DE60209467T2

DE60209467T2 - Neue aminopeptidase und ihr gen

Info

Publication number: DE60209467T2
Application number: DE60209467T
Authority: DE
Inventors: KyokoFood Res. & Dpt Lab Kawasaki-Shi KOIBUCHI; Daiki.Food Res. & Dpt Lab Kawasaki-ku Kawasaki-shi NINOMIYA; Mari Food Res. & Dpt Lab. Kawasaki-Shi KOJIMA; Yoichi.Seasoning Res. & Dpt Lab. Kawasaki-Shi UEDA; Jun-ichi Adachi-Ku MARUYAMA; Katsuhiko Bunkyo-Ku KITAMOTO
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2001-03-19
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2022-03-16
Also published as: US7087422B2; EP1371725A1; JPWO2002077223A1; CN1501975A; ATE318898T1; DE60209467D1; WO2002077223A1; EP1371725A4; BR0207889A; EP1371725B1; US20040219636A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Aminopeptidasen und dafür kodierende Gene.
Kojipilze werden für die Herstellung von Sojasoße, miso (fermentierte Sojabohnenpaste) und andere natürliche Würzmittel, die Proteinhydrolysate enthalten, eingesetzt. Beispielsweise wird Sojasoße in zwei Stufen hergestellt, das heißt eine Stufe, bei der Koji hergestellt wird, und eine Fermentationsstufe. Die Ausgangsmaterialien werden durch ein Enzym, das von einem Kojipilz (ein filamentöser Pilz der Gattung Aspergillus) hergestellt wird, in der Stufe der Präparation des Kojipilzes hydrolysiert. Zum Verbessern des Geschmacks der Sojasoße ist es wichtig, die Menge der freien Aminosäuren in der Sojasoße in diesen Stufen zu erhöhen.
Aminosäuren werden durch zwei Stufen aus dem Ausgangsprotein hergestellt. Die erste Stufe ist die Freisetzung eines Peptids aus Proteinen durch Proteanen, und die zweite Stufe ist die Produktion von Aminosäuren durch Hydrolyse der Peptide, was durch Peptidasen katalysiert wird.
Was die Peptidasen aus Kojipilzen betrifft, wurden solche aus Aspergillus oryzae und Aspergillus sojae berichtet (JP-Kokai Nr. 11-346777, DE 95-1952648, WO 9851163, WO 9628542, WO 9615504, WO 9851803 und WO 9814599). Darin wird beschrieben, dass die Leucinaminopeptidase bei der Herstellung von Sojasoße besonders wichtig ist. Es wird jedoch nicht berichtet, dass bekannte Leucinaminopeptidase gegen Salz resistent ist. Was die Gene der Leucinaminopeptidase der Gattung Aspergillus betrifft, haben Kaifu et al. Aspergillus sojae (JP-Kokai Nr. 11-346777) beschrieben, es gibt jedoch bislang keinen Bericht über die Salzbeständigkeit dieses Enzyms.
Was die Gattung Bacillus betrifft, wurde eine salzbeständige Leucinaminopeptidase offenbart (Lee, G. D. et al., J. Appl. Microbiol. (1988), 85 (3)).
Auf der anderen Seite haben Asano et al. berichtet, dass die Vorratsproteine in Sojabohnen während eines sehr kurzen Zeitraums während der Keimung in Aminosäuren hydrolysiert werden. Sie fanden Peptidasen (Aminopeptidase GX, die saure Aminosäuren enthaltende Peptide effizient hydrolysieren kann, und Leucinaminopeptidasen) in Sojabohnencotyledonen und konnten das Sojabohnenprotein effektiv hydrolysieren (JP-Kokai Nr. Hei 9-294583).
Im Hinblick auf die enzymologischen Eigenschaften der Aminopeptidase GX aus Sojabohnen ist die Aminopeptidase GX eine neue Aminopeptidase, über die bislang nicht berichtet worden ist. Die Anwesenheit der Aminopeptidase GX aus Sojabohnen war bislang nur in keimenden Sojabohnen bekannt. Aminopeptidase GX aus Sojabohnen kann N-terminale saure Aminosäuren aus Peptiden mit sauren Aminosäuren, wie Glutaminsäure, an deren N-Terminus effektiv freisetzen. Dementsprechend ist es möglich, Sojasoße mit einem hohen freien Glutaminsäuregehalt und hervorragenden Geschmack unter Ausnutzung der Wirkung dieses Enzyms herzustellen.
Ninomiya et al. haben erfolgreich eine große Menge an Sojabohnen-Aminopeptidase GX durch ein genetisches Rekombinationsverfahren hergestellt (JP-Kokai Nr. 2000-325090). Es ist jedoch schwierig, Aminopeptidase GX aus Sojabohnen, hergestellt durch dieses Verfahren zur Produktion von Sojasoße, aufgrund der Probleme hinsichtlich GMO und der Kosten einzusetzen.
Lee, G.-D. et al., "Purification and properties of an extracellular leucine aminopeptidase from Bacillus sp. N2", September 1998 (1998-09), Journal of Applied Microbiology, Vol. 85, Nr. 3, Seiten 561–566 offenbaren eine aus Bacillus isolierte NaCl-tolerante Aminopeptidase.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine von Kojipilzen abgeleitete Aminopeptidase bereitzustellen, die bei der Herstellung von Sojasoße oder Proteinhydrolysaten mit einem hohen Gehalt an freien Aminosäuren und hervorragenden Würzeigenschaften effektiv produzieren kann, und auch ein diese Aminopeptidase kodierendes Gen bereitzustellen.
Nach eingehenden Untersuchungen zur Lösung der vorstehend beschriebenen Aufgaben haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung erfolgreich eine DNA, die eine neue Aminopeptidase kodiert, aus Aspergillus nidulans durch Screenen der genomischen DNA-Bibliothek von Aspergillus nidulans mit A. nidulans EST, der zu Sojabohnen-Aminopeptidase GX-Genen homolog ist, als Sonde erhalten. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieses Ergebnisses gemacht.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt ein Protein aus einem Kojipilz bereit, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus

(A) einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 519 in der SEQ ID NR: 3 des Sequenzprotokolls,
(B) einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 510 in der SEQ ID NR: 5 des Sequenzprotokolls,
(C) einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 519 in der SEQ ID NR: 3, wobei eine bis 170 Aminosäuren substituiert, deletiert, inseriert, addiert oder invertiert in der Sequenz der SEQ ID NR: 3 ist und das Protein die Fähigkeit zum Katalysieren der Reaktion der Freisetzung einer Aminosäure an einem N-Terminus eines Peptids hat,
(D) einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 510 in der SEQ ID NR: 5, wobei in der Sequenz der SEQ ID NR: 5 eine bis 170 Aminosäuren substituiert, deletiert, inseriert, addiert oder invertiert sind und das Protein die Fähigkeit zum Katalysieren der Reaktion der Freisetzung einer Aminosäure am N-Terminus eines Peptids hat.

