DE602005002562T2

DE602005002562T2 - Pyrrolylsubstituierte pyridoä2,3-düpyrimidin-7-one und derivate davon als therapeutische mittel

Info

Publication number: DE602005002562T2
Application number: DE602005002562T
Authority: DE
Inventors: Michelle M. Pfizer Globa Ann Arbor BRUENDL; Rocco D.. Pfizer Globa Ann Arbor GOGLIOTTI; A.P.. Pfizer Globa Ann Arbor GOODMAN; Gregory. Pfizer Globa Ann Arbor REICHARD
Original assignee: Warner Lambert Co LLC
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 2004-05-04
Filing date: 2005-04-22
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2025-04-23
Also published as: DE602005002562D1; EP1749004B1; US20080255162A1; ATE373659T1; EP1749004A1; MXPA06012829A; BRPI0510560A; WO2005105801A1; CA2563669A1; JP2007536370A; ES2292130T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Phosphoinositid-3-Kinasen (PI3Ks) sind eine Familie von Lipidkinasen, die Phosphoinositole am 3'-OH unter Erzeugung von PI-3-P (Phosphatidylinositol-3-phosphat), PI-3,4-P2 und PI-3,4,5-P3 phosphorylieren. Eine Klasse von PI3Ks wird durch Wachstumsfaktoren stimuliert. Eine getrennte Klasse von PI3Ks werden durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren aktiviert und umfassen PI3Kγ. Die Wachstumsfaktor-stimulierten PI3Ks (z.B. PI3Kα) sind bei der zellulären Proliferation und bei Krebs impliziert. Es wurde bewiesen, dass PI3Kγ in Signalkaskaden involviert ist. Beispielsweise wird PI3Kγ als Reaktion auf Liganden, z.B. C5a, fMLP, ADP und IL-8, aktiviert. Außerdem war PI3Kγ bei Immunantworten impliziert (Hirsch et al., Science 2000; 287:1049-1053). PI3Kγ-null-Makrophagen (Makrophagen ohne PI3Kγ) zeigen eine reduzierte chemotaktische Antwort und eine verringerte Fähigkeit, Entzündungen zu bekämpfen (Hirsch et al., 2000, supra). Darüber hinaus ist PI3Kγ auch bei thrombolytischen Erkrankungen impliziert (z.B. Thromboembolie, ischämische Erkrankungen, Herzattacken und Schlaganfall) (Hirsch et al., FASEB J. 2000; 15(11):2019-2021; und Hirsch et al., FASEB J., 9. Juli 2001; 10.1096/fj.00-0810fje (hierin zitiert als Hirsch et al., 2001).
PI3K-Inhibitoren finden für die Behandlung von Erkrankungen bei Menschen Beachtung (siehe z.B. WO 01/81346 ; WO 01/53266 und WO 01/83456 und WO 2004/007491 ). Es gibt einen Bedarf für weitere Verbindungen, die PI3Ks inhibieren können, zur Verwendung als pharmazeutische Mittel.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Nach einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Pyridopyrimidine der Formel I:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon bereit, wobei:
R⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
Methyl, Ethyl, CF₃, CH₂F, CHF₂ und CH₂OH;
R⁵ H oder Methyl ist;
J nicht vorhanden ist oder ein C₁-C₆-Alkylen ist;
R⁸ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: C₁-C₆-Alkyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heterocycloalkyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heteroaryl und Phenyl;
R⁶ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: H, Halogen, Phenyl und C₁-C₃-Alkyl;
R²
ist;
R¹⁰ C₁-C₆-Alkyl oder H ist;
R¹² C₁-C₆-Alkyl oder C₁-C₃-Alkylen-R¹³ ist,
R¹³ Pyridinyl oder Phenyl ist und
R¹⁴ C₁-C₆-Alkyl oder H ist.
In bestimmten Ausführungsformen der Formel I ist R⁴ Methyl, ist R⁵ H und ist R²:
In bestimmten Ausführungsformen von Formel II ist R¹² C₁-C₃-Alkylen-R¹³. In bestimmten Ausführungsformen von Formel II ist R⁸ ein C₁-C₆-Alkyl. Ein Beispiel für eine Verbindung der Formel II, worin R⁸ ein C₁-C₆-Alkyl ist, ist 4-(4,8-Dimethyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-(1-phenylethyl)-1H-pyrrol-2-carbonsäure. In anderen Ausführungsformen der Formel II ist R⁸ ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: C₃-C₈-Cycloalkyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heterocycloalkyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heteroaryl und Phenyl. Beispiele für eine Verbindung der Formel II, wobei R⁸ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: einem C₃-C₈-Cycloalkyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heterocycloalkyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heteroaryl und Phenyl, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf:
4-(8-Cyclopentyl-6-fluor-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-pyridin-3-ylmethyl-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester;
4-(8-Cyclopentyl-6-fluor-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-(1-Phenyl-ethyl)-1H-pyrrol-2-carbonsäure und
1-Benzyl-4-(8-cycloheptyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester.
In anderen Ausführungsformen der Formel II ist R¹² ein C₁-C₆-Alkyl und ist R⁸ ein C₁-C₆-Alkyl, ein C₃-C₈-Cycloalkyl, ein 5- oder 6-gliedriges Heterocycloalkyl, ein 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl oder ein Phenyl. Beispiele für solche Verbindungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf:
4-(6-Chlor-8-ethyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester;
4-[6-Brom-8-(2-methoxy-ethyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure und
4-(6-Chlor-8-ethyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure;
4-(8-Cyclohexyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure-methylester;
4-[6-Fluor-8-(4-methoxy-cyclohexyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester;
4-[6-Fluor-4-methyl-7-oxo-8-(tetrahydro-pyran-4-ylmethyl)-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester;
4-(8-Cyclopentyl-6-fluor-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure;
4-(8-Cyclopentyl-6-fluor-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester;
4-[8-(2-Cyclopropyl-ethyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester;
4-(8-Cyclobutyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester;
4-[6-Brom-8-(4-methoxy-benzyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure;
4-(8-Cyclopropyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester;
4-[6-Fluor-8-(4-methoxy-cyclohexyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure und
4-[8-Cyclohexyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
In bestimmten Ausführungsformen der Formel I ist R⁶ Methyl und ist R⁴ ein C₃-C₈-Cycloalkyl und ist R²:
In bestimmten Ausführungsformen der Formel III ist R⁸ ein C₁-C₆-Alkyl, ein C₃-C₈-Cycloalkyl, ein 5- oder 6-gliedriges Heterocycloalkyl, ein 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl oder ein Phenyl.
In bestimmten Ausführungsformen der Formeln I, II oder III ist R⁶ Halogen. In anderen Ausführungsformen der Formeln I, II oder III ist R⁶ H. In noch anderen Ausführungsformen der Formeln I, II oder III ist R⁶ Phenyl. In noch anderen Ausführungsformen der Formel I, II oder III ist R⁶ ein C₁-C₃-Alkyl.
Nach einem anderen Aspekt stellt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung einer der Formeln I–III und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen. In bestimmten Ausführungsformen sind diese Zusammensetzungen bei der Behandlung einer PI3K-vermittelten Erkrankung einsetzbar. Die Verbindungen der Erfindung können auch in einer pharmazeutischen Zusammensetzung kombiniert werden, die auch Verbindungen umfasst, die zur Behandlung von Krebs, einer thrombolytischen Erkrankung, einer Entzündungserkrankung, z.B. rheumatoide Arthritis, oder einer anderen PI3K-vermittelten Erkrankung, nützlich sind.
In bestimmten Ausführungsformen ist die PI3K-vermittelte Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus rheumatoider Arthritis, Spondylarthritis, Osteoarthritis, Psoriasisarthritis, Psoriasis, Entzündungserkrankungen und Autoimmunerkrankungen. In anderen Ausführungsformen ist die PI3K-vermittelte Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus kardiovaskulären Erkrankungen, Atherosklerose, Hypertonie, Thrombose der tiefen Venen, Schlaganfall, Myokardinfarkt, instabile Angina, Thromboembolie, Lungenembolie, thrombolytischen Erkrankungen, akuter Arterienischämie, peripheren thrombotischen Okklusionen und Koronararterienerkrankung. In noch anderen Ausführungsformen ist die PI3K-vermittelte Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Krebs, Kolonkrebs, Glioblastom, Endometriumkrebs, Leberzellenkarzinom, Lungenkrebs, Melanom, Nierenzellkarzinom, Schilddrüsenkarzinom, Zelllymphom, lymphoproliferativen Störungen, kleinzelligem Lungenkarzinom, Plattenepithelkarzinom der Lunge, Gliom, Brustkrebs, Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Cervixkrebs und Leukämie. In noch einer anderen Ausführungsform ist die PI3K-vermittelte Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Diabetes Typ II. In noch anderen Ausführungsformen ist die PI3K-vermittelte Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Atemwegserkrankungen, Bronchitis, Asthma und chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung. In bestimmten Ausführungsformen ist das Subjekt ein Mensch.
Nach einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung der Formel I bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Störung bei Säugern bereit, wobei die Störung ausgewählt ist aus Krebs, Brustkrebs, Glioblastom, Endometriumkrebs, Leberzellkarzinom, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Melanom, Nierenzellkarzinom, Schilddrüsenkarzinom, kleinzelligem Lungenkarzinom, Plattenepithelkarzinom der Lunge, Gliom, Brustkrebs, Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Cervixkrebs, Leukämie, Zelllymphom, lympho proliferativen Störungen. Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung einer Verbindung der Formel I bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von rheumatoider Arthritis bei Säugern sowie die Verwendung einer Verbindung der Formel I bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung bei Säugern bereit.
DEFINITIONEN
Eine "PI3K-vermittelte Erkrankung" ist durch die Beteiligung einer oder mehrerer PI3Ks oder einer PI3P-Phosphatase (z.B. PTEN (Phosphatase und Tensin-Homologes, deletiert auf Chromosom Ten) usw.) beim Beginn, der Manifestation von einem oder mehrerer Symptomen oder Krankheitsmarkern, der Schwere oder Progression einer Erkrankung gekennzeichnet. PI3K-vermittelte Erkrankungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: rheumatoide Arthritis, Spondylarthritis, Osteoarthritis, Psoriasisarthritis, Psoriasis, Entzündungserkrankungen, Lungenfibrose, Autoimmunerkrankungen, kardiovaskuläre Erkrankungen, Atherosklerose, Hypertonie, Thrombose der tiefen Venen, Schlaganfall, Myokardinfarkt, instabile Angina, Thromboembolie, Lungenembolie, thrombolytische Erkrankung, akute Arterienischämie, periphere thrombotische Okklusionen, Koronararterienerkrankung, Krebs, Brustkrebs, Glioblastom, Endometriumkarzinom, Leberzellenkarzinom, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Melanom, Nierenzellkarzinom, Schilddrüsenkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Plattenepithelkarzinom der Lunge, Gliom, Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Cervixkrebs, Leukämie, Zelllymphom, lymphoproliferative Störungen und Diabetes Typ II, Atemwegserkrankungen, Bronchitis, Asthma und chronischobstruktive Lungenerkrankung.
Eine PI3K ist ein Enzym, das fähig ist, das 3'-OH eines Phosphoinositols unter Bildung von PI3P zu phosphorylieren. PI3Ks umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kγ und PI3Kδ. Eine PI3K umfasst typischerweise wenigstens eine katalytische Untereinheit (z.B. p110γ) und kann außerdem eine regulatorische Untereinheit (z.B. p101 usw.) umfassen.
Der Ausdruck "Alkylgruppe" oder "Alkyl" schließt geradkettige und verzweigte Kohlenstoffreste ein. Der Ausdruck "Alkylen" bezieht sich auf einen zweiwertigen Rest eines unsubstituierten oder substituierten Alkans. Beispielsweise ist "C_1- ₆-Alkyl" eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispiele für geradkettige C₁-C₆-Alkylgruppen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl. Beispiele für verzweigtkettige Alkylgruppen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Isopropyl, tert.-Butyl, Isobutyl usw. Beispiele für Alkylengruppen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, -CH₂-, -CH₂-CH₂-, -CH₂-CH(CH₃)-CH₂- und -(CH₂)_1- ₃. Alkylengruppen können mit Gruppen, wie sie unten für Alkyl genannt werden, substituiert sein.
Der Ausdruck Alkyl umfasst sowohl "unsubstituierte Alkyle" als auch "substituierte Alkyle", wobei sich die Letztgenannten auf Alkylgruppierungen beziehen, die Substituenten haben, welche ein Wasserstoff an einem oder mehreren Kohlenstoffen der Kohlenwasserstoffhauptkette ersetzen. Solche Substituenten sind unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Halogen, I, Br, Cl, F, -OH, -COOH, Trifluormethyl, -NH₂, -OCF₃, und O-C₁-C₃-Alkyl.
Typische substituierte Alkylgruppen sind demnach 2,3-Dichlorpentyl, 3-Hydroxy-5-carboxyhexyl, 2-Aminopropyl, Pentachlorbutyl, Trifluormethyl, Methoxyethyl, 3-Hydroxypentyl, 4-Chlorbutyl, 1,2-Dimethylpropyl und Pentafluorethyl.
"Halogen" umfasst Fluor, Chlor, Brom und Iod.
Der Ausdruck "C₃-C₈-Cycloalkyl" bezieht sich auf eine Cycloalkylgruppe, die 3 bis 8 Kohlenstoffatome enthält. So umfasst der Ausdruck "C₃-C₈-Cycloalkyl" monocyclische Cycloalkylgruppen, die 3 bis 8 Kohlenstoffatome enthalten, und bicyclische Cycloalkylgruppen, die 7 oder 8 Kohlenstoffatome enthalten. Beispiele für "C₃-C₈-Cycloalkyle" umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl und Bicyclo[2.2.1]heptyl; die Cycloalkylgruppe kann gegebenenfalls eine oder zwei Doppelbindungen enthalten (d.h., ein Cycloalkylenyl sein), einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Cyclopentenyl, Cyclohexenyl und Cycloheptenyl. Ein "C₃-C₈-Cycloalkyl" kann mit ein oder zwei Gruppen substituiert sein, die unabhängig ausgewählt sind aus -OH, C₁-C₄-Alkyl (z.B. Methyl) und -O-C₁-C₄-Alkyl (z.B. Methoxy). Beispiele für substituierte Cycloalkylgruppen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Methylcyclopropyl, Dimethylcyclohexyl, 2-Methylcyclohexyl, 3-Methylcyclohexyl, 3,5-Dimethylcyclohexyl und 4-Methylcyclohexyl.
Ein "5-gliedriges Heterocycloalkyl" ist ein stabiler 5-gliedriger monocyclischer Cycloalkylring mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: 1 O; 1 S; 1 N; 2 N; 1 S und 1 N; 1 S und 2 N; 1 O und 1 N; und ein 1 O und 2 N, wobei, wenn zwei O-Atome oder ein O-Atom und ein S-Atom in einem Ring vorliegen, die zwei O-Atome bzw. das eine O-Atom und das eine S-Atom nicht direkt aneinander gebunden sind. Erläuternde Beispiele für stabile 5-gliedrige Heterocycloalkyle umfassen Tetrahydrofuranyl, Dihydrofuranyl, Tetrahydrothienyl, Dihydrothienyl, Imidazolidinyl, Oxazolidinyl, Imidazolinyl, Isoxazolidinyl, Pyrrolidinyl, 2-Pyrrolinyl und 3-Pyrrolinyl.
