DE60128252T2

DE60128252T2 - Membranfraktionen von mit 1,2-sn-Diacylglycerol angereicherten Zellen

Info

Publication number: DE60128252T2
Application number: DE60128252T
Authority: DE
Inventors: Eric Marechal; Stephane Miras; Jacques Joyard
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2000-10-31
Filing date: 2001-10-26
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2021-10-27
Also published as: ATE361376T1; US7435583B2; CA2427267A1; DE60128252D1; WO2002036811A1; EP1330537A1; US20040013739A1; FR2815968B1; JP2004529612A; AU1411302A; FR2815968A1; EP1330537B1; AU2002214113B2; JP4024147B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Membranfraktionen von Zellen, die eine rekombinante Monogalaktosyldiacylglycerin(MGDG)-Synthase enthalten, und mit 1,2-sn-Diacylglycerin (DAG) angereichert sind, ein Verfahren zur Herstellung derselben, sowie ihre Verwendung zum Screenen von Effektormolekülen der MGDG-Synthase-Aktivität. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Screenen von Effektormolekülen der MGDG-Synthase-Aktivität, bei dem die Membranfraktionen verwendet werden.
MGDG ist aus allen bisher analysierten Plastiden bekannt: in Plastidmembranen, in denen es über 50% der Glycerolipide ausmacht, ist es das Lipid, das am häufigsten vorkommt. MGDG ist für die Plastidbiogenese und das Überleben der Zellen essentiell, und es kommt in keinen anderen Membransystemen vor, insbesondere nicht in Tierzellen (Douce, Sciences, 1974,183, 852–853); seine Biosynthese wird in der Hülle durch eine Uridin-5'-diphosphatgalaktose(UDP-Gal)-1,2-diacylglycerin-3-β-Dgalaktosyltransferase (EC 2.4.1.46), auch MGDG-Synthase genannt, entsprechend der folgenden Reaktion katalysiert:
Die MGDG-Synthase ist ein bifunktionelles Enzym mit nicht geordneter Substratbindung (Maréchal et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 5788–5798), das oxidationsempfindliche und für die Katalyse wichtige Cysteine aufweist (Maréchal et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 11, 5714–5722).
Daher ist die MGDG-Synthase auch ein Hauptenzym der Biogenese der Plastide und daher ein Ziel erster Wahl zur Selektion oder zum Screenen von Molekülen mit Herbizidpotential. Zudem enthalten die Parasiten, die verantwortlich für Malaria (4 Plasmodium-Spezies, einschließlich P. falciparum), Toxoplasmose (Toxoplasma gondii) und Tierplagen wie zum Beispiel Coccidiosis (Eimeria) sind, degenerierte Chloroplasten (Apicoplasten), von denen gezeigt wurde, dass sie für das Überleben der Parasiten essentiell waren (G. Mc Fadden und David Roos, "Apicomplexan plastids as drug targets", 1999, 7, Nr. 8, 328–333).
Parasiten, die diese Apikoplasten aufweisen, werden apikomplexe Parasiten genannt.
Ein Molekül mit hemmender Wirkung auf die MGDG-Synthase-Aktivität hat daher starkes Herbizidpotential und starkes Potential gegen apikomplexe Parasiten und kann vorteilhaft als neues, gegen apikomplexe Parasiten wirksames Medikament oder als Herbizid verwendet werden.
Die Verwendung einer MGDG-Synthase zur Selektion oder zum Screenen von Produkten, die die Aktivität von MGDG-Synthasen hemmen und als Herbizide oder als Wirkstoffe gegen apikomplexe Parasiten verwendet werden können, wurde bereits vorgeschlagen, insbesondere in der Patentanmeldung FR-A-2 790 915 .
Gemäß dieser Anmeldung erfolgt die Selektion und/oder das Screenen solcher Produkte gemäß einem Verfahren, das die Inkubation einer Testsubstanz mit einer in biologische Membranen eingebetteten MGDG-Synthase umfasst, und bei dem nach der Inkubation die spezifische Enzymaktivität gemessen wird.
Die biologischen Membranen, die in dieser älteren Anmeldung verwendet werden, können insbesondere Plastidmembranen sein, die aus Pflanzen isoliert wurden, oder auch Membranfraktionen von E. coli, der eine rekombinante MGDG-Synthase überexprimiert.
Die Bestimmung der Aktivität der Galaktosylierung durch MGDG-Synthase ist bislang sehr komplex und lässt sich insbesondere aus den folgenden Gründen nicht einfach miniaturisieren.

(1) Zugabe von zwei Substraten: Die beiden Substrate des Enzyms (DAG und UDP-Gal) sollten gleichzeitig in das Inkubationsmedium gegeben werden. Damit stellt sich ein Homogenitätsproblem für das System, insbesondere aufgrund der Tatsache, dass diese beiden Substrate sehr unterschiedliche physikochemische Eigenschaften haben: das eine ist sehr hydrophil (UDP-Gal), das andere sehr hydrophob (DAG). Daher ist die Zufuhrregelung dieser beiden Substrate schwer zu miniaturisieren.
(2) Zugabe eines Detergens: DAG ist so hydrophob, dass es mit Wasser nicht mischbar ist. Damit dieses exogene Substrat für das Enzym zugänglich ist, muss dem Inkubationsmedium daher ein Detergens zugesetzt werden, zum Beispiel 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS), das die biologischen Membranen vollständig zerstört und eine Reorganisation aller hydrophoben Moleküle in Form von Mizellen erlaubt. Die Mizellen sind zu klein, als dass sie durch Filtration oder Zentrifugation vom Reaktionsmedium abgetrennt werden könnten (Stoke-Radius 3,8 nm; Maréchal et al., 1994, wie oben zitiert).
(3) Phasentrennung: Zur Extraktion der Lipidphase, die das Reaktionsprodukt (MGDG) enthält, wird entsprechend dem von Bligh et al. beschriebenen Verfahren am Ende der Reaktion eine Mischung aus organischen Lösungsmitteln (Chloroform und Methanol) zugegeben (Can. J. Biochem. Physiol., 1959, 37, 911–917). Es bildet sich ein Zweiphasensystem, und die Lipide finden sich in der unteren organischen Phase. Die Bildung eines Zweiphasensystems und die Extraktion einer organischen Phase sind Verfahren, die für die Anwendung in einem miniaturisierten Verfahren zu kompliziert sind.

