DE60214029T2

DE60214029T2 - Milchsäurebakterien und deren verwendungen zur behandlung von und vorbeugung gegen krebs

Info

Publication number: DE60214029T2
Application number: DE2002614029
Authority: DE
Inventors: Francois-Marie Luquet; Cindy Laval BALDWIN; St-Lambert LACROIX. Monique
Original assignee: Bio K Plus International Inc
Current assignee: Bio K Plus International Inc
Priority date: 2001-11-27
Filing date: 2002-11-27
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2022-11-28
Also published as: DE60214029D1; WO2003045405A3; US20050208033A1; AU2002349226A1; CA2364249A1; US7887794B2; ATE336258T1; HK1067985A1; EP1450832B1; MXPA04005002A; EP1450832A2; WO2003045405A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich darauf, den Nutzen des Milchsäurestamms Lactobacillus acidophilus I-1492, der bei der CNCM hinterlegt ist, zur Vorbeugung und Behandlung von Krebs aufzuzeigen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Milchsäurebakterien zur Erleichterung der Induktion der Zellapoptose einer Krebsart.
Beschreibung des Standes der Technik
Die Bakterien Lactobacillus acidophilus I-1492, die im Produkt Bio-K+ vorliegen und Gegenstand der Patentanmeldung WO 98/23727 sind, sind dafür bekannt, dass sie einen vorteilhaften Effekt auf den Blut-Cholesteringehalt bei Säugern ausüben.
Die Internationale Patentanmeldung WO 98/23727 betrifft ein Milchsäureferment, das einen Stamm von Lactobacillus acidophilus I-1492 umfasst. Auch diese Bakterien werden hauptsächlich für die Herstellung von Milchsäureferment verwendet, um den Blut-Cholesteringehalt bei Säugern zu reduzieren.
Zudem sind diese Bakterien auch dafür bekannt, dass sie Eigenschaften aufweisen, die eine Verstärkung des Immunsystems bewirken, die Resorption von Nahrungsmitteln erleichtern und die Darmflora anregen. Es ist bekannt, dass die Milchsäurebakterien eine positive Auswirkung auf die Darmflora und auch auf das Immunsystem haben. Tatsächlich ermöglichen die Milchsäurebakterien eine Anregung des Immunsystems, wodurch erreicht wird, dass dem Verdauungssystem eine bessere Abwehr verliehen wird. Diese Bakterien sind auch dafür bekannt, dass sie die Nebenwirkungen neutralisieren, die durch verschiedene Antibiotika verursacht werden.
In Kanada sterben jedes Jahr zahlreiche Personen an Colonkrebs. Krebs steht an dritter Stelle der Krankheiten, die die größte Anzahl an Todesfällen pro Jahr verursachen.
In Kanada betrug im Jahr 2000 die durch Krebs verursachte Sterblichkeitsrate 6500 und es liegen mehr als 17 000 neue Fälle vor.
Die Verwendung eines pharmazeutisch wirkenden Nahrungsmittels (Nutrazeutikum), einschließlich der Verabreichung von Joghurt und/oder fermentierter Milch, als Ergänzungsbehandlung gegen Krebs ist ebenfalls bekannt.
Die beim Menschen bereits als Therapie verwendete Behandlung ist die Ablation der Krebsmasse durch Chirurgie, und anschließend kann eine Bestrahlung der Zone erfolgen, in der sich der Krebs befand, um zu vermeiden, dass Spuren von unerwünschten Zellen zurückbleiben.
Gleichfalls existiert die Chemotherapie. Diese Behandlung umfasst die Verabreichung von Antikrebsmitteln, wie 5-Fluoruracil (5FU). Diese Verbindung wird mit einem Hilfsmittel kombiniert, um die negativen Auswirkungen der Chemotherapie einzuschränken. 5-Fluoruracil ist ein Medikament, das häufig zur Behandlung von Colonkrebs verwendet wird. Dieses Medikament kann angesichts seiner großen Instabilität in Serum oral oder intraperitoneal (am nächsten zum kanzerogenen Ziel) verabreicht werden. Es ist dafür bekannt, den Tod von Colon-Krebszellen zu verursachen, und zwar auf unterschiedliche Weisen.
Der Tod einer Zelle, der auch als Apoptose bezeichnet wird, kann sich mit Hilfe unterschiedlicher Proteine vollziehen. Z.B. kann sich die Zellapoptose aus der Aktivierung eines Membranrezeptors oder aus der zytoplasmatischen Expression verschiedener Proteine ergeben, die dieses Phänomen begünstigen. Diesbe züglich ist bekannt, dass 5FU die Expression des Proteins p53 sowie die Expression des Membranrezeptors Fas erhöht.
1. Allgemeines über die Apoptose
1.1 Definition der Apoptose
Der programmierte Zelltod, der von unterschiedlichen Zytologen und Biologen mehrere Male entdeckt und wieder entdeckt wurde, hat im Laufe der zwei letzten Jahrhunderte verschiedene Namen erhalten. 1972 wurde schließlich der Begriff Apoptose übernommen und von Currie und seinen Kollegen gewählt, um ein häufiges Modell des programmierten Zelltodes zu beschreiben, den die Autoren wiederholt bei mehreren Geweben und Zelltypen beobachteten. Es wurde beobachtet, dass diese sterbenden Zellen mehrere morphologische Eigenschaften gemeinsam haben, die von den Eigenschaften verschieden sind, die bei Zellen, die von einer Pathologie befallen sind, und bei nekrotisierten Zellen beobachtet wurden, und sie schlugen vor, dass diese gemeinsamen morphologischen Eigenschaften das Ergebnis eines üblichen und konservierten Pragramms des Zelltodes sein könnten.
1.2 Rolle der Apoptose
Forscher haben gefunden, dass die Zellen unseres Körpers sich selbst töten können, und sie wissen dass der Zellen-"Selbstmord", der "Apoptose" genannt wird, für den Organismus unerlässlich ist. Die Apoptose ist auch für die Physiologie von Zellen und Geweben wesentlich, wie die Zellteilung und -differenzierung. Die Apoptose ist die üblichste Form des physiologischen Zelltodes, der sich zu verschiedenen Zeitpunkten ereignet, z.B. während der embryonalen Entwicklung, bei der Gewebeumorganisation, bei Immunitätsregulationen und der Tumorregression. Somit ist der physiologische Zelltod ein Prozess der spontanen Zelleliminierung, der die Gewährleistung der Zellerneuerung ermöglicht und der in die Aufrechterhaltung der Zell- und Gewebe-Homöostase in entgegengesetzter Weise zur Mitose eingreift. Es ist der angeborene Mechanismus, durch den der Organismus unerwünschte Zellen eliminiert. Jede Zelle trägt in sich den genetischen Mechanismus ihrer eigenen Zerstörung. Die Zellen bleiben nur unter der Bedingung am Leben, dass sie Signale zum Überleben erhalten, die aus ihrer Umgebung stammen. Wenn die Zelle Signale wahrnimmt, die ihr befehlen, Selbstmord zu begehen, dann löst sie das Programm des Sterbens aus. Eine Störung des Gleichgewichts zwischen den Proteinen, die die Zellen am Leben halten, und den Proteinen, die zum Tode der Zellen führen, kann mit einem großen Spektrum an Krankheiten verbunden sein, die Krebs, Nervendegenerierung, Autoimmunkrankheiten, Diabetes und andere Erkrankungen umfassen.
2. Morphologische Eigenschaften von Apoptose und Nekrose
2.1 Apoptose
Eine der Schlüsseleigenschaften der Apoptose ist die Zellschrumpfung. Während die Zellschrumpfung erfolgt, zieht sich das Zytoplasma zusammen und das Kerngerüst verdichtet sich und bildet Aggregate im Zellkern, die sich dann an den Membrankern anlagern. Die Zellorganellen, darunter das Mitochondrium, scheinen demgegenüber relativ unverändert zu bleiben. Anschließend wird der Zellkern gespalten. Die Bildung und Emission von Ausstülpungen wird auf der Oberfläche der Zeile beobachtet. Die Integrität der Plasmamembran wird jedoch während der ganzes Verfahrens beibehalten, selbst wenn die Permeabilität zunimmt. Während des abschließenden Schritts der Apoptose zerbricht die Zelle in mehrere Vesikel, die eine Vielzahl von intakten Organellen und Kernfragmenten enthalten. Die Fragmente von apoptotischen Zellen werden durch die umgebenden phagozytischen Zellen, wie z.B. Makrophagen, schnell verschlungen. Die Apoptose stellt eine so genannte "saubere" Tötung dar, da die Zellfragmente schnell entfernt werden. Es gibt weder eine inflammatorische Phase, noch eine Schädigung des umgebenden Gewebes, und dies teilweise deswegen, weil dessen Zellmembranen intakt bleiben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die morphologischen Änderungen, die für die Apoptose charakteristisch sind, die Schrumpfung des Zytoplasmas, die Verdichtung und Fragmentierung der DNA und schließlich die Bildung apoptotischer Körper sind, die die Kernfragmente umfassen, die vom Zytoplasma und der Zellmembran umgeben sind.
2.2 Nekrose
Die Nekrose betrifft einen plötzlichen Tod, der sich nach extremem physischen oder chemischen Stress ereignet. Sie ist durch unterschiedliche morphologische Kriterien gekennzeichnet. Bei der Nekrose, diesem unkontrollierten Zelltod, liegt ein schneller Verlust der Steuerung des Ionenstroms vor, der das Eindringen von Wasser und eine Erhöhung des Einströmens von Ionen zur Folge hat, wobei sich die Zellen ebenso wie ihre Organellen wie z.B. das Mitochondrium und das endoplasmatische Retikulum aufblähen, bis die Membranen platzen und die DNA im Zellkern unspezifisch gespalten wird. Die Freisetzung des zytoplasmatischen Inhalts an der Außenseite unter Beteiligung anderer Vorgänge ruft am häufigsten Schädigungen in den Geweben hervor, die in der Nähe vorliegen, und löst eine sehr ausgeprägte lokale inflammatorische Reaktion aus.
Tabelle 1: Die prinzipiellen Unterschiede zwischen Nekrose und Apoptose
3. Verschiedene Schritte des apoptotischen Prozesses
Die Apoptose kann drei verschiedene Schritte umfassen (2). Zuerst muss die Zelle ein apoptotisches Signal erhalten, d.h., die Phase des Auslösens oder des Einsetzens. Dann gibt es die Phase der Regulation oder Steuerung, dann schließlich die Phase der Ausführung, während der die enzymatische intrazelluläre Kaskade abläuft, die den apoptotischen Tod induziert.
3.1 Schritt des Auslösens der Apoptose
Eine Vielfalt von Stimuli, sowohl innere als auch äußere, können die Zellen aktivieren, um apoptotisch zu werden. Unter den verschiedenen Stimuli kann man biologische Reagenzien (Membranrezeptoren, Transkriptionsfaktoren, Onkoproteine, virale, toxische, bakterielle Infektion usw.), die Unterdrückung der essentiellen Faktoren des Zellwachstums (Cytokine, Wachstums- und Nahrungsfaktoren usw.), genomische Läsionen der DNA (spontan oder provoziert), die Einwirkung chemischer Produkte (Antikrebsmittel), die Einwirkung auslösender physikalischer Mittel (UV-Strahlung, Röntgenstrahlung, Mikrowellen, Wärme usw.) aufführen. Diese Phase erfolgt gemäß zahlreichen biochemischen Modifikationen.
3.2 Schritt der Entscheidung oder Ausführung der Apoptose
Im Anschluss an diese verschiedenen Reize erhält die Zelle unterschiedliche Signale und entscheidet, ob sie apoptotisch wird oder nicht. Dieser Schritt umfasst unterschiedliche Signaltransduktionswege, u.a. die Aktivierung (oder Inaktivierung) der Serin/Threonin- und Tyrosinkinasen und Phosphatasen, die Synthese des zweiten Messengers, die Modifikation der Genexpression und die Aktivierung der spezialisierten Proteasen, die unter dem Namen Caspasen bekannt sind. Die endgültige Entscheidung, um apoptotisch zu werden, hängt von mehreren Faktoren ab, die das Gleichgewicht zwischen den apoptotischen und anti-apoptotischen Proteinen (die Bcl-2-Proteinfamilie), den metabolischen Zustand der Zellen und auch die Stufe des Zellzyklus, in der sich die Zelle befindet, einschließen. Mehrere Argumente legen es nahe, dass der Ablauf dieses zweiten Schrittes durch die Proteinfamilie Bcl-2 gesteuert wird, die man im Allgemeinen assoziiert mit der äußeren Membran der Mitochondrien, dem endoplasmatischen Retikulum und dem Zellkern antrifft. Die Proteinfamilie Bcl-2 ist in zwei Gruppen von Proteinen aufgeteilt, wobei die einen die Apoptose hemmen (Bcl-2, Bcl-X_L, Bcl-w, CED-9 usw.) und die anderen die Apoptose begünstigen (Bax, Bid, Bad, Bak, Bcl-X_S usw.). Unabhängig davon, ob sie pro- oder antiapoptotisch sind, haben sie die Fähigkeit, den Ionenstrom zwischen unterschiedlichen Zellkompartimenten zu steuern, insbesondere zwischen den Mitochondrien und dem Zytoplasma. In diesem Schritt gibt es eine Aktivierung der Caspasen in Form des Amplifikationssystems durch Autoaktivierung durch dieselben und zwischen denselben, aber auch durch die Freisetzung von Aktivierungsfaktoren der Apoptose, wie AIF (Apoptose-induzierender Faktor) und des Cytochrom C durch die Mitochondrien. Der Zwischenmembranbereich des Mitochondriums umfasst mehrere Proteine, die an der Aktivierung der Apoptose teilnehmen, wie die Procaspase-2, -3, -7 und -9, AIF und Cytochrom C. Die Aktivierung dieser Caspasen führt zu einem Punkt, an dem es kein Zurück mehr gibt, da sie durch ihre Aktivierung ihre verschiedenen Ziele spalten, u.a. die Proteine, die für das Überleben der Zelle notwendig sind.
3.3 Schritt des apoptotischen Abbaus
Die Zelle ist jetzt in irreversibler Weise in das Zelltod-Programm verwickelt, das aus der Präsentation von morphologischen Eigenschaften der apoptotischen Kennzeichnung besteht. Demzufolge werden durch Aktivierung verschiedener Caspasen mehrere Proteine, die für das Überleben der Zelle notwendig sind, gespalten und werden nicht-funktionell, wie z.B. die Polymerase Poly(DNA-Ribose). Andere Ziele von Caspasen können durch dieselben aktiviert werden, u.a. DNasen, die von sich aus das Chromatin in Fragmente hoher Molmassen schneiden.
4. Proteine, die an den Mechanismen der Apoptoseregulation beteiligt sind
4.1.1 Die Proteinfamilie Bcl-2
Das Protein Bcl-2 und diejenigen der gleichen Familie sind wichtige Modulatoren der Apoptose. In dieser Familie von Proteinen existieren zwei Klassen, die anti-apoptotische Proteine (Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1, Bcl-w, Bfl-1/A1, Brag-1) und pro-apoptotische Proteine (Bax, Bak, Bad, Bid, Bim, Bcl-X_S) (Reed 1996) einschließen. Die Vertreter der Familie Bcl-2 sind gemäß ihrer Anzahl der Domänen-Homologie mit Bcl-2 (BH: Bcl-2-Homologie) klassifiziert. Das Protein Bcl-2 enthält 4 Domänen. Alle anti-apoptotischen Proteine besitzen die vier Domänen, während die pro-apoptotischen Proteine in drei Kategorien eingeteilt werden können. Eine Gruppe enthält die Domänen BH1, BH2 und BH3 (Bax, Bak), während die andere Gruppe nur die Domäne BH3 (Bad, Bid, Bik) enthält. Bcl-X_S bildet seine eigene Gruppe, die die Domänen BH3 und BH4 enthält. Eine kristallographische Untersuchung hat die Bestimmung der Struktur des Proteins Bcl-X_L ermöglicht. Das Protein wird demnach aus zwei zentralen α-Helices gebildet, die von fünf "amphipathischen" α-Helices umgeben sind. Es ist interessant festzustellen, dass die dreidimensionale Struktur Bakterientoxinen homolog ist, die Poren in den Membranen bilden, wie das Diphtherietoxin und Colicin, wodurch auf einen möglichen Wirkungsmechanismus für diese Proteine im Bereich des Mitochondriums geschlossen werden könnte. Eine andere Struktureigenschaft wäre die Fähigkeit dieser Proteine, eine Homo- oder Heterodimerisation miteinander durch ihre Domäne BH3 durchzuführen; auf diese Weise könnten sie ihre Funktionen untereinander begünstigen oder denselben entgegenwirken.
4.1.2. Anti- und pro-apoptotische Faktoren
A. Über das Mitochondrium
Zunächst eine Beschreibung der Modifikationen, die das Mitochondrium in der Apoptose-Situation erleidet. Die Mitochondrien, die in einer Apoptose-Situation isoliert sind, erleiden das, was als mitochondrialer Permeabilitätsübergang (MPT) bezeichnet wird. Experimentell ist der MPT durch eine sehr schnelle Erhöhung der Permeabilität der Innenmembran für Teilchen mit Molmassen von < 1500 Da gekennzeichnet. Dieser Permeabilitätsübergang hat mehrere Konsequenzen, die das Ablaufen von ΔΨ_m, osmotisches Anschwellen, Freisetzung des Ca²⁺ der Matrix, die Bildung von sauerstoffreaktiven Spezies und das Aufbrechen der äußeren Membran des Mitochondriums einschließen, was zu einer Freisetzung von Cytochrom C des Zwischenmembranbereichs des Mitochondriums führt. Eine biochemische Eigenschaft des Mitochondriums hat es ermöglicht, die Poren zu identifizieren, die auf eine elektrische Spannung und Ca²⁺ reagieren, das die MPT steuert, welche als PT-Poren bezeichnet werden. Die Poren sind an der Verbindungsstelle der inneren und äußeren Membranen des Mitochondriums lokalisiert, und somit erlaubt die Öffnung der Poren die direkte Kommunikation zwischen der Matrize des Mitochondriums und seiner Umgebung. Der "spannungsabhängige Anionenkanal" (VDAC) und der "Adeninnucleotid-Translokator" (ANT) machen einen Teil der PT-Pore aus.