Die vorliegende Erfindung stellt auch Nucleinsäuremoleküle bereit, die für ein beliebiges Protein der vorstehend genannten Punkte (A) bis (D) kodieren, rekombinante Nucleinsäuremoleküle, welche diese Nucleinsäuremoleküle enthalten, transformierte Mikroorganismuswirtszellen und ein Verfahren zur Herstellung einer Aminopeptidase unter Verwendung der transformierten Mikroorganismuswirtszellen. In der vorliegenden Erfindung umfassen transformierte Mikroorganismuswirtszellen transformierte filamentöse Pilze, insbesondere transformierte Kojipilze.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Aminopeptidase aus einem Kojipilz mit den folgenden Eigenschaften 1) bis 8) bereit:

1) Hydrolysieren eines Peptids oder Proteins mit Leucin oder Methionin am N-Terminus unter Freisetzung von Leucin oder Methionin;
2) pH-Optimum bei 7,0 bis 7,5;
3) Temperaturoptimum bei 37°C bis 45°C;
4) verbleibende Aktivität von mindestens 80% selbst bei einer Natriumchloridkonzentration von 3 M, wobei die Aktivität in Abwesenheit von Natriumchlorid als 100 definiert ist;
5) verbleibende Aktivität von mindestens 80% nach Lagerung in Anwesenheit von 3 M Natriumchlorid bei 0°C während 24 Stunden, wobei die Aktivität nach der Lagerung in Abwesenheit von Natriumchlorid bei 0°C während 24 Stunden als 100 definiert ist;
6) verbleibende Aktivität von mindestens 60% nach Lagerung bei pH 5,8 bis 9,5 bei 0°C während 24 Stunden, wobei die Aktivität nach Lagerung bei pH 7,5 bei 0°C während 24 Stunden als 100 definiert ist;
7) Molekulargewicht von 550 kD auf einem nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel und ein Molekulargewicht von 22 oder 33 kD auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel; und
8) benötigt für die Aktivierung Cobaltionen oder Zinkionen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Graph, der die Temperaturabhängigkeit der PepE-Aktivität zeigt. Die horizontale Achse gibt die Temperatur an, und die vertikale Achse gibt die relative Aktivität der Leucinaminopeptidase an, wobei die bei 37°C erhaltene Aktivität als 100 definiert ist.
2 ist ein Graph, der den Einfluss der Konzentration von Natriumchlorid in dem Reaktionsgemisch auf PepE zeigt. Die horizontale Achse zeigt die NaCl-Konzentration (M), und die vertikale Achse zeigt die relative Aktivität von Leucinaminopeptidase bei unterschiedlichen NaCl-Konzentrationen, wobei die Aktivität in Abwesenheit von NaCl als 100 definiert ist.
3 ist ein Graph, der die Abhängigkeit der PepE-Aktivität vom pH-Wert zeigt. Die horizontale Achse gibt den pH-Wert an, und die vertikale Achse gibt die relative Aktivität der Leucinaminopeptidase an, wobei die Aktivität in einem Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) als 100 definiert ist.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Wie vorstehend beschrieben betrifft die vorliegende Erfindung Aminopeptidasen aus Kojipilzen, Nucleinsäuremoleküle, welche für diese kodieren, transformierte Mikroorganismuswirtszellen, welche eine rekombinante DNA tragen, die die Nucleinsäuremoleküle enthalten, und ein Verfahren zur Herstellung einer Aminopeptidase durch Kultivieren der transformierten Mikroorganismuswirtszellen. In der vorliegenden Erfindung stellt "PepE" ein Aminopeptidaseprotein aus Kojipilzen gemäß der vorliegenden Erfindung dar, und "pepE" stellt das für PepE kodierende Gen dar. Der hier verwendete Ausdruck "Aminopeptidase" gibt ein Protein an, das die Reaktion des aufeinander folgenden Freisetzens von Aminosäuren von dem N-Terminus eines Peptids katalysieren kann.
Die die erfindungsgemäßen Aminopeptidasen kodierenden Nucleinsäuremoleküle können aus der chromosomalen DNA oder cDNA von Aspergillus nidulans erhalten werden. Genauer gesagt können diese Nucleinsäuremoleküle aus der chromosomalen DNA-Bibliothek von Aspergillus nidulans, wie Aspergillus nidulans A26, erhalten werden. Ein Klon, der die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthält, kann durch das PCR (Polymerasekettenreaktion)-Verfahren unter Einsatz der chromosomalen DNA-Bibliothek von Aspergillus nidulans als Matrize durch Herstellung von PCR-Primern auf der Grundlage der Gensequenz der Aminopeptidase GX, die von keimenden Sojabohnen abgeleitet ist (JP-Kokai Nr. 2000-325090), und der Nucleotidsequenzen von EST-Fragmenten mit hoher Homologie in Aspergillus nidulans EST-Datenbanken erhalten werden. Die Beispiele der PCR-Primer umfassen beispielsweise Oligonucleotide mit der Nucleotidsequenz der SEQ ID NRn: 6 und 7.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können von einer cDNA-Bibliothek, hergestellt von Poly (A)-RNA von Aspergillus nidulans, durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden mit der Nucleotidsequenz der SEQ ID NRn: 8 und 9 als Primer und unter Verwendung von 5'-RACE unter Verwendung von Oligonucleotiden der SEQ ID NRn: 10 und 11 als Primer erhalten werden. SEQ ID NR: 1 zeigt die Nucleotidsequenz der genomischen DNA, die das Gen enthält, das für Aspergillus nidulans A26 PepE kodiert und wie vorstehend beschrieben erhalten wurde. SEQ ID NR: 2 zeigt die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz von cDNA, und SEQ ID NR: 3 zeigt die Aminosäuresequenz allein. Die Nucleotidsequenzen der genomischen DNA und der cDNA wurden miteinander verglichen, und es zeigte sich, dass in der genomischen DNA keine Introns waren.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können solche sein, die die erfindungsgemäßen Aminopeptidasen kodieren. Sie umfassen DNA, welche die Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 72 bis 1628 der Nucleotidsequenz in SEQ ID NR: 2 enthalten, und solche, die durch Entfernen eines nichterforderlichen Teils am 5'-Ende erhalten werden. Der Ausdruck "Nucleinsäuremolekül" umfasst DNA, RNA und Analoge davon. In Abhängigkeit von ihrem Verwendungszweck sind auch solche Moleküle einsetzbar, die nur das reife Protein kodieren. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle umfassen auch solche, die durch Ersetzen eines Codons, das für eine Aminosäure kodiert, in der kodierenden Domäne durch ein anderes äquivalentes Codon erhalten werden. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können solche sein, die Aminopeptidase mit einer Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion von 1 bis 170 Aminosäuren an einer oder mehreren Positionen haben, solange die kodierte Aminopeptidaseaktivität nicht beeinträchtigt wird. Die Bedeutung des Ausdrucks "Vielzahl", die in Abhängigkeit von der Position und der Verschiedenheit der Aminosäurereste in der dreidimensionalen Struktur des Peptidaseproteins variieren, bedeutet hier vorzugsweise 2 bis 170, stärker bevorzugt 2 bis 50 und am stärksten bevorzugt 2 bis 10.
Das Nucleinsäuremolekül, das für ein Protein kodiert, das im Wesentlichen mit der vorstehend beschriebenen Aminopeptidase identisch ist, kann durch Modifizieren der Nucleotidsequenz von PepE erhalten werden, sodass eine Aminosäure an einer bestimmten Position substituiert, deletiert, inseriert oder zugegeben wird, beispielsweise durch ortsgerichtete Mutagenese. Die modifizierten Nucleinsäuremoleküle können durch ein bekanntes Mutageneseverfahren erhalten werden. Die Verfahren zur Mutagenese umfassen ein Verfahren, bei dem für PepE kodierende DNA in vitro mit Hydroxylamin oder dergleichen behandelt wird, und ein Verfahren, bei dem Escherichiabacterien, welche für PepE kodierende DNA enthalten, mit UV-Licht bestrahlt werden oder mit einem Mutagen behandelt werden, das üblicherweise für die künstliche Mutagenese eingesetzt wird, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder Nitrit.
