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DE602005004420T2 - Verfahren zur bestimmung der wirksamkeit, der spezifität und der giftigkeit der blutbildenden prostaglandin-d2-synthase - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der wirksamkeit, der spezifität und der giftigkeit der blutbildenden prostaglandin-d2-synthase Download PDF

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DE602005004420T2
DE602005004420T2 DE602005004420T DE602005004420T DE602005004420T2 DE 602005004420 T2 DE602005004420 T2 DE 602005004420T2 DE 602005004420 T DE602005004420 T DE 602005004420T DE 602005004420 T DE602005004420 T DE 602005004420T DE 602005004420 T2 DE602005004420 T2 DE 602005004420T2
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Aventis Pharmaceuticals Inc
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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues und wertvolles Verfahren zur Untersuchung von Verbindungen und Mitteln auf ihre Fähigkeit zum Vermindern bzw. Inhibieren der Aktivität der hämatopoetischen Prostaglandin-D2-Synthase (hPGDS). Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Assays zum Messen der Wirksamkeit, der Spezifität und der Toxizität von hPGDS-Inhibitoren.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Bei den Prostaglandinen handelt es sich um eine Klasse von Eicosanoiden mit verschiedenen biologischen Wirkungen. Es wurde gezeigt, daß Prostaglandine pharmakologische Wirkungen auf das Herz-Kreislauf-System und die Thrombozytenaggregation, Wirkungen auf die glatte Muskulatur, wodurch das Magen-Darm-System, die Nierenfunktion und die Harnbildung beeinflußt werden, Wirkungen auf das zentrale Nervensystem, das Endocrinsystem und Wirkungen auf den Stoffwechsel haben und eine kritische Rolle bei Entzündungs- und Immunreaktionen spielen. Prostaglandine sind somit potentiell von breitem therapeutischem Nutzen. Prostaglandine werden aus Arachidonsäure synthetisiert und weisen einen fünfgliedrigen Ring von Kohlenstoffatomen auf, der einen Teil der Arachidonsäurekette gebildet hatte. Typischerweise wirken Prostaglandine lokal, d. h. in der Nähe des Orts ihrer Synthese.
  • Bei Prostaglandin D2 (PGD2) handelt es sich um das von aktivierten Mastzellen als Reaktion auf eine Antigen-Herausforderung produzierte Hauptprostanoid, das ein wichtiger Vermittler von allergischen Atemwegserkrankungen ist. Insbesondere bewirkt es unter anderem eine Bronchokonstriktion, eine bronchiale Hyperreaktivität, eine Verstopfung der Nase und eine Infiltration von eosinophilen Zellen und TH2-Zellen. Es wird außerdem angenommen, daß aus antigenstimulierten Mastzellen und basophilen Zellen freigesetztes PGD2 eine unmittelbare Hypersensibilität, eine Atemwegsentzündung oder eine Remodellierung bei Asthma herbeiführt.
  • Das Enzym Prostaglandin-D-Synthase (PGDS) katalysiert die Umwandlung von Prostaglandin H2 (PGH2) in PGD2. Es sind zwei Typen von PGD2-Synthasen bekannt. Bei der ersten handelt es sich um einen Lipocalintyp (L-PGDS), der sich hauptsächlich im zentralen Nervensystem findet, und beim zweiten handelt es sich um eine hämatopoetische PGDS (hPGDS), die sich vorwiegend in peripheren Geweben findet. L-PGDS ist glutathion-(GSH-)unabhängig, während hPGDS GSH-abhängig ist. Weiterhin gibt es nur eine sehr geringe strukturelle Homologie zwischen L-PGDS und hPGDS.
  • Da PGD2 eine wichtige Rolle bei Entzündungen spielt, wurden Anstrengungen unternommen, Assays zu entwickeln, mit denen sich Verbindungen daraufhin untersuchen lassen, ob sie ihre Produktion hemmen können. Inhibitoren der PGD2-Synthese können sich insbesondere bei der Behandlung von allergischer Rhinitis, Asthma und möglicherweise chronischer obstruktiver Atemwegserkrankung („Chronic Obstructive Pulmonary Disease", COPD) von Nutzen erweisen. Die therapeutische Anwendung kann sich außerdem auf die Behandlung von Multipler Sklerose, Alzheimer-Krankheit und von Ischämie-Reperfusionsverletzung herrührenden Erkrankungen, Gehirntumoren und therapeutischen Anwendungen in durch Prostaglandine modulierten biologischen Prozessen erstrecken.
