DE60126767T2 - Neuartige (r)-2-hydroxy-3-phenylpropionat (d-phenyllaktat) dehydrogenase und für diese kodierendes gen - Google Patents
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Description
- Hintergrund der Erfindung
- Gebiet der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue D-Phenylmilchsäuredehydrogenase (gelegentlich nachfolgend abgekürzt als „D-PLDH") zur Herstellung optisch aktiver 2-Hydroxysäurederivate, wie beispielsweise (R)-2-Hydroxy-3-phenylpropionsäure (gelegentlich nachfolgend abgekürzt als „D-Phenylmilchsäure") oder Derivate davon, und ein Gen, welches dieses Enzym codiert.
- Stand der Technik
- D-Phenylmilchsäure ist ein Precursor der Substanz PF1022 [Cyclo(D-lactyl-L-N-methylleucyl-D-3-phenyllactyl-L-N-methylleucyl-D-lactyl-L-N-methylleucyl-D-3-phenyllactyl-L-N-methylleucyl)], welches durch den filamentösen Pilzstamm PF1022 (Mycelia sterilia, FERM BP-2671) produziert wird, welcher zu den Agonomycetales gehört (Sasaki, T. et al., J. Antibiotics, 45, 692 (1992)). Kürzlich wurden ein Enzym, welches direkt die Substanz PF1022 produziert, und ein Gen dieses Enzyms offenbart (WO 01/18179A1). Ferner ist es bekannt, dass wenn ein Phenylmilchsäurederivat von außen während dem Kultivieren des Stammes, welcher die Substanz PF1022 produziert, in ein flüssiges Medium gegeben wird, eine neue Substanz PF1022 produziert werden kann, in welche das zugegebene Phenylmilchsäurederivat inkorpuriert ist (WO 97/20945). In diesem Fall ist ein zuzugebender Precursor, vorzugsweise ein (R)-2-Hydroxyderivat.
- Bestimmte Arten von Enzymen, welche durch Mikroorganismen hergestellt werden, sind dafür bekannt, spezifisch optisch aktive Verbindungen zu produzieren, wie beispielsweise D-Milchsäure (Taguchi, H. et al., J. Biol. Chem., 266, 12588 (1991)). Darüber hinaus erschienen zahlreiche Berichte über Verfahren zur Herstellung industriell verwendbarer Verbindungen, wie beispielsweise (R)-2-Hydroxy-4-Phenylbuttersäure, durch Verwendung bestimmter Arten von Enzymen oder Mikroorganismen, welche brauchbare Enzyme herstellen (Japanische Patentschrift Nr. 2750017, Japanische Patentschrift Nr. 2752754, Japanische Patentschrift Nr. 2774341, Japanische Patentschrift Nr. 2873236, Japanische Patentver öffentlichung Nr. 61271/1994, Japanische Offenlegungsschrift Nr. 197774/1994 und Japanische Offenlegungsschrift Nr. 75797/1998). Enzymatische Reaktionen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Zielverbindung selektiver und effizienter herstellen als chemische Synthesen. Auf der anderen Seite ist es notwendig, Enzyme zu suchen, welche spezifisch auf Zielverbindungen wirken, da die Substratspezifität jedes Enzyms strikt ist. Bis jetzt existiert kein Bericht über ein Dehydrogenaseenzym, welches spezifisch für D-Phenylmilchsäure ist, abgeleitet von Mikroorganismen.
- Zusammenfassung der Erfindung
- Die gegenwärtigen Erfinder waren erfolgreich in der Isolierung eines Enzyms, welches spezifisch Phenylbrenztraubensäure reduziert und D-Phenylmilchsäure produziert, nämlich D-Phenylmilchsäuredehydrogenase (D-PLDH), und ein Gen, welches dieses Enzym codiert. Darüber hinaus waren die Erfinder erfolgreich beim reichlichen Exprimieren dieses Gens in Escherichia coli.
- Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine D-Phenylmilchsäuredehydrogenase zur Verfügung zu stellen.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Gen zur Verfügung zu stellen, welches die D-Phenylmilchsäuredehydrogenase codiert.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen rekombinanten Vektor und einen Transformanten zum Exprimieren der D-Phenylmilchsäuredehydrogenase und ein Verfahren zum Herstellen der D-Phenylmilchsäuredehydrogenase zur Verfügung zu stellen.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Massenproduktionssystem der Substanz PF1022 und Derivaten davon sowie ein Verfahren zur Herstellung derselben zur Verfügung zu stellen.
- Eine D-Phenylmilchsäuredehydrogenase gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 umfasst.
- Ein D-Phenylmilchsäuredehydrogenase-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine Nucleotidsequenz, welche die D-Phenylmilchsäuredehydrogenase codiert.
- Ferner umfasst ein D-Phenylmilchsäuredehydrogenase-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung eine Nucleotidsequenz, welche aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden Sequenzen, ausgewählt ist:
- (c) die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr.1,
- (d) eine Nucleotidsequenz, welche eine Homologie von mindestens 70% mit der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 aufweist und ein Protein codiert, welches D-Phenylmilchsäuredehydrogenaseaktivität aufweist, und
- (e) eine Nucleotidsequenz, welche mit der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert und ein Protein codiert, welches D-Phenylmilchsäuredehydrogenaseaktivität aufweist.
- Ein rekombinanter Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst ein D-Phenylmilchsäuredehydrogenase-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung.
- Ein Transformant gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Wirt, welcher einen rekombinanten Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
- Ein Verfahren zur Herstellung einer D-Phenylmilchsäuredehydrogenase gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst Schritte des Kultivierens eines Transformanten gemäß der vorliegenden Erfindung und das Sammeln der D-Phenylmilchsäuredehydrogenase aus dem Kulturmedium.
- Ein System zur Herstellung der Substanz PF1022 gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Mikroorganismus, welcher die Substanz PF1022 produziert, transformiert mit einem rekombinanten Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung.
- Ein Verfahren zur Herstellung der Substand PF1022 gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst Schritte des Kultivierens eines PF1022 produzierenden Mikroor ganismus, welcher mit einem rekombinanten Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert ist, und das Sammeln der Substanz aus dem Kulturmedium.
- Kurze Beschreibung der Zeichnung
-
1 zeigt ein Verfahren zum Aufbauen des Plasmids pDPLDH-1. - Detaillierte Beschreibung der Erfindung
- Hinterlegung der Mikroorganismen
- Der Stamm PF1022, welcher im Beispiel 1-1 beschrieben ist, wurde am International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan), am 24. Januar 1989 hinterlegt.
- Die Hinterlegungsnummer ist FERM BP-2671.
- Der Escherichia coli (DH5d)-Stamm, welcher mit dem Plasmid pDPLDH-1 transformiert wurde, beschrieben im Beispiel 3-3, wurde am National Institute of Advanced Industrial Science and Technology am 12. April 2000 hinterlegt.
- Die Hinterlegungsnummer lautet FERM-BP-7545.
- Gen und Protein:
- Gemäß der vorliegenden Erfindung werden eine D-Phenylmilchsäuredehydrogenase und ein Gen davon zur Verfügung gestellt.
- Ein Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung wirkt auf 2-Oxo-3-phenylpropionsäure (nachfolgend gelegentlich als „Phenylbrenztraubensäure" bezeichnet) und reduziert diese, um sie zu (R)-2-Hydroxy-3-phenylpropionsäure zu konvertieren. Derivate oder Analoge von D-Phenylmilchsäure können durch vorhergehendes Modifizieren des Substrats, Phenylbrenztraubensäure, hergestellt werden.
- Beispiele von Derivaten von D-Phenylmilchsäure enthalten p-Aminophenylmilchsäure, p-Nitrophenylmilchsäure und p-Hydroxyphenylmilchsäure. In diesem Fall können zum Beispiel p-Aminophenylbrenztraubensäure, p-Nitrophenylbrenztraubensäure und p-Hydroxyphenylbrenztraubensäure als ein Substrat für die Synthese der D-Phenylmilchsäurederivate verwendet werden.
