DE60131749T2

DE60131749T2 - Aspartic endoproteinase

Info

Publication number: DE60131749T2
Application number: DE60131749T
Authority: DE
Inventors: Peter Bucheli; Maryse Laloi; James Mc Carthy
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 2000-07-11
Filing date: 2001-06-26
Publication date: 2008-11-06
Anticipated expiration: 2021-06-27
Also published as: PT1303621E; US6790650B2; US20050091715A1; AU2002218773A1; US7122366B2; US20080050470A1; DE60131749D1; EP1303621B1; US20030148417A1; ES2296823T3; WO2002004617A3; EP1303621A2; ATE380246T1; WO2002004617A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Endoproteinasen, die bei der Herstellung von Kakaoaroma bzw. -geschmack beteiligt sind und die für sie kodierende DNA. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Enzyme für die Herstellung eines Kakaoaromas.
Es ist bekannt, dass bei der Bearbeitung von Kakaobohnen die Erzeugung des typischen Kakaoaromas bzw. -geschmacks zwei Schritte erfordert – den Fermentierungsschritt, der ein Lufttrocknen des fermentierten Materials und den Röstschritt einschließt. Obwohl das Rösten die Schlüsselstufe für einen Erhalt von Kakaoaroma zu sein scheint, wird, wenn nicht fermentierte Bohnen einem Röstschritt unterzogen werden, kein Kakaoaroma erhalten, was nahe legt, dass während der Fermentationsschritts Vorläufer hergestellt werden, die für die Erzeugung des Aromas (Rohar J. Food Sci. 29 (1964), 456–459) essentiell sind.
Während der Fermentation können zwei Hauptaktivitäten beobachtet werden. Erstens, die Pulpa, die die Bohne umgibt, wird durch Mikroorganismen abgebaut, wobei die in der Pulpa beinhalteten Zucker größtenteils zu Säure, insbesondere Essigsäure (Quesnel et al. J. Sci. Food Agric. 16 (1965), 441–447, Ostovar and Keeney, J. Food. Sci. 39 (1973), 611–617) umgewandet werden. Die Säuren diffundieren langsam in die Bohnen und bewirken schließlich eine Ansäuerung des zellulären Materials. Zweitens, die Fermentation führt ebenfalls zu einer Freisetzung von Peptiden, die eine unterschiedliche Größe aufweisen und zu einer Erzeugung eines hohen Spiegels an hydrophoben freien Aminosäuren. Diese letztere Feststellung führte zu der Hypothese, dass eine während des Fermentationsschrittes auftretende Proteolyse nicht für eine zufällige Proteinhydrolyse verantwortlich ist, wobei sie jedoch vielmehr auf der Aktivität spezifischer Endoproteinasen (Kirchhoff et al., Food Chem. 31 (1989), 295–311) basiert. Dieses spezifische Gemisch von Peptiden und hydrophoben Aminosäuren wird als die für Kakao spezifischen Aroma- bzw. Geschmacksvorläufer darstellend angesehen.
Bisher wurden in Kakao mehrere proteolytische Enzymaktivitäten untersucht und auf deren mögliche Rolle bei der Bildung von Vorläufern eines Kakaoaromas überprüft.
Eine Aktivität der Asparagin-Endoproteinase, die optimal bei sehr geringem pH-Wert (pH-Wert 3,5) ist und durch Pepstatin A gehemmt wird, wurde identifiziert. Ein Polypeptid, das beschrieben wurde diese Aktivität aufzuweisen wurde isoliert und beschrieben zwei Peptide (29 und 13 kDa) zu beinhalten, von denen angenommen wird, dass sie durch Selbstverdau von einem 42 kDa Pro-Peptid (Voigt et al., J. Plant Physiol. 145 (1995), 299–307) abgeleitet wurden. Das Enzym spaltet Proteinsubstrate zwischen hydrophoben Aminosäureresten, um Oligopeptide mit hydrophoben Aminosäureresten an den Enden (Voigt et al., Food Chem. 49 (1994), 173–180) zu erzeugen. Untersuchungen bei die Reifung von pro2S-Albumin, Proglubin und Proricin ergaben, dass eine gereinigte Asparagin-Endopeptidase von Castorbohne bzw. Rizinussamen die Umwandlung der Pro-Proteine in deren reife Form nicht unmittelbar umwandeln kann, sondern dass das Enzym eine Rolle beim Trimmen der C-terminalen Pro-Peptide von den Untereinheiten (Hiraiwa et al., Eur. J. Biochem. 246 (1997), 133–141) spielen kann. Untersuchungen mit polyklonalen Antikörpern, die gegen die großen Untereinheiten der Asparagin-Endoprotease und das 7S Globulin von Kakaosamen gezüchtet wurden, ergaben, dass die zwei Untereinheiten der Asparagin-Endoprotease durch Selbstverdau (Voigt et al., J. Plant Physiol. 145 (1995), 299–307) abgeleitet wurden. Die polyklonalen Antikörper wurden weiterhin dazu verwendet, um die Akkumulation der Asparagin-Endoprotease und des globulären Speicherproteins der Vicilin-Klasse während der Entwicklung der Samen zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass die Menge von Asparagin-Endoprotease koordinativ mit dem Globulin der Vicilin-Klasse ansteigt. Während der ganzen Keimung bleibt deren Aktivität während der ersten Tage konstant und sinkt nicht vor dem Beginn des Globulin-Abbaus (Voigt et al., J. Plant Physiol. 145 (1995), 299–307). Ein Beispiel für eine Asparagin-Proteinase mit der Zugangsnummer VUU61396, die bei EMBL offenbart ist, worin die mRNA Sequenz einer Asparagin-Proteinase von Vigna unguiculata spezifiziert ist
Eine Aktivität einer Cystein-Endoproteinase wurde isoliert, die bei einem pH-Wert von 5 optimal ist. Es wird angenommen, dass diese enzymatische Aktivität nicht native Speicherproteine in nicht gekeimten Samen spaltet. Die Aktivität der Cystein-Endoproteinase steigt während des Keimungsvorgangs an, wenn der Abbau von globulärem Speicherprotein auftritt (Biehl et al., Cocoa Research Conference, Salvador, Bahia, Brasil, 17–23 Nov. 1996).
Außerdem wurde eine Aktivität einer Carboxypeptidase identifiziert, die durch PMSF gehemmt wird und folglich zu der Klasse der Serinproteasen gehört. Sie ist stabil gegenüber einem breiten pH-Wertbereich mit einer maximalen Aktivität bei pH-Wert 5,8. Dieses Enzym verdaut nicht native Proteine, sondern spaltet vorzugsweise hydrophobe Aminosäuren von dem Carboxy-Terminus von Peptiden. Folglich sind Peptide mit carboxyterminalem Arginin, Lysin oder Prolinresten scheinbar gegen einen Abbau resistent. Es wurde festgestellt, dass die Rate einer Hydrolyse nicht nur durch die carboxyterminalen Aminosäuren als solchen bestimmt wird, sondern ebenfalls durch die benachbarten Aminosäurereste (Bytof et al., Food Chem. 54 (1995), 15–21) beeinflusst wird.
In vitro Untersuchungen zeigten, dass essentielle Proteolyseprodukte von den (7S) Globulinen der Vicilin-Klasse der Kakaosamen durch eine kooperative Wirkung einer endogenen Asparagin-Endoprotease und einer Carboxypeptidase (Voigt et al., Botanica Acta 108 (1995), 283–293) abgeleitet sind. Diese Proteolyseprodukte zeigen wesentliche Vorläufer für die Bildung des spezifischen Kakaoaromas bzw. -geschmacks.
Es wurde festgestellt, dass während des zweiten Schrittes der Herstellung von Kakaoaroma – dem Röstschritt – die auf der Stufe der Fermentation erzeugten Oligopeptide und Aminosäuren offensichtlich mit vorhandenen reduzierenden Zuckern eine Maillard-Reaktion durchlaufen, die schließlich die Substanzen herstellt bzw. erzeugt, die für das Kakaoaroma als solchem verantwortlich sind. Diese Hypothese wurde in einem Experiment bestätigt, worin eine nach der Fermentation von Kakaobohnen isolierte Oligopeptidfraktion einem Rösten in der Anwesenheit von freien Aminosäuren und reduzierenden Zuckern ausgesetzt wurden, um Kakaoaroma (Mohr et al., Fette, Seifen, Anstrichmittel 73 (1971), 515–521 and 78 (1976), 88–95) zu erhalten.
Es wurde ebenfalls in einem Experiment ein spezifisches Kakaoaroma erhalten, worin ein aus nicht fermentierten reifen Kakaobohnen hergestelltes trockenes Acetonpulver (AcDP) einer Autolyse bei einem pH-Wert von 5,2 unterzogen wurde, gefolgt durch Rösten in der Anwesenheit von reduzierenden Zuckern. Es wurde angenommen, dass unter diesen Bedingungen vorzugsweise frei hydrophobe Aminosäuren und hydrophile Peptide erzeugt werden sollten, wobei das so erhaltene Peptidmuster dem von Extrakten von fermentierten Kakaobohnen ähnlich war. Eine Analyse von freien Aminosäuren zeigte, das Leu, Ala, Phe und Val die hauptsächlichen Aminosäuren darstellten, die aus fermentierten Bohnen oder durch Autolyse (Voigt et al., Food Chem. 49 (1994), 173–180) freigesetzt wurden. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen konnte kein spezifisches Kakaoaroma detektiert werden, falls AcDP einer Autolyse bei einem so niedrigen pH-Wert von 3,5 unterzogen wurde, dem pH-Wert, bei dem die bekannte Asparagin-Endoproteinase eine Aktivität aufweist. Es wurden lediglich einige freizusetzende freie Aminosäuren aufgefunden, wobei jedoch eine große Anzahl hydrophober Peptide gebildet wurde. Dies kann durch die Asparagin-Endoproteinase erklärt werden, die eine hohe Aktivität bei diesem pH-Wert aufweist, wobei unter diesen Bedingungen die Carboxypeptidase im Wesentlichen inaktiv ist. Werden Peptide, die nach der Autolyse von AcDP bei einem pH-Wert von 3,5 erhalten wurden mit einer Carboxypeptidase A aus dem Schweinepankreas bei einem pH-Wert von 7,5 inkubiert, dann werden vorzugsweise hydrophobe Aminosäuren freigesetzt. Das Muster von freien Aminosäuren und Peptiden war dem von fermentierten Kakaobohnen und bei den Proteolyseprodukten ziemlich ähnlich, die durch Autolyse von AcDP bei dem pH-Wert von 5,2 erhalten wurden. Wurden die Aminosäuren und Peptidgemische wie vorstehend geröstet, dann konnte ein Kakaoaroma erzeugt werden. Im Gegensatz dazu konnte mit einem synthetischen Gemisch von freien Aminosäuren alleine, deren Zusammensetzung ähnlich dem in fermentierten Bohnen aufgefundenen Spektrum war, nach dem Rösten kein Kakaoaroma detektiert werden, was anzeigt, dass sowohl die Peptide als auch die Aminosäuren für diesen Zweck (Voigt et al., Food Chem. 49 (1994), 173–180) bedeutsam sind.