Die Proteine der Familie Bcl-2 haben unterschiedliche zytoplasmatische Verteilungen. Die Proteine Bci-2 und Bcl-X_L besitzen einen hydrophoben Schwanz am C-terminalen Ende, der eine Insertionssequenz der Membran enthält, und es ist bekannt, dass der Hauptteil dieser Proteine mit den Membranen der Mitochondrien, dem endoplasmatischen Retikulum und der Kernmembran assoziiert ist. In ihrer inaktiven Form weisen die pro-apoptotischen Proteine Bad, Bax und Bid einen Primärort im Zytoplasma auf. Demgegenüber befinden sie sich bei ihrer Aktivierung wieder auf den Mitochondrien. Wenn Bid gespalten wird, befindet sich sein terminaler COOH-Teil wieder auf der Oberfläche des Mitochondriums. Die Wirkung dieser Proteine, sei es um der Apoptose vorzubeugen oder die Apoptose zu initiieren, befindet sich in den Mitochondrien, demgegenüber bleibt der Mechanismus dieser Wirkungen kontrovers und unbestimmt. Es wurde gezeigt, dass beim Hinzufügen des Proteins Bax – ein pro-apoptotisches Protein – zu isolierten Mitochondrien eine Induktion der Freisetzung von Cytochrom C erfolgt, während die Überexpression der Proteine Bcl-2 oder Bcl-X_L die Freisetzung von Cytochrom C verhütet und somit die Apoptose blockiert wird. Es ist klar, dass die Familie Bcl-3 in direkter Weise an die Freisetzung von Cytochrom C, dem Elektronen-Transportprotein im Inneren des Mitochondriums, beteiligt ist. Indem es darüber hinaus an der oxidativen Phosphorylierung im Mitochondrium beteiligt ist, ist Cytochrom C einer der Bestandteile (wie das Adaptorprotein Apaf-1), die für die Aktivierung von Caspase-9 im Zytosol erforderlich sind. Zur Art und Weise, wie die Membranen der Familie Bcl-2 die Freisetzung von Cytochrom C regulieren, sind mehrere Hypothesen aufgestellt wurden, aber keine hat sich als endgültig erwiesen. Es gibt drei Basismodelle, die vorgeschlagen werden können.

1. Die Vertreter der Familie Bcl-2 bilden einen Kanal, der den Transport von Proteinen erleichtert. Basierend auf der Ähnlichkeit der Struktur von Bcl-X_L mit der Untereinheit des Diphtherietoxins, das Poren bildet, wurde angeregt, dass die Proteine Bcl-2 sich in die äußere Membran des Mitochondriums einfügen könnten, wo sie einen Kanal oder sogar ein großes Loch bilden könnten. Die Vertreter der Familie Bcl-2 können sich tatsächlich in eine synthetische Lipid-Doppelschicht einfügen, oligomerisieren und einen Kanal mit einer diskreten Leitfähigkeit bilden. Die Proteine Bid und Bik können das Mitochondrium direkt induzieren, um Cytochrom C freizusetzen, ohne mit VDAC oder ANT in Wechselwirkung zu treten, was darauf schließen lässt, dass sie außerhalb der PT-Poren agieren.
2. Die Vertreter der Familie Bcl-2 treten mit anderen Proteinen in Wechselwirkung, um Kanäle zu bilden. Die Vertreter der Familie Bcl-2 interagieren mit mehreren Proteinen. Eine Möglichkeit wäre, dass die Vertreter der Familie des apoptotischen Proteins andere Proteine der äußeren Membran des Mitochondriums rekrutieren, um eine Pore zu bilden, die ausreichend groß ist, um einen Kanal zu erzeugen. Ein besonders interessanter Kandidat für ein solches Protein wäre der spannungsabhängige Anionenkanal (VDAC), mehrere Vertreter der Familie Bcl-2 können sich mit ihm verbinden und seine Kanalaktivität regulieren. Da die Größe der charakteristischen Pore des VDAC-Kanals zu gering ist, um Proteine durchzulassen, soll gemäß diesem Modell angenommen werden, dass der VDAC eine Konformationsänderung nach der Bindung von Vertretern der Familie Bcl-2 erleidet. Es wurde gezeigt, dass die Proteine Bcl-2 und Bcl-X_L das Schließen der PT-Poren begünstigen, während das pro-apoptotische Protein Bax den entgegengesetzten Effekt hat, es tritt mit ANT und VDAC in Wechselwirkung, um die Öffnung dieser Poren und die Freisetzung von Cytochrom C zu begünstigen.
3. Die Vertreter der Familie Bcl-2 induzieren ein Aufbrechen der äußeren Membran des Mitochondriums. Es ist möglich, dass die Familie Bcl-2 die Homöostase des Mitochondriums steuert. In diesem Modell würde das apoptotische Signal die Physiologie des Mitochondriums verändern (z.B. Ionenaustausch oder oxidative Phosphorylierung), so dass sich die Organelle aufbläht, was ein physi sches Aufbrechen der äußeren Membran und eine Freisetzung von Proteinen ergibt, die sich zwischen den Membranen des Mitochondriums, im Zytosol, befinden. Die Notwendigkeit zur Bildung eines ausreichend großen Kanals, um das Cytochrom C passieren zu lassen, ist jetzt noch dringender erforderlich, da die Proteine einfach durch Risse in der Lipid-Doppelschicht diffundieren würden.

Die pro-apoptotischen Proteine (Bid) können unter Bildung einer Pore homodimerisieren, um das Cytochrom C austreten zu lassen. Die anti-apoptotischen Proteine (Bcl-2) haben die Fähigkeit, sich mit den PT-Poren zu verbinden und somit die Freisetzung von Intermembran-Proteinen zu verhindern, wohingegen die pro-apoptotischen Proteine (Bax) die Öffnung der PT-Poren erlauben.
Das AIF-Protein (für Apoptose-induzierender Faktor), das identifiziert wurde und dessen Gen kloniert wurde, kann von sich aus die Apoptose in isolierten Zellkernen induzieren. Dieses Molekül wird im Zytosol in Form eines Vorläufers synthetisiert, dann wird es in das Mitochondrium eingeführt. Wie beim Cytochrom C handelt es sich um ein phylogenetisch altes Molekül mit einer doppelten Funktion: Oxidation-Reduktion und apoptotischer Faktor. Jedoch im Gegensatz zum Weg des Cytochroms C, der die Aktivierung anderer Faktoren benötigt, um die Apoptose zu induzieren, ist der Weg von AIF umgekehrt von Caspasen unabhängig und benötigt keine Zwischenstufe, um die Apoptose auszulösen. Er würde u.a. einen Prototyp von Apoptose-Wegen darstellen, die von Caspasen unabhängig sind.
Die Hypothesen in Bezug auf die Mechanismen der Apoptose-Hemmung und insbesondere der Maskierung von Apaf-1 durch Bcl-2 und seiner anti-apoptotischen Agonisten scheinen noch ausführlich diskutiert zu werden. Apaf-1 ist wahrscheinlich ein wichtiges Ziel der Vertreter der Bcl-2-Familie, da die Apaf-1-defizienten Zellen gegenüber verschiedenen pro-apoptotischen Signalen unempfindlich sind und von sich aus durch Bcl-2 inhibiert werden. Zudem hat sich bei Überexpression von Apaf-1 gezeigt, dass dieses Protein mit den Überlebensproteinen wie Bcl-X_L und Bcl-2 assoziiert war. Demgegenüber wurde gezeigt, dass keine Coimmunpräzipitation zwischen den Membranen der Familie Bcl-2 und Apaf-1 existiert. Gleichfalls wurde Apaf-1 an Orten gefunden, wo die Überlebensproteine wie Bcl-2 und Bcl-X_L vorliegen, etwa in den äußeren Membranen des Mitochondriums, in der Kernhülle und im endoplasmatischen Retikulum.
4.1.3 Mechanismus der Modulation von Proteinen der Familie Bcl-2
Es existieren mehrere unterschiedliche Mechanismen, um die Funktionen von pro- und anti-apoptotischen Proteinen zu modulieren. Zunächst beeinflusst der Dimerisierungszustand der Vertreter der Familie Bcl-2 ihre Aktivität. Eine der Funktionen der anti-apoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-X_L besteht darin, mit dem pro-apoptotischen Protein Bax zu dimerisieren, um dessen Aktivität zu neutralisieren. Wenn es ein Heterodimer ist, ist Bax inaktiv; nachdem es aber frei ist, um mit sich selbst zu dimerisieren, kann Bax die Apoptose induzieren. Bid, Bik und Bad können dahingehend wirken, dass sie die anti-apoptotische Wirkung von Bcl-2 und Bcl-X_L unter Bildung von Heterodimeren hemmen. Zweitens kann durch Änderung des Expressionsstärke der pro- und anti-apoptotischen Vertreter der Familie Bcl-2 die Apoptose initiiert oder inhibiert werden. Wenn z.B. die Anzahl von Bcl-2 größer ist als die von Bax oder derselben gleich ist, werden die in Frage kommenden Zellen vor Apoptose geschützt. Wenn demgegenüber die Anzahl von Bax diejenige von Bcl-2 übersteigt, ist die Zelle stärker dafür anfällig, apoptotisch zu werden. Drittens können die Proteine der Familie Bcl-2 durch Phosphorylierung modifiziert werden. Das beste Beispiel für diesen Vorschlag wäre das pro-apoptotische Protein Bad. In seinem nicht phosphorylierten Zustand dimerisiert es mit Bcl-2 und Bcl-X_L, wodurch deren anti-apoptotische Aktivität neutralisiert wird. Ist demgegenüber Bad phosphoryliert, so ist es maskiert und kann deswegen nicht mit Bcl-2 und Bcl-X_L in Wechselwirkung treten und dieselben neutralisieren. Viertens kann die Familie Bcl-2 durch Spaltung modifi ziert werden. Bei einer durch Fas verursachten Apoptose wurde gezeigt, dass die Caspasen Bcl-2 und Bcl-X_L spalten würden und die Spaltprodukte keine Schutzmittel mehr sind und selbst pro-apoptotisch werden. Bid ist ein anderes Protein der Familie Bcl-2, das durch die Spaltung von Caspasen aktiviert wird. Während das Protein in seiner vollen Länge inaktiv ist, induziert Bid als Folge der durch die Caspase-8 verursachten Spaltung die Freisetzung von Cytochrom C durch das Mitochondrium. Schließlich modifiziert die Konformation der Proteine Bcl-2 ihre Aktivität. Der beste Beweis für diesen Mechanismus stammt aus Untersuchungen, die über Bax durchgeführt wurden. In seinem inaktiven Zustand existiert Bax in einer Konformation, in der es proteolytischen Spaltungen widersteht. Demgegenüber wird nach seiner Aktivierung und seiner erneuten Lokalisierung auf dem Mitochondrium der N-terminale Bereich des Proteins für Spaltungen anfällig, was darauf schließen lässt, dass sich wohl eine Änderung der Konformation ergeben hat.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Mitochondrien eine wichtige Rolle beim Auslösen der Apoptose annehmen. Ihr Zwischenmembran-Bereich enthält mehrere Proteine (Cytochrom C, Caspase-2, -3, -7 und -9, AIF), die, nachdem sie im Zytoplasma freigesetzt sind, an der Abbauphase der Apoptose teilnehmen. Das Rätsel der Mechanismen der Induktion und Steuerung der Apoptose durch das Mitochondrium beruht auf vier wesentlichen Punkten: nämlich den Molekülen der Familie Bcl-2/Bcl-X_L, die zur Bildung von Ionenkanälen an den intrazellulären Membranen beitragen könnten. Die pro-apoptotischen Vertreter dieser Familie (wie Bax, Bid usw.) könnten auch in die Permeabilität der PT-Poren der mitochondrialen Membran eingreifen, insbesondere als aktivierende Proteine der Apoptose. Schließlich könnten auch die anti-apoptotischen Moleküle der Familie Bcl-2 agieren, indem sie die endogenen Aktivatoren (wie Apaf-1) der Apoptose titern. Ein letzter Punkt ist derjenige, dass bestimmte Procaspasen auch eine mitochondriale Lokalisation aufweisen. Somit regulieren die apoptotischen Promotoren oder die Inhibitoren der Familie Bcl-2 die Apoptose, und zwar aufgrund mehrfacher Einwirkungen auf die Aktivierungskaskaden von Caspasen, auf das Redoxpotential und auf die Sperrfunktion der Permeabilität mitochondrialer Membranen. Insgesamt weisen diese Beobachtungen somit auf eine Einbeziehung des Permeabilitätsübergangs in die Regulierung der durch Mitochondrien induzierten Apoptose hin.
4.2 Rolle der Caspasen bei der Apoptose
4.2.1 Definition und Klassifizierung der Caspasen
Die Caspasen sind spezialisierte Proteasen, die für die Apoptose wesentlich sind. Sie sind von anderen Proteasen verschieden, weil sie ein Cystein für die Katalyse verwenden und nur nach den Asparaginsäureresten spalten. Diese ungewöhnliche Spezifität, ein Aspartat als Substrat aufzuweisen, wird nur bei einer anderen Protease, dem Granzym B, gefunden; dieses Enzym verwendet jedoch ein Serin als aktive Stelle. Die Caspasen werden wie eine einfache Polypeptidkette synthetisiert und sind inaktive Zymogene. Diese Zymogene bestehen aus drei Domänen: einer N-terminalen Pro-Domäne und zwei anderen Domänen, p10 und p20, die wieder im reifen Enzym gefunden werden. Bei ihrer Aktivierung wird jede Polypeptidkette in zwei Untereinheiten gespalten, eine große (p20) und eine kleine (p10), die in der Folge dimerisieren. Folglich sind die reifen Enzyme, die beobachtet wurden, Heterotetramere, die aus zwei Heterodimeren p20/p10 und zwei aktiven Stellen bestehen. Das N-terminale Peptid wird gespalten und bei der Aktivierung freigesetzt. Dieses N-terminale Peptid ist nicht für die enzymatische Aktivität erforderlich, seine Rolle für die Caspasen 8 und 10 ist bekannt, wo es als Wechselwirkungsdomäne mit anderen Proteinen agiert, um deren Aktivierung zu modulieren. Die Caspasen 8 und 10 enthalten eine "Todeffektor-Domäne" (DED), während die Caspasen 2 und 9 eine "Caspasen-Aktivierungs- und Rekrutierungsdomäne" (CARD) enthalten.
Es gibt wenigstens 14 unterschiedliche Caspasen, die bisher in den Geweben von Säugern identifiziert wurden. Es ist möglich, die Caspasen in drei Gruppen einzuteilen, die sich in ihrer Substratspezifität unterscheiden, d.h. durch ihr Erkennen von drei Aminosäuren, die der Asparaginsäure vorangehen. Die erste Gruppe enthält Caspasen, die am Entzündungsprozess beteiligt sind, also an der Aktivierung von Procytokinen, und umfasst die Caspasen 1, 4 und 5. Diese Enzyme sind auch als "ICE-ähnliche" Caspasen bekannt, weil ein anderer Name für Caspase-1 "Interleukin-1-umwandelndes Enzym" (ICE) ist. Ihr Tetrapeptid-Muster, das sie erkennen und bevorzugen, ist WEHD, demgegenüber sind die "ICE-ähnlichen" Caspasen in Bezug auf die Aminosäure-Substitution die tolerantesten, verglichen mit den Signal- und Effektor-Caspasen. Die zweite Gruppe von Caspasen enthält die Caspasen 6, 8, 9 und 10. Diese Enzyme werden als Signal-Caspasen angesehen, weil sie andere Caspasen aktivieren können und somit die Kaskade beginnen können. Ihr Erkennungsmuster ist (LV)EXD. Diese letzte Gruppe enthält die Caspasen 2, 3 und 7. Diese Enzyme sind unter dem Namen Effektoren bekannt, weit sie mehrere zelluläre Ziele spalten, was als Ergebnis den morphologischen Eindruck der Apoptose ergibt. Die Aktivierung dieser Caspasen führt im Allgemeinen zu einem Punkt beim Zelltod, an dem es kein Zurück mehr gibt. Die Effektor-Enzyme sind die spezifischsten Enzyme, wobei es notwendig ist, dass sie eine Asparaginsäure an der ersten und vierten Position haben müssen, die der Spaltungsstelle vorangehen. Ihr Erkennungsmuster ist DEXD. Die neuesten Caspasen, Caspasen 12–14, sind noch nicht ausreichend charakterisiert worden, als dass sie in eine der drei Gruppen eingeteilt werden könnten.
4.2.2 Aktivierung der Caspasen
Es existieren drei unterschiedliche Mechanismen zur Aktivierung der Caspasen. Der erste Mechanismus ist die Aktivierung der Caspase durch eine andere Caspase, die zuvor aktiviert wurde. Der größte Teil der Caspasen wird nach einer proteolytischen Spaltung des Zymogens zwischen den Domänen p20 und p10 und üblicherweise einer anderen Spaltung zwischen der Pro-Domäne und der Domäne p20 aktiviert. Es ist interessant festzustellen, dass alle diese Spaltungs stellen nach einem Aspartat, dem Substrat der Caspasen, vorliegen, was auf die Möglichkeit einer Aktivierung durch Autokatalyse schließen lässt. Tatsächlich besteht die einfachste Art zur Aktivierung einer Caspase darin, eine andere bereits aktivierte Caspase anzubieten. Diese Kaskadenstrategie von Caspasen wird in auseichendem Maße von der Zelle für die Aktivierung der drei wichtigen Caspasen Caspase-3, -6 und -7 verwendet. Diese drei Effektor-Caspasen werden als die regesten der Familie der Caspasen angesehen, und sie sind üblicherweise zahlreicher und aktiver als die anderen.
Wie in der 4 erläutert ist, erfolgt die erste Spaltung zwischen den Domänen p20 und p10 (hier 12 kDa), um die zwei Untereinheiten zu trennen. Die zweite proteolytische Spaltung erfolgt zwischen der Pro-Domäne und der großen Untereinheit und dann erfolgt die Bildung eines Heterotetramers, das zur reifen Caspase in ihren aktiven Form führt.