- Beispiele von Analogen von D-Phenylmilchsäure enthalten (R)-2-Hydroxy-4-phenylbuttersäure, welches als ein Material für ein Anti-Bluthochdruckmittel verwendet wird. In diesem Fall kann zum Beispiel 2-Oxo-4-phenylbuttersäure als ein Substrat für die Synthese des D-Phenylmilchsäureanalogen verwendet werden.
- Die Sequenz (d) kann vorzugsweise eine Homologie von mindestens 80%, bevorzugter von mindestens 90% und am bevorzugtesten von mindestens 95% zu der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 aufweisen.
- In der Sequenz (e) bedeutet der Ausdruck „stringente Bedingungen", dass eine Membran nach der Hybridisierung bei einer hohen Temperatur in einer Lösung mit niedriger Salzkonzentration, zum Beispiel bei 0,2 × SSC-Konzentration (1 × SSC: 15 mM Trinatriumcitrat, 150 mM Natriumchlorid) in einer 0,1% SDS-Lösung bei 60°C für 15 Minuten, gewaschen wird.
- Für eine gegebene Sequenz kann zum Beispiel durch Bereitstellen eines Substrats für die D-Phenylmilchsäuredehydrogenase (z.B. Phenylbrenztraubensäure) und eines Coenzyms des Reduktionstyps, d.h. Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH), Reagieren eines zu testenden Proteins und anschließendes Messen der physikochemischen Veränderungen, generiert durch die Enzymreaktion, wie beispielsweise ein Wechsel in der optischen Dichte des Nicotinamidadenindinucleotidphophats und/oder ein quantitativer Wechsel im Produkt, d.h. D-Phenylmilchsäure ermittelt werden, ob sie D-Phenylmilchsäuredehydrogenase-Aktivität aufweist oder nicht [siehe Beispiel 3].
- Für die Sequenzen (d) und (e) kann zum Beispiel durch Exprimieren einer zu testenden Nucleotidsequenz in einem Wirt, Reagieren des resultierenden Proteins mit einem Substrat für die D-Phenylmilchsäuredehydrogenase (z.B. Phenylbrenztraubensäure) und einem Coenzyms des Reduktionstyps, d.h. Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH) und anschließendes Messen der physikochemischen Veränderungen, generiert durch die Enzymreaktion, wie beispielsweise ein Wechsel in der optischen Dichte von Nicotinamidadenindinucleotidphosphat und/oder einem quantitativen Wechsel im Produkt, d.h. D-Phenylmilchsäure, ermittelt werden, ob sie ein Protein mit D-Phenylmilchsäuredehydrogenaseaktivität codieren oder nicht (siehe Beispiel 3).
- In Anbetracht der Aminosäuresequenz eines Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung können Nucleotidsequenzen, welche diese codieren, in einfacher Art und Weise bestimmt werden und verschiedene Nucleotidsequenzen, welche die Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 2, codieren, können ausgewählt werden. Daher enthalten Nucleotidsequenzen, welche ein Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung codieren, jede DNA-Sequenz, welche dieselbe Aminosäuresequenz codiert und welche degenerative Codons aufweist, in Addition zu einem Teil oder dem Ganzen der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1, und enthalten ferner DNA-Sequenzen, welche korrespondierend zu diesen Sequenzen sind.
- Der Ursprung eines Enzyms und eines Gens gemäß der vorliegenden Erfindung ist nicht speziell beschränkt und jeder Mikroorganismus, welcher ein Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung herstellen kann, kann verwendet werden; der Mikroorganismus, welcher die Substanz PF1022 produziert (Mycelia sterilia, FERM BP-2671), ist bevorzugt.
- Die N-terminale Aminsosäuresequenz eines Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durch Aufbringen des Enzyms auf SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese, elektrisches Transferieren der resultierenden Enzym-Bande auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran oder dergleichen und anschließendes Analysieren derselben durch einen Protein-Sequenzer bestimmt werden.
- Die interne Aminosäuresequenz eines Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durch teilweises Abbauen des Enzyms mit einer Proteinase oder dergleichen und anschließendes Durchführen der oben genannten Schritte nach der SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese und einem Isolationsschritt unter Verwendung umgekehrter Phasenchromotographie bestimmt werden.
- Ein Gen gemäß der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise wie folgt erhalten werden.
- Eine genomische DNA wird aus einem Mikroorganismus, welcher die Substanz PF1022 produziert, extrahiert und mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten, worauf eine Bibliothek, umfassend die genomische DNA des Mikroorganismus, welcher die Substanz PF1022 produziert, unter Verwendung eines Phagenvektors aufgebaut wird. Alternativ wird die gesamte DNA aus dem Mikroorganismus, welcher die Substanz PF1022 produziert, extrahiert, die cDNA, korrespondierend zur mRNA, wird durch eine Reverse-Transkriptase-Reaktion unter Verwendung eines Oligo dT als Primer hergestellt, worauf eine Bibliothek, umfassend die cDNA des Mikroorganismus, welcher die Substand PF1022 produziert, unter Verwendung eines Phagenvektors aufgebaut wird.
- Geeignete Primer werden synthetisiert, basierend auf der N-terminalen Aminosäuresequenz und der internen Aminosäuresequenz von D-PLDH. Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) wird unter Verwendung dieser Primer und der genomischen DNA oder cDNA, abgeleitet vom Mikroorganismus, welcher die Substand PF1022 produziert, als Templat, durchgeführt, und dadurch wird das DNA-Fragment des D-PLDH Gens vervielfältigt. Die genomische Bibliothek oder die cDNA-Bibliothek wird unter Verwendung dieses DNA-Fragments als eine Probe gescreent. Auf diese Art und Weise kann die gesamte Region des D-Phenylmilchsäuehydrogenasegens oder einer Region, welche für die Expression nötig ist, isoliert werden. Nach der Bestimmung der Basensequenz dieses DNA-Fragments werden geeignete Restriktionsenenzym-Spaltungsstellen strangaufwärts des Translations-Startcodons und strangabwärts des Translations-Stopcodons durch PCR oder ähnliches eingeführt, um ein Gen-Fragment zu erhalten, welches das D-Phenylmilchsäuredehydrogenasegen ausschließlich enthält.
- Rekombinanter Vektor
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter Vektor, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche eine D-Phenylmilchsäuredehydrogenase codiert, zur Verfügung gestellt.
- Die Vorgehensweise und das Verfahren zum Aufbauen eines rekombinanten Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung können solche sein, welche gewöhnlich auf dem Gebiet der Gentechnologie verwendet werden.
- Beispiele von Vektoren, welche hierin verwendet werden, enthalten Vektoren, welche in ein Wirts-Chromosomen-DNA inkorpuriert werden können und Vektoren, welche eine selbstreplizierbare autonome Replikationssequenz, welche als ein Plasmid in einer Wirtszelle vorhanden sein kann, z.B. pUC Vektoren (z.B. pUC18 und pUC118), pBluescript-Vektoren (z.B. pBluescript II KS+) und Plasmide, wie beispielsweise pBR322, aufweisen. Eine oder mehrere Kopien des Gens können in einer Wirtszelle vorhanden sein.
- Ein rekombinanter Vektor der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durch durchführbares Verbinden eines Promotors und eines Terminators strangaufwärts bzw. strangabwärts der Nucleotidsequenz, welche eine D-Phenylmilchsäuredehydrogenase codiert, und, falls dienlich, durch durchführbares Verbindens eines Genmarkers und/oder anderer regulatorischer Sequenzen, aufgebaut werden.
- Das Binden eines Promotors und eines Terminators an ein Gen gemäß der vorliegenden Erfindung und die Einführung einer Expressionseinheit in einen Vektor können durch bekannte Verfahren durchgeführt werden.