Abgesehen von den Enzymen scheint ebenfalls die Proteinquelle der Peptide/Aminosäuren für die Erzeugung von Kakaoaroma von Bedeutung zu sein.
Während der Fermentation von Kakaobohnen beträgt die beobachtete prozentuale Verringerung der Proteinkonzentration für Vicilin und Albumin 88,8% beziehungsweise 47,4% (Amin et al., J. Sci. Food Agric. 76 (1998), 123–128). Wurden die durch eine Proteolyse der Globulinfraktion erhaltenen Peptide mit Carboxypeptidase nachbehandelt, dann wurden vorzugsweise hydrophobe Aminosäuren (Leu, Phe, Ala, Val, Tyr) freigesetzt und ein typisches Kakaoaroma wurde nach dem Rösten in der Anwesenheit von reduzierenden Zuckern (Voigt et al., Food Chem. 50 (1994), 177–184) detektiert. Dagegen waren die hauptsächlich freigesetzten Aminosäuren der von Albumin abgeleiteten Peptide Asparaginsäure, Glutaminsäure und Asparagin. Weiterhin wurde mit der Albuminfraktion kein Kakaoaroma detektiert. Folglich wurde geschlossen, dass spezifische Kakaoaroma-Vorläufer hauptsächlich von dem Vicilin ähnlichen Globulin von Kakaobohnen abgeleitet sind. Folglich scheint das Gemisch von hydrophoben Aminosäuren und verbleibenden Oligopeptiden, das für die Erzeugung der typischen Kakaoaromakomponenten erforderlich ist, durch die besondere chemische Struktur der Vicilin-Klasse der Globuline von Kakao bestimmt zu werden.
Es wurde ebenfalls festgestellt, dass diese Globuline, die von Kakaobohnen isoliert wurden, durch Pepsin (eine Asparagin-Endoproteinase) und Chymotrypsin (eine Serin-Endoproteinase) wirksam verdaut werden können. Produkte, die von Kakaoglobulinen durch einen erfolgreichen proteolytischen Verdau mit Pepsin und Carboxypeptidase A abgeleitet wurden, zeigten auf Rösten ein typisches, jedoch wenig ausgeprägtes Kakaoaroma. Es wurden durch Verdau von Globulinen mit Chymotrypsin und Carboxypeptidase A (Voigt et al., Food Chem. 51 (1994), 7–14) keine Kakaoaroma-Vorläufer erzeugt. Folglich wird das spezifische Gemisch von Oligopeptiden und hydrophoben freien Aminosäuren, das für die Bildung des typischen Kakaoaromas erforderlich ist, nicht nur durch die Struktur des Proteinsubstrats bestimmt, sondern ist ebenfalls von der Spezifität der Kakaoenzyme abhängig, die das Protein spalten.
Angesichts der vorstehend erwähnten Daten wurde ein hypothetisches Modell für die Erzeugung des Gemisches von Peptiden und Aminosäuren, d. h, der Kakaoaroma bzw. -geschmacks-Vorläufer während der Fermentation (1) vorgeschlagen. wobei in einem ersten Schritt, Peptide mit einer hydrophoben Aminosäure an deren Ende von Speicherproteinen gebildet werden, deren Peptide anschließend weiter abgebaut bzw. verdaut werden. Beim Abspalten von hydrophoben Aminosäuren von Peptiden, die in einem vorhergehenden Schritt gebildet wurden, scheint die vorstehend erwähnte Aktivität der Carboxypeptidase beteiligt zu sein. Dennoch ist die Stufe eines Herstellens bzw. Erzeugens der Peptide, die C-terminal hydrophobe Aminosäuren aufweisen, die einzig bekannte enzymatische Aktivität, die in dieser Hinsicht berücksichtigt werden kann, eine Asparagin-Endoproteinase, die zu der vorstehend erwähnten in Beziehung steht. Es ist ebenfalls möglich, dass die vorstehend erwähnte Aktivität die Folge unterschiedlicher Enzymaktivitäten darstellt, die immer noch unbekannt sind.
Obwohl mehrere Gesichtpunkte der Herstellung von Kakaoaroma aufgeklärt wurden, besteht in dem Fachgebiet immer noch ein Bedarf die ablaufenden Vorgänge vollständig zu verstehen, so dass die Herstellung von Kakaoaroma schließlich optimiert werden kann.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht folglich darin Mittel bereitzustellen, um die Bildung von Kakaoaroma bzw. -geschmack während der Bearbeitung und Herstellung zu verbessern.
Die vorstehend erwähnte Aufgabe wurde gelöst, indem eine neue Asparagin-Endoproteinase bereitgestellt wird, die wie durch SEQ ID NO. 1 bestimmt, von Th. cacao abgeleitet wurde. Die hier beschriebene Asparagin-Endoproteinase (im folgenden TcAP1 genannt) wird die Globuline der Vicilin-Klasse, die von Kakaobohnen isoliert wurden, so spalten, dass ein aufeinanderfolgender Abbau der Peptide durch eine Carboxypeptidase zu einem Gemisch von Peptiden und Aminosäuren führt, die auf eine Reaktion mit reduzierenden Zuckern, d. h. auf ein Rösten, ein/einen Kakaoaroma bzw. -geschmack ergeben.
Gemäß einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine DNA Sequenz bereitgestellt, die für die entsprechende Endoproteinase kodiert. Die DNA Sequenz kann, wie unter SEQ ID NO. 1 bestimmt, entsprechend des genetischen Codes von der Aminosäuresequenz abgeleitet werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA Sequenz unter SEQ ID NO. 3 (TcAP1) bestimmt bzw. festgelegt.
Die DNA Sequenz kann verwendet werden, um die Asparagin-Endoproteinase der Erfindung rekombinant herzustellen. Zu diesem Zweck wird die DNA Sequenz in einen geeigneten Expressionsvektor, wie beispielsweise ein Plasmid oder einen viralen Vektor eingefügt, der die gemeinsamen bzw. allgemeinen Sequenzen, wie beispielsweise einen Promotor umfasst, einen Polylinker, um das Klonieren der DNA Sequenzen darin zu erleichtern, Leader-Sequenzen, um das produzierte Polypeptid aus der Zelle herauszuführen. Die Vektoren werden, basierend auf den Erfordernissen des verwendeten Systems ausgewählt, beispielsweise können für eine Expression in E. coli die Vektoren pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET-Derivate, pQE8 vorgesehen sein, die weit verbreitet in der Verwendung und im Handel erhältlich sind. Als ein Beispiel kann Asparagin-Endoproteinase in ein Medium oder auf/an einer Oberfläche von Milchsäure-Bakterien exprimiert werden, die in Milchprodukten, wie beispielsweise Milch oder Jogurt verwendet werden.
Zum Exprimieren der Endoproteinase können, beispielsweise, in Hefe die Vektoren pNFF296, pY100, pPIC9K, pPICz und Ycpadl verwendet werden und zum Exprimieren in Säugerzellen können die Vektoren pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4 als auch pSS-Derivate (Kay R. et al., Science 236 (1987), 1299–1302) verwendet werden. Außerdem können zum Exprimieren der Endoproteinase in Pflanzenzellen, insbesondere in Kakao, der Vektor pAL76 oder die pBin19-Derivate und in Insektenzellen, beispielsweise, der Vektor pAcSGNT-A verwendet werden.
Die Asparagin-Endoproteinase kann, wie vorstehend erwähnt, in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle exprimiert sein. Es wird klar sein, dass der Fachmann basierend auf der Notwendigkeit und dessen eigenen Fachkönnens ein geeignetes Expressionssystem auswählen wird, um das gewünschte Ziel zu erreichen. In dem Fall, dass die Endoproteinase einfach zu einem Proteingemisch zugegeben werden soll, wie beispielsweise isolierten Kakaoglobulinen der Vicilin-Klasse, dann kann das rekombinante Enzym in einem bakteriellen System, wie beispielsweise E. coli oder in Hefe hergestellt und auf das Proteinmaterial aufgebracht bzw. angewendet werden.
In Anbetracht der Wirkung die enzymatische Aktivität in Kakao selbst zu erhöhen, kann eine transgene Pflanze vorgesehen sein, in der eine oder mehrere Kopien der Endoproteinase, wahlweise gekoppelt mit einem geeigneten und steuerbaren Promotor, in das Genom der Pflanzenzelle eingefügt wurde(n). Das Einfügen bzw. Einbringen der DNA Sequenz(en) kann beispielsweise durch homologe Rekombination von DNA-Abschnitten erreicht werden, die eine oder mehrere Kopien der DNA Sequenz beherbergen, die für die Endoproteinase der vorliegenden Erfindung in embryonalen Kalli kodiert, die vorher präpariert wurden. Da Pflanzenzellen totipotent sind, kann ein neuer transgener Kakaobaum auf diese Weise hergestellt werden, dessen Bohnen einen schnelleren Abbau der Globuline der Vicilin-Klasse zeigen, falls sie Bedingungen einer Fermentation ausgesetzt werden.