Die Caspasen-Kaskade ist ein sehr nützliches Verfahren, um das pro-apoptotische Signal zu amplifizieren, sie kann aber nicht erklären, wie die erste, die am weitesten stromabwärts gelegene der Caspasen aktiviert wird. Es gibt wenigstens zwei andere Modelle, die die Aktivierung aller ersten Caspasen erklären könnten. Das erste Modell ist die Induktion der Aktivierung durch Annäherung. Es ist bekannt, dass die Caspase-8 die Initiierungscaspase bei der Apoptose ist, die durch die Todesrezeptoren induziert wird. Bei der Bindung des Liganden an seinen Rezeptor trimerisiert der Todesrezeptor CD95/Fas und bildet Signalkomplexe, die mit der Membran verbunden sind. Diese Komplexe rekrutieren durch die Adaptorproteine mehrere Moleküle von Procaspase-8, was als Ergebnis eine große lokale Konzentration an Zymogenen ergibt. Dieses Modell der Aktivierung durch Annäherung bedingt, dass unter dieser Massenbedingung die schwache proteolytische Aktivität, die der Procaspase-8 eigen ist, ausreichend ist, um eine gegenseitige Spaltung der Proenzyme und eine gegenseitige Aktivierung derselben zu ermöglichen. Das letzte Modell der Aktivierung der Caspa sen ist die Assoziierung der Procaspase mit einer regulierenden Untereinheit. Nehmen wir als Beispiel die Caspase-9, für deren Aktivierung eine Assoziierung mit den Cofaktoren notwendig ist. Der Cofaktor "apoptotischer Protease-aktivierender Faktor-1" (Apaf-1) wurde dergestalt durch einen biochemischen Versuch identifiziert, dass er eines der zwei Proteine ist, die für die Aktivierung der Caspase-9 notwendig sind, wobei das andere das Cytochrom C ist. Der Komplex, den diese drei Proteine bilden, wobei ATP notwendig ist, ergibt die aktive Form der Caspase-9, die häufig als Apoptosom bezeichnet wird. Somit ist Apaf-1 nicht nur ein Aktivator-Protein der Caspase-9, sondern ist eine wesentliche Untereinheit für das Funktionieren derselben. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die Effektor-Caspasen im Allgemeinen durch vorhergehende Caspasen aktiviert werden, während die Initiator-Caspasen durch die regulierten Protein-Protein-Wechselwirkungen aktiviert werden.
4.2.3 Die Opfer der Caspasen
Die Caspasen spalten eine große Anzahl von Zellproteinen, und das proteolytische Verfahren ist begrenzt, da es eine kleine Anzahl von Schnitten gibt, die realisiert werden. Manchmal haben die Spaltungen die Aktivierung des Proteins zur Folge, und ein anderes Mal die Inaktivierung, aber niemals den Abbau, da ihre Substratspezifität die Caspasen dahingehend auszeichnet, dass sie die striktesten Endopeptidasen sind. Die Caspasen spalten mehrere Zellproteine, deren Anzahl fortlaufend zunimmt. Die Strukturproteine, Kernproteine, Signalproteine sind alles Ziele von Caspasen (Tabelle 1). Es gibt unterschiedliche Proteine des Zytoskeletts, die durch Caspasen gespalten werden, wie z.B. Lamin, α-Fodrin und Actin. Die Spaltung dieser Proteine ist wahrscheinlich für morphologische Veränderungen verantwortlich, die während der Apoptose beobachtet werden; z.B. ist die Spaltung der Kernlamine für die Schrumpfung und Ausstülpungsbildung des Kerns notwendig. Die Fragmentierung der DNA ist auf die Aktivierung der "Caspasen-aktivierten DNase" (CAD) durch die Caspase-3 zurückzuführen. Diese DNase existiert in Form eines inaktiven Komplexes mit der hemmenden Untereinheit ICAD. Die Aktivierung von CAD erfolgt somit durch die Spaltung der hemmenden Untereinheit durch die Caspase-3, was die Freisetzung und katalytische Aktivierung der Untereinheit ergibt.
Tabelle 2: Einige Beispiele von Opfern der Caspasen
4.3 Das Protein p53
Das Protein p53 ist ein Transkriptionsfaktor, der eine entscheidende Rolle bei der Vorbeugung von Krebs spielt. Das Protein p53 wird als "Wächter des Genoms" angesehen. Dieses Protein ist ein gutes Beispiel dafür, wie die Entscheidung zwischen der Apoptose oder dem Leben an einem aktivierten Verifizierungspunkt getroffen werden kann, wenn die DNA beschädigt ist. Alles hängt vom Stimulus und der Phase ab, in der sich die Zelle befindet; die Aktivierung von p53 kann zu einem Anhalten der Zellproliferation und zur Reparatur der DNA oder auch zur Apoptose führen. Während der erste Stimulus für die Aktivierung von p53 die beschädigte DNA ist, kann ein anderer Zellstress, wie Abreicherung des Metaboliten, eine physische Schädigung, Wärme und Sauerstoffzutritt, ebenfalls p53 aktivieren.
Der p53-Gehalt erhöht sich dramatisch in einigen Minuten nach der Schädigung, die die Zelle erlitten hat. Diese Erhöhung wird durch posttranslationale Modifikationen des Polypeptids von p53 ermöglicht, ohne eine offensichtliche dramatische Induktion des mRNA-Gehalts von p53 nach der der DNA zugefügten Beschädigung. Die Modifikation, die an dem Polypeptid von p53 nach einer DNA-Beschädigung bewirkt wird, äußert sich durch die Phosphorylierung. In einer Zelle, die irgendeinem Stress ausgesetzt wurde, besitzt das Protein p53 eine extrem kurze Halbwertszeit, es wird aber sehr viel stabiler nach einer der Zelle zugefügten Schädigung. Die Instabilität des Proteins p53 unter normalen Bedingungen für die Zelle ist mit der Tatsache verbunden, dass p53 das Ziel einer Proteolyse ist, die durch kleine Peptide, Ubiquitine, induziert wird. Folglich wird p53 wieder durch die Ubiquitine mit Hilfe eines Proteins markiert, das den Namen Mdm2 hat; ein Protein, das eine Rolle bei der negativen Regulation von p53 spielt. Es wurde gezeigt, dass das Protein Mdm2 mit p53 interagiert, damit es das perfekte Ziel von Proteasen durch die Ubiquitine wird. Das Protein Mdm2 verursacht ebenfalls die Translokation von p53 des Zellkerns im Zytoplasma, wo es eine Proteolyse erleidet, die durch die Ubiquitine induziert wird. Folglich wurde durch die Phosphorylierung der Regulationsdomäne am C-terminalen Ende von p53 gezeigt, dass die Aktivierung seiner Bindung mit der DNA gemäß spezifischen Sequenzen stattfindet. Zudem verursacht die Phosphorylierung von Serin-15 und Serin-20 am N-Terminus von p53 die Hemmung der Wechselwirkung zwischen p53 und Mdm2, wodurch demgemäß der Gehalt an p53 erhöht und dasselbe in eine Form überführt wird, die einer Transkriptionsaktivität fähig ist. Eine große Anzahl von Kinasen phosphorylieren p53, einschließlich der Kinase Casein, der Kinasen, die mit extrazellulären Signalen verbunden sind, der Proteinkinase C und der Kinase Raf-1. Nachdem p53 phosphoryliert ist, wirkt es wie ein Transkriptionsfaktor, um die Transkription mehrerer Gene, die an der Apoptose beteiligt sind, zu erhöhen oder zu reduzieren.
Mehrere regulierende Proteine des Zellzyklus werden durch p53 induziert, z.B. p21, GADD45 und die Vertreter der Familie 14-3-3. Die Fähigkeit von p53, einen Stillstand des Zellzyklus in der Phase G₁ nach einer Beschädigung der DNA zu induzieren, ist wohlbekannt und kann durch die Tatsache erklärt werden, dass das Protein p53, sobald es angeregt ist, eine Transkriptionsaktivität besitzt, die es erlaubt, das Inhibierungsgen der von Cyclinen abhängigen Kinase (Cdk), das Protein p21, zu transkribieren. Eine erhöhte Anzahl von p21 hemmt dann die Kinasen Cyclin E/cdk2 und Cyclin A/cdk2, wodurch verhindert wird, dass diese Kinasen die Progression des Zellzyklus fördern. Zudem ist das Protein p53 auch am Stillstand des Zellzyklus in Phase G₂ beteiligt, teilweise weil p53 die Expression des Proteins Sigma 14-3-3 induziert, das die Maskierung des Cyclin-Komplexes B/Cdc2 verursacht. Das Protein p53 kann durch Aktivierung der Transkription unterschiedlicher Gene, die Proteine ergeben, welche in den apoptotischen Prozess verwickelt sind, zur Apoptose führen. Die Proteine, die induziert werden, sind das Protein Bax, der Rezeptor Fas und DR5 (Rezeptor für den Todesliganden TRAIL), die alle am Prozess der Apoptose beteiligt sind. Es verursacht auch die Verringerung der mRNA-Expression von Bcl-2 und begünstigt somit die Apoptose. Es scheint ein apoptotischer Weg zu existieren, der durch p53 induziert wird, bei dem nicht die Freisetzung von Cytochrom C notwendig ist, für den aber immer die Aktivierung von Caspasen notwendig ist. Trotzdem die Expression des Proteins Bax erhöht ist, befindet es sich eher im Zytosol, und es ist keine Translokation auf das Mitochondrium nachweisbar. Somit könnte ein anderer Weg existieren, durch den das Protein p53 die Apoptose induzieren würde, ohne dass eine Freisetzung von Cytochrom C erfolgt.
Die Endergebnisse nach einer Schädigung der DNA können Stillstand des Zellzyklus sein, somit des Wachstums, oder auch die Apoptose. Eine Schädigung der DNA ergibt eine Akkumulierung und Aktivierung des Proteins p53 (5). Sobald es aktiviert ist, besitzt p53 eine Transkriptionsaktivität, die die Transkription verschiedener Gene (GADD45, 14-3-3, Mdm2, p21, Bax, Fas, DR5) erhöht. Es kann auch verschiedene Gene (Bcl-2) herunterregulieren. Indem p21 erhöht wird, das die von Cyclinen abhängigen Kinasen (Cdk) hemmt, wird nun der Zellzyklus in G₁ angehalten. Der Zellzyklus kann auch in der Phase G₂ angehalten werden, indem die Proteine GADD45 und 14-3-3 durch p53 erhöht werden. Der Apoptose-Prozess wird durch unterschiedliche Proteine (Bax, Fas, DR5) realisiert, die durch p53 hochreguliert werden. Ein Regulierungsschleife des Proteins p53 ist aufgrund der Erhöhung von Mdm2 möglich, einem Protein, das sich an p53 bindet und seinen Abbau begünstigt.
4.4 Todesrezeptoren
Die Todesrezeptoren sind Rezeptoren, die sich auf der Oberfläche der Zelle befinden, und sie werden so bezeichnet, weil sie durch die Bindung an einen Liganden den Apoptose-Prozess verstärken können. Diese Rezeptoren sind Teil der Familie des TNF-Rezeptors, insbesondere des TNF-R1-Rezeptors selbst, des Fas-Rezeptors (wird auch als CD95 oder Apo-1 bezeichnet) und auch der Rezeptoren DR-3, DR-4 und DR-5. Diese Rezeptoren werden durch ihren Liganden aktiviert, der löslich oder membranartig ist wie der "Tumornekrosefaktor-α" (TNF-α), Fas-L und der "TNF-verwandte Apoptose-induzierende Ligand" (TRAIL). Die Liganden der Todesrezeptoren sind Teil der Familie des Cytokins TNF-α und sind homotrimere Moleküle. Kristallographische Analysen weisen darauf hin, dass jedes Monomer des Liganden an einen Rezeptor bindet, was darauf hinweist, dass die Bindung eines Liganden die Trimerisierung dieser Rezeptoren zur Folge hat. Die Wechselwirkung von Ligand-Rezeptor induziert die Trimerisierung des Rezeptors, die die physikalische Assoziierung von Adaptorproteinen mit den Domänen ermöglicht, die mit der Protein-Todesdomäne (RIP- DD) interagieren, wodurch die Rekrutierung und Aktivierung von proximalen Caspasen, wie die Procaspasen-8, -10 und -2, begünstigt wird, die nun befähigt sind, das Todessignal in das Innere der Zelle zu übertragen. Nehmen wir als Beispiel die Aktivierung des TNF-R1-Rezeptors. Durch die Bindung von TNF-α an den TNF-R1-Rezeptor trimerisiert der letztere und ergibt als Resultat die Aggregation von Todesdomänen, die die Rekrutierung von TRADD ermöglichen, das seinerseits ein adaptives Molekül, TRAF-2 "TNF-Rezeptor-assoziierter Faktor 2", rekrutiert, das zur Aktivierung der Wege JNK und NF-κB führt. TRADD kann auch FADD und RIP rekrutieren, was zum apoptotischen Prozess bzw. zur Aktivierung von NF-κB führt. RIP kann gleichermaßen RAIDD, "RIP-assoziiertes ICH-1/CED-3-homologes Protein mit einer Todesdomäne", rekrutieren, das dann die Caspase-2 rekrutiert und die Apoptose induziert. Wenn man den Rezeptor Fas als Aktivierungsmodell der Apoptose nimmt, rekrutiert der Komplex von Fas und FADD die Caspase-8, die den Komplex bildet, der das Todessignal, "Todinduzierender Signalkomplex" (DISC), induziert. Sobald er zusammengefügt ist, verursacht der DISC eine schnelle Autoaktivierung der Caspase-8, die die Caspase-3 aktiviert und die Apoptose der Zelle verursacht. Somit ist der erste Wirkungsweg des Fas-Rezeptors ein schneller Weg, der das Mitochondrium kurzschließt und keinen Beitrag von neuen Molekülen benötigt, denn er basiert auf der Wechselwirkung von bereits existierenden Molekülen.
Jedoch wurde kürzlich gezeigt, dass die Aktivierung der Caspase-8 nach der Trimerisierung des Fas-Rezeptors auch die Spaltung von Bid, einem proapoptotischen Protein der Familie Bcl-2, herbeiführen könnte. Diese Spaltung bringt das Eindringen einer abgeschnittenen Form von Bid in das Mitochondriums mit sich, mit der Konsequenz des Austretens von Cytochrom C, dann der Depolarisierung des mitochondrialen Membranpotentials und der Apoptose. Es wurde gleichermaßen gezeigt, dass, wenn eine Aktivierung von DR-4 und DR-5 durch TRAIL vorliegt, die Caspase-8 aktiviert wird. Der verwendete Weg ist noch nicht sicher aufgeklärt, doch es wird von verschiedenen Seiten bestätigt, dass es eine Aktivierung der Caspasen-3 und -9 nach der Aktivierung der Caspase-8 gibt, und beobachtet, dass Bid nach der Aktivierung der Caspase-8 gespalten wird. Es ist möglich, dass durch die Bindung von TRAIL an die Rezeptoren DR4 oder DR5 eine Aktivierung der Caspase-8 durch Rekrutierung mit Hilfe eines Adaptormoleküls erfolgt, das zugleich die Caspase-3 aktiviert und Bid spaltet, damit das letztere aktiv wird und die Freisetzung von Cytochrom C ermöglicht, was die Aktivierung der Caspase-9 zur Folge hätte, die ihrerseits die Caspase-3 aktivieren würde, was eine Amplifikation der Kaskade von Caspasen verursachen und den Tod der Zelle ergeben würde.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es wenigstens zwei Wege der Übertragung der apoptotischen Signals durch bestimmte Todesrezeptoren gibt, einen direkten schnellen Weg und einen langsameren, der das mitochondriale Relais einsetzt. Deshalb klassifizieren einige Autoren die Zellen (Typ I oder II) gemäß ihrem Induktionsmodus der Apoptose durch Fas. Z.B. führt die Aktivierung von Fas in bestimmten Zellen quasi ausschließlich über den Caspasen-Weg (Zellen des Typs I). Diese Zellen weisen üblicherweise keine Beteiligung des Teils der Mitochondrien auf, und der Zelltod wird nicht durch Bcl-2 oder Bcl-X_L inhibiert. In anderen Zellen wird zur Aktivierung von Fas ein Weg eingeschlagen, bei dem in hohem Maße Mitochondrien verwendet werden, und dies nach der Aktivierung der Caspase-8. Die anti-apoptotischen Proteine Bcl-2 oder Bcl-X_L können die Apoptose nur in den Zellen des Typs II hemmen, und zwar durch ihre Wirkung, die Freisetzung von Cytochrom C im Zytosol zu verhindern.
Mehrere Reize können die Apoptose initiieren, andererseits werden häufige morphologische und biochemische Änderungen beobachtet, und zwar unabhängig vom anfänglichen Stimulus. Untersuchungen lassen darauf schließen, dass der größte Teil der apoptotischen Signale sich auf eine beschränkte Anzahl von Wegen konzentriert, die zur Apoptose führen.
Die 6 zeigt die Struktur von Vertretern von Membran-Todesrezeptoren und ihre Wechselwirkungen mit den hauptsächlichen zytoplasmatischen Effektoren, die an den apoptotischen Wegen beteiligt sind. Die roten Pfeile zeigen eine direkte Aktivierung der Caspase-8 an, und die schwarzen Pfeile geben eine Hemmung der Apoptose mit intermediären Etappen an (Aktivierung von Kinasen/Transkriptionsfaktor). Die in dieser Figur erwähnten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen: DD, death domain; TRADD, TNF-receptor associated death domain; FADD, Fas-associated death domain; DISC, death-inducing signaling complex; RIP, receptor-interacting protein; TRAF2, TNF-receptor associated factor-2; NF-κB, nuclear factor kappa B, I-κB, inhibitory kappa B; JNKK, JNK kinase; TNF, tumor necrosis factor; TNFR, TNFR, Rezeptor von TNF; Fas L, Fas-Ligand; TRAIL, tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand; DR4-5, death receptor 4-5; DED, death-effector domain; RAIDD, RIP-associated ICH-1/CED-3-homologous protein with a death domain.