  • Zur Quantifizierung der Produktion von PGD2 zum Bestimmen der Fähigkeit einer Verbindung bzw. eines Mittels zum Vermindern, Inhibieren, Verstärken oder Modulieren der Produktion von PGD2 werden Verfahren wie die Hochdruckflüssigchromatographie („High Pressure Liquid Chromatography", HPLC), Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA), die auch als Enzymimmunassays (EIA) bekannt sind, oder Radioimmunassays (RIA) angewendet.
  • In der Vergangenheit wurden die Untersuchungen der Wirksamkeit, der Spezifität und der Toxizität nach verschiedenen experimentellen Paradigmen getrennt. Außerdem waren Spezifitätsbestimmungen in biochemischen Assays, die in vielen Fällen die in Zellen vorliegenden komplexen biologischen Bedingungen nicht nachahmen können, leichter durchführbar. Es ist somit wünschenswert, einen auf Zellen basierenden Assay zu entwerfen, bei dem die Wirksamkeit, die Spezifität und die Toxizität von PGDS-Modulatoren aus der gleichen experimentellen Probe gemessen wird. Bei einem solchen Design würden die Schritte, die normalerweise eine zweite Untersuchung erfordern würden, verkürzt werden, und es würden Informationen gewonnen werden, die relevanter für die Zellbedingungen in vivo sind.
  • KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen Einzelassay auf Zellbasis zur gleichzeitigen Untersuchung der Wirksamkeit, der Spezifität und der Zytotoxizität für hPGDS-Modulatoren bereit. Verbindungen, die die Aktivität von hPGDS modulieren, stellen neue therapeutische Ansätze für die Behandlung von Entzündungen und die pharmakologische Manipulation von Immunreaktionen bereit. Das Assaydesign eignet sich für die Verwendung in einer beliebigen Säugetier-Zellinie, in der hPGD2 exprimiert wird, wie z. B. Mastzellen, antigenpräsentierende Zellen, Megakaryozyten und Th2-Lymphozyten. Bei der vorliegenden Erfindung werden die Säugetierzellen mit einem stimulierenden Molekül behandelt, das die Freisetzung von Arachidonsäure verstärkt. Moleküle, die für die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen werden, sind Calciumionophore wie A23187, Ionomycin, Phorbolester, Wachstumsfaktoren, Zytokine, Tumorpromotoren oder calciumkanalmobilisierende Moleküle wie BAY K-8644. Bei einer besonderen Ausführungsform kann den Zellen direkt Arachidonsäure zugesetzt werden.
  • Für die Untersuchung von Verbindungen, die hPGDS modulieren, verwendete Zellen werden mit der Testverbindung und einem stimulierenden Molekül zur Induktion der Freisetzung von Arachidonsäure behandelt. Die PGD2-Produktionskonzentrationen werden in Gegenwart von Testverbindung gemessen und mit den PGD2-Konzentrationen ohne Vorbehandlung mit Testverbindung verglichen. Zusätzlich zur Messung der Wirksamkeit einer Testverbindung stellt die vorliegende Erfindung Messungen auf Spezifität und Zytotoxizität bereit, alle im gleichen Assaysystem auf Zellbasis. Dies ist so konstruiert, daß man einen zweiten, für PGE2 abgelesenen Wert bewertet. Inhibiert eine Testverbindung zum Beispiel spezifisch die hPGDS-Aktivität, so wird sie einen IC50-Wert für PGD2 haben, der signifikant niedriger ist als der für PGE2. Im Gegensatz dazu wird, wenn die Testverbindung nichtspezifisch oder zytotoxisch ist, sie für PGD2 und PGE2 ähnliche IC50-Werte liefern. Durch zusätzliche Zytotoxizitätstests läßt sich bestimmen, ob diese Werte auf die Toxizität der Testverbindung oder auf eine nichtspezifische Inhibierung der Prostanoidsynthese zurückzuführen sind.