Ein "6-gliedriges Heterocycloalkyl" ist ein stabiler 6-gliedriger monocyclischer Cycloalkylring mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: 1 O; 2 O; 1 S; 2 S; 1 N; 2 N; 3 N; 1 S, 1 Ound 1 N; 1 S und 1 N; 1 S und 2 N; 1 S und 1 O; 1 S und 2 O; 1 O und 1 N und 1 Ound 2 N, wobei, wenn zwei O-Atome oder ein O-Atom und ein S-Atom vorliegen, die zwei O-Atome oder ein O-Atom und ein S-Atom nicht direkt aneinander gebunden sind. Typische Beispiele für stabile 6-gliedrige Heterocycloalkyle umfassen Tetrahydropyranyl, Dihydropyranyl, Dioxanyl, 1,3-Dioxolanyl, 1,4-Dithianyl, Hexahydropyrimidin, Morpholinyl, Piperazinyl, Piperidinyl, 2H-Pyranyl, 4H-Pyranyl, Pyrazolidinyl, Pyrazolinyl, 1,2,3,6-Tetrahydropyridinyl, Tetrahydrothiopyranyl, 1,1-Dioxohexahydro-1λ⁶-thiopyranyl, 1,1-Dioxo-1λ⁶-thiomorpholinyl, Thiomorpholinyl, Thioxanyl und 1,3,5-Trithianyl.
Von dem Ausdruck "5- oder 6-gliedriges Heterocycloalkyl" mit umfasst werden 5-gliedrige Ringe mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff- oder einer Kohlenstoff-Stickstoff-Doppel bindung im Ring (z.B. 2-Pyrrolinyl, 3-Pyrrolinyl usw.) und 6-gliedrige Ringe mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff- oder einer Kohlenstoff-Stickstoff-Doppelbindung im Ring (z.B. Dihydro-2H-pyranyl, 1,2,3,4-Tetrahydropyridin, 3,4-Dihydro-2H-[1,4]oxazin, usw.).
"5- oder 6-gliedrige Heterocycloalkyle" können unsubstituiert sein oder mit Gruppen substituiert sein, z.B. mit denen, die oben für C₃-C₈-Cycloalkyle angegeben sind, wenn möglich, und mit einer Oxo- oder Thiooxogruppe an einem Kohlenstoffringatom.
Wenn nichts anderes angegeben ist, können die vorstehend genannten Heterocycloalkyle C-gebunden oder N-gebunden sein, wenn dies möglich ist und dies in der Schaffung einer stabilen Struktur resultiert. Piperidinyl z.B. kann Piperidin-1-yl(N-gebunden) oder Piperidin-4-yl(C-gebunden) sein.
Der Ausdruck "Phenyl" bezieht sich auf unsubstituierte und substituierte Phenylgruppen. Eine Phenylgruppe kann mit 4 Halogen-Substituenten oder mit 1 bis 3 Substituenten substituiert sein, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: Halogen, I, Br, Cl, F, -CH₂OH, -OH, -COOH, Trifluormethyl, -NH₂, -C(O)NH₂, -OCF₃, -O-C₁-C₃-Alkyl, C₁-C₃-Alkyl, -O-C₁-C₃-Alkyl, -OCF₃, -O-Phenyl, -O-C₁-C₃-Alkylenphenylphenyl und C₅-C₆-Cycloalkyl, wobei das -O-C₁-C₃-Alkyl, C₁-C₃-Alkyl, -O-C₁-C₃-Alkyl, -O-Phenyl und das C₅-C₆-Cycloalkyl gegebenenfalls mit 1 bis 3 Substituenten, ausgewählt aus Halogen, Benzyl und -OH, substituiert sein können.
Typische substituierte Phenylgruppen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, 3-Benzyloxyphenyl, 3-Chlorphenyl, 2,6-Dibromphenyl, 2,4,6-Tribromphenyl, 2,6-Dichlorphenyl, 4-Trifluormethylphenyl, 3-Methylphenyl, 4-Methylphenyl, 3,5-Dimethylphenyl, 3,4,5-Trimethoxyphenyl, 3,5-Dimethoxyphenyl, 3,4-Dimethoxyphenyl, 3-Methoxyphenyl, 4-Methoxyphenyl, 3,5-Difluorphenyl, 4-Chlorphenyl, 3-Trifluormethylphenyl, 3,5-Dichlorphenyl, 2-Methoxy-5-methylphenyl, 2-Fluor-5-methylphenyl, 4-Chlor-2-trifluormethylphenyl und dergleichen.
Ein "5-gliedriges Heteroaryl" ist ein stabiler 5-gliedriger, monocyclischer, aromatischer Ringrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und 1 bis 4 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: 1 O; 1 S; 1 N; 2 N; 3 N; 4 N; 1 S und 1 N; 1 S und 2 N; 1 O und 1 N; und 1 O und 2 N. Typische Beispiele für stabile 5-gliedrige Heteroaryle umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Furanyl, 2-Furanyl, 3-Furanyl, Imidazolyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, Oxadiazolyl, Oxazolyl, Pyridinyl, 2-, 3- oder 4-Pyridinyl, Pyrimidinyl, 2-, 4- oder 5-Pyrimidinyl, Pyrazolyl, Pyrrolyl, 2- oder 3-Pyrrolyl, Pyrazinyl, Pyridazinyl, 3- oder 4-Pyridazinyl, 2-Pyrazinyl, Thienyl, 2-Thienyl, 3-Thienyl, Tetrazolyl, Thiazolyl, Thiadiazolyl, Triazinyl und Triazolyl.
Ein "6-gliedriges Heteroaryl" ist ein stabiler 6-gliedriger, monocyclischer, aromatischer Ringrest mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: 1 N; 2 N; und 3 N. Typische Beispiele für stabiles 6-gliedriges Heteroaryl umfassen Pyridin-2-yl, Pyridin-4-yl, Pyrimidin-2-yl, Pyridazin-4-yl und Pyrazin-2-yl.
Ein Heteroaryl kann auch Ringsysteme umfassen, die an Ringkohlenstoffen mit einer oder mehreren funktionellen -OH-Gruppen substituiert sind (die tautomerisieren können, wo durch eine Ring-C=O-Gruppe erhalten wird) und/oder an einem Ringschwefelatom durch ein oder zwei Sauerstoffatome substituiert sind, wodurch die Gruppen S=O bzw. SO₂ gebildet werden.
Kohlenstoffringatome in einem 5- oder 6-gliedrigen Heteroaryl können gegebenenfalls, wo es möglich ist, mit ein oder zwei Gruppen substituiert sein, die ausgewählt sind aus NH₂, Hydroxy, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₁-C₆)-Alkyl-SO₂-NH-, (C₁-C₆)-Alkyl-(C=O)-, (C₁-C₆)-Alkyl-NH-(C=0)- und (C₁-C₆)-Alkyl-SO₂-.
Stickstoffringatome in einem 5- oder 6-gliedrigen Heteroaryl können gegebenenfalls, wo es möglich ist, mit einem H₂N(C=O)- oder mit (C₁-C₆)-Alkyl, (C₁-C₆)-Alkyl-(C=O)-, (C₁-C₆)-Alkyl-NH-(C=O)-, [(C₁-C₆)-Alkyl]₂-N-(C=O)- oder (C₁-C₆)-Alkyl-O(C=O)- substituiert sein.
Einige der Verbindungen in der vorliegenden Erfindung können als Stereoisomere, einschließlich Enantiomere, Diastereomere und geometrische Isomere, vorliegen. Geometrische Isomere umfassen Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die Alkenylgruppen haben, die als Entgegen- oder Zusammen-Konformationen vorliegen können, wobei alle geometrischen Formen davon, sowohl entgegen als auch zusammen, cis und trans, und Gemische davon, im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen. Einige Verbindungen der vorliegenden Erfindung haben Cycloalkylgruppen, die an mehr als einem Kohlenstoffatom substituiert sein können, wobei in diesem Fall alle geometrischen Formen derselben, sowohl cis als auch trans, und Gemische davon, im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen. Alle diese Formen, einschließlich (R), (S), Epimere, Diastereomere, cis, trans, syn, anti, (E), (Z), Solvate (eingeschlossen Hydrate), Tautomere und Gemische davon, werden als Verbindungen der vorliegenden Erfindung angesehen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I. EINFÜHRUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Pyridopyrimidine der Formeln I-III, wobei R², R⁴, R⁵, R⁶, R⁸ und J eine beliebige der Bedeutungen haben, die dafür in der Beschreibung spezifiziert sind, und auch pharmazeutisch annehmbare Salze davon, die als Mittel in der Behandlung von Erkrankungen und Zuständen, einschließlich Entzündungserkrankungen, kardiovaskulärer Erkrankungen und Krebs, einsetzbar sind. Bereitgestellt werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine oder mehrere Verbindungen der Formeln I-III umfassen.
II. HERSTELLUNG VON VERBINDUNGEN
Verbindungen der vorliegenden Erfindung (z.B. Verbindungen der Formel I) können durch Anwendung der fachbekannten Synthesemethodologie und der in den folgenden Schemata ausgeführten Synthesemethodologie hergestellt werden. Schema 1a
In Schema 1a wird Thioharnstoff in Dichlormethan mit 2 (z.B. 1,1-Dimethoxyethyl)dimethylamin) unter Erhalt von Thioharnstoff 3 (z.B. (1-Dimethylaminoethyliden)thioharnstoff) umgesetzt. 3 wird dann mit Iodmethan (MeI) in THF (Tetrahydrofuran) alkyliert, wodurch 2-Methylisothioharnstoff 4 (z.B. 1-(1-Dimethylaminoethyliden)-2-methylisothiohamstoff) erhalten wird. Der Isothioharnstoff 4 wird in chloriertem Kohlenwasserstofflösungsmittel (z.B. Dichlormethan) mit Chlorcarbonylessigsäureethylester, anschließend mit tertiärem Amin, z.B. Triethylamin, behandelt, wodurch das Pyrimidin 5 (z.B. 4-Hydroxy-6-methyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-carbonsäureethylester) erhalten wird.
5 wird in Dichlormethan mit Oxalylchlorid und einer katalytischen Menge an DMF (Dimethylformamid) umgesetzt, wodurch 6 (z.B. 4-Chlor-6-methyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-carbonsäureethylester) erhalten wird. Die Chlorgruppe von 6 wird dann mit einem Amin (NH₂-J-R⁸) in Gegenwart von Triethylamin in einem Lösungsmittel, z.B. Dichlormethan, verdrängt, wodurch 7 (z.B. 4-Cycloheptylamino-6-methyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-carbonsäureethylester) bereitgestellt wird. Es kann eine Vielzahl von Aminen (NH₂-J-R⁸) verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Cycloheptylamin, Cyclopentylamin, Cyclohexylamin, Methylamin und 2-Cyclopropylethylamin. Schema 1b
In Schema 1b wird 8 (z.B. 4,4,4-Trifluor-3-oxobuttersäureethylester) mit 2-Methylisothioharnstoff in einem Lösungsmittel, z.B. Dichlormethan, behandelt, wodurch 9 (z.B. 2-Methylsulfanyl-6-trifluormethylpyrimidin-4-ol) erhalten wird. 9 wird in einem Lösungsmittel, z.B. Dichlormethan, mit Oxalylchlorid und einer katalytischen Menge an DMF chloriert, wodurch 10 (z.B. 4-Chlor-2-methylsulfanyl-6-trifluormethylpyrimidin) erhalten wird.
Die Chlorgruppe von 10 wird dann mit einem Amin, NH₂-J-R⁸, verdrängt, wodurch 11 (z.B. Methyl-(2-methylsulfanyl-6-trifluormethylpyrimidin-4-yl)amin) erhalten wird. 11 wird dann mit Brom in Essigsäure unter Bereitstellung von 12 (z.B. (5-Brom-2-methylsulfanyl-6-trifluormethylpyrimidin-4-yl)methylamin) bromiert. Die Bromgruppe von 12 kann dann in den Ester 7a (z.B. 4-Methylamino-2-methylsulfanyl-6-trifluormethylpyrimidin-5-carbonsäuremethylester) umgewandelt werden, wobei ein Palladiumkatalysator mit CO₂(g) in Methanol verwendet wird. Schema 2
In Schema 2 kann 7 (oder 7a) in THF mit einem Hydrid, z.B. Lithiumaluminiumhydrid (LAH) unter Bereitstellung des Alkohols 14 (z.B. 4-Cycloheptylamino-6-methyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-yl)methanol) reduziert werden. 14 kann dann in Chloroform unter Verwendung eines Metalldioxids, z.B. Mangandioxid (MnO₂) oxidiert werden, wodurch 16 (z.B. 4-Cycloheptylamino-6-methyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-carbaldehyd) bereitgestellt wird.
16 wird dann entweder mit einem stabilisierten Phosphoran, einem Phosphonatester (z.B. (Et-O)₂-P(O)-CH(R⁶)-COOEt, worin R⁶ Br, Cl, F oder H ist) in Gegenwart einer Base oder eines alternativen geeigneten Wittig- oder Horner-Emmons-Wadsworth-Reagenses unter Bereitstellung des entsprechenden ungesättigten Esters 18 (z.B. 3-(4-Cycloheptylamino-6-methyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-yl)acrylsäure(ethylester) umgesetzt. Beispielsweise kann die Trans formation von 16 in 18 in einem Lösungsmittel, wie z.B. THF, mit Natriumhydrid-behandeltem Ethoxyphosphinoylessigsäureethylester oder Triethyl-2-fluor-2-phosphonoacetat durchgeführt werden.
Die Behandlung von 18 in DMF mit einem tertiären Amin, z.B. 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) oder 1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en (DBN) mit einer katalytischen Menge an Kalium-tert.-butoxid fuhrt einen Ringschluss unter Bereitstellung von 20 (z.B. 8-Cycloheptyl-4-methyl-2-methylsulfanyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on) durch.
Die Methylthiogruppe eines 2-Methylsulfanyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on 8 (z.B. 4-Methyl-2-methylsulfanyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on) in Dichlormethan oder Chloroform wird dann zu dem entsprechenden Methylsulfanyl-Derivat unter Verwendung eines geeigneten Oxaziridins (z.B. Davis-Oxaziridin ((1S)-(+)-(10-Camphorsulfonyl)oxaziridin); oder 3-Phenyl-2-(phenylsulfonyl)-1,2-oxaziridin usw.), Dimethyldioxiran oder mCPBA (3-Chlorperoxybenzoesäure) in einem Lösungsmittel, z.B. Chloroform oder Dichlormethan, oxidiert, um 22 (z.B. 8-Cycloheptyl-4-methyl-2-methylsulfanyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on) bereitzustellen. Die Methylsulfanylgruppe von 22 wird dann mit einem Aminopyrrol 23 (R²-NH₂) (z.B. 4-Amino-1-benzyl-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester usw.) in Acetonitril verdrängt, um so das 8H-Pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on 24 (z.B. 1-Benzyl-4-(8-cycloheptyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester) zu erhalten. Es kann eine Vielzahl von R²-NH₂-Verbindungen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: 4-Amino-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester, 4-Amino-1-pyridin-3-ylmethyl-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester, 4-Amino-1-(1-phenylethyl)-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester, 4-Amino-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester und 4-Amino-1-isopropyl-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester. Ein anschließender Entschützungsschritt und/oder Verseifungsschritt kann/können erforderlich sein, was von der Natur von Substituenten, wie z.B. R² oder R⁸, abhängt. Beispielsweise kann eine Estergruppe mit einer geeigneten Base (z.B. NaOH, LiOH) zu der entsprechenden Säure hydrolysiert werden. Schema 3 zeigt ein Beispiel für ein Entschützungsreaktionsschema. Schema 3
In bestimmten Ausführungsformen werden Schutzgruppen an Gruppierungen, wie z.B. R² oder R⁸, während der Synthese von Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet. Der Fachmann wird erkennen, dass es eine Vielzahl von Schutzgruppen gibt, die in organischen Synthesen verwendet werden können (siehe z.B. Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausg., (John Wiley & Sons, Inc., 1991)). Beispielsweise wird in Schema 3 ein Pyridopyrimidin 25 in DMF mit Polystyrol-getragenem BEMP-Harz (2-tert.-Butylimino-2-diethylamino-1,3-dimethylperhydro-1,3,2-diazaphosphorin) und einer Br-J-R⁸-TBDMS-Verbindung (z.B. (3-Brompropoxy)-tert.-butyldimethylsilan) umgesetzt, wodurch 26 erhalten wird. Schutzgruppen für Hydroxyle, z.B. die Silylether-Schutzgruppe t-Butyldimethylsilyl (TBDMS)-Ethergruppe sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausg., (John Wiley & Sons, Inc., 1991)). Die Silylethergruppe von 26 kann dann durch Säurehydrolyse, z.B. Fluorwasserstoff-Pyridin (35-40% HF)-Polymer-gebundenes Harz entfernt werden, wodurch 27 bereitgestellt wird. Schema 4