Für den Apoptose-Prozess ist die Beteiligung mehrerer Wege erforderlich, um die Caspasen zu aktivieren (7). Die zwei bekanntesten und am besten charakterisierten sind die Übertragung des apoptotischen Signals durch die Todesrezeptoren, und der andere Weg mehr im Inneren der Zelle ist die Apoptose, die durch die Änderungen der mitochondrialen Integrität induziert wird, insbesondere die Freisetzung von apoptotischen Faktoren wie Cytochrom C und AIF. Es existieren Kopplungen zwischen diesen beiden Signalwegen und Amplifikationsschleifen des Signals. Abkürzungen: AIF, Apoptose induzierender Faktor; tBid, abgeschnittenes Protein.
4.5 Proteinkinase C und Nurr 77
Die Proteinkinase C (PKC) ist Teil einer Familie der Serin/Threonin-Kinasen. Es gibt wenigstens 11 unterschiedliche Isoenzyme von PKC, die man in drei Untergruppen einteilen kann, indem man sich auf ihre Struktur und ihren Mechanismus der Antwort auf Regulationsfaktoren bezieht. Die konventionellen PKC (α, βI, βII, γ) hängen von Ca²⁺ ab und werden durch Diacylglycerin (DAG) oder durch 12-o-Tetradecanoylphorbol-3-acetat (PMA) in vivo aktiviert. Die zweite Untergruppe (δ, ε, η, θ, μ), die neuen Isotypen, reagieren nicht auf Ca²⁺, werden aber durch DAG und PMA aktiviert. Die letzte Untergruppe (λ, ζ, ι), die atypischen PKC, sind sowohl gegenüber Ca²⁺ als auch DAG unempfindlich. Die PKC sind für die Übertragung mehrerer Zellsignale bei einer Vielzahl von Zellprozessen verantwortlich, wie zelluläres Wachstum, Differenzierung, maligne Transformation und Apoptose. Die PKC sind auch dafür bekannt, dass sie die Aktivität verschiedener Membranproteine modulieren, wie die Transportproteine, die Kanäle und die Membranproteine, die mit dem Zytoskelett verbunden sind. Da sie unterschiedliche Funktionen besitzen, wurde festgestellt, dass ihre Aktivierung unterschiedliche Ergebnisse ergeben kann, die selbst entgegengesetzte Ergebnisse sein können. Es wurde gezeigt, dass die Aktivierung von PKC die Apoptose bei einer mit PMA behandelten gastritischen Krebszelllinie induziert, und zwar über die Caspase-3 und die Serinproteasen. Gleichermaßen wurde gezeigt, dass PKC die durch den Fas-Rezeptor induzierte Apoptose hemmt, und zwar durch Modulierung des Verlustes an Kalium (K⁺) und Hemmung der Aktivität des Caspasen-8 und -3. Durch verschiedene Forscher wurde gezeigt, dass die PCK eine Rolle spielen bei der Transkriptionsregulierung der Expression der Gene Fas und Fasl. Die Arbeitsgruppe von Park hat aufgezeigt, dass die Fähigkeit der PCK zum Induzieren der Expression von Fas aufgrund des Gens TDAG51 (T-cell death-associated gene) in den Zellen möglich ist, die nur den Wildtyp aufweisen. Es existiert ein anderer Mediator bei der Expression des Systems Fas/FasL, der ein Vertreter der Superfamilie von steroiden, nukleären Waisen-Rezeptoren Nurr77 ist. Nurr77 spielt eine Rolle beim Zellwachstum durch seine Rolle als Kerntranskriptionsfaktor. Es wurde gezeigt, dass durch Zugabe von Nurr77 in transgener Form zu Thymozyten eine Erhöhung des Fas-Liganden erhalten wird, was nahelegt, dass Nurr77 die Zellen dazu bringen kann, durch Induktion der Expression des Fas-Liganden apoptotisch zu werden. Eine weitere Aufgabe wurde für Nurr identifiziert. Nurr77 könnte befähigt sein, die Apoptose durch ein Mittel zu regulieren, das von seiner Aktivität der Transkriptionsregulierung unabhängig ist, u.a. durch seine erneute Lokalisierung des Zellkerns zu den Mitochondrien hin, was die Freisetzung von Cytochrom C verursacht. Durch seine Rolle als Transkriptionsfaktor und seine Rolle als Protein, das die Freisetzung von Cytochrom C verursachen kann, kann Nurr77 somit eine Zelle dazu bringen, dass sie apoptotisch wird.
5. Colonkrebs und Mittel zu seiner Abwehr
Im Inneren eines Gewebes wird die Homöostase durch das Gleichgewicht zwischen dem Zellwachstum und dem programmierten Zelltod aufrechterhalten. Eine Krebszelle kann als eine Zelle definiert werden, die den Apoptose-Prozess überlebt hat und jetzt einen Teil der Zellen ausmacht, die zur Tumorbildung beitragen können. Mehrere Gründe können zur Krebsbildung führen, sowohl eine Schwachstelle im Wachstumsprozess als auch eine Schwachstelle im Apoptose-Prozess. Diese Schwachstellen sind für zahlreiche Krankheiten verantwortlich, einschließlich Krebs. Eine Zellakkumulierung kann erzeugt werden, wenn die Sterblichkeitsrate normal ist, aber die Wachstumsrate anomal hoch ist oder auch wenn die Wachstumsrate normal ist, aber die Sterblichkeitsrate anomal niedrig ist. Die maligne Transformation und die Tumorprogression sind komplizierte Vorgänge, für die eine große Anzahl genetischer Veränderungen notwendig sind.
Normalerweise werden Tumorzellen beseitigt, indem an der Membranoberfläche Antigene für zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) und für "natürliche Killerzellen" (NK) durch den Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I (MHC I) an ihrer Oberfläche präsentiert werden, was die Aktivierung der Immunantwort ermöglicht. Die zytotoxischen Zellen können die Tumorzellen erkennen, indem an ihrer Oberfläche Virusantigene (nicht eigene), Neo-Antigene (vom mutierten eigenen Protein abgegeben), nicht mutierte, aber eigene überexprimierte Antigene, on kofetale Antigene (Gen, das im Laufe der Embryogenese ausgelöscht wird, das spontan re-transkribiert werden würde) exprimiert werden.
Zuweilen entwickeln die Tumorzellen Alternativen, um dem Immunsystem zu entkommen. Mehrere Mechanismen sind für die Tumorzelle aufgestellt worden, einige verursachen eine Abberation der Antigen-Präsentation an der Oberfläche der Krebszelle: die Verringerung der Expression von MHC I (diese Tumorzelle ist nicht mehr durch CTL erkennbar, sie kann aber durch NK zerstört werden) und Veränderungen der Struktur von MHC I (weder CTL noch NK werden erkannt). Somit solche, die eine schlechte Wechselwirkung zwischen zytotoxischen Zellen und der Krebszelle verursachen: die Verringerung der Sekretion von costimulierenden oder Adhäsionsmolekülen (wesentlich bei der antigenen Präsentation, kann Anergie verursachen), die Verringerung oder Mutation des Membranrezeptors Fas und des Rezeptors DR4 oder DR5 (Tumorzelle, die gegenüber einem Angriff von CTL oder NK weniger empfindlich ist). Die Tumorzellen können auch Cytokine sezernieren, die ihr Wachstum begünstigen. Eine Untersuchung zeigt, dass ein bestimmter Colonkrebs, wie die Produktion von IL-10 (das den Effekt hat, die Produktion der Zelle T CD4⁺ des Typs Th1 zu hemmen und die Funktionen von Makrophagen zu hemmen), durch die lokale Produktion von pro-inflammatorischen Cytokinen wie IL-6 und IFN-γ gesteuert wird. Eine zweite Untersuchung, die mit 9 Colonkrebs-Zelllinien durchgeführt wurde, zeigt, dass diese Immunsuppressionsfaktoren erzeugen, die die Proliferation von T-Zellen hemmen.
Das Konzept der Zellimmunität basiert auf der Fähigkeit von zytotoxischen T-Lymphozyten zur Beseitigung von Tumorzellen. Die Wirkungsweise von CTL besteht darin, die Apoptose bei Krebszellen durch zwei Mechanismen zu induzieren: durch die Todesrezeptoren und über Perforin/Granzym B. Demgegenüber entwickeln die Tumorzellen in bestimmten Fällen Mittel, um einen Gegenangriff gegen die Überwachung des Immunsystems zu führen und verursachen auf diese Weise, dass der Apoptose-Prozess nicht ausgelöst wird. Gruppen von Forschern haben gezeigt, dass sich Colonkrebszellen gegen die CTL verteidigen können, und zwar durch Expression des Fas-Liganden auf ihrer Membranoberfläche, wodurch der Tod von CTL durch Bindung des Fas-Rezeptors von CTL und des Fas-Liganden von Krebszellen verursacht wird. Demgegenüber haben widersprüchliche Ergebnisse diese Hypothese dementiert. Es lässt sich also feststellen, dass diese Hypothese ein ziemlich kontroverser Forschungsgegenstand bleibt. Ein anderer Mechanismus kann durch Krebszellen entwickelt werden, um die Apoptose zu vermeiden und die CTL zu neutralisieren: die Sekretion in löslicher Form des Fas-Liganden. In diesem Handlungsschema sezerniert die Krebszelle den Fas-Liganden in löslicher Form, wodurch eine Mutation in der Transmembran-Domäne des Proteins verursacht wird, folglich dieses keinen Verankerungspunkt mehr an der Zellmembran besitzt und sich somit der Fas-Ligand mit seinem Liganden verbindet, der an der Oberfläche der CTL vorliegt, und somit die Apoptose bei den CTL verursacht. Es wurde gezeigt, dass in einem bestimmten Fall die CTL die Apoptose bei Krebszellen, die den Fas-Liganden exprimieren, durch den Mechanismus Perforin/Granzym B induzieren können. Demgegenüber konnten in einem anderen Fall diese Tumorzellen einen Mechanismus entwickeln, der die Wirksamkeit des Mechanismus Perforin/Granzym B durch Überexpression eines Inhibitors von Serinprotease, PI-9, behindert.
Tumorzellen können eine große Anzahl von Mechanismen entwickeln, um den Tod zu vermeiden, manchmal können diese Mechanismen aber dazu führen, dass die Zelle sich selbst tötet oder auch ein Fratrizid (Tod einer benachbarten Krebszelle) verursacht wird. Wenn sich die Zelle z.B. anschickt, den Fas-Liganden an ihrer Oberfläche oder in löslicher Form zu sezernieren, könnte sich derselbe mit dem Fas-Rezeptor einer benachbarten Zelle oder sogar mit einem Fas-Rezeptor, der sich an der Oberfläche der gleichen Zelle befindet, verbinden.
Es bestehen andere Arten für eine Krebszelle, der Apoptose zu entgehen, u.a. durch Mutation eines bestimmten Proteins, das am Apoptose-Prozess beteiligt ist, wie z.B. das Protein p53. Dieses Protein ist eines der Ziele des größten Teils der Colonkrebsarten. Durch Mutation, die der Zelle ihre Wächterfunktionen des Aktivierungsgenoms des Apoptose-Prozesses entzieht, selbst wenn die Zelle im Bereich ihrer DNA durch unterschiedliche Behandlungen (Strahlentherapie und/oder Chemotherapie) beschädigt ist, riskiert sie somit trotzdem, der Apoptose zu entgehen. Es gibt auch die Überexpression des Proteins c-FLIP; dieses Protein hemmt den Bindungsschritt zwischen rekrutierenden Proteinen. FADD der Caspase-8 durch seine Bindung an FADD. Es wurde gezeigt, dass die Überexpression dieses Proteins bei unterschiedlichen Colonkrebsarten häufig ist, was zur Tumor-Transformation in vivo beitragen könnte.
Natürlich kann die Liste der Umgehungsmechanismen lang sein, denn die Krebszellen scheinen Strategien zu entwickeln, die es ihnen erlauben, mehrere Hindernisse zu umgehen, die fortlaufend gefunden werden.
5.1 Therapien gegen Colonkrebs
Die Behandlungen von Colonkrebs erhalten eine hohe Erfolgsaussicht, wenn der Krebs im Colon lokalisiert ist und wenn er nicht die Colonwände durchdrungen hat. Man führt diese hohe Erfolgsaussicht auf die Diagnostik zurück, die früh bei der Entwickelung der Krankheit erhalten wurde. Gemäß der kanadischen Statistik steht der Colonkrebs an dritter Stelle der Krebsarten, die die größte Anzahl an Todesfällen in Kanada pro Jahr verursachen, 6500 Tote im Jahr 2000 und 17 000 neue Fälle. Deshalb sind zur Zeit mehrere Behandlungen verfügbar, um dieser Krankheit entgegenzuwirken.
5.1.1 Stadien von Colonkrebs nach Dukes
Die Behandlungen erfolgen gemäß dem Stadium der Krankheit, es existieren zwei Systeme, um zu klassifizieren, in welchem Stadium sich der Colonkrebs eines Patienten befindet: die Klassifizierung von Duke und das System TNM ("tumor characteristics, nodal involvement and amount of metastasis"). Die Klas sifizierung von Duke wird zur Zeit am häufigsten verwendet, somit hier eine Zusammenfassung: Das Stadium A stellt den Schritt dar, in dem der Colonkrebs auf die Schleimhaut oder die Unterschleimhaut des Colon beschränkt ist. Die Behandlungsmöglichkeiten in diesem Stadium sind entweder die Colosektomie bei einer Oberflächenläsion, die durch den Krebs verursacht wird, oder eine Exzision des betroffenen Teils bei einer tieferen Läsion. Die Überlebensrate nach der Operation beträgt 90%. Das Stadium B richtet sich nach dem Grad des Befalls von Organen oder von Geweben, die in der Nähe des Tumors vorliegen. Die in diesem Fall zu verabreichende Behandlung ist natürlich die Exzision des Tumors und das Erwägen des Einsatzes einer Chemotherapie und/oder Strahlentherapie. Die Überlebensrate beträgt 70–80%. Das Stadium C umfasst den Befall von Lymphknoten und die Bildung von Metastasen in den Hauptblutgefäßen. Die vorzuschreibenden Behandlungen sind die Exzision erkrankter Teile, die Chemotherapie in Kombination mit einem Hilfsmittel. Im Stadium D, dem abschließenden, liegen entfernte Metastasen vor. Die Behandlungen sind die Ablation unterschiedlicher isolierter Metastasen (Leber, Lunge, Eierstöcke), sowie die Chemotherapie und/oder die palliative Strahlentherapie. Die Überlebensrate nach der Operation beträgt im Allgemeinen weniger als 5 Jahre.
5.1.2 Chemotherapie
Das am häufigsten bei der Chemotherapie verwendete Medikament ist 5-Fluoruracil (5FU), es wird in intravenöser Form verabreicht. Untersuchungen haben gezeigt, dass die Verwendung von 5FU nach der Exzision des Tumors für Patienten in der Phase C gemäß Dukes vorteilhafter ist als die alleinige Exzision. Mit dem Wunsch, die besten Ergebnisse zum Besiegen des Colonkrebs zu erhalten, werden dann verschiedenen Patienten, die vom Colonkrebs in der Phase B und C betroffen sind, kombinierte Behandlungen verschrieben. Mehrere Untersuchungen zeigen, dass bei der Kombination von 5FU mit einem Hilfsmittel, Levamisol oder Leucovorin, bessere Ergebnisse für das Stadium C von Dukes erhalten werden. Levamisol ist dafür bekannt, dass es die Wirksamkeit von 5FU verbessert; durch diese Kombination wurde gezeigt, dass die Fälle eines erneuten Auftretens verringert werden und der Mechanismus wahrscheinlich mit der Aktivierung der Makrophagen verbunden ist, die die verbliebenen Tumorzellen zerstören, da dies das Immunsystem positiv zu modulieren scheint. Leucovorin ist eine Folsäure, die verabreicht wird, um negative hämatologische Effekte zu vermeiden, es ist somit behilflich, die Zellen gesund und lebendig zu halten und ermöglicht, dass die Krebszellen der zytotoxischen Wirkung von 5FU ausgesetzt werden. Im Allgemeinen bringen die Untersuchungen zum Ausdruck, dass die Behandlungen in Kombination mit dem Hilfsmittel im Vergleich zur alleinigen Verwendung von 5FU einen positiven Effekt auf die Überlebensrate sowie auf die Zeitspanne des erneuten Auftretens des Tumors nach der Ablation des Krebs haben. Der Wirkungsmechanismus von 5FU besteht darin, sich mit einem Enzym im Inneren der Zelle zu verbinden, das die Synthese von Thymin bei der DNA-Replikation ermöglicht, und dieselbe zu hemmen. Demgemäß wird die zur Teilung unfähige Zelle sterben. Andere Medikamente können gegen Colonkrebs wirken und befinden sich zur Zeit in der klinischen Prüfung oder werden es bald sein. Die unterschiedlichen Medikamente sind die Folgenden: Irinotecan (Camptosar, CPT-11), Oxaliplatin und Ralitrexed, Xeloda (Capecitabin). Irinotecan wirkt dahingehend, dass es die Topoisomerase I hemmt, die notwendig ist, um der DNA bei der Translation, Transkription und der Replikation eine bestimmte Form zu geben. Oxaliplatin wirkt auf die DNA ein, indem es Brücken in der DNA bildet, wodurch ihre Synthese und Replikation gehemmt wird. Ralitrexed spielt eine ähnliche Rolle wie 5FU, da es in die Synthesephase der DNA eingreift, indem es das Enzym blockiert, das Thymin synthetisiert. Xeloda ist eine orale Tablette, die sich nach der Verdauung in 5FU umwandelt.
