörper mit einer in demselben enthaltenen Strahlungsquelle. Die von der Quelle emittierte Strahlung tritt mit den Molekülen in Wechselwirkung, was zu einer Veränderung von mindestens einer optischen Eigenschaft dieser Moleküle führt.
WO 01/44813 A offenbart ein Verfahren zum Untersuchen eines Analyten in einer Probe, dadurch dass die Probe. mit einer Sensorvorrichtung in Kontakt gebracht wird, wobei die Sensorvorrichtung einen mit einem Metall beschichteten Polymerfilm umfasst und eine analytspezifische Rezeptorlage aufweist, welche in einer Struktur auf der Metallbeschichtung gedruckt ist, und dass Licht durch die Sensorvorrichtung hindurch gelassen wird und dass das Vorhandensein des Analyten festgestellt wird durch das Nachweisen eines Musters, das durch die Beugung des durchgelassenen Lichtes erzeugt wird.
Ziele der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, ein Verfahren zum Untersuchen eines Analyten zu liefern, welches keine Markierung erfordert und welches sehr empfindlich ist.
Es ist weiterhin ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zu liefern, welches benutzerfreundlich ist und welches nur einen geringen Herstellungspreis verursacht. Es ist weiterhin ein Ziel der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zum Untersuchen von Biomolekülen vorzuschlagen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zielt ab auf ein Verfahren zum Analysieren und Bestimmen eines Analyten innerhalb einer Probe, Verfahren welches die folgenden Verfahrensschritte umfasst:

– ein Bereitstellen eines Substrats, wobei das Substrat einen elektrisch leitfähigen Bereich und eine analytspezifische Erkennungslage aufweist, welche Rezeptormoleküle enthält, welche mit dem Analyten in eine spezifische Wechselwirkung zu treten in der Lage sind, wobei der leitfähige Bereich mindestens eine erste Oberfläche und eine zweite Oberfläche aufweist, wobei die erste Oberfläche operativ mit der analytspezifischen Erkennungslage assoziiert ist;
– das Substrat dem Analyten derart unterziehen, dass eine spezifische Wechselwirkung zwischen dem Analyten und den Rezeptormolekülen eintritt;
– ein Hindurchschicken einer elektromagnetischer Strahlung durch das Substrat; wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es weiterhin die nachfolgenden Schritte aufweist:
– ein Messen der Intensität der von dem Substrat absorbierten oder durchgelassenen Strahlung als eine Funktion der Wellenlänge/Frequenz; und
– ein Bestimmen des Vorhandenseins des Analyten aus einer sich ergebenden Veränderung in der Wellenlänge/Frequenz gegenüber der Intensität der Strahlung, die von dem Substrat durchgelassenen oder absorbiert worden ist, im Kontakt mit der Probe.

Das Verfahren kann zur Affinitätsimmunerfassung und Bioerfassung verwendet werden, im Allgemeinen durch eine optische Überwachung der Ablagerung auf der Erkennungslage, der Antikörperimmunisierung und der Erkennung des Antigens.
Bei einer Ausführungsform dieser Erfindung besteht der leitfähige Bereich im Wesentlichen aus mindestens einer Partikel. Die Partikel ist vorzugsweise kleiner als die Wellenlänge der einfallenden Strahlung. Die Wechselwirkung zwischen dem Analyten und den leitfähigen Bereichen beeinflusst die dielektrische Konstante des leitfähigen Bereiches und der Erkennungslage, was zu einer Veränderung in dem Absorptions- oder Transmissionsspektrum führt. Darüber hinaus führt die Wechselwirkung zu einer Veränderung der Resonanzfrequenz der Plasmonpartikel, da diese hauptsächlich durch die dielektrische Funktion des leitfähigen Bereiches und des umgebenden Mediums bestimmt wird, wie etwa durch die Erkennungslage und durch die Partikelform.
Vorzugsweise liegt der Durchmesser der Partikel unterhalb von 300 nm, unterhalb von 200 nm, unterhalb von 100 nm oder unterhalb von 50 nm.
Bei einer weiteren Ausführung führt die Wechselwirkung zwischen dem Analyten und den Erkennungslagen zu einer Veränderung der dielektrischen Konstante der Erkennungslage.
Bei einer weiteren Ausführung umfasst das Substrat weiterhin eine Trägerlage und die zweite Oberfläche ist operativ mit der Trägerlage assoziiert. Die Trägerlage ist durchsichtig oder halbdurchsichtig. Bei einer weiteren Ausführung enthält der leitfähige Bereich ein Metall. Das Metall kann ein Metall sein, welches einen Plasmoneffekt einleitet. Das Metall kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Gold, Silber und Kupfer.
Bei einer weiteren Ausführung enthält die Erkennungslage eine sich selbst zusammenstellende Monolage.
Bei einer weiteren Ausführung weist das Substrat mehrfache leitfähige Bereiche auf und die leitfähigen Bereiche sind in einer Gruppe angeordnet. Das Substrat kann aus einer Mikrotitrierplatte bestehen. Das Substrat kann für ein Auswählen (screening) mit einem hohen Durchsatz verwendet werden.
Bei einer weiteren Ausführung umfasst das Verfahren weiterhin die folgenden Verfahrensschritte:

– ein Bereitstellen eines zweiten Substrats, wobei das zweite Substrat einen elektrisch leitfähigen Bereich mit mindestens einer ersten Oberfläche und einer zweiten Oberfläche aufweist und eine Erkennungslage, wobei die erste Oberfläche operativ mit der Erkennungslage assoziiert ist,
– das zweite Substrat einer Referenzprobe unterziehen,
– ein Hindurchschicken einer Strahlung durch den leitfähigen Bereich und durch die Erkennungslage des zweiten Substrats,
– ein Messen der Intensität der von dem zweiten Substrat absorbierten oder durchgelassenen Strahlung als eine Funktion der Wellenlänge,
– ein Vergleichen der Intensität der von dem zweiten Substrat absorbierten oder durchgelassenen Strahlung mit der Intensität der von dem ersten Substrat absorbierten oder durchgelassenen Strahlung, um das Vorhandensein eines Analyten zu bestimmen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: experimenteller Aufbau, so wie derselbe bei einer Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
2: schematische Darstellung des Verfahrens, so wie dasselbe bei den herkömmlichen ELISA Experimenten beschrieben ist.
3: schemtische Darstellung der Objektträger und der Quarzzellen, so wie dieselben bei der bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung beschrieben ist.
4:

(a) Absorptionsspektren von menschlichem Serumalbumin (HSA = Human Serum Albumin), welches direkt auf dem dünnen Goldfilm absorbiert ist;
(b)Differenzspektren von menschlichem Serumalbumin (HSA), welches direkt auf dem dünnen Goldfilm und dünnen Gold auf Quarz absorbiert ist.

5:

(a) Absorptionsspektren von sich selbst zusammensetzenden Monolagen von Thiolen auf Gold, gefolgt von der Adsorption von HSA bei verschiedenen Konzentrationen und bei verschiedenen Zeiten.
(b) Differenzspektren der Spektren gemäß 5.

6 Differenzspektren, welche bei der Anwendung von Immunosensoren verwendet werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Unter Bezugnahme auf die angehängten Zeichnungen kann die vorliegende Erfindung im Folgenden bis in ihre Einzelheiten beschrieben werden. Es ist jedoch offensichtlich, dass ein Experte auf diesem Gebiet sich mehrere andere gleichwertige Ausführungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, so wie derselbe durch die Ansprüche definiert ist, vorstellen kann.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein verbessertes Verfahren zum Nachweisen eines Analyten. Die vorliegende Erfindung kann für Sensorvorrichtungen verwendet werden, welche eine höhere Empfindlichkeit aufweisen und welche dazu verwendet werden können, um eine sehr niedrige Konzentration eines Analyten nachzuweisen.
Insbesondere kann dieses Verfahren zur Affinitätsimmunerfassung und Bioerfassung verwendet werden, im Allgemeinen durch eine optische Überwachung der Ablagerung der Verbindungslage, der Erkennung der Immobilisierung der Moleküle und der Erkennung des Analyten. Dieses Verfahren ist vielseitig und es erlaubt Anwendungen in der flüssigen Phase, in der Gasphase, genauso wie es quantitative Messungen in situ erlaubt.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zum Untersuchen eines Analyten in einer Probe (siehe 1), wobei die Probe in Kontakt mit dem Substrat (12) gebracht wird, welches einen elektrisch leitfähigen Bereich (13) und eine Erkennungslage (14) aufweist, wobei die elektromagnetische Strahlung (11) durch das Substrat hindurch gelenkt wird und die Intensität der Strahlung (15), welche von dem Substrat absorbiert oder durch das Substrat hindurch gelassen worden ist, als eine Funktion der Wellenlänge/Frequenz gemessen wird. Das Vorhandensein des Analyten wird bestimmt durch die sich ergebende Veränderung in dem Spektrum (Wellenlänge/Frequenz versus Intensität) des Lichts, welches durch das Substrat im Kontakt mit der Probe hindurch gelassen oder von demselben absorbiert worden ist.
Für den Zweck dieser Erfindung sollte es klar und verstanden sein, dass die Wörter "absorbierte Strahlung (oder Absorption)" und "hindurch gelassene Strahlung (oder Durchlässigkeit)" sich gegenseitig ersetzen können. Die Beziehung zwischen der Absorption (A) und der Durchlässigkeit (T = Transmittance = Transmission) ist gegeben durch: A = –log T.
Die vorliegende Erfindung zielt ab auf ein Verfahren zum Analysieren und Bestimmen eines Analyten innerhalb einer Probe, welches die folgenden Verfahrensschritte umfasst:

– ein Bereitstellen eines Substrats, wobei das Substrat einen elektrisch leitfähigen Bereich und eine analytspezifische Erkennungslage aufweist, welche Rezeptormoleküle enthält, welche mit dem Analyten in eine spezifische Wechselwirkung zu treten in der Lage sind, wobei der leitfähige Bereich mindestens eine erste Oberfläche und eine zweite Oberfläche aufweist, wobei die erste Oberfläche operativ mit der analytspezifischen Erkennungslage assoziiert ist;
– das Substrat dem Analyten derart unterziehen, dass eine spezifische Wechselwirkung zwischen dem Analyten und den Rezeptormolekülen eintritt;
– ein Hindurchschicken einer elektromagnetischer Strahlung durch das Substrat; wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es weiterhin die folgenden Schritte aufweist:
– ein Messen der Intensität der von dem Substrat absorbierten oder durchgelassenen Strahlung als eine Funktion der Wellenlänge/Frequenz; und
– ein Bestimmen des Vorhandenseins des Analyten aus einer sich ergebenden Veränderung bei der Wellenlänge/Frequenz gegenüber der Intensität der Strahlung, die von dem Substrat durchgelassenen oder absorbiert worden ist, im Kontakt mit der Probe.