Die vorstehend genannte Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion des Nucleotids umfasst auch die Mutation, die natürlich in den Varianten oder Stämmen des Kojipilzes gefunden werden. Das Nucleinsäuremolekül mit einer solchen Mutation wird in geeigneten Zellen exprimiert, und die PepE-Aktivität des exprimierten Produkts wird untersucht, wobei Nucleinsäuremoleküle erhalten werden, die im Wesentlichen das zu PepE identische Protein kodieren. Außerdem können Nucleinsäuremoleküle, die im Wesentlichen das zu PepE identische Protein kodieren, beispielsweise durch Isolieren von Nucleinsäuremolekülen, die unter stringenten Bedingungen mit einem Nucleinsäuremolekül der Sequenz, die aus den Nucleotiden Nr. 72 bis 1628 der Nucleotidsequenz der SEQ ID NR: 2, das für ein Protein mit PepE-Aktivität kodiert, hybridisiert, erhalten werden. Der Ausdruck "stringente Bedingung" bedeutet hier die Bedingung, bei der so genannte spezifische Hybride gebildet werden. Es ist schwierig, die Bedingungen genau zu beschreiben, weil sie in Abhängigkeit von dem GC-Gehalt jeder Sequenz und der Anwesenheit oder Abwesenheit von Wiederholungssequenzen variieren. Beispielhafte Bedingungen sind jedoch solche, bei denen Nucleinsäuremoleküle mit hoher Homologie von beispielsweise mindestens 65% miteinander hybridisieren können und solche mit einer Homologie von weniger als 65% nicht miteinander hybridisieren. Alternativ dazu können diese Bedingungen solche sein, bei denen Nucleinsäuremoleküle unter üblichen Waschbedingungen für die Southern-Hybridisierung, d. h. 60°C, 1 × SSC und 0,1% SDS, vorzugsweise 0,1 × SSC und 0,1% SDS Salzkonzentration, hybridisieren. Die Gene, die unter solchen Bedingungen hybridisieren können, können solche enthalten, bei denen ein Stoppcodon innerhalb des Gens gebildet wird, oder solche, welche die Aktivität durch Mutation im aktiven Zentrum verloren haben. Sie können leicht entfernt werden, indem sie mit einem käuflich erwerbbaren Aktivitätsexpressionsvektor verbunden werden und die PepE-Aktivität durch ein nachstehend beschriebenes Verfahren bestimmt wird.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können auch aus chromosomaler DNA oder cDNA von Mikroorganismen anderer Spezies der Gattung Aspergillus, wie Aspergillus oryzae, erhalten werden. Insbesondere können sie aus einer cDNA-Bibliothek von Aspergillus oryzae, wie Aspergillus oryzae RIB40 (ATCC 42149) durch PCR erhalten werden. Die Nucleinsäuremoleküle können durch Synthetisieren eines Oligonucleotidprimers für die PCR auf der Grundlage der Nucleotidsequenz von PepE aus Aspergillus nidulans und Durchführen der PCR unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek, die aus Zellen von Aspergillus oryzae, wie Aspergillus oryzae RIB40, hergestellt worden ist, als Matrize hergestellt werden. Primer für die PCR umfassen die Oligonucleotide mit den Nucleotidsequenzen der SEQ ID NRn: 12 und 13 für die 5'-RACE oder die Nucleotidsequenzen der SEQ ID NRn: 14 und 15 für die 3'-RACE.
Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz einer cDNA, die pepE aus Aspergillus oryzae RIB40 entspricht und wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, sind in SEQ ID NR: 4 gezeigt, und die Aminosäuresequenz allein ist in SEQ ID NR: 5 gezeigt. Die Aminosäuresequenz von PepE aus Aspergillus nidulans in SEQ ID NR: 2 und die Aminosäuresequenz einer korrespondierenden Aminopeptidase von Aspergillus oryzae in SEQ ID NR: 4 haben eine Homologie von etwa 77%, und außerdem sind etwa 120 Aminosäurereste in den reifen Proteinteilen unterschiedlich. Die Homologie zwischen pepE von Aspergillus nidulans und dem kor respondierenden Gen von Aspergillus oryzae war etwa 71% für die kodierende Region.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül ein Nucleinsäuremolekül, das für ein Protein mit der Fähigkeit zum Katalysieren der Reaktion zum Freisetzen einer Aminosäure aus einem Peptid kodiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz hat, die den Aminosäurepositionen Nr. 1 bis 510 der SEQ ID NR: 4 mit Substitutionen, Deletionen, Insertionen, Additionen oder Inversionen von einer oder mehreren Aminosäuren entspricht. In einer weiteren Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle solche, die mit DNA mit einer Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 73 bis 1602 in der Nucleotidsequenz der SEQ ID NR: 4 unter stringenten Bedingungen hybridisieren und für ein Protein kodieren, das die Reaktion zum Freisetzen einer Aminosäure aus einem Peptid katalysieren kann.
In den vorstehend genannten Beispielen sind die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle die vorstehend beschriebenen DNA's. Sobald deren Nucleotidsequenzen bestimmt worden war, wurde es möglich, Nucleinsäuremoleküle, welche die entsprechende Aminopeptidase kodieren, aus der genomischen DNA von Aspergillus nidulans A26, Aspergillus oryzae RIB40 oder von anderen Stämmen von Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae durch PCR oder Hybridisierung zu klonieren. Dementsprechend werden solche Nucleinsäuremoleküle vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle sind für das Produzieren der erfindungsgemäßen Aminopeptidasen nützlich.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle sind für das Züchten von filamentösen Pilzen, wie Kojipilzen, oder für die Produktion von Aminopeptidase PepE geeignet. Beispielsweise kann in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform die PepE-Aktivität durch Einführen der DNA, die für die erfindungsgemäße Aminopeptidase kodiert, in die Zellen eines filamentösen Pilzes (wie Aspergillus oryzae), vorzugsweise als Mehrkopien-DNA erhöht werden. PepE kann durch Exprimieren der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in einem geeigneten Wirt hergestellt werden. Die filamentösen Pilze, wie Kojipilze, die so erhalten werden, oder PepE, das daraus erhalten wird, sind für die Produktion von Sojasoße, miso (fermentierte Sojabohnenpaste) oder anderen Würzmitteln, die Proteinhydrolysate enthalten, nützlich.
Die filamentösen Pilze, in die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle eingeführt werden, umfassen filamentöse Pilze der Gattung Aspergillus, wie Aspergillus oryzae, Aspergillus niger oder Aspergillus nidulans, solche der Gattung Neurospora, wie Neurospora crassa, und solche der Gattung Rhizomucor, wie Rhizomucor miehei. Die filamentösen Pilze der Gattung Aspergillus sind besonders bevorzugt.
Die Vektoren zum Einführen der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in die vorstehend beschriebenen filamentösen Pilze sind nicht besonders eingeschränkt, und es sind solche einsetzbar, die üblicherweise zum Züchten von filamentösen Pilzen verwendet werden. Beispielsweise umfassen die für Aspergillus oryzae verwendeten Vektoren pUNG (Lee, B. R. et al., Appl. Microbiol. biotechnol., 44, 425–431 (1995)), pMARG (Tsuchiya, K. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 40, 327–332 (1993)), pUSC (Gomi, K. et al., Agric. Biol. Chem. 51, 2549–2555 (1987)), und dergleichen. Der Vektor pUNG hat einen Marker, der niaD- (mit einem Defekt der Assimilation von Salpetersäure) von Aspergillus oryzae niaD300 (Minetoki, T. et al., Curr. Genet. 30, 432–438 (1996)) komplementiert, pMARG hat einen Marker, der argB- (Argininbedarf) von Aspergillus oryzae M2-3 (Gomi, K. et al., Agric. Biol. Chem., 51(9), 2549–2555 (1987)) komplementiert, und pUSC hat einen Marker, der sC- (Defekt in der ATP-Sulfurylase) von Aspergillus oryzae NS4 (Yamada, 0. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 61(8), 1367–1369 (1997)) komplementiert.