- Ein Promotor und ein Terminator, welche in der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, sind nicht speziell beschränkt. Beispiele enthalten regulatorische Sequenzen von Genen von Glycolyseenzymen, wie beispielsweise 3-Phosphoglyceratkinase und Glutaraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, regulatorische Sequenzen von Genen von aminosäure-synthetisierenden Enzymen, wie beispielsweise Tryptophansynthase, regulatorische Sequenzen von Genen von hydrolytischen Enzymen, wie beispielsweise Amylase, Protease, Lipase und Cellulase, regulatorische Sequenzen von Genen von Oxidations-Reduktions-Enzymen, wie beispielsweise Nitratreduktase, Orotidin-5-phosphatdehydrogenase und Alkoholdehydrogenase und regulatorische Sequenzen von Genen, abgeleitet von einem Mikroorganismus, welcher die Substand PF1022 produziert, wie beispielsweise Abpl, beschrieben in WO 01/18219A1, welches hochgradig im Mikroorganismus, welcher die Substanz PF1022 produziert, exprimiert wird.
- Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann als ein Fusionsprotein durch Verbinden eines Gens gemäß der vorliegenden Erfindung mit einem fremden Gen, welches eine Translationsregion des anderen Proteins codiert, exprimiert werden.
- Das Einfügen eines Gen-Markers kann beispielsweise durch Einfügen einer geeigneten Restriktionsenzym-Spaltungsstelle in eine regulatorische Sequenz durch das PCR-Verfahren, Einfügen dieser in einen PlasmidVektor und Binden eines selektiven Markergens, wie beispielsweise eines Arzneimittelresistenzgens und/oder eines Gens, welches ein Ernährungserfordernis komplementiert, durchgeführt werden.
- Ein selektiver Marker kann in passender Weise ausgewählt werden, abhängig von der Technik zum Auswählen eines Transformanten. Zum Beispiel können ein Arzneimittelresistenzgen oder ein Gen, welches ein Ernährungserfordernis komplementiert, verwendet werden. Beispiele von Arzneimittelsresistenzgenen enthalten Gene, welche Resistenz gegen Destomycin, Benomyl, Oligomycin, Hygromycin, G418, Pleomycin, Phosphinothricin, Ampicillin, Kanamycin oder dergleichen verleihen. Beispiele von Genen, welche ein Ernährungserfordernis komplementieren, enthalten argB, pyr4, trpC, TRPI, niaD, LEU2 und URA3.
- Herstellung von Transformant und D-Phenylmilchsäuredehydrogenase
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Wirt zur Verfügung gestellt, welcher mit dem oben genannten Vektor transformiert ist.
- Ein in der vorliegenden Erfindung verwendeter Wirt ist nicht speziell beschränkt und es kann jeder Mikroorganismus verwendet werden, welcher als ein Wirt für eine genetische Rekombination verwendet werden kann.
- Beispiele eines Wirts, welcher verwendet werden kann, enthalten Mikroorganismen, nämlich bestimmte Bakterien oder Pilze, vorzugsweise Escherichia coli, Lactobacillus, Actinomyceten, Hefen und filamentöse Pilze, bevorzugter filamentöse Pilze, welche die Substanz PF1022 produzieren und am bevorzugtesten den Stamm PF1022 (Mycelia sterilia, FERM BP-2671) und Varianten davon.
- Ein rekombinanter Vektor für die Genexpression kann in einen Wirt durch ein herkömmliches Verfahren eingefügt werden. Beispiele des Verfahrens zur Einführung enthalten Elektroporations-Verfahren, Polyethylenglycol-Verfahren, Aglobacterium-Verfahren, Lithium-Verfahren und Calciumchlorid-Verfahren. Ein Verfahren, welches für jede Wirtszelle geeignet ist, kann ausgewählt werden. Das Polyethylenglycol-Verfahren ist bevorzugt, wenn ein Mikroorganismus, welcher die Substanz PF1022 produziert, als ein Wirt verwendet wird.
- Ein Transformant kann gemäß einem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung eines Mediums, Kulturbedingungen und dergleichen, welche in geeigneter Art und Weise ausgewählt werden, kultiviert werden. Als ein Medium können konventionelle Komponenten verwendet werden. Als Kohlenstoffquelle können Glucose, Sucrose, Stärkesirup, Dextrin, Stärke, Glycerol, Molassen, tierische und pflanzlische Öle und dergleichen verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische oder anorganische Stickstoffverbindungen, wie beispielsweise Sojabohnenpulver, Weizenkeim, Pharmamedien, cornsteep-Flüssigkeit (engl. „cornsteep liquor"), Baumwollsamenöl-Bodensatz, Bouillon, Polypepton, Malzextrakt, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und Harnstoff verwendet werden. Falls es nötig ist, können Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Kobalt, Chlor, Phosporsäure, Schwefelsäure und andere anorganische Salze, welche Ione bilden können, wie beispielsweise Kaliumchlorid, Calciumcarbonat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Monokaliumphosphat, Zinksulfat, Mangansulfat und Kupfersulfat in effektiver Art und Weise zugegeben werden. Falls es nötig ist, können verschiedene Vitamine, wie beispielsweise Thiamin (z.B. Thiaminhydrochlorid), Aminosäuren, wie beispielsweise Glutaminsäure (z.B. Natrium glutamat) und Asparagin (z.B. DL-Asparagin), Nucleinsäurekomponenten, wie beispielsweise Nucleotide, und selective Arzneimittel, wie beispielsweise Antibiotica, zugegeben werden. Darüber hinaus können organische und anorganische Substanzen in geeigneter Art und Weise zugegeben werden, um das mikrobielle Wachstum zu erhöhen und die Produktion eines Enzyms der gegenwärtigen Erfindung zu verbessern.
- Die Kultivierung kann durchgeführt werden durch ein Schüttelkulturverfahren unter einer aeroben Bedingung, einem Bewegungs-Kulturverfahren mit Belüftung oder einem aeroben Untertauch-Kulturverfahren. Insbesondere ist ein aerobes Untertauch-Kulturverfahren am meisten bevorzugt. Einige Wirte können durch ein anaerobes Kulturverfahren kultiviert werden.
- Ein pH-Bereich des Mediums ist zum Beispiel ca. 6-8. Die Kultivierung kann durchgeführt werden durch ein Schüttel-Kultur-Verfahren unter einer aeroben Bedingung oder einem Bewegungskulturverfahren unter Belüftung. Eine geeignete Kulturtemperatur beträgt 15°C bis 60°C, vorzugsweise ca. 20°C bis 40°C. Die Kultivierungszeit beträgt zum Beispiel 60 bis 240 Stunden, vorzugsweise ca. 8 bis 168 Stunden.
- Die Kultivierung wird beendet, wenn die Menge der D-Phenylmilchsäuredehydrogenase im Medium seinen Höchstpunkt erreicht und die D-Phenylmilchsäuredehydrogenase wird isoliert und von der Kultur gereinigt.
- Ein Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung kann isoliert und von der Kultur gereinigt werden durch Zerstörung der kultivierten mikrobiellen Zellen und Behandlung des resultierenden zellfreien Extrakts unter Verwendung herkömmlicher Reinigungsmittel. Die mikrobiellen Zellen, welche durch Zentrifugieren oder Filtrieren der Kultur zurückgewonnen wurden, werden zum Beispiel auf physikalische Weise, beispielsweise durch Ultraschallbehandlung, unter Verwendung von Seesand oder eines Mörsers und Pistills, zerbrochen, oder unter Verwendung einer Kugelmühle, einer französischen Presse, einem Gefrierbrecher (engl. "freezing crusher"), einem Mischer, einem Mixer oder dergleichen, gemahlen, worauf Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt werden, um ein zellfreies Extrakt zu erhalten. In dem Fall, in welchem die Zellen, welche von der Kultur durch Zentrifugieren oder Filtrieren zurückgewonnen wurden, nicht sofort zerbrochen werden, können sie durch Gefrieren oder Lyophilisieren gelagert werden und zerbrochen werden, wenn nötig. Dann kann ein Enzym mit der Aktivität durch Behandeln des zellfreien Extrakts unter Verwendung eines herkömmlichen Reinigungsverfahrens, wie beispielsweise einem Ammonium-Sulfat-Fraktionierungsverfahren, einem Ionenaustausch-Chromotographieverfahren, einem Affinitäts-Chromotographieverfahren, einem Adsorptions-Chromotographieverfahren und einem Gelfiltrationsverfahren, einzeln oder in Kombination erhalten werden.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Massenproduktionssystem von einer D-Phenylmilchsäuredehydrogenase zur Verfügung gestellt. Beispiele eines Wirts, welcher als ein System für Massenproduktion von der D-Phenymilchsäuredehydrogenase zu verwenden ist, enthalten Escherichia coli, Lactobacillus, Actinomyceten, Hefen und filamentöse Pilze.