In Schema 4 kann die Methylsulfanylgruppe 30 zu einer Methylsulfinylgruppe oxidiert werden, wobei ein Oxiran, z.B. Dimethyldioxiran, in einem Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, oder ein Oxaziridin verwendet wird, und dann wird mit einem Amin R²-NH₂ in Acetonitril oder mit DCM (4-(Dicyanomethylen)-2-methyl-6-(4-dimethylaminostyryl)-4H-pyran) und PS-Morpholin (Polystyrol-Morpholin), in einem Lösungsmittel, wie DMF, umgesetzt, wodurch 32 bereitgestellt wird. 32 kann mit R⁸-J-I und Natriumhydrid in DMF oder mit PS-BEMP (Polystyrol-2-tert.-butylimino-2-diethylamino-1,3-dimethylperhydro-1,3,2-diazaphosphorin) und R⁸-J-X (worin X für I, Br oder Cl steht) in DMF umgesetzt werden, wodurch 24 erhalten wird. 32 (oder 30) kann auch unter Mitsunobu-Bedingungen (z.B. mit DEAD (Diethylazodicarboxylat)) und PPh₃ (Triphenylphosphin) in einem Lösungsmittel, z.B. Tetrahydrofuran (THF), mit R⁸-OH unter Bereitstellung von 24 bzw. 34 umgesetzt werden. Schema 5
In Schema 5 wird 40 mit N-Bromsuccinimid (NBS) in DMF unter Erhalt von 41 bromiert. Alternativ kann 40 mit N-Chlorsuccinimid (NCS) chloriert werden, um das Chlor-Analoge von 41 zu erhalten. 41 wird dann mit Dimethyldioxiran wie in Schema 2 behandelt, um 42 bereitzustellen, welches wiederum mit 23 wie in Schema 2 unter Bildung von 43 umgesetzt wird. 43 kann dann wie in Schema 4 mit R⁸-J-I oder R⁸-J-X unter Bereitstellung von 44 umgesetzt werden (siehe Schema 6). Schema 6
In Schema 6 kann die Bromgruppe von 44 in einem Lösungsmittel, z.B. einem Gemisch von THF:Methanol (1:1), mit Triethylamin und 10% Pd(OH)₂/C und unter Wasserstoffgas (z.B. 50 psi) unter Bereitstellung von 50 reduziert werden. Schema 7
Der Aldehyd 16 kann mit einer organometallischen Verbindung, z.B. Methylmagnesiumbromid, unter Erhalt des alkylierten Alkohols 51 umgesetzt werden. Diese Alkoholfunktion kann dann mit einem Oxidationsmittel, z.B. Mangandioxid, zum Keton 52 oxidiert werden. 52 kann dann weiter zu Verbindungen der Formel 53 gemäß derselben Methodologie wie in Schema 2 umgewandelt werden. Schema 8
Wenn eine Verbindung der Formel 7 eine R⁴-Gruppe mit C-H-Bindungen enthält, z.B. Methyl, 7b, ist die C-H-Bindung sauer und kann mit einem starken Alkyllithiumreagens, z.B. n-Butyllithium in THF, bei kalten Temperaturen (z.B. –78°C) abstrahiert werden und mit einem Alkyliodid, z.B. Methyliodid, unter Erhalt von 7c alkyliert werden. 7c kann dann wie in Schema 2 verwendet werden. Schema 9
In Schema 9 kann 54 mit einer Boronsäure-Verbindung R⁶-B(OH)₂ (z.B. Phenylboronsäure) oder einem organischen Zinnreagens, z.B. Trimethyl-Zinn-R⁶, worin R⁶ eine Phenylgruppe ist, gekoppelt werden, um 24b zu erzeugen (siehe allgemein Miyaura und Suzuki, (1995) Chem. Rev. 95: 2457-2483). Diese Reaktionen können unter Verwendung eines Palladiumkatalysators auf Phosphin-Basis, z.B. Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (Pd(Ph₃)₄) in einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. wässriges Natriumbicarbonat, Methanol und Toluol (1:1:1) durchgeführt werden. Boronsäuren sind im Handel von Lieferanten, wie z.B. Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA, verfügbar. Alternativ kann 20, worin R⁶ Br ist, an ein Boronsäure-Derivat gekoppelt werden, gefolgt von einer Oxidation der Methylsulfanylgruppe zu einer Methylsulfinylgruppe, wie in Schema 2, gefolgt von einer Verdrängung der Methylsulfinylgruppe unter Bereitstellung von 24b. Schema 10
In Schema 10 kann die C-6-Position von 56 (z.B. 4-[6-Brom-8-(4-methoxybenzyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester) mit einem organischen Zinnreagens, z.B. Tetramethyl-Zinn oder Tetraethyl-Zinn, in Gegenwart von Kupferiodid und PdCl₂(PPh₃)₂ in einem Lösungsmittel, wie DMF, alkyliert werden, wodurch 24c (z.B. 4-[8-(4-Methoxybenzyl)-4,6-dimethyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester) gebildet wird.
III. EVALUIERUNG VON VERBINDUNGEN
Verbindungen der vorliegenden Erfindung (z.B. Verbindungen der Formeln I–III und pharmazeutisch annehmbare Salze davon) können auf ihre Fähigkeit, PI3K zu inhibieren, untersucht werden. Beispiele für diese Assays sind unten angegeben und umfassen in vitro und in vivo-Assays der PI3K-Aktivität.
Bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen, die im Vergleich zu einem oder mehreren Enzymen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, eine cyclische Nucleotid-abhängige Proteinkinase, PDGF, eine Tyrosinkinase, eine MAP-Kinase, eine MAP-Kinase-Kinase, eine MEKK, eine Cyclin-abhängige Proteinkinase (z.B. CDK2/CyclinA), eine oder mehrere PI3Ks selektiv inhibieren. Andere Ausführungsformen der Erfindung sind Verbindungen, die selektiv eine PI3K im Vergleich zu einer anderen PI3K inhibieren. Beispielsweise sind bestimmte Ausfürungsformen Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die die Fähigkeit zeigen, PI3Kγ selektiv im Vergleich zu PI3Kα oder PI3Kγ zu inhibieren. Eine Verbindung inhibiert selektiv ein erstes Enzym im Vergleich zu einem zweiten Enzym, wenn die IC₅₀ der Verbindung gegen das erste Enzym kleiner als die IC₅₀ der Verbindung gegen die zweite Verbindung ist. Die IC₅₀ kann z.B. in einem in vitro-PI3K-Assay gemessen werden.
In derzeit bevorzugten Ausführungsformen können Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf ihre Fähigkeit, PI3K-Aktivität in einem in vitro- oder einem in vivo-Assay zu inhibieren, untersucht werden (siehe unten).
PI3K-Assays werden in Gegenwart oder in Abwesenheit einer für PI3K inhibitorischen erbindung durchgeführt, und die Menge an Enzymaktivität wird für eine Bestimmung der inhibitorischen Aktivität der für PI3K inhibitorischen Verbindung verglichen.
Proben, die keine für PI3K inhibitorische Verbindung enthalten, wird ein relativer PI3K-Aktivitätswert von 100 zugeordnet. Die Inhibierung der PI3K-Aktivität wird erreicht, wenn die PI3K-Aktivität in Gegenwart einer für PI3K inhibitorischen Verbindung kleiner ist als die einer Kontrollprobe (d.h., keine inhibitorische Verbindung). Die IC₅₀ einer Verbindung ist die Konzentration an Verbindung, die 50% der Kontrollprobenaktivität aufweist. In bestimmen Ausführungsformen haben Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine IC₅₀ von kleiner als etwa 100 μM. In anderen Ausführungsformen haben Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine IC₅₀ von etwa 1 μM oder weniger. In noch anderen Ausführungsformen haben Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine IC₅₀ von etwa 200 nM oder weniger.
PI3Kγ-Assays wurden auf dem Fachgebiet beschrieben (siehe z.B. Leopoldt et al., J Biol. Chem., 1998; 273: 7024–7029). Typischerweise wird eine Probe, die einen Komplex aus p101- und p110γ-Protein enthält, mit Gβ- und Gγ-Proteinen (z.B. G-Protein β₁/γ₂-Untereinheiten) kombiniert. Dann wird radioaktiv markiertes ATP (z.B. γ-³²P-ATP) zu diesem Gemisch gegeben. Die Lipidsubstrate werden gebildet, indem PIP₂-enthaltende Lipidmicellen produziert werden. Die Reaktionen werden dann gestartet, indem die Lipid- und Enzym-Gemische zugegeben werden, und sie werden durch Zusatz von H₃PO₄ gestoppt. Die Lipidprodukte werden dann zu einer Glasfaser-Filterplatte transferiert und mehrmals mit H₃PO₄ gewaschen. Das Vorliegen von radioaktivem Lipidprodukt (PIP₃) kann dann unter Verwendung radiometrischer Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, gemessen werden.
Die Aktivität von Wachstumsfaktor-regulierten PI3Ks kann auch unter Verwendung eines Lipidkinase-Assays gemessen werden. Beispielsweise kann PI3Kα unter Verwendung von Proben, die eine regulatorische und eine katalytische Untereinheit enthalten, analysiert werden. Der Probe mit radioaktiv markiertem ATP wird ein Aktivierungspeptid (z.B. ein pY-Peptid, SynPep Corp.) zugesetzt. PIP₂-enthaltende Lipidmicellen werden dann zu der Probe gegeben, um die Reaktion zu starten. Die Reaktionen werden aufgearbeitet und analysiert, wie es für den gerade beschriebenen PI3Kγ-Assay beschrieben ist. Assays können auch unter Verwendung von Zellextrakten durchgeführt werden (Susa et al., J. Biol. Chem., 1992; 267:22951-22956).
Verbindungen der vorliegenden Erfindung (z.B. Verbindungen der Formeln I-III und pharmazeutisch annehmbare Salze davon) können auf ihre Fähigkeit, quantitative oder qualitative Marker von Prozessen, wie z.B. Entzündung, zu verringern, untersucht werden. Beispiele für Tiermodelle von Arthritis werden unten beschrieben, die eingesetzt werden können, um die Fähigkeit einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, rheumatoide Arthritis zu behandeln, zu untersuchen.
Streptokokken-Zellwand (SCW)-induzierte Arthritis-Assay
Arthritis wird induziert, wie es von Schwab et al. (1991), Infection and Immunity 59:4436-4442, beschrieben ist, allerdings mit geringen Modifikationen. Ratten erhalten typischerweise 6 μg Ultraschall-behandelte SCW (in 10 μl Dulbeccos PBS (DPBS)) durch eine intraartikuläre Injektion in das rechte tibiotarsale Gelenk am Tag 0. Am Tag 21 kann eine Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ durch systemischer SCW mit etwa 100 μg SCW (250 μl), verabreicht i.v., initiiert werden. Für orale Verbindungsstudien können die Verbindungen in einem geeigneten Vehikel (z.B. 0,5% Hydroxypropylmethylcellulose/0,2% Tween 80) suspendiert werden, Ultraschall-behandelt werden und zweimal täglich (10 mg/kg Volumen), beginnend 1 Stunde vor der Initiierung der Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ durch i.v.-Injektion von SCW verabreicht werden. Die Verbindungen werden typischerweise in Mengen zwischen 10 und 500 mg/kg Körpergewicht/Tag, z.B. 20, 30, 60, 100, 200 und 300 mg/kg/Tag, verabreicht. Ödemmessungen werden erhalten, indem die Basislinienvolumina der sensibilisierten Hinterpfote vor Reaktivierung am Tag 21 bestimmt werden und diese mit Volumina an nachfolgenden Zeitpunkten, z.B. Tag 22, 23, 24 und 25, verglichen werden. Quecksilber-Verdrängungs-Plethysmographie ist ein Verfahren, das verwendet werden kann, um das Pfotenvolumen eines Tiers zu untersuchen.
Um Schmerzen zu messen, werden Ratten in eine Vorrichtung gebracht, die die Druckmenge, die auf jede Hinterpfote gebracht wird, misst. Die durchschnittliche Differenz zwischen den arthritischen und den normalen Pfoten ist ein Verfahren, das eingesetzt wird, um Schmerzen zu messen. Außerdem können inflammatorische Cytokin-Level in Material gemessen werden, das aus den artbritischen Gelenken eines Tiers gespült wurde, und mit den Leveln eines nichtarthritischen Gelenks oder mit typischen nicht-artbritischen Gelenldeveln verglichen werden.
Assay mit Collagen-induzierter Arthritis
Typ II-Collagen-induzierte Arthritis (CIA) bei Mausen ist ein experimentelles Modell für rheumatoide Arthritis (siehe z.B. Stuart et al. (1984), Annual Rev. Immunol. 2: 199-218; Wooley (1988), Meth. Enzymol. 162: 361-373). Die Erkrankung wird typischerweise durch Immunisierung von DBA/1-Mäusen mit 100 μg Typ II-Collagen ("CII") (z.B. Rinder- oder Hühner-Typ 11-Collagen), das intradermal an der Basis des Schwanzes in Freunds vollständigem Adjuvans abgegeben wird, induziert.
Bei der Mehrzahl an immunisierten Mausen entwickelt sich progressive und inflammatorische Arthritis, charakterisiert durch eine Zunahme der Pfotenbreite von bis zu 100%. Eine Testverbindung kann Mäusen in einem Mengenbereich von z.B. 20, 60, 100 und 200 mg/kg Körpergewicht/Tag, verabreicht werden. Die Dauer des Testes kann mehrere Wochen bis wenige Monate betragen, z.B. 40, 60 oder 80 Tage. Es kann ein klinischer Scoring-Index verwendet werden, um das Fortschreiten der Erkrankung von Erythem und Ödem (Stufe 1), Gelenkverstauchung (Stufe 2) zu Gelenkankylose (Stufe 3) zu untersuchen. Die Erkrankung kann eine oder alle Pfoten in einem Tier befallen, was in einem möglichen Gesamtscore von 12 für jede Maus resultiert. Eine Histopathologie eines artbritischen Gelenks zeigt im Allgemeinen Synovitis, Pannus-Bildung und Knorpel- und Knochenerosionen. Alle Mausstämme, die gegenüber CIA empfindlich sind, sind starke Antikörper-Responder auf Typ II-Collagen, und es gibt eine merkliche zelluläre Antwort auf CII.
Die Dosierung einer Testverbindung wird üblicherweise entweder prophylaktisch (für 10 Wochen) oder therapeutisch (für 10 Tage, wenn die Erkrankung erstmals beobachtet wird) durchgeführt. Die Mäuse werden typischerweise täglich auf Entwicklung von Arthritis untersucht, und es wird oft ein klinischer Score zugeordnet. Serum kann zu verschiedenen Zeitpunkten zur Messungen von Antikörpern oder Cytokinen (bei Bedarf) von jedem Tier gewonnen werden. Am Ende der Studie können die Mause getötet werden, und ein quantitativer Histopathologie-Score kann zugeordnet werden.
Assay mit durch monoklonalen Antikörper induzierte Arthritis
Ein anderes experimentelles Modell für rheumatoide Arthritis involviert ein Injizieren von Antikörpern gegen Typ II-Collagen-Epitope in eine Maus, um Arthritis in wenigen Tagen zu induzieren (siehe z.B. Burkhardt et al. (2002), Arthritis & Rheumatism 46:2339-348; Terato et al. (1992), J. Immunol. 148:2103-2108). Cocktails von vier Antikörpern sind im Handel zur Verwendung in diesem Modell verfügbar (Arthrogen-CIA^® Monoclonal Antibody Cocktail, CHEMICON International, Inc., Temecula, CA). Dieses Modell erfordert keine Mäuse vom DBA/1-Stamm. Eine Testverbindung kann Mäusen ein- oder mehrmals in einem Bereich von Mengen, z.B. 20, 60, 100 und 200 mg/kg Körpergewicht/Tag, zu einem beliebigen Zeitpunkt während der Studie verabreicht werden. Eine Schwellung von Knöchel- und Pfote wird typischerweise quantitativ oder qualitativ als Endpunkt, wie auch als Histologie, gemessen. Außerdem kann Serum von jedem Tier zu verschiedenen Zeitpunkten für Messungen von Antikörpern oder Cytokinen gewonnen werden.
IV. PHARMAZEUTISCH ANNEHMBARE SALZE UND SOLVATE
Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Verbindungen können in unsolvatisierten Formen wie auch solvatisierten Formen, einschließlich hydratisierten Formen, vorliegen. Im Allgemeinen sind die solvatisierten Formen, einschließlich hydratisierter Formen, äquivalent zu den nicht-solvatisierten Formen und sollen vom Rahmen der vorliegenden Erfindung mit umfasst werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung (z.B. Verbindungen der Formeln I-III) sind außerdem fähig, pharmazeutisch annehmbare Salze, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Säureadditions- und/oder Basensalze zu bilden. Pharmazeutisch annehmbare Salze der Verbindungen der Formel (I) umfassen die Säureadditions- und Basensalze (einschließlich Disalze) davon. Beispiele für geeignete Salze können z.B. in Stahl und Wermuth, Handbook of Pharma ceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Wiley-VCH, Weinheim, Deutschland (2002); und Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. of Pharmaceutical Science, 1977; 66:1-19, gefunden werden.
Pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze der Verbindungen der Formeln I-III umfassen nicht-toxische Salze, die von anorganischen Säuren abgeleitet sind, wie von Salzsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, phorphosriger Säure und dergleichen, sowie die Salze, die von organischen Säuren abgeleitet sind, wie von aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren, Phenyl-substituierten Alkansäuren, Hydroxyalkansäuren, Alkandisäuren, aromatischen Säuren, aliphatischen und aromatischen Sulfonsäuren, usw. Solche Salze umfassen demnach die Acetat-, Aspartat-, Benzoat-, Besylat(Benzolsulfonat-), Bicarbonat/Carbonat-, Bisulfat-, Caprylat-, Camsylat-(Camphersulfonat-), Chlorbenzoat-, Citrat-, Edisylat-(1,2-Ethandisulfonat-), Dihydrogenphosphat-, Dinitrobenzoat-, Esylat(Ethansulfonat-), Fumarat-, Gluceptat-, Gluconat-, Glucuronat-, Hibenzat-, Hydrochlorid-/Chlorid-, Hydrobromid-/Bromid-, Hydroiodid-/Iodid-, Isobutyrat-, Monohydrogenphosphat-, Isethionat-, D-Lactat-, L-Lactat-, Malat-, Maleat-, Malonat-, Mandelat-, Mesylat-(Methansulfonat-), Metaphosphat-, Methylbenzoat-, Methylsulfat-, 2-Napsylat-(2-Naphthalinsulfonat-), Nicotinat-, Nitrat-, Orotat-, Oxalat-, Palmoat-, Phenylacetat-, Phosphat-, Phthalat-, Propionat-, Pyrophosphat-, Pyrosulfat-, Saccharat-, Sebacat-, Stearat-, Suberat-, Succinat-, Sulfat-, Sulfit-, D-Tartrat-, L-Tartrat-, Tosylat-(Toluolsulfonat-) und Xinafoat-Salze, und dergleichen, von Verbindungen der Formeln I-III. Auch in Betracht gezogen werden die Salze von Aminosäuren, z.B. Arginat, Gluconat, Galacturonat und dergleichen.
Säureadditionssalze der basischen Verbindungen können hergestellt werden, indem die freie Basenform mit einer ausreichenden Menge der gewünschten Säure in Kontakt gebracht wird, um das Salz in herkömmlicher Weise zu produzieren. Die freie Basenform kann regeneriert werden, indem die Salzform mit einer Base in Kontakt gebracht wird und die freie Base in herkömmlicher Weise isoliert wird. Die freien Basenformen unterscheiden sich von ihren jeweiligen Salzformen etwas in ihren physikalischen Eigenschaften, z.B. Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln, aber ansonsten sind die Salze ihren entsprechenden freien Basen zu Zwecken der vorliegenden Erfindung äquivalent.
Pharmazeutisch annehmbare Basenadditionssalze können mit Metallen oder Aminen, z.B. Alkali- und Erdalkalimetallhydroxiden oder organischen Aminen, gebildet werden. Beispiele für Metalle, die als Kationen verwendet werden, sind Aluminium, Calcium, Magnesium, Kalium, Natrium und dergleichen. Beispiele für geeignete Amine umfassen Arginin, Cholin, Chlorprocain, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Diethylamin, Diethanolamin, Diolamin, Ethylendiamin (Ethan-1,2-diamin), Glycin, Lysin, Meglumin, N-Methylglucamin, Ölamin, Procain (Benzathin) und Tromethamin.
Die Basenadditionssalze von sauren Verbindungen können hergestellt werden, indem die freie Säureform mit einer ausreichenden Menge der gewünschten Base in Kontakt gebracht wird, um das Salz in herkömmlicher Weise zu produzieren. Die freie Säureform kann durch Inkontaktbringen der Salzform mit einer Säure und Isolieren der freien Säure in herkömmlicher Weise regeneriert werden. Die freien Säure-Formen unterscheiden sich von ihren jeweiligen Salzformen etwas in ihren physikalischen Eigenschaften, z.B. Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln, aber ansonsten sind die Salze zu Zwecken der vorliegenden Erfindung mit ihren jeweiligen freien Säuren äquivalent.
V. PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN UND VERFAHREN ZUR VERABREICHUNG
Diese Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formeln I–III oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipiens dafür. Der Ausdruck "pharmazeutische Zusammensetzung" bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die zur Verabreichung bei medizinischer oder veterinärmedizinischer Verwendung geeignet ist. Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" bezeichnet eine Menge einer Verbindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, die ausreichend ist, um die behandelte Krankheit zu inhibieren, anzuhalten oder eine Verbesserung zuzulassen, wenn sie allein oder in Verbindung mit einem anderen pharmazeutischen Mittel oder bei der Behandlung eines bestimmten Subjekts oder einer Subjektgruppe verabreicht wird. Beispielsweise kann bei einem Menschen oder einem anderen Säuger eine therapeutisch wirksame Menge experimentell in einem Labor oder einer klinischen Einrichtung für die bestimmte Erkrankung oder das zu behandelnde Subjekt bestimmt werden.
Es sollte klar sein, dass die Bestimmung geeigneter Dosierungsformen, Dosierungsmengen und Verabreichungswegen innerhalb des Fachwissens eines Fachmanns auf dem pharmazeutischen und medizinischen Gebiet liegt, und dies wird unten beschrieben.
Eine Verbindung der vorliegenden Erfindung kann als pharmazeutische Zusammensetzung in Form eines Sirups, eines Elixiers, einer Suspension, eines Pulvers, eines Granulats, einer Tablette, einer Kapsel, eines Lutschbonbons, einer Pastille, einer wässrigen Lösung, einer Creme, einer Salbe, einer Lotion, eines Gels, einer Emulsion usw., formuliert werden. Vorzugsweise wird eine Verbindung der vorliegenden Erfindung eine Verringerung bei den Symptomen oder der Erkrankungsanzeichen, die mit einer PI3K-vermittelten Erkrankung assoziiert sind, wie sie quantitativ oder qualitativ gemessen werden, verursachen.
Zum Herstellen pharmazeutischer Zusammensetzungen aus den Verbindungen der vorliegenden Erfindung können pharmazeutisch annehmbare Träger entweder fest oder flüssig sein. Präparationen in fester Form umfassen Pulver, Tabletten, Pillen, Kapseln, Briefchen, Suppositorien und dispergierbares Granulat. Ein fester Träger kann eine oder mehrere Substanzen sein, die auch als Verdünnungsmittel, Aromatisiermittel, Bindemittel, Konservierungsmittel, Tablettenzerfallsmittel oder Verkapselungsmaterial wirken.
In Pulvern ist der Träger ein fein verteilter Feststoff, der im Gemisch mit der fein verteilten aktiven Komponente ist. In Tabletten ist die aktive Komponente mit dem Träger, der die notwendigen Bindungseigenschaften hat, in geeigneten Verhältnismengen gemischt und zu der gewünschten Gestalt und Größe verpresst.
Die Pulver und Tabletten enthalten 1% bis 95% (G/G) der aktiven Verbindung. In bestimmten Ausführungsformen macht die aktive Verbindung 5% bis 70% (G/G) aus. Geeignete Träger sind Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Talk, Zucker, Lactose, Pektin, Dextrin, Stärke, Gelatine, Tragakanth, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, ein niedrig schmelzendes Wachs, Kakaobutter und dergleichen. Der Ausdruck "Präparation" bzw. "Zubereitung" soll die Formulierung der aktiven Verbindung mit Verkapselungsmaterial als Träger umfassen, wobei eine Kapsel bereitgestellt wird, in der die aktive Komponente mit oder ohne andere Träger von einem Träger umgeben ist, der somit in Verbindung damit ist. In ähnlicher Weise sind Briefchen und Lutschbonbons eingeschlossen. Tabletten, Pulver, Kapseln, Pillen, Briefchen und Lutschbonbons können als feste Dosierungsformen verwendet werden, die für eine orale Verabreichung geeignet sind.
Zur Herstellung von Suppositorien wird ein niedrig schmelzendes Wachs, z.B. ein Gemisch von Fettsäureglyceriden oder Kakaobutter, zunächst geschmolzen, und die aktive Kornponente wird, wie durch Rühren, homogen dispergiert. Das geschmolzene homogene Gemisch wird dann in Formen zweckmäßiger Größe gegossen, abkühlen und dadurch verfestigen gelassen.
Präprationen in flüssiger Form umfassen Lösungen, Suspensionen und Emulsionen, z.B. Lösungen in Wasser- oder Wasser/Propylenglykol. Zur parenteralen Injektion können flüssige Präparationen in Lösung in wässriger Polyethylenglykollösung formuliert werden.
Wässrige Lösungen, die zur oralen Verwendung geeignet sind, können hergestellt werden, indem die aktive Komponente in Wasser gelöst wird und geeignete Färbemittel, Aromatisiermittel, Stabilisatoren und Verdickungsmittel, wenn gewünscht, zugesetzt werden. Wässrige Suspensionen, die zur oralen Verwendung geeignet sind, können hergestellt werden, indem die fein verteilte aktive Komponente in Wasser mit viskosem Material, z.B. natürlichen oder synthetischen Gummen, Harzen, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und anderen gut bekannten Suspendiermitteln, dispergiert wird.
Auch eingeschlossen sind Präparationen in fester Form, die dazu bestimmt sind, kurz vor der Verwendung in Präparationen in flüssiger Form zur oralen Verabreichung umgewandelt zu werden. Solche flüssigen Formen umfassen Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Diese Präparationen können zusätzlich zu der aktiven Komponente Färbemittel, Aromatisiermittel, Stabilisatoren, Puffer, künstliche und natürliche Süßungsmittel, Dispergiermittel, Verdickungsmittel, Solubilisiermittel und dergleichen enthalten.
Die pharmazeutische Präparation ist vorzugsweise in Einheitsdosierungsform. In einer solchen Form ist die Präparation in Einheitsdosen aufgeteilt, die geeignete Mengen der aktiven Komponente enthalten. Die Einheitsdosierungsform kann eine verpackte Präparation sein, wobei die Verpackung getrennte Mengen an Präparation enthält, z.B. verpackte Tabletten, Kapseln und Pulver in Phiolen oder Ampullen. Die Einheitsdosierungsform kann eine Kapsel, eine Tablette, ein Briefchen oder ein Lutschbonbon selbst sein, oder sie kann die geeignete Anzahl einer Beliebigen von diesen in verpackter Form sein.
Die Menge an aktiver Komponente in einer Einheitsdosis-Präparation kann von 0,1 mg bis 1000 mg, vorzugsweise 1,0 mg bis 100 mg, oder von 1% bis 95% (G/G) einer Einheitsdosis variiert oder eingestellt werden, und zwar entsprechend der bestimmten Anwendung und der Wirksamkeit der aktiven Komponente. Die Zusammensetzung kann, wenn dies gewünscht ist, auch andere kompatible therapeutische Mittel enthalten.
Pharmazeutisch annehmbare Träger werden zum Teil durch die bestimmte Zusammensetzung, die verabreicht wird, wie auch durch das bestimmte zur Verabreichung der Zusammensetzung verwendete Verfahren, bestimmt. Dementsprechend gibt es eine weite Vielzahl von geeigneten Formulierungen pharmazeutischer Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung (siehe z.B. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20. Ausgabe, Gennaro et al., Hrsg., Lippincott Williams and Wilkins, 2000).
Eine Verbindung der vorliegenden Erfindung kann allein oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten zu einer Aerosol-Formulierung verarbeitet werden (d.h., sie können "vernebelt" werden), um über Inhalation verabreicht zu werden. Aerosolformulierungen können in komprimierte, annehmbare Treibmittel, z.B. Dichlordifluormethan, Propanstickstoff, und dergleichen, gegeben werden.
Formulierungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, z.B. auf intravenösem, intramuskulärem, intradermalem und subkutanem Weg, umfassen wässrige und nichtwässrige, isotonische sterile Injektionslösungen, die Antioxidationsmittel, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe, die die Formulierung mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers isotonisch machen, enthalten können, und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel, Solubilisiermittel, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel enthalten können. In der Praxis dieser Erfindung können Zusammensetzungen z.B. durch intravenöse Infusion, oral, topisch, intraperitoneal, intravesikal oder intrathekal verabreicht werden. Die Formulierungen von Verbindungen können in versiegelten Einheitsdosis- oder Mehrdosis-Behältern präsentiert werden, z.B. als Ampullen und Phiolen. Injektionslösungen und -suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der vorher beschriebenen Art hergestellt werden.
Die an ein Subjekt verabreichte Dosis sollte im Kontext der vorliegenden Erfindung ausreichend sein, um im Lauf der Zeit bei dem Subjekt eine günstige therapeutische Reaktion zu bewirken. Der Ausdruck "Subjekt" bezieht sich auf ein Mitglied der Klasse Mammalia. Beispiele für Säuger umfassen, ohne Beschränkung, Menschen, Primaten, Schimpansen, Nager, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Pferde, Viehbestand, Hunde, Katzen, Schafe und Kühe.
Die Dosis wird durch die Wirksamkeit der bestimmten verwendeten Verbindung und dem Zustand des Subjekts sowie dem Körpergewicht oder dem Oberflächenbereich des zu behandelnden Subjekts bestimmt werden. Die Größe der Dosis wird auch durch das Vorliegen, die Natur und das Ausmaß von Nebenwirkungen, die die Verabreichung einer bestimmten Verbindung bei einem bestimmten Subjekt begleiten, bestimmt werden. Bei der Bestimmung der wirksamen Menge der Verbindung, die bei einer Behandlung oder Prophylaxe der behandelten Krankheit zu verabreichen ist, kann der Arzt verschiedene Faktoren, wie z.B. zirkulierende Plasmakonzentrationen der Verbindung, Verbindungstoxizitäten und/oder das Fortschreiten der Erkrankung usw., evaluieren. Im Allgemeinen ist das Dosisäquivalent einer Verbindung etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg für ein typisches Subjekt. Dem Fachmann sind viele unterschiedliche Verabreichungsverfahren bekannt.
Zur Verabreichung können Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit einer Rate verabreicht werden, welche durch Faktoren bestimmt wird, die das pharmakokinetische Profil der Verbindung, kontraindizierte Arzneimittel und die Nebenwirkungen der Verbindung bei verschiedenen Konzentrationen, wenn sie auf die Masse und die Gesundheit des Subjektes angewendet wird, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Eine Verabreichung kann durch eine einzelne oder aufgeteilte Dosen erreicht werden.
Beispiele einer typischen Tablette, einer parenteralen Formulierung und einer Pflasterformulierung umfassend die Folgenden: TABLETTENFORMULIERUNG BEISPIEL 1

