DE60125350T2

DE60125350T2 - Chlamydia-antigene, entsprechende dns-fragmente und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE60125350T2
Application number: DE60125350T
Authority: DE
Inventors: D. Andrew Richmond Hill MURDIN; P. Raymond Aurora OOMEN; Joe Toronto WANG; Pamela Woodbridge DUNN
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 2000-05-08
Filing date: 2001-05-08
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2021-05-09
Also published as: CA2408199A1; AU2001258105A1; DE60125350D1; WO2001085972A2; EP1282718B1; EP1282718A2; ATE348892T1; WO2001085972A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft einen Impfstoff, der eine CLPc-Protease und ihr entsprechendes DNA-Molekül umfasst, für die Vermeidung und Behandlung von Chlamydia-Infektion bei Säugern.
Die Anmeldung beschreibt auch eine Reihe von Chlamydia-Antigenen, einschließlich eines ATP-Bindekassette-Proteins, eines sekretorischer Lokus-ORF, einer Endopeptidase, einer Protease, einer Metalloprotease, CLP-Protease ATPase, einer CLP-Protease-Untereinheit, einer Transglycolase/Transpeptidase und Thioredoxin, und deren entsprechende DNA-Moleküle für die Vermeidung und Behandlung von Chlamydia-Infektion in Säugern.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Chlamydien sind Prokaryonten. Sie weisen morphologische und strukturelle Ähnlichkeiten zu gram-negativen Bakterien auf, einschließlich einer trilaminaren äußeren Membran, die Lipopolysaccharid und mehrere Membranproteine enthält, die zu Proteinen strukturell und funktionell analog sind, die bei E. coli gefunden werden. Sie sind obligat intrazelluläre Parasiten mit einem einzigartigen biphasischen Lebenszyklus, der aus einem metabolisch inaktiven, jedoch infektiösen extrazellulären Stadium und einem replizierenden, jedoch nicht-infektiösen intrazellulären Stadium besteht. Das replikative Stadium des Lebenszyklus findet innerhalb eines Membran-gebundenen Einschlusses statt, der die Bakterien von dem Cytoplasma der infizierten Wirtszelle abtrennt.
C. pneumoniae ist ein häufiges menschliches Pathogen, das ursprünglich als der TWAR-Stamm von Chlamydia psittaci beschrieben wurde, jedoch sodann als eine neue Spezies erkannt wurde. C. pneumoniae ist antigenisch, genetisch und morpho logisch von anderen Chlamydia-Spezies (C. trachomatis, C. pecorum und C. psittaci) verschieden. Es zeigt 10% oder weniger DNA-Sequenzhomologie mit sowohl C. trachomatis als auch C. psittaci.
Im Allgemeinen weisen alle Chlamydien eine gemeinsame Entwicklungsmikrobiologie auf und sie scheinen eine gemeinsame Immunbiologie aufzuweisen. Genomanalysen zeigen, dass mehr als 80% der Protein-kodierenden Gene von C. pneumoniae und C. trachomatis Orthologe sind, die eine ähnliche Genomorganisation aufweisen.
C. pneumoniae ist die dritthäufigste Ursache für Lungenentzündungen, deren auslösende Erreger außerhalb des Krankenhauses aufgenommen wurden, und ist nur weniger häufig als Streptococcus pneumoniae und Mycoplasma pneumoniae (Grayston et al. (1995) Journal of Infectious Diseases 168:1231; Campos et al. (1995) Investigation of Ophthalmology and Visual Science 36:1477). Es kann auch Symptome und Erkrankungen des oberen Atemtrakts, einschließlich Bronchitis und Sinusitis hervorrufen (Grayston et al. (1995) Journal of Infectious Diseases 168:1231; Grayston et al. (1990) Journal of Infectious Diseases 161:618–625; Marrie (1993) Clinical Infectious Diseases 18:501–513; Wang et al. (1986) Chlamydial infections, Cambridge University Press, Cambridge, S. 329). Die große Mehrheit der Erwachsenen (mehr als 60%) weist Antikörper gegen C. pneumoniae auf (Wang et al. (1986) Chlamydial infections, Cambridge University Press, Cambridge, S. 329), was eine zurückliegende Infektion anzeigt, die unerkannt oder asymptomatisch blieb.
C. pneumoniae-Infektion stellt sich gewöhnlich als eine akute respiratorische Erkrankung dar (d.h. Husten, Halsschmerzen, Heiserkeit und Fieber; abnormale Geräusche im Brustkorb bei Abhören). Bei den meisten Patienten dauert der Husten zwei bis sechs Wochen an und eine Genesung ist langsam. Bei etwa 10% dieser Fälle wird eine Infektion des oberen Atemtrakts durch Bronchitis oder Lungenentzündung gefolgt. Ferner wurde während einer C. pneumoniae-Epidemie eine darauf folgende Co-Infektion mit Pneumococcus bei etwa der Hälfte dieser Patienten mit Lungenentzündung verzeichnet, insbesondere bei geschwächten und älteren Personen. Wie vorstehend beschrieben gibt es zunehmend Anzeichen dafür, dass eine C. pneumoniae-Infektion auch mit Erkrankungen gekoppelt ist, die keine respiratorischen Infektionen sind.
Das Reservoir für den Organismus sind vermutlich Menschen. Im Gegensatz zu C. psittaci-Infektionen gibt es kein bekanntes Vogel- oder Tierreservoir. Eine Übertra gung wurde nicht deutlich definiert. Sie könnte aus einem direkten Kontakt mit Sekreten, aus Infektionsträgern oder aus Luftübertragung resultieren. Es gibt einen langen Inkubationszeitraum, der für viele Monate andauern kann. Basierend auf einer Analyse von Epidemien scheint sich C. pneumoniae langsam über eine Population auszubreiten (das Fall-zu-Fall-Intervall beträgt durchschnittlich 30 Tage), da infizierte Personen unzureichende Überträger für den Organismus sind. Eine Empfänglichkeit für C. pneumoniae ist universell. Erneute Infektionen treten während des Erwachsenenalters auf und folgen der Primärinfektion als Kind. C. pneumoniae scheint eine endemische Erkrankung auf der ganzen Welt zu sein, wobei überlagernde Intervalle eines erhöhten Auftretens (Epidemien), die zwei bis drei Jahre andauern, festzustellen sind. C. trachomatis-Infektion verleiht keine Kreuz-Immunität gegenüber C. pneumoniae. Infektionen werden leicht mit oralen Antibiotika, Tetracyclin oder Erythromycin (2 g/d, mindestens 10 bis 14 d lang) behandelt. Ein kürzlich entwickeltes Arzneimittel, Azithromycin, ist als Einzeldosistherapie gegen Chlamydien-Infektionen hochgradig wirksam.
In den meisten Fällen verläuft eine C. pneumoniae-Infektion häufig mild und ohne Komplikationen und bis 90% der Infektionen sind subakut oder unerkannt. Man nahm an, dass bei Kindern in Industrieländern Infektionen bis zu einem Alter von fünf Jahren selten sind, obwohl eine jüngere Untersuchung (E. Normann et al., Chlamydia pneumoniae in children with acute respiratory tract infections, Acta Paediatrica, 1998, Band 87, Ausgabe 1, Seiten 23–27) beschrieb, dass viele Kinder in dieser Altersgruppe in einer PCR Anzeichen für eine Infektion aufweisen, obwohl sie seronegativ sind. Es wurde eine Prävalenz von 17–19% bei Kindern im Alter von 2–4 Jahren geschätzt. In Entwicklungsländern ist die Seroprävalenz von C. pneumoniae-Antikörpern unter jungen Kindern erhöht und es gibt Vermutungen, dass C. pneumoniae eine wichtige Ursache für eine akute Erkrankung des unteren Atemtrakts und eine Mortalität bei Säuglingen und Kindern in tropischen Regionen der Welt sein könnte.
Aus Seroprävalenzuntersuchungen und Untersuchungen von lokalen Epidemien war zu erkennen, dass eine anfängliche C. pneumoniae-Infektion gewöhnlich zwischen einem Lebensalter von 5 und 20 Jahren auftritt. Für die USA wird beispielsweise angenommen, dass es 30000 Fälle einer durch C. pneumoniae verursachten Pneumonie bei Kindern jedes Jahr gibt. Infektionen können sich unter Gruppen von Kindern oder jungen Erwachsenen anhäufen (z.B. Schüler oder Wehrpflichtige).
C. pneumoniae verursacht 10–25% der Infektionen des unteren Atemtrakts, deren auslösende Erreger außerhalb des Krankenhauses aufgenommen werden (wie von Schweden, Italien, Finnland und den USA berichtet). Während einer Epidemie kann C. pneumonia-Infektion 50–60% der Fälle an Pneumonie ausmachen. Während dieser Zeiträume wurden auch mehrere Episoden einer Mischinfektion mit S. pneumoniae beschrieben.
Eine erneute Infektion während des Erwachsenenalters ist häufig. Das klinische Bild neigt dazu, abgeschwächter zu sein. Wie anhand Seroprävalenzuntersuchungen in der Bevölkerung ermittelt, gibt es eine Tendenz für eine zunehmende Exposition mit dem Alter, die besonders unter Männern deutlich ist. Manche Wissenschaftler spekulierten, dass ein persistierendes, asymptomatisches C. pneumoniae-Infektionsstadium auftritt.
Bei älteren Erwachsenen oder Erwachsenen mittleren Alters kann sich C. pneumoniae-Infektion zu einer chronischen Bronchitis und Sinusitis entwickeln. Eine Untersuchung in den USA zeigte, dass die Häufigkeit für durch C. pneumoniae verursachte Pneumonie bei Personen, die jünger als 60 Jahre sind, ein Fall pro 1000 Personen pro Jahr beträgt. Jedoch erhöhte sich die Erkrankungswahrscheinlichkeit bei älteren Menschen um das Dreifache. C. pneumoniae-Infektion führt selten zu einem Krankenhausaufenthalt, mit der Ausnahme von Patienten mit einer Basiserkrankung.
Von beträchtlicher Wichtigkeit ist die Verbindung von Atherosklerose und C. pneumoniae-Infektion. Es gibt mehrere epidemiologische Untersuchungen, die eine Korrelation von vorherigen Infektionen mit C. pneumoniae und Herzinfarkten und Erkrankungen der Koronararterien und Halsschlagadern zeigen (Saikku et al. (1988) Lancet; ii:983–986; Thom et al. (1992) JAMA 268:68–72; Linnanmaki et al. (1993) Circulation 87:1030; Saikku et al. (1992) Annals Internal Medicine 116:273–287; Melnick et al. (1993) American Journal of Medicine 95:499). Darüber hinaus wurden die Organismen in Atheromen und Fettstreifen der Koronararterien, Halsschlagadern, peripheren Arterien und Aorta nachgewiesen (Shor et al. (1992) South African Medical Journal 82:158–161; Kuo et al. (1993) Journal of Infectious Diseases 167:841–849; Kuo et al. (1993) Arteriosclerosis and Thrombosis 13:1501–1504; Campbell et al. (1995) Journal of Infectious Diseases 172:585; Chiu et al. (1997) Circulation 96:2144–2148). Lebensfähiges C. pneumoniae wurde aus der Koronararterie und Halsschlagader gewonnen (Ramirez et al. (1996) Annals of Internal Medici ne 125:979–982; Jackson et al. (1997) J. Infect. Dis. 176:292–295). Ferner wurde gezeigt, dass C. pneumoniae Veränderungen einer Atherosklerose im Kaninchenmodell induzieren kann (Fong et al. (1997) Journal of Clinical Microbiology 35:48 und Laitinen et al. (1997) Infect. Immun. 65:4832–4835). Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass es hochgradig wahrscheinlich ist, dass C. pneumoniae Atherosklerose bei Menschen hervorrufen kann, obwohl die epidemiologische Wichtigkeit für Chlamydien-Atherosklerose noch zu zeigen ist.
Eine Reihe jüngerer Untersuchungen zeigte auch eine Verbindung zwischen C. pneumoniae-Infektion und Asthma. Eine Infektion wurde auch mit keuchender asthmatischer Bronchitis, Altersasthma und akuten Verschlimmerungen von Asthma bei Erwachsenen in Verbindung gebracht und Untersuchungen in kleinerem Maßstab zeigten, dass eine längere Antibiotikabehandlung wirksam war, die Schwere der Erkrankung bei manchen Individuen stark zu verringern (Hahn D.L. et al., Evidence for Chlamydia pneumoniae infection in steroid-dependent asthma, Ann. Allergy Asthma Immunol., 1998 Jan, 80(1): 45–49; Hahn D.L. et al., Association of Chlamydia pneumoniae IgA antibodies with recently symptomatic asthma, Epidemiol. Infect., 1996 Dez, 117(3): 513–517; Bjornsson E. et al., Serology of chlamydia in relation to asthma and bronchial hyperresponsiveness, Scand. J. Infect. Dis., 1996, 28(1): 63–69; Hahn D.L., Treatment of Chlamydia pneumoniae infection in adult asthma: a before-after trial, J. Fam. Pract., 1995 Okt, 41(4): 345–351; Allegra L. et al., Acute exacerbations of asthma in adults: role of Chlamydia pneumoniae infection, Eur. Respir. J., 1994 Dez, 7(12): 2165–2168; Hahn D.L. et al., Association of Chlamydia pneumoniae (strain TWAR) infection with wheezing, asthmatic bronchitis, and adult-onset asthma, JAMA, 1991 Jul. 10, 266(2): 225–230).
Im Hinblick auf diese Ergebnisse wäre ein schützender Impfstoff gegen C. pneumoniae-Infektion von beträchtlicher Wichtigkeit. Es gibt bisher keinen wirksamen Impfstoff für eine jegliche menschliche Chlamydien-Infektion. Es ist vorstellbar, dass ein wirksamer Impfstoff unter Verwendung von physikalisch oder chemisch inaktivierten Chlamydien entwickelt werden kann. Jedoch bietet ein solcher Impfstoff keine große Sicherheit. Im Allgemeinen werden sicherere Impfstoffe dadurch hergestellt, dass der Organismus durch Attenuierung oder in rekombinanter Art und Weise genetisch manipuliert wird.
Eine mit C. trachomatis-Infektion assoziierte Erkrankung ist Trachom, eine Folgekrankheit einer Augeninfektion. Diese Erkrankung ist nach wie vor eine Hauptur sache für eine verhinderbare Erblindung, wobei schätzungsweise 500 Millionen Fälle von aktivem Trachom weltweit auftreten (7 Millionen umfassen Blindheit aufgrund von Bindehautvernarbung und Deformationen des Augenlids). In den letzten beiden Jahrzehnten wurde eine Genital-Chlamydien-Infektion als ein hauptsächliches Gesundheitsproblem dadurch identifiziert, dass erkannt wurde, dass eine Chlamydien-Infektion mit Krankheitssyndromen wie nicht-gonococcaler Urethritis, mucopurulenter Cervicitis, Nierenbeckenentzündung (PID), ektopischer Schwangerschaft und Eileiterunfruchtbarkeit assoziiert ist. Die Weltgesundheitsorganisation schätzte 89 Millionen neue Fälle einer genitalen Chlamydien-Infektion weltweit im Jahre 1995. In den Vereinigten Staaten treten jedes Jahr schätzungsweise 4 Millionen neue Fälle auf und 50000 Frauen werden als ein Ergebnis einer Infektion unfruchtbar.
Untersuchungen mit C. trachomatis und C. psittaci zeigen, dass ein sicherer und wirksamer Impfstoff gegen Chlamydia ein erstrebenswertes Ziel ist. Zum Beispiel sind Mäuse, die sich von einer Lungeninfektion mit C. trachomatis erholt haben, vor einer Unfruchtbarkeit, die durch einen darauf folgenden vaginalen Befall induziert wird, geschützt (Pal et al. (1996) Infection and Immunity 64:5341). In ähnlicher Weise waren Schafe, die mit inaktiviertem C. psittaci immunisiert worden waren, vor darauf folgenden durch Chlamydien induzierten Abgängen und Totgeburten geschützt (Jones et al. (1995) Vaccine 13:715). In einem Mäusemodell wurde ein Schutz vor Chlamydien-Infektionen mit Thl-Immunreaktionen, insbesondere einer CD8+-CTL-Reaktion, in Verbindung gebracht (Rottenberg et al. (1999) J. Immunol. 162:2829–2836 und Penttila et al. (1999) Immunology 97:490–496) und es ist unwahrscheinlich, dass ähnliche Reaktionen bei Menschen induziert werden müssen, um einen Schutz zu verleihen. Jedoch sind Antigene, die fähig sind, eine schützende Immunreaktion gegenüber C. pneumoniae hervorzurufen, größtenteils unbekannt. Das Auftreten ausreichend hoher Titer von neutralisierenden Antikörpern an Mucosaoberflächen kann auch eine schützende Wirkung ausüben (Cotter et al. (1995) Infection and Immunity 63:4704).
Eine antigene Variation innerhalb der Spezies C. pneumoniae ist aufgrund einer unzureichenden genetischen Information nicht gut dokumentiert, obwohl basierend auf C. trachomatis das Vorliegen einer Variation erwartet wird. Serovarietas von C. trachomatis wird auf der Basis einer antigenen Variation in dem Hauptprotein der äußeren Membran (MOMP) definiert, veröffentlichte MOMP-Gensequenzen von C. pneumoniae zeigen jedoch keine Variation zwischen mehreren verschiedenen Isola ten des Organismus (Campbell et al. (1990) Infection and Immunity 58:93; McCafferty et al. (1995) Infection and Immunity 63:2387–9; Gaydos et al. (1992) Infection and Immunity 60(12):5319–5323). Das Gen, das für ein 76 kDa-Antigen kodiert, wurde von einem einzigen Stamm von C. pneumoniae kloniert und die Sequenz veröffentlicht (Perez Melgosa et al. (1994) Infection and Immunity 62:880). Ein Operon, das für die Gene für Cystein-reiche Proteine der äußeren Membran mit 9 kDa und 60 kDa kodiert, wurde beschrieben (Watson et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:5299; Watson et al. (1995) Microbiology 141:2489). Viele Antigene, die durch Immunseren gegen C. pneumoniae erkannt werden, sind über alle Chlamydien konserviert, jedoch können das Protein mit 98 kDa, das Protein mit 76 kDa und mehrere andere Proteine spezifisch für C. pneumoniae sein (Knudsen et al. (1999) Infect. Immun. 67:375–383; Perez Melgosa et al. (1994) Infection and Immunity 62:880; Melgosa et al. (1993) FEMS Microbiol. Lett. 112: 199; Campbell et al. (1990) J. Clin. Microbiol. 28:1261; Iijima et al. (1994) J. Clin. Microbiol. 32:583). Es wurde beschrieben, dass Antiseren gegen Antigene mit 76 kDa und 54 kDa C. pneumoniae in vitro neutralisieren (Perez Melgosa et al. (1994) Infect. Immun. 62:880–886 und Wiedmann-Al-Ahmad et al. (1997) Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:700–704). Eine Bewertung der Anzahl und relativen Häufigkeit jeglicher Serotypen von C. pneumoniae und der definierenden Antigene ist bisher nicht möglich. Die gesamte Genomsequenz von C. pneumoniae, Stamm CWL-029 ist nun bekannt (http://chlamydia-www.berkeley.edu:4231/), und wie weitere Sequenzen verfügbar werden, kann ein besseres Verständnis von antigener Variation gewonnen werden.
Viele Antigene, die durch Immunseren gegen C. pneumoniae erkannt werden, sind über alle Chlamydien konserviert, jedoch scheinen Proteine mit 98 kDa, 76 kDa und 54 kDa spezifisch für C. pneumoniae zu sein (Campos et al. (1995) Investigation of Ophthalmology and Visual Science 36:1477; Marrie (1993) Clinical Infectious Diseases 18:501–513; Wiedmann-Al-Ahmad M. et al., Reactions of polyclonal and neutralizing anti-p54 monoclonal antibodies with an isolated, species-specific 54-kilodalton protein of Chlamydia pneumoniae, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 1997 Nov, 4(6): 700–704).
Ein Immunoblotting von Isolaten mit Seren aus Patienten zeigt eine Variation von Blottingmustern zwischen Isolaten, was anzeigt, dass Serotypen von C. pneumoniae existieren könnten (Grayston et al. (1995) Journal of Infectious Diseases 168:1231; Ramirez et al. (1996) Annals of Internal Medicine 125:979–982). Jedoch werden die Ergebnisse möglicherweise durch den Infektionszustand der Patienten verzerrt, da Immunoblot-Profile von Seren eines Patienten sich während der Zeit nach einer Infektion verändern. Eine Bewertung der Anzahl und relativen Häufigkeit jeglicher Serotypen und der definierenden Antigene ist bisher nicht möglich.
Die Verwendung von DNA-Immunisierung, um eine schützende Immunreaktion in Balb/c-Mäusen gegen pulmonale Infektion mit dem Mäuse-Pneumonitis (MoPn)-Stamm von Chlamydia trachomatis zu erzeugen, wurde kürzlich beschrieben (Zhang et al. (1997) J. Infect. Dis. 76:1035–1040 und Zhang et al. (1999) Immunology 96:314–321). Kürzlich wurde die Genomsequenz des C. pneumoniae-Stamms CM1 (ATCC # 1360-VR) von Griffais in der WO 99/27105 am 3. Juni 1999 beschrieben.
Dementsprechend besteht ein Bedarf für eine Identifizierung und Isolierung von Polynukleotid-Sequenzen aus C. pneumoniae für eine Verwendung bei der Vermeidung und Behandlung von Chlamydia-Infektion.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Anmeldung beschreibt aufgereinigte und isolierte Polynukleotid-Moleküle, die für ein Chlamydia-Polypeptid kodieren, das ausgewählt ist aus: einem ATP-bindenden Kassettenprotein, einem sekretorischer Lokus-ORF, einer Endopeptidase, einer Protease, einer Metalloprotease, CLP-Protease ATPase, einer CLP-Protease-Untereinheit, einer Transglycolase/Transpeptidase, einer CLPc-Protease und Thioredoxin. Die in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotid-Moleküle können in Verfahren zur Verhinderung, Behandlung und Diagnose von Chlamydia-Infektion verwendet werden. Beispielsweise sind die in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotid-Moleküle DNA, die für ein Polypeptid einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 kodiert.