- Ein Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert Phenylbrenztraubensäure in D-Phenylmilchsäure. Auf der anderen Seite wird die Substanz PF1022 aus vier Molekülen L-Leucine, zwei Molekülen D-Milchsäure und zwei Molekülen D-Phenylmilchsäure durch ein zyklisches Depsipeptid-synthetisierendes Enzym synthetisiert. Dementsprechend korrespondiert D-Phenylmilchsäure mit einem Rohmaterial zur Synthese der Substanz PF1022. Daher kann die Substanz PF1022 in großen Mengen hergestellt werden, wenn D-Phenylmilchsäure reichlich in einem Mikroorganismus, welcher die Substanz PF1022 produziert, exprimiert wird. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Massenproduktionssystem der Substanz PF1022 zur Verfügung, dadurch gekennzeichnet, dass das System so transformiert wird, um ein Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung zu exprimieren. Die Substanz PF1022 ist als Wurmmittel für Tiere brauchbar (Sasaki, T. et al., J. Antibiotics, 45, 692 (1992).
- Ein Mikroorganismus, welcher die Substanz PF1022 produziert, verwendbar als ein System zur Massenproduktion der Substanz PF1022, ist vorzugsweise ein filamentöser Pilz, welcher die Substanz PF1022 produziert, am bevorzugtesten der Stamm Mycelia sterilia (FERM BP-2671), welcher die Substanz PF1022 produziert.
- Ein PF1022 produzierender Mikroorganismus kann ferner durch ein anderes Gen als ein Enzym-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert werden. Die Produktion der Substanz PF1022 kann zum Beispiel durch Einführen eines Gens eines Enzyms verbessert werden, welches im Schema für die Synthetisierung der Substanz PF1022 agiert, gelegentlich mit einem starken Promotor. Ein Beispiel eines solchen Gens ist ein zyklisches Depsipeptid-synthetisierendes Enzym (WO 01/18179A1).
- In einem Wirt, welcher nicht ein Substrat synthetisiert, auf welches ein Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung wirkt, zum Beispiel Phenylbrenztraubensäure, derivative oder homologe Substanzen davon, D-Phenylmilchsäure, derivative oder homologe Substanzen davon, können durch Zugabe des mangelhaften Substrats, Derivats oder homologen Substanz des Substrats zur Kultur oder durch Transformieren des Wirts mit einem Gen, welches das mangelhafte Substrat, Derivat oder homologe Substanz des Substrats codiert, hergestellt werden. Ein Beispiel von solch einem Enzymgen ist ein Gen, welches in einen Biosynthesepfad von Chorisminsäure zu p-Aminophenylbrenztraubensäure involviert ist (WO 01/23542A1).
- In einem Wirt, in welchem das Gen, involviert in den Biosynthesepfad von Chorisminsäure zu p-Aminophenylbrenztraubensäure, vorhanden ist, wird p-Aminophenylbrenztraubensäure synthetisiert und ein Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung wandelt die p-Aminophenylbrenztraubensäure in p-Aminophenylmilchsäure um. Als Ergebnis bildet die konvertierte p-Aminophenylmilchsäure ein Rohmaterial für die Substanz PF1022-Produktion, so dass ein Derivat des Substrats PF1022, von welchem ein Benzolring mit einer Aminogruppe an der Para-Position modifiziert wird, z.B. [Cyclo(D-lactyl-L-N-methylleucyl-D-3-(4-aminophenyl)lactyl-L-N-methylleucyl-D-lactyl-L-N-methylleucyl-D-3-phenyllactyl-L-N-methylleucyl)], synthetisiert wird.
- Ein Substanz PF1022 – Derivat, modifiziert mit einer funktionellen Gruppe, wie beispielsweise einer Aminogruppe, ist nützlich als Rohmaterial für die Synthese eines hochaktiven Substanz PF1022-Derivats.
- Ein rekombinanter Vektor, welcher zur Transformation verwendet wird, ist vorzugsweise ein Expressionsvektor, in welchem eine regulatorische Sequenz (z.B. Promotor und Terminator), welche im Mikroorganismus, welcher die Substanz PF1022 produziert, fungiert, durchführbar an ein Enzymgen gemäß der vorliegenden Erfindung gebunden wird, oder am meisten bevorzugt ein Expressionvektor, in welchem eine regulatorische Sequenz, welche im Stamm PF1022 (Mycelia sterilia, FERM BP-2671) fungiert, durchführbar an ein Enzymgen gemäß der vorliegenden Erfindung gebunden wird. Ein Beispiel eines starken Promotors, um die Expression zu verbessern, ist der Abpl-Promotor (WO 01/18219A1).
- Beispiel
- Die vorliegende Erfindung wird im Weiteren durch die folgenden Beispiele illustriert, welche nicht dafür gedacht sind, als Einschränkung der Erfindung zu dienen.
- Beispiel 1: Isolierung und Reinigung von D-PLDH
- 1. Herstellung von mikrobiellen Zellen
- Der die Substanz PF1022 produzierende Mikroorganismus (Mycelia sterilia, FERM BP-2671) wurde UV-Strahlung oder NTG-Behandlung unterworfen, um Mutation zu induzieren, und der resultierende, die Substand PF1022 produzierende Stamm 432-26, in welchem die PF1022 – Produktivität verbessert war, wurde in 50 ml eines Saatmediums [1% Hefeextrakt, 1% Malzextrakt, 2% Polypepton, 2,5% Glucose, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Mangansulfat (pH 7.0)] (WO 0118179A1) in einem geeigneten Behälter überimpft und bei 26°C drei Tage lang unter Schütteln kultiviert, um eine primäre Saatkultur herzustellen. Diese Kultur wurde in 500 ml eines Mediums, welches in WO 97/20945 beschrieben ist, in einen geeigneten Behälter überimpft und bei 26°C drei Tage lang unter Verwendung eines Rotationsschüttlers inkubiert, um eine sekundäre Saatkultur herzustellen. Diese Kultur wurde in 500 ml desselben Mediums in einem geeigneten Behälter überimpft und bei 26°C vier bis sechs Tage lang unter Verwendung eines Rotationsschüttlers inkubiert. Nach der Kultivierung wurde die resultierende Kultur unter Absaugung und der Verwendung von kommerziellem Nylongewebe und einem Büchnertrichter filtriert und zur selben Zeit wurden die mikrobiellen Zellen mit deionisiertem Wasser gewaschen. Ein Kuchen der so erhaltenen mikrobiellen Zellen wurde sofort bei minus 80°C getrocknet und in einem Gefriertrockner zwei Nächte lang getrocknet. Die gefriergetrockneten Zellen, welche auf diese Art und Weise hergestellt wurden, könnten bei minus 80°C in einem luftdichten Container gelagert werden.
- 2. Extraktion und Reinigung von D-PLDH
- Eine Mischung von 2 μl von 0,1 M Phenylbrenztraubensäure, 2 μl 0,1 M NADPH, Pufferlösung A (10 mM Tris-HCl, 10 mM DTT, pH 8) und ein optionales Volumen einer Enzym-Samplelösung, um ein Gesamtvolumen von 100 μl zu ergeben, wurde bei 26°C zwei Stunden lang zur Reaktion gebracht. Nach Beendigung der Reaktion durch Wärmebehandlung wurde die Reaktionslösung unter Verwendung von HPLC (Kolonne: ODS 4,6 O × 150 mm (Chemicals Evaluation an Research Institute, Japan), mobile Phase: 0.1 M Natriumsulfat: Acetonitril (3,9:1) isokratisch, Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min, Temperatur: 40°C, UV-Detection: 210 nm) analysiert und die Menge an produzierter Phenylmilchsäure wurde als die Aktivität dieses Enzyms definiert. Ferner wurde die optische Aktivität des Enzymreaktionsprodukts unter Verwendung einer anderen HPLC analysiert (Kolonne: Chiralpak WH 0,46 O × 25 cm (Daicel Chemical Industries, LTD.), mobile Phase: wässrige Kupfersulfatlösung (25 mM), Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min, Temperatur: 40°C, UV-Detection: 210 nm).