Tablettenformulierung

Ingrediens Menge

Verbindung der Formeln I Lactose Maisstärke (zum Mischen) Maisstärke (für eine Paste) Magnesiumstearat (1%) 50 mg 80 mg 10 mg 8 mg 2 mg

150 mg
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung (z.B. eine Verbindung der Formeln I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon) können mit Lactose und Maisstärke (zum Mischen) vermischt werden und zur Gleichmäßigkeit zu einem Pulver vermengt werden. Die Maisstärke (für Paste) wird in 6 ml Wasser suspendiert und unter Rühren unter Bildung einer Paste erwärmt. Die Paste wird zu dem gemischten Pulver gegeben, und die Mischung wird granuliert.
Das nasse Granulat wird durch ein hartes Sieb Nr. 8 passiert und bei 50°C getrocknet. Das Ge misch wird mit 1% Magnesiumstearat "geschmiert" und zu einer Tablette verpresst. Die Tabletten werden einem Patienten mit einer Rate von 1 bis 4 täglich zur Behandlung einer PI3K-vermittelten Erkrankung verabreicht.
FORMULIERUNG EINER PARENTERALEN LÖSUNG, BEISPIEL 1
In eine Lösung von 700 ml Propylenglykol und 200 ml Wasser zur Injektion können 20,0 g einer Verbindung der vorliegenden Erfindung gegeben werden. Das Gemisch wird gerührt, und der pH wird mit Salzsäure auf 5,5 eingestellt. Das Volumen wird mit Wasser zur Injektion auf 1000 ml eingestellt. Die Lösung wird sterilisiert, in 5,0 ml-Ampullen gefüllt, die jeweils 2,0 ml (40 mg der erfindungsgemäßen Verbindung) enthalten, und diese werden unter Stickstoff versiegelt. Die Lösung wird durch Injektion an ein Subjekt verabreicht, das an einer PI3K-vermittelten Erkrankung leidet und einer Behandlung bedarf.
PFLASTERFORMULIERUNG BEISPIEL 1
Zehn Milligramm einer Verbindung der vorliegenden Erfindung können mit 1 ml Propylenglykol und 2 mg Polymerkleber auf Acryl-Basis, der ein harzartiges Vernetzungsmittel enthält, vermischt werden. Das Gemisch wird auf eine undurchlässige Stützschicht (30 cm²) aufgetragen und auf dem oberen Rücken eines Patienten für eine Behandlung mit verzögerter Freisetzung einer PI3K-vermittelten Erkrankung aufgebracht.
VI. VERFAHREN ZUM BEHANDELN VON PI3K-VERMITTELTEN ERKRANKUNGEN
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung und pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung umfassen, können an ein Subjekt verabreicht werden, das an einer PI3K-vermittelten Erkrankung leidet. PI3K-vermittelte Erkrankungen können prophylaktisch, akut und chronisch unter Verwendung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Abhängigkeit von der Natur der Erkrankung behandelt werden. Typischerweise ist der Mensch oder das Subjekt in jedem dieser Verfahren ein Mensch, obgleich auch andere Säuger aus der Verabreichung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung Nutzen ziehen können.
In therapeutischen Anwendungen können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einem weiten Bereich oraler und parenteraler Dosierungsformen hergestellt und verabreicht werden. Der Ausdruck "verabreichen" bezieht sich auf das Verfahren des Inkontaktbringens einer Verbindung mit einem Subjekt. So können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch Injektion verabreicht werden, d.h. intravenös, intramuskulär, intrakutan, subkutan, intraduodenal, parenteral oder intraperitoneal. Die Verbindungen, die hierin beschrieben werden, können auch durch Inhalation, z.B. intranasal, verabreicht werden. Zusätzlich können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung transdermal, topisch, via Implantation, transdermal, topisch und via Implantation verabreicht werden. In bestimmten Ausführungsformen werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung oral abgegeben. Die Verbindungen können auch rektal, bukkal, intravaginal, Okular, andial oder durch Insufflation abgegeben werden.
Die in dem pharmazeutischen Verfahren der Erfindung verwendeten Verbindungen können in einer Anfangsdosierung von etwa 0,001 mg/kg bis etwa 100 mg/kg täglich verabreicht werden. In bestimmten Ausführungsformen ist der tägliche Dosisbereich von etwa 0,1 mg/kg bis etwa 10 mg/kg. Die Dosierungen können jedoch in Abhängigkeit von den Bedürfnissen des Subjekts, der Schwere der Erkrankung, die behandelt wird, und der Verbindung, die verwendet wird, verändert werden. Eine Bestimmung der geeigneten Dosierung für eine bestimmte Situation liegt im Rahmen des Fachwissens des Fachmanns. Im Allgemeinen wird eine Behandlung mit kleineren Dosierungen, die geringer als die optimale Dosis der Verbindung sind, begonnen. Danach wird die Dosierung in kleinen Schritten erhöht, bis die optimale Wirkung unter den betreffenden Umständen erreicht ist. Aus Gründen der Zweckmäßigkeit kann die gesamte Tagesdosierung aufgeteilt werden und in Portionen während des Tages verabreicht werden, wenn dies gewünscht ist. Der Ausdruck "Behandlung" umfasst die akute, chronische oder prophylaktische Verringerung oder Linderung wenigstens eines Symptoms oder Merkmals, das mit der Erkrankung, die behandelt wird, assoziiert ist oder durch diese verursacht ist. Beispielsweise kann eine Behandlung eine Verminderung von mehreren Symptomen einer Erkrankung, eine Inhibierung des pathologischen Fortschreitens einer Erkrankung oder eine vollständige Eliminierung einer Erkrankung umfassen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können einem Subjekt coverabreicht werden. Der Ausdruck "co-verabreicht" bedeutet die Verabreichung von zwei oder mehr verschiedenen pharmazeutischen Mitteln oder Behandlungen (z.B. Strahlungsbehandlung), die einem Subjekt durch Kombination in derselben pharmazeutischen Zusammensetzung oder in getrennten pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden. Demnach involviert eine Co-Verabreichung eine gleichzeitige Verabreichung einer einzelnen pharmazeutischen Zusammensetzung, die zwei oder mehr pharmazeutische Mittel umfasst, oder eine Verabreichung von zwei oder mehr unterschiedlichen Zusammensetzungen an das Subjekt zur gleichen Zeit oder zu verschiedenen Zeiten. Beispielsweise erhält ein Subjekt, dem eine erste Dosierung, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung umfasst, um 8 Uhr morgens verabreicht wird und dem ein zweites therapeutisches Mittel 1-12 Stunden später verabreicht wird, 6 Uhr nachmittags, und zwar am gleichen Tag, eine Co-Verabreichung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung und des zweiten therapeutischen Mittels. Alternativ könnte z.B. ein Subjekt eine einzelne Dosierung, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung und ein zweites therapeutisches Mittel umfasst, um 8 Uhr morgens als Co-Verabreichung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung und des zweiten therapeutischen Mittels erhalten.
Somit können Verbindungen der vorliegenden Erfindung auch mit Verbindungen, die für die Behandlung von Krebs nützlich sind (z.B. cytotoxische Arzneimittel, wie TAXOL^®, Taxoter, GLEEVEC^® (Imatinib-Mesylat), Adriamycin, Daunomycin, Cisplatin, Etoposid, ein Vincaalkaloid, Vinblastin, Vincristin, Methotrexat oder Adriamycin, Daunomycin, Cisplatinum, Etoposid und Alkaloide, z.B. Vincristin, Farnesyl-Transferase-Inhibitoren, Endostatin und Angiostatin, VEGF-Inhibitoren und Metabolite, z.B. Methotrexat) co-verabreicht werden. Die Ver bindungen der Erfindung können auch in Kombination mit einem Taxan-Derivat, einem Platin-Koordinationskomplex, einem Nucleosid-Analogon, einem Anthracyclin, einem Topoisomerase-Inhibitor oder einem Aromatase-Inhibitor verwendet werden. Strahlungsbehandlungen können ebenfalls mit einer Verbindung der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von Krebs coverabreicht werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch mit Verbindungen coverabreicht werden, die für die Behandlung einer thrombolytischen Erkrankung, Herzerkrankung, Schlaganfall usw., nützlich sind (z.B. Aspirin, Streptokinase, Gewebe-Plasminogen-Aktivator, Urokinase, Antikoagulantien, antithrombozytäre Arzneimittel (z.B. PLAVIX^®, Clopidogrelbisulfat), ein Statin (z.B. LIPITOR^® (Atorvastatin-Calcium), ZOCOR^® (Simvastatin), CRESTOR^® (Rosuvastatin) etc.), ein Betablocker (z.B. Atenolol), NORVASC^® (Amlodipin-Besylat) und ein ACE-Inhibitor (z.B. Accupril^® (Quinapril-Hydrochlorid), Lisinopril usw.)
Die Verbindungen der Erfindung können auch für die Behandlung von Hypertonie mit Verbindungen, wie z.B. ACE-Inhibitoren, Lipid-senkenden Mitteln, wie Statinen, LIPITOR^® (Atorvastatin-Calcium), Calciumkanal-Blockern, z.B. NORVASC^® (Amlodipin-Besylat), coverabreicht werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in Kombination mit Fibraten, Beta-Blockern, NEPI-Inhibitoren, Angiotensin-2-Rezeptor-Antagonisten und Plättchenaggregationshemmern verwendet werden.
Für die Behandlung von Entzündungserkrankungen, einschließlich rheumatoider Arthritis, können die Verbindungen der Erfindung mit Mitteln, z.B. TNF-α-Inhibitoren, wie monoklonalen Antikörpern gegen TNF-α (z.B. REMICADE^®, CDP-870 und HUMIRA^TM (Adalimumab), und TNF-Rezeptor-Immunglobulin-Fusionsmolekülen (wie ENBREL^®), IL-1-Inhibitoren, Rezeptor-Antagonisten oder löslichem IL-1Rα (z.B. KINERET^TM oder ICE-Inhibitoren), nichtsteroidalen Antirheumamitteln (NSAIDS), Piroxicam, Diclofenac, Naproxen, Flurbiprofen, Fenoprofen, Ketoprofen, Ibuprofen, Fenamate, Mefenaminsäure, Indomethacin, Sulindac, Apazon, Pyrazolone, Phenylbutazon, Aspirin, COX-2-Inhibitoren (z.B. CELEBREX^® (Celecoxib), BEXTRA^® (Valdecoxib) und Etoricoxib, Metalloprotease-Inhibitoren (vorzugsweise MMP-13-selektive Inhibitoren), NEURONTIN^®, Pregabalin, Methotrexat in niedriger Dosis, Leflunomid, Hydroxychlorochin, D-Penicillamin, Auranofin oder parenterales oder orales Gold, co-verabreicht werden.
Die Verbindungen der Erfindung können mit existierenden therapeutischen Mitteln für die Behandlung von Osteoarthritis co-verabreicht werden. Geeignete Mittel, die in Kombination zu verwenden sind, umfassen nicht-steroidale Standard-Antirheumatika (im Folgenden NSAIDS genannt), z.B. Piroxicam, Diclofenac, Propionsäuren, wie Naproxen, Flurbiprofen, Fenoprofen, Ketoprofen und Ibuprofen, Fenamate, z.B. Mefenaminsäure, Indomethacin, Sulindac, Apazon, Pyrazolon, z.B. Phenylbutazon, Salicylate, z.B. Aspirin, Cox-2-Inhibitoren, z.B. Celecoxib, Valdecoxib und Etoricoxib, Analgetika, und intraartikuläre Therapien, z.B. Corticosteroide und Hyaluronsäuren, z.B. Hyalgan und Synvisc.
Die Verbindungen der Erfindung können auch mit antiviralen Mitteln, z.B. Viracept, AZT, Acyclovir und Famcyclovir, und Antisepsis-Verbindungen, z.B. Valant, co-verabreicht werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können außerdem mit ZNS-Mitteln, z.B. mit Antidepressiva (z.B. Sertralin), Arzneimittel gegen Parkinson (z.B. Deprenyl, L-Dopa, Requip, Mirapex, MAOS-Inhibitoren, z.B. Selegin und Rasagilin, comP-Inhibitoren, z.B. Tasmar, A-2-Inhibitoren, Dopamin-Wiederaufnahme-Inhibitoren, NMDA-Antagonisten, Nicotin-Agonisten, Dopamin-Agonisten und Inhibitoren der neuronalen Stickoxidsynthase), NEURONTIN^®, Pregabalin, und Arzneimitteln gegen Alzheimer-Erkrankung, z.B. ARICEPT^®, Tacrin, Propentofyllin oder Metrifonat, co-verabreicht werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zusätzlich mit Osteoporosemitteln, z.B. EVISTA^® (Raloxifen-Hydrochlorid), Droloxifen, Lasofoxifen oder FOSAMAX^®, und Immunsuppressiva, z.B. FK-506 und Rapamycin, co-verabreicht werden.
BEISPIELE
Intermediat 1: 1-(1-Dimethylaminoethyliden)-2-methylisothioharnstoff. Zu einer Lösung von Dichlormethan (10 ml) und Thioharnstoff (0,761 g, 10 mmol) wurde (1,1-Dimethoxyethyl)dimethylamin (1,9 ml, 13 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde für 4 Stunden unter Rückfluss erhitzt, dann gekühlt und das Dichlormethan unter reduziertem Druck entfernt, wodurch ein orangefarbener Feststoff erhalten wurde. Der Feststoff wurde mit heißem Ethylether verrieben und getrocknet. Dieses Intermediat wurde in einem 1:1-Gemisch von THF (Tetrahydrofuran)/MeI (10 ml) für 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Aufschlämmung wurde filtriert und mit Ethylether gespült, wodurch die Titelverbindung als farbloser Feststofferhalten wurde, 2,54 g. ¹H NMR (DMSO): 9.15 (brs, 1H), 8.80 (s, 1H), 3.18 (s, 3H), 3.08 (s, 3H) m 2.35 (s, 3H), 2.23 (s, 3H).
Intermediat 2: 4-Hydroxy-6-methyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-carbonsäureethylester. Zu einer Aufschlämmung von Intermediat 1 (2,86 g, 10 mmol) in Dichlormethan (50 ml) bei Raumtemperatur wurde Chlorcarbonylessigsäureethylester (1,54 ml, 12 mmol) gegeben. Nachdem die Reaktion für vier Stunden unter Erhalt einer orangefarbenen Suspension gerührt worden war, wurde sie auf 0°C gekühlt und mit Triethylamin (3,34 ml, 24 mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und für 24 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde in Dichlormethan gegossen und dann sukzessive mit 10% Schwefelsäure, Wasser und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, und das Dichlormethan wurde unter reduziertem Druck entfernt, wodurch ein gelber Feststoff, 2,12 g, erhalten wurde. Das Rohprodukt wurde aus Dichlormethan/Hexanen kristallisiert, wodurch die Titelverbindung als hellgelber Feststoff, 1,05 g, erhalten wurde. ¹H NMR (CDCl₃): 4.41 (q, 2H), 2.59 (s, 3H), 2.57 (s, 3H), 1.41 (t, 3H).
Intermediat 3: 4-Chlor-6-methyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-carbonsäureethylester. Zu einer Lösung von Dichlormethan (250 ml) und Intermediat 2 (15,0 g, 65,7 mmol) wur de Oxalylchlorid (11,47 ml, 131,4 mmol) sowie eine katalytische Menge an DMF (N,N-Dimethylformamid) gegeben. Es bildete sich unverzüglich ein Präzipitat, und es entwickelte sich etwas Gas. Das Gemisch wurde zweimal mit Dichlormethan gestrippt, wodurch die Titelverbindung erhalten wurde. ¹H NMR (CDCl₃): 4.42 (q, 2H), 2.57 (s, 3H), 2.48 (s, 3H), 1.39 (t, 3H). MS (M+1): 247.
Intermediat 4: 4-Cycloheptylamino-6-methyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-carbonsäureethylester. Zu einer Lösung von Dichlormethan (15 ml) und Intermediat 3 (1,02 g, 4,1 mmol) wurden Triethylamin (1,73 ml, 12,3 mmol) und Cycloheptylamin (0,58 ml, 4,51 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Wasser und Dichlormethan gegossen und mit 1,0 N Salzsäure (8,0 ml) versetzt, mit Wasser, Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, das Dichlormethan wurde unter reduziertem Druck entfernt, wodurch die Titelverbindung als braunes Öl erhalten wurde, 1,13 g. ¹H NMR (CDCl₃): 4.32 (q, 2H), 4,25 (brs, 1H), 2,50 (m, 6H), 1.98 (m, 1H), 1.60 (m, 10H), 1.40 (t, 3H). MS (M+1): 324.
Intermediat 5: 4-Cycloheptylamino-6-methyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-yl)methanol. Zu einer Lösung von THF (40 ml) und Intermediat 4 (1,0 g, 3,1 mmol) wurde Lithiumaluminiumhydrid (0,117 g, 3,1 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt und durch TLC (thin-layer chromatography = Dünnschichtchromatographie) (10% Ethylacetat/Dichlormethan) überwacht. Die Reaktion wurde mit 2% Natriumhydroxid gequencht, filtriert, und das THF wurde unter reduziertem Druck entfernt, wodurch die Titelverbindung als orangefarbener Feststoff, 0,854 g, erhalten wurde. ¹H NMR (CDCl₃): 5.87 (d, 1H), 4.60 (s, 2H), 4,18 (brs, 1H), 2,50 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 1.97 (m, 1H), 1.7-1.40 (m, 10H). MS (M+1): (282).
Intermediat 6: 4-Cycloheptylamino-6-methyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-carbaldehyd. Zu einer Lösung von Chloroform (30 ml) und Intermediat 5 (0,854 g, 3,0 mmol) wurde Mangandioxid (2,11 g, 24 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 3 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Das Mangandioxid wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde unter Erhalt der Titelverbindung als farbloser Feststoff, 0,721 g, konzentriert. ¹H NMR (CDCl₃): 10.18 (s, 1H), 9.13 (s, 1H), 4.30 (m, 1H), 2,58 (s, 3H), 1,97 (m, 1H), 1.70-1.50 (m, 10H). MS (M+1): 280.
Intermediat 7: 3-(4-Cycloheptylamino-6-methyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-yl)acrylsäureethylester. Zu einer Lösung von THF (10 ml) und Ethoxyphosphinoylessigsäureethylester (0,715 ml, 3,6 mmol) wurde Natriumhydrid (0,083 g, 3,45 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten gerührt, dann wurde Intermediat 6 (0,838 g, 3,0 mmol) in THF (15 ml) zum Reaktionsgemisch gegeben. Das Gemisch wurde für mehrere Stunden unter Rückfluss erhitzt und wurde durch TLC (9:1 Hexane/Ethylether) überwacht. TLC zeigte hauptsächlich Ausgangsmaterial, wohingegen eine massenspektrometrische Analyse hauptsächlich Produkt zeigte. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur gekühlt und in Wasser gegossen. Ethylacetat wurde zu dem Gemisch gegeben, welches dann sukzessive je ein mal mit Wasser, Bicarbonat und dann Kochsalzlösung gewaschen wurde. Die Lösung wurde dann über Magnesiumsulfat getrocknet, und das Ethylacetat wurde unter reduziertem Druck entfernt, wodurch die Titelverbindung als farbloses Öl, 1,07 g, erhalten wurde. ¹H NMR (CDCl₃): 7.61 (d, 1H), 6.18 (d, 1H), 5.10 (s, 1H), 4.30 (q, 2H), 4.20 (m, 1H), 4.4.55 (s, 3H), 4.18 (s, 3H), 2,00 (m, 1H), 1.70-1.47 (m, 10H), 1.35 ((t, 3H). MS (M+1): 350.
Intermediat 8: 8-Cycloheptyl-4-methyl-2-methylsulfanyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on. Zu einer Lösung von DMF (4 ml) und Intermediat 7 (0,860 g, 2,46 mmol) wurde DBU (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en) (0,410 ml, 2,70 mmol) sowie eine katalytische Menge an Kalium-tert.-butoxid gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 24 Stunden auf 150°C erhitzt, dann für 72 Stunden auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wurde in Wasser gegossen und dann mit 1 Äquivalent 10%iger Schwefelsäure auf pH = 4 angesäuert. Die Reaktion wurde mit Ethylacetat extrahiert und dann der Reihe nach mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen. Das Gemisch wurde dann mit Magnesiumsulfat getrocknet, und das Ethylacetat wurde unter reduziertem Druck entfernt, wodurch die Titelverbindung als orangefarbenes Öl, 0,590 g, erhalten wurde. ¹H NMR (CDCl₃): 7.73 (d, 1H), 6.58 (brs, 1H), 5.78, 5.40 (brs, 1H), 2.63 (s, 3H), 2.63 (s, 3H), 2,53 (m, 3H), 1.90-1.50 (M, 11H). MS (M+1): 304.