5.1.3 Mechanismus der Zerstörung von Krebszellen durch Chemotherapie
Wenn die Wirkung des Medikaments auf die Zellen bekannt ist, ist es möglich, den Mechanismus zu verstehen, der die Zelle dazu bringt, apoptotisch zu werden. Da 5FU ein Inhibitor der Thymin-Synthetase ist, verursacht es eine Beschä digung der DNA bei der Zellteilung, indem es derselben eine der vier Pyrimidinbasen entzieht, aus denen die DNA besteht. Durch diese der DNA zugefügten Beschädigung ist das 5FU für die Aktivierung des Wächterproteins des Genoms, das p53, verantwortlich. Es wurde gezeigt, dass dieses Protein durch seine Transkriptionsaktivität die Expression verschiedener Proteine modulieren kann, die am Apoptose-Prozess beteiligt sind, wie z.B. das Protein Bax, Bak und Bcl-2. Wenn die Expression von Bax erhöht und die Expression von Bcl-2 verringert wird, werden somit die Chancen, dass das mitochondriale Membranpotential verloren geht, erhöht, was dazu führt, dass der Apoptose-Prozess über den mitochondrialen Weg ausgelöst wird. Diese Proteine, indem sie durch das Protein p53 reguliert werden, bestimmen die Empfindlichkeit der Zelle gegenüber einer Chemotherapie, weil bei den hauptsächlichen Colonkrebsarten p53 mutiert ist. Trotz Mutation von p53 ist es möglich, den Tod dieser Zellen nach Hinzufügen von 5FU zu beobachten.
Es wurde gleichermaßen gezeigt, dass die Behandlung von Krebszellen mit 5FU die Expression des Fas-Rezeptors und des Fas-Liganden auf der Oberfläche von Krebszellen induziert. Die Induktion der Expression des Fas-Rezeptors ermöglicht somit eine bessere Chance, die Krebszelle durch Immunzellen zu beseitigen. Es wurde auch vorgeschlagen, dass durch Induktion der Expression des Fas-Rezeptors und des Fas-Liganden auf der Oberfläche von behandelten Krebszellen ein autokriner, parakriner oder fratrizider Tod erfolgen kann. Da die Zellen den Rezeptor und Liganden exprimieren, könnte es eine Überkreuzbindung zwischen dem Rezeptor und dem Liganden der gleichen Zelle (autokrin) oder dem Rezeptor einer Zelle und dem Liganden einer anderen Zelle (parakrin) geben. Unterschiedliche Forschungsgruppen haben gezeigt, dass die Apoptose, die durch die Chemotherapie-Behandlung induziert wurde, die Aktivierung der Caspasen-3, und -8 impliziert, egal ob es eine Zelle vom Typ I oder II ist. Es wurde vorgeschlagen, dass in den Zellen vom Typ I die beiden Wege der Initiierung der Apoptose bei der Chemotherapie übernommen werden. Somit begün stigt die Behandlung die Aggregation des Fas-Rezeptors, was die Aktivierung der Caspase-8 verursacht, die die Caspase-3 direkt aktiviert, und die Caspase-8 kann ebenfalls das Protein Bid durch Spaltung aktivieren, was die mitochondrialen Wege der Apoptose aktiviert. Bei den Zellen des Typs II wird die Apoptose durch den mitochondrialen Weg gesteuert, da bei diesem Zelltyp die Verwendung des Inhibitors von FADD nicht die durch Chemotherapie verursachte Apoptose verringert. Somit findet die Aktivierung der Caspase-8 in den Zellen des Typs II nach Signalvorgängen des Mitochondriums statt.
Andere Untersuchungen haben gezeigt, dass die der DNA durch Chemotherapie oder Strahlung zugefügte Beschädigung die Expression des Todesrezeptors DR5 erhöht, und zwar auf eine von p53 abhängige und unabhängige Weise.
Man beobachtet nach einer Chemotherapie-Behandlung, dass mehrere Proteine beteiligt sind. Es ist wichtig, die Mechanismen gut zu verstehen, die bei dieser Behandlung genutzt werden, weil mehrere Krebsarten unterschiedliche Tricks entwickeln, um den Tod zu vermeiden.
6. Milchsäurebakterien
Der Wissenschaftler E. Metchnikoff (1845–1919) hat in Betracht gezogen, dass die Langlebigkeit und Gesundheit des bulgarischen Volkes auf den Verzehr eines fermentierten Milchprodukts zurückzuführen sei. Es war wohlbekannt, dass bestimmte Bakterien Krankheitserreger für den Organismus sind, somit wurde vorgeschlagen, diese Bakterien durch Joghurt-Bakterien zu ersetzen, da sie seit langem ohne irgendwelche Befürchtungen verwendet wurden. Mehrere Eigenschaften existieren, um gute Milchsäurebakterien zu definieren: sie müssen ihre Aktivität und Lebensfähigkeit vor ihrem Verzehr bewahren, sie müssen den Magen-Darm-Trakt überleben, sie müssen befähigt sein, im Intestinum zu überleben und zu wachsen und möglicherweise vorteilhafte Effekte erzeugen. Zudem dürfen die Mikroorganismen weder pathologisch noch toxisch sein.
Seitdem sind mehrere Versuche unternommen worden, um die Gesundheit durch Modifizierung der Darmflora durch lebende Milchsäurebakterien zu verbessern. Heute sind die vorteilhaften Wirkungen dieser Bakterien gut identifiziert, und man versucht jetzt, den Mechanismus (die Mechanismen) zu erklären, der (die) mit diesen wohltuenden Wirkungen verbunden ist (sind). Die Gruppe von Salminen hat die wichtigsten wohltuenden Wirkungen zusammengefasst, unterstützt von wissenschaftlichen Beweisen, wie die Immunmodulation und die Verstärkung der Schleimhautbarriere des Intestinums. Andere Gruppen haben bei der Maus gezeigt, dass das Wachstum sowie die Metastasen von Krebs durch den Stamm Lactobacillus casei gehemmt werden können. Unterschiedliche Mechanismen sind vorgeschlagen worden, um zu erklären, worauf diese wohltuenden Wirkungen zurückzuführen sind: die Modifizierung der Darmflora, die Haftung an der Darmschleimhaut mit der Fähigkeit, die Haftung pathogener Bakterien oder die Aktivierung von Pathogenen zu verhüten, die Modifizierung von Nahrungsproteinen durch die Darmmikroflora, die Modifizierung der enzymatischen bakteriellen Fähigkeit; insbesondere wurden solche vorgeschlagen, die sich mit der Induktion von Krebs verbinden lassen, und schließlich der Einfluss auf die Permeabilität der Darmschleimhaut.
Der größte Teil der Untersuchungen weist auf ein therapeutisches Potential von Milchsäurebakterien und des Joghurts hin, das hauptsächlich auf die Änderung der gastrointestinalen Mikroökologie zurückzuführen ist. Die Wirksamkeit von Milchsäurebakterien vergrößert sich durch ihre Fähigkeit, an der Darmwand zu haften, da die anhaftenden Stämme einen konkurrenzfähigen Vorteil haben, der wichtig ist, um ihren Platz im Magen-Darm-Trakt beizubehalten. Demgegenüber wurden noch keine Stämme aufgezeigt, die auf permanente Weise haften können. Indem man die Menge von Milchsäurebakterien im Intestinum erhöht, ist es möglich, das Wachstum von pathogenen Bakterien zu unterdrücken, die im Gegenzug zu einer Reduktion von Infektionen beitragen. Ein intaktes Darmepithel mit einer optimalen Darmflora stellt eine Barriere dar gegen das Eindringen oder die Kolonisation von pathogenen Mikroorganismen, Antigenen und verhängnisvollen Verbindungen für den Darmtrakt.
Im Allgemeinen wirkt sich der Verzehr von Milchsäurebakterien durch eine Verstärkung der nicht spezifischen Immunantwort aus oder wirkt in Form eines Hilfsmittels bei der Antigen-spezifischen Immunantwort. Untersuchungen bei Tieren haben gezeigt, dass das lymphoide Gewebe, das mit dem Darm assoziiert ist, durch lebende Milchsäurebakterien angeregt wird, was eine Produktion von Cytokinen und Antikörpern (IgA) und eine Erhöhung der mitogenen Aktivität von Zellen zur Folge hat, die die Peyer-Plaques und die Splenozyten bilden. Bei den Untersuchungen über menschliche Zellen werden die Produktion von Cytokin, die phagozytische Aktivität, die Produktion von Antikörpern, die Funktionen in den T-Zellen und die Aktivität von NK-Zellen durch den Verzehr von Joghurt oder beim Einwirkenlassen von Milchsäurebakterien in vitro auf die Zellen erhöht.
Bestimmte Befunde deuten darauf hin, dass der das Immunsystem anregende Joghurt mit einer Verringerung pathologischer Ereignisse wie Krebs, gastrointestinale Störungen und allergische Symptome in Verbindung gebracht werden kann.
6.1 Antikrebs-Eigenschaften
Milchsäurebakterien haben angeblich antineoplastische Eigenschaften in einer Vielzahl von Krebszelllinien menschlichen oder tierischen Ursprungs. Kurzum, die Milchsäurebakterien reduzieren die Lebensfähigkeit von Tumorzellen, verringern die Karzinogenese, die durch das Colon und die Leber induziert wird, hemmen die mutagene Aktivität und binden an potentiell mutagene Verbindungen. Trotzdem kein Mechanismus bekannt ist, wird angenommen, dass die Inaktivierung oder Hemmung der Krebsbildung im Intestinaltrakt induziert wird.
Es besteht ein erhebliches Interesse an der metabolischen Aktivität der Darmmikroflora, insbesondere in Bezug auf die Ätiologie des Colonkrebs. Die Untersuchungen wurden u.a. hinsichtlich der Schlüsselenzyme durchgeführt: β-Glucuronidase, Azoreduktase und Nitroreduktase. Diese Enzyme katalysieren die Umwandlung von indirekten Karzinogenen in Karzinogene im Darm. Durch Resorption von Milchsäurebakterien reduzieren diese die Aktivität dieser Schlüsselenzyme und beugen somit der Bildung von Tumoren vor. Eine orale Ergänzung von Milchsäurebakterien (L. acidophilus) menschlichen Ursprungs verursacht eine signifikante Reduktion dieser drei Schlüsselenzyme. Diese Ergebnisse wurden teilweise durch die Gruppe von Marteau bestätigt, die eine Verringerung allein der Nitroreduktase bei 9 Versuchspersonen festgestellt hatte, die Milchsäurebakterien (L. acidophilus, B. bifidum) während einer Zeitspanne von 3 Wochen eingenommen hatten. Die Forscher haben ihre Studien mit einem Modell eines tierischen Colonkrebses fortgesetzt, der durch 1,2-Dimethylhydrazindihydrochlorid (DMH) chemisch induziert wurde. Die Aktivierung von DMH erfolgt im Dickdarm, und es ist das Bakterienenzym β-Glucurodinase, das DMH in ein potentielles Karzinogen umwandelt. Die Unterdrückung dieses Enzyms kann die Aktivierung von DMH und deshalb die Tumorbildung reduzieren. Diese Untersuchungen zeigen, dass die Zugabe von Milchsäurebakterien die Bildung von Colonkrebs verzögern kann, indem die Induktion verlängert wird, was darauf hinweist, dass Lactobacillus die Entwicklung des Tumors im tierischen Versuchsmodell verlangsamen kann.
Zusammengefasst lässt sich sagen, dass mehrere Schlussfolgerungen vorgeschlagen wurden, die die inhibierenden Funktionen von Milchsäurebakterien gegenüber Colonkrebs attraktiv gemacht haben. Unter anderem könnte die Erhöhung oder Stimulierung der Immunfunktionen dazu beitragen, das Risiko der Entwicklung oder des erneuten Auftretens von Krebs zu verringern. Ebenso könnten die Bakterien den Platz von pathogenen Bakterien einnehmen, die die Ursache der Bildung von mutagenen Verbindungen sein könnten, welche Colonkrebs verursachen.
Somit besteht die Notwendigkeit, wirksamere Methoden zu finden oder solche, die weniger Nebenwirkungen haben, als die Behandlungen, die bereits zur Behandlung von Krebs verfügbar sind.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Wie vorstehend erwähnt, wurden neue Eigenschaften dieser Bakterien gefunden. Tatsächlich wurde überraschend gefunden, dass sich durch die Wirkung von Milchsäurebakterien, insbesondere solcher, die in dem Produkt enthalten sind, das unter dem Handelsnamen Bio-K + International verkauft wird, in Kombination mit einem Antikrebsmittel Zellapoptose herbeiführen lässt.
Mehrere Mechanismen können die Ursache eines solchen Phänomens sein. Z.B. können die Milchsäurebakterien die Mutation verhindern, die die Ursache von Krebs ist. Sie können auch der Progression von Tumoren vorbeugen, indem sie das Immunsystem stärken.
Die Anmelderin hat überraschend gefunden, dass der Verzehr von Milchsäurebakterien den Effekt hat, der Bildung von Krebs, insbesondere von Colonkrebs, vorzubeugen.
Die Anmelderin hat ebenso überraschend gefunden, dass die Verwendung von Milchsäurebakterien in Kombination mit einem Antikrebsmittel den Effekt hat, die Anfälligkeit von Krebszellen gegenüber der Apoptose zu erhöhen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung einen Milchsäurebakterienstamm zur Verstärkung der Immunantwort bei einem Säuger, um Krebs vorzubeugen oder zu behandeln, wobei der Stamm Lactobacillus acidophilus I-1492 ist, der bei der CNCM hinterlegt ist.
Ein anderes Ziel ist die Verwendung eines Milchsäurebakterienstamms zum Erleichtern der Induktion der Apoptose von Krebszellen, wobei es sich bei dem Stamm um Lactobacillus acidophilus I-1492 handelt, der bei der CNCM hinterlegt ist.
Ein anderes Ziel ist die Verwendung eines Milchsäurebakterienstamms zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung oder Vorbeugung von Krebs bestimmt ist, wobei es sich bei dem Stamm um Lactobacillus acidophilus I-1492 handelt, der bei der CNCM hinterlegt ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Milchsäurebakterienstamm ein Stamm, der in lebender oder bestrahlter Form vorliegt.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung von Krebs wie Colonkrebs bereitzustellen. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst eine wirksame Menge eines wie oben definierten Milchsäurebakterienstamms und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Zusammensetzung auch ein Antikrebsmittel wie 5-Fluoruracil.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erleichtern der Apoptose von Krebszellen bei einem Säuger, dadurch gekennzeichnet, dass es die Verabreichung einer wie oben definierten Zusammensetzung an den Säuger umfasst.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Milchsäurebakterien zum Erhöhen der Apoptose von Krebszellen, wobei es sich bei den Milchsäurebakterien um Lactobacillus acidophilus I-1492 handelt, der bei der CNCM hinterlegt ist.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung betrifft die kombinierte Verwendung von Milchsäurebakterien und eines Antikrebsmittels wie 5 FU zur Behandlung von Colonkrebs, wobei es sich bei den Milchsäurebakterien um Lactobacillus acidophilus I-1492 handelt, der bei der CNCM hinterlegt ist.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Kits zur Vorbeugung oder Behandlung von Krebs bei einem Säuger, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Behälter aufweist, der eine wie oben definierte Zusammensetzung enthält.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 stellt eine schematische Darstellung dar, die eine typische Analyse der prozentualen Apoptose durch Durchflusszytometrie erläutert.
2 stellt eine schematische Darstellung dar, die ein Modell des apoptotischen Prozesses erläutert.
3 stellt eine schematische Darstellung dar, die Hypothesen der Freisetzung durch die Bcl-2-Proteinfamilie erläutert.
4 stellt eine schematische Darstellung dar, die die proteolytische Reifung der Caspase-3 erläutert.
5 stellt eine schematische Darstellung dar, die die Zusammenfassung der Aktivierungseffekte von p53 erläutert.
6 stellt eine schematische Darstellung dar, die die Struktur von Vertretern von Membran-Todesrezeptoren und ihre Wechselwirkungen mit den hauptsächlichen zytoplasmatischen Effektoren erläutert, die an den apoptotischen Wegen beteiligt sind.
7 stellt eine schematische Darstellung dar, die die Wechselwirkungen zwischen unterschiedlichen Transduktionswegen der Apoptose erläutert.
8 stellt ein Diagramm dar, das die optimale 5-Fluoruracil-Dosis zeigt, um 50% Mortalität der Zellen zu erhalten.
9 zeigt eine visuelle Darstellung von Apoptose-Schemata, die durch Durchflusszytometrie erhalten wurden.
10 stellt ein Diagramm dar, das die Auswirkung der Zusammensetzung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auf die Lebensfähigkeit der Zellen LS 513 zeigt.
11 stellt ein Diagramm dar, das die Auswirkung der Zusammensetzung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auf die Apoptose der Zellen LS 513 zeigt.
Die 12a, 12b, 12c und 12d stellen schematische Darstellungen dar, die das Messen der Apoptose durch Durchflusszytometrie erläutern. Die 12a erläutert die Zellen, die keiner Behandlung unterzogen wurden. Die 12b erläutert die Zellen, die 5FU in einer Konzentration von 100 μg/ml ausgesetzt wurden. Die 12c erläutert die Zellen, die Milchsäurebakterien in einer Konzentration von 10⁸ ausgesetzt wurden. Die 12d erläutert die Kombination von Zellen, Milchsäurebakterien (10⁸) und 5FU (100 μg/ml).
13 zeigt einen Western-Blot, der die Aktivierung der Caspase-3 durch Zellen erläutert, die einer Zusammensetzung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ausgesetzt wurden.
14 stellt ein Diagramm dar, das das Messen der Apoptose der Zellen LS 513 in Gegenwart von Zusammensetzungen gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zeigt.
15 stellt ein Diagramm dar, das das Messen der Lebensfähigkeit der Zellen LS 513 durch MTT zeigt.
16 stellt ein Diagramm dar, das die Auswirkung von lebenden Milchsäurebakterien gegenüber erhitzten Bakterien auf die Apoptose der Zellen LS 513 zeigt.
17 zeigt Western-Blots, die die Auswirkung von lebenden Milchsäurebakterien gegenüber erhitzten Bakterien auf die Aktivierung der Caspase-3 zeigen.
18 stellt ein Diagramm dar, das das Messen der Apoptose zeigt, die den Milchsäurebakterienstämmen der vorliegenden Erfindung innewohnt.
19 stellt ein Diagramm dar, das den apoptotischen Effekt der Mischung von lebenden Bakterien und erhitzen Bakterien zeigt.
20 stellt ein Diagramm dar, das die Auswirkung der Zugabe von Buttersäure und 5FU auf die Apoptose der Zellen LS 513 zeigt.