Ein weiterer in der Anmeldung beschriebener Aspekt betrifft Polypeptide, die einem isolierten DNA-Molekül entsprechen. Aminosäuresequenzen der entsprechenden kodierten Polypeptide sind in einer Ausführungsform als SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 gezeigt.
Der Fachmann wird leicht verstehen, dass die Anmeldung bei Beschreibung der für Chlamydia-Polypeptide kodierenden Polynukleotid-Sequenzen auch Polynukleotide beschreibt, die für Fragmente kodieren, die von solchen Polypeptiden abgeleitet sind. Darüber hinaus beschreibt die Anmeldung ferner Mutanten und Derivate sol cher Polypeptide und Fragmente, die davon abgeleitet sind, die sich aus der Addition, Deletion oder Substitution von nicht-essenziellen Aminosäuren wie hier beschrieben ergeben. Der Fachmann würde auch leicht verstehen, dass die Anmeldung bei Beschreibung der für Chlamydia-Polypeptide kodierenden Polynukleotid-Sequenzen ferner monospezifische Antikörper beschreibt, die spezifisch an solche Polypeptide binden.
Die Anmeldung beschreibt Expressionskassetten, Vektoren und Zellen, die mit den in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotiden transformiert oder transfiziert sind.
Dementsprechend beschreibt die Anmeldung ferner (i) ein Verfahren zur Herstellung eines in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids in einem rekombinanten Wirtsystem und entsprechende Expressionskassetten, Vektoren und transformierte oder transfizierte Zellen, (ii) ein Verfahren zur Diagnose des Auftretens von Chlamydia in einer biologischen Probe, das die Verwendung eines in der Anmeldung beschriebenen DNA- oder RNA-Moleküls, monospezifischen Antikörpers oder Polypeptids umfassen kann, und (iii) ein Verfahren zur Aufreinigung eines in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids durch Antikörper-basierte Affinitätschromatographie.
Erfindungsgemäß wird bereitgestellt: (i) ein Impfstoff oder ein Lebend-Impfvektor wie ein Pockenvirus-, Salmonella typhimurium- oder Vibrio cholerae-Vektor mit einem in der Anmeldung beschriebenen Polypeptid oder Polynukleotid, wobei solche Impfstoffe und Impfvektoren für beispielsweise eine Vermeidung und Behandlung von Chlamydia-Infektion verwendbar sind, in Kombination mit einem Verdünnungsmittel oder Träger, und damit in Beziehung stehende pharmazeutische Zusammensetzungen und verbundene therapeutische und/oder prophylaktische Verfahren, (ii) eine therapeutische und/oder prophylaktische Verwendung eines in der Anmeldung beschriebenen RNA- oder DNA-Moleküls, entweder in nackter Form oder mit einem Zufuhrträger formuliert, eines Polypeptids oder einer Kombination von Polypeptiden oder eines monospezifischen Antikörpers wie in der Anmeldung beschrieben, und damit in Verbindung stehende pharmazeutische Zusammensetzungen.
In einem erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Impfstoff bereitgestellt, der einen Impfvektor und mindestens eine erste Nukleinsäure umfasst, die ausgewählt ist aus einer jeglichen der folgenden:

(i) eine in SEQ ID NO: 17 gezeigte Nukleinsäuresequenz,
(ii) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein durch SEQ ID NO: 17 kodiertes Polypeptid kodiert,
(iii) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das zu mindestens 75% in der Aminosäuresequenz zu dem durch SEQ ID NO: 17 kodierten Polypeptid identisch ist,
(iv) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz in SEQ ID NO: 18 gezeigt ist,
(v) eine Nukleinsäuresequenz wie in (i), (ii) oder (iv) definiert, die derart modifiziert wurde, dass sie für ein modifiziertes Polypeptid kodiert, wobei das modifizierte Polypeptid Immunogenizität beibehält und zu mindestens 75% in der Aminosäuresequenz zu dem entsprechenden durch die Nukleinsäure von (i), (ii) oder (iv) kodierten Polypeptid identisch ist,

In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Impfstoff bereitgestellt, der einen Impfvektor und mindestens eine erste Nukleinsäure umfasst, die ausgewählt ist aus einer jeglichen der folgenden:

(i) eine Nukleinsäuresequenz, die mindestens 36 aufeinander folgende Nukleotide aus SEQ ID NO: 17 umfasst,
(ii) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein immunogenes Fragment kodiert, das mindestens 12 aufeinander folgende Aminosäuren aus SEQ ID NO: 18 umfasst,
(iii) eine Nukleinsäuresequenz wie in (i) oder (ii) definiert, die derart modifiziert wurde, dass sie für ein modifiziertes Polypeptid kodiert, wobei das modifizier te Polypeptid Immunogenizität beibehält und zu mindestens 75% in der Aminosäuresequenz zu dem entsprechenden Fragment von (i) oder (ii) identisch ist,

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen weiter verstanden werden, worin:
9 zeigt die Nukleotidsequenz des Gens, das für eine CLPc-Protease kodiert (SEQ ID NO: 17), und die abgeleitete Aminosäuresequenz der CLPc-Protease aus Chlamydia pneumoniae (SEQ ID NO: 18).
19 zeigt die Restriktionsenzymanalyse des C. pneumoniae-Gens, das für eine CPLc-Protease kodiert.
29 zeigt die Herstellung und Elemente des Plasmids pCACPNM459.
39 zeigt einen Schutz gegenüber C. pneumoniae-Infektion durch pCACPNM459 nach einer DNA-Immunisierung.
Die Anmeldung beschreibt auch weitere Zeichnungen, worin:
1 zeigt die Nukleotidsequenz des Gens, das für eine ATP-bindende Kassette kodiert (SEQ ID NO: 1), und die abgeleitete Aminosäuresequenz der ATP-bindenden Kassette aus Chlamydia pneumoniae (SEQ ID NO: 2).
2 zeigt die Nukleotidsequenz des Gens, das für einen sekretorischer Lokus-ORF kodiert (SEQ ID NO: 3), und die abgeleitete Aminosäuresequenz des sekretorischer Lokus-ORF aus Chlamydia pneumoniae (SEQ ID NO: 4).
3 zeigt die Nukleotidsequenz des Gens, das für eine Endopeptidase kodiert (SEQ ID NO: 5), und die abgeleitete Aminosäuresequenz der Endopeptidase aus Chlamydia pneumoniae (SEQ ID NO: 6).
4 zeigt die Nukleotidsequenz des Gens, das für eine Protease kodiert (SEQ ID NO: 7), und die abgeleitete Aminosäuresequenz der Protease aus Chlamydia pneumoniae (SEQ ID NO: 8).
5 zeigt die Nukleotidsequenz des Gens, das für eine Metalloprotease kodiert (SEQ ID NO: 9), und die abgeleitete Aminosäuresequenz der Metalloprotease aus Chlamydia pneumoniae (SEQ ID NO: 10).
6 zeigt die Nukleotidsequenz des Gens, das für CLP-Protease ATPase kodiert (SEQ ID NO: 11), und die abgeleitete Aminosäuresequenz der CLP-Protease ATPase aus Chlamydia pneumoniae (SEQ ID NO: 12).
7 zeigt die Nukleotidsequenz des Gens, das für eine CLP-Protease-Untereinheit kodiert (SEQ ID NO: 13), und die abgeleitete Aminosäuresequenz der CLP-Protease-Untereinheit aus Chlamydia pneumoniae (SEQ ID NO: 14).
8 zeigt die Nukleotidsequenz des Gens, das für eine Transglycolase/Transpeptidase kodiert (SEQ ID NO: 15), und die abgeleitete Aminosäuresequenz der Transglycolase/Transpeptidase aus Chlamydia pneumoniae (SEQ ID NO: 16).
10 zeigt die Nukleotidsequenz des Gens, das für Thioredoxin kodiert (SEQ ID NO: 19), und die abgeleitete Aminosäuresequenz von Thioredoxin aus Chlamydia pneumoniae (SEQ ID NO: 20).
11 zeigt die Restriktionsenzymanalyse für das C. pneumoniae-Gen, das für eine ATP-bindende Kassette kodiert.
12 zeigt die Restriktionsenzymanalyse für das C. pneumoniae-Gen, das für einen sekretorischer Lokus-ORF kodiert.
13 zeigt die Restriktionsenzymanalyse für das C. pneumoniae-Gen, das für eine Endopeptidase kodiert.
14 zeigt die Restriktionsenzymanalyse für das C. pneumoniae-Gen, das für eine Protease kodiert.
15 zeigt die Restriktionsenzymanalyse für das C. pneumoniae-Gen, das für eine Metalloprotease kodiert.
16 zeigt die Restriktionsenzymanalyse für das C. pneumoniae-Gen, das für CLP-Protease ATPase kodiert.
17 zeigt die Restriktionsenzymanalyse für das C. pneumoniae-Gen, das für eine CLP-Protease-Untereinheit kodiert.
18 zeigt die Restriktionsenzymanalyse für das C. pneumoniae-Gen, das für eine Transglycolase/Transpeptidase kodiert.
20 zeigt die Restriktionsenzymanalyse für das C. pneumoniae-Gen, das für Thioredoxin kodiert.
21 zeigt die Herstellung und Elemente des Plasmids pCACPNM213.
22 zeigt die Herstellung und Elemente des Plasmids pCACPNM882.
23 zeigt die Herstellung und Elemente des Plasmids pCACPNM208.
24 zeigt die Herstellung und Elemente des Plasmids pCACPNM1096.
25 zeigt die Herstellung und Elemente des Plasmids pCACPNM1097.
26 zeigt die Herstellung und Elemente des Plasmids pCACPNM908.
27 zeigt die Herstellung und Elemente des Plasmids pCACPNM909.
28 zeigt die Herstellung und Elemente des Plasmids pCACPNM440.
30 zeigt die Herstellung und Elemente des Plasmids pCACPNM708.
31 zeigt einen Schutz gegenüber C. pneumoniae-Infektion durch pCACPNM213 nach DNA-Immunisierung.
32 zeigt einen Schutz gegenüber C. pneumoniae-Infektion durch pCACPNM882 nach DNA-Immunisierung.
33 zeigt einen Schutz gegenüber C. pneumoniae-Infektion durch pCACPNM208 nach DNA-Immunisierung.
34 zeigt einen Schutz gegenüber C. pneumoniae-Infektion durch pCACPNM1096 nach DNA-Immunisierung.
35 zeigt einen Schutz gegenüber C. pneumoniae-Infektion durch pCACPNM1097 nach DNA-Immunisierung.
36 zeigt einen Schutz gegenüber C. pneumoniae-Infektion durch pCACPNM908 nach DNA-Immunisierung.
37 zeigt einen Schutz gegenüber C. pneumoniae-Infektion durch pCACPNM909 nach DNA-Immunisierung.
38 zeigt einen Schutz gegenüber C. pneumoniae-Infektion durch pCACPNM2440 nach DNA-Immunisierung.
40 zeigt einen Schutz gegenüber C. pneumoniae-Infektion durch pCACPNM708 nach DNA-Immunisierung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Offene Leserahmen (ORF), die für eine Reihe von Chlamydien-Proteinen kodieren, wurden aus dem Genom von C. pneumoniae identifiziert. Diese Proteine umfassen ein ATP-Bindekassette-Protein, einen sekretorischer Lokus-ORF, eine Endopeptidase, eine Protease, eine Metalloprotease, CLP-Protease ATPase, eine CLP-Protease-Untereinheit, eine Transglycolase/Transpeptidase, eine CLPc-Protease und Thioredoxin. Das Gen, das für ein jegliches dieser Polypeptide kodiert, wurde in ein Expressionsplasmid inseriert und es wurde gezeigt, dass es einen Immunschutz gegenüber Chlamydien-Infektion verleiht. Dementsprechend kann ein jegliches dieser Polypeptide und verwandter Polypeptide für eine Vermeidung und Behandlung von Chlamydia-Infektion verwendet werden.
Gemäß einem ersten in der Anmeldung beschriebenen Aspekt werden isolierte Polynukleotide beschrieben, die für Chlamydia-Polypeptide kodieren, deren Aminosäuresequenzen in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 gezeigt sind.
Der Begriff „isoliertes Polynukleotid" definiert ein Polynukleotid, das aus der Umgebung, in der es natürlicherweise auftritt, entfernt wurde. Zum Beispiel ist ein natürlich auftretendes DNA-Molekül, das in dem Genom eines lebenden Bakteriums oder als Teil einer Genbank vorliegt, nicht isoliert, das gleiche Molekül ist jedoch bei Abtrennung von dem verbleibenden Teil des bakteriellen Genoms als Ergebnis von beispielsweise einem Klonierungsereignis (Amplifikation) isoliert. Typischerweise ist ein isoliertes DNA-Molekül frei von DNA-Regionen (wie kodierenden Regionen), mit denen es in dem natürlich auftretenden Genom am 5'- oder 3'-Ende unmittelbar benachbart ist. Solche isolierten Polynukleotide können Teil eines Vektors oder einer Zusammensetzung sein und immer noch als isoliert definiert werden, dadurch dass ein solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung nicht Teil der natürlichen Umgebung eines solchen Polynukleotids ist.
Das in der Anmeldung beschriebene Polynukleotid ist entweder RNA oder DNA (cDNA, genomische DNA oder synthetische DNA) oder Modifikationen, Varianten, Homologe oder Fragmente davon. Die DNA ist entweder doppelsträngig oder einzelsträngig und falls sie einzelsträngig ist, ist sie entweder der kodierende Strang oder der nicht-kodierende (Antisense-)Strang. Eine jegliche der Sequenzen, die für die in der Anmeldung beschriebenen Polypeptide wie in einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 gezeigt kodieren, ist (a) eine kodierende Sequenz, (b) eine Ribonukleotidsequenz, die von der Transkription von (a) abgeleitet ist, oder (c) eine kodierende Sequenz, die die Redundanz oder die Degeneriertheit des genetischen Codes, die gleichen Polypeptide zu kodieren, nutzt. „Polypeptid" oder „Protein" betrifft eine jegliche Kette von Aminosäuren, ungeachtet der Länge oder einer post-translationellen Modifikation (wie Glykosylierung oder Phosphorylierung). Beide Begriffe werden austauschbar in der vorliegenden Anmeldung verwendet.
In Übereinstimmung mit einem in der Anmeldung beschriebenen Aspekt werden Aminosäuresequenzen bereitgestellt, die zu einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 homolog sind. Wie hier verwendet betrifft „homologe Aminosäuresequenz" ein jegliches Polypeptid, das vollständig oder teilweise durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die bei 25–35°C unter der kriti schen Schmelztemperatur (Tm) an einen jeglichen Teil der Nukleinsäuresequenz nach einer der SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und 19 hybridisiert. Eine homologe Aminosäuresequenz ist eine Sequenz, die sich von einer Aminosäuresequenz nach einer der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheidet. Eine solche Sequenz umfasst auch serotypische Varianten (nachstehend definiert), sowie Sequenzen mit Deletionen oder Insertionen, die inhärente Eigenschaften des Polypeptids wie Immunogenizität beibehalten. Vorzugsweise ist eine solche Sequenz zu mindestens 75%, vorzugsweise mindestens 78%, mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 85%, 88% oder 90% und am meisten bevorzugt mindestens 93%, 95% oder 98% zu einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 identisch.
Homologe Aminosäuresequenzen umfassen Sequenzen, die zu einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 identisch oder im Wesentlichen identisch sind. „Im Wesentlichen identische Aminosäuresequenz" betrifft eine Sequenz, die zu mindestens 90%, vorzugsweise 95%, mehr bevorzugt 97% und am meisten bevorzugt 99% zu einer Referenz-Aminosäuresequenz identisch ist und die sich vorzugsweise von der Referenz-Sequenz durch hauptsächlich konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheidet.
Konservative Aminosäuresubstitutionen sind Substitutionen innerhalb von Aminosäuren derselben Klasse. Diese Klassen umfassen beispielsweise Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten wie Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin und Tyrosin, Aminosäuren mit basischen Seitenketten wie Lysin, Arginin und Histidin, Aminosäuren mit sauren Seitenketten wie Asparaginsäure, Glutaminsäure und Aminosäuren mit nicht-polaren Seitenketten wie Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan und Cystein.
Homologie wird unter Verwendung von Sequenzanalyse-Software wie dem Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705 gemessen. Aminosäuresequenzen werden aneinander ausgerichtet, um eine Identität zu maximieren. Lücken können künstlich in die Sequenz eingeführt werden, um eine korrekte Ausrichtung zu erreichen. Sobald eine optimale Ausrichtung erstellt wurde, wird der Homologiegrad durch Aufzeichnung aller Positionen, in denen die Aminosäuren beider Sequenzen identisch sind, im Verhältnis zu der Gesamtzahl an Positionen bestimmt.
Homologe Polynukleotid-Sequenzen werden in ähnlicher Weise definiert. Vorzugsweise ist eine homologe Sequenz eine Sequenz, die zu mindestens 45%, mehr bevorzugt 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% und noch mehr bevorzugt 85%, 87%, 90%, 93%, 96% und am meisten bevorzugt 99% zu der kodierenden Sequenz einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und 19 identisch ist.
In Übereinstimmung mit einem in der Anmeldung beschriebenen Aspekt umfassen Polypeptide mit einer Sequenz, die zu einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 homolog ist, natürlich auftretende allelische Varianten, sowie Mutanten oder jegliche andere nicht natürlich auftretenden Varianten, die die inhärenten Eigenschaften des Polypeptids einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 beibehalten.
Wie bekannt ist, ist eine allelische Variante eine alternative Form eines Polypeptids, die dadurch charakterisiert ist, dass sie eine Substitution, Deletion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren aufweist, die nicht die biologische Funktion des Polypeptids verändert. „Biologische Funktion" betrifft die Funktion des Polypeptids in den Zellen, in denen es natürlicherweise auftritt, selbst wenn die Funktion für das Wachstum oder das Überleben der Zellen nicht notwendig ist. Beispielsweise ist die biologische Funktion eines Porins, den Eintritt von Verbindungen, die im extrazellulären Medium vorliegen, in Zellen zu ermöglichen. Biologische Funktion unterscheidet sich von antigener Eigenschaft. Ein Polypeptid kann mehr als eine biologische Funktion aufweisen.
Allelische Varianten sind in der Natur sehr häufig. Beispielsweise ist eine bakterielle Spezies wie C. pneumoniae gewöhnlicherweise durch eine Vielzahl von Stämmen vertreten, die sich voneinander durch kleine allelische Variationen unterscheiden. Tatsächlich kann ein Polypeptid, das die gleiche biologische Funktion in verschiedenen Stämmen erfüllt, eine Aminosäuresequenz (und Polynukleotid-Sequenz) aufweisen, die nicht in jedem der Stämme identisch ist. Ungeachtet dieser Variation wurde eine Immunreaktion gezeigt, die allgemein gegen viele allelische Varianten gerichtet ist. In Untersuchungen des Chlamydien-MOMP-Antigens tritt ein Binden des Antikörpers über verschiedene Stränge zusammen mit einer Neutralisierung einer Infektiösität auf, obwohl Aminosäuresequenz-Variationen von MOMP von Stamm zu Stamm vorliegen, was zeigt, dass das MOMP bei einer Verwendung als Immunogen gegenüber Aminosäurevariationen tolerant ist.
Polynukleotide, die für homologe Polypeptide oder allelische Varianten kodieren, werden durch Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) von genomischer bakterieller DNA, die herkömmlicherweise extrahiert wurde, gewonnen. Dies umfasst die Verwendung von synthetischen Oligonukleotidprimern, die zu stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Bereichen der 5'- und 3'-Enden der kodierenden Domäne passen. Geeignete Primer werden gemäß der Nukleotidsequenz-Information entworfen, die durch eine jegliche Sequenz der SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und 19 bereitgestellt wird. Das Verfahren ist wie folgt: ein Primer wird ausgewählt, der aus 10 bis 40, vorzugsweise 15 bis 25 Nukleotiden besteht. Es ist vorteilhaft, Primer auszuwählen, die C- und G-Nukleotide in einem Anteil enthalten, der ausreichend ist, um eine wirksame Hybridisierung sicherzustellen, d.h. eine Menge an C- und G-Nukleotiden von mindestens 40%, vorzugsweise 50% des gesamten Nukleotidgehalts. Eine Standard-PCR-Reaktion enthält typischerweise 0,5 bis 5 Units Taq-DNA-Polymerase pro 100 μl, 20 bis 200 μM von jedem Desoxynukleotid, vorzugsweise bei gleichen Konzentrationen, 0,5 bis 2,5 mM Magnesium über der gesamten Konzentration an Desoxynukleotiden, 10⁵ bis 10⁶ Zielmoleküle und etwa 20 pmol eines jeden Primers. Etwa 25 bis 50 PCR-Zyklen werden durchgeführt, wobei eine Annealingtemperatur 15°C bis 5°C unter dem wahren Tm der Primer liegt. Eine stringentere Annealingtemperatur verbessert eine Unterscheidung gegenüber falsch hybridisierten Primern und verringert einen Einbau von falschen Nukleotiden am 3'-Ende von Primern. Eine Denaturierungstemperatur von 95°C bis 97°C ist typisch, obwohl höhere Temperaturen für eine Denaturierung von G+C-reichen Zielen geeignet sein können. Die Anzahl an durchgeführten Zyklen hängt von der Ausgangskonzentration von Zielmolekülen ab, obwohl typischerweise mehr als 40 Zyklen nicht empfohlen sind, da eine Tendenz zur Akkumulierung von nicht-spezifischen Hintergrundprodukten besteht.
Ein alternatives Verfahren zum Gewinnen von Polynukleotiden, die für homologe Polypeptide oder allelische Varianten kodieren, besteht in einem Hybridisierungsscreening einer DNA- oder RNA-Bibliothek. Hybridisierungsverfahren sind bekannt und in Ausubel et al. (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994), Silhavy et al. (Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1984) und Davis et al. (Davis et al., A Manual for Genetic Engineering: Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1980) beschrieben. Wichtige Parameter für eine Optimierung von Hybridisierungsbedingungen spiegeln sich in einer Formel wider, die verwendet wird, um die kritische Schmelztemperatur zu erhalten, über der sich zwei komplementäre DNA-Stränge voneinander trennen (Casey & Davidson (1977) Nucl. Acid Res. 4:1539). Im Fall von Polynukleotiden mit etwa 600 Nukleotiden oder größer ist diese Formel wie folgt: Tm = 81,5 + 0,41 × (% G + C) + 16,6 log (Kationenionenkonzentration) – 0,63 × (% Formamid) – 600/Basenzahl. Unter geeigneten stringenten Bedingungen beträgt die Hybridisierungstemperatur (Th) etwa 20–40°C, 20–25°C oder vorzugsweise 30–40°C unter dem berechneten Tm. Der Fachmann wird verstehen, dass eine optimale Temperatur und optimale Salzbedingungen einfach bestimmt werden können.