Intermediat 9: 8-Cycloheptyl-4-methyl-2-methylsulfinyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on. Zu einer Lösung von Intermediat 8 (590 mg, 2,0 mmol) in Chloroform (15 ml) wurde Davis-Oxaziridin (533 mg, 1,1 Äquiv.) gegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Dünnschichtanalyse zeigte zu diesem Zeitpunkt, dass die Reaktion nahezu vollständig war. Das Lösungsmittel wurde teilweise unter reduziertem Druck entfernt, und das Reaktionsgemisch wurde an Silicagel unter Elution mit Ethylacetat, dann 10% Methanol in Ethylacetat, chromatographiert, wodurch die Titelverbindung als farbloser Schaum, 400 mg, erhalten wurde. ¹H NMR: 7.81 (d, 1H), 6.78 (brd, 1H), 2.95 (s, 3H), 2.81 (s, 3H), 2,52 (m, 1H), 1.90-1.50 (m, 11H). MS (M+1): 320.
Beispiel 1: 4-(8-Cycloheptyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester. Ein Gemisch aus Intermediat 9(0,4 g, 1,25 mmol), 4-Amino-1-methylpyrrol-2-carbonsäuremethylester. HCl (0,475 g, 2,5 mmol), Triethylamin (0,348 ml, 2,5 mmol) und Acetonitril (4 ml) wurde für 18 Stunden auf 120°C erhitzt, wobei das Lösungsmittel abdestillieren gelassen wurde. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst, mit 1N HCl extrahiert, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde an einer Silicagelsäule gereinigt, wobei THF/Hexan als mobile Phase verwendet wurde und die Titelverbindung erhalten wurde. Ausbeute: 0,25 g, 48%.
Die Titelverbindungen der Beispiele 2–8 wurden in einer Art analog der von Beispiel 1 synthetisiert.
Beispiel 2: 4-(4,8-Dimethyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-(1-phenylethyl)-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester.
Beispiel 3: 4-(8-Cyclopropyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester.
Beispiel 4: 4-(8-Cyclobutyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester.
Beispiel 5: 1-Methyl-4-[4-methyl-7-oxo-8-(tetrahydropyran-4-yl)-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester.
Beispiel 6: 4-(8-Cyclohexyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester.
Beispiel 7: 1-Benzyl-4-(8-cycloheptyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimdin-2-ylamino)-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester.
Beispiel 8: 4-[8-(2-Cyclopropylethyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester.
Die Titelverbindungen der Beispiele 9 bis 13 wurden in einer Art analog der von Beispiel 1 synthetisiert, indem Ethoxyphosphinoylessigsäureethylester durch Triethyl-2-fluor-2-phosphonoacetat ersetzt wurde.
Beispiel 9: 4-(8-Cyclopentyl-6-fluor-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]-pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester.
Beispiel 10: 4-[6-Fluor-4-methyl-7-oxo-8-(tetrahydropyran-4-ylmethyl)-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester.
Beispiel 11: 4-[6-Fluor-8-(4-methoxycyclohexyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester.
Beispiel 12: 4-(8-Cyclopentyl-6-fluor-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-pyridin-3-ylmethyl-1H-pyrrol-2-carbonsäureethyIester.
Beispiel 13: 4-(8-Cyclopentyl-o-fluor-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-(1-phenylethyl)-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester.
Intermediat 10: 4-Cycloheptylamino-6-ethyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-carbonsäureethylester. Eine Lösung von Diisopropylamin (3,25 ml, 23,2 mmol) in THF (90 ml) wurde auf 0°C gekühlt und tropfenweise mit n-BuLi (15,2 ml, 1,6 M, 24 mmol) behandelt. Die Lösung wurde für 0,5 Stunden auf Umgebungstemperatur erwärmt und dann auf 78°C gekühlt. Eine Lösung von Cyloheptylamino-6-methyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-carbonsäureethylester (3,0 g, 9,28 mmol) in THF (30 ml) wurde tropfenweise zu dem Gemisch gegeben, und die Lösung wurde für 2 Stunden bei –78°C gerührt. Methyliodid (0,186 ml, 3 mmol) wurde zu der Reaktion gegeben, und das Gemisch wurde auf Umgebungstemperatur erwärmen gelassen, mit Ethylacetat verdünnt und mit 1N HCl extrahiert. Die Lösung wurde getrocknet, unter reduziertem Druck konzentriert, und der Rückstand wurde an einer Silicagelsäule (Hexan/Ethylacetat) gereinigt, wodurch 2,7 g der Titelverbindung erhalten wurden (86%).
¹H NMR (400 MHz, DMSO-D6): δ ppm 1.1 (t, J=7.4 Hz, 3H) 1.3 (t, J=7.1 Hz, 3H) 1.5 (m, 2 H) 1.5 (m, 8H) 1.9 (m, 2H) 2.5 (s, 3H) 2.8 (m, 2H) 4.2 (m, 1H) 4.3 (q, J=7.1 Hz, 2H)
Intermediat 11: 8-Cycloheptyl-4-ethyl-2-methylsulfinyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-
Intermediat 11 wurde aus Intermediat in einer Art analog der der Synthese von Intermediat 7-on.9 synthetisiert.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-D6): δ ppm 1.2 (1, J=7.6 Hz, 3H) 1.5 (m, 3H) 1.6-1.8 (m, 12H) 2.9 (s, 3H) 3.1 (q, J=7.6 Hz, 3H) 6.8 (m, 1H) 7.5 (d, J=7.8 Hz, 1H) 8.2 (d, J=9.8 Hz, 1H)
Beispiel 14: 4-(8-Cycloheptyl-4-ethyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester. Die Titelverbindung wurde aus Intermediat 11 in einer Art analog zu der Synthese von Beispiel 1 aus Intermediat 9 synthetisiert.
Beispiel 15: 4-(8-Cycloheptyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure. Die Titelverbindung von Beispiel 1 (0,25 g, 0,6 mmol) wurde in Ethanol (20 ml) gelöst und mit 1N NaOH (10 ml) behandelt und für 18 Stunden rühren gelassen. Das Gemisch wurde für 3 Stunden unter Rückfluss erhitzt, gekühlt, das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und es wurde dann mit Wasser verdünnt. Der pH der Lösung wurde durch Zusatz von HCl sauer gemacht, und der resultierende Feststoff wurde durch Filtration entfernt. Der Feststoff wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch 0,2 g der Titelverbindung (84%) erhalten wurden.
Die Titelverbindungen der Beispiele 16 bis 28 wurden in einer Art analog zu Beispiel 15 synthetisiert.
Beispiel 16: 4-(4,8-Dimethyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-(1-phenylethyl)-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Beispiel 17: 1-Methyl-4-[4-methyl-8-(3-methylcyclohexyl)-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Beispiel 18: 4-(8-Cyclopropyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Beispiel 19: 1-Methyl-4-[4-methyl-7-oxo-8-(tetrahydropyran-4-yl)-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Beispiel 20: 4-(8-Cycloheptyl-4-ethyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Beispiel 21: 4-(8-Cyclobutyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Beispiel 22: 4-(8-Cycloheptyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-isopropyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Beispiel 23: [3-(8-Cycloheptyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)pyrrol-1-yl]]essigsäure.
Die Titelverbindungen der Beispiele 24 bis 28 wurden in einer zu Beispiel 15 analogen Weise synthetisiert, indem Ethoxyphosphinoyl-Essigsäureethylester durch Triethyl-2-fluor-2-phosphonoacetat ersetzt wurde.
Beispiel 24: 4-(8-Cyclopentyl-6-fluor-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Beispiel 25: 4-[6-Fluor-4-methyl-7-oxo-8-(tetrahydropyran-4-yl)-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Beispiel 26: 4-[6-Fluor-4-methyl-7-oxo-8-(tetrahydropyran-4-ylmethyl)-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Beispiel 27: 4-[6-Fluor-8-(4-methoxycyclohexyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Beispiel 28: 4-(8-Cyclopentyl-6-fluor-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido 2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-(1-phenylethyl)-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Beispiel 29: 4-(6-Chlor-8-cyclopentyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester.
Zu einer Lösung von 8-Cyclopentyl-4-methyl-2-methylsulfanyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on (2,5 g, 9,08 mmol) in 36 ml DMF (N,N-Dimethylformamid) wurde N-Chlorsuccinimid (1,81 g, 13,55 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 30 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Wasser und Ethylacetat gegossen. Die organische Schicht wurde gesammelt und die wässrige Schicht wurde zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, das Ethylacetat wurde unter reduziertem Druck entfernt, wodurch 4,9 g Feststoff erhalten wurden. Das Rohprodukt wurde an Silicagel unter Flution mit einem Gradienten von 0% Ethylacetat bis 40% Ethylacetat/60% Hexan eluiert, und 1,00 g 6-Chlor-8-cyclopentyl-4-methyl-2-methylsulfanyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on als orangefarbener Feststoff erhalten wurde.
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ ppm 1.70 (m, 2H) 1.89 (m, 2H) 2.10 (m, 2H) 2.31 (m, 2H) 2.61 (s, 3H) 2.67 (s, 3H) 6.06 (tt, J=8.91, 8.74 Hz, 1H) 7.95 (s, 1H). MS (M+1): 310.1.
Zu einer Lösung von 6-Chlor-8-cyclopentyl-4-methyl-2-methylsulfanyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on (1,00 g, 3,22 mmol) in Chloroform (20 ml) wurde M-CPBA (m-Chlorperoxybenzoesäure: 0,760 g, 3,39 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 35 Minuten gerührt und wurde durch HPLC überwacht. Die Reaktion wurde mit gesättigter Natriumcarbonatlösung gequencht, und die organische Schicht wurde gesammelt. Die organische Schicht wurde zweimal mit einer gesättigten Natriumcarbonatlösung und dann ein mal mit Kochsalzlösung extrahiert. Das Gemisch wurde dann mit Magnesiumsulfat getrocknet, und das Chloroform wurde unter reduziertem Druck entfernt, wodurch 6-Chlor-8-cyclopentyl-4-methyl-2-methansulfinyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on erhalten wurde (0,970 g als schwachgelber Feststoff).
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ ppm 1.69 (m, 2H) 1.95 (m, 2H) 2.14 (m, 2H) 2.24 (m, 2 H) 2.84 (s, 3H) 2.97 (s, 3H) 6.08 (m, 1H) 8.07 (s, 1H). MS (M+1): 326.1.
Zu einer Lösung von 6-Chlor-8-cyclopentyl-4-methyl-2-methansulfmyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on (0,325 g, 1,00 mmol) in Acetonitril (3 ml) und DMF (5 Tropfen) wurden Triethylamin (0,29 ml, 2,09 mmol) und 4-Amino-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester-Hydrochlorid (0,38 g, 2,00 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde für 2 Tage bei 120°C erhitzt, dann abgekühlt, und das Acetonitril wurde unter reduziertem Druck entfernt, wodurch 1 g eines rohen Feststoffs erhalten wurde. Das Rohrprodukt wurde an Silicagel unter Flution mit einem Gradienten von 100% Hexane zu 100% Ethylacetat chromatographiert. Um weitere Verunreinigungen zu entfernen, wurde die Verbindung in Ether aufgenommen, filtriert und getrocknet, wodurch 45 mg der Titelverbindung erhalten wurden.
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ ppm 1.64 (m, 2H) 1.87 (m, 2H) 2.06 (m, 2H) 2.34 (m, 2H) 2.60 (s, 3H) 3.82 (s, 3H) 3.94 (s, 3H) 6.00 (m, 1H) 6.94 (m, 1H) 7.15 (m, 1H) 7.88 (s, 1H). MS (M+1): 416.1.
Beispiel 30: 4-(6-Chlor-8-ethyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester.
Die Titelverbindung von Beispiel 30 wurde in einer Weise analog zu Beispiel 29 synthetisiert.
Beispiel 31: 4-(6-Chlor-8-ethyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Die Titelverbindung von Beispiel 31 wurde in einer zu Beispiel 29 analogen Weise synthetisiert, gefolgt von einem Esterhydrolyseschritt, der wie in Beispiel 15 durchgeführt wurde.
Beispiel 32: 4-[6-Brom-8-(2-methoxyethyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyI-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Die Titelverbindung von Beispiel 32 wurde in einer zu Beispiel 31 analogen Art durch Ersetzen von N-Chlorsuccinimid durch N-Bromsuccinimid synthetisiert.
Beispiel 33: 4-[6-Brom-8-(4-methoxybenzyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methy1-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Die Titelverbindung von Beispiel 33 wurde in einer zu Beispiel 32 analogen Weise synthetisiert.
Beispiel 34: 4-[6-(3-Benzyloxyphenyl)-8-(2-methoxyethyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester.
Zu einer Lösung von 6-Brom-8-(2-methoxyethyl)-4-methyl-2-methylsulfanyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on (0,665 g, 1,93 mmol) in Methanol (3,6 ml) und Toluol (3,6 ml) wurden Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (0,089 g, 0,077 mmol) und gesättigte Natriumcarbonatlösung (3,6 ml) und 3-Benzyloxyphenylboronsäure (0,485 g, 2,12 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 19 Stunden auf 110°C erhitzt. Das rohe Produkt wurde an Silicagel unter Flution mit einem Gradienten von 0% Ethylacetat bis 50% Ethylacetat/50% Hexan chromatographiert, wobei 0,705 g, 82% Ausbeute, der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden.
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ ppm 2.63 (s, 3H) 2.68 (s, 3H) 3.39 (m, 3H) 3.76 (t, J=6.20 Hz, 2H) 4.76 (t, J=6.22 Hz, 2H) 5.12 (s, 2H) 7.01 (qd, J=8.06, 2.44, 0.98 Hz, 1) 7.27 (t, J=1.71 Hz, 1H) 7.33 (m, 2 H) 7.38 (m, H) 7.46 (m, 2H) 7.83 (s, 1H). MS (M+1): 448.1.
Zu einer Lösung von 6-(3-Benzyloxyphenyl)-8-(2-methoxyethyl)-4-methyl-2-methylsulfanyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on (0,705 g, 1,52 mmol) in Chloroform (15 ml) wurde M-CPBA (m-Chlorperoxybenzoesäure: 0,375 g, 1,67 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 2,5 h gerührt und durch HPLC überwacht. Die Reaktion wurde mit gesättigter Natriumcarbonatlösung gequencht, und die organische Schicht wurde gesammelt. Die organische Schicht wurde zweimal mit einer gesättigten Natriumcarbonatlösung und dann einmal mit Kochsalzlösung extrahiert. Das Gemisch wurde dann mit Magnesiumsulfat getrocknet, wodurch 0,666 g Produkt erhalten wurden.
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ ppm 2.92 (s, 3H) 2.92 (s, 3H) 3.3] (s, 3H) 3.73 (td, J=5.68, 1.83 Hz, 2H) 4.75 (q, J=5.62 Hz, 2H) 5.06 (s, 2H) 7.00 (qd, J=8.30, 2.68, 0.98 Hz, 1H) 7.21 (m, 1H) 7.28 (m, 2H) 7.34 (m, 3H) 7.40 (m, 2 H) 7.87 (s, 1). MS (M+1): 464.1.
Zu einer Lösung von 6-(3-Benzyloxyphenyl)-2-methansulfinyl-8-(2-methoxyethyl)-4-methyl-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-on (0,300 g, 0,647 mmol) in Acetonitril (2 ml) und DMF (1 ml) wurden Triethylamin (0,225 ml, 1,62 mmol) und 4-Amino-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester-Hydrochlorid (0,248 g, 1,3 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde für 24 h auf 135°C, dann für 65 h auf 120°C erhitzt, dann gekühlt, und das Acetonitril wurde unter reduziertem Druck unter Erhalt eines rohen Feststoffs entfernt. Das rohe Produkt wurde an Silicagel mit Dichlormethan, dann 20% THF/80% Dichlormethan chromatographiert, wodurch 40 mg der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden.
¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ ppm 2.55 (s, 3H) 3.35 (s, 3H) 3.72 (t, J=6.83 Hz, 2H) 3.77 (s, 3H) 3.90 (s, 3H) 4.66 (m, 2 H) 5.06 (s, 2H) 6.74 (d, J=1.95 Hz, 1H) 6.92 (qd, J=8.30, 2.68, 0.98 Hz, 1H) 7.00 (m, 1H) 7.19 (s, 2H) 7.21 (t, J=1.22 Hz, 1H) 7.27 (m, 2H) 7.32 (m, 2H) 7.40 (m 1H) 7.74 (s 1H). MS (M+1): 554.1.
Beispiel 35: 4-[6-(3-Benzyloxyphenyl)-8-(4-fluorbenzyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure. Die Titelverbindung von Beispiel 35 wurde in einer zu Beispiel 34 analogen Art, gefolgt von einem Esterhydrolyseschritt, wie er in Beispiel 15 durchgeführt worden war, synthetisiert.
Beispiel 36: 4-[8-(4-Methoxybenzyl)-4,6-dimethyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Zu einer Lösung von 4-[6-Brom-8-(4-methoXybenzyl)-4-methyI-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsauremethylester (0,190 g, 0,370 mmol) in DMF (4 ml) wurden Kupferiodid (6 mg, 0,0555 mmol), PdCl₂(PPh₃)₂ (0,019 g, 0,0278 mmol) und Tetramethylzinn (0,103 ml, 0,740 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 17,5 Stunden bei 100°C erhitzt. Das Rohprodukt wurde an Silicagel unter Flution mit einem Gradienten von 40% Ethylacetat/60% Hexane zu 60% Ethylacetat/40% Hexan chromatographiert, wodurch der 4-[8-(4-Methoxybenzyl)-4,6-dimethyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester als Feststoff (0,050 g, 30% Ausbeute) erhalten wurde.
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ ppm 2.15 (d, J=1.22 Hz, 3H) 2.53 (s, 3H) 3.68 (s, 3H) 3.74 (s, 3H) 3.76 (s, 3H) 5.50 (s, 2H) 6.72 (s, 1H) 6.73 (m, 2H) 6.83 (s, 1H) 7.26 (m, 2H) 7.52 (d, J=1.22 Hz, 1H). MS (M+1): 448.1.
Zu einer Lösung von 4-[8-(4-Methoxybenzyl)-4,6-dimethyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester (0,049 g, 0,109 mmol) und THF (15 ml) wurde eine Lösung von 1M Natriumhydroxid (0,22 ml, 0,218 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 1,5 h refluxiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser gegossen, und 1M Salzsäure wurde zugesetzt, bis ein pH von 5 erreicht war. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und der Filterkuchen mit Wasser gewaschen. Der Feststoff wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 0,39 g, 83% Ausbeute, erhalten wurden.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-D6): δ ppm 2.09 (s, 3H) 2.55 (s, 3H) 3.66 (s, 3H) 3.70 (s, 3H) 5.49 (s, 2H) 6.77 (s, 1H) 6.81 (d, J=8.78 Hz, 2H) 7.11 (m, 2H) 7.33 (m, 1H) 7.89 (s, 1H). MS (M-1): 432.1.
Beispiel 38: 4-[8-Cyclohexyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure. Die Titelverbindung von Beispiel 38 wurde in einer zu Beispiel 15 analogen Art synthetisiert.
Intermediat 12: 4-Amino-1-benzyl-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester. Eine Lösung von Ethyl-4-nitropyrrol-3-carboxylat (4,0 g, 21,7 mmol) in DMF (70 ml) wurde portionsweise mit NaH (0,57 g, 23,9 mmol) behandelt und über einen Zeitraum von 20 Minuten rühren gelassen. Das Gemisch wurde mit Benzylbromid (3,09 ml, 26 mmol) behandelt, für 18 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, dann wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt.

Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst, mit 1N NaOH und 1N HCl extrahiert, über MgSO₄ getrocknet und zur Trockene konzentriert, wodurch 4-Nitro-1-benzyl-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester erhalten wurde (5,2 g). Das Rohprodukt (2,5 g, 9 mmol) wurde dann in THF/Methanol (50 ml/50 ml) gelöst und mit RaNi (0,5 g) bei 51 psi Wasserstoffgas behandelt. Das Gemisch wurde gerührt, bis die Wasserstoffgasaufnahme gestoppt war, und dann wurde der RaNi-Katalysator durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, so dass die Titelverbindung erhalten wurde, 2,2 g.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-D6): δ ppm 1.2 (t, J=7.1 Hz, 3H) 4.1 (q, J=7.1 Hz, 2H) 5.4 (s, 2H) 6.3 (s, 1H) 6.5 (s, 1H) 7.0 (d, J=6.8 Hz, 2H) 7.2 (m, 1H) 7.3 (d, J=7.6 Hz, 2H).

Beisp.	Massenspektrum	¹H NMR²
1	410	1.5 (s, 5H) 1.6 (s, 5H) 1.8 (s, 2H) 2.4 (s, 2H) 2.5 (s, 3H) 3.7 (s, 4H) 3.8 (s, 4H) 5.6 (s, 1H) 6.2 (d, J=9.5 Hz, 1H) 7.1 (s, 1H) 7.2 (s, 1H) 7.8 (d, J=9.5 Hz, 1H) 9.9 (s, 1H)
²	432,2 M-1=430,2	1.23 (t, J=7.1 Hz), 1.74 (d, J= 7.1 Hz, 3H), 2.51 (s, 3H), 3.29 (s, 3H), 4.11-4.2] (m, 2H), 6.27 (d, J=9.5 Hz, 1H), 6.46-6.52 (m, 1H), 6.89 (s, 1H), 7.22-7.35 (m, 5H), 7.60 (s, 1H), 7.89 (d, J=9.5 Hz, 1H), 10.03 (s, 1H)
3	354	0.7 (s, 2H) 12 (s, 2H) 2.5 (s, 3H) 2.9 (s, 1H) 3.7 (s, 3H) 3.8 (s, 3H) 6.2 (d, J=9.5 Hz, 1H) 7.0 (s, 1H) 7.6 (s, 1H) 7.9 (d, J=9.5 Hz, 1H) 10.0 (s, 1H)
4	368	1.7 (m, 1H) 1.9 (m, 2H) 2.1 (m, 2H) 2.5 (s, 3H) 3.1 (m, 1H) 3.7 (s, 3H) 3.8 (s, 3H) 5.9 (m, 1H) 6.2 (d, J=9.5 Hz, 1H) 7.1 (s, 1H) 7.2 (s, 1H) 7.9 (d, J=9.5 Hz, 1H) 9.9 (s, 1H)
5	398	1.5 (s, 2H) 2.6 (s, 3H) 2.9 (m, 1H) 3.5 (m, 2H) 3.7 (s, 3H) 3.8 (s, 3H) 4.0 (m,
6	396	2H) 5.6 (m, 1H) 5.7 (s, 1H) 6.2 (s, 2H) 7.9 (d, J=9.8 Hz, 2H) 10.0 (s, 1H) 1.2 (m, 3H) 1.4 (m, 2H) 1.5 (m, 2H) 1.7 (m, 2H) 1.8 (m, 2H) 2.5 (s, 3H) 3.7 (s, 3H) 3.8 (s, 3H) 5.5 (m, 1H) 6.2 (s, 1H) 7.1 (s, 1H) 7.9 (d, J=9.5 Hz, 1H) 10.0 (s, 1H)
7	500	1.2 (d, J=14.2 Hz, 3H) 1.3-1.6 (m, 10H) 2.4 (m, 2H) 2.5 (s, 3H) 4.1 (q, J=7.2 Hz 2H, 2H) 5.6 (m, 3H) 62 (d, J=9.0 Hz, 1H) 7.0 (m, 2H) 7.0 (s, 1H) 7.2 (m, 1H) 7.3 (m, 2H) 7.4 (s, 1H) 7.9 (d, J=9.3 Hz, 1H)
8	382,2 M-1=380,2	0.02 (m, 2H) 0.41 (d, J=8.30 Hz, 2H) 0.80 (dd, J=7.81, 3.17 Hz, 1H) 155 (m, 2H) 2.55 (s, 3H) 3.72 (s, 3H) 3.87 (s, 3H) 4.38 (m, 2H) 6.29 (d, J=9.52 Hz, 1H) 7.01 (s, 1H) 7.34 (s, 1H) 7.94 (d, J=9.76 Hz_' 1H) 10.00 (s, 1H)
9	400	1.6 (s, 3H) 1.8 (s, 3H) 1.9 (s, 3H) 2.2 (m, 5H) 25 (s, 4H) 3.6 (m, 1H) 3.7 (s, 7H) 18 (s, 4H) 3.9 (s, 3H) 6.0 (s, 2H) 7.0 (8, 1H) 7.1 (s, 1H) 7.9 (d, J=10.2 Hz, 2H) 8.2 (s, 1H) 9.8 (s, 1H) 9.9 (s, 1H)
10	430	12-1.5 (m, 5H) 2.2 (m, 1H) 25 (s, 3H) 3.2 (t, J=11.0 Hz, 2H) 3.7 (s, 3H) 3.8 (m, 4H) 4.3 (d, J=7.1 Hz, 2H) 7.1 (s, 1H) 72 (s, 1H) 8.0 (d, J=10.5 Hz, 1H) 10.0 (s, 1H)
11	444	1.4 (m, 2H) 1.6 (m, 2H) 2.0 (m, 2H) 2.5 (s, 3H) 2.8 (m, 2H) 3.3 (d, J=15.1 Hz, 3H) 3.5 (m, 1H) 3.7 (s, 3H) 3.8 (s, 3H) 5.5 (m, 1H) 7.1 (d, J=13.9 Hz, 2H) 7.9 (d, J=10.2 Hz, 1H) 10.0 (s, 1H)
12	491	1.2 (m, 4H) 15 (s, 2H) 1.7 (s, 2H) 1.9 (s, 2H) 2.1 (s, 1H) 22 (s, 2H) 2.5 (s, 6H) 4.2 (m, 2H) 5.6 (s, 2H) 5.9 (s, 1H) 7.1 (s, 1H) 7.3 (d, J=4.9 Hz, 2H) 7.4 (m, 2H) 7.9 (d, J=10.2 Hz, 1H) 8.4 (s, 1H) 8.4 (s, 1H) 10.0 (s, 1H)
13	504	1.2 (t, J=7.1 Hz, 3H) 1.4 (s, 2H) 1.7 (d, J=10.2 Hz, 4H) 1.9 (s, 2H) 2.1 (s, 2H) 2.5 (s, 3H) 42 (m, 2H) 6.0 (s, 1H) 65 (s, 1H) 7.0 (s, 1H) 7.1 (s, 2H) 72 (d, J=7.3 Hz, 1H) 7.3 (s, 2H) 75 (s, 1H) 7.9 (d, J=10.2 Hz, 1H) 10.0 (s, 1H)
14	424	1.2 (t, J=7.4 Hz, 3H) 1.6-1.8 (m, 10H) 2.4 (s, 1H) 2.9 (q, J=7.6 Hz, 2H) 3.7 (s, 3H) 18 (s, 3H) 5.7 (m, 1H) 6.2 (s, 1H) 7.1 (s, 1H) 7.2 (s, 1H) 7.9 (d, J=9.5 Hz, 1H) 9.9 (s, 1H)
15	396	1.5 (s, 5H) 1.6 (s, 4H) 1.7 (s, 2H) 2.4 (s, 2H) 2.5 (s, 8H) 2.6 (s, 1H) 3.3 (s, 3H) 5.6 (s, 1H) 6.2 (m, 1H) 6.9 (s, 1H) 7.2 (s, 1H) 7.8 (d, J=9.5 Hz, 1H) 9.9 (m, 1H)
16	404,2 M-1=402,2	1.74 (d, J=7.1 Hz, 3H), 2.51 (s, 3H), 3.34 (s, 3H), 6.26 (d, J= 9.5 Hz, 1H), 6.54-6.59 (m, 1H), 6.83 (s, 1H), 7.22-7.35 (m, 5H), 755 (s, 1H), 7.90 (d, J=9.5 Hz, 1H), 10.00 (s, 1H), 12.21 (bs, 1H)
17	346	0.9 (m, 3H) 1.5-1.8 (m, 5H) 2.2 (m, 1H) 2.5 (s, 3H) 3.8 (s, 3H) 5.5 (m, 1H) 6.2 (d, J=95 Hz, 1H) 72 (m, 2H) 7.8 (d, J=9.5 Hz, 1H) 9.9 (s, 1H) 122 (s, 1H)
18	340	0.7 (s, 2H) 1.2 (s, 1H) 1.3 (s, 1H) 2.5 (m, 10H) 2.9 (s, 1H) 3.8 (s, 3H) 6.2 (d, (s, 1H) J=9.5 Hz, 1H) 7.0 (s, 1H) 7.5 (s, 1H) 7.9 (d, J=9.8 Hz, 1H) 9.9 (s, 1H) 12.1
19	384	1.5 (d, J=19.5 Hz, 2H) 2.5 (s, 3H) 2.9 (m, 2H) 3.5 (t, J=12.0 Hz, 2H) 3.8 (s, 3H) 4.0 (d, J=8.5 Hz, 2H) 5.7 (m, 1H) 6.2 (d, J=9.5 Hz, 1H) 6.9 (m, 2H) 7.9 (d, J=9.5 Hz, 1H) 9.9 (s, 1H) 12.2 (s, 1H)
20	410	1.1 (m, 2H) 1.2 (t, J=12.2 Hz, 2H) 15-1.8 (m, 911) 2.6 (m, 2H) 2.9 (m, 2H) 3.3 (s, 3H) 5.3 (m, 1H) 6.3 (d, J=9.3 Hz, 1H) 7.4 (m, 1H) 7.6 (d, J=7.8 Hz, 1H) 8.0 (m, 1H) 10.1 (s, 1H) 13.0 (s, 1H)
21	354	1.7 (m, 1H) 1.9 (m, 1H) 2.1 (m, 2H) 2.6 (s, 3H) 3.1 (m, 2H) 3.8 (s, 3H) 5.9 (m, 1H) 6.2 (d, J=9.5 Hz, 1H) 7.0 (s, 1H) 7.2 (s, 1H) 7.9 (d, J=9.5 Hz, 1H) 9.8 (s, 1H) 12.2 (s, 1H)
22	424	1.3 (d, J=6.6 Hz, 6H) 1.5 (m, 4H) 1.6 (m, 5H) 1.7 (m, 2H) 2.4 (m, 2H) 25 (s, 3H) 5.4 (m, 1H) 5.6 (m, 1H) 6.1 (d, J=8.8 Hz, 1H) 7.1 (s, 1H) 7.2 (s, 1H) 7.8 d, J=9.5 Hz, 1H) 9.9 (s, 1H)
23	396	1.6 (s, 5H) 1.7 (s, 2H) 2.1 (s, 4H) 2.3 (s, 2H) 25 (s, 4H) 4.8 (s, 3H) 5.5 (s, 1H) 62 (s, 2H) 6.6 (s, 1H) 7.0 (s, 1H) 7.8 (d, J=9.5 Hz, 2H) 8.6 (s, 1H) 12.9 (s, 1H)
24	386	1.6 (m, 2H) 1.8 (m, 2H) 1.9 (m, 2H) 2.2 (m, 2H) 2.5 (s, 3H) 3.8 (s, 3H) 5.9 (m, 1H) 6.9 (s, 1H) 7.1 (s, 1H)7.9 (d, J=10.2 Hz, 1H) 9.9 (s, 1H) 12.1 (s, 1H)
25	402	1.5 (d, J=13.9 Hz, 2H) 2.5 (s, 313) 2.9 (m, 2H) 3.5 (1, J=10.2 Hz, 2H) 3.8 (s, 3H) 4.0 (m, 2H) 5.7 (m, 1H) 7.0 (s, 1H) 7.2 (s, 1H) 7.9 (d, J=10.2 Hz, 1H) 9.9 (s, 1H) 12.2 (s, 1H)
26	416	1.3 (d, J=11.2 Hz, 3H) 1.4 (d, J=10.0 Hz, 3H) 22 (s, 2H) 25 (s, 6H) 3.1 (m, 4H) 3.2 (s, 1H) 3.8 (d, J=19.8 Hz, 8H) 4.2 (s, 3H) 7.0 (s, 1H) 7.2 (s, 1H) 7.9 (d, J=10.2 Hz, 1H) 9.9 (s, 1H) 12.2 (s, 1H)
27	430	1.4 (d, J=7.6 Hz, 2H) 1.6 (m, 2H) 2.0 (d, J=13.9 Hz, 213) 25 (s, 3H) 2.8 (m, 2H) 3.3 (s, 3H) 3.4 (s, 1H) 3.8 (s, 3H) 5.6 (m, 1H) 7.1 (m, 2H) 7.9 (d, J=10.2 Hz, 1H) 9.9 (s, 1H)
28	476	1.4 (s, 2H) 1.6 (s, 1H) 1.7 (d, J=7.1 Hz, 4H) 1.9 (s, 2H) 2.2 (s, 2H) 2.5 (s, 3H) 3.3 (s, 3H) 6.0 (s, 1H) 6.6 (s, 1H) 6.9 (s, 1H) 7.1 (s, 2H)7.2 (s, 1H) 7.3 (s, 2H) 7.5 (s, 1H) 7.9 (d, J=10.2 Hz, 1H) 9.9 (s, 1H) 12.3 (s, 1H)
29	416,1	1.64 (m, 2H) 1.87 (m, 2H) 2.0 (m, 2H) 234 (m, 2H) 2.60 (s, 3H) 3.82 (s, 3H) 3.94 (s, 3H) 6.00 (m, 1H) 6.94 (m, 1H) 7.15 (m, 1H) 7.88 (s, 1H).
30	376,1	1.29 (t, J=6.95 Hz, 3H) 2.55 (s, 3H) 3.72 (s, 3H) 3.85 (s, 3H) 4.39 (d, J=7.08 Hz, 2H) 6.98 (s, 1H) 7.34 (s, 1H) 8.27 (s, 1H).
31	362,0 M-1=360,1	1.28 (t, J=6.83 Hz; 3H) 2.48 (s, 3H) 3.83 (s, 3H) 4.38 (q, J=6.59 Hz, 2H) 6.93 (s, 1H) 7.30 (s, 1H) 8.26 (s, 1H) 10.10 (s, 1H)
32	438,0	2.51 (s, 3H) 3.22 (s, 3H) 3.59 (t, J=6.47 Hz, 2H) 3.78 (s, 3H) 4.49 (t, J=6.10 Hz, 2H) 6.78 (s, 1H) 7.37 (s, 1H) 8.39 (s, 1H) 10.09 (s, 1H)
33	500,0 M-1=498,0	2.57 (s, 3H) 3.66 (s, 3H) 3.70 (s, 3H) 5.52 (s, 2H) 6.79 (s, 1H) 6.82 (d, J=8.78 Hz, 2H) 7.07 (s, 1H) 7.15 (d, J=8.54 Hz, 2H) 8.49 (s, 1H)10.08 (s, 1H)
34	554,2 M-1=552,2	2.5 (s, 3H) 3.4 (s, 3H) 3.7 (m, 2H) 3.8 (s, 3H) 3.9 (s, 3H) 4.7 (m, 2H) 5.1 (s, 2H) 6.7 (d, J=2.0 Hz, 1H) 6.9 (m, 1H) 7.2 (m, 1H) 7.3 (m, 3H) 7.3 (m, 5H) 7.7 (s, 1H)
35	590,2 M-1=588,2	2.59 (s, 3H) 3.67 (s, 3H) 5.09 (s, 2H) 5.55 (s, 2H) 6.75 (s, 1H) 6.95 (m, 1H) 7.04 (m, 3H) 7.27 (m, 4H) 7.34 (m, 3H) 7.41 (s, 1H) 7.43 (d, J=1.46 Hz, 1H) 8.04 (s, 1H) 9.97 (s, 1H)
36	432,1	2.09 (s, 3H) 2.55 (s, 3H) 3.66 (s, 3H) 3.70 (s, 3H) 5.49 (s, 2H) 6.77 (s, 1H) 6.81 (d, J=8.78 Hz, 2H) 7.11 (m, 2H) 7.33 (m, 1H) 7.89 (s, 1H)
37	436,1	1.15 (t, J=7.20 Hz, 3H) 2.50 (m, 2H) 2.57 (s, 3H) 3.70 (s, 3H) 5.54 (s, 2H) 6.76 (s, 1H) 7.01 (m, 1H) 7.08 (t, J=9.03 Hz, 2H) 7.23 (m, 2H) 7.81 (s, 1H).
38	382	1.2-1.8 (m, 10H) 2.6 (s, 3H) 3.8 (s, 5H) 5.5 (m, 3H) 6.2 (d, J=95 Hz, 1H) 7.0 (s, 1H) 7.1 (s, 1H) 7.8 (d, J=9.5 Hz, 1H) 9.9 (s, 1H) 12.2 (s, IN)