Bei der Suche nach Effektormolekülen der MGDG-Synthase-Aktivität ist es nun aber unabdingbar, über ein einfaches, kostengünstiges, schnelles und miniaturisierbares Verfahren verfügen zu können, das das testen einer großen Anzahl von Molekülen ermöglicht, die potentiell als Herbizide oder als Wirkstoffe gegen apikomplexe Parasiten geeignet sind.
Zur Lösung dieser Probleme haben die Erfinder den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
Tatsächlich haben die Erfinder neue biologische Membranfraktionen bereitgestellt, die in der gleichen Lipidschicht sowohl MGDG-Synthase als auch DAG aufweisen. Diese Membranen können in einem enzymatischen Verfahren mit hohem Durchsatz zum automatischen Screening und zur automatischen Selektion (High Throughput Screening; HTS) von Effektormolekülen der MGDG-Synthase-Aktivität (Inhibitoren oder Aktivatoren) verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Plasmamembranfraktionen von prokaryontischen oder eukaryontischen tierischen Zellen, die wenigstens eine rekombinante Monogalaktosyldiacylglycerin(MGDG)-Synthase enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktionen wenigstens 1 Gew.-% (DAG) enthalten, bezogen auf das Gesamtproteingewicht, und dass sie in Form kugelförmiger Vesikel vorliegen, die aus einer Lipiddoppelschicht gebildet sind.
Tatsächlich haben die Erfinder gezeigt, dass es die gleichzeitige Anwesenheit von MGDG-Synthase und DAG in den Membranfraktionen erlaubt, diese Membranfraktionen in einem Verfahren zum Screenen und/oder zur Selektion von Effektormolekülen der MDGD-Synthase-Aktivität zu verwenden, bei dem das Volumen an Reaktionsmedium wesentlich geringer sein kann, was die Miniaturisierung des Verfahrens ermöglicht.
Durch diese Membranfraktionen wird die Zugabe von Detergenzien zur besseren Kontrolle der Mischung aus MGDG-Synthase/DAG überflüssig, und die Enzymreaktion findet direkt in den Membranen statt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Molverhältnis von MDGD-Synthase/DAG weniger als 10, insbesondere weniger als 0,12.
Das Enzym/Substrat-Verhältnis sollte den Messbedingungen entsprechen, die die Anwendung des enzymologischen Modells nach Michaelis-Menten ermöglichen, vor allem sollte das Substrat nicht der limitierende Faktor für die Anfangsreaktion sein.
Die erfindungsgemäßen Membranfraktionen liegen in Form kugelförmiger Vesikel vor, die aus einer Lipiddoppelschicht gebildet sind und deren Größe im Allgemeinen zwischen 0,1 μm und 10 μm liegt.
Im Inneren dieser Vesikel ist die MGDG-Synthase im Allgemeinen auf der Innenseite der Lipiddoppelschicht lokalisiert.
Diese Vesikel können in Form nichtinvertierter, invertierter oder hybrider Vesikel vorliegen.
Tatsächlich erlaubt das Aufbrechen der Membranen die Bildung invertierter oder nichtinvertierter Vesikel, in beiden Fällen befindet sich die MGDG-Synthase jedoch auf der anderen Seite als das meiste DAG. Eine Fusion zwischen invertierten und nichtinvertierten Vesikeln kann zu einer neuen Vesikelfamilie führen, bei der MGDG-Synthase und DAG in der gleichen Lipidschicht vorliegen.
Diese Art Hybridvesikel kann eine erhöhte katalytische Aktivität (zugängliches Substrat) aufweisen, und stellt daher eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Membranfraktionen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es besteht:

– in einem ersten Schritt, Transformieren der prokaryontischen oder eukaryontischen tierischen Zellen mit einem Konstrukt, das das Gen enthält, das für eine Pflanzen-MGDG-Synthase codiert,
– in einem zweiten Schritt, Kultivieren der Zellen in einem Kulturmedium, das die Proteinsynthese begünstigt, so dass die Synthese der MGDG-Synthase durch die Zellen induziert wird,
– in einem dritten Schritt, Inkubieren der in dem vorhergehenden Schritt kultivierten Zellen in einem Reaktionsmedium, das wenigstens eine Phospholipase C enthält,
– und dann in einem vierten Schritt, Fraktionieren der so an DAG angereicherten Zellen, um Membranfraktionen in Form kugelförmiger Vesikel zu erhalten, die aus einer Lipiddoppelschicht gebildet sind und wenigstens eine rekombinante MGDG-Synthase und wenigstens 1 Gew.-% DAG enthalten, bezogen auf das Gesamtproteingewicht der Membranfraktionen.

Als prokaryontische Zellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Bakterien wie E. coli zu nennen, die erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind.
Als eukaryontische Zellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Hefezellen zu nennen, wie Saccharomyces cerevisiae, Insektenzellen, wie Drosophila, sowie Sängerzellen, wie sie üblicherweise zur Expression von Genen verwendet werden, beispielsweise COS-Zellen und CHO-Zellen.
Die Transformation der Zellen im ersten Schritt erfolgt bevorzugt mit Bakterienzellen und insbesondre mit E. coli-Zellen.
Diese Transformation kann gemäß dem in der Patentanmeldung FR-A-2 790 915 beschriebenen Verfahren durchgeführt, werden, zum Beispiel durch Hitzeschock mit einem pET-Y3a-Plasmid, das die Sequenz enthält, die für die MGDG-Synthase A von Arabidopsis thaliana codiert (Miège et al., Eur. J. Biochem., 1999, 265, 990–1001).
Das im zweiten Schritt verwendete Kulturmedium ist ein Vollmedium, damit die Expression der MGDG-Synthase gefördert wir, und wird entsprechend dem zu kultivierenden Zelltyp gewählt. Im dem besonderen Fall von Bakterienzellen und insbesondere bei E. coli kann Luria Broth (LB) als Medium verwendet werden.
Die Verwendung von PLC im dritten Schritt des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens ist für die Anreicherung der Plasmazellmembranen mit DAG unabdingbar.
Tatsächlich sind diese Zellmembranen reich an Phospholipiden, insbesondere an Phosphatidylethanolamin (80% der Phospholipide). Diese Phospholipide können durch PLC hydrolysiert werden, die nicht für den polaren Kopf spezifisch ist.
PLC katalysiert die Umwandlung von Phosphatidylethanolamin zu DAG gemäß der folgenden Reaktion:
PLC ermöglicht daher die Anreicherung die Zellmembranen mit DAG durch die Hydrolyse ihrer Phospholipide.
Die Art des erfindungsgemäß verwendeten PLC ist nicht entscheidend, solange sie für die Phospholipide der Membranen, in denen DAG angereichert werden soll, aktiv ist.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Phospholipase C von Bacillus cereus verwendet.
PLC wird bevorzugt in einer Konzentration zwischen 1 U und 20 U pro ml Reaktionsmedium eingesetzt, und besonders bevorzugt bei einer Konzentration zwischen 5 und 12 U.
Natürlich ist das Reaktionsmedium, das im dritten Schritt verwendet wird, im Allgemeinen ein Puffermedium, dessen pH so sein sollte, dass eine gute Funktion der PLC gewährleistet ist. Dieser pH liegt gewöhnlich zwischen 6 und 8.
Im vierten Schritt werden die Membranen fraktioniert, um Membranfraktionen zu bilden, die sich spontan wieder in der Form von Membranvesikeln schließen. Die Fraktionierung der Membranen kann durch mechanischen Schock, zum Beispiel mittels einer French-Press, durch Hitzeschock (Einfrieren/Auftauen), durch osmotischen, elektrischen oder auch einen physischen Schock, wie zum Beispiel durch Ultraschallbehandlung, erfolgen.
Die auf diese Weise erhaltenen Membranfraktionen können anschließend zum Beispiel über ein Percoll-Kissen gereinigt werden.
Wenn die Herstellung der erfindungsgemäßen Membranfraktionen beendet ist, können diese gegebenenfalls eingefroren werden, bevor sie zur Selektion oder zum Screenen von Effektormolekülen der MGDG-Synthase-Aktivität verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher auch die Verwendung der oben beschriebenen Membranfraktionen zur Selektion oder zum Screenen in vitro von Effektormolekülen der MGDG-Synthase-Aktivität.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Verwendung von Membranfraktionen, wie sie oben beschrieben wurden, zur Selektion oder zum Screenen von Inhibitormolekülen der MGDG-Synthase-Aktivität, die als Wirkstoffe gegen Parasiten oder als Herbizide geeignet sind.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Selektion und/oder zum Screenen von Effektormolekülen der MGDG-Synthase-Aktivität, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst:

– einen Inkubationsschritt der Testsubstanz oder der Testsubstanzen mit einer ausreichenden Menge der oben beschriebenen Membranfraktionen und mit radiomarkierter UDP-Galaktose in einer wässrigen Phase mit einem pH zwischen 4 und 11,
– einen Schritt mit ein oder mehrmaligem Waschen der Membranfraktionen.
– einen Schritt des Abtrennens der Membranfraktionen,
– und dann einen Schritt zur Bestimmung der Aktivität der MGDG-Synthase.