- Die folgenden Schritte wurden alle bei 4°C ausgeführt. Ca. 70 g an gefriergetrockneten Zellen, welche im Beispiel 1-1 erhalten wurden, wurden über Nacht in der Kugelmühle gemahlen (äußerer Gefäßdurchmesser: 210 ∅ mm, Kugeldurchmesser: 35 ∅ mm, Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd.). Das resultierende Feinzellenpulver wurde gründlich in 1,5 l einer Extraktions-Pufferlösung suspendiert (50 mM Tris-HCL, 10 mM DTT, 50 mM Kaliumchlorid, pH 8), welche zu den Zellen gegeben wurde. Die Zellsuspension wurde behutsam ca. 1 Stunde unter Verwendung eines Magnetrührers gerührt. Als nächstes wurde die Zellsuspension bei 8000 U/min 30 Minuten lang zentrifugiert, um ca. 1,2 l eines Überstands unter Verwen dung einer gekühlten Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge SCR 20B (Rotor Nr. RPR9, Hitachi Koki Co., Ltd.) zurückzugewinnen. Der zurückgewonnene Überstand wurde auf eine Kolonne (26 ∅ × 300 mm), gefüllt mit Red Sepharose CL 6B (Amersham Pharmacia) als Beförderungsmittel, aufgebracht. Die Kolonne wurde mit Pufferlösung A gewaschen, bis eine nichtabsorbierte Franktion komplett verschwunden ist, worauf ein Protein, eluiert mit Pufferlösung A, enthaltend 1 M Kaliumchlorid, fraktioniert wurde. Eine vereinigte aktive Fraktion wurde einer Gelchromotographie unter Verwendung einer Kolonne (26 ∅ × 950 mm), welche mit Superdex 200 (Amersham Pharmacia) als ein Beförderungsmittel gefüllt war, unterzogen. Die aktive Fraktion wurde sofort auf MonoQ10/10 (Amersham Pharmacia) aufgebracht. Nach dem Waschen der Kolonne mit Pufferlösung A wurden absorbierte Proteine unter Verwendung von 0–0,3 M Kaliumchloridgradient eluiert. Die resultierende vereinigte aktive Fraktion wurde 10 Mal mit Pufferlösung A verdünnt und auf eine Kolonne (16 ∅ × 100 mm), gefüllt mit AMP-Agarose (Amersham Pharmacia) aufgebracht. Eine nichtabsorbierte Fraktion wurde zurückgewonnen und sofort auf eine Kolonne (5 ∅ × 50 mm) gefüllt mit Hydroxyapatit, aufgebracht. Eine nichtabsorbierte Fraktion wurde zurückgewonnen und wiederum auf MonoQ10/10 absorbiert. Die Proteine wurden unter Verwendung eines 0–0,2 M Kaliumchloridgradienten eluiert. Eine Polyacrylamidelektrophorese zeigte, dass die aktive Fraktion ein annähernd einzelnes Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 38 kDa enthielt.
- 3. Bestimmung der Aminosäuresequenz des inneren Teils von D-PLDH
- Das Protein, welches im Beispiel 1-2 erhalten wurde, wurde konzentriert und unter Verwendung von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese isoliert und elektrisch auf eine PVDF-Membran transferiert. Das Protein, welches auf die PVDF-Membran transferiert wurde, wurde mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt, um seine Anwesenheit und Lokalisierung zu bestätigen. Ein Stück der PVDF-Membran, an welchem das Protein anwesend war, wurde ausgeschnitten und der Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Proteinsequenzers unterzogen, was jedoch fehlgeschlagen ist.
- Das Protein, welches im Beispiel 1-2 erhalten wurde, wurde konzentriert und unter Verwendung von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese isoliert und das Gel wurde mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt. Ein Stück des Gels, welches das gewünschte Protein enthielt, wurde ausgeschnitten. Dieses Gel wurde wiederholt mit 200 μl einer Entfärbungslösung (0,2 M Ammoniumbicarbonat, 50% Acetonitril, ph 8,0) in einem kleinen Teströhrchen gewaschen, um das Coomassie Brilliant Blue aus dem Gel auszuwaschen, worauf das Gel unter reduziertem Druck getrocknet wurde. Zu dem halbgetrockneten Gel wurden 5 μl Pufferlösung B (0,2 M Ammoniumbicarbonat, 0,02% Tween 20, pH 8,0) gegeben, worauf ein 1/100 molares Volumen an Trypsin zugegeben wurde. Die Mischung wurde ca. 10 Minuten lang stehengelassen, um das Enzym im Gel zu verteilen, worauf 200 μl von Pufferlösung B zugegeben wurden und das Protein mit dem Enzym bei 37°C 48 Stunden lang abgebaut wurde. Die Enzymreaktion wurde mit Trifluoressigsäure beendet und die Reaktionslösung wurde zurück gewonnen. Das Gel wurde gründlich mit 200 μl einer Waschlösung (0,1% Trifluoressigsäure, 60% Acetonitril) gewaschen und wurde mit der vorher zurückgewonnenen Reaktionslösung gemischt. Der Waschvorgang wurde ferner zweimal wiederholt, um das Trypsinextrakt zurückzugewinnen. Das zurückgewonnene Trypsinextrakt wurde unter reduziertem Druck getrocknet, worauf 60 μl destilliertes Wasser zugegeben wurden, um eine Peptidfragmentprobe, digestiert durch Trypsin, herzustellen. Diese Probe wurde einer Chromotographie zur Fraktionierung unterworfen (Kolonne: C18, 0,21 ∅ × 220 mm, Gradient: 0,1% Trifluoressigsäure, 5% Acetonitril – 0,085% Trifluoressigsäure, 35% Acetonitril) unter Verwendung eines Modells 172 μ für ein preparatives HPLC-System (Perkin-Eimer Applied Biosystem). Von den Peptidfragmentpeaks, welche erhalten wurden, wurden zwei Peptidfragmente hinsichtlich den Aminosäuresequenzen analysiert und die folgenden Sequenzen wurden bestimmt.
Peptidfragment 1: ANVAGFVTTSEPK (SEQ ID Nr. 3)
Peptidfragment 2: AGDWVTK (SEQ ID Nr. 4). - Beispiel 2: Isolierung der cDNA von D-PLDH
- 1. Isolierung von cDNA und Aufbau einer cDNA-Bibliothek
- Der die Substanz PF1022 produzierende Mikroorganismus (Mycelia sterilia, FERM BP-2671) wurde einer UV-Bestrahlung oder einer NTG-Behandlung unterzogen, um eine Mutation zu induzieren, und der resultierende Stamm 432-26, welcher die Substanz PF1022 produziert, in welchem die PF1022-Produktivität verbessert war, wurde in 10 ml eines Saatmediums [1% Hefeextrakt, 1% Malzextrakt, 2% Polypepton, 2,5% Glucose, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat (pH 7,0)] (WO 01/18179A1) in einem Teströhrchen überimpft und bei 26°C drei Tage lang unter Schütteln inkubiert. Die Saatkultur wurde in 50 ml des Mediums, welches in WO 97/20945 beschrieben wurde, in einen geeigneten Behälter überimpft und bei 26°C sechs Tage lang unter Verwendung eines Rotationsschüttlers inkubiert, worauf die Zellen durch Zentrifugieren zurück gewonnen wurden. Die so erhaltenen Zellen wurden mit flüssigem Stickstoff gefroren und dann mit einem Mörser und Pistill zerrieben. Die gesamte RNA wurde von den zerriebenen Zellen unter Verwendung von ISOGEN (Nippon Gene) gemäß dem beigefügten Protokoll isoliert. Ferner wurde die mRNA unter Verwendung eines mRNA-Reinigungskits (Amersham Pharmacia) von der gesamten RNA gemäß dem beigefügten Protokoll gereinigt.