Als Folge liegt eine transgene Pflanze, die eine oder mehrere zusätzliche Kopie(n) einer DNA Sequenz für die Endoproteinase der vorliegenden Erfindung beherbergt, in dem Umfang der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Endoproteinase kann ebenfalls für die Herstellung von Kakaoaroma bzw. -geschmack verwendet werden, indem ein geeignetes Ausgangsmaterial (Kakaobohne, Liquor oder Krümel), vorzugsweise Globuline der Vicilin-Klasse mit der Endoproteinase der vorliegenden Erfindung und gleichzeitig oder nachher das Material mit Carboxypeptidase behandelt wird, um ein Gemisch von Peptiden und Aminosäuren zu erhalten, das geeignet ist als Vorläufer des Kakaoaromas zu wirken. Dieses Gemisch kann dann einem "Röstschritt" ausgesetzt werden, d. h. kann einer Reaktion mit reduzierenden Zuckern ausgesetzt werden, um schließlich Kakaoaroma zu erhalten.
Da einige der bei der Erzeugung von Kakaoaroma beteiligten Enzyme nun zur Hand sind, kann Kakaoaroma künstlich hergestellt werden, ohne auf den gesamten Prozess eines Fermentierens und Röstens von Kakaobohnen angewiesen zu sein. Die vorliegende Erfindung stellt folglich ein Verfahren zum Erzeugen bzw. Herstellen von Kakaoaroma bereit, das den Schritt umfasst, Unterziehen eines Materials, das dazu geeignet ist Vorläufer von Kakaoaroma, wie beispielsweise die bekannten Globuline der Vicilin-Klasse, zu ergeben, einem enzymatischen Abbau, bei dem die Asparagin-Endoproteinase der vorliegende Erfindung verwendet wird.
Insbesondere kann die vorliegende Asparagin-Endoproteinase in Proteinkörpern von Pflanzenzellen, insbesondere Samenzellen überexprimiert sein, wobei anschließend eine Hydrolyse des zellulären Proteinmaterials durch Behandeln derartiger Pflanzenzellen mit einer sauren Lösung, bewirkt werden kann.
Die vorliegende Endoproteinase kann ebenfalls zum Hydrolysieren von Proteinen verwendet werden, indem ein Material der Wahl, wie beispielsweise das Protein in isolierter Form oder das Protein beinhaltendes Material, wie beispielsweise Lebensmittelmaterial, mit einer Endoproteinase der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht wird und die Hydrolyse bis zu einem wünschenswerten Grad bewirkt. Beispiele für Materialien sind Molkereisubstanzen (Molkenprotein und Kasein), Weizengluten, Maisgluten, Fleisch, Eiprotein und anderes pflanzliche Substanzen beinhaltendes Protein, das vorstehend nicht erwähnt wurde, wie beispielsweise Proteine von Ölsamen, einschließlich Sojabohnenprotein und entfettetes Sojaprotein.
In den Figuren,
zeigt 1 den theoretischen Produktionsprozess von spezifischen Vorläufern des Kakaoaromas;
zeigt 2 eine schematische Darstellung von Asparagin-Prä-Pro-Peptiden von Pflanzen;
zeigt 3 schematisch die Klonierungsstrategie für die Isolation der Endoproteinase TcAP1 cDNA;
zeigt 4 schematisch die Klonierungsstrategie für die Isolation der Endoproteinase TcAP2 cDNA;
zeigt 5 einen Vergleich zwischen den erhaltenen unterschiedlichen Polypeptiden;
zeigt 6 eine Hydrophilie-Darstellung Kyte-Doolittle für beide erhaltenen Endoproteinasen.
zeigt 7 die Expression von TcAP1a und Tcap2 in Kakaobohnen von drei verschiedenen Kakaoklonen;
zeigt 8 die Ergebnisse einer Northern-Blot-Analyse von einer TcAP1a und TcAP2 Expression in Kakaobohnen von Klone CCN51 zu unterschiedlichen Reifungsstadien;
zeigt 9 die Ergebnisse einer Northern-Blot-Analyse einer TcAP1a und TcAp2 Expression in Kakaobohnen, die durch Kakaoklon CCN51 zu unterschiedlichen Keimungsstadien hergestellt wurden;
zeigt 10 die Ergebnisse eines Hydrolyse-Experimentes von Rinder- Hämoglobin durch rekombinantes TcAP2 Protein in Kulturmedium der Hefe und Vergleich mit dem Kontroll-Stamm pNFF296;
zeigt 11 die Ergebnisse von Experimenten, die die pH-Wert Abhängigkeit der Hämoglobin-Hydrolyse durch rekombinantes TcAP2 bestimmen;
zeigt 12 die Wirkung unterschiedlicher Hemmstoffe auf die Hydrolyse von Rinder-Hämoglobin durch rekombinantes TcAP2
zeigt 13 die Analyse des am meisten aktiven Pools bzw. Vereinigungen (Fraktionen 57–64) von der Sephacryl S-200 HiPrep 16/60 Größenausschluss-Säule auf einem 10–20% Gradienten SDS-PAGE Gel (Coomassie gefärbt). In die Spuren 1–3, wurden jeweils 12, 24 und 40,8 μg Protein geladen. Komplex bezeichnet einen möglichen kovalenten Komplex zwischen AP und Trypsininhibitor bzw. -hemmstoff Fragmenten; TcAP2 bezeichnet das 30,5 kDa umfassende Polypeptid, 27,9 bezeichnet die 27,9 kDa umfassende mögliche Endochitinase; TI, Trypsininhibitor. Die Molekulargewichte der Marker sind an der rechten Seite angegeben;
zeigt 14 eine SDS-PAGE Gel Analyse der Reaktionsprodukte nachdem eine durch Q-Sepharose Fast Flow gereinigte Präparation von Asparagin-Endoproteinase unter sauren Bedingungen für 1 Minute und 7 Stunden inkubiert wurde. AP bezeichnet das 30,5 kDa umfassende Polypeptid, 27,9 bezeichnet die 27,9 kDa umfassende mögliche Endochitinase; TI, Trypsininhibitor. M, Molekulargewichtsmarker (Precision Biorad)
zeigt 15 eine Denaturierungs-Größenausschluss-Chromatographie der Reaktionsprodukte nachdem eine durch Q-Sepharose Fast Flow gereinigte Asparagin-Endoproteinase unter den sauren. Bedingungen für 1 Minute beziehungsweise 7 Stunden inkubiert wurde. Die Molekulargewichtsmarker sind: 1. Ribonuklease A, 13,7 kDa, 2. Aprotinin 6,5 kDa, 3. Substanz P 1,347 kDa, 4. N-Benzoyl-Gly-Phe (Hipporyl-Phe) 326 Da, 5. Phe 165 Da.
Während der Untersuchungen, die zu der vorliegenden Erfindung führten, wurden zwei Asparagin-Endoproteinasen aufgefunden, die bei dem enzymatischen Abbau von Globulinen der Vicilin-Klasse in Kakaobohnen unter den Bedingungen einer Fermentation beteiligt sind.
Asparagin-Endoproteinasen als solche stellen eine weit verbreitete Klasse von Proteasen in Tieren, Mikroben, Viren und Pflanzen dar. Alle Asparagin-Endoproteinasen beinhalten zwei Asparagin-Reste an der aktiven Stelle und sind bei saurem pH-Wert aktiv. In den meisten Asparagin-Endoproteinasen sind die katalytischen Asparagin-Reste in einem gemeinsamen Asp-Thr-Gly Motiv beinhaltet, das in beiden Schleifen des Enzyms vorhanden ist, wobei Asparagin-Endoproteinasen Pflanzen an einer der Stellen Asp-Ser-Gly beinhalten.
Es wurden zahlreiche Asparagin-Proteinasen in Monocotyledonen und Dicotyledonen detektiert oder gereinigt, die entweder Heterodimere oder Monomere sind. Die Sequenzen der entsprechenden Gene sagen voraus, dass die aktiven heterodimeren Enzyme von dem Bearbeiten eines einzelnen Pro-Proteins abgeleitet sind.
Obwohl die Gene und vorhergesagten Pro-Proteine von Asparagin-Endoproteinasen für sowohl monocotyledone als auch dicotyledone Pflanzen sehr ähnlich sind, unterscheiden sie sich von den Gegenstücken der Säuger und Mikroben durch das Vorhandensein eines 100 Aminosäuren umfassenden Einsatzes (ein sogenanntes für Pflanzen spezifisches Insert: PSI), das in Asparagin-Endoproteinasen von Säugern und Mikroben abwesend ist. Dieser/s Einsatz bzw. Insert teilt das Protein in zwei Regionen: eine aminoterminale und eine carboxyterminale Region, die eine relativ hohe Ähnlichkeit zu einander und zu Enzymen der Säuger und Mikroben zeigen. Die aminoterminale Region beinhaltet zwei aktive Stellen Asp-Thr-Gly (DTG) und Asp-Ser-Gly (DSG) (2). Obwohl die Positionen von sechs Cysteinresten konserviert sind, liegen die PSI von unterschiedlichen Spezies weniger homolog miteinander vor als die amino- und carboxyterminalen Regionen.
Angesichts dieses Wissens wurde die konservierte Region dazu verwendet, um die Nukleotid- und die Aminosäure-Sequenz von Asparagin-Endoproteinase (TcAP1) von der Kakaobohne (Klone ICS 95), wie folgt, zu erhalten:
Ein 1 kB umfassendes internes Fragment der Asparagin-Proteinase der Kakaobohne wurde durch RT-PCR unter Verwendung degenerierter Oligonukleotide amplifiziert, die gemäß eines/r Abgleiches bzw. Ausrichtung bekannter Sequenzen von Asparagin-Endoproteinasen und einer Auswahl von konservierten Regionen ausgewählt wurden. Basierend auf der Sequenz dieses Fragments wurden Primer gestaltet, um 5'- und 3'-Enden zu amplifizieren. Danach wurde eine Volllängen cDNA (TcAP1b) durch Ligation des 3' und 5' Fragments unter Verwendung der BamHI Restriktionsstelle erhalten und eine andere (TcAP1a) wurde unter Verwendung von Primer amplifiziert, die spezifisch für beide Extremitäten waren (3).