Entsprechend diesem Verfahren findet die Enzymreaktion direkt im Inneren der Membranfraktionen statt, deren Größe so ist, dass sie durch Zentrifugation oder Filtration vom Reaktionsmedium abgetrennt werden können. Dadurch ist es nicht mehr notwendig, organische Lösungsmittel zur Extraktion der Reaktionsprodukte zu verwenden, da das MGDG tatsächlich in den Membranfraktionen eingeschlossen ist, mit denen eine einfache Messung der Radioaktivität der eingebauten radiomarkierten Galaktose erfolgen kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die wässrige Phase für die Inkubation einen Puffer und hat einen pH zwischen 6 und 8.
Der Puffer kann zum Beispiel insbesondere 3-(N-morpholino)propansulfonsäure oder eine KCl/K₂HPO₄-Mischung sein.
Die in dem Inkubationsmedium zu verwendende Menge an UDP-Galaktose sollte natürlich so ausreichend sein, dass sie keinen limitierenden Faktor für die Reaktion darstellt. Diese Menge liegt bevorzugt zwischen 0,1 und 10 nmol pro μl Reaktionsmedium.
Der Inkubationsschritt wird bevorzugt wenigstens 10 Sekunden lang und insbesondere 1 bis 45 Minuten lang bei Umgebungstemperatur durchgeführt.
Am Ende des Inkubationsschrittes wird die Reaktion bevorzugt durch Abkühlen des Inkubationsmediums (im Allgemeinen auf eine Temperatur von etwa 4°C) oder durch Abzentrifugieren gestoppt.
Nach Beendigung der Reaktion erfolgt das Waschen der Membranfraktionen, um die überschüssige radiomarkierte UDP-Galaktose, die von den Membranfraktionen nicht eingebaut wurde, zu eliminieren. Es können eine oder mehrere Waschschritte nacheinander durchgeführt werden, im Allgemeinen mit Wasser.
Die Membranfraktionen werden anschließend durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt, wobei letztere Methode zur Miniaturisierung des Verfahrens auf Mikrotiterplatten besonders geeignet ist.
Die Bestimmung der MGDG-Synthase-Aktivität erfolgt durch Messung der Menge der in die Membranfraktionen eingebauten radiomarkierter Galaktose. Diese Messung erfolgt in klassischer Weise mit einem Radioaktivitätszähler.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Selektion und/oder zum Screenen von Effektormolekülen der MGDG-Synthase-Aktivität kann leicht miniaturisiert werden, da es geringe Reaktionsvolumina einsetzt und weder Detergenzien noch organische Lösungsmittel benötigt werden, wie dies bei den oben beschriebenen Verfahren des Standes der Technik der Fall ist.
Gegenstand der Erfindung sind daher ferner Mikrotiterplatten, die eine Vielzahl an Vertiefungen haben, dadurch gekennzeichnet, dass der Boden der Vertiefungen aus einem Filter besteht und dass die Vertiefungen Membranfraktionen enthalten, wie sie oben beschrieben sind.
Diese Mikroplatten können vor der Verwendung in einem Gefrierschrank aufbewahrt werden. Gegebenenfalls können sie mit einem abnehmbaren Boden ausgerüstet sein.
Die erfindungsgemäßen Mikroplatten ermöglichen die Bestimmung der MGDG-Synthase-Aktivität durch direkte Messung der Radioaktivität der radiomarkierten Galaktose, die in die Membranfraktionen eingebaut ist, die von dem Filter am Boden der Vertiefungen zurückgehalten wird.
Sie können daher zum Testen von Molekülbanken („Chimiotheken") auf Effektorwirkung für die MGDG-Synthase-Aktivität verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich die Verwendung von wenigstens einem Inhibitormolekül der MGDG-Synthase-Aktivität, wie es entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Screening und zur Selektion selektiert wurde, zur Herstellung eines Medikaments gegen Parasiten oder eines Herbizids.
Neben den obigen Ausführungsformen bezieht sich die Beschreibung auf ein Beispiel für die Herstellung der erfindungsgemäßen Membranfraktionen, ein Vergleichsbeispiel zur Bestimmung der Aktivität der MGDG-Synthase, ein Beispiel zum Nachweis der MGDG bei einem apikomplexen Parasiten, sowie die anliegenden Figuren, von denen:
1 die Menge an nmol Galaktose, die pro Stunde in die mit DAG angereicherten Membranfraktionen eingebaut werden, als Funktion der Anzahl der μg Protein zeigt,
2A die Menge an nmol Galaktose, die pro Stunde und pro mg Protein eingebaut werden (mit DAG angereicherte Membranfraktionen), als Funktion der Menge an μmol DAG zeigt,
2B ein reziprokes Koordinatensystem nach Lineweaver und Burk darstellt, in dem der Kehrwert der Menge an μmol Galaktose, die pro Stunde und pro mg Protein eingebaut werden, als Funktion des Kehrwerts der Menge an μmol DAG ausgedrückt sind;
3 die Menge der von den Membranlipiden von Toxoplasma gondii eingebauten markierten Galaktose zeigt.
Es versteht sich jedoch, dass diese Beispiele lediglich der Veranschaulichung des Gegenstands der Erfindung dienen und diese in keiner Weise einschränken.
Beispiel 1:
Herstellung von Membranfraktionen, die eine MGDG-Synthase und DAG umfassen.
1. Herstellung von rekombinanter MGDG-Synthase in E. coli.
A) Transformation von Bakterien
Die Transformation von Bakterien erfolgte gemäß dem in der Patentanmeldung FR-A-2 790 915 beschriebenen Verfahren.
Alle Kultivierungen werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Kompetente Bakterien (Bakterienstamm BL21 oder BLR von Escherichia coli) werden durch Hitzeschock mit einem pET-Y3-Plasmid transformiert, das es erlaubt, das Problem zu umgehen, dass die von MGDG-Synthase abgeleitete Sequenz 22 Argininreste enthält, von denen 17 durch AGG oder AGA codiert werden, Codons, die von E. coli tatsächlich sehr selten verwendet werden.
Plasmid pET-Y3 wurde in der Patentanmeldung FR-A-2 790 915 beschrieben und wird gebildet, indem das arg U-Gen (oder DNA Y), das für die Transfer-RNA von Arginin für die seltenen Codons AGA/AGG codiert, in das Plasmid pET-3a (Novagen) inseriert. Plasmid pET-Y3a enthält die für die MGDG-Synthase A von Arabidopsis thaliana codierende Sequenz (unter Kontrolle eines durch Isopropyl-β-Dthiogalaktopyranosid, IPTG, induzierbaren Promotors), ein Resistenzgen für Carbenecillin und eine für die Transfer-RNA von Arginin codierende Sequenz. Diese ARG4-tRNA erlaubt die Synthese von Proteinen wie MGDG-Synthase, deren Sequenz zahlreiche Arg-Codons enthält, die bei Bakterien selten vorkommen.
B) Herstellung von rekombinanter MGDG-Synthase A in E. coli
Eine isolierte Kolonie von rekombinanten Bakterien wird in Gegenwart von Antibiotikum (20 μg/ml Endkonzentration an Carbenecillin) in 8 ml Luria Broth (LB) transferiert. Die Vorkultur wird unter regelmäßigem Schütteln bei 37°C inkubiert und die Entwicklung des Bakterienwachstums wird durch Messen der optischen Dichte (CD) bei 600 nm bis zu einem Wert von 0,5 verfolgt.
Die Vorkultur wird in 500 ml LB-Medium (20 μg/ml Endkonzentration an Carbenecillin) transferiert und bei 37°C unter regelmäßigem Schütteln inkubiert. Bei einer optischen Dichte von 0,5, gemessen bei 600 nm, befindet sich die Bakterienpopulation dann in der exponentiellen Wachstumsphase, einem Augenblick intensiver Proteinsynthese.
Die Zugabe von IPTG (Endkonzentration 0,4 mM) erlaubt es, die Synthese der rekombinanten MGDG-Synthase zu induzieren.
Die Kultur wird dann 3 Stunden lang unter Schütteln bei 28°C inkubiert, um die Bildung des Proteins in aktiver Form zu fördern.
Die Suspension der induzierten Bakterien wird in zwei Fraktionen von 250 ml aufgeteilt, die 15 min bei 5 000 U/min (Sorvall^®-Zentrifuge RCSC, GS-3-Rotor) zentrifugiert werden.
Die erhaltenen Pellets werden in 10 ml Kulturmedium resuspendiert (LB, Carbenecillin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml) und 15 Minuten lang bei 5 000 U/min (Sorvall^® RCSC, SLA TC Rotor) zentrifugiert.
Der Überstand wird verworfen und das Bakterienpellet bei –80°C aufbewahrt.
2. Anreicherung der Bakterienmembranen mit DAG durch Behandlung mit Phospholipase C.
5 ml der Bakterienpellets, die im vorhergehenden Schritt zur MGDG-Synthase induziert wurden, werden in 5 ml 10 mM 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure (MOPS), pH 7,8, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 10% (W/V) Glycerin resuspendiert.
Es werden 20 μl Phospholipase C (PLC) von Bacillus cereus (Phosphatidylcholin-Cholinphosphohydrolase, EC 3.1.4.3) hinzugegeben, um eine Endkonzentration von 8 U/ml zu erhalten. Die Umsetzung erfolgt 3 Stunden bei Umgebungstemperatur unter Agitation und wird durch Zugabe von EDTA (0,4 M Endkonzentration) gestoppt.
3. Reinigung der Bakterienmembranen
Eine Lösung der wie im vorhergehenden Schritt erhaltenen induzierten Bakterien, deren Membranen durch Behandlung mit PLC mit DAG angereichert waren, wird in 50 ml 5 mM MOPS, pH 7,8, 0,5 M DTT und 5% Glycerin (W/V) aufgenommen.
Die Bakterien werden mittels French-Press unter hohem Druck (800 psi) aufgebrochen: die Membranen organisieren sich dann spontan in der wässrigen Lösung zu Vesikeln und invertierten Vesikeln.