  • Die folgende ausführliche Beschreibung zusammen mit den beigefügten Abbildungen ermöglicht ein besseres Verständnis der obigen Aspekte und anderer Aspekte, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die Ergebnisse des Assays auf Zellbasis, der zwischen spezifischen und nichtspezifischen PGD2- Inhibitoren unterscheidet. Die Verbindung A000050350 inhibiert in RBL-Zellen spezifisch die PGD2-Produktion, während die Verbindung A000127348 sowohl die PGD2- als auch die PGE2-Produktion in RBL-Zellen nichtspezifisch inhibiert.
  • 2 ist eine graphische Darstellung der Bewertung der Zytotoxizität durch Messung der Zellproliferation von mit mehreren Konzentrationen von PGDS-Testverbindungen behandelten basophilen Ratten-Leukämiezellen (Rat Basophilic Leukemia Cells, RBL-Zellen) unter Verwendung des CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Assay auf Zellbasis zum Screening von Verbindungen, die die hämatopoetische PGD2-Synthase (hPGDS) inhibieren. Mit dem Assay werden die Wirksamkeit, die Spezifität und die Toxizität von Testverbindungen in lebenden Zellen bestimmt. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Identifizierung von Inhibitorverbindungen, die als Arzneimittel zur Behandlung vieler entzündlicher Krankheiten einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Asthma, allergischer Rhinitis, COPD, Multipler Sklerose, Alzheimer-Krankheit und anderen von Ischämie-Reperfusionsverletzung herrührenden Erkrankungen verwendet werden können.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein einen Assay auf Zellbasis, der zum Messen der Wirksamkeit, Spezifität und Toxizität von Testverbindungen, die die hPGDS-Aktivität in einem Assay auf Einzelzellbasis modulieren, verwendet wird. Die Messungen lassen sich schnell durchführen, wobei sich der Maßstab vergrößern läßt, so daß viele verschiedene Verbindungen gleichzeitig getestet werden können.
  • Hinsichtlich der Verbindungen, die untersucht werden können, gibt es keine besonderen Einschränkungen. Beispiele schließen chemische Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht, Bibliotheken synthetischer niedermolekularer Verbindungen, aufgereinigte Proteine, Expressionsprodukte von Genbibliotheken, Bibliotheken synthetischer Peptide, Zellextrakte und Kulturüberstände ein.
  • Bei der vorliegenden Erfindung kann man eine beliebige Säugetier-Zellinie verwenden, solange die Säugetier-Zellinie hPGDS exprimiert. Beispiele schließen Mastzellen, antigenpräsentierende Zellen, Megakaryozyten und TH2-Lymphozyten ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Darüber hinaus kann man Säugetier-Zellinien wie basophile Leukämiezellen der Ratte (Rat Basophilic Leukemia, RBL) verwenden. Primäre Mastzellen verschiedener Spezies wie des Menschen und der Maus oder T-Zellen-Subtypen von verschiedenen Spezies sind weitere Beispiele. Für die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen werden auch Zellen, die so manipuliert wurden, daß sie hPGDS oder modifiziertes hPGDS exprimieren oder überexprimieren.
  • Die gewählten Säugetierzellen werden mit einem stimulierenden Molekül behandelt, das die Freisetzung von Arachidonsäure verstärkt. Für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogene Moleküle sind Calciumionophoren wie A23187, Ionomycin, Phorbolester, Wachstumsfaktoren, Zytokine, Tumorpromotoren und calciumkanalmobilisierende Moleküle wie BAY K-8644. Bei einer anderen besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann man die gewählten Säugetierzellen direkt mit Arachidonsäure versetzen.