- Die cDNA wurde anhand der so erhalten mRNA unter Verwendung eines „Time Saver cDNA Synthesekits" (Amersham Pharmacia) gemäß dem beigefügten Protokoll synthetisiert. Diese cDNA wurde in einen Phagenvektor, Lambda ZAP II (Stratagene Co.) eingefügt. Der rekombinante Phagenvektor, welcher auf diese Art und Weise aufgebaut wurde, wurde einem in „vitro packaging" unter Verwendung eines Gigapack III Gold Packaging Extracts (Stratagene Co.) gemäß dem beigefügten Protokoll unterzogen. Danach wurde der Escherichia coli-Stamm XL1-Blue MRF' mit diesen rekombinanten Phagen infiziert und auf einer Platte kultiviert, um Plaques zu bilden. Die cDNA-Bibliothek, welche auf diese Art und Weise aufgebaut wurde, besaß eine Plaque-Bildungseinheit von 6,8 × 105. Ferner wurde diese cDNA-Bibliothek gemäß dem Protokoll, welches dem Lambda ZAP II beigefügt ist, vervielfältigt. Der Escherichia coli-Stamm XL1-Blue MRF' wurde mit dem rekombinanten Phagen in dieser vervielfältigten cCNA-Bibliothek infiziert und auf einer Platte kultiviert, um Plaques zu bilden.
- 2. Isolierung eines partiellen DNA-Fragments des D-PLDH-Gens
- Die folgenden beiden Primer wurden synthetisiert, basierend auf den Sequenzen der Peptidfragmente 1 und 2, welche im Beispiel 1-3 erhalten wurden.
Primer 1: 5'-GTIGTIACRAAICCNGCNAC-3'(SEQ ID Nr. 5)
Primer 2: 5'-GCIGGIGAYTGGGTNAC-3'(SEQ ID Nr. 6). - Unter Verwendung dieser Primer wurde eine PCR unter Verwendung der genomischen DANN durchgeführt, welche aus dem die Substanz PF1022 produzierenden Mikroorganismus (FERM BP-2671) als ein Templat isoliert wurde, durch das Verfahren, welches in WO 01/18179A1 beschrieben wurde. Die PCR wurde in 100 μl der Reaktionslösung unter Verwendung von 80 ng der genomischen DNA als ein Templat und unter Zugabe von 2,5 Einheiten von ExTaq DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), der beigefügten Pufferlösung und der dNTP-Mischung und den zwei Arten von Primern jeweils bei einer Endkonzentration von 0,5 μM unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Bei 94°C für fünf Minuten [bei 94°C für eine Minute, bei 58°C für eine Minute, bei 72°C für dreißig Sekunden] × 40 Zyklen und bei 72°C sieben Minuten; Lagerung bei 4°C. Eine Analyse der Reaktionslösung durch 2% Agarosegelelektrophorese zeigte, dass ein DNA-Fragment von 550 bp vervielfältigt wurde. Dieses DNA-Fragment wurde aus dem Agarosegel unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Sephaglas BandPrep Kits (Amersham Pharmacia) zurück gewonnen: Das zurück gewonnene DNA-Fragment und der pT7Blue T-Vektor (Novagen, Inc.) wurden unter Verwendung eines DNA-Verbindungskits ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) gemäß dem beigefügten Protokoll gebunden.
- Die Basensequenz dieses so geklonten DNA-Fragments wurde unter Verwendung eines DNA-Sequentierungskits dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer) und eines ABI PRISM 310 Genetic-Analysiergerätes (Perkin-Elmer) gemäß dem beigefügten Protokoll bestimmt. Als Ergebnis zeigte sich, dass die Basensequenz des isolierten DNA-Fragments homolog zu der des D-α-keto-Säure spezifischen Dehydrogenasegens war und es lag nahe, dass sie ein Teil des gewünschten D-PLDH-Gens war.
- 3. Klonieren der gesamten Region der cDNA von D-PLDH
- Die folgenden beiden Primer wurden neu synthetisiert, basierend auf den Sequenzen der DNA-Fragmenten, welche in Beispiel 2-2 erhalten wurden.
Primer 3: 5'-AAGGGATCCCAGCAGAGCACGATGAA-3'(SEQ ID Nr. 7)
Primer 4: 5'-GCAGGCTCGGCTGTAGTTATCAAA-3'(SEQ ID Nr.8). - Ein PCR-Produkt, welches durch PCR mit dem Primer 3 und Primer 4 unter Verwendung des DNA-Fragments, welches im Beispiel 2-2 erhalten wurde, als ein Templat vervielfältigt wurde, wurde als eine Probe beim Screening der cDNA-Bibliothek verwendet. Die PCR wurde in 100 μ der Reaktionslösung unter Verwendung von 500 ng des pT8Blueplasmid-Vektors, in welchen das DNA-Fragment, welches im Beispiel 2-2 erhalten wurde, eingefügt wurde, als ein Templat und Zugeben von 2,5 Einheiten von ExTaq DNA Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), der beigefügten Pufferlösung und der dNTP-Mischung und der beiden Arten von den Primern, jeweils bei einer Endkonzentration von 0,5 μM, unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Bei 94°C fünf Minuten lang, [bei 94°C eine Minute lang, bei 60°C eine Minute lang, bei 72°C dreißig Sekunden lang] × 40 Zyklen und bei 72°C sieben Minuten lang; Lagerung bei 4°C. Die resultierende Reaktionslösung wurde einer 2%-Agarosegelelektrophorese unterzogen, was die Anwesenheit eines DNA-Fragments von ca. 530 bp bestätigte. Dieses DNA-Fragment wurde von dem Agarosegel unter Verwendung eines Sephalas BandPreP Kits (Amersham Pharmacia) zurück gewonnen. Das zurück gewonnene DNA-Fragment wurde unter Verwendung eines „ECL Direct DNA/RNA Labeling Detecting Systems" (Amersham Pharmacia) gemäß dem beigefügten Protokoll markiert und als eine Nucleinsäuresonde zur Hybridisierung verwendet. - Eine „blotting-membrane Hibond N+" (Amersham Pharmacia) wurde auf der Platte, hergestellt im Beispiel 2-1 plaziert, auf welcher Plaques gebildet wurden, um die Plaques zu kopieren. Diese Membran wurde gemäß dem Verfahren von Makabe (Kazuhiro Makabe, Visual Experimental Note Series, Biotechnology Experiments Illustrated 4, in Cell Technology Supp., 125-133, 1997, veröffentlicht von Shujunsha) behandelt, um die DNA auf der Mebran zu immobilisieren. Bei dieser Behandlung wurde die Membran mit 5 × SSC gewaschen. Unter Verwendung eines ECL Direct DNA/RNA Labeling Detecting Systems (Amersham Pharmacia) wurden die markierte Nucleinsäuresonde und die Phagen-DNA, welche auf der Membran immobilisiert war, gemäß dem beigefügten Protokoll hybridisiert und dann wurden die Plaques, in welchen die markierte Nucleinsäure hybridisiert war, detectiert. Auf diese Art und Weise wurde ein positiver Phage mit einer 5'-Strangaufwärts-Region und einer 3'-Strangabwärts-Region homolog zu der Sonde, selektiert.
- Der positive Phage wurde gemäß dem Protokoll, beigefügt zu einem Lambda ZAP II (Stratagene Co.), behandelt, um ein Plasmid herzustellen, in welches das cDNA-Gen von D-PLDH eingefügt war.