21 stellt ein Diagramm dar, das die Auswirkung der Zusammensetzung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auf die Expression des Fas-Rezeptors zeigt.
22 stellt ein Diagramm dar, das die Auswirkung der Zusammensetzung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auf die Expression des Fas-Liganden zeigt.
23 zeigt Western-Blots, die die Auswirkung der Zusammensetzung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auf die Expression eines Proteins erläutern, das an der Apoptose beteiligt ist, d.h. Protein p53.
24 zeigt Western Blots, die die Auswirkung der Zusammensetzung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auf die Expression eines Proteins erläutern, das an der Apoptose beteiligt ist, d.h. Protein p21.
25 stellt ein Diagramm dar, das die Auswirkung von PKC auf die Apoptose zeigt.
26 stellt ein Diagramm dar, das die Hemmwirkung von PKC auf die Apoptose zeigt.
27 stellt ein Diagramm dar, das die Auswirkung von Überständen von Milchsäurebakterien der Erfindung auf die Induktion der Aktivität der Caspase-3 in den Zellen LS 513 erläutert.
28 zeigt Photographien, die die Auswirkung von Überständen von Milchsäurebakterien der Erfindung auf die Fluoreszenzfärbung des Zellkerns der Zellen LS 513 erläutert.
29 stellt ein Diagramm dar, das die Auswirkung von Überständen von Milchsäurebakterien der Erfindung auf die Lebensfähigkeit der Zellen LS 513 erläutert.
30 stellt ein Diagramm dar, das die Auswirkung von Überständen von Milchsäurebakterien der Erfindung auf das Zellgel der Zellen LS 513 erläutert.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zielt somit darauf ab, die Verwendung neuer Eigenschaften des Milchsäurestamms Lactobacillus acidophilus I-1492, der bei der CNCM hinterlegt ist, zur Vorbeugung oder Behandlung von Krebs aufzuzeigen. Insbesondere soll die Verwendung dieser Milchsäurebakterien die Induktion der Apoptose von Krebszellen erleichtern.
Die Erfindung betrifft auch das Einbeziehen dieser Milchsäurebakterienstämme in die Verfahren und Zusammensetzungen, die für die Behandlung oder Vorbeugung von Krebs wie Colonkrebs brauchbar sind.
Gemäß einer ersten Ausführungsform bezweckt die vorliegende Erfindung die Verwendung des Milchsäurebakterienstamms Lactobacillus acidophilus I-1492, der bei der CNCM hinterlegt ist, zur Verstärkung der Immunantwort bei einem Säuger, mit dem Ziel, Krebs vorzubeugen oder zu behandeln.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform bezweckt die vorliegende Erfindung die Verwendung dieses Milchsäurebakterienstamms Lactobacillus acidophilus I-1492, der bei der CNCM hinterlegt ist, zur Erleichterung der Induktion der Apoptose von Krebszellen. Unter " Induktion der Apoptose zu erleichtern" versteht man ein Verfahren, durch das das Vorliegen von Milchsäurebakterienstämmen der Erfindung den Zelltod eines Tumors und vorzugsweise eines Colontumors positiv moduliert.
Unter "Säuger" versteht man jeden lebenden Organismus, der sich eine Krebsart zuziehen kann, und dieser schließt Wirbeltiere, wie insbesondere den Menschen, Haustiere und wilde Tiere ein.
Unter "Behandeln" versteht man ein Verfahren, durch das die Krebssymptome und insbesondere diejenigen des Colons, abgeschwächt oder vollständig eliminiert werden.
Unter "Vorbeugen" versteht man ein Verfahren, durch das Krebs und insbesondere Colonkrebs eingedämmt oder verzögert wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt der Bakterienstamm in lebender oder bestrahlter Form vor.
Gemäß einer dritten Ausführungsform zielt die vorliegende Erfindung auf die Verwendung dieses Milchsäurebakterienstamms zur Herstellung von Zusammensetzungen ab, die für die Behandlung oder Vorbeugung von Krebs wie Colonkrebs brauchbar sind. Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst eine wirksame Menge dieses Milchsäurebakterienstamms und einen pharmazeutisch brauchbaren Träger. Die Erfindung umfasst eine Mischung des Milchsäurebakterienstamms Lactobacillus acidophilus und eines Stamms der Spezies L. casei.
Unter "pharmazeutisch annehmbar" versteht man einen Träger, der ohne Risiko einem Säuger, insbesondere einem Menschen, verabreicht werden kann, und zwar mit geringen oder keinen negativen oder toxischen Nebenwirkungen. Ein solcher Träger kann für unterschiedliche Funktionen verwendet werden. Z.B. kann er als Konservierungsmittel, Solubilisierungsmittel, Stabilisator, Emulgator, Erweichungsmittel, Färbemittel, Geruchsstoff oder auch als Antioxidationsmittel verwendet werden. Diese Typen von Trägern können durch dem Fachmann wohlbekannte Verfahren leicht hergestellt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zudem ein Antikrebsmittel. Zu diesem Zweck ist jedes Antikrebsmittel, das im vorliegenden Zusammenhang nützlich sein kann, im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. 5-Fluoruracil wird jedoch vorzugsweise als solches Antikrebsmittel verwendet. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch Teil einer komplizierteren therapeutischen Zubereitung sein, die für die Behandlung und Vorbeugung von Krebs brauchbar ist.
Die Menge oder Konzentration der Milchsäurebakterien, die in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung vorliegt, ist eine therapeutisch wirksame Menge. Eine therapeutisch wirksame Menge an Milchsäurebakterien ist die Menge, die notwendig ist, um positive Ergebnisse zu erhalten, ohne übermäßig negative Nebenwirkungen beim Wirt zu verursachen, dem die Milchsäurebakterien oder die Zusammensetzung verabreicht wird. Im Übrigen ist eine wirksame Menge an Milchsäurebakterien zur Behandlung einer spezifischen Krebsart eine Menge, die ausreichend ist, um auf irgendeine Weise die mit Krebs verbundenen Symptome abzuschwächen oder zu reduzieren. Ein solche Menge kann in einer einzigen Dosis verabreicht werden oder sie kann durch eine Vorschrift verabreicht werden, durch die sie wirksam ist. Die Menge der Milchsäurebakterien gemäß der vorliegenden Erfindung kann Krebs behandeln, typischerweise wird sie aber verabreicht, um Krebssymptome abzuschwächen. Die exakte Menge der Milchsäurebakterien oder jedes der Inhaltsstoffe der Zusammensetzung und die zu verabreichende Menge der Zusammensetzung wird gemäß Faktoren wie dem Typ des zu behandelnden Krebses, den anderen Inhaltsstoffen in der Zusammensetzung, der Verabreichungsart, dem Alter und Gewicht des Säugers usw. variieren.
Die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können in irgendeiner festen oder flüssigen Form vorliegen, die zur pharmazeutischen Verabreichung gebräuchlich ist, d.h. z.B. flüssige Verabreichungsformen, Gelformen oder jede andere dem Fachmann bekannte Trägerform. Unter den brauchbaren Zusammensetzungen lassen sich insbesondere die Zusammensetzungen auffüh ren, die auf oralem Weg verabreicht werden. In diesem speziellen Fall kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung in Form von Nahrungsmitteln oder Nahrungsmittelzusatzstoffen verabreicht werden. Man kann auch injizierbare Zusammensetzungen aufführen, insbesondere solche, die für Injektionen in den Blutkreislauf im Menschen bestimmt sind.
Ein Fachmann wird in der Lage sein, pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen herzustellen und in Abhängigkeit von mehreren Faktoren die bevorzugte Verabreichungsart und die zu verabreichende Menge zu bestimmen. Unter den Faktoren, die seine Auswahl beeinflussen können, sind die Art der Behandlung, die exakte Art der gegebenenfalls aktiven Inhaltsstoffe, die in die Zusammensetzung eingebracht werden, das Krankheitsstadium, der Zustand, das Alter und das Gewicht des Patienten usw..
Die vorliegende Erfindung umfasst auch pharmazeutisch brauchbare Kits, z.B. zur Vorbeugung oder Behandlung von Krebs wie Colonkrebs. Die Kits umfassen ein oder mehrere Gefäße, die zudem eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten. Solche Kits können zudem – falls es erwünscht ist – eine oder mehrere konventionelle pharmazeutische Komponenten einschließen, wie z.B. Behälter, die ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger enthalten, oder irgendeine andere zusätzliche Komponente, die dem Fachmann geläufig sein wird. Ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung kann vorteilhaft Erläuterungen in Form einer Broschüre oder irgendeiner anderen Drucksache einschließen, in der die zu verabreichenden Mengen der Komponenten, die Anweisungen zur Verabreichung und/oder die Anweisungen zum Vermischen der Komponenten angegeben sind.
Das nachstehende Beispiel erlaubt es, andere Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung aufzuzeigen.
Beispiel
Das folgende Beispiel dient dazu, den Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung zu erläutern, nicht aber den Umfang derselben einzuschränken. Modifikationen und Variationen können durchgeführt werden, ohne vom Erfindungsgedanken abzuweichen. Obwohl man andere Verfahren oder Produkte verwenden kann, die denjenigen äquivalent sind, welche nachstehend aufgeführt sind, um die vorliegenden Erfindung zu testen oder zu realisieren, werden das bevorzugte Material und die bevorzugten Verfahren beschrieben.
Einführung
Um zu bestimmen, wie die Milchsäurebakterien die Apoptose von Krebs erleichtern, wurden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Versuche mit der menschlichen Colonkrebs-Zelllinie LS-513 durchgeführt. Die verwendeten Milchsäurebakterien stellen eine Mischung aus Lactobacillus acidophilus und Lactobacillus casei dar. Das Antikrebsmittel ist 5-Fluoruracil (5FU). Diese Verbindung wirkt als Inhibitor des Enzyms, das Thymin synthetisiert.
Material und Verfahren
1. Milchsäurebakterien
1.1 Herkunft
Die für die verschiedenen Versuche verwendete Bakterien-Mischung wird von der Firma Bio-K (Laval, Qc, Kanada) geliefert. Die Mischung umfasst eine Kombination von Lactobacillus acidophilus I-1492, der Gegenstand der Internationalen Patentanmeldung WO 98/23727 ist, und Lactobacillus casei.
1.2. Herstellung
Die Bakterien, die in 9 ml des Komplexmediums MRS (Difco Laboratories, Detroit, USA) erhalten wurden, werden sogleich in 100 ml des gleichen Mediums vermehrt, indem man 100 μl der Bakteriensuspension entnimmt. Nach einer Inkubation von 18 Stunden in einem Inkubator bei 37°C werden 10 ml Glycerin zur Mischung von 100 ml gegeben, die anschließend in aliquote Anteile von 1 ml in mehrere sterile Kunststofffläschchen, die 1,5 ml enthalten können, aufgeteilt wird. Diese Fläschchen werden in einem Gefrierschrank bei einer Temperatur von –80°C aufbewahrt.
Für die verschiedenen Stimulierungsprotokolle wird ein Fläschchen aufgetaut und der Inhalt wird in 9 ml MRS gegeben und 18 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit wird eine Passage durchgeführt. Ein Volumen von 100 μl wird entnommen und zu 9 ml MRS gegeben und ebenfalls 18 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach diesen Inkubationen werden die Bakterien zweimal in sterilem PBS gewaschen und durch Zentrifugieren bei 3500 U/min während einer Zeitspanne von 10 Minuten geerntet. Sie werden dann in einem Endvolumen von 9 ml sterilem RPMI, das 10% fetales Rinderserum enthält, suspendiert und sind dann zur Verwendung für eine Zellstimulierung bereit. Bei den unterschiedlichen Versuchen werden die Bakterien in erhitzter, bestrahlter und lebender Form verwendet.
1.3 Erhitzen
Die Bakterien werden 40 Sekunden lang bei Einstellung "erhöht" in einem Mikrowellenofen (General Électrique, Turntable Microwave Oven, 700 Watt) erhitzt, um eine Temperatur von 100°C zu erreichen und eine Mischung von Bakterien zu erzeugen, die als erhitzte Bakterien verwendet wird. Dieser Schritt erfolgt in einem geschlossenen Glasbehälter.
1.4 Bestrahlung
Um eine Mischung von bestrahlten Bakterien zu erzeugen, werden Röhrchen mit lebenden Bakterien mit einer minimalen Dosis bestrahlt, d.h. 5 kGy, um eine Letalität von 100% zu erhalten. Die Mischungen werden in einer Gammacell-220 (MDS Nordion, Laval, Qc, Kanada) unter Verwendung von Cobalt-60 (⁶⁰Co) als Emissionsquelle von Gammastrahlung bestrahlt.
Zur Durchführung einer Bakterienzählung, um eine Konzentration an Bakterien pro 1 ml dieser Suspension zu erhalten, werden 9 ml peptisiertes Wasser zugegeben (eine isotonische Lösung, die 0,1% Bactopepton [Difco Laboratories, Detroit, USA] enthält). Es werden Verdünnungsreihen aufgestellt. Dann wird 1 ml dieser Verdünnungen entnommen und in eine Petrischale gegeben, der man 10 ml MRS an 1,5% Agar (Difco Laboratories, Detroit, USA) zufügt, um eine Zählung nach einer Inkubation von 48 Stunden in einem Inkubator bei 37°C durchführen zu können. Jede Probe wird zweifach ausgeführt.
2. Krebszellen
2.1 Herkunft
Die Zelllinie LS 153 (ATCC, Rockville, MD, USA) ist eine kontinuierliche Linie von Colonkrebs menschlichen Ursprungs.
2.2 Kultur
Da die Zelllinie adhäsiv ist, ist es notwendig, die Zellen mit Hilfe einer Trypsin-EDTA-Lösung (Gibco, Burlington, ON, Kanada) abzulösen, um sie dann in mit L-Glutamin ergänztem RPMI und 10% SBF, was man somit als "vollständiges RPMI" bezeichnen kann, erneut zu suspendieren. Die Platten werden am Tag vor der Stimulierung hergestellt, damit die Zellen an den Platten haften können. Am Tag der Stimulierung werden die unterschiedlichen Produkte in erwünschten Konzentrationen zugegeben, und dann werden die Zellen während einer Zeitspanne, die für jeden Versuchstyp bestimmt ist, in einem feuchtigkeitsgesättigten Inkubator bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert.
3. Co-Kulturen von Krebszellen und Bakterien
3.1 Zugabe von Bakterien
Nachdem die Zellplatten zur Anwendung bereit sind, d.h. nachdem die Zellen die Zeit hatten, zu haften und die vorbereiteten Bakterien zur Verwendung bereit sind, werden dieselben gemäß dem Stimulierungsprotokoll in die Vertiefungen gegeben, die die adhäsiven Zellen und das "vollständige RPMI"-Medium enthalten. Eine Inkubation wird während einer Zeitspanne durchgeführt, die durch den durchzuführenden Versuch bestimmt ist.
3.2 Versuch unter Zugabe von Butyrat
Die Krebszellenplatte, die 3·10⁵ Zellen pro Vertiefung enthält, wird eine Nacht lang inkubiert, um ein Anhaften der Zellen zu ermöglichen. Dann werden unterschiedliche Konzentrationen an Buttersäure (Sigma, St-Louis, USA) in die Vertiefungen gegeben, die die adhäsiven Zellen und das vollständige RPMI-Kulturmedium enthalten. Nach dieser Zugabe wird eine Inkubation von 48 Stunden durchgeführt, um den Prozentsatz Apoptose gemäß einer später beschriebenen Technik zu messen.
3.3 Gewinnung und Untersuchungen der Überstände
Das Ziel dieses Versuchs besteht darin, zu verifizieren, ob das Vorliegen von Bakterien die pharmakologische Präsentation von 5FU modifiziert. Eine erste Stimulierung erfolgt mit adhäsiven Zellen während einer Zeitspanne von 48 Stunden in Gegenwart unterschiedlicher Stimulierungsprodukte. Nach dieser Inkubation werden die Überstände gewonnen und zu einer neuen Kultur von frisch haftenden Zellen gegeben. Dann wird eine zweite Inkubation während 48 Stunden durchgeführt, um dann die Zellen zu ernten und die prozentuale Apoptose zu messen.
4. Messung der Lebensfähigkeit der Krebszellen
4.1 Proliferation
4.1.1 MTT
Die Zellen werden hergestellt wie oben erwähnt. Der Test wird mit einer Platte mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Ein Volumen von 100 μl einer Konzentration von 3,3·10⁵ Zellen pro ml wird in jede Vertiefung gegeben, außer in der ersten Reihe, die als "Blindversuch" dient. Nachdem die Stimulierungsprodukte zuge fügt sind, wird eine Inkubation von 48 Stunden durchgeführt. Nach der Inkubation werden die Überstände durch Absaugen entfernt, und die Zellschicht wird gewaschen, indem man 200 μl PBS vorsichtig in jede Vertiefung gibt und das zugefügte PBS schnell in das Spülbecken dekantiert. Dann wird eine Lösung von MTT (Sigma, St-Louis, USA) in fünffacher Verdünnung in vollständigem RPMI in die Vertiefungen gegeben und eine Inkubation während 5 Stunden bei 37°C durchgeführt. Danach wird die Lösung dekantiert, und eine andere Lösung wird mit dem Ziel zugefügt, die in den lebenden Zellen gebildeten Kristalle zu lösen. Diese Lösung umfasst 50% Dimethylformamid und 12% Natriumdodecylsulfat (SDS). Eine 18-stündige Inkubation ist erforderlich, um alle Kristalle zu lösen. Nach dieser Inkubation wird die Platte in einem Spektrophotometer (Mandel Scientific Company, Bio-Tek Instruments, Microplate EL309 Autoreader) bei 540 nm abgelesen. Jede Probe wird dreifach durchgeführt und ein Mittelwert wird aus den erhaltenen Werten gebildet. Der Mittelwert des Kontrollversuchs ist "100%"lebende Zellen. Um den Prozentgehalt anderer Proben zu erhalten, genügt es, ein Überkreuzprodukt auszuführen.