  • Zum Messen der Wirksamkeit werden bei der vorliegenden Erfindung werden Zellen mit einer Testverbindung behandelt, gefolgt von der Zugabe eines stimulierenden Moleküls zur Verstärkung der Freisetzung von Arachidonsäure. Die Konzentrationen an PGD2-Produktion werden in mit dem stimulierenden Molekül und verschiedenen Konzentrationen an Testverbindungen behandelten Zellen gemessen. Diese Konzentrationen werden mit den Konzentrationen von PGD2, die in mit dem Stimulus behandelten, jedoch nicht der Testverbindung ausgesetzten Zellen erhalten wurden, verglichen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem mit dem gleichen Assay auf Zellbasis die Möglichkeit bereit, die Spezifität und die Zytotoxizität zu messen. Dies ist so konstruiert, daß man einen zweiten Wert der Prostanoidproduktion, zum Beispiel die Konzentration an PGE2, im Zellenüberstand abliest. Inhibiert eine Testverbindung spezifisch die hPGDS-Aktivität, so wird sie einen IC50-Wert für PGD2 liefern, der signifikant niedriger ist als der für PGE2. Im Gegensatz dazu wird, wenn die Testverbindung nichtspezifisch oder zytotoxisch ist, sie ähnliche IC50-Werte sowohl für PGD2 als auch für PGE2 liefern. Um zu bestimmen, ob die nichtspezifische Inhibierung auf die Toxizität der Testverbindung zurückzuführen ist, kann man anschließend einen zusätzlichen Zytotoxizitätsassay unter Verwendung der gleichen Proben wie in dem Assay auf Zellbasis oder getrennt unter den gleichen Bedingungen wie in dem oben beschriebenen Assay auf Zellbasis durchführen. Findet man eine Inhibierung der Zellproliferation, so wird dies als Maß für die Off-Target-Aktivität der getesteten Verbindung angesehen.
  • Zytotoxizitätsassays, die in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen können, schließen Assays wie MTS-, MTT- und LDH-Assays, die alle zum Beispiel von Promega kommerziell erhältlich sind, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Die Fähigkeit einer Verbindung zur Modulierung der Konzentration von PGD2 wird nicht nur durch das Durchführen von Messungen in Gegenwart und Abwesenheit der Inhibitorverbindung sondern auch bei verschiedenen Konzentrationen davon bestimmt. Indem man Messungen bei verschiedenen Verbindungskonzentrationen durchführt, ist es möglich, bestimmte Merkmale wie den IC50-Wert zu bestimmen. Der IC50-Wert ist definiert als die Konzentration, bei der die Verbindung eine 50%ige Inhibierung bewirkt. Umgekehrt kann der Assay der vorliegenden Erfindung leicht auf die Untersuchung von Verbindungen, die die PGD2-Produktion stimulieren, angepaßt werden, indem man eine unter der Schwelle liegende Menge an stimulierendem Molekül bzw. nichtstimulierendem Molekül verwendet.
  • Es versteht sich außerdem, daß der Assay der vorliegenden Erfindung auch als Einzelpunktassay durchgeführt werden kann, bei dem die inhibierende Wirkung einer Verbindung auf die PGD2- und PGE2-Produktion mit nur einer Konzentration an Testverbindung bewertet wird. Sowohl das Einzelpunkt-Screening als auch die IC50-Bestimmungen eignen sich für ein Screening mit hohem Durchsatz. Screeningsysteme mit hohem Durchsatz sind im Handel erhältlich (siehe z. B. Zymark Corp., Hopkington, Mass., USA; Air Technical Industries, Mentor, Ohio, USA; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, Calif., USA; Precision Systems, Inc., Natick, Mass., USA, usw.). Bei diesen Systemen werden typischerweise ganze Vorschriften automatisiert, einschließlich aller Proben- und Reagens-Pipettierschritte, dem Zufügen von Flüssigkeiten, zeitlich bemessenen Inkubationen und der abschließenden Bestimmung der Proben in für den Assay geeigneten Detektoren. Diese konfigurierbaren Systeme bieten einen hohen Durchsatz und ein schnelles Beginnen sowie ein hohes Ausmaß an Flexibilität und Anpaßbarkeit. Die Hersteller dieser Systeme stellen ausführliche Protokolle für die verschiedenen Assays mit hohem Durchsatz bereit.
  • Verfahren zum Messen der Konzentrationen von PGD2 und PGE2 sind im Stand der Technik gut bekannt. Beispiele schließen die Hochdruckflüssigchromatographie (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC), die massenspektrometriegekoppelte Gaschromatographie (Gas Chromatography Mass Spectrometry, GC-MS), den Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), der auch als Enzymimmunassay (Enzyme Immunoassay, EIA) bekannt ist, Radioimmunassays (RIAs) und die Fluoreszenzpolarisation (FP) ein. Bei der Messung der PGD2- und PGE2-Konzentrationen kann auch der Szintillationsproximitätsassay von Nutzen sein.