Im Fall der in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotide werden stringente Bedingungen für sowohl Vorhybridisierungs-, als auch Hybridisierungsinkubationen (i) innerhalb von 4 bis 16 Stunden bei 42°C in 6 × SSC mit 50% Formamid oder (ii) innerhalb von 4 bis 16 Stunden bei 65°C in einer wässrigen 6 × SSC-Lösung (1 M NaCl, 0,1 M Natriumcitrat (pH 7,0)) erreicht. Typischerweise werden Hybridisierungsexperimente bei einer Temperatur von 60 bis 68°C, z.B. 65°C, durchgeführt. Bei einer derartigen Temperatur können stringente Hybridisierungsbedingungen in 6 × SSC, vorzugsweise in 2 × SSC oder 1 × SSC, mehr bevorzugt in 0,5 × SSC, 0,3 × SSC oder 0,1 × SSC (bei Fehlen von Formamid) erreicht werden. 1 × SSC enthält 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat.
Geeignete Homologe und Fragmente davon, die nicht natürlich auftreten, werden unter Verwendung von bekannten Verfahren für eine Identifizierung von solchen Regionen eines Antigens, die wahrscheinlich Aminosäuresequenzveränderungen und/oder -deletionen tolerieren, entworfen. Als ein Beispiel werden homologe Polypeptide aus unterschiedlichen Spezies verglichen und konservierte Sequenzen werden identifiziert. Je unterschiedlicher Sequenzen sind, desto wahrscheinlicher ist es, dass sie Sequenzveränderungen tolerieren. Eine Homologie unter Sequenzen kann unter Verwendung von beispielsweise dem BLAST-Homologie-Suchalgorithmus von Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389–3402 analysiert werden. Alternativ werden Sequenzen basierend auf einer Computer-gestützten Analyse von möglichen T- oder B-Zell-Epitopen derart modifiziert, dass sie gegenüber T- und/oder B-Zellen reaktiver werden. Eine noch weitere Alternative ist die Mutierung eines bestimmten Aminosäurerests oder einer bestimmten Aminosäurese quenz innerhalb des Polypeptids in vitro und sodann ein Screening der mutierten Polypeptide auf ihre Fähigkeit, Chlamydia-Infektion gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren zu verhindern oder zu behandeln.
Der Fachmann wird leicht verstehen, dass durch Befolgung des in dieser Anmeldung beschriebenen Screening-Verfahrens es ohne ungebührliches Experimentieren bestimmt werden wird, ob ein bestimmtes Homolog einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 bei der Vermeidung oder Behandlung von Chlamydia-Infektion verwendbar sein kann. Das Screening-Verfahren umfasst die Schritte:

(i) Immunisieren eines Tieres, vorzugsweise einer Maus, mit dem Testhomolog oder Fragment,
(ii) Beimpfen des immunisierten Tieres mit Chlamydia und
(iii) Selektieren derjenigen Homologe oder Fragmente, die einen Schutz gegenüber Chlamydia verleihen.

„Verleihen von Schutz" bedeutet, dass eine Verringerung hinsichtlich der Schwere einer jeglichen der Wirkungen einer Chlamydia-Infektion im Vergleich mit einem Kontrolltier, das nicht mit dem Testhomolog oder -fragment immunisiert wurde, auftritt.
In Übereinstimmung mit dem vorstehend in der Anmeldung beschriebenen Aspekt werden Polypeptid-Derivate beschrieben, die Teilsequenzen einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20, Teilsequenzen von Polypeptidsequenzen, die zu einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 homolog sind, Polypeptide, die von Volllängen-Polypeptiden durch innere Deletion abgeleitet sind, und Fusionsproteine sind.
Es ist anerkannte Praxis in der Immunologie, Fragmente und Varianten von Protein-Immunogenen als Impfstoffe zu verwenden, da alles, was erforderlich ist, um eine Immunreaktion gegenüber einem Protein zu induzieren, eine kleine (z.B. 8 bis 10 Aminosäuren) immunogene Region des Proteins ist. Es wurde gezeigt, dass verschiedene kurze synthetische Peptide, die Oberflächen-exponierten Antigenen von Pathogenen entsprechen, die von Chlamydia verschieden sind, wirksame Impfstoff- Antigene gegen ihre jeweiligen Pathogene sind, z.B. ein Peptid mit 11 Resten von murinem Mammatumorvirus (Casey & Davidson (1977) Nucl. Acid Res. 4:1539), ein Peptid mit 16 Resten von Semliki Forest Virus (Snijders et al. (1991) J. Gen. Virol. 72:557–565) und zwei überlappende Peptide mit 15 Resten, die jeweils aus Hunde-Parvovirus stammen (Langeveld et al. (1994) Vaccine 12(15):1473–1480).
Dementsprechend wird dem Fachmann nach Lesen der Beschreibung offensichtlich sein, dass Teilsequenzen einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 oder deren homologe Aminosäuresequenzen den Volllänge-Sequenzen inhärent sind und diese sind in der vorliegenden Anmeldung beschrieben. Solche Polypeptidfragmente sind vorzugsweise mindestens 12 Aminosäuren lang. Vorteilhafterweise sind sie mindestens 15 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 Aminosäuren, mehr bevorzugt mindestens 55, 60, 65, 70, 75 Aminosäuren und am meisten bevorzugt mindestens 80, 85, 90, 95, 100 Aminosäuren lang.
Polynukleotide mit 30 bis 600 Nukleotiden, die für Teilsequenzen von Sequenzen kodieren, die zu einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 homolog sind, werden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Parameter und unter Verwendung von Primern, die zu den Sequenzen passen, die stromaufwärts und stromabwärts zu den 5'- und 3'-Enden des zu amplifizierenden Fragments liegen, gewonnen. Das Matrizen-Polynukleotid für eine solche Amplifikation ist entweder das Volllängen-Polynukleotid, das zu einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und 19 homolog ist, oder ein Polynukleotid, das in einem Gemisch von Polynukleotiden wie einer DNA- oder RNA-Bibliothek enthalten ist. Als ein alternatives Verfahren für ein Gewinnen der Teilsequenzen wird eine Screening-Hybridisierung unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen und unter Verwendung der Formel für eine Berechnung des Tm-Werts durchgeführt. Falls Fragmente mit 30 bis 600 Nukleotiden gewonnen werden sollen, wird der berechnete Tm-Wert durch Subtrahieren korrigiert (600 pro Polynukleotid, Größe in Basenpaaren) und die Stringenzbedingungen werden durch eine Hybridisierungstemperatur definiert, die 5–10°C unter dem Tm-Wert liegt. Falls Oligonukleotide erhalten werden sollen, die kürzer als 20 bis 30 Basen sind, ist die Formel für eine Berechnung des Tm-Werts wie folgt: Tm = 4 × (G + C) + 2 (A + T). Beispielsweise würde ein Fragment mit 18 Nukleotiden und einem G+C-Gehalt von 50% einen ungefähren Tm-Wert von 54°C aufweisen. Kurze Peptide, die Fragmente einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 oder deren homologen Sequenzen sind, werden direkt durch chemische Synthese erhalten (E. Gross und H.J. Meinhofer, 4 The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Modern Techniques of Peptide Synthesis, John Wiley & Sons (1981) und M. Bodanzki, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag (1984)).
Geeignete Polypeptid-Derivate wie Polypeptidfragmente werden unter Verwendung von computergestützter Analyse von Aminosäuresequenzen entworfen. Dies würde mögliche Oberflächen-exponierte, antigene Regionen identifizieren (Hughes et al. (1992) Infect. Immun. 60(9):3497). Eine Analyse von Sequenzen mit 6 Aminosäuren, die in einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 enthalten sind, basierend auf dem Produkt von Flexibilitäts- und Hydrophobizitätsneigungen unter Verwendung des Programms SEQSEE (Wishart D.S. et al., „SEQSEE: a comprehensive program suite for protein sequence analysis", Comput. Appl. Biosci., 1994 Apr., 10(2):121–32), deckt mögliche B- und T-Zellepitope auf, die als eine Basis für eine Auswahl geeigneter immunogener Fragmente und Varianten verwendet werden können. Diese Analyse verwendet eine sinnvolle Kombination von Merkmalen der äußeren Oberfläche, die wahrscheinlich durch Antikörper erkannt werden. Mögliche T-Zell-Epitope für HLA-A0201-MHC-Unterklasse können durch einen Algorithmus aufgedeckt werden, der ein Vorgehen emuliert, das am NIH entwickelt wurde (Parker K.C. et al., „Peptide binding to MHC class I molecules: implications for antigenic peptide prediction", Immunol. Res., 1995, 14(1):34–57). Die möglichen B-Zell- und T-Zell-Epitope sind in den Tabellen 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und 19 und in SEQ ID NOs: 41 bis 74 gezeigt. Sequenzen, die im Wesentlichen zu SEQ ID NOs: 41 bis 74 identisch sind oder die konservativ substituierte Varianten von SEQ ID NOs: 41 bis 74 sind, sind erwartungsgemäß funktionelle Epitope und in der Anmeldung beschrieben.
Epitope, die eine schützende T-Zell-abhängige Immunreaktion induzieren, sind über die gesamte Länge des Polypeptids vorhanden. Jedoch können manche Epitope durch Sekundär- und Tertiärstrukturen des Polypeptids maskiert sein. Um solche maskierten Epitope freizulegen, werden große innere Deletionen geschaffen, die einen großen Teil der ursprünglichen Proteinstruktur entfernen und die maskierten Epitope exponieren. Solche inneren Deletionen bewirken manchmal den zusätzlichen Vorteil, dass immunodominante Regionen mit hoher Variabilität unter Stämmen entfernt werden.
Polynukleotide, die für Polypeptidfragmente und Polypeptide mit großen inneren Deletionen kodieren, werden in an sich bekannter Weise hergestellt (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994). Solche Verfahren umfassen Standard-PCR, inverse PCR, Restriktionsenzymbehandlung von klonierten DNA-Molekülen oder das Verfahren von Kunkel et al. (Kunkel et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:448). Komponenten für diese Verfahren und Anweisungen für ihre Verwendung sind einfach von verschiedenen kommerziellen Quellen wie Stratagene verfügbar. Sobald die Deletionsmutanten hergestellt wurden, werden sie auf ihre Fähigkeit getestet, Chlamydia-Infektion zu vermeiden oder zu behandeln, wie vorstehend beschrieben.
Wie hier verwendet, ist ein Fusionspolypeptid ein Polypeptid, das ein Polypeptid oder ein Polypeptid-Derivat, das in der Anmeldung beschrieben ist, in Fusion an das N- oder C-terminale Ende eines jeglichen anderen Polypeptids enthält (hier nachstehend als ein Peptidschwanz bezeichnet). Eine einfache Möglichkeit, ein solches Fusionspolypeptid zu erhalten, ist die Translation einer In-Frame-Fusion der Polynukleotid-Sequenzen, d.h. eines Hybridgens. Das Hybridgen, das für das Fusionspolypeptid kodiert, wird in einen Expressionsvektor inseriert, der für eine Transformation oder Transfektion einer Wirtszelle verwendet wird. Alternativ dazu wird die Polynukleotid-Sequenz, die für das Polypeptid oder Polypeptid-Derivat kodiert, in einen Expressionsvektor inseriert, in dem das für den Peptidschwanz kodierende Polynukleotid bereits vorhanden ist. Solche Vektoren und Anweisungen für ihre Verwendung sind käuflich verfügbar, z.B. das pMal-c2- oder pMal-p2-System von New England Biolabs, indem der Peptidschwanz ein Maltose-bindendes Protein ist, das Glutathion-S-Transferase-System von Pharmacia oder das His-Taq-System von Novagen. Diese und andere Expressionssysteme stellen einfache Mittel für eine weitere Aufreinigung von in der Anmeldung beschriebenen Polypeptiden und Derivaten bereit.
Ein vorteilhaftes Beispiel für ein Fusionspolypeptid ist ein Polypeptid, bei dem das in der Anmeldung beschriebene Polypeptid oder Homolog oder Fragment an ein Polypeptid mit einer förderlichen Aktivität wie Untereinheit B von Choleratoxin oder hitzelabilem Toxin aus E. coli fusioniert ist. Eine weitere vorteilhafte Fusion ist eine Fusion, bei der das Polypeptid, Homolog oder Fragment an ein starkes T-Zell-Epitop oder B-Zell-Epitop fusioniert ist. Ein solches Epitop kann ein bekanntes Epitop sein (z.B. das Kernantigen von Hepatitis B-Virus, D.R. Millich et al., „Antibody production to the nucleocapsid and envelope of the Hepatitis B virus primed by a single synthetic T cell site", Nature, 1987, 329:547–549) oder ein Epitop, das basierend auf einer computergestützten Analyse von möglichen T- oder B-Zell-Epitopen in einem anderen in der Anmeldung beschriebenen Polypeptid identifiziert wurde. In Übereinstimmung mit diesem in der Anmeldung beschriebenen Aspekt ist ein Fusionspolypeptid, das T- oder B-Zell-Epitope einer jeglichen Sequenz der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 oder ihres Homologs oder Fragments umfasst, wobei die Epitope von mehreren Varianten des Polypeptids oder Homologs oder Fragments abgeleitet sind und sich jede Variante in der Position und Sequenz ihres Epitops innerhalb des Polypeptids unterscheidet. Eine solche Fusion ist bei der Vermeidung und Behandlung von Chlamydia-Infektion wirksam, da sie die T- und B-Zell-Reaktion gegen das gesamte Polypeptid, Homolog oder Fragment optimiert.
Um eine Fusion zu erreichen, wird das in der Anmeldung beschriebene Polypeptid an das N- oder vorzugsweise C-terminale Ende des Polypeptids mit förderlicher Aktivität oder des T- oder B-Zell-Epitops fusioniert. Alternativ wird ein in der Anmeldung beschriebenes Polypeptidfragment innerhalb der Aminosäuresequenz des Polypeptids mit förderlicher Aktivität inseriert. Das T- oder B-Zell-Epitop kann auch innerhalb der Aminosäuresequenz des in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids inseriert werden.
In Übereinstimmung mit dem vorstehend beschriebenen Aspekt kodieren die in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotide auch für Hybrid-Vorläuferpolypeptide mit heterologen Signalpeptiden, die in Polypeptide reifen, die in der Anmeldung beschrieben sind. „Heterologes Signalpeptid" betrifft ein Signalpeptid, das in natürlich auftretenden Vorläufern von in der Anmeldung beschriebenen Polypeptiden nicht vorgefunden wird.
In der Anmeldung beschriebene Polynukleotid-Moleküle umfassen RNA, DNA oder Modifikationen oder Kombinationen davon mit verschiedenen Anwendungen. Ein DNA-Molekül wird zum Beispiel (i) in einem Verfahren zur Herstellung des kodierten Polypeptids in einem rekombinanten Wirtssystem, (ii) bei der Herstellung von Impfvektoren wie Poxviren, die ferner in Verfahren und Zusammensetzungen zur Vermeidung und/oder Behandlung von Chlamydia-Infektion verwendet werden, (iii) als Impfmittel (auch als RNA-Molekül), in einer nackten Form oder mit einem Zufuhrträger formuliert, und (iv) bei der Herstellung von attenuierten Chlamydia-Stämmen, die ein in der Anmeldung beschriebenes Polynukleotid überexprimieren können oder dieses Polynukleotid in einer nicht-toxischen, mutierten Form exprimieren können, verwendet.
Ausgewählte Gene aus pathogenen Mikroorganismen in einem eukaryontischen Expressionsplasmid sind als Impfstoffe verwendbar. Expressionsplasmide enthalten methylierte CpG-Motive, die immanente Cytokinreaktionen auslösen, die die Kanalisierung von CD4-T-Zell-Reaktionen zu einem Th1-Cytokin-Sekretionsmuster verstärken. Die intrazelluläre Synthese des mikrobiellen Proteins, insbesondere innerhalb transfizierter professioneller Antigen-präsentierender Zellen, erleichtert die Präsentation von Antigen auf Klasse I- und Klasse II-Molekülen und die Induktion von zellvermittelter Immunität. Die Verwendung eines oder einer Reihe von Genen, die für mikrobielle Proteine kodieren, ermöglicht, dass die Präsentation von schützenden Antigenen gegenüber dem Immunsystem bei Abwesenheit von Mikroben-gerichteten Immunevasionsmechanismen und bei Abwesenheit von kompetitierenden oder pathologischen Antigenen stattfindet. Durch DNA-Impfstoffe geprimte Immunreaktionen werden auch einfach durch Protein-Antigen-Immunisierung amplifiziert. Somit ist eine Immunisierung mit DNA-Impfstoffen für ein Entwerfen eines Chlamydien-Impfstoffes besonders relevant.
Dementsprechend umfasst ein weiterer in der Anmeldung beschriebener Aspekt (i) eine Expressionskassette mit einem in der Anmeldung beschriebenen DNA-Molekül, das unter die Kontrolle der Elemente gestellt wird, die für eine Expression erforderlich sind, insbesondere unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors, (ii) einen Expressionsvektor mit einer in der Anmeldung beschriebenen Expressionskassette, (iii) eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle, die mit einer in der Anmeldung beschriebenen Expressionskassette und/oder mit einem in der Anmeldung beschriebenen Vektor transformiert oder transfiziert ist, sowie (iv) ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder Polypeptid-Derivats, das durch ein in der Anmeldung beschriebenes Polynukleotid kodiert wird, das ein Kultivieren einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle, die mit einer in der Anmeldung beschriebenen Expressionskassette und/oder einem in der Anmeldung beschriebenen Vektor transformiert oder transfiziert ist, unter Bedingungen, die eine Expression des in der Anmeldung beschriebenen DNA-Moleküls ermöglichen, und ein Gewinnen des kodierten Polypeptids oder Polypeptid-Derivats aus der Zellkultur umfasst.
Ein rekombinantes Expressionssystem wird aus prokaryontischen und eukaryontischen Wirten ausgewählt. Eukaryontische Wirte umfassen Hefezellen (z.B. Saccha romyces cerevisiae oder Pichia pastoris), Säugerzellen (z.B. COS1-, NIH3T3- oder JEG3-Zellen), Arthropodenzellen (z.B. Spodoptera frugiperda (SF9)-Zellen) und Pflanzenzellen. Ein bevorzugtes Expressionssystem ist ein prokaryontischer Wirt wie E. coli. Bakterielle und eukaryontische Zellen sind von einer Reihe unterschiedlicher Quellen verfügbar, einschließlich kommerzieller Quellen wie der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland). Kommerzielle Quellen von Zellen, die für eine Expression von rekombinantem Protein verwendet werden, stellen auch Anleitungen für eine Verwendung der Zellen bereit.
Die Auswahl des Expressionssystems hängt von den für das exprimierte Polypeptid erwünschten Merkmalen ab. Beispielsweise kann es hilfreich sein, ein in der Anmeldung beschriebenes Polypeptid in einer bestimmten lipidierten Form oder in einer jeglichen anderen Form herzustellen.
Der Fachmann wird leicht verstehen, dass nicht alle Vektoren und Expressionskontrollsequenzen und Wirte erwartungsgemäß gleich gut die in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotide exprimieren würden. Innerhalb der nachstehend beschriebenen Richtlinien kann jedoch eine Auswahl von Vektoren, Expressionskontrollsequenzen und Wirten ohne ungebührliches Experimentieren und ohne von dem Umfang der Anmeldung abzuweichen erfolgen.
Bei der Auswahl eines Vektors muss ein Wirt ausgewählt werden, der mit dem Vektor kompatibel ist, der darin vorliegen und möglicherweise replizieren soll. Überlegungen werden hinsichtlich der Vektorkopienzahl, der Verfügbarkeit einer Kontrolle der Kopienzahl und einer Expression anderer Proteine wie einer Antibiotikaresistenz angestellt. Bei der Auswahl einer Expressionskontrollsequenz werden eine Reihe von Variablen berücksichtigt. Unter den wichtigen Variablen sind die relative Stärke der Sequenz (z.B. die Möglichkeit, die Expression unter verschiedenen Bedingungen anzutreiben), die Möglichkeit, die Funktion der Sequenz zu steuern, und eine Kompatibilität zwischen dem zu exprimierenden Polynukleotid und der Kontrollsequenz (z.B. vermeiden Sekundärstrukturen Haarnadelstrukturen, die eine wirksame Transkription verhindern). Bei der Auswahl des Wirts werden einzellige Wirte ausgewählt, die mit dem ausgewählten Vektor kompatibel sind, die gegenüber jeglichen möglichen toxischen Wirkungen des exprimierten Produkts tolerant sind, die fähig sind, das exprimierte Produkt wirksam zu sekretieren, falls dies erwünscht ist, die fähig sind, das Produkt in der gewünschten Konformation zu exprimieren, und bei denen eine maßstäbliche Vergrößerung leicht durchgeführt werden kann und das Endprodukt leicht aufgereinigt werden kann.