Unter diesen Vektoren haben pUNG und pMARG einen Promotor für das Glucoamylasegen (glaA) und für das α-Amylasegen (amyB-Terminator). Durch Einführen der erfindungsgemäßen DNA (beispielsweise der Region, welche die Nucleotide der Positionen Nr. 72 bis 1628 der SEQ ID NR: 2 umfasst) in dem Bereich stromabwärts des Promotors im Leserahmen kann PepE unter Kontrolle des Promotors exprimiert werden. Wenn pUSC verwendet wird, kann, da pUSC keinen Promotor enthält, PepE durch Einbau in einen filamentösen Wirtspilz durch Kotransformation mit einem Plasmid, wie pUC19, der die erfindungsgemäße DNA enthält, exprimiert werden.
In Abhängigkeit von dem filamentösen Wirtspilz sind auch Vektoren, Promotoren und Marker einsetzbar, die in der Literatur beschrieben sind und in Tabelle 1 gezeigt sind. In Tabelle 1 sind die Promotoren durch die Angabe der Enzyme aufgelistet, welche durch die Gene kodiert werden, die natürlicherweise von den Promotoren reguliert werden.
Tabelle 1
Für die Transformation von filamentösen Pilzen kann jedes bekannte Verfahren neben den in Tabelle 1 aufgelisteten Verfahren, die in der Literatur beschrieben sind, eingesetzt werden. Beispielsweise kann Aspergillus oryzae wie nachstehend beschrieben transformiert werden.
Die Zellen (Conidien) werden in DPY-Kulturmedium (2% Glucose, 1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, pH 5,0) eingeimpft und etwa 24 Stunden bei 30°C heftig geschüttelt, um eine Schüttelkultur durchzuführen. Die Kultur wurde durch ein Myracloth (CALBIO CHEM Co.) oder durch ein sterilisiertes Filtertuch oder dergleichen filtriert, wobei die Zellen gewonnen wurden. Die Zellen wurden mit sterilisiertem Wasser gewaschen und sorgfältig entwässert. Die Zellen wurden in ein Teströhrchen gegeben. Eine Enzymlösung [1,0% Yatalase; Takara Shuzo Co., Ltd.] oder 0,5% NovoZyme (Novo Nordisk) und 0,5% Cellulase (beispielsweise Cellulase Onozuka; Yakult Co., Ltd.), 0,6 M (NH₄)2SO₄ und 50 mM Äpfelsäure, pH 5,5] werden zugegeben und etwa 3 Stunden bei 30°C leicht geschüttelt. Der Grad der Protoplastenbildung wird mit einem Mikroskop überwacht. Sobald der gewünschte Zustand beobachtet wird, werden die Protoplasten auf Eis gelagert.
Das enzymatische Reaktionsgemisch wird durch Myracloth filtriert, um die Zellrückstände zu entfernen. Eine gleiche Menge Puffer A (1,2 M Sorbitol, 50 mM CaCl₂, 35 mM NaCI und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) wird zu dem Protoplasten-enthaltenden Filtrat gegeben, und das erhaltene Gemisch wird in Eis gegeben. Nach der Zentrifugation des Gemisches bei 1.500 bis 2.500 UpM bei 0°C während 5 bis 10 Minuten wird die Zentrifugation langsam angehalten. Die Pellets werden mit Puffer A gewaschen und dann in einer geeigneten Menge Puffer A suspendiert. 20 μl oder weniger DNA-Lösung (5 bis 10 μg) werden zu 100 bis 200 μl der Protoplastensuspension gegeben, und die erhaltene Suspension wird 20 bis 30 Minuten in Eis gegeben. 250 μl Puffer A (60% Polyethylenglykol 6000, 50 mM CaCl₂, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) werden zu dem erhaltenen Gemisch gegeben. Nach vorsichtigem Mischen werden zusätzliche 250 μl Puffer B zugegeben, und das erhaltene Gemisch wird vorsichtig gemischt. Dann werden 850 μl Puffer B zu dem Gemisch gegeben, und es wird vorsichtig gemischt, und dann lässt man das Gemisch 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen. 10 ml Puffer A werden zu dem Gemisch gegeben. Das Teströhrchen wird gestürzt, um den Inhalt; zu mischen. Nach der Zentrifugation bei 1.500 bis 2.500 UpM bei 0°C wäh rend 5 bis 10 Minuten werden die Zellen in 500 μl Puffer A suspendiert.
Eine geeignete Menge der so erhaltenen Suspension wird zu 5 ml des Topagars gegeben, der vorher portioniert und vorgewärmt und auf das untere Schichtmedium gegeben wurde (selektives Medium, hergestellt in Abhängigkeit von dem Marker und enthaltend 1,2 M Sorbitol), und es wurde bei 30°C kultiviert. Die gewachsenen Zellen werden auf dem Selektionsmedium subkultiviert, um zu bestätigen, dass Transformanten vorhanden sind. Es ist bevorzugt, dass rekombinante DNA außerdem aus den Zellen präpariert werden, um die Einführung der erfindungsgemäßen DNA durch Restriktionsenzymanalyse oder Southern-Analyse und dergleichen zu bestätigen.
Die so erhaltenen Transformanten werden unter Bedingungen kultiviert, die für den Promotor geeignet sind, der eingesetzt wird, um pepE zu exprimieren, wodurch PepE erhalten wurde. Wenn beispielsweise Aspergillus oryzae als Wirt und Glucoamylasepromotor als der Promotor eingesetzt wird, werden Sporen oder transformierte Aspergillus oryzae in einem Medium suspendiert, das Weizenkleie, Kaliumphosphat und dergleichen enthält, und es wird etwa 3 Tage bei etwa 30°C kultiviert, um PepE zu produzieren. Die Kultur wird bei Bedarf mit destilliertem Wasser oder dergleichen verdünnt und dann mit einem Homogenisator oder dergleichen extrahiert, um einen Rohenzymextrakt, der PepE enthält, zu erhalten. Der erhaltene Rohextrakt kann durch Gelfiltration oder Chromatografie behandelt werden, um PepE weiter zu reinigen. Das so erhaltene PepE kann durch Aussalzen, isoelektrische Ausfällung, Gelfiltration, Ionenchromatografie, Umkehrphasenchromatografie oder dergleichen weiter gereinigt und für die Hydrolyse von Proteinen eingesetzt werden. Es ist auch möglich, ein Proteinhydrolysat: mit einem hohen Gehalt an freien Aminosäuren und einem starken Würzaroma durch direktes Mischen eines Kulturprodukts des transformier ten Mikroorganismus mit erhöhter PepE-Aktivität, erhalten durch Einführen der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, mit einem proteinhaltigen Ausgangsmaterial zusammen mit einem proteolytischen Enzym zu erhalten. Die hier eingesetzten proteinhaltigen Ausgangsmaterialien sind beispielsweise Sojabohnen, Weizen und Weizengluten. Sie umfassen außerdem entfettete Sojabohnen und verschiedene verarbeitete Proteine, wie aufgequollene oder aufgelöste Proteine, sowie Proteine, die aus verschiedenen Ausgangsmaterialien abgetrennt werden.
Die Aktivität von PepE kann durch Zugeben von 0,02 ml Rohenzymextrakt und 0,015 ml 100 mM Zinkchlorid zu 0,75 ml 1 mM Leu-pNA (50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5), Umsetzen des Gemisches bei 37°C während 10 Minuten, Beenden der Reaktion durch Zugeben von 0,25 ml 40% Essigsäure und Bestimmen der Absorption der Reaktionslösung bei 405 nm bestimmt werden. Die Aktivitäten von PepE in verschiedenen Präparationen können dadurch miteinander verglichen werden, dass die Aktivität zur Erzeugung von 1 μmol p-Nitroanilin pro Minute als 1 Einheit (U) der Aktivität definiert wird.