Das Substrat kann weiterhin eine Trägerlage umfassen, wobei die zweite Oberfläche des leitfähigen Bereiches operativ mit der Trägerlage assoziiert sein kann.
Die vorliegende Erfindung kann zum Untersuchen eines Analyten in einer Probe eingesetzt werden.
Der Analyt kann irgendeine Art eines chemischen Moleküls sein wie etwa Biomoleküle, Ionen, Zellen. Die Biomoleküle können Hormone, Proteine wie etwa Antikörper, Antigene, Steroide, Nukleinsäuren, Wirkstoffmetaboliten oder Mikroorganismen sein. Die Probe kann auch eine leere bzw. Blankprobe sein, dies bedeutet eine Probe ohne einen Analyten oder überhaupt keine Probe.
Die Strahlungsquelle kann irgendeine Strahlungsquelle sein wie etwa eine Lampe, eine Licht emittierende Diode (LED) oder ein Laser. Bei einer Anwendung sollte die Strahlungsquelle in der Lage sein, eine wesentliche Menge an Strahlung in dem Wellenlängenbereich der maximalen Absorptions (oder der minimalen Transmissions-) – Wellenlänge des Substrats zu liefern. Vorzugsweise liefert die Strahlungsquelle eine Strahlung in dem Wellenlängenbereich zwischen 200 nm und 1500 nm. Vorzugsweise kann die Strahlungsquelle eine Strahlung in dem Wellenlängenbereich zwischen 200 nm und 1000 nm erzeugen. Eine LED, etwa eine rote LED oder eine blaue LED, kann verwendet werden. Auch andere Quellen können für die Strahlung verwendet werden.
Die Strahlungsquelle kann eine Strahlungsquelle mit einem fokussierten Strahl sein (wie zum Beispiel ein Laser) oder sie kann eine Lichtquelle sein, welche Licht mit einem breiteren Spektrum liefert. Vorzugsweise liefert die Strahlungsquelle eine parallele Strahlung. Die Strahlung kann monochromatisch sein.
Zwischen der Strahlungsquelle und dem Substrat können mehrere Komponenten vorhanden sein wie etwa Linsen, Schlitze, Beugungsgitter.
Die Strahlungsquelle kann ein Teil eines im Handel erhältlichen UV-VIS Spektrometers (oder Absorptionsmeters oder Kolorimeters) sein.
Das Substrat weist einen leitfähigen Bereich und eine Erkennungslage auf.
Das Substrat kann weiterhin eine Trägerlage umfassen. Die Trägerlage dient zur Erzielung von mindestens einer mechanischen Unterstützung. Die Trägerlage kann für die Wellenlänge, welche von der Strahlungsquelle geliefert wird, durchsichtig oder halb durchsichtig sein. Die Trägerlage sollte eine optische Durchlässigkeit in dem Bereich zwischen 5 % und 95 % aufweisen, vorzugsweise zwischen 20 % und 80 %, vorzugsweise mindestens 80 %. Das Substrat kann hergestellt sein, ohne aber darauf beschränkt zu sein, aus Glas, aus Quarz, aus einem polymeren Material (wie etwa Polycarbonat, Polysulfonat, Polymethyl-methacrylat). Vorzugsweise ist die Trägerlage aus Glas oder aus Quarz hergestellt. Die Trägerlage kann flach sein. Die Trägerlage kann auch ein Teil eines Glas- oder Quarzrohres, eines polymeren Rohres oder einer Mikrotitrierplatte sein. Das Substrat kann in einem Durchflusssystem integriert sein. Das Substrat kann auch eine Mikrotitrierplatte sein, welche ein Teil eines Screeningsystems mit hohem Durchsatz oder eines ELISA Testsystems darstellt.
Der leitfähige Bereich weist eine erste Oberfläche und eine zweite Oberfläche auf. Die erste Oberfläche ist operativ mit der Erkennungslage assoziiert. Die zweite Oberfläche kann im Kontakt mit einem äußeren Medium stehen (wie zum Beispiel mit Luft, mit einem Gas). Bei einer bevorzugten Ausführung ist die zweite Oberfläche operativ mit der Trägerlage assoziiert.
Der leitfähige Bereich enthält ein leitfähiges Material. Vorzugsweise ist das leitfähige Material ein Metall. Das Metall kann Gold, Silber und Kupfer sein, ohne aber auf dieselben beschränkt zu sein. Irgendein Metall, welches einen Plasmoneffekt auszulösen in der Lage ist, kann im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. Andere mögliche Materialien sind leitfähiges Glas, leitfähige Polymere oder metallische Nanopartikel.
Der leitfähige Bereich kann eine leitfähige Lagenschicht sein oder er kann mindestens aus einer Partikel bestehen. Eine leitfähige Lagenschicht weist eine Dicke unter 60 nm, unter 50 nm, unter 40 nm, unter 30 nm, unter 20 nm oder unter 10 nm auf und vorzugsweise liegt sie unter 5 nm. Die Lagenschicht kann kontinuierlich oder diskontinuierlich sein, so dass Inseln eines leitfähigen Materials gebildet werden. Eine kontinuierliche Lage kann uneben oder eben sein.
Stärker bevorzugt besteht der leitfähige Bereich im Wesentlichen aus Partikeln, spezifischer betrachtet aus Mikro- oder Nanopartikeln. Die Größe der Partikel ist kleiner als die Wellenlänge der Strahlung, welche auf die Partikel auftrifft. Der Durchmesser der Partikel ist kleiner als 500 nm, kleiner als 400 nm, vorzugsweise kleiner als 300 nm. Die Dicke kann auch kleiner als 200 nm, kleiner als 100 nm, kleiner als 80 nm, kleiner als 50 nm, kleiner als 40 nm, kleiner als 30 nm oder kleiner als 20 nm sein. Die Partikelgröße kann durch das Ablagerungsverfahren bestimmt werden. Die Form der Partikel kann kugelförmig sein, aber andere strukturelle und räumliche Konfigurationen sind nicht ausgeschlossen. Zum Beispiel können die Partikel die Form von Splittern, Würfeln, Ellipsoiden, Röhren und dergleichen aufweisen. Die Partikel können hohl sein. Die Partikel kann im Wesentlichen aus einem leitfähigen Material bestehen. Die Partikel kann auch aus einem polymeren Material bestehen, welches mit einem leitfähigen Material überzogen ist.
Der leitfähige Bereich kann auf solch eine Art und Weise angepasst werden, dass er optisch abgestimmt werden kann. Eine optisch abstimmbare Lage bedeutet, dass der Bereich auf solch eine Art und Weise hergestellt worden ist, dass er eine vorherbestimmte Dicke oder eine vorherbestimmte Partikelgröße aufweist, welche mit einem vorher eingestellten Wert der Wellenlänge korrespondiert, bei welchem die Intensität der absorbierten Strahlung ausreichend hoch ist. Die gewünschte Dicke des leitfähigen Bereiches kann gesteuert werden durch eine Verdampfung, durch Zerstäubung, durch chemisches Beschichten oder durch galvanisches Beschichten des leitfähigen Materials.
Bei einer Ausführungsform ist die zweite Oberfläche des leitfähigen Bereiches operativ mit einer Trägerlage assoziiert. Bei einer Ausführung kann die zweite Oberfläche des leitfähigen Bereiches direkt auf die Trägerlage aufgetragen werden. Bei einer anderen Ausführung kann mindestens eine Haftungslage zwischen der Trägerlage und der zweiten Oberfläche des leitfähigen Bereiches vorhanden sein. Die Haftungslage kann die Stabilität des leitfähigen Bereiches verbessern. Die Haftungslage kann, ohne aber hierauf beschränkt zu sein, aus einer Lage von sich selbst zusammenstellenden bzw. anordnenden Molekülen bestehen, etwa von Molekülen auf der Basis von Silan oder von Molekülen auf der Basis von Thiol, ohne aber hierauf beschränkt zu sein. Die Haftungslage kann auch eine Lage organischer Verbindungsmoleküle (z.B. Leim, ...) enthalten. Die Haftungslage kann eine Wirkung auf die Eigenschaften von Absorption/Durchlässigkeit der ersten Lage ausüben, aber sie muss nicht notwendigerweise eine solche Wirkung hervorbringen. Vorzugsweise besteht die Haftungslage aus einer nicht metallischen Lage.