Die Auswahl der Expressionskassette hängt von dem ausgewählten Wirtssystem sowie den Merkmalen, die für das exprimierte Polypeptid erwünscht sind, ab. Typischerweise umfasst eine Expressionskassette einen Promoter, der in dem ausgewählten Wirtssystem funktionell ist und konstitutiv oder induzierbar sein kann, eine Ribosomen-Bindestelle, ein Startcodon (ATG), falls notwendig, eine Region, die für ein Signalpeptid wie ein Lipidierungs-Signalpeptid kodiert, ein in der Anmeldung beschriebenes DNA-Molekül, ein Stoppcodon und gegebenenfalls eine 3'-terminale Region (Translations- und/oder Transkriptionsterminator). Die für das Signalpeptid kodierende Region ist zu dem in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotid benachbart und liegt im richtigen Leserahmen. Die für das Signalpeptid kodierende Region ist zu dem DNA-Molekül, das für das reife Polypeptid kodiert, homolog oder heterolog und mit dem Sekretionsapparat des für die Expression verwendeten Wirts kompatibel. Der offene Leserahmen des in der Anmeldung beschriebenen DNA-Moleküls steht allein oder zusammen mit dem Signalpeptid unter der Kontrolle des Promotors, so dass eine Transkription und Translation in dem Wirtsystem auftritt. Promotoren und für Signalpeptide kodierende Regionen sind vielfältig bekannt und dem Fachmann verfügbar. Sie umfassen beispielsweise den Promotor von Salmonella typhimurium (und Derivate), der durch Arabinose induzierbar (Promotor araB) und in Gram-negativen Bakterien wie E. coli funktionell ist (wie in der US-PS 5,028,530 und in Cagnon et al. (Cagnon et al. (1991) Protein Engineering 4(7):843) beschrieben), den Promotor des Gens von Bakteriophage T7, das RNA-Polymerase kodiert, der in einer Reihe von E. coli-Stämmen, die T7-Polymerase exprimieren, funktionell ist (beschrieben in der US-PS 4,952,496), OspA-Lipidierungssignalpeptid und RlpB-Lipidierungssignalpeptid (Takase et al. (1987) J. Bact. 169:5692).
Die Expressionskassette ist typischerweise Teil eines Expressionsvektors, der bezüglich seiner Fähigkeit ausgewählt ist, in dem ausgewählten Expressionssystem zu replizieren. Expressionsvektoren (wie Plasmide oder virale Vektoren) können beispielsweise von den in Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Supp. 1987) ausgewählt werden. Geeignete Expressionsvektoren können von verschiedenen kommerziellen Quellen bezogen werden.
Verfahren zur Transformation/Transfektion von Wirtszellen mit Expressionsvektoren sind bekannt und hängen von dem ausgewählten Wirtssystem ab, wie beschrieben in Ausubel et al. (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994).
Bei Expression wird ein in der Anmeldung beschriebenes rekombinantes Polypeptid (oder ein Polypeptid-Derivat) produziert und verbleibt in dem intrazellulären Kompartiment, wird in das extrazelluläre Medium oder in dem periplasmatischen Raum sekretiert/ausgeschieden, oder wird in die zelluläre Membran eingebettet. Das Polypeptid wird in einer im Wesentlichen aufgereinigten Form aus dem Zellextrakt oder aus dem Überstand nach Zentrifugation der rekombinanten Zellkultur gewonnen. Typischerweise wird das rekombinante Polypeptid durch Antikörper-basierte Affinitätsaufreinigung oder durch andere bekannte Verfahren, die leicht durch den Fachmann angepasst werden können, z.B. durch Fusion des Polynukleotids, das für das Polypeptid oder sein Derivat kodiert, an eine kleine Affinitäts-bindende Domäne, aufgereinigt. Antikörper, die für eine Aufreinigung der in der Anmeldung beschriebenen Polypeptide durch Immunoaffinität verwendbar sind, werden wie nachstehend beschrieben erhalten.
Ein in der Anmeldung beschriebenes Polynukleotid kann auch als Impfstoff verwendbar sein. Es gibt zwei Hauptwege, entweder die Verwendung eines viralen oder bakteriellen Wirts als Gen-Zufuhrträger (Lebend-Impfvektor) oder die Verabreichung des Gens in einer freien Form, z.B. in ein Plasmid inseriert. Therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit eines in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotids wird wie nachstehend beschrieben bewertet.
Dementsprechend stellt die Erfindung einen Impfstoff bereit, der ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel oder einen physiologisch verträglichen Träger für eine Verwendung in einem Impfstoff und ein jegliches von (a) mindestens einer ersten Nukleinsäure in einem Impfvektor, wobei die erste Nukleinsäure für ein erstes Polypeptid kodiert, (b) dem ersten Polypeptid, (c) einem Fusionsprotein, das das erste Polypeptid und ein zweites Polypeptid umfasst, oder (d) einer Hybridnukleinsäure in einem Impfvektor, wobei die Hybridnukleinsäure die erste Nukleinsäure in einer In-Frame-Fusion mit einer Nukleinsäure umfasst, die für das zweite Polypeptid kodiert, umfasst, wobei eine jegliche erste Nukleinsäure exprimiert werden kann und das erste Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (i) einem Polypeptid, dessen Sequenz in SEQ ID NO: 18 angegeben ist, (ii) einem Polypeptid, das zu mindestens 75% in der Aminosäuresequenz zu SEQ ID NO: 18 identisch ist, und (iii) einem immunogenen Fragment, das mindestens 12 aufeinander folgende Aminosäuren aus SEQ ID NO: 18 umfasst.
Erfindungsgemäß wird auch bereitgestellt: (i) ein Impfvektor wie ein Poxvirus mit einem in der Anmeldung beschriebenen DNA-Molekül, das unter der Kontrolle von für eine Expression erforderlichen Elementen steht, (ii) eine Zusammensetzung, die einen erfindungsgemäßen Impfvektor zusammen mit einem Verdünnungsmittel oder Träger umfasst, insbesondere (iii) eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Impfvektors, (iv) ein Verfahren zur Induktion einer Immunreaktion gegenüber Chlamydia in einem Säuger (z.B. einem Menschen; alternativ kann das Verfahren in der Veterinärmedizin für eine Behandlung oder Vermeidung von Chlamydia-Infektion bei Tieren wie Katzen oder Vögeln eingesetzt werden), das eine Verabreichung an den Säuger einer immunogen wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Impfvektors für ein Auslösen einer schützenden oder therapeutischen Immunreaktion gegenüber Chlamydia umfasst, und insbesondere (v) ein Verfahren zur Vermeidung und/oder Behandlung einer Chlamydia-Infektion (wie C. trachomatis-, C. psittaci-, C. pneumonia-, C. pecorum-Infektion), das eine Verabreichung einer prophylaktischen oder therapeutischen Menge eines erfindungsgemäßen Impfvektors an ein infiziertes Individuum umfasst. Des Weiteren umfasst die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Impfvektors zur Herstellung eines Medikaments zur Vermeidung und/oder Behandlung von Chlamydia-Infektion.
Wie hier verwendet exprimiert ein Impfvektor ein oder mehrere in der Anmeldung beschriebene Polypeptide oder Derivate. Der Impfvektor kann des Weiteren ein Cytokin wie Interleukin-2 (IL-2) oder Interleukin-12 (IL-12) exprimieren, das die Immunreaktion verstärkt (förderliche Wirkung). Jede der zu exprimierenden Komponenten wird unter die Kontrolle von Elementen gestellt, die für eine Expression in einer Säugerzelle erforderlich sind.
In Übereinstimmung mit dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Aspekt ist eine Zusammensetzung, die mehrere Impfvektoren umfasst, wobei ein jeder davon ein in der Anmeldung beschriebenes Polypeptid oder Derivat exprimieren kann. Eine Zusammensetzung kann auch einen Impfvektor umfassen, der ein weiteres Chlamydia-Antigen oder eine Untereinheit, ein Fragment, ein Homolog, eine Mutante oder ein Derivat davon, gegebenenfalls zusammen mit einem Cytokin wie IL-2 oder IL-12, exprimieren kann.
Ein allgemeines Prinzip ist, dass eine Erkennung eines bestimmten Antigens nicht alleine ausreicht, eine wirksame Immunreaktion zu erzeugen. In manchen Fällen ist eine zellvermittelte Reaktion geeignet, in anderen ein Antikörper.
Antigene von Mikroorganismen variieren hinsichtlich ihrer Zugänglichkeit für Zellen des Immunsystems beträchtlich. Antigene, die normalerweise im Inneren eines Pathogens auftreten, können lediglich dann zugänglich werden, wenn das Pathogen oder eine infizierte Zelle abgetötet wird. Sogar Antigene, die an der Zelloberfläche exprimiert werden, können lediglich einen begrenzten Bereich ihrer möglichen Epitope für eine Antikörperbindung abhängig von ihrer Orientierung in der Membran präsentieren. Schützende Strukturen wie Bakterienkapseln begrenzen weiter die wirksame Erkennung von Epitopen.
Ein Unterschied sollte gemacht werden zwischen der Gesamtzusammensetzung der Immunreaktion, denjenigen Komponenten davon, die für die Auflösung einer Infektion wichtig sind, und den Komponenten, die für die Vermeidung einer erneuten Infektion verantwortlich sind. In vielen Fällen sind bestimmte Elemente der Immunreaktion von entscheidender Bedeutung, wie eine zellvermittelte Immunität bei Lepra. Sogar bei Betrachtung eines bestimmten Effektorsystems ist die gegen manche Antigene gerichtete Reaktion häufig viel wirksamer als die Reaktionen gegen andere. Immunreaktionen gegen bestimmte mikrobielle Antigene weisen einen unterschiedlichen Grad einer Bedeutung für eine antimikrobielle Immunität auf, abhängig von der Art des Organismus, seiner Pathogenizität und der Art der durch ihn ausgelösten Immunreaktion.
Die hauptsächlichen Effektoren gegen extrazelluläre Pathogene sind Antikörper und Komplement. Eine Bindung von Antikörper an Rezeptoren auf dem Pathogen kann dessen Anbindung an seine Zielzelle verhindern. Antikörper alleine oder mehr wirksam in Verbindung mit Komplement führt Pathogene einer Aufnahme durch Phagozyten, die Fc-Rezeptoren und Komplementrezeptoren CR1 und CR3 exprimieren, zu. Gewöhnlich wird dies zu einer intrazellulären Zerstörung des Pathogens führen, jedoch kann ein Antikörper tatsächlich die Ausbreitung der Infektion beschleunigen, falls der Phagozyt nicht in der Lage ist, das Pathogen zu zerstören und eine fakultative Wirtszelle ist. Eine solche Eventualität hängt jedoch von dem dynamischen Gleichgewicht zwischen den Wirkungen der humoralen und zellvermittelten Immunreaktionen ab.
Manchmal müssen wirksame Antikörper der richtigen Klasse angehören, um geeignete Effektoren zu aktivieren. Die wichtigen Antigene sind diejenigen, die bei einer Evasion von Immuneffektormechanismen beteiligt sind. Diese sind Pili, Fimbrien und Kapselantigene, die die Hauptantigene der äußeren Schicht von Bakterien ausmachen. Häufig ist eine Epitop-Spezifität wichtig, da sie bestimmt, ob Komplement in einer Position für die Schädigung der äußeren Membran abgeschieden wird. Es gibt auch zahlreiche Proteinantigene, die eine Antikörperreaktion induzieren können. Jedoch ist die Antikörperreaktion, obwohl sie teilweise Spezies-spezifisch ist und diagnostisch verwendbar sein kann, für eine Immunität größtenteils irrelevant. Dies wird am besten bei Lepra lepromatosa tuberosa deutlich, wo die Patienten eine schwache zellvermittelte Immunität, hohe Mengen an spezifischem Antikörper und Geweben, die stark mit Bakterien infiziert sind, aufweisen.
In manchen Fällen ist ein bestimmter Typ einer Antikörperreaktion für eine Beseitigung des Pathogens zwingend. Dies trifft für viele Bakterieninfektionen zu, bei denen spezifische Antikörper gegen Oberflächenantigene für eine Neutralisierung der bakteriellen Verteidigungsmechanismen und ein Zuführen der Bakterien zu Phagozyten notwendig sind.
Es gibt auch Fälle, bei denen Reaktionen auf einzelne Antigene für eine Wirtsimmunität wesentlich sind. Die einfachsten Beispiele sind die Toxine, die durch die Erreger von Diphtherie, Tetanus und Clostridien-Enteritis produziert werden. Die Schädigung, die direkt durch den Erreger bei diesen Erkrankungen erzeugt wird, ist im Vergleich zu derjenigen, die durch die sekretierten Toxine erzeugt wird, leicht. Dementsprechend umfasst ein Schutz gegen diese Zustände eine Immunisierung gegenüber Toxoiden. Nichtsdestotrotz muss das Immunsystem nach wie vor die Primärstelle der Bakterieninfektion beseitigen, falls die Erkrankung aufgelöst werden soll. Die Zielantigene für bakterizide Antikörper sind außerordentlich divers und umfassen LPS, Kapsel-Polysaccharide und andere Proteine der äußeren Membran. Virulenzfaktoren können auch gute Immunogene in einem Impfstoff bereitstellen.
Die Tabellen 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 18, sowie die entsprechenden 31 bis 40 zeigen, dass die hier beschriebenen Polypeptide immunogen sind. Ferner zeigen diese Figuren, dass die hier beschriebenen Polypeptide einen Immunschutz vor einer Chlamydia-Infektion verleihen, wie durch eine beschleunigte Beseitigung einer pulmonalen Infektion gezeigt wird. Eine solche Verminderung der Schwere der Wirkungen einer Chlamydia-Infektion ist ein Zeichen dafür, dass die Polypeptide eine aktive funktionelle Immunreaktion gegen das Pathogen, und nicht nur eine Antikörperreaktion gegen das Antigen erzeugt haben.
Tiermodelle wurden verwendet, um das immunbiologische Merkmal einer C. trachomatis-Infektion zu definieren. Das Mausmodell ist besonders informativ, größtenteils aufgrund der einfachen Verfügbarkeit von Immunreagenzien für Studien an Mäusen und der Entwicklung von transgenen Mäusen und Knockout-Mäusen (KO-Mäuse). C. trachomatis-Pneumonitis bei Maus (MoPn) ist das am häufigsten getestete Biovar unter den drei C. trachomatis-Biovaren (Trachom, venerisches Granulom und MoPn). Obwohl menschliche Biovare auch in Tiermodellen verwendet wurden, erfordern sie normalerweise eine starke Beimpfung oder Vorbehandlung mit Progesteron. MoPn, das ursprünglich aus Mausgewebe isoliert wurde, ist vermutlich ein natürliches murines Pathogen und bietet daher ein evolutionär angepasstes Pathogen für eine Analyse von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen.
Der signifikante Fortschritt in der Chlamydien-Immunbiologie basierend auf Mäusemodellen einer MoPn-Infektion hat sich erweitert und jüngere immunepidemiologische Untersuchungen bei Menschen aufgeklärt (Yang und Brunham (1998) Can. J. Infect. Dis. 9:99–108). Insbesondere wurde seit der Entdeckung von T-Helfer (Th) 1- und 2-Untergruppen gezeigt, dass Cytokinmuster für die Regulierung von Immunreaktionen gegen eine Vielzahl von Infektionserregern, einschließlich Chlamydien, entscheidend sind. Eine klinische Untersuchung zeigte, dass Trachomapatienten mit einer schweren Vernarbung der Bindehaut verminderte zellvermittelte Immunreaktionen gegen C. trachomatis und hohe IgG-Antikörpertiter aufweisen (Yang und Brunham (1999) Curr. Opin. Infect. Dis. 12:47–52). Eine Cytokinanalyse zeigt eine gesteigerte Interleukin (IL)-4- und eine verringerte Interferon (IFN)-γ-Produktion bei Patienten mit einer Narbenbildungserkrankung aufgrund einer C. trachomatis-Infektion im Vergleich zu Kontrollen ohne Narbenbildungserkrankung.
Impfverfahren für eine Behandlung oder Vermeidung einer Infektion bei einem Säuger umfassen die Verabreichung eines in der Anmeldung beschriebenen Impfvektors auf einem jeglichen herkömmlichen Weg, insbesondere an eine mucosale (z.B. okulare, intranasale, orale, gastrische, pulmonale, intestinale, rektale, vaginale oder zum Harnweg gehörige) Oberfläche oder über den parenteralen (z.B. subkutanen, intradermalen, intramuskulären, intravenösen oder intraperitonealen) Weg. Bevorzugte Wege hängen von der Wahl des Impfvektors ab. Eine Behandlung kann mit einer einzelnen Dosis bewirkt oder in Intervallen wiederholt werden. Die geeignete Dosis hängt von verschiedenen Parametern ab, die dem Fachmann bekannt sind, wie dem Impfvektor selbst, dem Verabreichungsweg oder dem Zustand des zu impfenden Säugers (Gewicht, Alter und dergleichen).
Verfügbare Lebend-Impfvektoren umfassen virale Vektoren wie Adenoviren und Poxviren, sowie bakterielle Vektoren wie Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, Bacillus Calmette-Guérin (BCG) und Streptococcus.
Ein Beispiel für einen Adenovirus-Vektor, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines Adenovirus-Vektors, der ein in der Anmeldung beschriebenes DNA-Molekül exprimieren kann, sind in der US-PS 4,920,209 beschrieben. Poxvirus-Vektoren umfassen Vaccinia- und Canarypox-Virus, die in den US-PSen 4,722,848 und 5,364,773 beschrieben sind (vergleiche auch beispielsweise Tartaglia et al. (1992) Virology 188:217 bezüglich einer Beschreibung eines Vaccinia-Virus-Vektors und Taylor et al. (1995) Vaccine 13:539 bezüglich einer Referenz eines Canarypox). Poxvirus-Vektoren, die ein in der Anmeldung beschriebenes Polynukleotid exprimieren können, werden durch homologe Rekombination wie in Kieny et al. (1984) Nature 312:163 beschrieben erhalten, so dass das in der Anmeldung beschriebene Polynukleotid in das Virusgenom unter geeigneten Bedingungen für eine Expression in Säugerzellen inseriert wird. Im Allgemeinen kann die Dosis eines Impfvirus-Vektors für eine therapeutische oder prophylaktische Verwendung etwa 1 × 10⁴ bis etwa 1 × 10¹¹, vorteilhafterweise etwa 1 × 10⁷ bis etwa 1 × 10¹⁰, vorzugsweise etwa 1 × 10⁷ bis etwa 1 × 10⁹ Plaque-bildende Einheiten pro Kilogramm betragen. Vorzugsweise werden virale Vektoren parenteral, beispielsweise in drei Dosen, die vier Wochen voneinander entfernt liegen, verabreicht. Es ist bevorzugt, die Hinzufügung eines chemischen Adjuvanz zu einer Zusammensetzung mit einem erfindungsgemäßen Virusvektor zu vermeiden, und dadurch die Immunreaktion gegenüber dem Virusvektor selbst zu minimieren.
Mutierte Stämme von Vibrio cholerae, die kein Gift produzieren und als oraler Lebend-Impfstoff verwendbar sind, sind bekannt. Mekalanos et al. (1983) Nature 306:551 und US-PS 4,882,278 beschreiben Stämme, bei denen eine wesentliche Menge der kodierenden Sequenz von jedem der beiden ctxA-Allele deletiert ist, so dass kein funktionelles Choleratoxin produziert wird. Die WO 92/11354 beschreibt einen Stamm, bei dem der irgA-Lokus durch Mutation inaktiviert ist. Diese Mutation kann in einem einzigen Stamm mit ctxA-Mutationen kombiniert werden. Die WO 94/01533 beschreibt eine Deletionsmutante, der funktionelle ctxA- und attRS1-DNA-Sequenzen fehlen. Diese mutierten Stämme sind genetisch derart verändert, dass sie wie in der WO 94/19482 beschrieben heterologe Antigene exprimieren. Eine wirksame Impfstoffdosis eines Vibrio cholerae-Stamms, der ein durch ein in der Anmeldung beschriebenes DNA-Molekül kodiertes Polypeptid oder Polypeptid-Derivat exprimieren kann, enthält etwa 1 × 10⁵ bis etwa 1 × 10⁹, vorzugsweise etwa 1 × 10⁶ bis etwa 1 × 10⁸ lebende Bakterien in einem Volumen, das für den ausgewählten Verabreichungsweg geeignet ist. Bevorzugte Verabreichungswege umfassen alle mucosalen Wege und am meisten bevorzugt werden diese Vektoren intranasal oder oral verabreicht.
Attenuierte Stämme von Salmonella typhimurium, die bezüglich einer rekombinanten Expression von heterologen Antigenen genetisch verändert oder nicht verändert sind, und deren Verwendung als orale Impfstoffe sind in Nakayama et al. (Bio/Technology (1988) 6:693) und in der WO 92/11361 beschrieben. Bevorzugte Verabreichungswege umfassen alle mucosalen Wege und am meisten bevorzugt werden diese Vektoren intranasal oder oral verabreicht.
Andere Bakterienstämme, die als Impfvektoren im Zusammenhang mit der Erfindung verabreicht werden, sind bezüglich Shigella flexneri in High et al. (1992) EMBO 11:1991 und Sizemore et al. (1995) Science 270:299, bezüglich Streptococcus gordonii in Medaglini et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6868 und bezüglich Bacillus Calmette-Guérin in Flynn J.L. (1994) Cell. Mol. Biol. 40 (Suppl. I):31, WO 88/06626, WO 90/00594, WO 91/13157, WO 92/01796 und WO 92/21376 beschrieben.
In Bakterienvektoren wird das in der Anmeldung beschriebene Polynukleotid in das Bakteriengenom inseriert oder verbleibt in einem freien Zustand als Teil eines Plasmids.
Die Zusammensetzung, die einen in der Anmeldung beschriebenen Impfstoff-Bakterienvektor umfasst, kann ferner ein Adjuvanz enthalten. Eine Reihe von Adjuvanzien sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte Adjuvanzien werden wie nachstehend beschrieben ausgewählt.
Dementsprechend werden in einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt bereitgestellt: (i) eine Zusammensetzung, die ein in der Anmeldung beschriebenes Polynukleotid zusammen mit einem Verdünnungsmittel oder einem Träger umfasst, (ii) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotids umfasst, (iii) ein Verfahren zur Induktion einer Immunreaktion gegenüber Chlamydia in einem Säuger durch Verabreichung einer immunogen wirksamen Menge eines in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotids, um eine schützende Immunreaktion gegenüber Chlamydia auszulösen, und insbesondere (iv) ein Verfahren zur Vermeidung und/oder Behandlung einer Chlamydia-Infektion (wie C. trachomatis-, C. psittaci-, C. pneumoniae- oder C. pecorum-Infektion) durch Verabreichung einer prophylaktischen oder therapeutischen Menge eines in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotids an ein infiziertes Individuum. Des Weiteren umfasst die Erfindung auch die Verwendung eines in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotids für die Herstellung eines Medikaments zur Vermeidung und/oder Behandlung von Chlamydia-Infektion. Eine bevorzugte Verwendung umfasst die Verwendung eines DNA-Moleküls, das unter Bedingungen für eine Expression in einer Säugerzelle insbesondere in ein Plasmid, das nicht in Säugerzellen replizieren und im Wesentlichen nicht in ein Säugergenom integrieren kann, gebracht wird.