4.2 Apoptose
4.2.1 Durchflusszytometrie
Eine Konzentration von 5·10⁵ Zellen pro ml, à 6 ml pro Vertiefung, wird verwendet, um 3·10⁵ Zellen pro Probe zu erhalten. Die Zellen werden hergestellt wie oben angegeben. Die unterschiedlichen Produkte werden in die Vertiefungen gegeben, und es wird eine Inkubation von 48 Stunden durchgeführt.
Nach der Inkubation werden die Überstände der Zellen in verschiedenen 15 ml-Röhrchen aufgefangen und 5 Minuten lang bei 1500 U/min zentrifugiert. Die Zellsedimente werden dann durch Dekantieren der Überstände gewonnen und auf Eis beiseite gelegt. Dieser Schritt besteht darin, die Zellen in Suspension zu gewinnen. Danach wird die adhäsive Zellschicht mit 0,5 ml Trypsin-EDTA gewaschen, dann werden 0,2 ml Trypsin-EDTA in jeden Vertiefung gegeben, um ein Voneinanderlösen der Zellen zu ermöglichen, während sie etwa 8 Minuten lang in einem Inkubator bei 37°C inkubiert werden. Die Zellen werden in 3 ml vollständigem RPMI, 10% SVF suspendiert, um die enzymatische Aktivität des Trypsins zum Stillstand zu bringen. Die Zellsuspension wird 5 Minuten lang bei 1500 U/min in den Röhrchen zentrifugiert, die für die Durchflusszytometrie dienen. Dann werden die zwei Zellsedimente (Zellen in Suspension und adhäsive Zellen) vereinigt und zweimal mit kaltem PBS, ergänzt mit 0,25% EDTA, gewaschen, um die Bildung von Zellagglomeraten zu vermeiden. Nach den Waschvorgängen werden 0,5 ml einer Propidiumiodid-Lösung zum Zellsediment gegeben. Die Lösung besteht aus 0,1 % Natriumcitrat (Fisher Scientific, New Jersey, USA), 0,1% Triton X-100 (Sigma, St-Louis, USA), 50 μg/ml RNase (Sigma, St-Louis, USA) und 20 μg/ml Propidiumiodid (Sigma, St-Louis, USA). Eine Inkubation von 15 Minuten bei 4°C wird durchgeführt, um dann die Proben durch Durchflusszytometrie (Coulter Epics XL-MCL) zu analysieren. Die 1 fasst ein typisches Resultat einer Analyse durch Durchflusszytometrie zusammen. Unterschiedliche Peaks haben sich aufgrund der Fluoreszenz-Unterschiede gebildet, die zwischen jedem Schritt des Zellzyklus existieren. Je größer der Gehalt an intakter DNA ist, desto höher ist die Fluoreszenz und umgekehrt. Das Programm misst die prozentuale Fluoreszenz, die den großen Peak bildet, der unterhalb des Peaks vorliegt, der G0-G1 entspricht, wobei dieser Peak Enden von fragmentierter DNA darstellt, eine Folge der DNA-Spaltung durch ein anderes Enzym, das bei der Apoptose aktiviert wird.
5. Messung der Expression von Proteinen die an der Apoptose beteiligt sind (p53, p21, Caspase-3, Bax)
5.1. Western-Blot
5.1.1 Stimulierung und Extraktion von Proteinen
Insgesamt etwa 6·10⁵ Zellen pro Probe werden verwendet. Am nächsten Tag, nachdem die die Zellen adhäsiv geworden sind, werden die Stimulierungsprodukte zugefügt. Die unterschiedlichen Stimulierungsprodukte sind 5-Fluoruracil (100 μg/ml) und die lebenden oder erhitzten Bakterien in einer Konzentration von 1·10⁸ Bakterien pro ml. Diese Produkte führen dazu, dass die Zellen durch Modulation von unterschiedlichen Proteinen, die an dem Vorgang beteiligt sind, apoptotisch werden. Die Technik ermöglicht die Verwirklichung dieser Modulation, Erhöhung der Expression oder Aktivierung des Proteins. Nach unterschiedlichen Stimulierungszeiten (da es sich um eine Kinetik handelt) werden die Zellen geerntet und bei 1500 U/min während einer Zeitspanne von 5 Minuten zentrifugiert. Anschließend werden 50 μl Lysepuffer, bestehend aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 % Nonidet P-40 (Roche Diagnostics, Laval, Qc), sowie eine Tablette Complete^TM (enthält Proteasehemmer) (Roche Diagnostics, Laval, Qc) zu dem Zellsediment gegeben, das dann 30 Minuten lang auf Eis inkubiert wird. Ein Volumen von 50 μl wird entnommen und in ein 1,5 ml-Mikroröhrchen gegeben. Eine zehnminütige Zentrifugation bei 15 000 U/min wird durchgeführt, um die Zelltrümmer auszufällen. Der Überstand wird gewonnen, und ein Volumen, das mit demjenigen des "Probepuffers" identisch ist, wird zugefügt. Der "Probepuffer" besteht aus 100 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 20% Glycerin und 0,006% Bromphenolblau. Zum Schluss werden die Proben in gleiche Volumenanteile von 20 μl aufgeteilt und bei einer Temperatur von –20°C gehalten.
5.2 Abtrennung und Identifizierung der Proteine
Die Proteinproben werden auf einem Polyacrylamid-SDS-Gel von 4% und 12% getrennt, wobei man das Gerät "mini-PROTEAN" von Bio-Rad verwendet. Die Proteine wandern in einem elektrischen Strom von 200 Volt während einer Zeitspanne von 45 Minuten. Die Wanderung erfolgt in einer "Puffer-Elektrode" bei pH 8,3, bestehend aus 1,5 % Tris-Base, 7,2% Glycin und 0,5% SDS in deionisiertem Wasser. Anschließend werden die Proteine auf eine Membran aus Nitrocellulose "Hybond ECL" (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Bale d'Urfe, Quebec) mit Hilfe einer Übertragungsmaschine von Bio-Rad übertragen, und zwar während einer Stunde bei 100 Volt in einem Übertragungspuffer, bestehend aus 0,58% Tris-Base, 0,29% Glycin, 0,037% SDS und 20% Methanol. Nach der Übertragung wird die Membran mit einer Blockierungslösung, bestehend aus 0,1% PBS-Tween 80 sowie 5% entrahmtem Milchpulver, während einer Stunde bei Raumtemperatur und unter Rühren "blockiert". Dann wird die erste Markierung mit dem Antikörper durchgeführt, der das gesuchte Protein erkennt. Der Antikörper wird in der Blockierungslösung auf eine angegebene Konzentration verdünnt, die vom Hersteller angegeben ist. Nach einer einstündigen Markierung wird ein 15-minütiges Waschen, gefolgt von zwei Waschvorgängen zu je 5 Minuten mit der Blockierungslösung durchgeführt. Die zweite Markierung wird mit einem zweiten Antikörper durchgeführt, der den ersten Antikörper erkennt und an Peroxidase gekuppelt wird. Eine einstündige Inkubation mit dem zweiten Antikörper wird durchgeführt, der ebenfalls in einer Blockierungslösung auf eine Konzentration verdünnt wird, die vom Hersteller angegeben ist. Sobald diese zweite Inkubation beendet ist, werden ein 15-minütiges Waschen sowie zwei Waschvorgänge zu je 5 Minuten mit einer 0,1% Lösung von PBS-Tween 80 ohne entrahmtes Milchpulver durchgeführt. Zum Nachweis der unterschiedlichen Proteine wird eine Lösung von ECL (Amersham Pharmacia Biotech Inc, Baie d'Urfe, Qc. Canada), die zur Aktivierung der Peroxidase führt, gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die Membran gegeben. Anschließend werden die Markierungen auf photographischem Papier (Hyperfilm ECL, Amersham Pharmacia Biotech Inc, Baie d'Urfe, Qc. Canada) sichtbar gemacht, das durch die aktivierte Peroxidase markiert ist. Das photographische Papier wird anschließend entwickelt. Die Tabelle 1 fasst die gesuchten Proteine und die verwendeten Reagenzien zusammen.
Tabelle 1: Antikörper, die für die verschiedenen zu identifizierenden Proteine verwendet wurden
6. Messung der Expression von Markern auf der Zellmembran (Fas, Fas L)
6.1 Durchflusszytometrie
Insgesamt etwa 5·10⁵ Zellen werden pro Probe verwendet. Die Zellen werden hergestellt wie oben erwähnt. Eine Inkubation von 24 Stunden wird nach dem Hinzufügen der verschiedenen Stimulierungsprodukte (5FU, lebende oder erhitzte und andere Bakterien gemäß den durchgeführten Versuchen) durchgeführt.
Nach der Inkubation werden die Zellschichten mit 0,5 ml Trypsin-EDTA gewaschen, dann werden 0,2 ml Trypsin-EDTA zu den Zellschichten gegeben, die dann etwa 10 Minuten lang in einen Inkubator bei 37°C gelegt werden. Sobald die Zellen abgelöst sind, werden 3 ml vollständiges RPMI zugegeben, und die Zellsuspension wird dann 5 Minuten lang mit 1500 U/min zentrifugiert. Die Überstände werden dekantiert, und die Zellen werden auf Eis gelegt. Dann werden 20 μl der Antikörperlösung gegen Fas-Rezeptor (BD PharMingen, Mississauga, Ontario) oder Fas-Liganden (BD PharMingen, Mississauga, Ontario) zum Zellsediment gegeben, zu dem man vorher 50 μl "Puffer für die Durchflusszytometrie", bestehend aus PBS 1X, 1% BSA, 0,02% Natriumazid und 0,25% EDTA, gegeben hatte. Eine halbstündige Inkubation auf Eis im Dunklen ist notwendig. Dann werden zwei Waschvorgänge mit 4 ml "Puffer für die Durchflusszytometrie" durchgeführt, indem man 5 Minuten lang bei 1500 U/min zentrifugiert. Zu den durch die Antikörper Fas-Ligand markierten Zellen wird nach der ersten Inkubation und zwei Waschvorgängen eine Menge von 0,25 μl pro Röhrchen Streptavidin-PE (BD PharMingen, Mississauga, Ontario) gegeben. Eine zweite Inkubation von 30 Minuten auf Eis im Dunklen wird durchgeführt, gefolgt von zwei weiteren Waschvorgängen. Am Ende einer Markierung werden 250 μl Paraformaldehyd-Lösung (PBS 1x, 2% Paraformaldehyd) und 250 μl "Puffer für die Durchflusszytometrie" zugegeben, um die Markierungen zu fixieren. Die Röhrchen werden dann in Aluminiumpapier eingewickelt und bei 4°C bis zur Analyse der Proben aufbewahrt.
7. Messung der Expression des Gens Nurr77
7.1. Extraktion der RNA
Eine Anzahl von 3·10⁵ Zellen wird pro Probe verwendet. Eine dreistündige Inkubation wird nach der Zugabe verschiedener Stimulierungsprodukte durchgeführt. Die Zellen werden dann durch einen Schaber geerntet, dann 5 Minuten lang bei 1500 U/min zentrifugiert. Die gesamte RNA jeder Probe wird extrahiert und gereinigt, indem man das Kit High Pure RNA von Roche Diagnostics (Laval, Qc, Canada) verwendet wie vom Hersteller angegeben. Die Konzentration der RNA wird dann mit dem Gerät (Pharmacia Biotech, Gene Quant RNA/DNA Calculator) gemessen, dann auf 92 ng/μl eingestellt.
7.2 RT-PCR
Das Kit LightCycler RNA Amplification SYBR Green 1 von Roche Diagnostics (Laval, Qc, Canada) wird verwendet, um die reverse Transkriptionsreaktion (RT) und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchzuführen. Das Prinzip von LightCycler ist demjenigen von Thermocycleur sehr ähnlich. Der Hauptunterschied besteht in der Möglichkeit, mit dem LightCycler die Amplifikation bei jedem Zyklus beobachten zu können, und zwar aufgrund eines fluoreszierenden Moleküls, das als SYBR Green 1 bezeichnet wird, das sich in jeden gebildeten Doppelstrang einfügt. Je mehr Doppelstränge gebildet werden, desto größer ist die Fluoreszenzerhöhung, die man mit Hilfe des im LightCycler eingeschlossenen Programms beobachtet. Die beiden RT-PCR-Reaktionen erfolgen in einer Kapillare, die speziell für den LightCycler (Laval, Qc, Canada) konstruiert wurde, und es genügt, eine einzige Mischung der in dem Kit enthaltenen Produkte zu bilden und dieses Gemisch gemäß den Anweisungen des Herstellers zu verwenden.
Vor der Durchführung einer Amplifikation ist es notwendig, bestimmte Bedingungen zu erfüllen; z.B. die Konzentration an MgCl₂, die Temperaturen und die Zeitspannen. Eine ideale Konzentration an MgCl₂ muss bestimmt werden. Für die vorliegende Amplifikation hat sich eine Konzentration von 7 mM als am besten erwiesen. Die Konzentration der Primer ist 0,5 mM wie vom Hersteller vorgeschlagen. Im Falle des Gens Nurr77 ist die Sequenz der verwendeten Primer für den positiven Strang 5'-CGACCCCCTGACCCCTGAGTT-3' und diejenige für den negativen Strang 5'-GCCCTCAAGGTGTTGGAGAAGT-3' (Kang J.H., Biol.Pharm.Bull.). Die Amplifikation durch dieses Primerpaar ergibt 658 Basenpaare. Die Programmierung der Maschine LightCycler wird im Handbuch beschrieben, das vom Hersteller geliefert wird. Zwei andere Parameter variieren im Amplifikationsprogramm: u.a. variiert im Hybridisierungssegment die zu verwendende Temperatur in Abhängigkeit von den Primern. Die Temperatur (eingestellt auf eine 5°C niedrigere Temperatur als die Temperatur der Hybridisierung der Primer (Tm)), berechnet sich aus der folgenden Formel: Tm = 2°C (A + T) + 4°C (C + G). Für die verwendeten Primer beträgt Tm 64°C. Der zweite Parameter ist die Inkubationszeit für die Verlängerung, die sich immer im Amplifikationsprogramm befindet; sie wird gemäß der folgenden Formel bestimmt: t = (Anzahl von Basenpaaren des Amplifikationsprodukts dividiert durch 25) Sekunden. In unserem Fall erhält man, da die Anzahl der Basenpaare 658 ist, somit 26 Sekunden. Nach 35 Zyklen, die zur Amplifikation des erwünschten Teils des Gens notwendig ist, wird eine Kurve des Fusionspunkts erstellt, wobei man eine Temperatur verwendet, die 10°C höher ist als die Hybridisierungstemperatur. Somit werden die Amplifikationen einer progressiven Temperaturerhöhung unterzogen, und bei jedem Grad wird die Fluoreszenz gemessen und aufgezeichnet. Indem die Temperatur auf progressive Weise erhöht wird, lösen sich die gebildeten Doppelstränge voneinander, wenn die Temperatur ausreichend hoch wird, und bei dieser Temperatur beobachtet man eine Verringerung der Fluoreszenz. Das Programm erstellt eine Kurve des Fusionspunktes mit den aufgezeichneten Fluoreszenzen und dann misst es die Ableitung der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Temperatur. Wenn man die theoretische Fusionstemperatur des Amplifikationsproduktes kennt, ist es möglich, den Peakflächenwert unter der Kurve des Peaks zu erhalten, der durch Trennung der Stränge des Amplifikationsprodukts bei dieser Temperatur gebildet wird. Die Maschine ermöglicht es nicht, die Anzahl der amplifizierten Basenpaare sichtbar zu machen; eine Migration auf 2% Agarosegel mit einem Basenpaar-Marker ermöglicht die Überprüfung nach Anfärben mit Ethidiumbromid einer Konzentration von 0,05 μg/ml während 15 Minuten.
8. Behandlungen durch Inhibitoren oder Stimulatoren von PKC
Die mit den Inhibitoren und Stimulatoren von PKC durchgeführten Stimulierungen werden auf die gleiche Weise durchgeführt wie die Stimulierungen durch Bakterien und 5FU. Zuerst werden die Zellen am Vortag hergestellt, um ihr Anhaften zu ermöglichen, und am Tag der Stimulierung werden die verschiedenen Stimulierungsprodukte gleichzeitig mit dem Inhibitor GÖ 6976 (Sigma) und/oder den Stimulatoren von PKC, Ionomycin (Sigma) und PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) (Sigma) zugegeben. Dann wird eine Inkubation während 48 Stunden durchgeführt, die Zellen werden geerntet und der Prozentsatz der Apoptose wird gemessen.
9. Messung von Cytokin
9.1 Messung des TNF durch Bioassay
Es ist möglich, die Menge an TNF in einem Überstand mit Hilfe der Zelllinie L929 zu messen, die eine Fibroblastenlinie von Mäusen ist, die gegenüber der zytotoxischen Wirkung von TNF empfindlich sind. Das Prinzip dieses Bioassays ist einfach: je mehr TNF im Überstand vorliegt, der der Schicht der Zellen L929 zugefügt wird, desto größer ist der Zelltod. Man kann dann den Gehalt an Zellen messen, die lebend geblieben sind. Zuerst kultiviert man die Zellen in vollständigem RPMI 1640 + 5% SVF. Die Zellen lösen sich mit Hilfe von Trypsin-EDTA (Gibco, Burlington, ON, Canada) vom Fläschchen ab, indem man 1 Minute lang bei 37°C inkubiert. Eine Zellenzählung wird durchgeführt, um eine Suspension von 3,3·10⁵ Zellen/ml für den Bioassay herzustellen.