Was die praktischen Bedingungen betrifft, unter denen das kultivierte Produkt des transformierten Mikroorganismus oder ein rohes Enzym mit Proteinen umgesetzt wird, wird beispielsweise ein proteinhaltiges Ausgangsmaterial mit einer Konzentration von 0,2 bis 50% mit dem kultivierten Produkt des transformierten Mikroorganismus in Anwesenheit eines proteolytischen Enzyms gemischt, wobei die Reaktion 4 Stunden bis 10 Tage bei 5 bis 60°C durchgeführt wird.
Nach dem vollständigen Ablauf der Reaktion werden unlösliche Materialien, wie das nicht-umgesetzte proteinhaltige Ausgangsmaterial und die Zellen, durch übliche Abtrennverfahren, wie Zentrifugation oder Filtration, entfernt. Das Produkt kann bei Bedarf unter vermindertem Druck oder durch Umkehrosmose oder dergleichen konzentriert werden, und das konzentrierte Produkt kann durch Trocknungsbehandlung, wie Gefriertrocknen, Trocknen unter vermindertem Druck oder Sprühtrocknen getrocknet oder granuliert werden. Somit können Proteinhydrolysate mit einem hohen Gehalt an freien Aminosäuren und einem starken Würzaroma erhalten werden.
Beispiele
Beispiel 1: Klonieren der pepE-Genom-DNA von Aspergillus nidulans
Durch Homologierecherche unter Einsatz der EST-Datenbank von Aspergillus nidulans (http://www.genome.ou.edu/fungal.html) auf Basis der Sequenz von Aminopeptidase GX, abgeleitet von keimenden Sojabohnen, wurde EST obd03a1.f1, der eine hohe Homologie hatte, gefunden.
Auf Grundlage dieser Information wurde Aspergillus nidulans pepE aus Aspergillus-nidulans-Genombibliothek wie folgt kloniert.
Die Aspergillus-nidulans-Genombibliothek wurde vom Fungal Genetics Stock Center (Kansas City, USA) käuflich erworben. Diese Bibliothek war durch Schneiden der genomischen DNA von Aspergillus nidulans mit Restriktionsenzymen, Ligieren des Verdauungsprodukts an einen Cosmidvektor und Einführen des Vektors in Escherichia coli erhalten worden. Die Bibliothek wurde wie folgt gescreent. Escherichia-coli-Klone, welche die gewünschten Gene enthielten, wurden mittels PCR unter Einsatz der Oligonucleotide mit den folgenden Sequenzen, die gemäß der Nucleotidsequenz von EST obd03a1.f1 synthetisiert worden waren, und Escherichia coli, enthaltend den Cosmidvektor als Quelle für die Matrizen-DNA, gescreent.
(Primer für das 5'-Ende)
CTC AAA CGG CCA CAT GAC TAC (SEQ ID NR: 6)
(Primer für das 3'-Ende)
GTC T GT TCA AGT GCA TAG CCT (SEQ ID NR: 7)
<Text ohne Sequenzliste>

SEQ ID NRn: 6 und 7: PCR-Primer

Was die PCR-Reaktion betrifft, wurden 25 Reaktionszyklen nach der thermischen Denaturierung bei 94°C während 3 Minuten durchgeführt. Jeder Reaktionszyklus wurde bei 94°C während 30 Sekunden, bei 52°C während 10 Sekunden und bei 72°C während 30 Sekunden durchgeführt. Es wurden 4 Klone gefunden, welche die gewünschten Gene enthielten. Die Cosmidvektoren wurden aus den Klonen gewonnen, um die Nucleotidsequenzen zu bestimmen. Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz, die von dieser Nucleotidsequenz kodiert wird, sind in SEQ ID NR: 2 gezeigt, und die Aminosäuresequenz allein ist in SEQ ID NR: 3 gezeigt.
Der Stamm Escherichia coli JM109, der mit einem Plasmid transformiert war, das durch Einführen des Gens in Plasmid pUC19 erhalten wurde, erhielt die interne Nummer AJ13856 und wurde am 19. März 2001 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Ministry of Economy, Trade and. Industry (derzeit National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Chuo Nr. 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan, 305-8566) unter der Hinterlegungsnummer FERM P-18263 hinterlegt. Am 11. März 2002 wurde dieser Stamm in eine internationale Hinterlegung mit der Nummer FERM BF-7949 überführt.
Beispiel 2: Klonieren der pepE-cDNA aus Aspergillus nidulans
Aspergillus nidulans A26 wurde durch Schütteln in 50 ml YG-Medium (0,5% Hefeextrakt, 2,5% Glucose, 0,1% Spurenelemente*, pH 6,5) bei 30°C während 48 Stunden kultiviert (Spurenelemente*: 0,1% FeSO₄·7H₂O, 0,88% ZnSO₄·7H₂O, 0,04% CuSO₄·5H₂O, 0,015% MnSO₄·4H₂O, 0,01% Na₂B₄O₇·10H₂O, 0,005% (NH₄)₆MoO₂₄ 4H₂O).
Die Zellen wurden gewonnen, in flüssigem Stickstoff gefroren und mit einem Mörser zerkleinert. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines RNeasy Plant Mini Kits (QIAGEN) aus den zerkleinerten Zellen präpariert, und mRNA wurde unter Verwendung eines Micro FAST Track Kits (Invitrogen) präpariert. cDNA wurde aus der mRNA unter Verwendung eines cDNA Synthesis Kit (Promega) synthetisiert, und die cDNA wurde mit einem cDNA PCR Library Kit (TaKaRa) hergestellt.
Durch die Verwendung der cDNA-Bibliothek als Matrize wurde pepE-cDNA durch PCR und 5'-RACE unter Einsatz von Oligonucleotiden als Primer, welche die folgenden Sequenzen hatten und auf der Grundlage der genomischen DNA-Sequenz von Aspergillus nidulans konstruiert wurden, kloniert.
(Primer für das 5'-Ende)
CAC CAC CAT GAG TCT AAC TTG G (SEQ ID NR: 8)
(Primer für das 3'-Ende)
GTC TGT TCA AGT GCA TAG CCT G (SEQ ID NR: 9)
(Primer für das 5'-Ende für die 5'-RACE)
CGT GGT ACC ATG GTC TAG AGT (SEQ ID NR: 10)
(Primer für das 3'-Ende für die 5'-RACE)
AAT CGC AGT AAG CCT GCG AG (SEQ ID NR: 11)
<Text ohne Sequenzliste>

SEQ ID NRn: 8 bis 11: PCR-Primer

Die PCR wurde mit 30 Reaktionszyklen nach thermischer Denaturierung bei 94°C während 9 Minuten durchgeführt. Jeder Zyklus der Reaktion wurde 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 30 Sekunden bei 72°C durchgeführt, und schließlich wurde die Reaktion 5 Minuten bei 72°C inkubiert. Es wurden DNA-Fragmente von etwa 1.800 bp durch PCR mit Primern der SEQ ID NRn: 8 und 9 erhalten, und es wurde Amplifikationsfragmente von etwa 250 bp durch 5'-PACE mit Primern der SEQ ID NRn: 10 und 11 erhalten. Die Nucleotidsequenzen dieser DNA-Fragmente und die Aminosäuresequenzen, die von den Nucleotidsequenzen abgeleitet sind, sind in SEQ ID NR: 2 gezeigt.
Der Stamm Escherichia coli JM109, der mit dem Plasmid transformiert war, wurde durch Einführen der cDNA-Fragmente des vorstehend beschriebenen Aspergillus nidulans pepE in pBluescript erhalten und erhielt die interne Nummer AJ13857 und wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Ministry of Economy, Trade and Industry (derzeit National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Chuo Nr. 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, 305-8566) am 19. März 2001 als FERM P-18264 hinterlegt und in eine internationale Hinterlegung am 11. März 2002 als FERM BP-7950 überführt.