6 ml des erhaltenen Lysats werden auf ein 35% Percoll-Kissen (in 10 mM MOPS, pH 7,8, 1 mM DTT, 10% Glycerin) geschichtet und dann 10 Minuten lang bei 5 000 U/min bei einer Temperatur von 4°C zentrifugiert (Sorvall^® RC SC, HB-6-Rotor).
Es werden Vesikel erhalten, die aus einer Lipiddoppelschicht bestehen, die die MGDG-Synthase und wenigstens 1 Gew.-% DAG enthalten, bezogen auf das Gesamtproteingewicht.
Dann werden vier Fraktionen gebildet: der Überstand (im oberen Teil des Röhrchens), die Interphase zwischen Überstand/Percoll, das 35% Percoll-Kissen, und das Pellet.
Alle Membranfraktionen werden gesammelt und durch Verdünnung mit 5 Volumenteilen 10 mM MOPS, pH 7,8, 1 mM DTT, 10% Glycerin (W/V) gewaschen und 15 Minuten lang bei 5 000 U/min bei einer Temperatur von 4°C zentrifugiert (Sorvall^® RCSC, HB-6 Rotor).
Die Überstände werden verworfen und die empfindlichen Pellets werden vorsichtig in 1 ml Waschmedium aufgenommen und dann erneut 10 Minuten lang bei 13 000 U/min bei einer Temperatur von 4°C zentrifugiert (Eppendorff-Zentrifuge 5804).
Die Pellets werden in 500 μl 10 mM MOPS, pH 7,8, 1 mM DTT, 10% Glycerin (W/V) resuspendiert und bei –20°C aufbewahrt.
Beispiel 2:
Vergleichende Bestimmung der Aktivität der MGDG-Synthese gemäß dem Stand der Technik und gemäß der vorliegenden Erfindung
I. Klassische Messung der Aktivität der MGDG-Synthese nach dem Verfahren von Bligh und Dyer (1959)
Dieses Verfahren wurde in dem Artikel von Bligh und Dyer „A Rapid Method Of Total Lipid Extraction and Purification", Can. J. Biochem. Physiol. 1959, 37, 911–917, beschrieben.
Die Messung der Galaktosylierungsaktivität basiert auf dem Einbau von Galaktose aus der radioaktiven (¹⁴C) UDP-Gal in die Lipidfraktion des Reaktionsmediums.
Die Reaktion läuft bei Umgebungstemperatur ab. 100 μg des hydrophoben DAG-Substrats (1 mg/ml) und 200 μg Phosphatidylglycerin (PG), gelöst in Chloroform (10 mg/ml), werden in ein Röhrchen gegeben, unter Argon getrocknet, und dann in 11 μl eines detergenzienhaltigen Mediums (85 mM CHAPS, 0,7 M MOPS, 14 mM DTT), 75 μl KCl (1 M) und 75 μl KH₂PO₄ (1 M) resuspendiert.
Die Anwesenheit von Detergens, in diesem Falle CHAPS, ermöglicht die Bildung von Mischmizellen, die das Detergens, das DAG, das PG und die MGDG-Synthase, die aus der Probe stammen, enthalten.
Nach Zugabe von 150 μl Probe entspricht die Endzusammensetzung des Reaktionsmediums (50 mM MOPS, 1 mM DTT, 250 mM KCl, 250 mM KH₂PO₄, 6 mM CHAPS in 300 μl Endvolumen) den Kriterien des Oberflächenverdünnungsmodells (Maréchal et al, 1995, wie oben zitiert).
In diesem Beispiel wird CHAPS als Detergens verwendet, es können jedoch auch andere Detergenzien verwendet werden, wie zum Beispiel Cholat, Deoxycholat, Triton-X100^®, NONIDET^®, Octylglukosid oder Laurydimethylaminoxid (LDAO).
Die Reaktion wird gestartet, indem man 10 μl UDP-[¹⁴C]-Galaktose (New England Nuclear 25 Bq/μmol, 10 mM) zugibt. Die Reaktion wird gestoppt, in dem 1,5 ml einer ½-Mischung von Choloroform/Methanol (V/V) zugegeben werden.
Die Zugabe von 0,5 ml Chloroform und von 0,6 ml Wasser erlaubt nach 10-minütigen Zentrifugation bei 1 000 U/min (Eppendorff-Zentrifuge A-4-44, Rotor 5804) den erhalt eines scharfen Zweiphasensystems (mit einer stark radioaktiven wässrigen Phase im oberen Teil des Röhrchens und einer organischen Phase im unteren Teil).
Die wässrige Phase enthält die Radioaktivität der restlich UDP-Gal, die von dem Enzym nicht verbraucht wurde, während die organische Phase die Radioaktivität des hydrophoben Reaktionsproduktes enthält: das MGDG.
Nach zweimaligem Waschen der wässrigen Phase mit einem gleichen Volumen wässriger Phase ohne UDP-[¹⁴C]-Gal, wird die organische Phase, die das MGDG enthält, in ein Zählröhrchen überführt.
Die erhaltene Fraktion wird unter Argon getrocknet und in 10 ml Szintillationsflüssigkeit aufgenommen, und die Radioaktivität der Probe wird bestimmt.
Die Galaktosylierungsaktivität wird durch die μmol Galaktose definiert, die pro mg Protein und pro Stunde in die Lipidfraktion eingebaut werden.
II. Messung durch Reinigung der Membranen nach Zentrifugation gemäß der vorliegenden Erfindung.
Diese Messung kann nur für eine Probe durchgeführt werden, die aus Vesikeln von Membranen besteht, die sowohl das Enzym (MGDG-Synthase) als auch sein hydrophobes Substrat (DAG) einschließen. Denn nur in diesem Fall ist es nicht mehr notwendig, ein Detergens zuzugeben, damit Enzym und Substrat in Kontakt kommen.
Das verwendete Reaktionsmedium unterscheidet sich von dem des klassischen Verfahrens nach der Extraktion der Lipide mit organischen Lösungsmitteln.
Die Probe der wie oben in Beispiel 1, Schritt 3, erhaltenen Membranfraktion, die die MGDG-Synthase und das DAG enthält, wird auf ein Endvolumen von 300 μl suspendiert, das 250 mM KCl und 250 mM KH₂PO₄ enthält.
Die Reaktion wird durch Zugabe von [¹⁴C]-radiomarkierter UDP-Gal gestartet.
Die Reaktion wird durch 10-minütigen Transfer auf Eis gestoppt.
Das Auswaschen von überschüssiger UDP-[¹⁴C]-Gal (die nicht in die Membranen eingebaut wurde) erfolgt durch 10-minütige Zentrifugation der Probe bei 13 000 U/Min bei einer Temperatur von 4°C, und Aufnehmen des Pellets in 500 μl sterilem Wasser.
Dieser Waschschritt wird dreimal wiederholt. Das erhaltene Pellet wird durch 1-stündiges Zentrifugieren unter Vakuum getrocknet (Speed-Vac-Eppendorff Concentrator 5301). Die getrocknete Probe wird dann in einer 1/2-Mischung (V/V) aus Chloroform/Methanol aufgenommen, in ein Zählröhrchen überführt, unter Argon getrocknet und mit 10 ml Szintillationsflüssigkeit solubilisiert.
Die Radioaktivität der Probe wird mit einem Kontron^®-Zähler (Betamatic) bestimmt.
Die Galaktosylierungsaktivität wird durch die μmol Galaktose definiert, die pro mg Protein und pro Stunde eingebaut werden.
III. Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen
Die zu analysierenden Proben werden in dem Auftragsmedium (0,15 M Tris-HCl, pH 6,8, 10% Glycerin, 0,02% SDS, 0,01% Bromphenolblau, 0,025% DTT) gelöst und dann 4 Minuten lang kochen gelassen.
Die Acrylamidlösungen werden in einem 25 mM Tris-Puffer, (pH 8,3 im Trenngel und pH 6,5 im Sammelgel) mit 0,192 M Glycin und 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) hergestellt.
Die Elektrophorese auf dem Sammelgel (5% Acrylamid) und anschließend auf dem Trenngel (12% Acrylamid) erfolgt bei Umgebungstemperatur in 25 mM Tris-Puffer mit 0,192 M Glycin (pH 8,3) und 0,1% (W/V) SDS (Laemmli U. K., Nature, 1970, 227, 680–683) unter einer konstanten Spannung von 100 V.
Die Wanderung wird gestoppt, wenn das Bromophenolblau aus dem Gel läuft. Die Proteine werden dann mit Coomassieblau angefärbt (0,5% Coomassie Brillant Blue 8250 (W/V), 25% Methanol, 10% Essigsäure (V/V)).
Die Entfärbung des Gels findet nacheinander in Bädern mit 25% Isopropanol und 10% Essigsäure (V/V) statt.
IV. Proteinassay
Prinzip: Die Proteine werden nach der Methode von Lowry (Lowry et al., J. Biol. Chem., 1951,193, 265–275) durch Messung von zwei gleichzeitigen Farbreaktionen getestet.
Eine erste Reaktion, die der "Biuret"-Reaktion entspricht, führt zur Bildung eines Komplexes zwischen den Peptidbindungen der Proteine (-CO-NH-) und den Cu²⁺-Ionen im alkalischen Medium, und eine zweite Reaktion führt zur Reduktion des Folin-Ciocalteau-Reagens durch die Phenole der Tyrosine. Dieses Verfahren erlaubt es, Lösungen mit Konzentration im Bereich von 2 bis 200 mg/ml zu testen.
Experimenteller Ansatz: Das Volumen der zu testenden Probe wird mit sterilem Wasser auf 200 μl eingestellt, und dann wird improvisiert 1 ml Testreagens hergestellt (50 Volumenteile 2% Na₂CO₃, 0,1 N NaOH + 1 Volumenteil CuSO₄, 0,5% SH₂O, 1% Natriumtartrat).
Nach 10-minütiger Reaktion bei 20°C werden 100 μl Folin-Ciocalteau-Reagens zugegeben und die Reaktion wird 30 Minuten bei 20°C inkubiert.
Die Menge an Proteinen in der zu testenden Probe wird durch Vergleich der Extinktion bei 750 nm anhand einer mit Rinderserumalbumin (BSA) erstellten Eichkurve bestimmt.
V. Ergebnisse
A) Die rekombinanten Bakterien müssen künstlich mit DAG angereichert werden, um die Messung der Galaktosylierungsaktivität in Gegenwart von UDG-Gal zu ermöglichen.
Die Analyse von Gesamtprotein der Bakterienproben, die während des Induktionsschritts (Beispiel 1, Schritt 1, 1) genommen wurden, zeigt, dass die Induktion mit IPTG zur Akkumulation von MGDG-Synthase A führt, die etwa 30% des Proteins ausmacht.
Es erfolgte ein Vergleich der Galaktosylierungsaktivität, die in einem Rohextrakt induzierter Bakterien gemessen wurde, die MGDG-Synthase A exprimieren, mit und ohne DAG.
Die Messung der Galaktosylierungsaktivität erfolgte durch Extraktion der Lipide gemäß dem Verfahren von Bligh und Dyer (siehe oben) mit 20 μl einer bei 28°C induzierten Bakterienkultur in Abwesenheit von PG und gegebenenfalls mit 50 μg DAG.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in untenstehender Tabelle 1 dargestellt: Tabelle 1