Ein Volumen von 75 μl wird in jeden Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Alle Reihen erhalten dieses Volumen, außer der ersten, die als Kontrollvergleich verwendet wird. Nach einer 24stündigen Inkubation wird ein Volumen von 25 μl Actinomycin D in einer Konzentration von 2 μg/ml in alle Vertiefungen aller Reihen, außer der ersten Reihe gegeben, die als Kontrolle von Actinomycin D dient, um das Zellwachstum zum Stillstand zu bringen. Dann werden die verschiedenen Proben ausgehend von der vierten Reihe mit 100 μl pro Vertiefung zugegeben, und dies auf dreifache Weise. Die dritte Reihe bleibt leer, da sie als positive Kontrolle dient, d.h. sie stellt die maximale Anzahl von Zellen dar, da kein zytotoxisches Mittel zugegeben wurde. Mit den zugefügten Proben werden fortlaufende Verdünnungen ausgehend von 100 μl durchgeführt, die man in Reihe in den folgenden 8 Bereichen verdünnt. Wenn die Proben verdünnt sind, inkubiert man 16 bis 24 Stunden bei 37°C + 5% CO₂. Nach dieser Inkubation werden die Überstände verworfen, und die Zellen werden am Boden der Vertiefungen mit einer 5% Formaldehyd-Lösung mit 100 μl pro Vertiefung während 5 Minuten fixiert. Die Platten werden entleert und dreimal mit fließendem Wasser gespült. Die fixiert gebliebenen Zellen werden dann mit Kristallviolett mit 50 μl pro Vertiefung während 5 Minuten angefärbt. Dann werden die Platten entleert, und der Überschuss an Färbemittel wird durch 3 Spülungen mit fließendem Wasser entfernt. Sobald die Platten gut getrocknet sind, werden 100 μl einer 33% Essigsäure-Lösung in jede Vertiefung gegeben, um das von den fixierten Zellen absorbierte Kristallviolett zu lösen. Die Extinktion wird bei einer Wellenlänge von 540 nm in einem Spektrophotometer für Platten abgelesen, indem man die Kolonne 1 als Referenz ("weiß") verwendet.
Zur Berechnung der Anzahl der TNF-Einheiten berücksichtigt man eine TNF-Menge, die dem Kehrwert des Verdünnungsfaktors entspricht, der 50% Zytotoxizität ergibt. Zur Berechnung der prozentualen Zytotoxizität für jede Probe wird die folgende Gleichung verwendet:
Somit ist die optische Dichte der Probe der Mittelwert der drei Extinktionen, die für eine Verdünnung nach dem Ablesen der Platten erhalten wurden. Die optische Dichte der positiven Kontrolle ist der Mittelwert der Vertiefungen der Reihe 3. Die prozentuale Zytotoxizität wird für jede Verdünnung berechnet. Dann wird eine Gerade mit linearer Regression für die Verdünnungen einer Probe gezogen, der Verdünnungsfaktor (= x) und die % Zytotoxizität (= y) und der 50%-Punkt werden mit Hilfe der Gleichung der Geraden gefunden. Der Kehrwert der Ver dünnung (2^x) entspricht der Anzahl der TNF-Einheiten in der anfänglichen nicht verdünnten Probe. Die Ergebnisse werden in U/ml ausgedrückt.
Ergebnisse
1) Suche nach der optimalen Dosis von 5-Fluoruracil
Die 8 zeigt die Messung der Apoptose durch Durchflusszytometrie nach der Einwirkung steigender Dosen an 5-Fluoruracil (5FU), um eine ideale Konzentration zu erhalten, die eine Mortalität von 50% ergibt. Insgesamt 3·10⁵ Zellen werden unterschiedlichen Konzentrationen an 5FU während 48 Stunden ausgesetzt. Dann wird der DNA-Gehalt der Zellen mit Hilfe von Propidiumiodid markiert und durch Durchflusszytometrie analysiert, um den Prozentsatz an Apoptose zu erhalten. Die folgenden Ergebnisse sind der Mittelwert von zwei unabhängigen Versuchen.
Die 9 erläutert ein Diagramm, das einen der zwei Versuche darstellt, die durchgeführt wurden, um die ideale Konzentration an 5FU zu erhalten. Die Apparatur misst die Anzahl der Ereignisse des Peaks Sub-G1 bezogen auf die Anzahl der Ereignisse der Probe, was ein prozentuales Resultat ergibt. Da bekannt ist, dass der Peak Sub-G1 gespaltener DNA entspricht, d.h., Anzeichen von Apoptose, ordnet man somit diesem Prozentgehalt den Apoptosewert zu.
2) Wirkung der Kombination von 5-Fluoruracil und lebenden Bakterien auf die Lebensfähigkeit der Zellen LS 513
Die 10 erläutert die Lebensfähigkeit von Colon-Krebszellen, denen MTT zugegeben wurde, nach einer Inkubation von 48 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit von 5-Fluoruracil (%FU) (2,5 μg/ml) und lebenden Bakterien (B) in unterschiedlichen Konzentrationen (10⁶–10⁸). Insgesamt 3,3·10⁴ Zellen pro Vertiefung in einer Platte von 96 Vertiefungen werden mit den verschiedenen Stimulierungsprodukten in Kontakt gebracht. Die durch die Reaktion von MTT mit lebenden Zellen erzeugte Färbung wird mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 540 nm bestimmt. Jede Probe ist der Mittelwert von 3 verschiedenen Vertiefungen.
Die 11 erläutert die Auswirkung von lebenden Bakterien und von 5FU auf die Apoptose von LS 513. Lebende Milchsäurebakterien (B) in unterschiedlichen Konzentrationen (10⁶–10⁹) und 5-Fluoruracil (5FU) (100 μg/ml) werden zu den Zellen LS 513 gegeben. Das Messen der Apoptose durch Durchflusszytometrie erfolgt nach einer Inkubation von 48 Stunden. Die Markierung der DNA mit einer Propidiumiodid ermöglicht es, den Prozentsatz der Zellen zu beobachten, die gespaltene DNA (Sub-G1) aufweisen, die nach der Inkubation erzeugt wird. Bei dem Kontrollvergleich handelt es sich um Zellen, die keiner Behandlung unterzogen wurden.
Die 12 zeigt Beispiele von Schemata der Durchflusszytometrie zur Messung der Apoptose. Diese 4 Schemata stellen 4 unterschiedliche Proben dar, die bei einem Versuch gebildet wurden. Die Anzahl der Ereignisse an Sub-G1 ergibt den Prozentgehalt, bezogen auf den Rest der Schritte des Mitosezyklus. Bei dem Kontrollvergleich (A) handelt es sich um Zellen, die keiner Behandlung unterzogen wurden; Abbildung B stellt Zellen dar, die 5FU in einer Konzentration von 100 μg/ml ausgesetzt wurden; Abbildung C ist eine solche, in der lebende Bakterien in einer Konzentration von 10⁸ mit Zellen kombiniert werden, und die letzte Abbildung (D) stellt die Kombination von Zellen, lebenden Bakterien (10⁸) und 5FU (100 μg/ml) dar.
13 erläutert einen Western Blot von Caspase-3, und zwar in pro-aktiver Form. Eine 48stündige Inkubation von lebenden Bakterien in einer Konzentration von 10⁸ und von 5-Fluoruracil (5FU) in einer Konzentration von 100 μg/ml wurde durchgeführt. Bei dieser Inkubation wurden die Proteine extrahiert und auf Polyacrylamidgel wandern lassen. Anschließend wurden sie auf eine Nitrocellulose- Membran übertragen und mit einem Antikörper markiert, der für Caspase-3 spezifisch ist, und zwar bei einer Konzentration von 1:1000.
3) Wirkung des Bakterienzustandes
3.1) Lebende Bakterien gegenüber bestrahlten Bakterien
Die 14 zeigt die Messung der Apoptose der Zellen LS 513 in Gegenwart von lebenden Bakterien, bestrahlten Bakterien und 5FU. Diese Figur zeigt insbesondere die Messung der Apoptose durch den Prozentgehalt an Sub-G1 durch Durchflusszytometrie mit Hilfe einer Propidiumiodid-Markierung (20 μg/ml). Die Colon-Krebszellen werden 5-Fluoruracil (5FU) (100 μg/ml) und lebenden Bakterien (B) oder bestrahlten Bakterien (C) in unterschiedlichen Konzentrationen (10⁶–10⁹) ausgesetzt bzw. nicht ausgesetzt, und zwar während einer Zeitspanne von 48 Stunden. Die Kontrollvergleiche sind Zellen ohne Behandlung.
3.2 Lebende Bakterien gegenüber erhitzten Bakterien
Die 15 zeigt die Messung der Lebensfähigkeit der Zellen LS 513 durch MTT. Insbesondere zeigt diese Figur die Auswirkung von lebenden Bakterien (B) und erhitzten Bakterien (C) in unterschiedlichen Konzentrationen (10eX) in Gegenwart oder Abwesenheit von 5-Fluoruracil (FU) (A) (2,5 μg/ml) auf die Lebensfähigkeit von LS 513 nach einer 48stündigen Inkubation. Die Werte werden durch spektrophotometrische Messung (540 nm) erhalten, und zwar durch Anfärben mittels MTT, das die funktionellen Mitochondrien färbt, und somit nur solche von lebenden Zellen. Die verwendete Zellenkonzentration beträgt 3,3·10⁴ Zellen pro Vertiefung. Die folgenden Ergebnisse sind der Mittelwert von drei Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen.
Die 16 zeigt die Auswirkung von lebenden Bakterien gegenüber erhitzten Bakterien auf die Apoptose der Zellen LS 513. Die Analyse des Prozentgehalts an Sub-G1 durch Markierung der DNA wurde mit Propidiumiodid erhalten. Insgesamt 10 000 Ereignisse werden pro Probe behandelt. Eine Inkubation von 48 Stunden in Gegenwart von lebenden Bakterien (B) und erhitzen Bakterien (C) und zwar in unterschiedlichen Konzentrationen mit oder ohne 5-Fluoruracil (100 μg/ml), stellen die unterschiedlichen in der Figur erläuterten Proben dar.
Die 17 zeigt die Auswirkung von lebenden oder erhitzten Bakterien auf die Aktivierung von Caspase-3.
4) Mögliche Mechanismen, die Bakterienkulturen innewohnen
Die 18 zeigt die Messung der Apoptose, die Milchsäurebakterienstämmen der Erfindung innewohnt. Eine erste Stimulierung wurde während 48 Stunden durchgeführt. Bestimmte Vertiefungen enthalten keine Zellen (F). Die unterschiedlichen Überstände (D) wurden gewonnen und einer frischen Zellkultur (E) zugefügt. Die Konzentration an 5-Fluoruracil (5FU) beträgt 100 μg/ml, und zwei verschiedene Konzentrationen werden für die lebenden Bakterien (B) und die erhitzten Bakterien (C) verwendet, welche 1·10⁷ bzw. 10⁸ betragen. Das Messen der Apoptose erfolgt durch Durchflusszytometrie mittels Markierung der DNA mit Propidiumiodid.
Die 19 zeigt den apoptotischen Effekt des Gemisches von lebenden und erhitzen Bakterien. Die Messung der Apoptose durch Durchflusszytometrie erfolgte nach einer 48stündigen Inkubation. Die Zelllinie LS 513 wird einer bestimmten Konzentration an 5FU (100 μg/ml) sowie lebenden Bakterien (B) und erhitzen Bakterien (C) in zwei unterschiedlichen Konzentrationen (10⁷ bzw. 10⁸) ausgesetzt. Der Kontrollvergleich besteht aus Zellen ohne irgendeine Behandlung.
Die 20 zeigt die Auswirkung der Zugabe von Buttersäure und 5FU auf die Apoptose der Zellen LS 513. Colon-Krebszellen werden eine Dosis von 5FU (100 μg/ml) sowie unterschiedlichen Dosierungen (2 mM und 4 mM) von Butter säure (ab) zugefügt. Die Apoptose wird nach einer 48stündigen Inkubation gemessen.
5) Möglicher Mechanismus, der Tumorzellen innewohnt
Die 21 zeigt die Auswirkung der Zusammensetzung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform auf die Expression des Fas-Rezeptors.
Die 22 zeigt die Auswirkung der Expression des Fas-Liganden.
Die 23 erläutert die Auswirkung der Zusammensetzung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform auf die Expression des Proteins p53.
Die 24 erläutert die Auswirkung der Zusammensetzung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform auf die Expression des Proteins p21.
Die 25 erläutert die Auswirkung der Aktivierung von PKC auf die Apoptose.
Die 26 erläutert die Auswirkung der Hemmung von PKC auf die Apoptose.
6) Auswirkung des Überstandes von Milchsäurebakterien der Erfindung auf die Apoptose von Darmtumorzellen LS 513
Die apoptotische Leistungsfähigkeit von Bakterien-Überständen in Bezug auf die Linie LS 513, die Tumorlinie, wurde analysiert. Die hinsichtlich der Aktivität der Caspase-3 erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Überstände selbst in Gegenwart von 5-Fluoruracil (2,5 μg/ml und 100 μg/ml) diese Caspase nicht signifikant aktivieren (27). Im Gegenteil: in Gegenwart von 100 μg/ml 5FU hemmen diese Überstände die Aktivität von Caspase-3. Die Fluoreszenzfärbung des Kerns von Krebszellen mit Hilfe der DAPI-Technik hat es nicht ermöglicht, Zellkerne sichtbar zu machen, bei denen das Chromatin verdichtet ist: ein grundsätzliches Merkmal von apoptotischen Zellen. Die Färbung von Zellkernen ist für gesunde und lebende Zellen typisch (28, 100fache und 630fache Vergrößerung). Zudem zeigen die Durchflusszytometrie-Untersuchungen mit Hilfe von Propidiumiodid weder einen Zelltod (29) noch eine signifikante Störung der Phasen des Zellzyklus (30). Die Gesamtheit dieser Ergebnisse deutet darauf hin, dass die Bakterien-Überstände keine Apoptose in den Zellen LS 513 induzieren.
Diskussion
Die Auswirkung von intakten Bakterien, d.h. solchen, die lebend und bestrahlt sind, auf Krebs ist die gleiche. Demgegenüber scheinen nicht intakte Bakterien, z.B. solche, die durch Hitze zerstört sind, eine den intakten Bakterien entgegengesetzte Wirkung zu haben.
Darüber hinaus wurde gemäß den im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung durchgeführten Arbeiten festgestellt, dass die Wirksamkeit eines Antikrebsmittels wie 5FU in Gegenwart von intakten Bakterien beträchtlich erhöht wird. Diese Wirksamkeit wäre dosisabhängig. Eine schnellere Apoptose in Gegenwart von lebenden Bakterien wurde festgestellt.
Das Vorliegen von erhitzten Bakterien zusammen mit 5FU würde die Expression des Proteins p21 erhöhen. Es könnte somit eine Modulation über einen unbekannten Rezeptor von Regulator-Proteinen der Apoptose/des Zellzyklus (p21) vorliegen. Eine Erhöhung des Proteins p21 wurde festgestellt, wenn weniger Apoptose vorliegt, und eine Reduktion des Proteins wurde festgestellt, wenn mehr Apoptose vorliegt.
Die Buttersäure ist ein Produkt von Milchsäurebakterien und sie liegt im Darm vor. Dieses Produkt verursacht Apoptose in Colon-Krebszellen in vitro. Es ergäbe sich ein synergistischer Effekt zwischen dem Butyrat und dem 5FU auf Colon krebs. Ebenfalls wurde festgestellt, dass Buttersäure das in vivo-Wachstum von menschlichem Colonkrebs bei Mäusen hemmt.
Aufgrund des Vorhergehenden weisen die lebenden Milchsäurebakterien einen synergistischen Effekt mit 5FU auf, um die Anzahl von Krebszellen in Kultur (MTT) zu verringern oder auch die Apoptose bei den letzteren zu erhöhen (Durchflusszytometrie).
Die bestrahlten Milchsäurebakterien haben die gleiche Wirkung wie die lebenden Bakterien, während die erhitzten Bakterien eine entgegengesetzte Wirkung haben. Somit ist die intakte Form der Milchsäurebakterien für ihre Wirkung gegen Tumorzellen notwendig. Darüber hinaus hängt die Wirkung der Bakterien auch von der Dosis ab und ist derselben proportional. Die Eigenschaft, die Apoptose durch Milchsäurebakterien der Erfindung zu induzieren oder zu modulieren, wurde durch Versuche erhärtet, die den nicht-apoptotischen Effekt des Überstandes dieser Bakterien zeigen.
Die Expression von Caspase-3 sowie von Protein 21 wird durch lebende Milchsäurebakterien auf die gleiche Weise wie die Apoptose moduliert.

Claims

Verwendung eines Milchsäurebakterienstammes zur Herstellung eines Medikamentes zur Verstärkung der Immunantwort bei einem Säuger zur Vorbeugung oder Behandlung von Krebs, wobei der Stamm Lactobacillus acidophilus I-1492 darstellt, der bei der CNCM (Collection Nationale de Cultures Micro-organismes, Institut Pasteur, Paris, France) hinterlegt ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Säuger ein menschliches Wesen ist.
Verwendung eines Milchsäurebakterienstammes zur Herstellung eines Medikaments zur Erleichterung der Induktion der Apoptose von Krebszellen, wobei der Stamm Lactobacillus acidophilus I-1492 darstellt, der bei der CNCM hinterlegt ist.
Verwendung eines Milchsäurebakterienstammes zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung von Krebs, wobei der Stamm Lactobacillus acidophilus I-1492 darstellt, der bei der CNCM hinterlegt ist.
Die Verwendung nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Bakterienstamm in lebender Form vorliegt, oder in nicht-lebender aber intakter Form vorliegt.
Die Verwendung nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass außerdem ein Stamm der Spezies Lactobacillus casei verwendet wird.
Die Verwendung nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 6, zusätzlich mit einem Antikrebsmittel.
Die Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Antikrebsmittel 5-Fluoruracil darstellt.
Die Verwendung nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte Krebsart Colonkrebs ist.
Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung von Krebs, enthaltend eine wirksame Menge eines Milchsäurebakterienstammes und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei der Stamm Lactobacillus acidophilus I-1492 darstellt, der bei der CNCM hinterlegt ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Bakterienstamm in lebender Form vorliegt, oder in nicht-lebender aber intakter Form vorliegt.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass außerdem ein Stamm der Spezies Lactobacillus casei enthalten ist.
Die Zusammensetzung nach irgend einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Antikrebsmittel enthält.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Antikrebsmittel 5-Fluoruracil ist.
Die Zusammensetzung nach irgend einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte Krebsart Colonkrebs ist.
Kit zur Vorbeugung oder Behandlung von Krebs bei Mammaliern, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Behälter aufweist enthaltend eine Zusammensetzung, die definiert ist nach einem der Ansprüche 10 bis 14.