¹ M+1, außer wenn als M-1 angegeben.
² 400 MHz, DMSO-D6, 6 ppm, außer für Beispiele 29 und 34, bei denen 400 MHz, CHCl₃, δ ppm

BIOLOGISCHES BEISPIEL 1
Protokoll für die PI3Kγ-Proteinexpression und -reinigung
Spodtera frugiperda-Zellen, die in ESF921-Medium gewachsen waren, wurden mit Baculovirus, das ein Glu-taggiertes p101 exprimiert, und Baculovirus, das ein HA-taggiertes p110γ exprimiert, in einem 3:1-Verhältnis von p101-Baculovirus zu p110γ-Baculovirus co-infiziert.
Sf9-Zellen wurden zu 1 × 10⁷ Gesamtzellen/ml in 101-Bioreaktoren wachsen gelassen und 48– 72 Stunden nach der Infektion geerntet. Proben infizierter Zellen wurden dann auf Expression von p101/p110γ-PI3-Kinase durch Immunpräzipitation und Western Blot-Analyseverfahren (siehe unten) getestet.
Um PI3Kγ zu reinigen, wurden 4 Volumina an hypotonischem Lysepuffer mit Raumtemperatur (1 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 5 mM EGTA, 1 mM Pefabloc, 0,5 μM Aprotinin, 5 μM Leupeptin, 5 μM Pepstatin, 5 μM E64, pH 8) pro Gramm Zellpaste unter Rühren auf gefrorene Zellpellets gegossen, dann wurde in einer Stickstoff-"Bombe" bei 400 psi (599HC T316, Parr Instrument Co, Moline, IL) lysiert. NaCl wurde zu 150 mM zugesetzt, und Natriumcholat wurde zu 1% zugesetzt, und es wurde für weitere 45 Minuten gemischt. Die Lysate wurden durch Zentrifugation bei 14.000 UpM für 25 Minuten geklärt. Die Lysate wurden dann auf Anti-Gluverknüpftes Protein-G-Sepharose-Perlen (Covance Research Products, Richmond, CA) aufgebracht, wobei 20 ml Harz/50 g Zellpaste verwendet wurden. Die Säule wurde mit 15 Volumina Waschpuffer (1 mM DTT, 0,2 mM EGTA, 1 mM Pefabloc, 0,5 μM Aprotinin, 5 μM Leupeptin, 2 μM Pepstatin, 5 μM E64, 150 mM NaCl, 1% Natriumcholat, pH 8) gewaschen. PI3Kγ wurde mit 6 Säulenvolumina Waschpuffer, der 100 μg/ml eines Peptids enthält, das für eine Bindung des Glu-Tags im Wettbewerb steht, eluiert. Die Säulenfraktionen mit dem eluierten Protein (bestimmt durch Aufnehmen von OD₂₈₀-Ablesungen) wurden gesammelt und in 0,2 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM Pefabloc, 5 μM Leupeptin, 0,5% Natriumcholat, 150 mM NaCl und 50% Glycerin, pH 8, dialysiert. Die Fraktionen wurden bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert.
BIOLOGISCHES BEISPIEL 2
G-Protein-Untereinheiten-Expression
Spodtera frugiperda-Zellen wurden mit Baculovirus, das ein Glu-taggiertes G-Protein-β₁ exprimiert, und Baculovirus, das ein G-Protein-β₂ exprimiert, in einem Verhältnis von 1:1 für Glu-taggiertes G-Protein-β₁-Baculovirus zu G-Protein-β₂-Baculovirus co-infiziert. Sf9-Zellen werden in 10 1-Bioreaktoren wachsen gelassen und 48–72 Stunden nach der Infektion geerntet. Proben der infizierten Zellen wurden auf G-Protein-β₁/β₂-Expression durch Western Blot-Analyse, wie unten beschrieben, getestet. Zelllysate wurden homogenisiert und auf eine Säule aus Glu-taggierten Perlen wie in Biologischem Beispiel 1 aufgebracht und mit einem Glu-Peptid aus der Säule eluiert und wie in Biologischem Beispiel 1 beschrieben prozessiert.
BIOLOGISCHES BEISPIEL 3
Western Blot-Analyse
Proteinproben wurden an einem 8% Tris-Glycin-Gel laufen gelassen und auf eine 45 μM-Nitrocellulosemembran transferiert. Die Blots wurden dann mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) und 5% Ovalbumin in TEST (50 mM Tris, 200 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,4) für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert und über Nacht bei 4°C mit primärem Antikörper, verdünnt 1:1000 in TEST mit 0,5% BSA, inkubiert. Die primären Antikörper für die p110γ-, p110α-, p110β-, p85α-, G-Protein-β₁- und G-Protein-γ₂-Untereinheiten wurden von Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, bezogen. Die p101-Untereinheit-Antikörper wurden bei Research Genetics, Inc., Huntsville, AL, basierend auf einem p101-Peptid-Antigen, entwickelt.
Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper wurden die Blots in TEST gewaschen und für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit Ziege-anti-Kaninchen-HRP-Konjugat (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, Produkt-Nr. 170-6515), verdünnt 1:10.000 in TEST mit 0,5% BSA, inkubiert. Die Antikörper wurden mit ECL^TM-Detektionsreagentien (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, New Jersey) detektiert und mit einem Kodak ISO400E-Scanner quantifiziert.
BIOLOGISCHES BEISPIEL 4
Immunpräzipitation
100 μl Zellpaste aus dem Biologischen Beispiel 1 oder 2 wurde aufgetaut und auf Eis mit 400 μl hypotonischem Lysepuffer (25 mM Tris, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM Pefabloc, 5 μM Leupeptin, 5 μM E64 (Roche), 1% Nonidet P40, pH 7,5-8) lysiert. Das Lysat wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit Glu-taggierten Perlen (Covance Research Products, Cambridge, England, Produkt-Nr. AFC-115P) inkubiert. Die Perlen wurden dreimal in Waschpuffer (20 mM Tris, pH 7,8-8, 150 mM NaCl, 0,5% NP40) gewaschen, und das Protein wurde durch Erwärmen in zweifachem Probenpuffer (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Produkt Nr. LC 1676) eluiert.
BIOLOGISCHES BEISPIEL 5
PI3Kγ-in-vitro-Kinase-Assay

Die inhibitorischen Eigenschaften der Verbindungen in Tabelle 1 wurden in einem in vitro-POI3K-Assay untersucht. In eine Polypropylenplatte mit 96 Wells wurde in jedes Well 2 μl mit 50facher Konzentration der gewünschten Endkonzentration an Verbindung in DMSO getüpfelt. Gereinigte rekombinante p101/p110γ-Protein- (0,03 μg, ~2,7 nM) und G-Proteinβ₁/γ₂-Untereinheiten (0,09 μg, ~57,7 nM) für jede Reaktion wurden in Assaypuffer (30 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA und 1 mM DTT) kombiniert. ATP und [γ-³²P-ATP] (0,09 μCi) wurden dem Gemisch zugesetzt, so dass die End-ATP-Konzentration in der Reaktion 20 μM war. Lipidmicellen wurden durch Beschallung von Phosphatidylinositol-4,5-diphosphat (PIP₂), Phosphatidylethanolamin (PE) und Na-Cholat in Assaypuffer für 10 Minuten, Zugeben von MgCl₂ und Inkubieren auf Eis für 20 Minuten für Endkonzentrationen von 25 μM PIP₂, 300 μM PE, 0,02% Na-Cholat und 10 mM MgCl₂ in der Reaktion gebildet. Die Reaktionen wurden gestartet, indem gleiche Volumina Lipid- und Enzymgemisch in einem Gesamtvolumen von 50 μl zugegeben wurden, für 20 Minuten bei Raumtemperatur laufen gelassen und mit 100 μl 75 mM H₃PO₄ gestoppt. Das Lipidprodukt wurde auf eine Glasfaser-Filterplatte transferiert und mehrmals mit 75 mM H₃PO₄ gewaschen. Das Vorliegen von radioaktivem Lipidprodukt (PIP₃) wurde gemessen, indem Wallac Optiphase-Mischung in jedes Well gegeben wurde und eine Zählung in einem Wallac 1450 Trilux-Plattenlesegerät (Perkin Elmer Life Sciences Inc., Boston, MA 02118) durchgeführt wurde. Der IC₅₀-Wert für jede getestete Verbindung ist in μM in Tabelle 2 angegeben: TABELLE 2

Beispiel	IC₅₀ (μM)	Beispiel	IC₅₀ (μM)
1	0,025	20	1,595
2	0,063	21	0,055
3	0,0180	22	0,035
4	0,013	23	1,085
5	0,024	24	0,009
6	0,004	25	0,040
7	0,036	26	0,025
8	0,012	27	0,019
9	0,012	28	0,015
10	0,008	29	0,006
11	0,005	30	0,002
12	0,004	31	0,005
13	0,160	32	0,005
14	1,442	33	0,017
15	0,033	34	0,305
16	0,148	35	0,340
17	0,180	36	0,047
18	0,185	37	0,056
19	0,034	38	0,021

BIOLOGISCHES BEISPIEL 6
CDK2/CyclinA-in-vitro-Kinase-Assay
Die inhibitorischen Eigenschaften der Verbindungen der Beispiele 19, 24 und 31 wurden in einem in vitro-CDK2/CyclinA-Assay mit 10 μM jeder Verbindung in DMSO untersucht. CDK2/CyclinA (5-20 mU, verdünnt in 50 mM Hepes, pH 7,5, 1 mM DTT, 0,02% Brij35, 100 mM NaCl) wurde gegen Histon H1 in einem Endvolumen von 25,5 μl, enthaltend 50 mM Hepes, pH 7,5, 1 mM DTT, 0,02% Brij35, 100 mM NaCl, Histon H1 (1 mg/ml), 10 mM Magnesiumacetat und 0,02 mM [³³P-γ-ATP] (500-1000 cpm/pmol) untersucht und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Assays wurden durch Zugabe von 5 μl 0,5 M (3%) Or thophosphorsäure gestoppt und dann auf P81 Unifilter-Platten geerntet und mit 50 mM Orthophosphorsäure gewaschen. Die Filterplatten wurden dann in einem Szintillationszähler gezählt.
Die Resultate in Tabelle 3 sind als Prozentwert der Kontrollen mit DMSO allein ausgedrückt (Mittelwert von Zweifachbestimmungen ± Standardabweichung vom Mittelwert). TABELLE 3

Beispiel % der DMSO-Kontrolle (Mittelwert ± S.A.)

19 101 ± 6

24 85 ± 9

31 104 ± 1
Es ist zu erkennen, dass die hierin beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen lediglich zu Erläuterungszwecken angeführt sind und dass verschiedene Modifikationen oder Änderungen daran einem Fachmann einfallen werden und dass diese im Rahmen der beigefügten Ansprüche enthalten sind.

Claims

Verbindung der Formel 1:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wobei: R⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Methyl, Ethyl, CF₃, CH₂F, CHF₂ und CH₂OH; R⁵ H oder Methyl ist; J nicht vorhanden ist oder ein C₁-C₆-Alkylen ist; R⁸ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: C₁-C₆-Alkyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heterocycloalkyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heteroaryl und Phenyl; R⁶ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: H, Halogen, Phenyl und C₁-C₃-Alkyl; R²
oder
ist; R¹⁰ C₁-C₆-Alkyl oder H ist; R¹² C₁-C₆-Alkyl oder C₁-C₃-Alkylen-R¹³ ist, R¹³ Pyridinyl oder Phenyl ist und R¹⁴ C₁-C₆-Alkyl oder H ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R⁴ Methyl ist, R⁵ H ist und R²
ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R¹² C₁-C₃-Alkylen-R¹³ ist und R⁸ C₁-C₆-Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei die Verbindung 4-(4,8-Dimethyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-(1-Phenyl-ethyl)-1H-pyrrol-2-carbonsäure ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R¹² C₁-C₃-Alkylen-R¹³ ist und R⁸ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: C₃-C₈-Cycloalkyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heterocycloalkyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heteroaryl und Phenyl.
Verbindung nach Anspruch 5, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: 4-(8-Cyclopentyl-6-fluor-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-pyridin-3-ylmethyl-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester; 4-(8-Cyclopentyl-6-fluor-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-(1-phenyl-ethyl)-1H-pyrrol-2-carbonsäure und 1-Benzyl-4-(8-cycloheptyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1H-pyrrol-2-carbonsäureethylester.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R¹² C₁-C₆-Alkyl ist und R⁸ C₁-C₆-Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 7, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: 4-(6-Chlor-8-ethyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester; 4-[6-Brom-8-(2-methoxy-ethyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure und 4-(6-Chlor-8-ethyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R¹² C₁-C₆-Alkyl ist und R⁸ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: C₃-C₈-Cycloalkyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heterocycloalkyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heteroaryl und Phenyl.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: 4-(8-Cyclohexyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-oarbonsuremethylester; 4-[6-Fluor-8-(4-methoxy-cyclohexyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester; 4-[6-Fluor-4-methyl-7-oxo-8-(tetrahydro-pyran-4-ylmethyl)-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester; 4-(8-Cyclopentyl-6-fluor-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure; 4-(8-Cyclopentyl-6-fluor-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester; 4-[8-(2-Cyclopropyl-ethyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäuremethylester; 4-(8-Cyclobutyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-oarbonsuremethylester; 4-[6-Brom-8-(4-methoxy-benzyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure; 4-(8-Cyclopropyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino)-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäremethylester; 4-[6-Fluor-8-(4-methoxy-cyclohexyl)-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure und 4-[8-Cyclohexyl-4-methyl-7-oxo-7,8-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-ylamino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R⁴ Methyl ist und R²
Ist.
Verbindung nach Anspruch 11, wobei R⁸ C₁-C₆-Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 11, wobei R⁸ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: C₃-C₈-Cycloalkyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heterocycloalkyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heteroaryl und Phenyl.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine Verbindung nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer PI3K-vermittelten Erkrankung, wobei die PI3K-vermittelte Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Atemwegserkrankungen, Bronchitis, Asthma, chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung, rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, Entzündungserkrankungen, Autoimmunerkrankungen, kardiovaskulären Erkrankungen, Atherosklerose, Hypertonie, Thrombose der tiefen Venen, Schlaganfall, Myokardinfarkt, instabiler Angina, Thromboembolie, Lungenembolie, thrombolytischen Erkrankungen, akuter Arterienischämie, peripheren thrombotischen Okklusionen, Koronararterienerkrankung, Krebs, Brustkrebs, Glioblastom, Endometriumkarzinom, Leberzellenkarzinom, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Melanom, Nierenzellkarzinom, Schilddrüsenkarzinom, kleinzelligem Lungenkarzinom, Plattenepithelkarzinom der Lunge, Gliom, Brustkrebs, Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Cervixkrebs, Leukämie, Zelllymphom, lymphoproliferativen Störungen und Diabetes Typ II.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Störung bei Säugern, wobei die Störung ausgewählt ist aus Krebs, Brustkrebs, Glioblastom, Endometriumkrebs, Leberzellkarzinom, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Melanom, Nierenzellkarzinom, Schilddrüsenkarzinom, kleinzelligem Lungenkarzinom, Plattenepithelkarzinom der Lunge, Gliom, Brustkrebs, Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Cervixkrebs, Leukämie, Zelllymphom, lymphoproliferativen Störungen.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von rheumatoider Arthritis bei Säugern.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von chronischobstruktiver Lungenerkrankung bei Säugern.