Eine Verwendung der in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotide umfasst deren Verabreichung an einen Säuger als ein Impfstoff für therapeutische oder prophylaktische Zwecke. Solche Polynukleotide werden in Form einer DNA als Teil eines Plasmids verwendet, das nicht in einer Säugerzelle replizieren und nicht in das Säugergenom integrieren kann. Typischerweise wird ein solches DNA-Molekül unter die Kontrolle eines Promotors gebracht, der für eine Expression in einer Säugerzelle geeignet ist. Der Promotor fungiert entweder in einer universellen oder gewebespezifischen Weise. Beispiele für nicht-gewebespezifische Promotoren umfassen den frühen Promotor von Cytomegalovirus (CMV) (beschrieben in der US-PS 4,168,062) und den Promotor von Rous-Sarcom-Virus (beschrieben in Norton & Coffin (1985) Molec. Cell. Biol. 5:281). Ein Beispiel für einen gewebespezifischen Promotor ist der Desmin-Promotor, der eine Expression in Muskelzellen antreibt (Li et al. (1989) Gene 78:243; Li & Paulin (1991) J. Biol. Chem. 266:6562 und Li & Paulin (1993) J. Biol. Chem. 268:10403). Eine Verwendung von Promotoren ist bekannt. Geeignete Vektoren sind in zahlreichen Veröffentlichungen, insbesondere in der WO 94/21797 und in Hartikka et al. (1996) Human Gene Therapy 7:1205, beschrieben.
In der Anmeldung beschriebene Polynukleotide, die als Impfstoffe verwendet werden, kodieren für einen Vorläufer oder eine reife Form des entsprechenden Polypeptids. In der Vorläuferform ist das Signalpeptid entweder homolog oder heterolog. Im letzteren Fall ist eine eukaryontische Leader-Sequenz wie die Leader-Sequenz des Gewebetyp-Plasminogen-Faktors (tPA) bevorzugt.
Wie hier verwendet enthält eine in der Anmeldung beschriebene Zusammensetzung ein oder mehrere Polynukleotide, wobei gegebenenfalls mindestens ein weiteres Polynukleotid für ein anderes Chlamydia-Antigen wie Urease-Untereinheit A, B oder beides oder ein Fragment, Derivat, eine Mutante oder ein Analogon davon kodiert. Die Zusammensetzung kann auch ein weiteres Polynukleotid enthalten, das für ein Cytokin wie Interleukin-2 (IL-2) oder Interleukin-12 (IL-12) kodiert, so dass die Immunreaktion verstärkt wird. Diese weiteren Polynukleotide werden unter die geeignete Kontrolle für eine Expression gestellt. Vorteilhafterweise sind in der Anmeldung beschriebene DNA-Moleküle und/oder weitere DNA-Moleküle, die in die gleiche Zusammensetzung eingebaut werden sollen, in dem gleichen Plasmid vorhanden.
Standard-Techniken der Molekularbiologie für eine Herstellung und Aufreinigung von Polynukleotiden werden zur Herstellung von erfindungsgemäßen Polynukleotid-Therapeutika verwendet. Für eine Verwendung als Impfstoff wird ein in der Anmeldung beschriebenes Polynukleotid gemäß den verschiedenen nachstehend beschriebenen Verfahren formuliert.
Bei einem Verfahren wird das Polynukleotid in nackter Form, frei von jeglichen Zufuhrträgern verwendet. Ein solches Polynukleotid wird einfach in einer physiologisch verträglichen Lösung wie steriler Kochsalzlösung oder steriler gepufferter Kochsalzlösung mit oder ohne einen Träger verdünnt. Wenn vorhanden, ist der Träger vorzugsweise isotonisch, hypotonisch oder schwach hypertonisch und weist eine verhältnismäßig geringe Ionenstärke auf, wie sie durch eine Sucroselösung wie eine Lösung mit 20% Sucrose bereitgestellt wird.
Bei einem alternativen Verfahren wird das Polynukleotid in Verbindung mit Mitteln verwendet, die die zelluläre Aufnahme unterstützen. Beispiele für solche Mittel sind (i) Chemikalien, die zelluläre Permeabilität modifizieren wie Bupivakain (vergleiche z.B. WO 94/16737), (ii) Liposomen für eine Einkapselung des Polynukleotids oder (iii) kationische Lipide oder Silica-, Gold- oder Wolfram-Mikropartikel, die sich mit den Polynukleotiden assoziieren.
Anionische und neutrale Liposomen sind bekannt (vgl. z.B. Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL Press (1990) bezüglich einer detaillierten Beschreibung von Verfahren zur Herstellung von Liposomen) und sind für eine Zufuhr eines großen Bereichs an Produkten, einschließlich Polynukleotiden, verwendbar.
Kationische Lipide sind auch bekannt und werden herkömmlich für eine Zufuhr von Genen verwendet. Solche Lipide umfassen Lipofectin^TM, auch bekannt als DOTMA (N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid), DOTAP (1,2-Bis(oleyloxy)-3-(trimethylammonio)propan), DDAB (Dimethyldioctadecylammoniumbromid), DOGS (Dioctadecylamidologlycylspermin) und Cholesterin-Derivate wie DC-Chol (3-Beta-(N-(N',N'-dimethylaminomethan)carbamoyl)cholesterin). Eine Beschreibung dieser kationischen Lipide findet sich in der EP 187,702 , WO 90/11092, US-PS 5,283,185, WO 91/15501, WO 95/26356 und US-PS 5,527,928. Kationische Lipide für eine Zufuhr von Genen werden vorzugsweise in Verbindung mit einem neutralen Lipid, z.B. DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin) wie beispielsweise in der WO 90/11092 beschrieben, verwendet.
Eine Formulierung mit kationischen Liposomen kann gegebenenfalls andere Transfektions-erleichternde Verbindungen enthalten. Eine Reihe von diesen ist in der WO 93/18759, WO 93/19768, WO 94/25608 und WO 95/02397 beschrieben. Sie umfassen Spermin-Derivate, die für eine Erleichterung des Transports von DNA über die Kernmembran geeignet sind (vergleiche beispielsweise WO 93/18759), und Membran-permeabilisierende Verbindungen wie GALA, Gramicidin S und kationische Gallensäuresalze (vergleiche beispielsweise die WO 93/19768).
Gold- oder Wolfram-Mikropartikel werden für eine Zufuhr von Genen verwendet, wie in der WO 91/00359, WO 93/17706 und in Tang et al. (1992) Nature 356:152 beschrieben. Das Mikropartikel-beschichtete Polynukleotid wird über den intradermalen oder intraepidermalen Weg unter Verwendung einer nadelfreien Injektionsvorrichtung („Genkanone") wie derjenigen, die in den US-PSen 4,945,050 und 5,015,580 und in der WO 94/24263 beschrieben sind, injiziert.
Die Menge der in einem Impfstoff-Empfänger zu verwendenden DNA hängt beispielsweise von der Stärke des in dem DNA-Konstrukt verwendeten Promotors, der Immunogenizität des exprimierten Genprodukts, dem Zustand des für eine Verabreichung vorgesehenen Säugers (z.B. Gewicht, Alter und allgemeiner Gesundheitszustand des Säugers), der Art der Verabreichung und dem Formulierungstyp ab. Im Allgemeinen kann eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Dosis von etwa 1 μg bis etwa 1 mg, vorzugsweise etwa 10 μg bis etwa 800 μg und mehr bevorzugt etwa 25 μg bis etwa 250 μg an menschliche Erwachsene verabreicht werden. Die Verabreichung kann mit einer einzigen Dosis erreicht oder in Intervallen wiederholt werden.
Der Verabreichungsweg ist ein jeglicher herkömmlicher Weg, der im Impfgebiet verwendet wird. Als allgemeiner Leitfaden wird ein in der Anmeldung beschriebenes Polynukleotid über eine mucosale Oberfläche wie eine okulare, intranasale, pulmonale, orale, intestinale, rektale, vaginale und zum Harnweg gehörige Oberfläche oder über einen parenteralen Weg wie einen intravenösen, subkutanen, intraperitonealen, intradermalen, intraepidermalen oder intramuskulären Weg verabreicht. Die Auswahl des Verabreichungswegs hängt von der ausgewählten Formulierung ab. Ein in Verbindung mit Bupivakain formuliertes Polynukleotid wird vorteilhafterweise in den Muskel verabreicht. Falls ein neutrales oder anionisches Liposom oder ein kationisches Lipid wie DOTMA oder DC-Chol verwendet wird, kann die Formulierung vorteilhafterweise durch einen intravenösen, intranasalen (Aerosolisierung), intramuskulären, intradermalen und subkutanen Weg injiziert werden. Ein Polynukleotid in einer nackten Form kann vorteilhafterweise durch den intramuskulären, intradermalen oder subkutanen Weg verabreicht werden.
Obwohl nicht unbedingt erforderlich, kann eine solche Zusammensetzung auch ein Adjuvanz enthalten. Falls dies der Fall ist, ist ein systemisches Adjuvanz, das keine begleitende Verabreichung erfordert, um eine Adjuvanzwirkung aufzuweisen, bevorzugt wie QS21, das in der US-PS 5,057,546 beschrieben ist.
Die in der Anmeldung bereitgestellte Sequenzinformation beschreibt das Entwerfen von spezifischen Nukleotidsonden und Primern, die für diagnostische Zwecke verwendet werden könnten. Dementsprechend beschreibt die Anmeldung eine Nukleotidsonde oder einen Nukleotidprimer mit einer Sequenz, die in einer Sequenz nach einer der SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und 19 vorgefunden wird oder durch die Degeneriertheit des genetischen Codes davon abgeleitet ist.
Der Begriff „Sonde" wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, betrifft DNA- (vorzugsweise einzelsträngig) oder RNA-Moleküle (oder Modifikationen oder Kombinationen davon), die unter stringenten Bedingungen wie vorstehend definiert an Nukleinsäuremoleküle mit einer Sequenz der SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und 19 oder an eine Sequenz, die zu einer Sequenz nach einer der SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und 19 homolog ist, hybridisieren, oder die komplementäre oder Antisense-Sequenz davon. Im Allgemeinen sind Sonden signifikant kürzer als Volllängen-Sequenzen. Solche Sonden enthalten etwa 5 bis etwa 100, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 80 Nukleotide. Insbesondere weisen Sonden Sequenzen auf, die zu mindestens 75%, vorzugsweise mindestens 80% oder 85%, mehr bevorzugt 90% oder 95% zu einem Teil einer Sequenz nach einer der SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und 19 homolog sind, oder die zu solchen Sequenzen komplementär sind. Sonden können modifizierte Basen wie Inosin, Methyl-5-desoxycytidin, Desoxyuridin, Dimethylamino-5-desoxyuridin oder Diamino-2,6-purin enthalten. Zucker- oder Phosphatreste können auch modifiziert oder substituiert werden. Beispielsweise kann ein Desoxyriboserest durch ein Polyamid ersetzt werden (Nielsen et al. (1991) Science 254:1497) und Phosphatreste können durch Estergruppen wie Diphosphat-, Alkyl-, Arylphosphonat- und Phosphorothioatester ersetzt werden. Des Weiteren kann die 2'-Hydroxylgruppe an Ribonukleotiden durch Einbau von Gruppen wie Alkylgruppen modifiziert werden.
Die in der Anmeldung beschriebenen Sonden können in diagnostischen Tests als Abfang- oder Nachweissonden verwendet werden. Solche Abfangsonden werden herkömmlicherweise auf einem Festträger direkt oder indirekt durch kovalente Mittel oder passive Adsorption immobilisiert. Eine Nachweissonde ist mit einem Nachweismarker markiert, der ausgewählt ist aus radioaktiven Isotopen, Enzymen wie Peroxidase, alkalischer Phosphatase und Enzymen, die ein chromogenes, fluorogenes oder lumineszentes Substrat hydrolysieren können, Verbindungen, die chromogen, fluorogen oder lumineszent sind, Nukleotidbase-Analoga und Biotin.
Die in der Anmeldung beschriebenen Sonden können in einer jeglichen herkömmlichen Hybridisierungstechnik wie Dot-Blot (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), Southern-Blot (Southern (1975) J. Mol. Biol. 98:503), Northern-Blot (identisch zu Southern-Blot mit der Ausnahme, dass RNA als ein Ziel verwendet wird) oder der Sandwich-Technik (Dunn et al. (1977) Cell 12:23) verwendet werden. Die letztere Technik umfasst die Verwendung einer spezifischen Abfangsonde und/oder einer spezifischen Nachweissonde mit Nukleotidsequenzen, die sich zumindest teilweise voneinander unterscheiden.
Ein Primer ist eine Sonde mit gewöhnlich etwa 10 bis etwa 40 Nukleotiden, die für die Einleitung einer enzymatischen Polymerisation von DNA in einem Amplifikationsverfahren (wie PCR), einem Elongationsverfahren oder einem reverse Transkription-Verfahren verwendet wird. Primer, die in diagnostischen Verfahren unter Einbeziehung von PCR verwendet werden, werden in an sich bekannter Weise markiert.
Wie hier beschrieben, beschreibt die Anmeldung auch (i) ein Reagenz, das eine in der Anmeldung beschriebene Sonde umfasst, für einen Nachweis und/oder für eine Identifizierung des Vorliegens von Chlamydia in einem biologischen Material, (ii) ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung des Vorliegens von Chlamydia in einem biologischen Material, worin (a) eine Probe von dem biologischen Material gewonnen oder abgeleitet wird, (b) DNA oder RNA aus dem Material extrahiert und denaturiert wird und (c) einer in der Anmeldung beschriebenen Sonde wie einer Abfang-, Nachweissonde oder beidem unter stringenten Hybridisierungsbedingungen ausgesetzt wird, so dass eine Hybridisierung nachgewiesen wird, und (iii) ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung des Vorliegens von Chlamydia in einem biologischen Material, worin (a) eine Probe von dem biologischen Material gewonnen oder abgeleitet wird, (b) DNA davon extrahiert wird, (c) die extrahierte DNA mit mindestens einem und vorzugsweise zwei in der Anmeldung beschriebenen Primern geprimt und durch Polymerasekettenreaktion amplifiziert wird und (d) das amplifizierte DNA-Fragment hergestellt wird.
Es ist offensichtlich, dass die Offenbarung einer Polynukleotid-Sequenz nach einer der SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und 19, der Homologen und Teilsequenzen davon deren Aminosäuresequenzen ermöglichen. Dementsprechend betrifft ein weiterer in der Anmeldung beschriebener Aspekt ein im Wesentlichen aufgereinigtes Polypeptid oder Polypeptid-Derivat mit einer Aminosäuresequenz, die durch ein in der Anmeldung beschriebenes Polynukleotid kodiert wird.
Ein „im Wesentlichen aufgereinigtes Polypeptid" wie hier verwendet ist als ein Polypeptid definiert, das von der Umgebung, in der es natürlicherweise auftritt, abgetrennt ist und/oder das frei von dem Großteil der Polypeptide ist, die in der Umgebung vorliegen, in der es synthetisiert wurde. Beispielsweise ist ein im Wesentlichen aufgereinigtes Polypeptid frei von cytoplasmatischen Polypeptiden. Der Fachmann würde leicht verstehen, dass die in der Anmeldung beschriebenen Polypeptide aus einer natürlichen Quelle, d.h. einem Chlamydia-Stamm, aufgereinigt sein können oder durch rekombinante Mittel produziert sein können.
In Übereinstimmung mit dem vorstehend in der Anmeldung beschriebenen Aspekt sind Polypeptide, Homologe oder Fragmente, die modifiziert oder behandelt sind, um ihre Immunogenizität in dem Zieltier zu verstärken, in dem das Polypeptid, Homolog oder die Fragmente einen Schutz gegenüber Chlamydia verleihen sollen. Solche Modifikationen oder Behandlungen umfassen: Aminosäuresubstitutionen mit einem Aminosäurederivat wie 3-Methylhistidin, 4-Hydroxyprolin, 5-Hydroxylysin usw., Modifikationen oder Deletionen, die nach Herstellung des Polypeptids, Homologs oder Fragments erfolgen, wie die Modifizierung von freien Amino-, Carboxyl- oder Hydroxylseitengruppen der Aminosäuren.
Eine Identifizierung von durch in der Anmeldung beschriebene Polynukleotide kodierten homologen Polypeptiden oder Polypeptid-Derivaten, die eine spezifische Antigenizität aufweisen, wird durch Screenen auf Kreuzreaktivität mit einem Antiserum erreicht, das gegen das Referenz-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz nach einer der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 erzeugt wurde. Das Verfahren ist wie folgt: ein monospezifisches Hyperimmun-Antiserum wird gegen ein aufgereinigtes Referenz-Polypeptid, ein Fusionspolypeptid (beispielsweise ein Expressionsprodukt von MBP, GST oder His-tag-Systemen, wobei die Beschreibung und Anleitungen für eine Verwendung derselben in den Produkthandbüchern von Invitrogen für pcDNA3.1/Myc-His(+) A, B und C und für die Xpress^TM-System-Proteinaufreinigung enthalten sind) oder ein synthetisches Peptid, das nach Vorhersage antigen ist, erzeugt. Bei einer Erzeugung eines Antiserums gegen ein Fusionspolypeptid werden zwei unterschiedliche Fusionssysteme eingesetzt. Spezifische Antigenizität kann gemäß einer Reihe von Verfahren, einschließlich Western-Blot (Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350), Dot-Blot und ELISA wie nachstehend beschrieben bestimmt werden.
Beim Western-Blot-Test wird das zu screenende Produkt entweder als eine aufgereinigte Zubereitung oder ein Gesamt-E. coli-Extrakt einer SDS-Page-Elektrophorese wie von Laemmli (Nature (1970) 227:680) beschrieben unterzogen. Nach Übertragung auf eine Nitrocellulosemembran wird das Material weiter mit dem monospezifischen Hyperimmun-Antiserum inkubiert, das auf etwa 1:5 bis etwa 1:5000, vor zugsweise etwa 1:100 bis etwa 1:500 verdünnt wurde. Spezifische Antigenizität wird festgestellt, sobald eine Bande, die dem Produkt entspricht, eine Reaktivität bei einer jeglichen der Verdünnungen in dem vorstehenden Bereich aufweist.
In einem ELISA-Test wird das zu screenende Produkt vorzugsweise als das Beschichtungsantigen verwendet. Eine aufgereinigte Zubereitung ist bevorzugt, obwohl ein Gesamtzellextrakt auch verwendet werden kann. Zusammengefasst werden etwa 100 μl einer Zubereitung bei etwa 10 μg Protein/ml in Wells einer 96 Well-Polycarbonat-ELISA-Platte verteilt. Die Platte wird zwei Stunden bei 37°C und sodann über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platte wird mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,05% Tween 20 (PBS/Tween-Puffer) gewaschen. Die Wells werden mit 250 μl PBS mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) abgesättigt, um nicht-spezifische Antikörperbindung zu verhindern. Nach einer Stunde Inkubation bei 37°C wird die Platte mit PBS/Tween-Puffer gewaschen. Das Antiserum wird seriell in PBS/Tween-Puffer mit 0,5% BSA verdünnt. 100 μl der Verdünnungen werden zu jedem Well gegeben. Die Platte wird 90 Minuten bei 37°C inkubiert, gewaschen und gemäß Standardverfahren ausgewertet. Beispielsweise wird ein Anti-Kaninchen-Peroxidase-Konjugat aus Ziege zu den Wells gegeben, falls spezifische Antikörper in Kaninchen erzeugt wurden. Eine Inkubation erfolgt für 90 Minuten bei 37°C und die Platte wird gewaschen. Die Reaktion wird mit dem geeigneten Substrat entwickelt und die Reaktion durch Kalorimetrie gemessen (Absorption wird spektrophotometrisch gemessen). Unter den vorstehenden experimentellen Bedingungen wird eine positive Reaktion durch O.D.-Werte von mehr als bei einem Nicht-Immun-Kontrollserum angezeigt.
In einem Dot-Blot-Test ist ein aufgereinigtes Produkt bevorzugt, obwohl ein Gesamt-Zellextrakt auch verwendet werden kann. Zusammengefasst wird eine Lösung des Produkts bei etwa 100 μg/ml seriell zweifach in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) verdünnt. 100 μl einer jeden Verdünnung werden auf eine Nitrocellulosemembran mit 0,45 μm gegeben, die in einer 96-Well-Dot-Blot-Vorrichtung (Biorad) platziert wurde. Der Puffer wird durch Anlegen von Vakuum an das System entfernt. Die Wells werden durch Zugabe von 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) gewaschen und die Membran wird an der Luft getrocknet. Die Membran wird mit Blockierungspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl, 10 g/l entrahmte Milch) abgesättigt und mit einer Antiserum-Verdünnung von etwa 1:50 bis etwa 1:5000, vorzugsweise etwa 1:500 inkubiert. Die Reaktion wird gemäß Standardverfahren angezeigt. Beispielsweise wird ein Anti-Kaninchen-Peroxidase-Konjugat aus Ziege zu den Wells gegeben, falls Kaninchen-Antikörper verwendet werden. Eine Inkubation erfolgt für 90 Minuten bei 37°C und der Blot wird gewaschen. Die Reaktion wird mit dem geeigneten Substrat entwickelt und abgestoppt. Die Reaktion wird visuell durch das Auftreten eines gefärbten Punktes, z.B. durch Kalorimetrie, gemessen. Unter den vorstehenden experimentellen Bedingungen wird eine positive Reaktion angezeigt, sobald ein gefärbter Punkt mit einer Verdünnung von mindestens etwa 1:5, vorzugsweise mindestens etwa 1:500 assoziiert ist.
Therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit eines in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids oder Derivats kann wie nachstehend beschrieben bewertet werden. In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird bereitgestellt: (i) eine Zusammensetzung, die ein in der Anmeldung beschriebenes Polypeptid zusammen mit einem Verdünnungsmittel oder Träger umfasst, insbesondere (ii) eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge eines in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids, (iii) ein Verfahren zur Induktion einer Immunreaktion gegenüber Chlamydia bei einem Säuger durch Verabreichung an den Säuger einer immunogen wirksamen Menge eines in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids, um eine schützende Immunreaktion gegenüber Chlamydia auszulösen, und insbesondere (iv) ein Verfahren zur Vermeidung und/oder Behandlung einer Chlamydia-Infektion (wie C. trachomatis-, C. psittaci-, C. pneumoniae- oder C. pecorum-Infektion) durch Verabreichung einer prophylaktischen oder therapeutischen Menge eines in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids an ein infiziertes Individuum. Des Weiteren umfasst der vorstehende erfindungsgemäße Aspekt die Verwendung eines in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Vermeidung und/oder Behandlung von Chlamydia-Infektion.