TcAP1a und TcAP1b Nukleotidsequenzen unterscheiden sich lediglich durch 6 Basenpaare. Einige dieser Unterschiede werden ebenfalls in dem teilweisen 1 kB umfassenden Fragment aufgefunden. Drei von diesen Unterschieden führen in dem kodierten Protein (Tabelle 1) zu Änderungen in der Aminosäure. Das Molekulargewicht und der pI des Proteins werden nicht geändert. Tabelle 1. Unterschiede, die in den Nukleotidsequenzen der unterschiedlichen cDNA Fragmente beobachtet werden, die durch PCR erhalten wurden und deren Wirkung auf die Proteinsequenz.

Position	1 kB Fragment	TcAP1a	TcAP1b	Geänderter Rest
318		T	A	L-------M
431	C	C	T	Keine Änder.
636	G	G	A	A-------T
764	T	C	T	Keine Änder.
1189	C	T	C	V-------A
1376	C	C	T	Keine Änder.

Diese Unterschiede können durch Fehler erklärt werden, die durch die Polymeraseenzyme während der PCR-Reaktionen ausgeführt werden. Eine andere Erklärung könnte sein, dass TcAP1a und TcAP1b zwei unterschiedliche Allele des gleichen Gens sind, das TcAp1 genannt wird. Weiterhin sind die 5' und 3' nicht translatierten Regionen von TcAP1a und TcAP1b identisch. Dies spricht vielmehr für die Anwesenheit von zwei Allelen als für zwei unterschiedliche Gene.
Die cDNA Sequenzen von TcAP1a (Seq ID No. 3), die von der Kakaobohne (Klon ICS95) isoliert wurde, ist 1784 bp lang. Ein mögliches Initiationsstartcodon wurde durch Vergleich mit anderen Sequenzen von Asparagin-Endoproteinasen der Pflanzen zugewiesen. Es ist 63 bp von dem 5' Ende angeordnet. Das offene Leseraster wird durch ein Stopp-Codon (TAA) an Position 1605 unterbrochen, gefolgt durch ein mögliches Polyadenylierungssignal (TATAAR) an Position 1625.
TcAP1a kodiert ein 514 Aminosäuren umfassendes Protein mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 56 kDa und einem pI von 5,05. Das Protein zeigt eine hohe Ähnlichkeit mit Asparagin-Endoproteinasen von Pflanzen. Bei Betrachtung der Gesamtsequenzen reicht die beobachtete prozentuale Identität zwischen 59% mit der Asparagin-Endoproteinase von Reis (Oryzasin A) und 87% mit der teilweisen Sequenz von Baumwolle. Eine Hydrophobie-Analyse (6A) ergab, dass TcAP1a ein hydrophiles Protein mit einem äußerst hydrophoben N-terminalen Ende kodiert, was die Anwesenheit eines Signalpeptids anzeigt. Zwei katalytische Triaden (DTG und DSG) sind ebenfalls vorhanden.
Die Nukleotid- und Aminosäure-Sequenz von Asparagin-Endoproteinase (TcAP2) von der Kakaobohne (Klon CCN51) wurde, wie folgt, erhalten:
Es wurde ein 1 kB umfassendes internes Fragment der Asparagin-Endoproteinase von der Kakaobohne durch RT-PCR unter Verwendung degenerierter Oligonukleotide amplifiziert, die wie vorstehend ausgewählt wurden. Basierend auf der Sequenz von diesem Fragment wurden Primer gestaltet, um 5' und 3' Enden zu amplifizieren. Danach wurde eine Volllängen cDNA (TcAP2) unter Verwendung von für beide Extremitäten (4) spezifischen Primern amplifiziert.
Die cDNA Sequenz von TcAP2 (SEQ ID No. 4), die von der Kakaobohne (Klon CCN51) isoliert wurde, weist 1828 bp in der Länge auf. Ein Initiationsstartcodon ist 62 bp von dem 5' Ende angeordnet. Das offene Leseraster wird durch ein Stopp-Codon (TAA) an Position 1606 unterbrochen, gefolgt durch ein mögliches Polyadenylierungssignal (TATAAR) an Position 1669.
TcAP2 kodiert ein 514 Aminosäuren umfassendes Protein mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 56 kDa und einem pI von 5,31. Das Protein zeigt eine hohe Ähnlichkeit mit Asparagin-Endoproteinasen von Pflanzen. Unter Berücksichtigung der Gesamtsequenzen reicht die beobachtete prozentuale Ähnlichkeit zwischen 57% mit Asparagin-Endoproteinase von Reis (Oryzasin A) und 77% mit der Teil-Sequenz von Baumwolle. Eine Hydrophobie-Analyse (6B) ergab, dass TcAP2 ein hydrophiles Protein mit einem äußerst hydrophoben N-terminalen Ende kodiert, was die Anwesenheit eines Signalpeptides anzeigt. Es sind ebenfalls zwei katalytische Triaden (DTG und DSG) vorhanden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne die gleiche zu beschränken.
Kakao (Theobroma cacao L.)-bohren von reifen Schoten bzw. Samenhülsen von Klonen ICS95, CCN51 und EET95 wurden durch das ex-R&D Zentrum Quito (Ecuador) von Nestle bereitgestellt. Die Bohnen wurden von den Schoten unmittelbar nach Ankunft in dem Labor (4–5 Tage nach der Ernte) verwendet. Die Pulpa und die Samenschale wurden beseitigt und die Cotyledonen wurden in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert.
Beispiel 1
Präparation von mRNA
Es wurden zwei Bohnen in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zerkleinert und eine Extraktion wurde unmittelbar mit einem Lysepuffer ausgeführt, der 100 mM Tris-HCl pH-Wert 8,1% SDS und 0,1 M β-Mercaptoethanol beinhaltete. Die RNA wurde mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1) extrahiert und bei 8.000 Upm für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde dreimal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24/1) gewaschen. Die RNA wurde mit 0,3 M Natriumacetat pH-Wert 5,2 in zwei Volumen Ethanol präzipitiert. Das nach Zentrifugation erhaltene RNA-Pellet wurde in 100 mM Tris HCl pH-Wert 8 resuspendiert und eine zweite Präzipitation wurde mit 2M Lithiumchlorid ausgeführt. Das RNA-Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in mit DEPC behandeltem Wasser resuspendiert.
Beispiel 2
Klonieren von Asparagin-Proteinase cDNAs
Eine Suche nach Sequenzen von Asparagin-Proteinasen in der Datenbank der Genbank führte zu der Identifikation von mehreren Pflanzensequenzen. Ein Mehrfachabgleich dieser Sequenzen ergab die Anwesenheit von konservierten Regionen, die verwendet wurden, um zwei degenerierte Oligonukleotide zu gestalten.
Ein Sinn-Primer, pAP0 (5'-GAYACNGGNAGYTCYAAYYTVTGG) wurde gemäß der Sequenz Asp-Thr-Gly-Ser-Ser-Asn-Leu-Trp synthetisiert, die eine aktive Stelle (Asp-Thr-Gly) des Proteins beinhaltet.
Ein Antisinn Primer, pAP4r (5'-CCATMAANACRTCNCCMARRATCC) wurde gemäß der Sequenz Trp-Ile-Leu-Gly-Asp-Val-Phe synthetisiert, die in dem C-terminalen Teil des Proteins angeordnet vorliegt.
Es wurde, wie in Beispiel 1, präparierte Gesamt-RNA verwendet, um mit dem SMART PCR cDNA Synthese-Kit (Clontech, USA) eine Erststrang cDNA zu synthetisieren. Die Synthese wurde genau, wie in den Anweisungen beschreiben, unter Verwendung von 1 μg Gesamt-RNA und der Superscript^TM II MMLV Reversen Transkriptase (Gibco BRL, USA) ausgeführt. Nach der Synthese wurde die cDNA unmittelbar für die PCR verwendet oder bei –20°C gehalten bzw. aufbewahrt.
Es wurde eine spezifische cDNA Amplifikation mit 2 μl Erststrang cDNA in 50 μl Puffer ausgeführt, der 10 mM Tris-HCl pH 8,8, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,001% (w/v) Gelatine, 0,25 mM dNTP's, 30 pMole von pAP0 und pAP4r Primern und 5 Einheiten von Taq DNA Polymerase (Stratagene, USA) beinhaltete. Eine Amplifikation wurde in einem Bio-med Wärmezyklisierer 60 (B. Braun) ausgeführt. Eine erster Denaturierungsschritt (94°C, 2 Min.) wurde durch 30 Zyklen einer Denaturierung (94°C, 1 Min.), eines Primerannealing (40°C, 1,5 Min) und einer Verlängerung (72°C, 2 Min.) gefolgt. Die Verlängerungszeit wurde bei jedem Zyklus um 3 Sek. erhöht. Die Amplifikation wurde durch einen End-Verlängerungsschritt (72°C, 10 Min.) beendet. Das amplifizierte Fragment wurde in den pGEM^®-T Easy Vektor kloniert und sequenziert.
TcAP1 und TcAP2 Volllängen cDNAs wurden unter Verwendung der Schnellen Amplifikation cDNA Enden PCR (RACE PCR) kloniert. Für das TcAP1 wurde der Marathon^TM cDNA Amplifikations-Kit (Clontech, USA) verwendet. Es wurde Poly A+ RNA, die von der Gesamt-RNA (150 μg) mit dem Oligotex mRNA Kit (QIAGEN, Deutschland) gereinigt wurde, verwendet, um Doppelstrang cDNA zu synthetisieren und ein Marathon cDNA Adapter wurde an beide Enden der cDNA ligiert. Diese zwei Schritte wurden gemäß den Anweisungen des Marathon^TM cDNA Amplifikations-Kits ausgeführt. Für TcAP2 wurde eine Einzelstrang cDNA von der Gesamt-RNA gemäß des SMART^TM RACE cDNA Amplifikations-Kits (Clontech, USA) synthetisiert.
Es wurde eine RACE PCR mit 5 μl einer an Marathon Adapter-legierten Doppelstrang cDNA oder 2,5 μl einer SMART Einzelstrang cDNA in 50 μl Puffer ausgeführt, der 40 mM Tricin-KOH pH 9,2, 15 mM KOAc, 3,5 mM Mg(OAc)₂, 3,75 μg/ml BSA, 0,005% Tween-20, 0,005% Nonidet-P40, 0,2 mM dNTP's, 0,2 μM von jedem Primer und 1 μl Advantage 2 Polymerase-Mix (Clontech, USA) beinhaltet. Eine Amplifikation wurde via einer Touchdown PCR in einem Bio-med Wärmezyklisierer 60 (B. Braun) ausgeführt.
Ein erster Denaturierungsschritt (94°C) wurde gefolgt von:

– 5 Zyklen einschließlich einer Denaturierung bei 94°C für 30 Sek. und Annealing/Verlängerung bei 72°C für 7 Min.
– 5 Zyklen einschließlich einer Denaturierung bei 94°C für 30 Sek. und Annealing/Verlängerung bei 70°C für 7 Min.
– 25 Zyklen einschließlich einer Denaturierung bei 94°C für 20 Sek. und Annealing/Verlängerung bei 68°C für 7 Min.

Für TcAP1 wurden zwei spezifische Primer mit dem AP1 Primer gepaart, der spezifisch für den in dem Marathon Kit bereitgestellten Marathon cDNA Adapter ist:
Für TcAP2 wurden zwei spezifische Primer mit dem UPM (universal Primer Mix)-Primer gepaart, der die SMART Sequenz erkennt:
Die amplifizierten Fragmente wurden in den pGEM^®-T Easy Vektor kloniert und sequenziert. Die nach dem Sequenzieren der RACE Fragmente erhaltene Sequenzinformation wurde dazu verwendet, um neue Oligonukleotide zu gestalten, um die Volllängen Fragmente zu amplifizieren:
Die PCR Reaktion wurde genau so ausgeführt wie für die Amplifikation der 5'- und 3'-RACE Fragmente mit einem Denaturierungsschritt (94°C, 1 Min.), gefolgt durch 35 Zyklen von Denaturierung (94°C, 30 Sek.), Primer Annealing (63°C, 1 Min.) und Verlängerung (72°C, 2 Min.). Die Verlängerungszeit wurde bei jedem Zyklus um 3 Sek. erhöht. Die Amplifikation wurde durch einen letzten Verlängerungsschritt (72°C, 10 Min.) beendet. Das amplifizierte Fragment TcAP1 und TcAP2 wurde jeweils in pGEM^®-T Easy oder pGEM^® T Vektoren kloniert und sequenziert.
Weiterhin wurde eine Klonierungsstrategie ebenfalls dazu verwendet, um die Volllängen TcAP1 cDNA zu erhalten. 5'- und 3'-RACE Fragmente überlappen für 200 Basenpaare. In dieser überlappenden Region liegt eine einzigartige BamHI Restriktionsstelle vor. Beide Fragmente wurden unter Verwendung von BamHI und EcoRI (vorhanden in dem Plasmid) isoliert und unter Verwendung der gleichen Restriktionsenzyme direkt in pBS+ (Stratagene, USA) subkloniert.
Beispiel 3
Sequenzieren und Analyse von DNA Sequenzen
Das Sequenzieren von cDNA wurde entsprechend von Standard-Techniken (Maniatis, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1992) ausgeführt. Die Sequenzanalyse und der Sequenzvergleich wurden unter Verwendung des DNAStar Programms ausgeführt. Die Sequenzen werden unter SEQ ID NO. 1 und 2 gezeigt.
Beispiel 4
Expression von TcAP1 und TcAP2 in Kakao-Pflanzen
Für den Northern-Blot wurde gesamt-RNA auf einem 1,5% Agarosegel aufgetrennt, das 6% Formaldehyd in 20 mM MOPS, 5 mM NaOAC, 1 mM EDTA pH-Wert 7 beinhaltete. Nach der Elektrophorese wurde die RNA auf Nylonmembranen (Appligene) geblottet bzw. übertragen und mit ³²P markierter TcAP1 oder TcAP2 Sonde bei 65°C in 250 mM Na-Phosphat-Puffer pH-Wert 7,2, 6,6% SDS, 1 mM EDTA und 1% BSA hybridisiert. Die Membranen wurden dreimal bei 65°C für 30 Min. in 2X SSC, 0,1% SDS, in 1X SSC, 0,1% SDS und schließlich in 0,5X SSC, 0,1% SDS gewaschen.
Die TcAP1a Sonde wurde durch PCR unter Verwendung von TcAP1 und TcAP1r Primern amplifiziert und die TcAP2 Sonde mit den folgenden Primern:
Die PCR Reaktion wurde mit 1 μl Matrizen-cDNA in 50 μl Puffer ausgeführt, der 40 mM Tricin-KOH pH-Wert 8,7, 15 mM KOAc, 3,5 mM Mg(OAc)₂, 3,75, μg/ml BSA, 0,005% Tween-20, 0,005% Noninet-P40, 0,2 mM dNTP's, 0,2 μM von jedem Primer of und 1 μl 50X Advantage 2 Polymerase-Mix (Clontech, USA). Die Amplifikation wurde in einem Bio-med Wärmezyklisierer 60 (B. Braun) ausgeführt. Ein erster Denaturierungsschritt (94°C, 1 Min.) wurde gefolgt durch 30 Zyklen einer Denaturierung (94°C, 30 Sek.), eines Primerannealing (63°C, 1,5 Min.) und einer Verlängerung (72°C, 2 Min.). Die Verlängerungszeit wurde bei jedem Zyklus um 3 Sek. erhöht. Die Amplifikation wurde durch einen letzten Verlängerungsschritt (72°C, 10 Min.) beendet.
Es wurden beide Fragmente mit dem Strataprep PCR Reinigungs-Kit (Stratagene, USA) gereinigt und durch das Zufalls-Füll bzw. Random-Priming-Verfahren (rediprime^TM II, Amersham Pharmacia Biotech) markiert.
Die Northern-Blot-Analyse mit von reifen Kakao-Bohnen gereinigter RNA, die von unterschiedlichen Baumen, CCN51, EET95 und ICS95 erzeugt wurden, zeigten, dass TcAP1a und TcAP2 in Bohnen exprimiert wird, die durch die drei unterschiedlichen Baume (7A) erzeugt werden. TcAP2 wird jedoch sehr viel stärker exprimiert als TcAP1a, was darauf hinweist, dass es die hauptsächliche Asparagin-Endoproteinase in Kakao-Bohnen sein kann. Die RT-PCR Experimente (7B) stehen mit diesen Ergebnissen in Einklang. Eine Bestätigung der Vorstellung, dass TcAP2 die hauptsächliche Aktivität von Asparagin-Endoproteinase in der Bohne darstellt, wird durch die N-terminale Sequenzierung des gereinigten nativen Proteins bereitgestellt, das die gleiche Sequenz wie TcAP2 aufweist. Schließlich zeigen die in 7B dargestellten Ergebnisse der RT-PCR ebenfalls deutlich, dass beide Gene in Blättern exprimiert werden.
Ähnliche Experimente, die mit RNA ausgeführt wurden, die von Kakaobohnen bei unterschiedlichen Reifestadien (8) gereinigt wurden, bestätigen, dass TcAP1 in sich entwickelnden und reifen Bohnen geringfügiger exprimiert wird als TcAP2. Die TcAP1 und TcAp2 Expression steigt geringfügig während der Reifung an und nimmt in reifen Bohnen ab. TcAP2 wird hauptsächlich in frühen Entwicklungsstadien der Bohne exprimiert, was nahe legt, dass die Synthese von neuer Asparagin-Endoproteinase mit der Reifung der Bohne fällt bzw. absinkt.
Während der Keimung liegt die Expression von TcAP2 im Gegensatz zu der von TcAP1 relativ stabil vor, die nach ein paar Tagen der Keimung mit einem Maximum bei Tagen 4 und 7 ansteigt. Es wird ebenfalls eine starke Expression bei 49 Tagen nach der Imbibition (9) detektiert
Beispiel 5
cDNA Expression im heterologen System der Hefe
Die kodierenden Sequenzen von TcAP1 und TcAP2 wurden in dem heterologen System der Hefe Yarrowia lipolytica überexprimiert.
TcAP1 und TcAP2 wurden unter der Kontrolle eines synthetischen XPR-2 abgeleiteten Promotors hp4d überexprimiert, der auf dem Expressions-/Sekretions-Plasmid pNFF296 von Yarrowia lipolytica vorhanden ist. Um das rekombinante Protein in das Kulturmedium abzusondern, wurden beiden cDNAs die Signalsequenz (ersten 24 Aminosäuren, vorausgesagt gemäß Nielson et al., Protein Engineering 10 (1997), 1–6) durch eine Signal-Sequenz einer Lipase ersetzt, die auf dem Yarrowia lipolytica Expressions-/Sekretions-Plasmid pNFF296 vorhanden ist.
TcAp1a, das in pGEM-T Easy kloniert wurde, wurde als Matrize für die Amplifikation der cDNA Sequenz verwendet, die für ein reifes Protein ohne eine mögliche Signalsequenz kodiert.
Es wurden zwei Primer für die Amplifikation von TcAP1a verwendet:
Primer C089
(5'-CCGGCCTCTTCGGCCGCCAAGCGAATATCCAATGAGAGATTGGTCAG) primt an dem 5' Ende der vorausgesagten reifen TcAP1a cDNA und führt eine SfiI Stelle ein, die ein Klonieren gestattet, das im Leseraster zu einer hybriden XPR2-Lipase Signal-Sequenz liegt, die auf dem Yarrowia lipolytica Expressions-/Sekretions-Plasmid pNFF296 vorhanden ist.
Primer C090
(5'-CCGGCCCACGTGGCCTTAGTGGTGGTGTGCAGCCTCGGCAAATCCAAC) primt an dem 3' Ende der reifen TcAP1a cDNA und führt im Leseraster eine 3 × HIS Sequenz gerade vor das Stopp-Codon und der SfiI Klonierungsstelle vor dem Lipase-Terminator von pNFF296 ein.