  • Der Umfang der vorliegenden Erfindung ist nicht durch die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen eingeschränkt. Dem Fachmann werden aus der obigen Beschreibung und den beigefügten Abbildungen zusätzlich zu den hier beschriebenen verschiedene Modifikationen der Erfindung offensichtlich sein. Solche Modifikationen sollen mit in den Schutzbereich der beigefügten Ansprüche fallen.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1: ZELLBEHANDLUNG MIT CALCIUMIONOPHOR UND INKUBATION MIT TEST- UND KONTROLLVERBINDUNGEN
  • In diesem Beispiel werden RBL-2H3-Zellen (die vom American Tissue Culture Center erhalten wurden) mit Trypsin (0,05% Trypsin-EDTA in zubereitetem MEM-Medium (Gibco 11095-080), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, L-Glutamin, Penicillin und Streptomycin behandelt, so daß man eine Einzelzellensuspension erhält. Die RBL-Zellen werden in Platten mit 96 Vertiefungen zu 2 × 104 Zellen/Vertiefung plattiert. Die Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert.
  • HBSS-Puffer (Gibco/Invitrogen 14025-092) wird mit DMSO (Sigma D-8779) entsprechend der höchsten in der Referenz oder Testverbindung enthaltenen Konzentration an DMSO verdünnt. Die Verbindungsplatte/n und die Referenzkontrolle werden aufgetaut und vor der Verwendung gut gemischt. Bei diesem Beispiel wurde der COX-1-Inhibitor SC560 als Referenz verwendet, bezogen von Cayman Chemical.
  • Die Verdünnungen von Testverbindung und der Referenz SC560 erfolgen mit einem Costar-(3960 oder Äquivalent)Assayblock gemäß der unten gezeigten EIA-Schablone. Die Vertiefungen in Spalte 1 (Leerwert, TA = Gesamtaktivität, NSB – nichtspezifische Bindung und Bo = Hintergrund) und die Spalten 2 & 3 werden nicht für Zellbehandlung verwendet, sondern mit Standards für den EIA-Assay gefüllt. Die Kontrollen 1, 2, 5 und 6 sind positive Kontrollen, die das Calciumionophor ohne Verbindung enthalten. Die Kontrollen 3, 4, 7 und 8 sind negative Kontrollen ohne Calciumionophor bzw. Verbindung.
  • Figure 00110001
  • Die Testverbindungen wurden wie folgt verdünnt: 1 ml HBSS (ohne DMSO) wird in die Assayblockvertiefungen A4-A10 gegeben [30 μM]. 620 μl HBSS w/0,3% DMSO werden in die Vertiefungen B4–B10 bis H4–H10 gegeben. 3 μl der Stammlösung der Verbindung [10 mM] werden zu 30-μM-Vertiefungen gegeben. Es wird gut gemischt. 310 μl aus Reihe A [30 μM] werden zu Reihe B [10 μM] gegeben. Es wird gut gemischt. Es wird weiter wie oben verdünnt, so daß man die folgenden Konzentrationen erhält [30, 10, 3,3, 1,1, 0,37, 0,12, 0,04 und 0,014 μM].
  • Die Referenz SC560 wurde wie folgt verdünnt: 1 ml HBSS (ohne DMSO) wird in Vertiefung A11 gegeben. 620 μl HBSS mit 0,3% DMSO werden in Vertiefungen B11–H11 gegeben. 3 μl vorverdünnte Stammlösung [1 mM in 100% DMSO] werden in Vertiefung A11 gegeben [3 μm]. Es wird gut gemischt. 310 μl aus Vertiefung A11 [3 μM] werden in Vertiefung B11 gegeben [1 μM]. Es wird gut gemischt. Es wird weiter wie oben verdünnt, so daß man die folgenden Konzentrationen [3 μM, 1 μM, 0,33 μM, 0,11 μM, 0,037 μM, 0,012 μM, 0,0041 μM und 0,0013 μM] erhält.
  • Ein automatisches Zellbehandlungssystem für die Zugabe von Calciumionophor (A23187 Sigma #C-7522) und Methoximatisierungsreagens (hergestellt nach den Anweisungen aus dem Cayman-Kit Nr. 512011) wurde unter Verwendung eines SciClone-Decks von Zymark entwickelt.