- 4. Bestimmung der Basensequenz
- Das Sequenzieren wurde unter Verwendung eines Plasmids durchgeführt, in welches das so isolierte cDNA-Gen von D-PLDH als ein Templat eingefügt wurde und eines Primers 5: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'(SEQ ID Nr: 9) und/oder Primer 6: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'(SEQ ID Nr. 10) als Primer durchgeführt. Das Sequenzieren wurde durchgeführt unter Verwendung eines DNA-Sequenzierungskits dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer) und einem ABI PRISM 310 Genetic-Analysierers (Perkin-Elmer) gemäß dem beigefügten Protokoll. Von den erhaltenen Ergebnissen wurden Regionen, bei denen die Basensequenz nicht bekannt war, weiter einer Sequenzierung unterzogen unter Verwendung von Primern, welche neu designed wurden, basierend auf bereits sequenzierten Basensequenzen. Auf diese Art und Weise wurde die Basensequenz des 1509-bp cDNA-Gens von D-PLDH, welche in das Plasmid eingeführt wurde, bestimmt.
- Die Analyse dieser Sequenz machte deutlich, dass ein 1011-bp offener Leserahmen (ORF) anwesend war. Das Protein, welches von diesem ORF extrapoliert wurde, wies 336 Aminosäurereste auf und ein Molekulargewicht von 36,5 kDa, und war homolog zur D-Milchsäuredehydrogenase oder dergleichen. Die höchste Homologie zeigte sich mit Glyceratdehydrogenase und die Homologie betrug 37%. Die Basensequenz und die Aminosäuresequenz des ORF des D-PLDH-Gens der vorliegenden Erfindung, welche auf diese Art und Weise isoliert wurden, sind in SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 2 in der Sequenzierungsliste gezeigt.
- Beispiel 3: Massenproduktion von D-PLDH durch Massenexprimierung des D-PLDH-Gens
- 1. Herstellung des D-PLDH-Gens zur Genexprimierung
- PCR wurde durchgeführt unter Verwendung des Plasmids, welches im Beispiel 2-3 als ein Templat hergestellt wurde, des Primers 7: 5'-AAGCTTGTAAGGAGATATACATGGCCCAAGCACAACCA-3'(SEQ ID Nr. 11), zu welchem eine HindIII-Stelle am 5'-Ende zugegeben wurde, einem Stop-Codon genau dahinter und ferner einer Ribosomenbindungsstelle genau dahinter und dem Primer 8: 5'-ATGCAAGCTTTAGTGAACCCTATACTTGG-3'(SEQ ID Nr. 12), zu welchem nur eine HindIII-Stelle am 5'Ende zugegeben wurde, um das D-PLDH-Gen zu vervielfältigen, in welches HindIII-Stellen an beiden Enden eingefügt waren. Die PCR wurde in 20 μl Reaktionslösung unter Verwendung von 80 ng der Plasmid-DNA als ein Templat, einer Einheit von TaKaRa LA-Taq DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), der beigefügten Pufferlösung und der dNTP-Mischung, 25 mM Magnesiumchlorid und 100 pM-Primer unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Bei 94°C eine Minute lang, (bei 98°C 15 Sekunden lang, bei 68°C 3 Minuten lang) × 30 Zyklen, und bei 72°C 10 Minuten lang. Die resultierende Reaktionslösung wurde einer 1% Agarosegelelektrophorese unterzogen, um die Anwesenheit eines ca. 1000-bp-DNA-Fragments zu bestätigen, welches vom Agarosegel unter Verwendung eines Sephaglas Band Prep Kits (Amersham Pharmacia) zurück gewonnen wurde. Das zurück gewonnene PCR-Produkt und pT7B Blue t-Vektor (Novagen, Inc.) wurden unter Verwendung eines DNA-Bindungskits ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) gemäß dem beigefügten Protokoll gebunden. Ein Plasmid, welches mit D-PLDH gebunden war, wurde in Escherichia coli DH5α eingefügt und vervielfältigt und die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines „Concert Rapid Plasmid Purification Systems" (Gibco BRL Products) zurückgewonnen.
- Die Gensequenz von D-PLDH, welche auf diese Art und Weise vervielfältigt wurde, wurde unter Verwendung des Primers, abgeleitet aus dem D-PLDH-Gen, verwendet in Beispiel 2-4, und eines Primers, abgeleitet von der Basensequenz des pT7-Plasmidvektors bestätigt. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines DNA-Sequenzierungskits „BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction" (Perkin-Elmer) und eines ABI PRISM 310 Genetic Analyzers (Perkin-Elmer) gemäß dem beigefügten Protokoll durchgeführt.
- Nach der Bestätigung der Sequenz wurden 24 μl einer DNA-Lösung, enthaltend den PT7-Plasmidvektor, an welchem ca. 12 μg des D-PLDH-Gens gebunden wurden, 3 μ von HindIII (Toyobo Co., Ltd.) und 3 μ der beigefügten Pufferlösung gründlich gemischt und die Mischung wurde bei 37°C 18 Stunden lang zur Reaktion gebracht. Als nächstes wurde die Reaktionslösung einer 1% Agarosegelelektrophorese unterzogen, um ein ca. 1000-bp DNA-Fragment zu bestätigen. Dieses Fragment wurde aus dem Agarosegel unter Verwendung eines Sephaglas Band Prep Kits (Amersham Pharmacia) zurück gewonnen, um das D-PLDH-Gen zur Exprimierung zu erhalten.
- 2. Aufbau des Genexprimierungsvektors
- Eine Lösung, welche ca. 2,5 μg an kommerziellem pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd.) enthielt, wurde mit HindIII (Toyobo Co., Ltd.) und der beigefügten Pufferlösung bei 37°C 18 Stunden lang zur Reaktion gebracht, worauf die DNA durch Phenolextraktion zurückgewonnen wurde. Zu dieser DNA wurden 3 μl basische Phosphatase C75 (Takara Shuzo Co., Ltd.), 3 μl der beigefügten Pufferlösung und 24 μl an sterilem Wasser zugegeben und daraufhin wurde die Mischung bei 50°C 30 Minuten lang zur Reaktion gebracht, um die terminale Phosphorsäure zu entfernen. Die dephosphorylierte DNA wurde durch Phenolextraktion zurück gewonnen und in 3 μl TE-Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) gelöst.
- Das Plasmid pDPLDH-1 wurde durch Binden von 5 μl des D-PLDH-Gens zur Exprimierung, hergestellt in Beispiel 3-1, und 0,5 μl des pUC119-Vektors, welcher mit HindIII digestiert und an den Enden dephosphoryliert wurde, unter Verwen dung eines DNA-Bindungskits ver.2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) gemäß dem beigefügten Protokoll (
1 ) aufgebaut. - 3. Exprimierung von D-PLDH in Escherichia coli
- Zellen von Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd.), in welchen pDPLDH-1 eingefügt wurden, wurden auf einem LB-Agar-Medium, enthaltend 50 μl/ml Ampicillin, verteilt. Nach statischem Kultivieren bei 37°C für 18 Stunden wurden gewachsene E.coli DH5α-Zellen in 2 ml eines LB-Mediums, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, überimpft und bei 37°C 18 Stunden lang unter Schütteln kultiviert, um eine Saatkultur herzustellen. Ein Teil der Saatkultur wurde in 2 ml jeweils desselben Mediums in 10 Teströhrchen überimpft. Schüttelkultivierung wurde bei 37°C gestartet, nach 5 Stunden wurde IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM gegeben und die Schüttelkultur wurde 2 Stunden weiter fortgeführt. Nach dem Kultivieren wurden die Zellen durch Zentrifugieren zurück gewonnen, mit Pufferlösung A, beschrieben in Beispiel 1-2, gewaschen und dann in 2,5 ml Pufferlösung A suspendiert. Die resultierende Suspension wurde in einem Ultrasonicator unter eiskalten Bedingungen behandelt, die Zellrückstände wurden durch Zentrifugieren entfernt und der Überstand, eine grobe Enzymlösung, wurde auf diese Art und Weise erhalten. Escherichia coli DH5α, welche unter Verwendung von pUC 119 ohne das D-PLDH-Gen transformiert wurde, wurde als Kontrolle verwendet.