Das Substrat enthält weiterhin eine Erkennungslage. Die Erkennungslage ist operativ mit der ersten Oberfläche des leitfähigen Bereiches assoziiert. Die Erkennungslage besteht aus einer Lage, die mindestens Erkennungsmoleküle enthält, welche auch Rezeptormoleküle genannt werden. Die Erkennungsmoleküle enthalten einen Teil eines spezifischen Bindungspaares und sie umfassen: Antigen/Antikörper, Enzym/Substrat, Metall/Chelatmittel, Bakterien/Rezeptor, Virus/Rezeptor, Hormon/ Rezeptor, Oligonukleotid/RNA, DNA/RNA, RNA/RNA, Oligonukleotid/DNA. Die Rezeptormoleküle sollten in der Lage sein, spezifisch mit dem Analyten in Wechselwirkung zu treten. Diese Wechselwirkung kann zu einer Veränderung der dielektrischen Konstante des leitfähigen Bereiches und der Erkenungslage führen. Die Erkennungslage kann auch aus einer Lage von Zellen bestehen, welche direkt auf die erste Lage oder auf eine Zwischenlage aufgetragen worden sind. Für den Zweck dieser Anwendung sollte die Zwischenlage als eine Lage verstanden werden, welche auf der ersten Oberfläche des leitfähigen Bereiches gebildet wird. In vielen Fällen wird die Erkennungslage so ausgelegt, dass eine nicht spezifische Adsorption im Wesentlichen vermieden wird.
Die Erkennungsmoleküle können direkt auf die erste Oberfläche des leitfähigen Bereiches aufgetragen werden. Die Erkennungslage kann auch aus einer sich selbst zusammenstellenden bzw. anordnenden Monolage (SAM self assembled monolayer) bestehen, auf welcher die Erkennungsmoleküle gebunden werden können (kovalente oder physikalische Adsorption). Die sich selbst anordnende Monolage kann mindestens zwei funktionale Gruppen enthalten, eine erste Gruppe, die so ausgewählt wird, dass sie operativ mit der ersten Oberfläche des leitfähigen Bereiches assoziiert ist, und eine zweite Gruppe, die so ausgewählt wird, dass sie mit dem Analyten in Wechselwirkung tritt.
Eine Wechselwirkung zwischen dem Erkennungsmolekül und dem Analyten kann, ohne dass dies aber so sein müsste, zu einer Veränderung des Absorptionsspektrums des Substrats führen. Wenn das Substrat Gegenstand der Probe ist, dann wird das Substrat der Strahlungsquelle derart ausgesetzt, dass das einfallende Licht auf das Substrat auftrifft, insbesondere auf den leitfähigen Bereich und auf die Erkennungslage. Die Durchlässigkeit oder die Absorption werden bestimmt. Dies kann bei einer vorherbestimmten Wellenlänge geschehen (zum Beispiel die Wellenlänge, bei welcher die Intensität am größten ist). Anstelle der Messung der Veränderung eines Scheitelwertes in dem Spektrum, kann man auch eine Veränderung in der integrierten Oberfläche unterhalb des Scheitelwertes bestimmen oder die Verschiebung des Spektrums messen. Die gemessene Durchlässigkeit oder Absorption gibt einen Hinweis auf das Vorhandensein eines Analyten in der Probe. Wenn z.B. ein Analyt vorhanden ist, dann kann die Absorption ansteigen oder sie kann abnehmen, das Spektrum kann sich verschieben, abhängig von den spezifischen Lagen, von der Wechselwirkung der verschiedenen Lagen und von dem Analyten.
Die Durchlässigkeit oder Absorption kann mittels eines herkömlichen Absorptionsmessers (auch Kolorimeter genannt) oder mittels eines Spektrometers gemessen werden.
Die Messung der Absorption oder Durchlässigkeit ist vorteilhaft im Vergleich zu Fluoreszenzmessungen, da keine Markierung des Moleküls erforderlich ist. Als Konsequenz davon wird das experimentelle Verfahren, so wie es im Rahmen dieser Erfindung dargelegt ist, vereinfacht.
Die Verwendung einer herkömmlichen Lichtquelle wie etwa einer LED und die Verwendung eines herkömmlichen Absorptionsmessers führen zu einem Verfahren, welches nur geringe Materialherstellungskosten verursacht.
Die Erfindung kann in einer Lösung, z.B. einer solchen auf Wasserbasis, derart durchgeführt werden, dass ein Fließsystem verwendet werden kann. Anderenfalls können die Experimente in der Form von "trockenen Messungen" durchgeführt werden.
Insbesondere im Fall von Nanopartikeln wird das Absorptionsspektrum von Nanometallpartikeln sowohl durch eine Hauptinterbandabsorption als auch durch Partikelplasmonresonanzen bestimmt. Letztere sind kollektive Schwingungen der Leitungselektronen auf der Oberfläche der kleinen Partikel. Die Resonanzfrequenz eines Partikelplasmons wird hauptsächlich bestimmt durch die dielektrischen Funktionen des Metalls und das Umgebungsmedium bzw. auch durch die Form der Partikel, d.h. durch das Verhältnis der Hauptachsen. Resonanzen führen zu einer engen, spektralen, sich selektiv auswirkenden Absorption und zu einer Vergrößerung des lokalen Lichtfeldes, welches auf die Oberfläche der Metallpartikel und auf deren nahe Umgebung beschränkt ist. Das Umgebungsmedium beeinflusst die Plasmonfrequenz und die Amplitude der Absorption. Der zweite Mechanismus, der eine Rolle bei der Lichtabsorption durch kleine Edelmetallpartikel spielt, besteht in einer Photoninterbandabsorption. Sie beinhaltet die Förderung eines Elektrons von dem besetzten d-Zustandsniveau in dem Edelmetall auf einen leeren Zustand oberhalb des Ferminiveaus. Die Absorption wird in einem starken Maße von der gemeinsamen Dichte der d- und s-Zustände der Leitungselektronen bestimmt. Eine starke Absorption weist auf eine "parallele" Energiedispersionsfunktion hin. Die verschiedenen Scheitelwerte bei dem Spektrum können verschiedenen Scheitelwerten der Interbandabsorption zugeordnet werden. Auf Grund der großen Hauttiefe von einigen Mikron absorbieren die Nanopartikel Licht auf der gesamten Hauptfläche der Partikel.
Durch ein Erhöhen der dielektrischen Konstante nahe an der Oberfläche der Nanopartikel vergrößert eine Zunahme der Dichte für das elektromagnetische Feld an der Position der Partikel die Übergangswahrscheinlichkeit und als solche die Absorption für die Hauptübergänge. Diese Wirkung ist nur sichtbar, wenn die Partikel kleiner ist als die Wellenlänge des auftreffenden Lichts, weil solch ein Objekt eine zu schmale seitliche Ausdehnung aufweist, um irgendwelche rein internen optischen Modi zu unterstützen. Der Operator des elektrischen Feldes, innerhalb einer solchen Sphäre, wird bestimmt durch die ausgedehnten Modi, folglich durch die dielektrische Konstante der Umgebung.
Wenn die dielektrische Konstante zunimmt, dann erwartet man eine erhöhte Absorption, so wie dies experimentell verifiziert wird. Dies kann für Partikelplasmonen verschieden sein, weil die dielektrische Konstante der Umgebung auch einen starken Einfluss auf die Wellenzahl und auf die Stärke der kollektiven und schwindenden Anregungsmodi besitzt. Dadurch dass man die Partikel mit einem unterschiedlichen Material beschichtet, kann man sowohl eine Verschiebung der Frequenz als auch eine solche der Absorptionswahrscheinlichkeit beobachten.
Verglichen mit SPR Messungen kann das Verfahren, so wie es in dieser Anmeldung beschrieben ist, die folgenden Vorteile aufweisen:

1) Das Verfahren ist einfacher im Aufbau und kann mit geringen Herstellungskosten ausgeführt werden. Darüber hinaus ermöglicht diese Erfindung die verschiedenen Aufbauten und sie kann leicht in verschiedene biologische Werkzeuge integriert werden.
2) Für die Messungen kann ein normales UV-vis Spektrometer verwendet werden.
3) Die Intensität des einfallenden Lichts muss nicht fokussiert werden. Ein Laser als einfallendes Licht ist möglich, aber im Rahmen unseres Verfahrens nicht notwendig.

Das Verfahren, so wie es in der vorliegenden Erfindung beschrieben worden ist, weist mehrere Vorteile auf im Vergleich zu dem herkömmlichen ELISA Experiment, bei welchem ein Antikörper (21) auf einer Mikrotitrierplatte (23) immobilisiert wird (siehe 2). Dieser Antikörper kann nicht durch herkömmliche UV-Vis Messungen nachgewiesen werden. Die Nachweisgrenze der UV-Vis Messungen ist nicht geeignet für den Nachweis einer dünnen Lage oder einer Monolage von Protein. In einem nächsten Schritt wird der Analyt oder das Antigen (24) durch den Antikörper erkannt. Auch dieses Ereignis ist mit Hilfe von UV-Vis Messungen nicht sichtbar. Daher wird ein zweiter Antikörper (25) mit einer Markierung (zum Beispiel Pferdeperoxidase) verwendet, um an die andere Seite des Antigens anzukoppeln. Auch dieses Ereignis ist nicht sichtbar. In einem nächsten Schritt wird eine Substanz hinzu gegeben, welche durch die Markierung (HRP) in eine Farbe in der Lösung (26) umgewandelt wird, welche eine quantitative Abschätzung für die Menge des Antigens in der Probe darstellt oder eine solche Abschätzung ergeben kann. Diese Abfolge von Schritten führt zu Verdünnungskurven, Optimierungen, Berechnungen, Zeit und Geld.
Bei dem Verfahren, so wie es durch die Erfindung beschrieben worden ist, wird eine dünne Lage von Gold oder von Nanopartikeln auf den Boden einer Mikrotitrierplatte aufgetragen. Die dünne Goldlage kann so betrachtet werden, als ob sie aus Goldnanopartikeln bestehen würde. Goldpartikel sind auf den Boden der Mikrotitrierplatte aufgetragen. In einem nächsten Schritt wird der Antikörper an die Goldlage gekoppelt. Die Absorption des dünnen Goldes oder der Goldnanopartikel wird gemessen. Dies führt zu einem Absorptionsspektrum. In einem nächsten Schritt wird der Antikörper einem äußeren Medium unterworfen, welches ein nachzuweisendes Antigen enthält. Das Antigen wird mit dem Antikörper in Wechselwirkung treten, was zu einer Veränderung in dem Absorptionsspektrum führt. Die Veränderung kann ein Anstieg der Intensität oder eine Verschiebung des Spektrums zu tieferen/höheren Wellenlängen sein. Als Konsequenz davon gestaltet das Verfahren, so wie es durch die vorliegende Erfindung beschrieben ist, den Test schneller, einfacher, preiswerter und zuverlässiger.
Beschreibung einer bevorzugten Ausführung der Erfindung
Es werden ultradünne Goldfilme hergestellt durch eine Verdampfung oder über eine Goldplattierung auf ein mercaptosilanisiertes Glas- oder Quarzsubstrat.
Die Glas- oder Quarzsubstrate werden gereinigt, indem sie während einer Zeitdauer von 2 Stunden in 2 M NaOH aufgelöst werden, gefolgt von einer Behandlung während einer Zeitdauer von 7 Minuten mit einer 1/1/5 Mischung von jeweils H₂O₂ (30 %), NH₄OH (25 %) und von ultrareinein H₂O bei 80 bis 90 °C, um eine frisch zubereitete und gleichmäßige Oxidlage zu erzielen.
Die aus 3-Mercaptopropylmethyltrimethoxysilan bestehende Verbindung wird in einer 95:5 (V/V) Lösungsmittelmischung bei 2 % aufgelöst. Die sich selbst anordnenden Haftungslagen aus Mercaptosilan werden gebildet durch ein Eintauchen der Substrate in diese Lösung während einer Zeitdauer von bis zu 72 Stunden. Anschließend an diesen Eintauchschritt, werden die Substrate aus der Lösung entfernt und mit Methanol gereinigt, mit N₂ trocken geblasen und während einer Zeitdauer von 10 Minuten bei 110 °C erhitzt. Die beschichteten Substrate werden bis zum Moment der Goldverdampfungsabscheidung oder Goldplattierung in N₂ gelagert.
Für die Herstellung der Goldfilme können zwei Techniken verwendet werden:

(i) die Goldverdampfung wird durchgeführt mit einer Geschwindigkeit von < 5 Å/sec mit Hilfe eines Alcatel scm601. Die endgültige Dicke auf den mercaptosilanisierten Substraten variiert zwischen 2 und 15 nm (durchschnittliche Dicke).
(ii) das stromlose Goldplattieren wird durchgeführt, so wie es von Jin et al. beschrieben worden ist (Jin, Y.; Kang, X.; Song, Y.; Zhang, B.; Cheng, G.; Dong, S. Anal. Chem. 2001, 73 (13), 2843). Die mercaptosilanisierten Substrate werden über Nacht in die oben erwähnte kolloidale Goldlösung eingetaucht. Die Substrate, die eine Monolage aus Goldpartikeln in Nanogröße aufweisen, werden dann nachfolgend in ein wässriges 0,4 mM Hydroxylaminhydrochlorid und 0,1 % HAuCl₄·3H₂O eingetaucht. Jede Glasware wird während einer Zeitdauer von 2 Stunden mit 2 M NaOH gereinigt. Die Substrate wechseln die Farbe von rosa zu purpurrot und zu blau, abhängig von der Plattierungszeit und demzufolge von der Filmdicke. Nach dem Plattieren werden die Substrate gründlich mit Wasser gereinigt, unter einem Stickstoffstrom getrocknet, woraufhin sie dann für die Messungen bereit sind.