Inkubation der Bakterien in 270 μM DAG MGDG-Synthase-Aktivität (in nmol eingebaute Galaktose pro Stunde)

Ja 576

Nein 5
Diese Ergebnisse zeigen, dass in dem Extrakt, der mit 270 μm DAG inkubiert wurde, eine beachtliche Galaktosylierungsaktivität beobachtet wird, während es praktisch keinen Galaktoseeinbau in die Bakterienmembranen gibt, die ohne exogene Zugabe von DAG inkubiert wurden.
Folglich besitzen die Bakterienmembranen nicht genügend endogenes DAG, um eine punktuelle Messung der Aktivität des rekombinanten Enzyms durchführen zu können.
B) Eine Behandlung der Bakterienmembranen mit PLC generiert DAG, das für die Messung der Galaktosylierungsaktivität verfügbar ist.
Die Galaktosylierungsaktivität der MGDG-Synthase wurde nach Synthese von endogenem DAG durch PLC oder nach Zugabe von exogenem DAG gemessen. Die Messung dieser Aktivität erfolgte mit 20 μl der gleichen, bei 28°C induzierten Bakterienkultur mit oder ohne 3 μl PLC (2000 U/ml), 50 μg DAG (1 mg/ml) und gegebenenfalls in Gegenwart von 1 oder 10 μl CaCl₂.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in untenstehender Tabelle II dargestellt: Tabelle II