Beispiel 3: Klonieren von cDNA, die Aspergillus oryzae pepE homolog ist
(1) Konstruktion einer Aspergillus-oryzae-cDNA-Bibliothek
Aspergillus oryzae RIB40 (ATCC 42149) wurde in 50 ml DPY-Medium 64 Stunden bei 30°C kultiviert. Die Zellen wurden durch Filtration geerntet, wobei 1 g Zellen erhalten wurden. Die Zellen wurden unmittelbar in flüssigem Stickstoff gefroren und in einem Mörser zerkleinert. Die Gesamt-RNA wurde aus den zerkleinerten Zellen mit RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) präpariert. Die gereinigte mRNA wurde aus der RNA mit dem mRNA Purification Kit (Pharmacia) erhalten, und die cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung des cDNA PCR Library Kit (TaKaRa) oder dem 3'-RACE-System für die rasche Amplifikation von cDNA-Enden (GIBCO BRL) konstruiert.
(2) Screenen der Aspergillus oryzae cDNA-Bibliothek
Die Klonierung der cDNA, die dem Aspergillus oryzae pepE homolog war, wurde durch 5'-RACE durchgeführt, wobei die Oligonucleotide der SEQ ID NRn: 12 und 13 als Primer eingesetzt wurden, und es wurde auch 3'-RACE durchgeführt, wobei die Oligonucleotide der SEQ ID NRn: 14 und 15 eingesetzt wurden, wobei die PepE-Sequenz von Aspergillus nidulans, erhalten in Beispiel 2, berücksichtigt wurde.
(Primer für das 5'-Ende für die 5'-RACE)
CGT GGT ACC ATG GTC TAG AGT (SEQ ID NR: 12)
(Primer für das 3'-Ende für die 5'-RACE)
CAT GGG CCC AAT GGT TCC GC (SEQ ID NR: 13)
(Primer für das 5'-Ende für die 3'-RACE)
CCA GAT TCG TAA TGA CTC CCG (SEQ ID NR: 14)
(Primer für das 3'-Ende für die 3'-RACE)
CTA CTA CTA CTA GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC (SEQ ID NR: 15)
<Text ohne Sequenzliste>

SEQ ID NRn: 12 bis 15: PCR-Primer

Die PCR-Reaktion für die 5'-RACE wurde mit 35 Reaktionszyklen nach thermischer Denaturierung bei 95°C während 9 Minuten durchgeführt. Jeder Reaktionszyklus wurde 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 53°C und 1 Minute bei 72°C durchgeführt. Es wurden Aspergillus-oryzae-pepE-Fragmente von etwa 1.400 bp erhalten. Die PCR-Reaktion der 3'-RACE wurde mit 35 Reaktionszyklen nach der thermischen Denaturierung bei 95°C während 9 Minuten durchgeführt. Jeder Reaktionszyklus wurde 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und 1 Minute bei 72°C durchge führt. Es wurden Genfragmente von etwa 300 Basen analog zu Aspergillus oryzae pepE erhalten.
Die Nucleotidsequenz der Genfragmente wurde bestimmt, um zu untersuchen, ob sie die vollständige Sequenz enthielt, die zu derjenigen von pepE homolog war. Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz, die von dieser Nucleotidsequenz kodiert wird, sind in SEQ ID NR: 4 gezeigt, und die Aminosäuresequenz allein ist in SEQ ID NR: 5 gezeigt.
Der Stamm Escherichia coli DH5α, der mit einem Plasmid transformiert war, das durch Einführen der Gensequenz in das Plasmid pBluescript erhalten wurde, erhielt die interne Nummer AJ13858 und wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Ministry of Economy (derzeit Advanced Industrial Science and Technology, Chuo Nr. 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, 305-8566) am 19. März 2001 als FERM P-18265 hinterlegt. Am 11. März 2002 wurde dieser Stamm in eine internationale Hinterlegung als FERM BP-7951 überführt.
Beispiel 4: Expression von pepE in Aspergillus oryzae
(1) Präparation von transformierten Aspergillus oryzae
Die pepE-cDNA von Aspergillus oryzae, erhalten in Beispiel 3, wurde an die SmaI-Stelle von pBluescript ligiert, wobei das Plasmid pBSAopepE erhalten wurde. Die pepE-cDNA wurde mit Eco-RI und XbaI aus dem Plasmid geschnitten und dann stromabwärts des Glucoamylasepromotors in pUNG1-Vektor, der das niaD-Markergen enthielt (Lee, B. R. et al., Applied Microbiology Biotechnology, 44, 425–431 (1995)), eingefügt, wobei das Plasmid pNGAPE erhalten wurde, das für die Transformation eingesetzt wurde. Die Transformation wurde mit 10 μg der Plasmid-DNA durchgeführt.
Conidien von Aspergillus oryzae niaD300 wurden in DPY-Kulturmedium eingeimpft. Nach dem Schütteln der Kultur bei 30°C während 24 Stunden wurde das Kulturgemisch durch ein sterilisiertes Tuch filtriert, wobei die Zellen erhalten wurden, die dann mit sterilisiertem Wasser gewaschen wurden. Die Zellen wurden in ein Teströhrchen gegeben. 20 ml einer Enzymlösung [1,0% Yatalase; (Takara Shuzo Co., Ltd.)] wurden zugegeben und 3 Stunden bei 30°C vorsichtig geschüttelt. Der Grad der Protoplastenbildung wurde unter einem Mikroskop überwacht, und dann wurden die Protoplasten in Eis gelagert.
Das Enzymreaktionsgemisch wurde durch Myracloth filtriert, um die Zellrückstände zu entfernen. Eine gleiche Menge des Puffers A (1,2 M Sorbitol, 50 mM CaCl₂, 35 mM NaCl und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) wurde zu dem Protoplasten-enthaltenden Filtrat gegeben, und dann wurde das erhaltene Gemisch in Eis gegeben. Nach der Zentrifugation des Gemisches bei 1.500 UpM bei 0°C während 5 Minuten wurde die Zentrifugation langsam gestoppt. Die Pellets wurden mit 10 ml Puffer A zweimal gewaschen und dann in 1 ml Puffer A suspendiert.
10 μl DNA-Lösung (10 μg) wurden zu 100 μl Protoplastensuspension gegeben, und das erhaltene Gemisch wurde 30 Minuten auf Eis gegeben. 250 μl Puffer B (60% PEG (Polyethylenglykol) 6000, 50 mM CaCl₂, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) wurden zu dem erhaltenen Gemisch gegeben. Nach leichtem Mischen wurden zusätzliche 250 μl Puffer B zugegeben, und das erhaltene Gemisch wurde vorsichtig gemischt. Dann wurden 850 μl Puffer B zu dem Gemisch gegeben, und das Gemisch wurde vorsichtig gemischt und 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurden 10 ml Puffer A zu dem Gemisch gegeben. Das Teströhrchen wurde umgedreht. Nach der Zentrifugation bei 1.500 UpM bei 0°C während 5 Minuten wurden die Pellets in 500 μl Puffer A suspendiert.
Die so erhaltene Suspension wurde zu 5 ml Topagarmedium gegeben, das vorher portioniert und vorgewärmt und über Czapek Doxmedium (1,2 M Sorbitol, 0,3% Natriumnitrat, 0,2% Kaliumchlorid, 0,1% Kaliumphosphat, 0,05 Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,002 Eisensulfatheptahydrat und 2% Glucose, pH 5,5) überschichtet, und dann wurde bei 30°C kultiviert. 10 Stämme der gewachsenen Zellen wurden auf das Czapek Doxmedium geimpft, wobei stabile Transformanten erhalten wurden.
(2) Produktion von pepE
Die vorstehend erhaltenen Transformanten wurden mit Weizenkleie kultiviert, und die Aminopeptidaseaktivität des daraus erhaltenen Extrakts wurde bestimmt.