- Ein 150 μl umfassender Anteil von Pufferlösung A, enthaltend 250 μM NADPH und 250 μM Phenylbrenztraubensäure, wurde in Vertiefungen einer 96 Vertiefungen aufweisenden Microtiterplatte verteilt, jeweils 50 μl der groben Enzymlösung wurde zugegeben und sofort unter Verwendung einer Pipette gemischt und ein Wechsel in der Absorption bei 340 nm bei 26°C wurde gemessen. Die Messung wurde unter Verwendung eines „Absorption Microassay Reader BioLumin 960" (Molecular Dynamics) durchgeführt, um einen Abfall in der Absorption mit der Zeit nach dem Start der Reaktion zu verfolgen. Die Menge an Enzym, welches 1 μmol NADPH pro Minute oxidierte, wurde als eine Einheit bestimmt. Ergebnisse, wie die Enzymaktivität der groben Enzymlösung, sind in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Dehydrogenaseaktivität in der groben Enzymlösung Stamm, aus welchem die grobe Enzymlösung hergestellt wurde Enzymaktivität
pUC 119-tragender Stamm 7.30 × 10–3 pDPLDH-1-tragender Stamm 1.01 × 10–1. - Die gezeigten Werte wurden in [Einheit/ml an grober Enzymlösung] konvertiert.
- Demnach zeigte Escherichia coli DH5α, transformiert mit pDPLDH-1, eine D-PLDH-Aktivität, welche 13 mal höher war, als bei E.coli DH5α, transformiert mit pUC 119. Ergebnisse der Analyse unter Verwendung einer optisch divergierenden Kolonne bestätigten, dass das Produkt des Stammes, welcher das D-PLDH-Gen trug, D-Phenylmilchsäure war. Das Gen gemäß der vorliegenden Erfindung wurde als das D-PLDH-Gen bestätigt.
- Ferner wurde die erhaltene grobe Enzymlösung unter Verwendung von Mono Q10/10 unter den Bedingungen, wie sie im Beispiel 1-2 beschrieben sind, verarbeitet, um eine teilweise gereinigte Enzymlösung herzustellen. Diese teilweise gereinigte Enzymlösung wurde auf einen 96-kämmrigen Mikrotiter mit unterschiedlichen Konzentrationen des Substrats, Phenylbrenztraubensäure, aufgebracht, um die Enzymaktivität zu messen. Ferner wurde die Enzymaktivität auch mit einem alternativen Substrat, Brenztraubensäure, anstelle von Phenylbrenztraubensäure gemessen. Ergebnisse der Messung sind in Tabelle 2 gezeigt, in welcher die Reaktionsraten mit Brenztraubensäure auf 100 gesetzt wurde. Tabelle 2: Relative Enzymaktivität mit unterschiedlichen Reaktionssubstraten
Reaktionssubstrat relative Reaktionsrate (Rate mit Phenylbrenztrauben säure = 100) Phenylbrenztraubensäure 100 Brenztraubensäure 10 - Demnach wurde gezeigt, dass sich das Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung offensichtlich in seinen Eigenschaften von bekannten Milchsäuredehydrogenasen und dergleichen unterscheidet (Japanisches Patent Nr. 2750017; Taguchi, H. et al., J. Biol. Chem., 266, S. 12588 (1991) und ein neues Enzym sowohl hinsichtlich der Aminosäuresequenz als auch der enzymatischen Eigenschaften war.
- Sequenzliste
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Claims (14)
- Protein, umfassend eine Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NR: 2
- Protein, kodiert durch eine Nucleotid-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden Sequenzen: (c) die DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 1; (d) eine Nucleotid-Sequenz, welche mindestens 70% Homologie mit der DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 1 aufweist und ein Protein kodiert, welches D-Phenylmilchsäuredehydrogenase-Aktivität aufweist; und (e) eine Nucleotid-Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert und ein Protein kodiert, welches D-Phenylmilchsäuredehydrogenase-Aktivität aufweist.
- Polynucleotid, welches das Protein gemäß Anspruch 1 kodiert.
- Polynucleotid nach Anspruch 3, welches die DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 1 umfasst.
- Polynucleotid-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden Sequenzen: (c) die DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 1; (d) eine Nucleotid-Sequenz, welche mindestens 70% Homologie mit der DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 1 aufweist und ein Protein kodiert, welches die D-Phenylmilchsäuredehydrogenase-Aktivität aufweist; und (e) eine Nucleotid-Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert und ein Protein kodiert, welches D-Phenylmilch-säuredehydrogenase-Aktivität aufweist.
- Polynucleotid gemäß Anspruch 5, wobei (d) ein Polynucleotid ist, welches mindestens 80% Homologie mit der DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 1 aufweist.
- Polynucleotid gemäß Anspruch 5, wobei (d) ein Polynucleotid ist, welches mindestens 90% Homologie mit der DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 1 aufweist.
- Rekombinanter Vektor, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 3 bis 7.
- Nicht-menschlicher Wirt, umfassend den rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 8.
- Wirt nach Anspruch 9, welcher eine D-Phenylmilchsäuredehy-drogenase exprimiert.
- Wirt nach einem der Ansprüche 9 oder 10, welcher ein Cyclo(D-lactyl-L-N-methylleucyl-D-3-phenyllactyl-L-N-methyl-leucyl-D-lactyl-L-N-methylleucyl-D-3-phenyllactyl-L-N-methylleucyl-produzierender Mikroorganismus ist.
- Verfahren zur Herstellung einer D-Phenylmilchsäuredehydro-genase, umfassend die Schritte des Kultivierens des Wirts von Anspruch 9, 10 oder 11 und Sammeln der D-Phenylmilch-säuredehydrogenase aus dem Kulturmedium.
- Verfahren zur Herstellung von D-Phenylmilchsäure, ein Derivat davon oder ein Analogon davon, umfassend die Schritte des Reagierenlassens von Phenylbrenztraubensäure, einem Derivat davon oder einem Analogon davon mit dem Protein der Ansprüche 1 oder 2, dem Wirt von Anspruch 9, 10 oder 11, einem Extrakt des Wirts, einer Kultur des Wirts oder einem Enzym, welches von der Kultur gereinigt ist, und des Sammelns von D-Phenylmilchsäure, dem Derivat oder dem Analogon, wobei das Derivat von D-Phenylmilchsäure aus gewählt ist von p-Aminophenylmilchsäure, p-Nitrophenylmilchsäure und p-Hydroxyphenylmilchsäure; das Analogon von D-Phenylmilchsäure (R)-2-Hydroxy-4-phenylbuttersäure ist; das Derivat von Phenylbrenztraubensäure ausgewählt ist von p-Aminophenylbrenztraubensäure, p-Nitrophenylbrenztrauben-säure und p-Hydroxyphenylbrenztraubensäure; und das Analogon von D-Phenylbrenztraubensäure (R)-2-Oxo-4-phenylbut-tersäure ist.
- Verfahren zur Herstellung von Cyclo(D-lactyl-L-N-methyl-leucyl-D-3-phenyllactyl-L-N-methylleucyl-D-lactyl-L-N-methylleucyl-D-3-phenyllactyl-L-N-methylleucyl oder Cyclo(D-lactyl-L-N-methylleucyl-D-3-(4-aminophenyl)lactyl-L-N-methylleucyl-D-lactyl-L-N-methylleucyl-D-3-phenyllactyl-L-N-methylleucyl, umfassend die Schritt des Kultivierens des Wirts von Anspruch 11 und des Sammelns des Cyclo(D-lactyl-L-N-methylleucyl-D-3-phenyllactyl-L-N-methylleucyl-D-lactyl-L-N-methylleucyl-D-3-phenyllactyl-L-N-methyl-leucyls oder Cyclo(D-lactyl-L-N-methylleucyl-D-3-(4-amino-phenyllactyl-L-N-methylleucyl-D-lactyl-L-N-methylleucyl-D-3-phenyllactyl-L-N-methylleucyls aus dem Kulturmedium.
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