  • Das vorliegende automatisierte (A) Protokoll erfordert, daß eine Reihe von Schritten manuell (M) durchgeführt werden, wie unten umrissen.
  • (A) Entfernen des über Nacht verwendeten Mediums und 1× Waschen mit 200 μl HBSS-Puffer.
  • Entfernen des HBSS-Puffers von den Zellen und Ersetzen durch 200 μl/Vertiefung verdünnter Verbindungen und Kontrollen gemäß der Schablone. (M) Zellplatten bedecken und wieder auf 37°C bringen. 15 Minuten lang inkubieren. Zellplatten abdecken und wieder in das Deck bringen. (A) 10 μl der 20×-Konzentration zu den 200 μl-Zellbehandlungen einschließlich der Vertiefungen mit der positiven Kontrolle geben. Beachten, daß den Vertiefungen mit der negativen Kontrolle kein Calciumionophor zugesetzt wird. (M) Leere Spitzen-Boxen entfernen und durch 200-μl-Spitzen an den Deck-Stellen B2, B3 und B4 ersetzen. (M) Zellplatten bedecken und wieder auf 37°C bringen. 15 Minuten lang inkubieren. (M) Platten 5 Minuten lang bei 1000× U/min zentrifugieren. Zellplatten abdecken und zum Deck zurückbringen. (A) Die chemisch mit 25 μl MOX-Reagens (Verhältnis 1:1) gemäß PGD2-MOX-EIA-Kit (Cayman Nr. 512011 oder Äquivalent) zu methoximierenden 25-μl-Überstände sammeln. Siehe folgendes Beispiel. (M) Die MOX-Assayplatten bedecken und 30 Minuten lang bei 60°C inkubieren. (M) Für die PGE2-Analyse zu sammelnden Überstände zusätzliche Assayplatten in die Deck-Stellen D2, D3 und D4 geben. (A) 175 μl des auf PGE2 zu untersuchenden verbliebenen Überstands abnehmen. Die methoximierten (für PGD2) und nicht methoximierten (für PGE2) Überstände können bis zu 3 Monate lang bei –80°C aufbewahrt werden.
  • BEISPIEL 2: QUANTIFIZIERUNG DER PROSTAGLANDIN-D2-KONZENTRATIONEN: ENZYMIMMUNASSAY
  • Bei diesem Beispiel wurde die Konzentration von PGD2 mit einem Enzymimmunassay (EIA) gemessen. EIAs für die Messung von PGD2 sind im Handel erhältlich. Ein PGD2-EIA-Kit ist zum Beispiel von Cayman Chemical erhältlich.
  • Dieser Assay basiert auf der Konkurrenz von PGD2-Methoxim (MOX) und einem PGD2-MOX-Acetylcholinesterase-(AchE-)Konjugat (PGD2-MOX-Tracer) um eine begrenzte Anzahl von PGD2-MOX-spezifischen Kaninchen-Antiserum-Bindungsstellen. Da die Konzentration des PGD2-MOX- Tracers konstant gehalten wird, während die Konzentration an PGD2-MOX variiert, ist die Menge an PGD2-MOX-Tracer, die sich an das Kaninchen-Antiserum binden kann, umgekehrt proportional zur Konzentration von PGD2-MOX in der Vertiefung. Dieser Kaninchen-Antiserum-PGD2-MOX-Komplex bindet sich an das monoklonale Maus-Anti-Kaninchen-IgG, das zuvor in der Vertiefung angebunden wurde. Nach dem Waschen der Platte wird Ellmans Reagens (das das Substrat für AchE enthält) in die Vertiefung gegeben. Das enzymatische Produkt hat eine ausgeprägte gelbe Farbe, die bei 412 nm stark absorbiert. Die Intensität dieser Farbe ist proportional zur an die Vertiefung gebundenen Menge an PGD2-MOX-Tracer, die umgekehrt proportional zur während der Inkubation in der Vertiefung vorhandenen Menge an freiem PGD2-MOX ist.