Die TcAp2 cDNA, die in pGEM-T kloniert wurde, wurde als Matrize für die Amplifikation der Sequenz verwendet, die für das reife Protein ohne eine mögliche Signalsequenz kodiert.
Es wurden zwei Primer für die Amplifikation von TcAp2 verwendet:
Primer C091
(5'-CCGGCCTCTTCGGCCGCCAAGCGAGTATCCAATGATGGGCTGGTTAG) primt an dem 5' Ende der vorausgesagten reifen TcAp2 cDNA und führt eine SfiI Stelle ein, die ein Klonieren gestattet, das im Leseraster zu einer hybriden XPR2-Lipase Signal-Sequenz liegt, die auf dem Yarrowia lipolytica Expressions-/Sekretions-Plasmid pNFF296 vorhanden ist.
Primer C092
(5'-CCGGCCCACGTGGCCTTAGTGGTGGTGTGCCGCCTCGGCGAAGCCGAC) primt an dem 3' Ende der reifen TcAP2 cDNA und führt im Leseraster eine 3 × HIS Sequenz gerade vor dem Stopp-Codon und der SfiI Klonierungsstelle vor dem Lipase-Terminator von NFF296 ein.
Die Amplifikation wurde mit 1 μl Matrizen-cDNA (20 ng) in 10 mM KCl, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 0,1% Triton X-100, 2 mM MgCl₂, 0,2 mM von jedem dNTP, 10 μg ml^–1 BSA, 0,25 μM von jedem Primer und 3 Einheiten von der Pfu DNA Polymerase (Stratagene, USA) ausgeführt. Die PCR wurde in einem Stratagene RoboCycler (Stratagene, USA) ausgeführt. Ein erster Zyklus (95°C-5 Min., 50°C-1 Min., 72°C-3 Min.) wurde gefolgt durch 30 Zyklen (95°C-1 Min., 50°C-1 Min., 72°C-3 Min.) und einen letzten Zyklus (95°C-1 Min., 50°C-1 Min., 72°C-10 Min.). Die PCR Produkte wurden unter Verwendung des Qiaquick PCR Reinigungs-Kits (Qiagen INC, USA) gereinigt, mit SfiI verdaut und anschließend in den Vektor pNFF296 legiert, der vorher mit SfiI verdaut wurde. Diese Ligation wurde verwendet, um E. coli BZ234 (Biozentrum, University of Basel, Schweiz) zu transformieren. Die Konstrukte wurden auf LB-Platten selektioniert, die mit 50 μg ml^–1 Kanamycin ergänzt waren, durch Mini-Präparationen plus einen Verdau mit Restriktionsenzym und letztlich durch eine Analyse der DNA Sequenz analysiert. Die erhaltenen Plasmide, die TcAp1a oder TcAp2 beinhalten, wurden pCY329 beziehungsweise pCY330 genannt.
Der Wirtsstamm YLP3 von Yarrowia lipolytica wurde von dem Stamm polf ((MatA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp-2 SUC2) durch Transformieren des Stamms auf eine Leucin Prototrophie mit einem 5,1 kB SalI Fragment, das das Wild-Typ Gen von Yarrowia lipolytica (J.-M. Nicaud, pers. Mitteilung) trägt, abgeleitet und für LEU2 Konvertanten selektioniert ist. Der Wirtsstamm von Yarrowia lipolytica wurde auf einer YPD-Platte (1% Difco Bacto Hefe-Extrakt, 2% Difco Bacto Peptone, 2% Glucose, 2% Difco Bacto Agar) ausgestrichen und über Nacht bei 28°C gezüchtet. Es wurden 4 ml flüssiges YPD, pH-Wert 4,0 (1% Difco Bacto Hefe-Extrakt, 1% Difco Bacto Peptone, 1% Glucose, 50 mM Citrat-Puffer bei pH-Wert 4,0) mit frisch gezüchteten Zellen der YPD-Platte inokuliert und in einem Röhrchen auf einem Drehschüttler (200 Upm, 28°C, 8–9 Std.) gezüchtet. Von dieser Vor-Kultur wurde eine geeignete Menge verwendet, um 20 ml YPD pH-Wert 4,0 in einem Erlenmeyer-Kolben ohne Scheidebleche bzw. Baffles zu inokulieren. Diese Kultur wurde in einem Drehschüttler bei 200 Upm bei 28°C (über Nacht) bis eine Zell-Titration von 10⁸ ml^–1 erreicht wurde, geschüttelt. Diese Zellen wurden für 5 Min. bei 3.000 g zentrifugiert, mit 10 ml sterilen Wassers gewaschen und erneut zentrifugiert. Das zelluläre Pellet wurde in 40 ml von 0,1 M Lithiumacetat pH-Wert 6,0 (eingestellt mit 10% Essigsäure) suspendiert und in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben bei 140 Upm bei 28°C für 60 Minuten geschüttelt. Die Zellen wurden erneut für 5 Min. bei 3000 g zentrifugiert. Das zelluläre Pellet wurde in 2 ml Lithiumacetat pH-Wert 6,0 suspendiert und die kompetenten Zellen wurden bis zur Transformation auf Eis gehalten.
Es wurden Einhundert Mikroliter der kompetenten Zellen mit 5–20 μl Plasmid, die mit NotI linearisiert wurden und 50 μg Träger DNA (Heringsspermien DNA, die auf 100–600 bp mit Ultraschall behandelt wurde, Promega, USA) in einem 2 ml Röhrchen vermischt und für 15 Minuten bei 28°C inkubiert. Es wurden 700 μl 40% GEG4000, 0,1 M Lithiumacetat pH-Wert 6,0 zugegeben und das Röhrchen wurde bei 240 Upm auf einem Drehschüttler bei 28°C für 60 Minuten kräftig geschüttelt. Es wurde ein Volumen von 1,2 ml von Lithiumacetat pH-Wert 6,0 zugegeben und vermischt. Es wurden 250 μl auf selektiven Agarplatten (0,17% Difco Bacto Hefe-Stickstoff-Base w/o Aminosäure und Ammoniumsulfat, 1% Glucose, 0,006% L-Leucin, 0,1% Natriumglutamat, 0,1% Difco Bacto Casaminosäuren, 2% Agar) ausplattiert. Das Expressionsplasmid pNFF296 trägt ein defektes URA3 Allel, was die Selektion einer Mehrfachintegration der Expressions-Sekretions-Kassette in dem YLP3 Wirtsstamm gestattet.
Die Transformanden (Ura+) wurden erneut auf Selektionsmedium ((0,17% Difco Bacto Hefe-Stickstoff-Base w/o Aminosäure und Ammoniumsulfat, 1% Glucose, 0,006% L-Leucin, 0,1% Natriumglutamat, 0,1% Difco Bacto Casaminosäuren, 2% Agar) isoliert. Es wurde eine Reihe von Klonen in Schüttelgefäßen gezüchtet, um die Expression und Sekretion von Asparagin-Proteinase in das Kulturmedium zu überprüfen.
Es wurden kleine Flecken bzw. Haufen der Zellen auf den YPD-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 28°C gezüchtet. Die dünnen Schichten von gezüchteten Zellen wurden verwendet, um 50 ml von DMI-Medium in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 4 lateralen Baffles zu inokulieren. Das DMI-Medium beinhaltete pro Liter: KH₂PO₄ 10 g, MgSO₄ 7H₂O 2,5 g, Glucose 20 g; Spurenelementenlösung 5,1 ml, Vitaminlösung 17 ml, Harnstoff 3 g. Der Harnstoff wurde in 15 ml Wasser gelöst und steril filtriert. Der anfängliche pH-Wert des Mediums wurde auf 5,0 eingestellt. Die Kulturen wurden bei 140 Upm auf einem Drehschüttler bei 28°C für drei Tage geschüttelt. Es wurden Aliquots der Kulturen bei maximaler Geschwindigkeit (3.000 g) für 15 min. zentrifugiert und wobei der Überstand für die Bestimmung der Aktivität der Asparagin-Endoproteinase verwendet wurde.
Die Aktivität der Asparagin-Endoproteinase wurde bei 42°C in 900 μl eines Reaktionsmediums getestet, das 0,2 M Natriumcitrat-Puffer pH-Wert 3,0, 10 μg/ml von Rinder-Hämoglobin und 150 μl eines Hefe-Kulturüberstandes beinhaltet. Um die Aliquots (80 μl) der Reaktion zu stoppen, wurde ein gleiches Volumen von TCA 8% zugegeben und das präzipitierte Protein wurde durch Zentrifugation bei 13.000 g entfernt. Es wurden 20 μl Überstand mit 250 μl von O-Phthaldialdehyd (OPA) Reagenz (50 mM Natriumtetraborat, 1% SDS, 5,96 mM OPA (gelöst in 1 ml Methanol) und 1,43 mM β-Mercaptoethanol vermischt. Die Aktivität wurde anschließend durch Erfassen der OD bei 340 nm bestimmt und ausgedrückt in produzierten pMole Leucin pro mg Protein. Dafür wird die folgende lineare Gleichung (OD 340 nm = 0,0156 pMole + 0,0088) verwendet, die unter Verwendung einer Standardkurve mit L-Leucin (0 bis 80 pMole) bestimmt wurde. Die Proteinkonzentration wurde durch den Bradford-Test (Biorad) bestimmt.