DAG in μM PLC CaCl₂ in μM Eingebaute Galaktose (nmol/Stunde)

- - - 7

270 - - 30

- + - 91

270 + - 99

270 + 33 118

270 + 330 109

- + 33 94

- + 330 97
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung der Bakterienmembranen mit PLC die Messung einer Galaktosylierungsaktivität ermöglicht, die höher ist als diejenige ist, die nach Zugabe von 270 μm exogenem DAG erhalten wurde.
Die PLC ermöglicht es daher, die Membranen der Bakterien durch Hydrolyse ihrer Phospholipide mit DAG zu beladen. Der schwache Einbau von Galaktose, der erhalten wird, wenn DAG zugegeben wird, erklärt sich durch die Tatsache, dass eine sehr kleine Menge des zugesetzten DAG in der Lage war, ohne PLC in die Bakterienmembranen einzudringen und als Substrat für die MGDG-Synthase zu dienen.
Es ist ferner wichtig festzuhalten, dass Calcium, das ein Aktivator von PLC ist, keine Wirkung auf den gemessenen Galaktoseeinbau hat. Dies deutet darauf hin, dass die Ca²⁺-Konzentration der Bakteriensuspension für die Messung einer optimalen PLC-Aktivität ausreicht.
C) Einbau radioaktiver Galaktose in mit DAG angereicherte Membranen
Der Einbau radioaktiver Galaktose in die wie oben in Beispiel 1, Schritt B-3) beschriebenen lysierten Membranvesikel wurde gemessen und mit dem Einbau radioaktiver Galaktose durch Bakterien verglichen, die zur Expression der MGDG-Synthase A induziert, jedoch nicht lysiert waren. Die Galaktosylierungsaktivität wird mit 150 μl Probe (wie zuvor beschrieben) in Abwesenheit oder Gegenwart von 150 μg PG (10 mg/ml) und von 100 μg exogenem DAG (1 mg/ml) gemessen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind untenstehend in Tabelle III dargestellt: Tabelle III

Eingebaute Galaktose (nmol/Stunde)

Induzierte Bakterien, behandelt mit PLC Ohne exogene Zugabe von DAG +550 μM exogenes DAG und 667 μM PG

Nicht lysiert 2426 6622

Lysiert 3172 8663
Diese Ergebnisse zeigen, dass die mit lysierten Bakterien ohne Zugabe von DAG und PG gemessene Galaktosylierungsaktivität darauf hinweist, dass Vesikel, die sowohl MGDG-Synthase als auch DAG enthalten gebildet wurden, und dass das Enzym seine katalytische Fähigkeit behalten hat.
Sie zeigen ferner, dass die Aktivität der lysierten Fraktionen größer als die der nicht lysierten Fraktionen ist. Diese Beobachtung stimmt mit einer Lokalisierung der MGDG-Synthase A auf der Innenseite der Lipiddoppelschicht der Bakterienmembranen überein. Da die PLC nur Zugang zur äußeren Lipidschicht hat, kann insbesondere der Anteil der MGDG-Synthase, der auf der Innenseite lokalisiert ist, nur einen Teil des gebildeten DAG einfangen, der eine transversale Verschiebung von der äußeren Schicht zur inneren Schicht der Membran vollzogen hat. Das Aufbrechen der Membranen erlaubt die Bildung invertierter oder nichtinvertierter Vesikel, in beiden Fällen befindet sich die MGDG-Synthase jedoch auf der anderen Seite als das meiste DAG. Eine Fusion zwischen invertierten und nichtinvertierten Vesikeln kann zu einer neuen Vesikelfamilie führen, bei der das Enzym und das DAG in der gleichen Membranschicht vorliegen. Dieser Vesikeltyp kann eine erhöhte katalytische Aktivität aufweisen (zugängliches Substrat). Unter der Annahme, dass die Bildung dieser drei Vesikelpopulationen, invertiert, nichtinvertiert und hybrid, gleichermaßen wahrscheinlich ist, ist die Aktivität der lysierten Proben im Vergleich mit den nichtlysierten Proben also um einen Faktor 1,33 erhöht, was im vorliegenden Fall zu beobachten ist.
D) Entwicklung eines miniaturisierbaren Assays
1. Beweis der Rolle von PLC
Eine Suspension von lysierten Bakterien, die Membranvesikel enthält, die durch Behandlung mit PLC mit MGDG-Synthase A und gegebenenfalls mit DAG angereichert sind, wird auf einem 35%-igen Percollgradienten (9ml) wie zuvor beschrieben fraktioniert. Die Fraktionen, die dem Überstand und der Interphase (S + SL: 6 ml) entsprechen, so wie diejenigen, die dem Pellet (P: 1 ml) entsprechen, werden gesammelt.
Die Galaktosylierungsaktivität und die Proteinmengen werden an den verschiedenen entnommenen Fraktionen (S + SL = 6 ml, P = 1 ml) sowie an der Auftragsfraktion (D = 6 ml) gemessen.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in untenstehender Tabelle IV dargestellt: Tabelle IV

Fraktionen		Proteine in μg/ml	Gesamtaktivität (in nmol eingebautes UDP-Gal/Stunde)	Spezifische Aktivität (nmol eingebautes UDP-Gal/Stunde/mg)	Anreicherung
Ohne Behandl. mit PLC	D	400	103	43	1
	S + SL	136	363	445	10,3
	P	39	3	83	1,9
Mit Behandl. mit PLC	D	500	618	206	1
	S + SL	880	11 462	2 169	10,5
	P	70	67	955	4,6