20 g Weizenkleie, 0,3 g Kaliumphosphat und 14 ml destilliertes Wasser wurden sorgfältig zusammen gerührt. Das erhaltene Gemisch wurde in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben und 30 Minuten bei 120°C autoklaviert, um ein Medium herzustellen. 8 ml sterilisiertes Wasser wurden in eine Petri-Schale gegeben, wobei zahlreiche Sporen gebildet wurden, die dann zusammen gerührt wurden, wobei eine Sporensuspension erhalten wurde. Die Sporensuspension wurde auf das Medium gesprüht. Das Medium, auf das die Sporen geimpft wurden, wurde sorgfältig gerührt. Nach dem Kultivieren bei 30°C während 3 Tagen wurden 10 Teile destilliertes Wasser zu 1 Teil Weizenkleie, hergestellt wie vorstehend beschrieben, gegeben, und es wurde mit einem Homogenisator während 5 Minuten extrahiert, wobei ein Rohenzymextrakt erhalten wurde.
Die Aminopeptidaseaktivität des Rohenzymextrakts, hergestellt wie vorstehend beschrieben, wurde wie folgt bestimmt: 0,02 ml des Rohenzymextrakts und 0,015 ml 100 mM Zinkchlorid wurden zu 0,75 ml 1 mM Leu-pNA (50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5) gegeben, und es wurde eine Reaktion 10 Minuten bei 37°C durchgeführt. 0,25 ml 40% Essigsäure wurden zu dem Reaktionsgemisch gegeben, um die Reaktion zu beenden. Die Absorption des Reaktionsgemisches bei 405 nm wurde gemessen, um die Aktivität zu bestimmen. 1 Einheit (U) der enzymatischen Aktivität wurde als die Aktivität bestimmt, die 1 μmol p-Nitroanilid pro Minute bildet. Als Kontrolle wurde ein Rohenzymextrakt aus einer Transformante hergestellt, die durch Transformation mit Vektor-DNA erhalten wurde, die nur das Markergen enthielt, und die Aminopeptidaseaktivität wurde auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben bestimmt.
Es wurde eine deutliche Erhöhung der Aminopeptidaseaktivität mit dem Stamm erkannt, in den das erfindungsgemäße Gen eingeführt worden war (Tabelle 2). Somit wurde bestätigt, dass das eingeführte Aminopeptidasegen tatsächlich exprimiert wurde und die Aminopeptidase hergestellt wurde.
Tabelle 2 Aminopeptidaseaktivität in Rohenzymextrakt
Beispiel 5: Charakterisierung von PepE
(1) Reinigung von pepE
20 g Weizenkleiemedium wurden in einen 300 ml Kolben gegeben und dann bei 120°C während 20 Minuten autoklaviert, wobei ein Medium hergestellt wurde.
Die Sporensuspension wurde mit der Transformanten hergestellt, welche das in Beispiel 4 hergestellte PepE stark exprimierte. Die Suspension wurde in das Medium geimpft, sorgfältig gemischt und bei 30°C während 5 Tagen kultiviert. Während der Kultivierung wurde 48 Stunden nach dem Beginn der Kultivierung das Medium gerührt.
1 Teil (Gew./Gew.) der so erhaltenen Weizenkleie wurde in ein Gemisch von 10 Teilen (Gew./Gew.) 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4), 1 mM EDTA und 1 mM PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid) getaucht. Nach dem Stehenlassen des erhaltenen Gemisches bei 4°C während 16 Stunden wurde das Reaktionsgemisch durch ein Tuch filtriert und dann zentrifugiert (7.500 UpM, 4°C, 10 Minuten), wobei eine Überstandsflüssigkeit erhalten wurde, die als Rohenzymextrakt eingesetzt wurde.
Ammoniumsulfat wurde zu dem Rohenzymextrakt gegeben, wobei 40%–60% Ammoniumsulfat-Fällungsfraktion erhalten wurde. Der Niederschlag wurde in 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde durch ein Filter mit einem Porendurchmesser von 0,45 um filtriert. Das Filtrat wurde auf eine Entsalzungssäule aufgetragen [HiTrap Desalting von Amersham Pharmacia (25 ml)], die vorher mit 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) und 150 mM NaCl äquilibriert worden war, und dann mit demselben Puffer eluiert. Die erhaltene aktive Fraktion wurde durch Ultrafiltration konzentriert.
Die so erhaltene Probe wurde an eine Anionenaustauschersäule [HiTrap Q-Sepharose HP von Amersham Pharmacia (25 ml)] adsorbiert, die vorher mit 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) äquilibriert worden war, und dann wurde mit demselben Puffer in einer Menge von 3 Volumina des Säulenvolumens gewaschen. Nach dem Waschen wurde die aktive Fraktion durch lineares Erhöhen der NaCl-Konzentration des Puffers von 0 M auf 1 M in 20 Volumina des Säulenvolumens eluiert, um die Elution durchzuführen.
Die aktive Fraktion, die in den Ausfluss gewonnen wurde, wurde durch Ultrafiltration konzentriert.
Die erhaltene Probe wurde durch Gelfiltrationschromatografie mit HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (Amersham Pharmacia) fraktioniert. Die Probe wurde auf eine Säule aufgetragen, die vorher mit 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) und 150 mM NaCl äquilibriert worden war, und die aktive Fraktion wurde durch Elution mit demselben Puffer gewonnen. Somit wurde gereinigtes PepE nach diesen Verfahren erhalten.
(2) Bestimmung der PepE-Aktivität
Die Aminopeptidaseaktivität des Enzymextrakts wurde wie folgt bestimmt. 0,02 ml des Rohenzymextrakts wurden zu 0,73 ml einer Substratlösung gegeben (1 mM Leu-pNA, 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,5), 2 mM Cobaltchlorid). Nach dem Durchführen der Reaktion bei 37°C während 10 Minuten wurden 0,25 ml 40% Essigsäure zu dem Reaktionsgemisch gegeben, um die Reaktion zu beenden. Die Absorption der Reaktionslösung bei 405 nm wurde bestimmt, und die Aktivität wurde berechnet. Eine enzymatische Aktivität zum Bilden von 1 μmol p-Nitroanilid pro Minute wurde als 1 Einheit definiert.
Die enzymatischen Eigenschaften dieses Enzyms sind wie folgt:
(i) Substratspezifität
Die Hydrolyseaktivitäten für verschiedene X-pNA wurden durch das vorstehend bestimmte Verfahren zum Bestimmen der Aktivität bestimmt, außer dass Leu-pNA durch X-pNA ersetzt wurde. Die erhaltenen relativen Aktivitäten, bezogen auf die Aktivität für Leu-pNA als 100, sind in der nachstehenden Tabelle 3 gezeigt. Es zeigte sich, dass dieses Enzym die Peptide mit Leu an deren N-Terminus effizient hydrolysierte.
Tabelle 3 Substratspezifität von PepE
(ii) Temperaturoptimum
Die LAP-Aktivität wurde bei verschiedenen Temperaturen durch das vorstehend beschriebene Verfahren zur Bestimmung der Aktivität bestimmt. Die erhaltenen relativen Aktivitäten, bezogen auf die Aktivität bei 37°C als 100, sind in 1 gezeigt.
(iii) Wirkungen der Natriumchloridkonzentration in der Reaktionslösung
Die LAP-Aktivität, erhalten durch Zugeben verschiedener Konzentrationen an NaCl, wurde durch das vorstehend beschriebene Verfahren zur Bestimmung der Aktivität bestimmt. Die relativen Aktivitäten, bezogen auf die Aktivität in Abwesenheit von NaCl als 100, sind in 2 gezeigt. Es zeigte sich, dass das Enzym seine Aktivität beibehalten kann, selbst wenn hohe Konzentrationen an Natriumchlorid vorhanden waren.