  • Die EIA und Waschpuffer wurden gemäß den kommerziellen Anweisungen durchgeführt. Die Proben wurden gemäß dem vorherigen Beispiel zubereitet. Da die Prostaglandin-Konzentrationen schwanken können, werden die Überstände mit EIA-Puffer verdünnt, so daß man Prostaglandin-Konzentrationen im linearen Bereich der Standardkurve erhält. Herkömmlicherweise verwendete PGD2-Verdünnungen sind 1:12,5.
  • Das Methyloximierungsreagens, der PGD2-MOX-Express-EIA-Standard, der PGD2-MOX-AchE-Express-Tracer, das PGD2-MOX-Express-Antiserum und die PGD2-MOX-Express-EIA-Methoximierungskontrolle wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Der Assay wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, und die Platten wurden bei einer Wellenlänge von 412 nm abgelesen.
  • Nach der Bestimmung der Prostaglandin-Konzentrationen in mit 8 Konzentrationen an Testverbindungen behandelten Zellen läßt sich der IC50-Wert der Verbindung erhalten, indem man eine halblogarithmische Auftragung der Prostaglandin-Konzentration gegen die Log-Skala der Verbindungskonzentration anfertigt. Dieser Assay kann auch als Einzelpunktassay durchgeführt werden, bei dem die Inhibierung der PGD2-Produktion durch eine Verbindung unter Verwendung von nur einer Konzentration der Verbindung durchgeführt wird.
  • BEISPIEL 3: QUANTIFIZIERUNG DER PROSTAGLANDIN-E2-KONZENTRATIONEN
  • In diesem Beispiel wurden die PGE2-Konzentrationen unter Verwendung eines Enzymimmunassays (EIA) gemessen. EIAs für die Messung von PGE2 sind im Handel erhältlich. Ein PGE2-EIA-Kit ist zum Beispiel von Assay Designs erhältlich. Für den PGE2-EIA wird ein für PGE2 spezifischer monoklonaler Mäuseantikörper verwendet. Das freie PGE2 in der Lösung konkurriert mit einer bekannten Menge an PGE2-Tracer um die Bindung einer bekannten Menge des Anti-PGE2-Antikörpers. Bei dem PGE2-Tracer handelt es sich um ein Konjugat von PGE2 und Acetylcholinesterase. Der Anti-PGE2-Antikörper wird dann mit einem Ziege-Anti-Maus-Ig-Antikörper fixiert. Der fixierte Antikörper wird dann mit Ellmans Reagens, das das Substrat für Acetylcholinesterase enthält, entwickelt. Das durch diese Reaktion erzeugte Produkt hat eine gelbe Farbe und absorbiert stark bei 412 nm. Liegt eine hohe Konzentration an PGE2 vor, so wird das PGE2 den Tracer verdrängen, und die so erhaltene Probe wird eine schwache Absorbanz bei 412 nm aufweisen. Umgekehrt wird bei einer niedrigen Konzentration an PGE2 der Tracer das PGE2 verdrängen, und die auf diese Weise erhaltene Probe wird eine starke Absorbanz bei 412 nm aufweisen. Bei der Durchführung dieses Assays wurde die Absorbanz bei 412 nm mit einem Standard von Absorbanzen bei bekannten Konzentrationen an PGE2 verglichen.
  • Dieser Assay läßt sich von einem Fachmann zum Beispiel unter Verwendung eines Zymark SciClone-Decks leicht in ein automatisiertes Format umwandeln.
  • BEISPIEL 4: QUANTIFIZIERUNG VON PGD2 UND PGE2 ZUR UNTERSCHEIDUNG SPEZIFISCHER UND NICHTSPEZIFISCHER VERBINDUNGEN
  • In diesem Beispiel wird gezeigt, wie sich die obigen PGD2- und PGE2-Assays auf Zellbasis zur Unterscheidung von spezifischen und nichtspezifischen Verbindungen einsetzen lassen. Wie in 1 gezeigt, hat die Verbindung A00050350 einen IC50-Wert von 2,65 μM bezüglich der PGD2-Inhibierung, zeigt jedoch keine Inhibierung von PGE2, was nahelegt, daß es sich bei A0050350 um einen wirksamen und spezifischen Inhibitor der PGD2-Synthese handelt. Im Gegensatz dazu zeigt die Verbindung A000127348 ähnliche IC50-Werte für PGD2 und PGE2 von 0,33 μM beziehungsweise 0,41 μM, was nahelegt, daß es sich bei A000127348 um eine nichtspezifische oder zytotoxische Verbindung handelt. Durch eine anschließend durchgeführte Zytotoxizitätsuntersuchung wurde bestätigt, daß die Verbindung A000127348 unter den Testbedingungen die Zellproliferation beeinträchtigt.