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Membranen, die durch Behandlung mit PLC mit DAG angereichert wurden, in der Lage sind, viel mehr UDP-Gal umzuwandeln als die Membranen, die nicht mit DAG angereichert sind, weil sie nicht mit PLC behandelt wurden.
Die Analyse der Fraktionen durch Acrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen zeigt Anreicherung eines der MGDG-Synthase entsprechenden Polypeptids vom Überstand zum Pellet. Die geringe Galaktosylierungsaktivität im Pellet (Tabelle IV) lässt eine Anreicherung dieser Fraktion hauptsächlich an „Inclusion Bodies" (inaktives Enzym) vermuten. Die S + SL-Fraktionen, die die MGDG-Synthase A assoziiert mit den Membranen enthalten, die mit DAG angereichert sind, wurden daher ausgewählt, um die Enzymaktivität der MGDG-Synthase in Abhängigkeit von den Kriterien für die Validität der Michaelis-Menton-Enzymologie zu analysieren.
2. Analyse der Enzymaktivität der MGDG-Synthase
Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt, die die Anfangsgeschwindigkeit (in nmol eingebaute Galaktose pro Stunde) als Funktion der Menge μg Protein/Röhrchen zeigt. Die Anfangsgeschwindigkeiten wurden bestimmt, indem der Einbau von Galaktose nach 15 und 30 Minuten Inkubation verschiedener Mengen der Membranen, die mit PLC behandelt waren und sich in den behandelten Fraktionen S + SL befanden (25, 50, 75 μg Protein), gemessen wurde.
Diese 1 zeigt, dass der Einbau von Galaktose eine lineare Funktion der in Gegenwart von UDP-Gal inkubierten Probenmenge ist. Aus der Steigung der Kurve lässt sich eine Aktivität von 340 nmol eingebaute Galaktose pro Stunde und pro mg Protein ableiten.
Die Menge DAG, die nach Behandlung mit PLC erhalten wurde, ist unbestimmt, aber die Konzentration dieses Substrats in den Membranvesikeln bleibt unabhängig von der Proteinmenge der Probe konstant. Daher sind die Oberflächenkonzentration von DAG (Molenbruch oder Mol DAG pro Einheit Membranoberfläche) und die molare Konzentration von UDP-Gal konstant. Aus diesem Grund ist die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion direkt proportional zur Proteinmenge, was den limitierenden Charakter der Enzymmenge zeigt. Die Linearitätsrelation ist eine Bedingung für die Validierung der Bedingungen der enzymologischen Analyse nach Michaelis.
3. Bestimmung der Menge DAG, die in den Bakterienmembranen durch Behandlung mit PLC gebildet wird
Die Aktivität (Anzahl nmol eingebaute Galaktose/Stunde/mg) von 5 μg nicht mit PLC behandelter und auf einem Percollgradienten gereinigter Membranen wurde bei verschiedenen Zugabemengen von DAG gemessen (2A). Die Anfangsgeschwindigkeiten wurden bestimmt, indem der Einbau von Galaktose nach 15 und 30-minütiger Inkubation gemessen wurde. Die Messungen erfolgten mit verschiedenen Zugabemengen von DAG (12,5 μg; 25 μg; 37,5 μg; pro 300 μl Reaktionsmedium).
Die Messungen erlauben die Erstellung eines reziproken Koordinatensystems nach Lineweaver-Burk (2B).
Unter der Annahme, dass die Messungen, die an Membranen vorgenommen wurden, die nicht mit PLC behandelt wurden, Eichkurven zur Bestimmung des DAG-Gehalts sind, entspricht eine Probe von 5 μg, deren intrinsische Aktivität 340 nmol/h/mg beträgt, einer gleichen unbehandelten Probe, der 0,5 μg DAG zugesetzt wurden.
Daraus lässt sich schließen, dass durch Behandlung mit PLC etwa 0,1 μg DAG pro μg Protein erhalten werden können.
4. Messung der Galaktosylierungsaktivität von Membranen, die mit MGDG-Synthase und DAG angereichert sind, vor und nach Auftauen
Die Fähigkeit von Membranen, die einen Tag lang bei –20°C eingefroren waren, Galaktose einzubauen, wurde gemessen und mit derjenigen von Membranen verglichen, die nicht eingefroren worden waren.
Zwischen den beiden Proben wurden keine wesentlichen Unterschiede festgestellt.
Folglich ermöglicht diese Eigenschaft die Herstellung von Membranproben und deren reproduzierbare Verarbeitung in einem Automaten zum Screenen von Effektormolekülen der Aktivität der MGDG-Synthase, was Aufbewahrungsschritte für die Probe in der Kälte ohne Aktivitätsverlust umfassen kann.
5. Vereinfachte Messung der Galaktosylierungsaktivität in mit MGDG-Synthase und DAG angereicherten Membranproben
Membranvesikel, die MGDG-Synthase umfassen und durch die Behandlung mit Phospholipase C mit DAG angereichert und gegebenenfalls gereinigt sind, können also zur Messung der Produktion von MGDG in diesen Vesikeln verwendet werden.
50 μg Membranvesikel (entsprechend 50 μg MGDG-Synthase und 50 μg DAG) werden in einer wässrigen Phase (250 mM KCl, 250 mM K₂HPO₄, Endvolumen 300 μl, pH 7,8) in einem Röhrchen (Röhrchen Nr. 1) suspendiert.
Zum Vergleich wurde ein Kontrollröhrchen (Röhrchen Nr. 2) präpariert: 50 μg MGDG-Synthase und 50 μg DAG wurden in der gleichen wässrigen Phase suspendiert, wie sie in Röhrchen Nr. 1 verwendet wurde.
Die Reaktion wird in jedem Röhrchen durch Zugabe von 10 μl UDP-Gal, die an der Galaktose mit ¹⁴C radiomarkiert war, gestartet, und dann nach 30 Minuten durch Abkühlen auf 4°C gestoppt.
Das Reaktionsmedium von Röhrchen Nr. 1 wird dann bei 13 000 U/min 10 Minuten zentrifugiert, mehrmals mit 500 μl Wasser gespült und dann erneut 10 Minuten bei 13 000/min zentrifugiert.
Röhrchen Nr. 2 wurde nach dem herkömmlichen Extraktionsverfahren für Lipide mit organischen Lösungsmitteln behandelt, wie oben beschrieben.
Die Radioaktivität im Zentrifugationspellet (Röhrchen Nr. 1) wurde mit einem Radioaktivitätszähler gemessen und betrug 4 026 dpm.
Die Radioaktivität, die nach Extraktion der Lipiden in Röhrchen Nr. 2 gemessen wurde, wurde auf dieselbe Weise gemessen und betrug 4 136 dpm.
Folglich ist die Radioaktivität, die für jedes der Röhrchen gemessen wurde, nicht signifikant verschieden und erlaubt die Validierung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Messung der MGDG-Synthase-Aktivität.
Die erfindungsgemäß hergestellte Probe der Membranvesikel enthält das Enzym und dessen hydrophobes Co-Substrat unter Bedingungen, die einer enzymologischen Enzymaktivitätsmessung nach dem Michaelis-Verfahren entsprechen. Ferner erlaubt diese Probe eine einfache und miniaturisierbare Messung der Galaktosylierungsaktivität durch Zentrifugation, und, als Erweiterung, durch Filtration.
VI. Schlussfolgerung
Dieses Beispiel zeigt, dass es möglich ist, Membranfraktionen, die aus einer Kultur von Zellen stammen, die eine rekombinante MGDG-Snythase exprimieren, dazu zu verwenden, Galaktosylierungsaktivität entsprechend den Michaelis-Menten-Regeln zu messen, wobei das Verfahren zu deren Messung für Mikroplatten miniaturisiert werden kann.
Es wurde ferner gezeigt, dass die eingebaute Radioaktivität leicht in den Aggregaten des Reaktionsmediums zurückerhalten werden konnte, die durch Zentrifugieren gesammelt wurden. Also sammelte sich das von diesem System gebildete MGDG in den Membranen an, zu dessen Messung ein Messystem mit Mikrofiltration ausreicht, was die Verwendung dieses Enzymassays für ein High Throughput Screening (HTS) von aktiven Molekülen ermöglicht. Es ist nun insbesondere möglich, mit diesem Verfahren eine „Chimiothek" zu screenen, um neue Moleküle mit Herbizidpotential zu selektieren. Die so hergestellten, für MGDG-Synthase A spezifischen Inhibitoren sind überdies leistungsfähige pharmakollogische Werkzeuge für physiologische Studien der Synthese von Glactolipiden.
Beispiel 3
Nachweis der MGDG-Synthese in einem apikomplexen Parasiten
Ziel dieses Beispiels ist es zu zeigen, dass MGDG in einem apikomplexen Parasiten, Toxoplasma gondii, vorkommt, und folglich, dass MGDG-Snythase, die bei der Suche nach Molekülen mit antiparasitären Eigenschaften als Ziel dient, auch bei Apikomplexa existiert.
2 × 10⁸ Toxoplasma gondii-Zellen, in Form von Tachyzoiten, werden in 0,1 ml einer 1:10-Mischung aus 10 mM 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS), pH 7,8 und 1 mM Dithiothreitol (DTT), enthaltend 2% (W/V) Glycerin und 50 mM KCl, suspendiert und dann 30 Minuten in Gegenwart von 4 μCi UDP-[³H]-Galaktose (7,5 nmol) inkubiert.
Die Glycolipide werden gemäß dem Verfahren von Bligh und Dyer, 1959 (wie oben zitiert) extrahiert und dann durch Dünnschichtchromatographie (DSC) auf 60μ-Silicagelplatten mit einer Mischung aus Chloroform/Methanol/Wasser [65/25/4 (V/V)] Mischung in Gegenwart von Kontrollipiden (MGDG; Monogalaktosylcerebrosid aus Rinderhirn (MGCB); Digalaktosyldiacylglycerin (DGDG); Trigalaktosyldiacylglycerin (triGDG) und Tetragalaktosyldiacylglycerin (tetraGDG) aufgelöst.
Die Radioaktivität des markierten Lipids wird anschließend mit Hilfe eines DSC-Analysators (automatischer DSC-Scanner LB2842) detektiert.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 3 dargestellt, die die Menge markierter Galaktose (cpm), die von Toxoplasma gondii-Zellen eingebaut wurde, als Funktion der Wanderung in Zentimetern darstellt.
In dieser Figur sieht man 3 erste Peaks, die auf gleicher Höhe wie das MGCB wandern, wohingegen der letzte Peak auf gleicher Höhe wie MGDG wandert.
Nach der Wanderung werden Lipide durch Besprühen der Silicagelplatten mit einer Lösung mit 0,2% Orcinol und 75% Schwefelsäure und anschließendes Erhitzen auf einer Temperatur von 100°C für 15 Minuten sichtbar gemacht (Ergebnisse nicht gezeigt).
Der Peak, der dem MGDG entspricht, verschwindet nach 3-stündiger alkalischer Hydrolyse mit 0,1 N Kaliumhydroxid in einer Wasser/Methanol-Mischung.
Die vollständige Identifizierung der Lipide erfolgt nach Hydrolyse des polaren Kopfs mit α-Galaktosidase aus grünen Kaffeebohnen und β-Galaktosidase aus Rinderhoden und Deacylierung durch alkalische Hydrolyse unter schonenden Bedingungen (0,1 N KOH, 3 Stunden in einer Wasser/Ethanol-Mischung).
Peak 4 ist gegenüber β-Galaktosidase hydrolyseempfindlich, was klar zeigt, dass die Galaktose in Beta-Stellung gebunden ist, wie bei MGDG.
Überdies verschwindet Peak 4 nach der alkalischen Hydrolyse, was klar zeigt, dass das Lipid in der Toxoplasma gondii-Membran auch eine Diacylglyceringruppe enthält.
Dieses Experiment zeigt die Existenz von MGDG in der Membran von Toxoplasma gondii-Tachyzoiten und bestätigt, dass die Suche nach Inhibitoren der Pflanzen-MGDG-Synthase bei der Identifizierung von Mitteln gegen apikomplexe Parasiten angewendet werden kann.