Die sich selbst anordnenden Monolagen (SAMs = Self Assembled Monolayers) aus 16-Mercapto-1-Hexadecansäure (16-MHA), 1-Octadecanthiol (HS-C18) und 1-Dodecanthiol (HS-C12) werden erstellt durch Eintauchen der gereinigten, ultradünnen Goldsubstrate in eine 1 mM Lösung aus Thiol/Ethanol während verschiedener Zeitdauern. Die Objektträger werden dann nachfolgend die einen nach den anderen mit Ethanol gespült und unter einem Strom von Stickstoff getrocknet.
Die UV/VIS spektroskopischen Untersuchungen werden ausgeführt unter Verwendung eines Shimatzu UV-1601PC mit einer Schlitzbreite von 2 nm und einem Datenintervall von 0,5 nm. Die ultradünnen, mit Gold beschichteten Substrate werden an der Luft gemessen, indem man die Objektträger (31) senkrecht zu dem Lichtstrahl anordnet. Eine Charakterisierung dieser Lösung wird in den Quarzzellen (32) durchgeführt, welche schematisch in der 3 aufgezeichnet worden sind.
AFM Oberflächenbilder werden in einem Stufenmodus (tapping mode) unter Umgebungsbedingungen erworben (PicoSPM, Molecular Imaging, USA). Si-Ausleger mit einer Federkonstanten zwischen 1,2 und 5,5 N/m werden verwendet, bei Resonanzfrequenzen zwischen 60 und 90 kHz.
In einem ersten Experiment wird menschliches Serumalbumin (HSA = Human Serum Albumin) direkt auf dem dünnen Goldfilm adsorbiert. In der 4a werden die rohen, unbearbeiteten Absorptionsspektren gezeigt. Diese Messungen auf verdampftem dünnem Gold auf Quarz sind bei Umgebungsbedingungen aufgenommen worden. Die Differenzspektren werden in der 4b gezeigt. Diese Spektren sind hinsichtlich des Hintergrundes berichtigt, wobei der Hintergrund aus den Absorptionsspektren des dünnen Goldfilms besteht Die Auftragung von HSA auf 4 nm verdampftem Gold wird durchgeführt mit Hilfe eines Tropfens von 1,244 mg/mL in PB während einer Zeitdauer von 120 Minuten, gefolgt von einem gründlichen Spülen mit Wasser und von einem Trocknen unter einem Strom von N₂. Der nächste Schritt besteht in dem Auftaragen eines Tropfens von Anti-HSA 250 μg/mL in PB während einer Zeitdauer von 180 Minuten mit demselben Spül- und Trocknungsverfahren. Die Absorption verändert sieh und verschiebt sich nach jedem Biosensorschritt. Der Anstieg des Scheitelwertes ist ein Maß für die Konzentration an Anti-HSA.
Die sich selbst anordnenden Monolagen von Thiolen werden dazu verwendet, um die Adsorption einzuleiten oder um die Biorezeptormoleküle kovalent an dem ultradünnen Gold festzumachen. In einem nächsten Experiment wird Quarz mit 4 nm verdampftem Gold verwendet. Die UV Messungen werden an der Luft durchgeführt. Die dünne Goldlage wird während einer Zeitdauer von 90 Minuten in eine 10 mM Lösung von 1-Dodecanthiol/Ethanol eingetaucht. Darauf folgt die Adsorption von HSA als eine Funktion der Zeit. Verschiedene Konzentrationen und unterschiedliche Zeiten werden verwendet. Die Adsorption wird durchgeführt für einen Tropfen der verschiedenen Konzentrationen von HSA in HBS. Die Verschiebung des Scheitelwertes der Absorption wird in der 5a gezeigt. Diese Verschiebung ist stärker ausgeprägt in den Differenzspektren der 5b. Die Abhängigkeit von der Konzentration wird auch deutlich gezeigt über den Anstieg der Absorption nach dem Einführen höherer Konzentrationen an HSA.
Immunosensorexperimente werden auf einer dünnen Lage von plattiertem Gold (8 Minuten der Plattierung) durchgeführt und sie zeigen deutlich das Potential dieses Sensorverfahrens für reale Biosensoranwendungen (6 – Differenzspektren). Eine sich selbst anordnende Monolage von 16-MHA wird auf dem dünnen Goldfilm durch eine 25 Minuten dauernde Auftragung gebildet. Die mit einer endständigen Carboxylgruppe abgeschlossene, erzielte SAM wird über das EDC-NHS Verfahren mit einer Mischung von 0,2 M/0,2 M von EDC/NHS während einer Zeitdauer von 10 Minuten aktiviert. Als Konsequenz davon werden die Aminogruppen der Lysinaminosäuren des Anti-HSA (500 μg/mL in 10 mM Acetatpuffer, pH = 5) kovalent an die aktivierte SAM Oberfläche gekoppelt. Die nicht reagierten, aktivierten Gruppen werden blockiert durch ein Spülen mit 1 M Ethanolamin während einer Zeitdauer von 7 Minuten und die nicht kovalent gebundenen Antikörper werden entfernt durch ein Spülen mit 10 mM Glycin während einer Zeitdauer von 2 Minuten. Der pH-Wert des HCl Puffers ist pH = 2,2. Auf diesem Wege kann eine Monolage eines Anti-HSA auf der Oberfläche beobachtet werden. Wieder ist eine Vergrößerung um den Wert von 270 nm herum sichtbar und eine Verschiebung des Scheitelwertes bei 600 nm. Diese Veränderungen der Spektren können verwendet werden, um die Konzentration an Anti-HSA zu bestimmen.