Wie hier verwendet, werden die in der Anmeldung beschriebenen immunogenen Zusammensetzungen in herkömmlicherweise wie es im Impfstoffgebiet bekannt ist, insbesondere an eine mucosale (wie okulare, intranasale, pulmonale, orale, gastrische, intestinale, rektale, vaginale oder zum Harnweg gehörende) Oberfläche oder über den parenteralen (wie subkutanen, intradermalen, intramuskulären, intravenösen oder intraperitonealen) Weg verabreicht. Die Wahl des Verabreichungswegs hängt von einer Reihe von Parametern wie dem mit dem Polypeptid assoziierten Adjuvanz ab. Falls ein mucosales Adjuvanz verwendet wird, ist der intranasale oder orale Weg bevorzugt. Falls eine Lipidformulierung oder eine Aluminiumverbindung verwendet wird, ist der parenterale Weg bevorzugt, wobei der subkutane oder intra muskuläre Weg am meisten bevorzugt ist. Die Wahl hängt auch von der Art des Impfstoffs ab. Beispielsweise wird ein in der Anmeldung beschriebenes Polypeptid, das an CTB oder LTB fusioniert ist, am besten an eine mucosale Oberfläche verabreicht.
Wie hier verwendet, enthält die in der Anmeldung beschriebene Zusammensetzung ein oder mehrere in der Anmeldung beschriebene Polypeptide oder Derivate. Die Zusammensetzung enthält gegebenenfalls mindestens ein weiteres Chlamydia-Antigen oder eine Untereinheit, ein Fragment, ein Homolog, eine Mutante oder ein Derivat davon.
Für eine Verwendung in einer in der Anmeldung beschriebenen Zusammensetzung wird ein Polypeptid oder Derivat davon in oder mit Liposomen, vorzugsweise neutrale oder anionische Liposomen, Mikrosphären, ISCOMS oder Virus-ähnliche-Partikel (VLP) formuliert, um eine Zufuhr zu erleichtern und/oder die Immunreaktion zu verstärken. Diese Verbindungen sind leicht für den Fachmann verfügbar; vgl. z.B. Liposomes: A Practical Approach, RCP New Ed, IRL Press (1990).
Von Liposomen verschiedene Adjuvanzien und dergleichen werden auch verwendet und sind bekannt. Adjuvanzien können das Antigen vor einer schnellen Zerstreuung durch dessen Abtrennung in ein lokales Depot schützen oder sie können Substanzen enthalten, die den Wirt stimulieren, Faktoren zu sekretieren, die für Makrophagen und andere Komponenten des Immunsystems chemotaktisch wirken. Eine geeignete Auswahl kann herkömmlicherweise durch den Fachmann beispielsweise aus den nachstehend beschriebenen Stoffen (unter einem weiteren in der Anmeldung beschriebenen Aspekt) erfolgen.
Eine Behandlung wird mit einer einzigen Dosis erreicht oder wie notwendig in Intervallen wiederholt, was einfach durch den Fachmann bestimmt werden kann. Beispielsweise wird eine Grunddosis durch drei Verstärkungsdosen bei wöchentlichen oder monatlichen Intervallen gefolgt. Eine geeignete Dosis hängt von verschiedenen Parametern ab, einschließlich des Empfängers (z.B. Erwachsener oder Kind), des spezifischen Impfstoff-Antigens, des Weges und der Häufigkeit einer Verabreichung, des Vorhandenseins/Fehlens oder des Typs von Adjuvanz und der gewünschten Wirkung (z.B. Schutz und/oder Behandlung), wie es durch den Fachmann bestimmt werden kann. Im Allgemeinen wird ein in der Anmeldung beschriebenes Impfstoff-Antigen über einen mucosalen Weg in einer Menge von etwa 10 μg bis et wa 500 mg, vorzugsweise etwa 1 mg bis etwa 200 mg verabreicht. Im Fall des parenteralen Wegs einer Verabreichung überschreitet die Dosis gewöhnlich nicht etwa 1 mg, vorzugsweise etwa 100 μg.
Bei einer Verwendung als Impfstoffe können in der Anmeldung beschriebene Polynukleotide und Polypeptide sequenziell als Teil eines Mehrschritt-Immunisierungsverfahrens verwendet werden. Beispielsweise findet ein Priming bei einem Säuger anfänglich mit einem in der Anmeldung beschriebenen Impfvektor wie einem Poxvirus beispielsweise über den parenteralen Weg statt und es erfolgt sodann beispielsweise über den mucosalen Weg ein zweifaches Boosten mit dem durch den Impfvektor kodierten Polypeptid. In einem weiteren Beispiel werden ebenfalls Liposomen, die mit einem in der Anmeldung beschriebenen Polypeptid oder Derivat assoziiert sind, für ein Priming verwendet, wobei das Boosten mucosal unter Verwendung eines in der Anmeldung beschriebenen löslichen Polypeptids oder Derivats in Kombination mit einem mucosalen Adjuvanz (z.B. LT) erfolgt.
Ein in der Anmeldung beschriebenes Polypeptid-Derivat wird auch gemäß dem vorstehend beschriebenen Aspekt als ein diagnostisches Reagenz für einen Nachweis des Vorliegens von Anti-Chlamydia-Antikörpern beispielsweise in einer Blutprobe verwendet. Solche Polypeptide sind etwa 5 bis etwa 80, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 50 Aminosäuren lang. Sie sind entweder markiert oder nicht-markiert, abhängig von dem diagnostischen Verfahren. Diagnostische Verfahren, die ein solches Reagenz einbeziehen, sind nachstehend beschrieben.
Bei Expression eines in der Anmeldung beschriebenen DNA-Moleküls wird ein Polypeptid oder Polypeptid-Derivat produziert und unter Verwendung bekannter Labortechniken aufgereinigt. Wie vorstehend beschrieben kann das Polypeptid oder Polypeptid-Derivat als ein Fusionsprotein mit einem fusionierten Schwanz produziert werden, der eine Aufreinigung erleichtert. Das Fusionsprodukt wird für eine Immunisierung eines kleinen Säugers wie eine Maus oder ein Kaninchen verwendet, um Antikörper gegen das Polypeptid oder Polypeptid-Derivat (monospezifische Antikörper) zu erzeugen. Dementsprechend wird in einem weiteren in der Anmeldung beschriebenen Aspekt ein monospezifischer Antikörper bereitgestellt, der an ein in der Anmeldung beschriebenes Polypeptid oder Polypeptid-Derivat bindet.
„Monospezifischer Antikörper" betrifft einen Antikörper, der mit einem einzigartigen natürlich auftretenden Chlamydia-Polypeptid reagieren kann. Ein in der Anmel dung beschriebener Antikörper ist entweder polyklonal oder monoklonal. Monospezifische Antikörper können rekombinant, z.B. chimär (z.B. aus einer variablen Region murinen Ursprungs in Assoziierung mit einer konstanten Region aus Mensch aufgebaut), humanisiert (ein konstantes Rückgrat aus menschlichem Immunglobulin zusammen mit einer hypervariablen Region tierischen Ursprungs, z.B. murinen Ursprungs) und/oder einzelkettig sein. Sowohl polyklonale, als auch monospezifische Antikörper können auch in Form von Immunglobulinfragmenten wie F(ab)'2- oder Fab-Fragmenten vorliegen. Die in der Anmeldung beschriebenen Antikörper gehören einem jeglichen Isotyp wie IgG oder IgA an und polyklonale Antikörper gehören einem einzigen Isotyp oder einem Gemisch von Isotypen an.
Antikörper gegen die in der Anmeldung beschriebenen Polypeptide, Homologe oder Fragmente werden durch Immunisieren eines Säugers mit einer Zusammensetzung, die das Polypeptid, Homolog oder Fragment umfasst, erzeugt. Solche Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Verfahren zur Herstellung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sind bekannt. Bezüglich einer Übersicht wird auf „Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg. E. Harlow und D. Lane (1988) und D.E. Yelton et al. (1981) Ann. Rev. Biochem. 50:657–680 verwiesen. Bezüglich monoklonaler Antikörper wird auf Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495–497 verwiesen.
Die in der Anmeldung beschriebenen Antikörper, die gegen in der Anmeldung beschriebene Polypeptide oder Polypeptid-Derivate erzeugt werden, werden unter Verwendung von Standard-immunologischen Tests produziert und identifiziert, wie Western-Blot-Analyse, Dot-Blot-Test oder ELISA (vgl. z.B. Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Die Antikörper werden in diagnostischen Verfahren eingesetzt, um das Vorliegen eines Chlamydia-Antigens in einer Probe wie einer biologischen Probe nachzuweisen. Die Antikörper werden auch in der Affinitätschromatgraphie für eine Aufreinigung eines in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids oder Polypeptid-Derivats verwendet. Wie nachstehend weiter erörtert, können solche Antikörper in prophylaktischen und therapeutischen Verfahren einer passiven Immunisierung verwendet werden.
Dementsprechend wird in einem weiteren in der Anmeldung beschriebenen Aspekt (i) ein Reagenz zum Nachweis des Auftretens von Chlamydia in einer biologischen Probe, das einen Antikörper, ein Polypeptid oder ein Polypeptid-Derivat wie in der Anmeldung beschrieben enthält, und (ii) ein diagnostisches Verfahren zum Nach weis des Auftretens von Chlamydia in einer biologischen Probe durch In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einem Antikörper, einem Polypeptid oder einem Polypeptid-Derivat wie in der Anmeldung beschrieben, so dass ein Immunkomplex gebildet wird, und durch Nachweis eines solchen Komplexes, um das Auftreten von Chlamydia in der Probe oder dem Organismus, von dem die Probe abgeleitet ist, anzuzeigen, bereitgestellt.
Der Fachmann wird leicht verstehen, dass der Immunkomplex zwischen einer Komponente der Probe und dem Antikörper, Polypeptid oder Polypeptid-Derivat, was auch immer verwendet wird, gebildet wird und dass ein jegliches nicht-gebundenes Material vor einem Nachweis des Komplexes entfernt wird. Man wird verstehen, dass ein Polypeptid-Reagenz für einen Nachweis des Auftretens von Anti-Chlamydia-Antikörpern in einer Probe wie einer Blutprobe verwendbar ist, während ein in der Anmeldung beschriebener Antikörper für ein Screening einer Probe wie Magensaft oder Biopsiematerial bezüglich des Vorliegens von Chlamydia-Polypeptiden verwendet wird.
Bezüglich diagnostischer Anwendungen liegt das Reagenz (d.h. der Antikörper, das Polypeptid oder das Polypeptid-Derivat wie in der Anmeldung beschrieben) in einem freien Zustand oder an einen Festträger wie einer Röhre, einem Partikel oder einem jeglichen anderen herkömmlichen Träger, der in diesem Gebiet verwendet wird, immobilisiert vor. Eine Immobilisierung wird unter Verwendung direkter oder indirekter Mittel erreicht. Direkte Mittel umfassen passive Adsorption (nicht-kovalente Bindung) oder kovalente Bindung zwischen dem Träger und dem Reagenz. „Indirekte Mittel" meint, dass eine Anti-Reagenz-Verbindung, die mit einem Reagenz wechselwirkt, zuerst an den Festträger gebunden wird. Beispielsweise kann, falls ein Polypeptid-Reagenz verwendet wird, ein Antikörper, der daran bindet, als ein Anti-Reagenz dienen, mit der Maßgabe, dass er an ein Epitop bindet, das nicht an der Erkennung von Antikörpern in biologischen Proben beteiligt ist. Indirekte Mittel können auch ein Ligand-Rezeptor-System beteiligen, beispielsweise falls ein Molekül wie ein Vitamin auf das Polypeptid-Reagenz gepfropft wird und der entsprechende Rezeptor auf der Festphase immobilisiert wird. Dies wird durch das Biotin-Streptavidin-System veranschaulicht. Alternativ wird ein Peptidschwanz chemisch oder durch genetische Veränderung an das Reagenz angefügt und das gepfropfte oder fusionierte Produkt durch passive Adsorption oder kovalente Bindung des Peptidschwanzes immobilisiert.
Solche diagnostischen Mittel können in einen Kit eingebaut werden, der auch Anleitungen für eine Verwendung umfasst. Das Reagenz wird mit einem Nachweismittel markiert, das es ermöglicht, das Reagenz bei einer Bindung an sein Ziel nachzuweisen. Das Nachweismittel kann ein fluoreszierendes Mittel wie Fluoresceinisocyanat oder Fluoresceinisothiocyanat oder ein Enzym wie Meerrettichperoxidase oder Luciferase oder alkalische Phosphatase oder ein radioaktives Element wie ¹²⁵I oder ⁵¹Cr sein.
Dementsprechend betrifft ein weiterer in der Anmeldung beschriebener Aspekt ein Verfahren zur Aufreinigung eines in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids oder Polypeptid-Derivats aus einer biologischen Probe, das ein Durchführen einer Antikörper-basierenden Affinitätschromatographie mit der biologischen Probe umfasst, wobei der Antikörper ein in der Anmeldung beschriebener monospezifischer Antikörper ist.
Für eine Verwendung in einem in der Anmeldung beschriebenen Aufreinigungsverfahren ist der Antikörper entweder polyklonal oder monospezifisch und gehört vorzugsweise dem IgG-Typ an. Aufgereinigte IgGs werden aus einem Antiserum in an sich bekannter Weise hergestellt (vgl. z.B. Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Herkömmliche Chromatographieträger, sowie Standardverfahren zur Pfropfung von Antikörpern sind beispielsweise in Antibodies: A Laboratory Manual, D. Lane, E. Harlow, Hrsg. (1988) beschrieben und nachstehend dargelegt.
Zusammengefasst wird eine biologische Probe wie ein C. pneumoniae-Extrakt vorzugsweise in einer Pufferlösung auf ein Chromatographiematerial, das vorzugsweise mit dem Puffer äquilibriert ist, der für eine Verdünnung der biologischen Probe verwendet wird, aufgetragen, so dass das in der Anmeldung beschriebene Polypeptid oder Polypeptid-Derivat (d.h. das Antigen) an das Material adsorbiert. Das Chromatographiematerial wie ein an einen in der Anmeldung beschriebenen Antikörper gekoppeltes Gel oder Harz liegt entweder im Gemenge oder in einer Säule vor. Die nicht-gebundenen Komponenten werden weggewaschen und das Antigen sodann mit einem geeigneten Elutionspuffer wie Glycinpuffer oder einem Puffer mit einem chaotropen Mittel wie Guanidin-HCl oder Hochsalz-Konzentration (wie 3 M MgCl₂) eluiert. Eluierte Fraktionen werden gewonnen und das Vorliegen des Antigens beispielsweise durch Messung der Absorption bei 280 nm nachgewiesen.
In einem weiteren in der Anmeldung beschriebenen Aspekt wird bereitgestellt: (i) eine Zusammensetzung, die einen in der Anmeldung beschriebenen monospezifischen Antikörper zusammen mit einem Verdünnungsmittel oder Träger umfasst, (ii) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines in der Anmeldung beschriebenen monospezifischen Antikörpers umfasst und (iii) ein Verfahren zur Behandlung oder Vermeidung einer Chlamydia-Infektion (wie C. trachomatis-, C. psittaci-, C. pneumoniae- oder C. pecorum-Infektion) durch Verabreichung einer therapeutischen oder prophylaktischen Menge eines in der Anmeldung beschriebenen monospezifischen Antikörpers an ein infiziertes Individuum. Des Weiteren umfasst der vorstehend beschriebene Aspekt der Anmeldung die Verwendung eines in der Anmeldung beschriebenen monospezifischen Antikörpers für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vermeidung von Chlamydia-Infektion.
Der monospezifische Antikörper ist entweder polyklonal oder monoklonal und gehört vorzugsweise dem IgA-Isotyp (vorherrschend) an. Bei einer passiven Immunisierung wird der Antikörper an eine Mucosaoberfläche eines Säugers wie Magenmucosa z.B. oral oder intragastrisch, vorteilhafterweise bei Gegenwart eines Bicarbonatpuffers verabreicht. Alternativ erfolgt eine systemische Verabreichung, die keinen Bicarbonatpuffer erfordert. Ein in der Anmeldung beschriebener monospezifischer Antikörper wird als eine einzelne aktive Komponente oder als ein Gemisch mit mindestens einem monospezifischen Antikörper, der für ein anderes Chlamydia-Polypeptid spezifisch ist, verabreicht. Die Menge an Antikörper und das spezifische verwendete Verabreichungsschema werden leicht durch den Fachmann bestimmt. Beispielsweise sind eine tägliche Verabreichung von etwa 100 bis 1000 mg Antikörpern über eine Woche oder eine Verabreichung von drei Dosen pro Tag von etwa 100 bis 1000 mg Antikörpern über zwei oder drei Tage wirksame Verabreichungsschemata für die meisten Zwecke.
Eine therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit wird unter Verwendung von Standardverfahren, beispielsweise durch Messung der Induktion einer mucosalen Immunreaktion oder der Induktion einer schützenden und/oder therapeutischen Immunität unter Verwendung von beispielsweise dem C. pneumoniae-Mausmodell bewertet. Der Fachmann wird leicht erkennen, dass der C. pneumoniae-Stamm des Modells durch einen anderen Chlamydia-Stamm ersetzt werden kann. Beispielsweise wird die Wirksamkeit von DNA-Molekülen und Polypeptiden aus C. pneumoniae vorzugsweise in einem Mausmodell unter Verwendung des C. pneumoniae-Stamms bewertet. Ein Schutz wird durch Vergleich des Grades einer Chlamydia-Infektion mit dem einer Kontrollgruppe bestimmt. Ein Schutz wird angezeigt, wenn eine Infektion im Vergleich mit der Kontrollgruppe verringert ist. Eine solche Bewertung erfolgt für in der Anmeldung beschriebene Polynukleotide, Impfvektoren, Polypeptide und Derivate davon, sowie Antikörper.
Adjuvanzien, die in einer jeglichen der vorstehend beschriebenen Impfzusammensetzungen verwendbar sind, sind wie folgt.
Adjuvanzien für eine parenterale Verabreichung umfassen Aluminiumverbindungen wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Aluminiumhydroxyphosphat. Das Antigen wird in an sich bekannter Weise mit der Aluminiumverbindung ausgefällt oder darauf adsorbiert. Andere Adjuvanzien wie RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT) werden bei einer parenteralen Verabreichung verwendet.
Adjuvanzien für eine mucosale Verabreichung umfassen bakterielle Toxine wie Choleratoxin (CT), das hitzelabile Toxin aus E. coli (LT), das Toxin A aus Clostridium difficile und das Pertussis-Toxin (PT) oder Kombinationen, Untereinheiten, Toxoide oder Mutanten davon wie eine aufgereinigte Zubereitung von nativer Cholera-Toxin-Untereinheit B (CTB). Fragmente, Homologe, Derivate und Fusionen eines jeglichen dieser Toxine sind auch geeignet, mit der Maßgabe, dass sie die Aktivität als Adjuvanz beibehalten. Vorzugsweise wird eine Mutante mit verringerter Toxizität verwendet. Geeignete Mutanten sind beispielsweise in der WO 95/17211 (Arg-7-Lys-CT-Mutante), der WO 96/06627 (Arg-192-Gly-LT-Mutante) und der WO 95/34323 (Arg-9-Lys- und Glu-129-Gly-PT-Mutante) beschrieben. Weitere LT-Mutanten, die in den Verfahren und Zusammensetzungen, die in der Anmeldung beschrieben sind, verwendet werden, umfassen beispielsweise Ser-63-Lys-, Ala-69-Gly-, Glu-110-Asp- und Glu-112-Asp-Mutanten. Andere Adjuvanzien wie bakterielles Monophosphoryl-Lipid A (MPLA) von beispielsweise E. coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium oder Shigella flexneri, Saponine oder Polylactidglycolid (PLGA)-Mikrosphären werden auch bei einer mucosalen Verabreichung verwendet.
Adjuvanzien, die für sowohl eine mucosale als auch eine parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen Polyphosphazen (WO 95/02415), DC-chol (3 b-(N-(N',N'-Dimethylaminomethan)carbamoyl)cholesterin; US-PS 5,283,185 und WO 96/14831) und QS-21 (WO 88/09336).
Eine jegliche erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polynukleotid, Polypeptid, Polypeptid-Derivat oder einen Antikörper wie in der Anmeldung beschrieben enthält, wird in herkömmlicher Weise hergestellt. Insbesondere wird sie mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Träger wie Wasser oder einer Kochsalzlösung wie Phosphatpuffer-Kochsalzlösung formuliert. Im Allgemeinen wird ein Verdünnungsmittel oder Träger auf der Basis der Verabreichungsart und des Verabreichungswegs und auf der Basis der pharmazeutischen Standardpraxis ausgewählt. Geeignete pharmazeutische Träger oder Verdünnungsmittel, sowie pharmazeutische Notwendigkeiten für deren Verwendung bei pharmazeutischen Formulierungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, eine Standard-Referenz auf diesem Gebiet, und in USP/NF beschrieben.