  • In diesem Beispiel wurden RBL-Zellen unter den gleichen Bedingungen wie in dem Assay auf Zellbasis, jedoch ohne Zusatz von A23187, 45 min mit den PGDS-Verbindungen behandelt. Die potentielle Zytotoxizität wurde mit dem CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega, Madison, WI, USA, Kat. -Nr. G3582) bestimmt. Der Assay wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
  • Acht Konzentrationen der jeweiligen Verbindung im Bereich von 0,01 μM bis 30 μM wurden auf Zytotoxizität untersucht. Die Testkonzentrationen betrugen 0,014 μM, 0,041 μM, 0,123 μM, 0,370 μM, 1,111 μM, 3,333 μM, 10 μM und 30 μM (siehe 2). Die Verbindung A000127348 und eine andere PGDS-Verbindung, A000123383, waren toxisch, was sich von einer Reihe nicht toxischer Testverbindungen, die in der gleichen Auftragung gezeigt sind, unterscheiden ließ. Als positive Kontrolle wurde Geneticin verwendet.
  • Schlussel zu den Figuren
  • Fig. 1
    Conc. Konz.
    Figure Figur
    Fig. 2
    Cell Proliferation in RBL cells Zellproliferation in RBL-Zellen
    Percent Positive Control Prozent Positive Kontrolle
    Compound Conc. (uM) Konz. Verbindung (uM)
    Figure Figur

Claims (7)

  1. In-vitro-Verfahren für die Untersuchung der Wirksamkeit, Spezifität und Toxizität von Hemmstoffen gegen die hämatopoetische Prostaglandin-D2-Synthase (hPGDS) in Säugetierzellen, bei dem man: i) die Säuretierzellen mit einem stimulierenden Molekül, das die Freisetzung von Arachidonsäure erhöht, in Kontakt bringt, ii) die Säugetierzelle mit einer Verbindung behandelt, iii) die Konzentration von Prostaglandin D2 (PGD2) in der Säugetierzelle oder im Überstand mißt, iv) die Konzentrationen von PGD2 in der Säugetierzelle mit den Konzentrationen von PGD2 in einer nicht mit der Verbindung behandelten Kontrollsäugetierzelle vergleicht, um die Wirksamkeit der Verbindung zu bestimmen, v) die Konzentration von Prostaglandin E2 (PGE2) in der Säugetierzelle mißt, vi) Die Konzentrationen von PGD2 mit den Konzentrationen von PGE2 in der Säugetierzelle vergleicht, wobei der Befund, daß die Konzentrationen an PGD2 niedriger sind als die Konzentrationen an PGE2, darauf hindeutet, daß die Verbindung eine hPGDS spezifisch hemmende Wirkung hat, vii) das Ausmaß der Zytotoxizität der mit der Verbindung behandelten Säugetierzellen und der Kontrollsäugetierzellen mißt und das Ausmaß der Zytotoxizität in den behandelten Säugetierzellen und den Kontrollsäugetierzellen vergleicht, wobei der Befund einer Zytotoxizität in mit Verbindung behandelten Zellen ein Hinweis auf eine Inhibierung der Zellproliferation ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Säugetierzelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mastzellen, antigenpräsentierenden Zellen, Megakaryozyten und TH2-Lymphozyten.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Säugetierzelle um eine basophile Leukämiezelle der Ratte (rat basophilic leukemia, RBL) handelt.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das stimulierende Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Calciumionophoren, Ionomycin, Phorbolestern, Wachstumsfaktoren, Zytokinen, Tumorpromotoren und calciumkanalmobilisierenden Molekülen.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem Calciumionophor um A23187 handelt.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem calciumkanalmobilisierenden Molekül um BAYK-8644 handelt.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem stimulierenden Molekül um Arachidonsäure handelt.
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