Claims

Verfahren zum Analysieren und Bestimmen eines Analyten innerhalb einer Probe, welches die folgenden Verfahrensschritte umfasst: – ein Bereitstellen eines Substrats, wobei das Substrat einen elektrisch leitfähigen Bereich und eine analyt-spezifische Erkennungslage aufweist, welche Rezeptormoleküle enthält, welche mit dem Analyten in eine spezifische Wechselwirkung zu treten in der Lage sind, wobei der leitfähige Bereich mindestens eine erste Oberfläche und eine zweite Oberfläche aufweist, wobei die erste Oberfläche operativ mit der analyt-spezifischen Erkennungslage assoziiert ist; – das Substrat wird dem Analyten derart unterzogen, dass eine spezifische Wechselwirkung zwischen dem Analyten und den Rezeptormolekülen eintritt; und – ein Hindurchschicken einer elektromagnetischer Strahlung durch das Substrat; wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es weiterhin die folgenden Schritte aufweist: – ein Messen der Intensität der von dem Substrat absorbierten oder durchgelassenen Strahlung als eine Funktion der Wellenlänge/Frequenz; und – ein Bestimmen des Vorhandenseins des Analyten aus einer sich ergebenden Veränderung bei der Wellenlänge/Frequenz gegenüber der Intensität der Strahlung, die von dem Substrat durchgelassenen oder absorbierten worden ist, im Kontakt mit der Probe.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die Lichtstrahlung durch das besagte Substrat hindurch gelenkt wird.
Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem die Durchlässigkeit oder die Absorption bei einer vorherbestimmten Wellenlänge gemessen wird.
Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem der leitfähige Bereich im Wesentlichen aus mindestens einem Partikel besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 4, bei welchem das Partikel kleiner ist als die Wellenlänge der auftreffenden Strahlung.
Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, bei welchem das Partikel einen Durchmesser unterhalb von 300 nm aufweist.
Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 4 bis 6, bei welchem das Partikel die Form von Kugeln, Splittern, Würfeln, Ellipsoiden oder von Rohren aufweist.
Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 4 bis 7, bei welchem das Partikel im Wesentlichen aus einem leitfähigen Material besteht oder von einem polymeren Material gebildet wird, welches mit einem leitfähigen Material überzogen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei welchem das Partikel im Wesentlichen aus einem leitfähigen Material besteht, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Metall, leitfähigem Glas, leitfähigen Polymeren und metallischen Nanopartikeln.
Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem die spezifische Wechselwirkung zwischen dem Analyten und den Rezeptormolekülen zu einer Veränderung der dielektrischen Konstante der Erkennungslage führt.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, bei welchem das Substrat weiterhin eine Trägerlage umfasst und bei welchem die zweite Oberfläche des Substrats operativ mit der Trägerlage assoziiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, bei welchem die Trägerlage durchsichtig oder halbdurchsichtig ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, bei welchem der leitfähige Bereich ein Metall enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 13, bei welchem der leitfähige Bereich mindestens ein Material enthält, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Gold, Silber oder Kupfer.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, bei welchem die Erkennungslage eine Verbindungslage und ein Erkennungsmolekül enthält.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15, bei welchem die Erkennungslage eine sich selbst anordnende Monolage enthält.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, bei welchem das Substrat mehrfache leitfähige Bereiche aufweist und bei welchem die leitfähigen Bereiche in einer Gruppe angeordnet sind.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17, bei welchem das Substrat aus einer Mikrotitrierplatte besteht.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18, welches weiterhin die folgenden Verfahrensschritte umfasst: – ein Bereitstellen eines zweiten Substrats, wobei das zweite Substrat einen elektrisch leitfähigen Bereich und eine Erkennungslage gemäß den Ansprüchen 1 bis 18 enthält, – das zweite Substrat einer Referenzprobe unterziehen, – ein Hindurchschicken einer elektromagnetischen Strahlung durch das zweite Substrat, – ein Messen der Intensität der von dem zweiten Substrat absorbierten oder durchgelassenen Strahlung als eine Funktion der Wellenlänge, und alsdann – ein Vergleichen der Intensität der von dem zweiten Substrat absorbierten oder durchgelassenen Strahlung mit der Intensität der von dem ersten Substrat absorbierten oder durchgelassenen Strahlung, um das Vorhandensein eines Analyten zu bestimmen.
Verfahren gemäß Anspruch 19, bei welchem die Lichistrahlung durch das Substrat hindurch gelenkt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20, bei welchem die Durchlässigkeit oder die Absorption bei einer vorherbestimmten Wellenlänge gemessen wird.