Die Erfindung umfasst auch Verfahren, bei denen eine Chlamydia-Infektion durch orale Verabreichung eines in der Anmeldung beschriebenen Chlamydia-Polypeptids und eines mucosalen Adjuvanz in Verbindung mit einem Antibiotikum, einem gegen Magensäure wirkenden Mittel, Sucralfat oder einer Kombination davon behandelt wird. Beispiele für solche Verbindungen, die zusammen mit dem Impfantigen und dem Adjuvanz verabreicht werden können, sind Antibiotika, einschließlich Makrolide, Tetracycline und Derivate davon (spezifische Beispiele für Antibiotika, die verwendet werden können, umfassen Azithromycin oder Doxicyclin oder Immunmodulatoren wie Cytokine oder Steroide). Des Weiteren werden Verbindungen, die mehr als eine der vorstehend beschriebenen Komponenten in Kopplung aneinander enthalten, verwendet. Die Anmeldung beschreibt auch Zusammensetzungen für eine Durchführung dieser Verfahren, d.h. Zusammensetzungen mit einem Chlamydia-Antigen (oder Antigenen) wie in der Anmeldung beschrieben, einem Adjuvanz und einer oder mehreren der vorstehend beschriebenen Verbindungen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Es wurde kürzlich gezeigt, dass das 60 kDa Cystein-reiche Membranprotein eine Sequenz enthält, die mit dem murinen alpha-Myosin-schwere Kette-Epitop M7A-alpha, einem Epitop, das bei Menschen konserviert ist, kreuzreagiert (Bachmaier et al. (1999) Science 283:1335). Es wurde vorgeschlagen, dass diese Kreuzreaktivität Anteil an der Entwicklung kardiovaskulärer Erkrankungen hat, so dass es günstig sein kann, dieses Epitop und jegliche andere Epitope, die mit menschlichen Antigenen kreuzreagieren, aus dem Protein zu entfernen, falls es als Impfstoff verwendet werden soll. Dementsprechend umfasst ein weiterer in der Anmeldung beschriebener Aspekt die Modifizierung der kodierenden Sequenz beispielsweise durch Dele tion oder Substitution der Nukleotide, die für das Epitop kodieren, in Polynukleotiden, die für das Protein kodieren, um so die Wirksamkeit und Sicherheit des Proteins als Impfstoff zu verbessern. Ein ähnlicher Ansatz kann für ein jegliches schützendes Antigen günstig sein, von dem festgestellt wurde, dass es unerwünschte Homologien oder Kreuzreaktivitäten mit menschlichen Antigenen aufweist.
Die Mengen der vorstehend beschriebenen Verbindungen, die in den in der Anmeldung beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden, werden leicht durch den Fachmann bestimmt. Behandlungs-/Immunisierungsschemata sind auch bekannt und werden leicht durch den Fachmann entworfen. Beispielsweise können die Nicht-Impfstoff-Komponenten an den Tagen 1–14 verabreicht werden und das Impfantigen und das Adjuvanz können an den Tagen 7, 14, 21 und 28 verabreicht werden.
BEISPIELE
Die vorstehende Offenbarung beschreibt allgemein die Erfindung. Ein vollständigeres Verständnis kann durch Bezugnahme auf die nachstehenden spezifischen Beispiele und insbesondere auf Beispiele, die das Plasmid pCACPNM459 betreffen, erhalten werden. Diese Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sind nicht begrenzend zu verstehen.
Beispiel 1:
Diese Beispiele zeigen die Herstellung von Plasmidvektoren, die bei Immunprotektionsuntersuchungen verwendet werden.
A. Herstellung des Plasmidvektors pCACPNM213
Das Gen für die ATP-Bindekassette wurde anhand genomischer DNA von Chlamydia pneumoniae, Stamm CWLO29, durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines 5'-Primers (5' ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGAAGATGCATAGGCTTAAACC 3'; SEQ ID NO: 21) und eines 3'-Primers (5' GCGCCGGATCCCACTTAAGATATCGATATTTTTGAG 3'; SEQ ID NO: 22) amplifiziert. Der 5'-Primer enthält eine NotI-Restriktionsstelle, eine Ribosomen-Bindestelle, ein Initiationscodon und eine Sequenz am 5'-Ende der für das ATP-Bin dekassetten-Protein kodierenden Sequenz. Der 3'-Primer enthält die Sequenz, die für die C-terminale Sequenz des ATP-Bindekassetten-Proteins kodiert, und eine BamHI-Restriktionsstelle. Das Stoppcodon wurde ausgeschlossen und ein weiteres Nukleotid inseriert, um eine In-Frame-Fusion mit dem Histidin-Tag zu erhalten.
Nach einer Amplifikation wurde das PCR-Fragment unter Verwendung des QIAquick^TM PCR-Aufreinigungskits (Qiagen) aufgereinigt, mit NotI und BamHI gespalten und in den in Beispiel 2 (21) beschriebenen eukaryontischen Expressionsvektor pCA-Myc-His kloniert, wobei die Transkription unter Kontrolle des humanen CMV-Promoters steht.
B. Herstellung des Plasmidvektors pCACPNM882
Das Gen für den sekretorischer Lokus-ORF wurde anhand von genomischer DNA von Chlamydia pneumoniae, Stamm CWLO29, durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines 5'-Primers 5' ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGCGGTTGGGAAATAAGCCTATGC 3'; SEQ ID NO: 23) und eines 3'-Primers (5' GCGCCGGTACCGTAATTTAATACTCTTTGAAGGGC 3'; SEQ ID NO: 24) amplifiziert. Der 5'-Primer enthält eine NotI-Restriktionsstelle, eine Ribosomen-Bindestelle, ein Initiationscodon und eine Sequenz am 5'-Ende der sekretorischer Lokus-ORF-kodierenden Sequenz. Der 3'-Primer enthält die Sequenz, die für die C-terminale Sequenz des sekretorischer Lokus-ORF-Proteins kodiert, und eine KpnI-Restriktionsstelle. Das Stoppcodon wurde ausgeschlossen und ein weiteres Nukleotid inseriert, um eine In-Frame-Fusion mit dem Histidin-Tag zu erhalten.
Nach einer Amplifikation wurde das PCR-Fragment unter Verwendung des QIAquick^TM-PCR-Aufreinigungskits (Qiagen) aufgereinigt, mit NotI und KpnI gespalten und in den in Beispiel 2 (22) beschriebenen eukaryontischen Expressionsvektor pCA-Myc-His kloniert, wobei die Transkription unter Kontrolle des humanen CMV-Promotors steht.
C. Herstellung des Plasmidvektors pCACPNM208
Das Endopeptidase-Gen wurde anhand von genomischer DNA aus Chlamydia pneumoniae, Stamm CWLO29, durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines 5'-Primers (5' ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGCTCACCCTAGGCTTGGAAAGTTCTTG 3'; SEQ ID NO: 25) und eines 3'-Primers (5' GCTTTGGAGGATCCCCGGAGAGGCTAAGGAGAATGG 3'; SEQ ID NO: 26) amplifiziert. Der 5'-Primer enthält eine NotI-Restriktionsstelle, eine Ribosomen-Bindestelle, ein Initiationscodon und eine Sequenz am 5'-Ende der für das Endopeptidase-Protein kodierenden Sequenz. Der 3'-Primer enthält die Sequenz, die für die C-terminale Sequenz des Endopeptidase-Proteins kodiert, und eine BamHI-Restriktionsstelle. Das Stoppcodon wurde ausgeschlossen und ein weiteres Nukleotid inseriert, um eine In-Frame-Fusion mit dem Histidin-Tag zu erhalten.
Nach einer Amplifikation wurde das PCR-Fragment unter Verwendung des QIAquick^TM-PCR-Aufreinigungskits (Qiagen) aufgereinigt, mit NotI und BamHI gespalten und in den in Beispiel 2 (23) beschriebenen eukaryontischen Expressionsvektor pCA-Myc-His kloniert, wobei die Transkription unter Kontrolle des humanen CMV-Promoters steht.
D. Herstellung des Plasmidvektors pCACPNM1096
Das Protease-Gen wurde anhand genomischer DNA von Chlamydia pneumoniae, Stamm CWLO29, durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines 5'-Primers (5' ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGAAAAAAGGGAAATTAGGAGCC 3'; SEQ ID NO: 27) und eines 3'-Primers (5' GCGCCGGATCCCCGAAGCAGAAGTCGTTGTGGG 3'; SEQ ID NO: 28) amplifiziert. Der 5'-Primer enthält eine NotI-Restriktionsstelle, eine Ribosomen-Bindestelle, ein Initiationscodon und eine Sequenz am 5'-Ende der für das Protease-Protein kodierenden Sequenz. Der 3'-Primer enthält die Sequenz, die für die C-terminale Sequenz des Protease-Proteins kodiert, und eine BamHI-Restriktionsstelle. Das Stoppcodon wurde ausgeschlossen und ein weiteres Nukleotid inseriert, um eine In-Frame-Fusion mit dem Histidin-Tag zu erhalten.
Nach einer Amplifikation wurde das PCR-Fragment unter Verwendung des QIAquick^TM-PCR-Aufreinigungskits (Qiagen) aufgereinigt, mit NotI und BamHI gespalten und in den in Beispiel 2 (24) beschriebenen eukaryontischen Expressionsvektor pCA-Myc-His kloniert, wobei die Transkription unter Kontrolle des humanen CMV-Promotors steht.
E. Herstellung des Plasmidvektors pCACPNM1097
Das Metalloprotease-Gen wurde anhand genomischer DNA von Chlamydia pneumoniae, Stamm CWLo29, durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines 5'-Primers 5' ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGAGAAAACTTATTTTATGCAATCCTA 3'; SEQ ID NO: 29) und eines 3'-Primers (5' GCGCCGGATCCCAGAACAACGGAGTTCTTTTGG 3'; SEQ ID NO: 30) amplifiziert. Der 5'-Primer enthält eine NotI-Restriktionsstelle, eine Ribosomen-Bindestelle, ein Initiationscodon und eine Sequenz am 5'-Ende der für das Metalloprotease-Protein kodierenden Sequenz. Der 3'-Primer enthält die Sequenz, die für die C-terminale Sequenz des Metalloprotease-Proteins kodiert, und eine BamHI-Restriktionsstelle. Das Stoppcodon wurde ausgeschlossen und ein weiteres Nukleotid inseriert, um eine In-Frame-Fusion mit dem Histidin-Tag zu erhalten.
Nach einer Amplifikation wurde das PCR-Fragment unter Verwendung des QIAquick^TM-PCR-Aufreinigungskits (Qiagen) aufgereinigt, mit NotI und BamHI gespalten und in den in Beispiel 2 (25) beschriebenen eukaryontischen Expressionsvektor pCA-Myc-His kloniert, wobei die Transkription unter Kontrolle des humanen CMV-Promoters steht.
F. Herstellung des Plasmidvektors pCACPNM908
Das CLP-Protease ATPase-Gen wurde anhand genomischer DNA von Chlamydia pneumoniae, Stamm CWLO29, durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines 5'-Primers (5' ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGAATAAAAAAAATCTAACTATTTG 3'; SEQ ID NO: 31) und eines 3'-Primers (5' GCGCCGGATCCCAGCGATAGCTTCTGGGGTCC 3'; SEQ ID NO: 32) amplifiziert. Der 5'-Primer enthält eine NotI-Restriktionsstelle, eine Ribosomen-Bindestelle, ein Initiationscodon und eine Sequenz am 5'-Ende der für das CLP-Protease ATPase-Protein kodierenden Sequenz. Der 3'-Primer enthält die Sequenz, die für die C-terminale Sequenz der CLP-Protease ATPase kodiert, und eine BamHI-Restriktionsstelle. Das Stoppcodon wurde ausgeschlossen und ein weiteres Nukleotid inseriert, um eine In-Frame-Fusion mit dem Histidin-Tag zu erhalten.
Nach einer Amplifikation wurde das PCR-Fragment unter Verwendung des QIAquick^TM-PCR-Aufreinigungskits (Qiagen) aufgereinigt, mit NotI und BamHI ge spalten und in dem in Beispiel 2 (26) beschriebenen eukaryontischen Expressionsvektor pCA-Myc-His kloniert, wobei die Transkription unter Kontrolle des humanen CMV-Promotors steht.
G. Herstellung des Plasmidvektors pCACPNM909
Das Gen, das für die CLP-Protease-Untereinheit kodiert, wurde anhand von genomischer DNA aus Chlamydia pneumoniae, Stamm CWLO29, durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines 5'-Primers (5' ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGACACTGGTACCCTATGTTG 3'; SEQ ID NO: 33) und eines 3'-Primers (5' GCGCCGGATCCCAGTGCTACTTGTATCCTTATTAG 3'; SEQ ID NO: 34) amplifiziert. Der 5'-Primer enthält eine NotI-Restriktionsstelle, eine Ribosomen-Bindestelle, ein Initiationscodon und eine Sequenz am 5'-Ende der für die CLP-Protease-Untereinheit kodierenden Sequenz. Der 3'-Primer enthält die Sequenz, die für die C-terminale Sequenz der CLP-Protease-Untereinheit kodiert, und eine BamHI-Restriktionsstelle. Das Stoppcodon wurde ausgeschlossen und ein weiteres Nukleotid inseriert, um eine In-Frame-Fusion mit dem Histidin-Tag zu erhalten.
Nach einer Amplifikation wurde das PCR-Fragment unter Verwendung des QIAquick^TM-PCR-Aufreinigungskits (Qiagen) aufgereinigt, mit NotI und BamHI gespalten und in den in Beispiel 2 (27) beschriebenen eukaryontischen Expressionsvektor pCA-Myc-His kloniert, wobei die Transkription unter Kontrolle des humanen CMV-Promotors steht.
H. Herstellung des Plasmidvektors pCACPNM440
Das Transglycolase/Transpeptidase-Gen wurde anhand von genomischer DNA aus Chlamydia pneumoniae, Stamm CWLO29, durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines 5'-Primers (5' ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGAGCTACCGTAAACGTTCGACTC 3'; SEQ ID NO: 35) und eines 3'-Primers (5' GCGCCGGATCCCCCTCGTTCCCCCTTGTTTCGGAG 3'; SEQ ID NO: 36) amplifiziert. Der 5'-Primer enthält eine NotI-Restriktionsstelle, eine Ribosomen-Bindestelle, ein Initiationscodon und eine Sequenz am 5'-Ende der für die Transglycolase/Transpeptidase kodierenden Sequenz. Der 3'-Primer enthält die Sequenz, die für die C-terminate Sequenz der Transglycolase/Transpeptidase kodiert, und eine BamHI-Restriktionsstelle. Das Stoppcodon wurde ausgeschlossen und ein weiteres Nukleotid inseriert, um eine In-Frame-Fusion mit dem Histidin-Tag zu erhalten.
Nach einer Amplifikation wurde das PCR-Fragment unter Verwendung des QIAquick^TM-PCR-Aufreinigungskits (Qiagen) aufgereinigt, mit NotI und BamHI gespalten und in den in Beispiel 2 (28) beschriebenen eukaryontischen Expressionsvektor pCA-Myc-His kloniert, wobei die Transkription unter Kontrolle des humanen CMV-Promotors steht.
I. Herstellung des Plasmidvektors pCACPNM459
Das Gen, das für CLPc-Protease kodiert, wurde anhand von genomischer DNA aus Chlamydia pneumoniae, Stamm CWLO29, durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines 5'-Primers (5' ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGTTTGAGAAGTTCACTAATAGAGC 3'; SEQ ID NO: 37) und eines 3'-Primers (5' GCGCCGGTACCGTGATTCCAAGTGAGGGCTAGGG 3'; SEQ ID NO: 38) amplifiziert. Der 5'-Primer enthält eine NotI-Restriktionsstelle, eine Ribosomen-Bindestelle, ein Initiationscodon und eine Sequenz am 5'-Ende der für CLPc-Protease kodierenden Sequenz. Der 3'-Primer enthält die Sequenz, die für die C-terminale Sequenz der CLPc-Protease kodiert, und eine KpnI-Restriktionsstelle. Das Stoppcodon wurde ausgeschlossen und ein weiteres Nukleotid inseriert, um eine In-Frame-Fusion mit dem Histidin-Tag zu erhalten.
Nach einer Amplifikation wurde das PCR-Fragment unter Verwendung des QIAquick^TM-PCR-Aufreinigungskits (Qiagen) aufgereinigt, mit NotI und KpnI gespalten und in den in Beispiel 2 (29) beschriebenen eukaryontischen Expressionsvektor pCA-Myc-His kloniert, wobei die Transkription unter Kontrolle des humanen CMV-Promoter steht.
J. Herstellung des Plasmidvektors pCACPNM708
Das Thioredoxin-Gen wurde anhand von genomischer DNA aus Chlamydia pneumoniae, Stamm CWLO29, durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines 5'-Primers (5' ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGGTAAAGATCATATCAAGTG 3'; SEQ ID NO: 39) und eines 3'-Primers (5' GCGCCGGATCCCAGCGTGCTTATTGATAAG 3'; SEQ ID NO: 40) amplifiziert. Der 5'-Primer enthält eine NotI-Restriktionsstelle, eine Ribo somen-Bindestelle, ein Initiationscodon und eine Sequenz am 5'-Ende der für Thioredoxin kodierenden Sequenz. Der 3'-Primer enthält die Sequenz, die für die C-terminale Sequenz des Thioredoxins kodiert, und eine BamHI-Restriktionsstelle. Das Stoppcodon wurde ausgeschlossen und ein weiteres Nukleotid inseriert, um eine In-Frame-Fusion mit dem Histidin-Tag zu erhalten.
Nach einer Amplifikation wurde das PCR-Fragment unter Verwendung des QIAquick^TM-PCR-Aufreinigungskits (Qiagen) aufgereinigt, mit NotI und BamHI gespalten und in den in Beispiel 2 (30) beschriebenen eukaryontischen Expressionsvektor pCA-Myc-His kloniert, wobei die Transkription unter Kontrolle des humanen CMV-Promoters steht.
Beispiel 2:
Das Plasmid pcDNA3.1(-)Myc-His C (Invitrogen) wurde mit SpeI und BamHI gespalten, um den CMV-Promoter zu entfernen und das verbleibende Vektorfragment wurde isoliert. Der CMV-Promoter und Intron A aus Plasmid VR-1012 (Vical) wurden auf einem SpeI/BamHI-Fragment isoliert. Die Fragmente wurden zusammen ligiert, um das Plasmid pCA/Myc-His herzustellen.
Das mit NotI und BamHI gespaltene PCR-Fragment mit dem ATP-Bindekassette-Gen wurde in das mit NotI und BamHI gespaltene Plasmid pCA/Myc-His ligiert, um das Plasmid pCACPNM213 herzustellen (21).
Das mit NotI und KpnI gespaltene PCR-Fragment mit dem sekretorischer Lokus-ORF-Gen wurde in das mit NotI und KpnI gespaltene Plasmid pCA/Myc-His ligiert, um das Plasmid pCACPNM882 herzustellen (22).
Das mit NotI und BamHI gespaltene PCR-Fragment mit dem Endopeptidase-Gen wurde in das mit NotI und BamHI gespaltene Plasmid pCA/Myc-His ligiert, um das Plasmid pCACPNM208 herzustellen (23).
Das mit NotI und BamHI gespaltene PCR-Fragment mit dem Protease-Gen wurde in das mit NotI und BamHI gespaltene Plasmid pCA/Myc-His ligiert, um das Plasmid pCACPNM1096 herzustellen (24).
Das mit NotI und BamHI gespaltene PCR-Fragment mit dem Metalloprotease-Gen wurde in das mit NotI und BamHI gespaltene Plasmid pCA/Myc-His ligiert, um das Plasmid pCACPNM1097 herzustellen (25).
Das mit NotI und BamHI gespaltene PCR-Fragment mit dem CLP-Protease ATPase-Gen wurde in das mit NotI und BamHI gespaltene Plasmid pCA/Myc-His ligiert, um das Plasmid pCACPNM908 herzustellen (26).
Das mit NotI und BamHI gespaltene PCR-Fragment mit dem CLP-Protease-Untereinheit-Gen wurde in das mit NotI und BamHI gespaltene Plasmid pCA/Myc-His ligiert, um das Plasmid pCACPNM909 herzustellen (27).
Das mit NotI und BamHI gespaltene PCR-Fragment mit dem Transglycolase/Transpeptidase-Gen wurde in das mit NotI und BamHI gespaltene Plasmid pCA/Myc-His ligiert, um das Plasmid pCACPNM440 herzustellen (28).
Das mit NotI und KpnI gespaltene PCR-Fragment mit dem CLPc-Protease-Gen wurde in das mit NotI und KpnI gespaltene Plasmid pCA/Myc-His ligiert, um das Plasmid pCACPNM459 herzustellen (29).
Das mit NotI und BamHI gespaltene PCR-Fragment mit dem Thioredoxin-Gen wurde in das mit NotI und BamHI gespaltene Plasmid pCA/Myc-His ligiert, um das Plasmid pCACPNM708 herzustellen (30).
Ein jedes der sich ergebenden Plasmide pCACPNM213, pCACPNM882, pCACPNM208, pCACPNM1096, pCACPNM1097, pCACPNM909, pCACPNM440, pCACPNM459 und pCACPNM708 wurde durch Elektroporation in E. coli XL-1 blue (Stratagene) eingebracht, das in LB-Nährmedium mit 50 μg/ml Carbenicillin vermehrt wurde. Das Plasmid wurde durch das Endo Free Plasmid Giga Kit^TM (Qiagen)-DNA-Aufreinigungssystem in großem Maßstab isoliert. Die DNA-Konzentration wurde durch Absorption bei 260 nm bestimmt und das Plasmid nach Gelelektrophorese und Färben mit Ethidiumbromid durch Vergleich mit Molekulargewichtsstandards bestätigt. Die 5'- und 3'-Enden des Gens wurden durch Sequenzierung unter Verwendung eines LiCor Modell 4000 L DNA-Sequenzierungsgeräts und von IRD-800-markierten Primern bestätigt.
Beispiel 3:
Dieses Beispiel zeigt die Immunisierung von Mäusen, um einen Schutz gegenüber einer intranasalen Belastung mit C. pneumoniae zu erhalten.
Es wurde kürzlich gezeigt (Yang et al., Infect. Immun., Mai 1993, 61(5):2037–40), das Mäuse für eine intranasale Infektion mit unterschiedlichen Isolaten von C. pneumoniae empfänglich sind. Stamm AR-39 (Grayston et al. (1990) Journal of Infectious Diseases 161:618–625) wurde in Balb/c-Mäusen als ein Belastungsinfektionsmodell verwendet, um die Fähigkeit von als nackte DNA zugeführten Chlamydia-Genprodukten zu untersuchen, eine schützende Reaktion gegenüber einer sublethalen C. pneumoniae-Lungeninfektion auszulösen. Eine schützende Immunität wird als ein beschleunigtes Beseitigen von pulmonaler Infektion definiert.
Gruppen aus 7 bis 9 Wochen alten männlichen Balb/c-Mäusen (8 bis 10 pro Gruppe) wurden intramuskulär (i.m.) und intranasal (i.n.) mit Plasmid-DNA immunisiert, die jeweils eines der in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen C. pneumoniae-Proteingene enthielt. Kochsalzlösung oder der Plasmid-Vektor ohne ein inseriertes Chlamydien-Gen wurden an Gruppen mit Kontrolltieren verabreicht.