Es konnte in 12 unabhängigen Klonen, die mit dem pCY330-Konstrukt (TcAP2) transformiert waren, eine starke Aktivität detektiert werden. Eine weitere Charakterisierung des rekombinanten Proteins TcAP2 wurde unter Verwendung eines mit pCY330-33 bezeichneten Klons ausgeführt. Ein Vergleich der Aktivitätserfassung mit Überstand von pCY330-33 und pNFF296 (Kontrolle) ergab deutlich, dass in der Kontrolle (1,44 ± 0,52 pMole L-Leucin/Min./mg Protein) keine Aktivität detektiert wurde und dass eine Hydrolyse von Rinder-Hämoglobin in der Anwesenheit des Überstandes von pCY330-33 (25,8 ± 1,45 pMole L-Leucin/Min./mg Protein) (10) auftritt. Diese Aktivität zeigt deutlich, dass durch pCY330-33 aktives rekombinantes TcAP2 Protein hergestellt wird.
Die in pCY3330-33 detektierte rekombinante TcAP2 Endoproteinase hydrolysiert das Rinder-Hämoglobin mit einem Optimum bei einem pH-Wert von 3 (11). Lediglich eine geringe Aktivität konnte für einen pH-Wert größer als 5 detektiert werden.
Die Endoprotease-Aktivität, die in dem Medium von pCY330-33 (TcAP2) detektiert wurde, wird durch 2 μM Pepstatin, einen spezifischen Hemmstoff für Asparagin-Endoproteinase, vollständig gehemmt. Die Pepstatin unempfindliche Aktivität (1,91 ± 1,26 pMole L-Leucin/Min./mg Protein, 6,65%) liegt in dem gleichen Bereich wie die eine, die für den Kontrollstamm (2,26 ± 1,26 pMole L-Leucin/Min./mg Protein, 7,8%) erfasst wurde. Andere Hemmstoffe wie beispielsweise 1,10 Phenanthrolin (Metallo-Protease), DCI (Serin-Protease und E64 (Cysteinprotease) zeigen keine Wirkung auf die Aktivität von TcAP2 (12).
Die hier dargestellten Daten zeigen deutlich, dass das Kulturmedium in dem die Hefe pCY330-33 gezüchtet wurde ein Protein beinhaltet, das Rinder-Hämoglobin hydrolysieren kann. Die maximale Aktivität liegt bei saurem pH-Wert und die Hemmung durch Pepstatin stellen zwei spezifische biochemische Merkmale für Asparagin-Proteinasen dar.
Beispiel 6
Reinigung des nativen Proteins
Es wurden ungefähr 25 g von gefrorenen EET95 Kakaobohnen unter Verwendung von flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver gemahlen und mit kaltem Aceton/Wasser/5 mM Natriumascorbat (80/20/5), gemäß eines modifizierten Verfahrens von Hansen et al., J. Sci. Food Agric. 77 (1998), 273–281, extrahiert, um den Hauptanteil des Fetts und phenolischer Verbindungen zu entfernen. Diese Verfahren führte zu ungefähr 11,3 g eines feinen Acetonpulvers.
Das Acetonpulver (5 g) wurde zweimal mit 500 ml eines Puffers A (10 mM Natriumphosphat pH-Wert 7,8, 2 mM EDTA, 10 mM Natriumacetat) für 1 Stunde bei 4°C extrahiert. Nach der Zentrifugation (7840 g, 25 Min. 4°C) wurden die kombinierten Überstände sequentiell zu 30% und 60% Ammoniumsulfat gemacht. Alle Ammoniumsulfat-Fraktionen wurden auf die Aktivität getestet, wobei festegestellt wurde, dass das Präzipitat von 60%igem Ammoniumsulfat den höchsten Pegel der Aktivität der Endoproteinase aufweist und wurde gegen den Puffer B (50 mM Natriumphosphat pH-Wert 7,8, 1 mM EDTA) dialysiert.
Unter Verwendung eines Akta-Reinigers bzw. Purifiers (Pharmacia) wurden 2 × 10 ml eines dialysierten Präzipitats des 60% Ammoniumsulfats auf eine Hiload 26/10 Q Sepharose Fast Flow Säule (Pharmacia) bei 8–10°C geladen. Nach dem Laden wurde die Säule mit 5 Säulenvolumen von 20 mM Tris-HCl pH-Wert 8 gewaschen, anschließend mit einem linearen Gradienten von 10 Säulenvolumen des gleichen Puffers eluiert, der mit 1 M NaCl ergänzt war. Die Flussgeschwindigkeit der Säule betrug 10 ml/Min. und es wurden Fraktionen von 5 ml aufgefangen.
Die Fraktionen von der Q Sepharose Fast Flow Säule wurden auf eine Aktivität der Asparagin-Endoproteinase getestet, wobei Fraktionen, die den höchsten Pegel bzw. Spiegel der Aktivität (#65–80) aufwiesen, vereinigt wurden. Die vereinigten Fraktionen (75 ml) wurden unter Verwendung von "Ultrafree Biomax" 4 ml Filtern (5 kDa MW Ausschluss) auf 2,2 ml konzentriert und auf eine Sephacryl S-200 Hiprep 16/60 Größenausschlusssäule (Pharmacia) geladen, die mit 10 mM Tris-HCl pH-Wert 8 und 500 mM NaCl, mit einer Flussgeschwindigkeit von 0,5 ml/Min. äquilibriert wurde. Es wurden 1 ml Fraktionen gesammelt und auf eine Aktivität der Asparagin-Endoproteinase getestet. Die am meisten aktiven Fraktionen wurden unter Verwendung des "Ultrafree Biomax" Filters in drei Pools bzw. Vereinigungen (#53–56, #57–64, #65–68) konzentriert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Mikro BCA Protein Test-Kit (Pierce, Inc.) unter Verwendung von BSA als Standard, bestimmt.
Der am meisten aktive Pool (#57–64) mit einer spezifischen Aktivität von 1054 Einheiten/mg Protein (1 Einheit = 100 ng Leucin äquivalent produziert/Min.) wurde einem SDS-PAGE unterzogen. Dieses Gel (13 zeigt, dass diese Fraktion mehrere Polypeptide beinhaltet. Ein N-terminales Sequenzieren der hauptsächlichen Banden ergab, dass lediglich die 30,5 kDA Bande (DSEETDIVAL) der Sequenz des TcAP2 Proteins von Kakao genau entspricht. Es wurde festgestellt, dass die anderen hauptsächlichen Polypeptide in der Präparation mögliche Proteinkörper-Proteine darstellen. Die N-terminale Sequenz (TVISTYWGQNGFEGT) des 27,9 kDa Polypeptids zeigt die größte Homologie (76,9%) mit einer Glycin max Säure Chitinase III-A (Zugangsnummer AB007127). Somit besteht die Möglichkeit, dass das 27,9 kDa umfassende Protein eine saure Chitinase darstellt. Die für das 20,2 kDa umfassende Polypeptid (ANSP) erhaltene N-terminale Sequenz bestätigte, dass diese Bande das Trypsin-Inhibitor-Protein von Kakao (Zugangsnummer X56509) darstellt. Um zu verifizieren, ob die Endoproteinase aus zwei Untereinheiten (29 und 13 kDa) (Voigt et al., J. Plant Physiol. 145 (1995), 299–307) wirksam zusammengesetzt war, wurden mehrere Polypeptide, die kleiner als 15,6 kDa sind, ebenfalls sequenziert. Es wurde festgestellt, dass alle untersuchten Banden Fragmente des 20,2 kDA umfassenden Trypsin-Inhibitor-Proteins von Kakao waren und keine einem möglichen 13,2 kDa von TcAP2 entsprach. Weiterhin wird die Vorstellung, dass dieses Polypeptid alleine proteolytisch aktiv ist durch die Tatsache gestützt, dass das 30,5 kDa umfassende Polypeptid beide katalytischen Triaden (D¹⁰⁸TG, D²⁹⁵SG) beinhaltet. Folglich ist TcAP2 eine neue monomere Asparagin-Endoproteinase.
Beispiel 7
Charakterisierung der gereinigten nativen Aktivität von Asparagin-Endoproteinase
Hemmstoff-Empfindlichkeit: Die Hemmstoff-Empfindlichkeit der nativen Asparagin-Endoproteinase wurde in 300 μl Reaktionen bestimmt, die 200 mM Natriumcitrat, pH-Wert 3, 10 mg/ml Rinder-Hämoglobin und 5 μl des über Größenausschluss gereinigten Pools #57–64 (2,4 μg Protein/μl) beinhalteten. Die Hemmstoffe wurden hinzugegeben, um eine Endkonzentration von 2 μM Pepstatin, 2 mM 1,10 Phenanthrolin, 100 μM Dichlorisocoumarin (DCI), 10 μM E-64 zu ergeben. Die Enzymaktivität wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, bestimmt. Die Tatsache, dass lediglich Pepstatin A die Aktivität (Tabelle 2) vollständig hemmt, bestätigt, dass die gereinigte Proteaseaktivität eine Asparagin-Endoproteinase ist. Tabelle 2. Inhibitor-Empfindlichkeit der gereinigten Asparagin-Endoproteinase Aktivität. Zwei Wiederholungen wurden für jeden Test ausgeführt.