(iv) pH-Optimum
Die vorstehend beschriebene Bestimmung der Aktivität wurde wiederholt, außer dass 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) durch einen Puffer mit einem anderen pH-Wert ersetzt wurde, sodass die Endkonzentration 50 mM war. Die LAP-Aktivität in Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) wurde als 100 definiert. Die Aktivität bei jedem pH-Wert ist in 3 gezeigt.
(v) pH-Stabilität
Das gereinigte Enzym wurde in 50 mM Puffer mit verschiedenen pH-Werten bei 0°C während 24 Stunden gehalten, und dann wurde die LAP-Aktivität durch das vorstehend beschriebene Aktivitätsbestimmungsverfahren (pH 7,5) bestimmt. Die relativen Aktivitäten, bestimmt auf der Basis der Aktivität (100) nach dem Lagern in Phosphatpuffer bei pH 7,5, sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4: pH-Stabilität von PepE
(vi) Stabilität in Natriumchloridlösung
Das gereinigte Enzym wurde in 0–4 M NaCl, 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) bei 0°C während 24 Stunden gehalten, und dann wurde die Aktivität in dem Reaktionsgemisch mit einer Salzkonzentration, die der Salzkonzentration beim Lagern identisch war, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5: Stabilität von PepE in Natriumchloridlösung
(vii) Wirkung von Metallionen
Die Hydrolyseaktivität für verschiedene X-pNA wurde durch das vorstehend beschriebene Aktivitätsbestimmungsverfahren bestimmt, außer dass Cobaltchlorid durch verschiedene zweiwertige Metallionen ersetzt wurde. Die relative Aktivität ist in Tabelle 6 gezeigt, worin die Hydrolyseaktivität von Leu-pNA in Anwesenheit von Cobaltchlorid als 100 definiert ist.
Tabelle 6: Wirkung von Metallionen auf die PepE-Aktivität
Die vorliegende Erfindung stellt Mittel bereit, um ein Proteinhydrolysat mit einem hohen Anteil an freien Aminosäuren und einer starken Würzeigenschaft zu erhalten. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine Aminopeptidase bereit, welche Peptide bei der Produktion von Sojasoße mit einem hohen Gehalt an Natriumchlorid durch Fermentation effizient hydrolysieren kann. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung eine Nucleinsäure bereit, die dieses Enzym kodiert. Durch die vorliegende Erfindung kann die Würzeigenschaft von Sojasoße oder Proteinhydrolysaten weiter verbessert werden.
Die Wirtszellen, welche das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül in einer Form enthalten, welche die Expression des Nuc leinsäuremoleküls erlaubt, sind für die Produktion des erfindungsgemäßen Proteins geeignet.
SEQUENZLISTE

Claims

Protein aus einem Kojipilz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (A) einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 519 in der SEQ ID NR: 3 des Sequenzprotokolls, (B) einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 510 in der SEQ ID NR: 5 des Sequenzprotokolls, (C) einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 519 in der SEQ ID NR: 3, wobei eine bis 170 Aminosäuren substituiert, deletiert, inseriert, addiert oder invertiert in der Sequenz der SEQ ID NR: 3 ist und das Protein die Fähigkeit zum Katalysieren der Reaktion der Freisetzung einer Aminosäure an einem N-Terminus eines Peptids hat, (D) einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 510 in der SEQ ID NR: 5, wobei in der Sequenz der SEQ ID NR: 5 eine bis 170 Aminosäuren substituiert, deletiert, inseriert, addiert oder invertiert sind und das Protein die Fähigkeit zum Katalysieren Reaktion der Freisetzung einer Aminosäure am N-Terminus eines Peptids hat.
Nucleinsäuremolekül, das für ein Protein aus einem Kojipilz codiert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (A) einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 519 in der SEQ ID NR: 3 des Sequenzprotokolls, (B) einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 510 in der SEQ ID NR: 5 des Sequenzprotokolls, (C) einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 519 in der SEQ ID NR: 3, wobei eine bis 170 Aminosäuren substituiert, deletiert, inseriert, addiert oder invertiert in der Sequenz der SEQ ID NR: 3 ist und das Protein die Fähigkeit zum Katalysieren der Reaktion der Freisetzung einer Aminosäure an einem N-Terminus eines Peptids hat, (D) einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 510 in der SEQ ID NR: 5, wobei in der Sequenz der SEQ ID NR: 5 eine bis 170 Aminosäuren substituiert, deletiert, inseriert, addiert oder invertiert sind und das Protein die Fähigkeit zum Katalysieren Reaktion der Freisetzung einer Aminosäure am N-Terminus eines Peptids hat.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 2, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (a) einer DNA mit einer Nucleotidsequenz der Nucleotide Nr. 72 bis 1628 in der Nucleotidsequenz in SEQ ID NR: 2, (b) einer DNA mit einer Nucleotidsequenz der Nucleotide Nr. 73 bis 1602 in der Nucleotidsequenz in SEQ ID NR: 4, (c) einer DNA, die mit der in (a) definierten DNA unter stringenten Bedingungen hybridisiert und für ein Protein codiert, das die Fähigkeit zum Katalysieren der Reaktion der Freisetzung einer Aminosäure vom N-Terminus eines Peptids hat, und (d) einer DNA, die mit (b) definierter DNA unter stringenten Bedingungen hybridisiert und für ein Protein codiert, das die Fähigkeit zum Katalysieren der Reaktion der Freisetzung einer Aminosäure von dem N-Terminus eines Peptids hat.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3 mit der Nucleotidsequenz der SEQ ID NR: 2 oder 4.
Rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das die Nucleinsäuren gemäß Anspruch 2 enthält.
Transformierter Wirtsmikroorganismus, der das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 2 in einer Form enthält, die exprimiert werden kann.
Transformierter Wirtsmikroorganismus nach Anspruch 6, der ein filamentöser Pilz, Hefe oder ein Escherichiabacterium ist.
Verfahren zum Produzieren einer Aminopeptidase, welches die Stufen umfaßt, bei denen der transformierte Wirtsmikroor ganismus nach Anspruch 7 kultiviert wird, um Nucleinsäuremoleküle, die in dem transformierten Wirtsmikroorganismus eingeführt sind, zu exprimieren und das produzierte Protein zu gewinnen.
Aminopeptidase aus einem Kojipilz nach Anspruch 1 mit den folgenden Eigenschaften 1) bis 8): 1) Hydrolysieren eines Peptids oder Proteins mit Leucin oder Methionin am N-Terminus unter Freisetzung von Leucin oder Methionin; 2) pH-Optimum bei 7,0 bis 7,5; 3) Temperaturoptimum bei 37°C bis 45°C; 4) verbleibende Aktivität von mindestens 80% selbst bei einer Natriumchloridkonzentration von 3 M, wobei die Aktivität in Abwesenheit von Natriumchlorid als 100% definiert ist; 5) verbleibende Aktivität von mindestens 80% nach Lagerung in Anwesenheit von 3 M Natriumchlorid bei 0°C während 24 Stunden, wobei die Aktivität nach der Lagerung in Abwesenheit von Natriumchlorid bei 0°C während 24 Stunden als 100% definiert ist; 6) verbleibende Aktivität von mindestens 60% nach Lagerung bei pH 5,8 bis 9,5 bei 0°C während 24 Stunden, wobei die Aktivität nach Lagerung bei pH 7,5 bei 0°C während 24 Stunden als 100% definiert ist; 7) Molekulargewicht von 550 kD auf einem nichtdenaturierenden Polyacrylamidgel und ein Molekulargewicht von 22 oder 33 kD auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel; und 8) benötigt für die Aktivierung Cobaltionen oder Zinkionen.