Für eine i.m.-Immunisierung wurden alternativ der linke und rechte Quadriceps mit 100 μg DNA in 50 μl PBS zu drei Zeitpunkten in den Wochen 0, 3 und 6 beimpft. Für eine i.n.-Immunisierung atmeten anästhesierte Mäuse 50 μl PBS mit 50 μg DNA zu drei Zeitpunkten in den Wochen 0, 3 und 6 ein. In Woche 8 wurden immunisierte Mäuse i.n. mit 5 × 10⁵ IFU C. pneumoniae, Stamm AR39, in 100 μl SPG-Puffer beimpft, um deren Fähigkeit zu testen, das Wachstum einer sublethalen C. pneumoniae-Belastung zu begrenzen.
Lungen wurden den Mäusen an Tag 9 nach der Belastung entnommen und unmittelbar in SPG-Puffer (7,5% Sucrose, 5 mM Glutamat, 12,5 mM Phosphat, pH 7,5) homogenisiert. Das Homogenat wurde gefroren bei –70°C bis zu einem Test aufbewahrt. Verdünnungen des Homogenats wurden auf das Vorliegen von infektiöser Chlamydia durch Impfen auf Monolayer aus empfänglichen Zellen getestet. Das Impfmaterial wurde auf die Zellen bei 3000 UpM eine Stunde zentrifugiert, sodann die Zellen drei Tage bei 35°C mit 1 μg/ml Cycloheximid inkubiert. Nach Inkubation wurden die Monolayer mit Formalin und Methanol fixiert und sodann auf das Vorliegen von Chlamydien-Einschlüssen mit Immunoperoxidase gefärbt, wobei konva leszente Seren aus Kaninchen, die mit C. pneumoniae infiziert worden waren, und Metall-verstärktes DAB als Peroxidasesubstrat verwendet wurden.
A. Immunisierung mit pCACPNM213
31 und Tabelle 1 zeigen, dass Mäuse, die mit pCACPNM213 i.n. und i.m. immunisiert worden waren, Chlamydien-Lungentiter von weniger als 60000 in 3 von 6 Fällen am Tag 9 (Mittelwert 51833) aufwiesen, während der Wertebereich für Kontrollmäuse, die mit Kochsalzlösung kontroll-immunisiert worden waren, 34200 bis 377800 IFU/Lunge (Mittelwert 141450) am Tag 9 betrug. Eine DNA-Immunisierung per se war nicht für die beobachtete schützende Wirkung verantwortlich, da ein weiteres Plasmid-DNA-Konstrukt, pCACPNM102, keine schützende Wirkung aufwies und Lungentiter bei immunisierten Mäusen ähnlich zu denjenigen waren, die für mit Kochsalzlösung immunisierte Kontrollmäuse erhalten worden waren (Mittelwert 153283). Das Konstrukt pCACPNM102 ist zu pCACPNM213 identisch, mit der Ausnahme, dass die Nukleotidsequenz, die für die putative ATP-Bindekassette kodiert, durch eine C. pneumoniae-Nukleotidsequenz ersetzt ist, die für ein damit nicht in Verbindung stehendes ATP-Synthase-Untereinheit I-Protein kodiert.
B. Immunisierung mit pCACPNM882
32 und Tabelle 3 zeigen, dass Mäuse, die mit pCACPNM882 i.n. und i.m. immunisiert worden waren, Chlamydien-Lungentiter von weniger als 73000 in 4 von 6 Fällen am Tag 9 (Mittelwert 77500) aufwiesen, während der Wertebereich für Kontrollmäuse, die mit Kochsalzlösung kontroll-immunisiert worden waren, 56000 bis 424000 IFU/Lunge (Mittelwert 186291) am Tag 9 betrug. Eine DNA-Immunisierung per se war nicht für die beobachtete schützende Wirkung verantwortlich, da ein weiteres Plasmid-DNA-Konstrukt, pCACPNM647, keine schützende Wirkung aufwies und Lungentiter bei immunisierten Mäusen ähnlich zu denjenigen waren, die für mit Kochsalzlösung immunisierte Kontrollmäuse erhalten worden waren (Mittelwert 143883). Das Konstrukt pCACPNM647 ist zu pCACPNM882 identisch, mit der Ausnahme, dass die Nukleotidsequenz, die für den putativen sekretorischer Lokus-ORF kodiert, durch eine C. pneumoniae-Nukleotidsequenz ersetzt ist, die für ein damit nicht in Verbindung stehendes Substrat-Bindeprotein kodiert.
C. Immunisierung mit pCACPNM208
33 und Tabelle 4 zeigen, dass Mäuse, die mit pCACPNM208 i.n. und i.m. immunisiert worden waren, Chlamydien-Lungentiter von weniger als 67000 in 4 von 6 Fällen am Tag 9 (Mittelwert 81766) aufwiesen, während der Wertebereich für Kontrollmäuse, die mit Kochsalzlösung kontroll-immunisiert worden waren, 56000 bis 424100 IFU/Lunge (Mittelwert 186291) am Tag 9 betrug. Eine DNA-Immunisierung per se war nicht für die beobachtete schützende Wirkung verantwortlich, da ein weiteres Plasmid-DNA-Konstrukt, pCACPNM647, keine schützende Wirkung aufwies und Lungentiter bei immunisierten Mäusen ähnlich zu denjenigen waren, die für mit Kochsalzlösung immunisierte Kontrollmäuse erhalten worden waren (Mittelwert 143883). Das Konstrukt pCACPNM647 ist zu pCACPNM208 identisch, mit der Ausnahme, dass die Nukleotidsequenz, die für die putative Endopeptidase kodiert, durch eine C. pneumoniae-Nukleotidsequenz ersetzt ist, die für ein damit nicht in Verbindung stehendes Protein kodiert.
D. Immunisierung mit pCACPNM1096
34 und Tabelle 6 zeigen, dass Mäuse, die mit pCACPNM1096 i.n. und i.m. immunisiert worden waren, Chlamydien-Lungentiter von weniger als 30000 in 5 von 6 Fällen am Tag 9 (Mittelwert 25000) aufwiesen, während der Wertebereich für Kontrollmäuse, die mit Kochsalzlösung kontroll-immunisiert worden waren, 51300 bis 170000 IFU/Lunge (Mittelwert 105150) am Tag 9 betrug. Eine DNA-Immunisierung per se war nicht für die beobachtete schützende Wirkung verantwortlich, da ein weiteres Plasmid-DNA-Konstrukt, pCACPNM553, keine schützende Wirkung aufwies und Lungentiter bei immunisierten Mäusen ähnlich zu denjenigen waren, die für mit Kochsalzlösung immunisierte Kontrollmäuse erhalten worden waren (Mittelwert 111583). Das Konstrukt pCACPNM553 ist zu pCACPNM1096 identisch, mit der Ausnahme, dass die Nukleotidsequenz, die für die putative Protease kodiert, durch eine C. pneumoniae-Nukleotidsequenz ersetzt ist, die für eine damit nicht in Verbindung stehende Protease kodiert.
E. Immunisierung mit pCACPNM1097
35 und Tabelle 8 zeigen, dass Mäuse, die mit pCACPNM1097 i.n. und i.m. immunisiert worden waren, Chlamydien-Lungentiter von weniger als 51000 in 4 von 6 Fällen am Tag 9 (Mittelwert 62883) aufwiesen, während der Wertebereich für Kon trollmäuse, die mit Kochsalzlösung kontroll-immunisiert worden waren, 90000 bis 242100 IFU/Lunge (Mittelwert 166287) am Tag 9 betrug. Eine DNA-Immunisierung per se war nicht für die beobachtete schützende Wirkung verantwortlich, da ein weiteres Plasmid-DNA-Konstrukt, pCACPNM1061, keine schützende Wirkung aufwies und Lungentiter bei immunisierten Mäusen ähnlich zu denjenigen waren, die für mit Kochsalzlösung immunisierte Kontrollmäuse erhalten worden waren (Mittelwert 148566). Das Konstrukt pCACPNM1061 ist zu pCACPNM1097 identisch, mit der Ausnahme, dass die Nukleotidsequenz, die für die putative Metalloprotease kodiert, durch eine C. pneumoniae-Nukleotidsequenz ersetzt ist, die für eine damit nicht in Verbindung stehende Zink-Metalloprotease kodiert.
F. Immunisierung mit pCACPNM908
36 und Tabelle 10 zeigen, dass Mäuse, die mit pCACPNM908 i.n. und i.m. immunisiert worden waren, Chlamydien-Lungentiter von weniger als 40000 in 3 von 6 Fällen am Tag 9 (Mittelwert 68333) aufwiesen, während der Wertebereich für Kontrollmäuse, die mit Kochsalzlösung kontroll-immunisiert worden waren, 56000 bis 424100 IFU/Lunge (Mittelwert 207962) am Tag 9 betrug. Eine DNA-Immunisierung per se war nicht für die beobachtete schützende Wirkung verantwortlich, da ein weiteres Plasmid-DNA-Konstrukt, pCACPNM569, keine schützende Wirkung aufwies und Lungentiter bei immunisierten Mäusen ähnlich zu denjenigen waren, die für mit Kochsalzlösung immunisierte Kontrollmäuse erhalten worden waren (Mittelwert 215600). Das Konstrukt pCACPNM569 ist zu pCACPNM908 identisch, mit der Ausnahme, dass die Nukleotidsequenz, die für die putative CLP-Protease ATPase kodiert, durch eine C. pneumoniae-Nukleotidsequenz ersetzt ist, die für eine damit nicht in Verbindung stehende Signalpeptidase kodiert.
G. Immunisierung mit pCACPNM909
37 und Tabelle 12 zeigen, dass Mäuse, die mit pCACPNM909 i.n. und i.m. immunisiert worden waren, Chlamydien-Lungentiter von weniger als 85000 in 5 von 6 Fällen am Tag 9 (Mittelwert 87683) aufwiesen, während der Wertebereich für Kontrollmäuse, die mit Kochsalzlösung kontroll-immunisiert worden waren, 56000 bis 424100 IFU/Lunge (Mittelwert 207962) am Tag 9 betrug. Eine DNA-Immunisierung per se war nicht für die beobachtete schützende Wirkung verantwortlich, da ein weiteres Plasmid-DNA-Konstrukt, pCACPNM569, keine schützende Wirkung aufwies und Lungentiter bei immunisierten Mäusen ähnlich zu denjenigen waren, die für mit Kochsalzlösung immunisierte Kontrollmäuse erhalten worden waren (Mittelwert 215600). Das Konstrukt pCACPNM569 ist zu pCACPNM909 identisch, mit der Ausnahme, dass die Nukleotidsequenz, die für die putative CLP-Protease-Untereinheit kodiert, durch eine C. pneumoniae-Nukleotidsequenz ersetzt ist, die für eine damit nicht in Verbindung stehende Signalpeptidase kodiert.
H. Immunisierung mit pCACPNM440
38 und Tabelle 14 zeigen, dass Mäuse, die mit pCACPNM440 i.n. und i.m. immunisiert worden waren, Chlamydien-Lungentiter von weniger als 98000 in 4 von 6 Fällen am Tag 9 (Mittelwert 87616) aufwiesen, während der Wertebereich für Kontrollmäuse, die mit Kochsalzlösung kontroll-immunisiert worden waren, 56000 bis 424100 IFU/Lunge (Mittelwert 186291) am Tag 9 betrug. Eine DNA-Immunisierung per se war nicht für die beobachtete schützende Wirkung verantwortlich, da ein weiteres Plasmid-DNA-Konstrukt, pCACPNM647, keine schützende Wirkung aufwies und Lungentiter bei immunisierten Mäusen ähnlich zu denjenigen waren, die für mit Kochsalzlösung immunisierte Kontrollmäuse erhalten worden waren (Mittelwert 143883). Das Konstrukt pCACPNM647 ist zu pCACPNM440 identisch, mit der Ausnahme, dass die Nukleotidsequenz, die für die putative Transglycolase/Transpeptidase kodiert, durch eine C. pneumoniae-Nukleotidsequenz ersetzt ist, die für ein damit nicht in Verbindung stehendes Gen kodiert.
I. Immunisierung mit pCACPNM459
39 und Tabelle 16 zeigen, dass Mäuse, die mit pCACPNM459 i.n. und i.m. immunisiert worden waren, Chlamydien-Lungentiter von weniger als 70000 in 4 von 6 Fällen am Tag 9 (Mittelwert 70516) aufwiesen, während der Wertebereich für Kontrollmäuse, die mit Kochsalzlösung kontroll-immunisiert worden waren, 56000 bis 424100 IFU/Lunge (Mittelwert 186291) an Tag 9 betrug. Eine DNA-Immunisierung per se war nicht für die beobachtete schützende Wirkung verantwortlich, da ein weiteres Plasmid-DNA-Konstrukt, pCACPNM647, keine schützende Wirkung aufwies und Lungentiter bei immunisierten Mäusen ähnlich zu denjenigen waren, die für mit Kochsalzlösung immunisierte Kontrollmäuse erhalten worden waren (Mittelwert 143883). Das Konstrukt pCACPNM647 ist zu pCACPNM459 identisch, mit der Ausnahme, dass die Nukleotidsequenz, die für die putative CLPc-Protease kodiert, deren Sequenz in SEQ ID NO: 18 gezeigt ist, durch eine C. pneumoniae-Nukleotidsequenz ersetzt ist, die für ein damit nicht in Verbindung stehendes Gen kodiert.
J. Immunisierung mit pCACPNM708
40 und Tabelle 18 zeigen, dass Mäuse, die mit pCACPNM708 i.n. und i.m. immunisiert worden waren, Chlamydien-Lungentiter von weniger als 52000 in 4 von 6 Fällen am Tag 9 (Mittelwert 73916) aufwiesen, während der Wertebereich für Kontrollmäuse, die mit Kochsalzlösung kontroll-immunisiert worden waren, 56000 bis 424100 IFU/Lunge (Mittelwert 207962) am Tag 9 betrug. Eine DNA-Immunisierung per se war nicht für die beobachtete schützende Wirkung verantwortlich, da ein weiteres Plasmid-DNA-Konstrukt, pCACPNM569, keine schützende Wirkung aufwies und Lungentiter bei immunisierten Mäusen ähnlich zu denjenigen waren, die für mit Kochsalzlösung immunisierte Kontrollmäuse erhalten worden waren (Mittelwert 215600). Das Konstrukt pCACPNM569 ist zu pCACPNM708 identisch, mit der Ausnahme, dass die Nukleotidsequenz, die für das putative Thioredoxin kodiert, durch eine C. pneumoniae-Nukleotidsequenz ersetzt ist, die für ein damit nicht in Verbindung stehendes C. pneumoniae-Gen kodiert.
Beispiel 4:
Dieses Beispiel zeigt die Identifizierung von B- und T-Zell-Epitopen in Proteinen wie jeweils exprimiert von pCACPNM213, pCACPNM882, pCACPNM208, pCACPNM1096, pCACPNM1097, pCACPNM909, pCACPNM440, pCACPNM459 und pCACPNM708.
B-Zell-Epitope wurden basierend auf dem Produkt von Flexibilitäts- und Hydrophobizitätsneigungen unter Verwendung des Programms SEQSEE (Wishart D.S. et al., „SEQSEE: a comprehensive program suite for protein sequence analysis", Comput. Appl. Biosci., 1994 Apr, 10(2):121–32) identifiziert, um äußere Oberflächenmerkmale (Epitope) zu identifizieren. T-Zell-Epitope für die HLA-A0201-MHC-Unterklasse wurden basierend auf dem Algorithmus von Parker et al. (Parker K.C. et al., „Peptide binding to MHC class I molecules: implications for antigenic peptide predicttion", Immunol. Res., 1995, 14(1):34–57) identifiziert. Diese Epitope sind in den Tabellen 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und 19 und in SEQ ID NOs: 41–74 gezeigt.
Tabelle 1
Tabelle 2: Identifizierte B- und T-Zell-Epitope aus CPNM213
Tabelle 3
Tabelle 4
Tabelle 5: Identifizierte B- und T-Zell-Epitope aus CPNM208
Tabelle 6
Tabelle 7: Identifizierte B- und T-Zell-Epitope aus CPNM1096
Tabelle 8
Tabelle 9: Identifizierte B- und T-Zell-Epitoge aus CPNM1097
Tabelle 10
Tabelle 11: Identifizierte B- und T-Zell-Epitope aus CPNM908
Tabelle 12
Tabelle 13: Identifizierte B- und T-Zell-Epitope aus CPNM909
Tabelle 14
Tabelle 15: Identifizierte B- und T-Zell-Epitope aus CPNM440
Tabelle 16
Tabelle 17: Identifizierte B- und T-Zell-Epitope aus CPNM459
Tabelle 18
Tabelle 19: Identifizierte B- und T-Zell-Epitope aus pCPNM708
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Impfstoff, der ein physiologisch akzeptables Verdünnungsmittel oder einen Träger zur Verwendung in einem Impfstoff umfasst, und jedes von: (a) mindestens einer erste Nukleinsäure in einem Impfvektor, wobei die erste Nukleinsäure für ein erstes Polypeptid kodiert. (b) dem ersten Polypeptid; (c) einem Fusionsprotein, umfassend das erste Polypeptid and ein zweites Polypeptid; oder (d) einem Hybrid-Nukleinsäure in einem Impfvektor, wobei die Hybrid-Nukleinsäure die erste Nukleinsäure fusioniert in-frame mit einer Nukleinsäure umfasst, die für das zweite Polypeptid kodiert; wobei jede erste Nukleinsäure in der Lage ist, exprimiert zu werden, und wobei das erste Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem Polypeptid, dessen Sequenz in SEQ ID No: 18 angegeben ist; (ii) einem Polypeptid, das in seiner Aminosäuresequenz zu mindestens 75% identisch zu SEQ ID No: 18 ist; und (iii) einem immunogenen Fragment umfassend mindestens 12 aufeinander folgende Aminosäuren von SEQ ID No: 18.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei der Impfstoff die mindestens erste Nukleinsäure in einem Impfvektor umfasst, und wobei die erste Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid in seiner Aminosäuresequenz zu mindestens 75% identisch zu der in SEQ ID No: 18 angegebenen Sequenz ist; (ii) einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID No: 18 angegeben ist; und (iii) einer Nukleinsäure, die für ein immunogenes Fragment kodiert, wobei das Fragment mindestens 12 aufeinander folgende Aminosäuren aus SEQ ID No: 18 umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei der Impfstoff die Hybrid Nukleinsäure in einem Impfvektor umfasst, und wobei die Hybrid-Nukleinsäure eine erste Nukleinsäure umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid in seiner Aminosäuresequenz zu mindestens 75% identisch zu der in SEQ ID No: 18 angegebenen Sequenz ist; (ii) einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID No: 18 angegeben ist; und (iii) einer Nukleinsäure, die für ein immunogenes Fragment kodiert, wobei das Fragment mindestens 12 aufeinander folgende Aminosäuren aus SEQ ID No: 18 umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 2 oder 3, wobei die in (ii) definierte Nukleinsäure die in SEQ ID No: 17 angegebene Sequenz umfasst, und wobei die Nukleinsäuresequenz der in (iii) definierten Sequenz mindestens 36 aufeinander folgende Nukleotide von der in SEQ ID No: 17 angegebenen Sequenz umfasst.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das zweite Polypeptid ein heterologes Signalpeptid ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das zweite Polypeptid eine Adjuvant-Aktivität aufweist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei jede erste Nukleinsäure mit einer oder mehreren Expressions-Kontrollsequenzen operativ verbunden ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Impfstoff die erste Nukteinsäure in einem Impfvektor oder die Hybrid-Nukleinsäure in einem Impfvektor umfasst, und wobei der Impfstoff weiter eine zweite Nukleinsäure umfasst, die für ein zusätzliches Polypeptid kodiert, das die Immunantwort gegen das erste Polypeptid verstärkt.
Impfstoff nach Anspruch 8, wobei die zweite Nukleinsäure für ein zusätzliches Chlamydia Polypeptid kodiert.
Impfstoff nach Anspruch 1. wobei der Impfstoff das erste Polypeptid umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei der Impfstoff das Fusionsprotein umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 11, wobei das zweite Polypeptid ein heterologes Signalpeptid ist.
Impfstoff nach Anspruch 11, wobei das zweite Polypeptid eine Adjuvant-Aktivität aufweist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 10 bis 13, weiter umfassend ein zusätzliches Polypeptid, das die Immunantwort gegen das erste Polypeptid verstärkt.
Impfstoff nach Anspruch 14, wobei das zusätzliche Polypeptid ein Chlamydia Polypeptid umfasst.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das immunogene Fragment, das mindestens 12 aufeinander folgende Aminosäuren aus SEQ ID No; 18 umfasst, SEQ ID No: 68 oder 69 umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 2, der die erste Nukleinsäure umfasst, wobei die Nukleinsäure für das Polypeptid von SEQ ID No: 18 kodiert. 18, Impfstoff nach Anspruch 17, wobei die erste Nukleinsäure SEQ ID No: 17 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Impfstoff nach einem der Ansprüche 10 bis 18 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verwendung einer effektiven Menge des Impfstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Behandlung von Chlamydia-Infektion.
Verwendung einer effektiven Menge der Zusammensetzung nach Anspruch 19 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Behandlung von Chlamydia-Infektion.
Kommerzielle Packung, umfassend den Impfstoff wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 18, und Anweisungen zur Verwendung des Impfstoffs zur Hervorrufung einer immunprotektiven Antwort in einem Säuger.
Kommerzielle Packung, umfassend den Impfstoff wie definiert in einem der Ansprüche 10 bis 15, und Anweisungen zur Verwendung des Impfstoffs zur Hervorrufung einer immunprotektiven Antwort in einem Säuger.
Impfstoff nach Anspruch 1, umfassend ein Expressionsplasmid, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Plasmid pCACPNM459 ist, wie in 29 gezeigt, und dass dieses umfasst: (a) das Ampicillin Resistenzgen; (b) das Neomycin Resistenzgen: (c) den Cytomegalovirus Promotor (pCMV); (d) die Intron A Sequenz; (e) die kodierende Sequenz des Polynukleotid-Moleküls der SEQ ID No: 1, das für das als CPLc-Protease bezeichnete Polypeptid kodiert; (f) die BGH poly A-Sequenz; und (g) die Myc-His-Sequenz.