Hemmstoff mM Restaktivität %

- - 100

Pepstatin A 0,002 0%

1,10 Phenanthrolin 2,0 86%

E-64 0,01 88%

DCI 0,1 90%
Bestimmung des optimalen pH-Werts: Der bei unterschiedlichen pH-Werten ausgeführte Aktivitätstest, weist darauf hin, dass das gereinigte Enzym eine optimale Aktivität bei einem pH-Wert von 3,0 (Daten nicht gezeigt) aufweist.
Beispiel 8
Analyse der gebildeten Produkte, wenn eine teilweise gereinigte Präparation der Asparagin-Endoproteinase unter sauren Bedingungen inkubiert wird.
Um die Peptide zu untersuchen, die durch die native Asparagin-Endoproteinase des Kakaosamen erzeugt bzw. hergestellt werden, wurde eine über Q Sepharose Fast Flow teilweise gereinigte Präparation von TcAP2 (197 μg Protein, 1,35 Aktivitäts-Einheiten/μg, spezifische Aktivität 821 Einheiten/mg Protein) unter sauren Bedingungen inkubiert. Es wurden 120 μl des teilweise gereinigten Enzyms mit 30 μl von 1 M Natriumcitrat pH-Wert 3 vermischt. Es wurden Proben von 4 μl und 70 μl gerade vor Inkubation bei 42°C (t = 1 Min.) und nach sieben Stunden herausgenommen. Die 4 μl umfassenden Proben wurden für eine SDS-PAGE Analyse in Lade-Puffer für ein SDS-Gel aufgenommen. Die Reaktion der 70 μl umfassenden Proben wurde durch Zugabe von SDS mit einer Endkonzentration von 1% gestoppt, die Proben wurden gefriergetrocknet, mit 100 μl 6 M Harnstoff, 20 mM Natriumphosphat pH-Wert 7 löslich gemacht, auf eine Superdex Peptid HR 10/30 Säule geladen (Amersham Pharmacia Biotech) und mit 6 M Harnstoff, 20 mM Natriumphosphat pH-Wert 7 bei Raumtemperatur eluiert.
Das in 14 dargestellte Gel zeigt, dass nach 7 Stunden nahezu alle Proteine, die in der 1 Min. Probe gesehen werden im wesentlichen hydrolysiert sind. Lediglich zwei signifikante Banden bleiben, eine von denen entspricht einer reduzierten Menge des 30,5 kDA umfassenden Asparagin-Endoproteinase Polypeptides des Kakao, was eine erhöhte Resistenz der Asparagin-Endoproteinase gegenüber einem autokatalytischen Abbau anzeigt. Wurden die Produkte des Abbaus der Asparagin-Endoproteinase bei hoch auflösender Größenausschluss-Chromatographie (15) untersucht, dann wurde ein wesentlicher Anteil von kleinen Oligopeptiden detektiert, wobei ein großer Anteil der Peptide Größen aufweist, die von 2 bis 70 Aminosäuren reichen. Diese Beobachtung weist darauf hin, dass ein Reagierenlassen der hauptsächlichen Asparagin-Endoproteinase (TcAP2) der Kakaosamen mit Proteinen einen wesentlichen Spiegel von sehr kleinen Peptiden erzeugen kann und folglich, dass die Wirkung dieses Enzyms einen wesentlichen Anteil der in fermentierten Kakaobohnen aufgefundenen Vorläuferpeptide des Kakaoaromas bzw. -geschmacks erzeugen kann. SEQUENZLISTE

Claims

Rekombinante Asparagin-Endoproteinase, wie durch SEQ ID Nr. 1 identifiziert.
DNA-Sequenz, die eine Asparagin-Endoproteinase nach Anspruch 1 kodiert.
DNA-Sequenz nach Anspruch 2, die durch SEQ ID Nr. 3 identifiziert ist.
Vektor, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 2 und 3.
Zelle, die eine rekombinante DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 4 enthält.
Zelle nach Anspruch 5, die eine prokaryotische Zelle, eine eukaryotische Zelle oder eine Pflanzenzelle ist, vorzugsweise eine Kakao-Zelle.
Transgene Pflanze, die eine Zelle nach Anspruch 6 enthält.
Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 2 und 3 zur Herstellung einer Kakao-Asparagin-Endoproteinase.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Asparagin-Endoproteinase in einer geeigneten Zelle hergestellt wird.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Zelle eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle oder eine Pflanzenzelle ist, vorzugsweise eine Kakao-Pflanzenzelle.
Verwendung einer Asparagin-Endoproteinase nach Anspruch 1 für die Zubereitung von Kakao-Geschmack.
Verwendung einer Asparagin-Endoproteinase nach Anspruch 1 zum Hydrolysieren von Proteinen.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Proteine von Nahrungsmittel-Material abgeleitet sind.
Verfahren zur Herstellung von Kakao-Geschmack, umfassend, Unterwerfen eines Materials, das geeignet ist, Kakao-Geschmack-Vorläufer hervorzubringen, einem enzymatischen Abbau, der die Verwendung einer Asparagin-Endoproteinase nach Anspruch 1 einschließt.
Verfahren zum Hydrolysieren von proteinhaltigem Material in einer Pflanze, umfassend, Exprimieren einer Asparagin-Endoproteinase nach Anspruch 1 in Pflanzenzellen, insbesondere Samenzellen, und dann Herbeiführen der Hydrolyse des zellulären Proteins durch die Behandlung derartiger Pflanzenzellen mit einer sauren Lösung.