Claims

Plasmamembranfraktionen von prokaryontischen oder eukaryontischen tierischen Zellen, die wenigstens eine rekombinante Monogalaktosyldiacylglycerin (MGDG)-Synthase enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktionen wenigstens 1 Gew.-% 1,2-sn-Diacylglycerin (DAG) enthalten, bezogen auf das Gesamtproteingewicht, und dass sie in Form kugelförmiger Membranvesikel vorliegen, die aus einer Lipiddoppelschicht gebildet sind.
Fraktionen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis von MGDG-Synthase/DAG weniger als 10 ist.
Fraktionen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis von MGDG-Synthase/DAG weniger als 0,12 ist.
Fraktionen nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranvesikel eine Größe zwischen 0,1 μm und 10 μm haben.
Fraktionen nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die MGDG-Synthase auf der Innenseite der Lipiddoppelschicht lokalisiert ist.
Fraktionen nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vesikel in Form nichtinvertierter, invertierter oder hybrider Vesikel vorliegen.
Fraktionen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form hybrider Vesikel vorliegen, die MGDG-Synthase und DAG in der gleichen Lipidschicht tragen.
Verfahren zur Herstellung von Membranfraktionen gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es besteht: – in einem ersten Schritt, Transformieren der prokaryontischen oder eukaryontischen tierischen Zellen mit einem Konstrukt, das das Gen enthält, das für eine Pflanzen-MGDG-Synthase codiert, – in einem zweiten Schritt, Kultivieren der Zellen in einem Kulturmedium, das die Proteinsynthese begünstigt, so dass die Synthese der MGDG-Synthase durch die Zellen induziert wird, – in einem dritten Schritt, Inkubieren der in dem vorhergehenden Schritt kultivierten Zellen in einem Reaktionsmedium, das wenigstens eine Phospholipase C enthält, – und dann in einem vierten Schritt, Fraktionieren der so an DAG angereicherten Zellen, um Membranfraktionen in Form kugelförmiger Vesikel zu erhalten, die aus einer Lipiddoppelschicht gebildet sind und wenigstens eine rekombinante MGDG-Synthase und wenigstens 1 Gew.-% DAG enthalten, bezogen auf das Gesamtproteingewicht der Membranfraktionen.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die prokaryontischen Zellen Bakterien sind.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Phospholipase C von Bacillus cereus verwendet.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Phospholipase C in einer Konzentration zwischen 1 U und 20 U pro ml Reaktionsmedium verwendet wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktionierung der Membranen durch mechanischen Schock, Hitzeschock, osmotischen Schock, elektrischen Schock oder physischen Schock erfolgt.
Verwendung der Membranfraktionen gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 zur Selektion und/oder zum Screenen in vitro von Effektormolekülen der MGDG-Synthase-Aktivität.
Verwendung nach Anspruch 13 zur Selektion und/oder zum Screenen in vitro von Inhibitormolekülen der MGDG-Synthase-Aktivität, die als Wirkstoffe gegen Parasiten oder als Herbizide dienen können.
Verfahren zur Selektion und/oder zum Screenen von Effektormolekülen der MGDG-Synthase-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – einen Inkubationsschritt der Testsubstanz oder der Testsubstanzen mit einer ausreichenden Menge Membranfraktionen gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 und mit radiomarkierter UDP-Galaktose in einer wässrigen Phase mit einem pH zwischen 4 und 11; – einen Schritt mit ein oder mehrmaligem Waschen der Membranfraktionen, – einen Schritt des Abtrennens der Membranfraktionen, – und dann einen Schritt zur Bestimmung der Aktivität der MGDG-Synthase.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Phase für die Inkubation einen Puffer enthält und einen pH zwischen 6 und 8 hat.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an UDP-Galaktose zwischen 0,1 und 10 nmol pro μl Reaktionsmedium liegt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Abtrennens der Membranfraktionen mittels Zentrifugation oder Filtration durchgeführt wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Aktivität der MGDG-Synthase durch Messung der Menge an radiomarkierter Galaktose erfolgt, die in die Membranfraktionen eingebaut ist.
Mikrotiterplatte umfassend eine Vielzahl von Vertiefungen, dadurch gekennzeichnet, dass der Boden der Vertiefungen aus einem Filter besteht und dass die Vertiefungen Membranfraktionen gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 enthalten.