DE60122672T2

DE60122672T2 - Zusammensetzung zur intestinalen verabreichung

Info

Publication number: DE60122672T2
Application number: DE60122672T
Authority: DE
Inventors: William Grant St-Augustin-de-Desmaures VANDENBERG
Original assignee: PEROS SYSTEMES TECHNOLOGIES IN; Peros Systemes Technologies Inc Saint Nicolas
Current assignee: PEROS SYSTEMES TECHNOLOGIES IN; Peros Systemes Technologies Inc Saint Nicolas
Priority date: 2000-01-27
Filing date: 2001-01-25
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2021-01-26
Also published as: CN1406112A; EP1250056B1; CN100366295C; MXPA02007202A; EP1250056A1; JP2003520862A; NO326525B1; NZ520238A; CA2396711A1; NO20023464D0; DE60122672D1; ATE337712T1; AU2990401A; KR20030009344A; NO20023464L; IL150818A0; WO2001054514A1

Description

Hintergrund der Erfindung
a) Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung und die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikamentes zur oralen Verabreichung von physiologisch aktiven Produkten und die intestinale Abgabe dieser. Die physiologisch aktiven Produkte, die gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, erlauben eine bessere systemische Abgabe, immunologische Zuführung, und es wurden verbesserte Nahrungs-, Ernährungs- und Therapieeigenschaften gezeigt.
b) Beschreibung des Standes der Technik
Der konventionelle Weg einer Therapie mit Hilfe von Proteinen oder Peptidarzneimitteln ist über die parenterale Verabreichung (d. h. mittels Injektion). Dies geschieht hauptsächlich aufgrund des Mangels an Absorption derartiger Wirkstoffe in dem Verdauungstrakt. Jedoch sind Injektionen schmerzhaft und manchmal im Vergleich zu anderen Dosierungsarten schwierig zu verabreichen. Die Folgsamkeit der Patienten ist ein wichtiger Gesichtspunkt gerade deshalb, weil einige dieser Arzneimittel häufig von Jugendlichen oder betagten Patienten eingenommen werden. Die orale Verabreichung ist hinsichtlich der Akzeptanz der Patienten bevorzugt gegenüber den Injektionen, gerade deshalb, weil sie weniger schmerzhaft und bequemer für den Patienten ist. Jedoch weist die Verabreichung von therapeutischen Polypeptiden durch den Mangen-Darm-Trakt (GI) eine Anzahl von Problemen wie beispielsweise den geringen pH-Wert im Magen, proteolytischen Abbau des Arzneimittels im Dünndarm, eine geringe Absorption durch die Dünndarm-Membran und eine begrenzte Stabilität derartiger Formulierungen, insbesondere als wässrige Lösung, die alle potentielle Barrieren gegenüber der Absorption der Polypeptide nach der oralen Administration darstellen, auf.
Jüngste Bemühungen, um Polypeptide oral zu verabreichen, haben sich auf die Verwendung von Absorptionsverbesserern konzentriert. Dies hat zu der Entdeckung geführt, dass eine Suspension von Natriumsalicylat in einem Überschuss von Öl die Absorption des menschlichen Wachstumshormones aus dem GI-Trakt verbessern kann.
Während die Absorption durch diese Kombination verbessert ist, beträgt die Bioverfügbarkeit lediglich bis zu etwa 10 bis 20 % des Proteins (bezogen auf die intravenöse Verabreichung), was immer noch recht gering ist. Im Ergebnis müssen größere Mengen an Proteinen oral verabreicht werden, um das benötigte therapeutische Level des Proteins im Plasma zur Verfügung zu stellen. Dies ist ein besonderes Problem mit Proteinen und Polypeptiden, welche, sogar mit der Einführung der Biotechnologie, noch immer vergleichsweise limitiert zu erhalten sind und ebenso komplexe chemische Einheiten darstellen, und im Ergebnis sehr teuer sind. Zusätzlich sind die flüssigen oder halbfesten Zusammensetzungen aus dem Stand der Technik schwierig zusammenzustellen oder in einer Dosis für die orale Verabreichung zu formulieren.
Weitere Aspekte können ebenfalls betrachtet werden. Beim Säugetier muss der Proteinabbau im Magen von geringerer Bedeutung sein, da es keine signifikante Absorptionshemmung des Proteins in Individuen mit dem kompletter gastrischer Atrophie von schädlichen Anämien gibt. Die Rolle des Magens als Reservoir ist von beträchtlicher Bedeutung, da dieser eine anhaltende Einheit von Proteinen in dem Zwölffinger-Darm nach einem Mahl gewährleistet und dadurch die intensive Vermischung mit Bauchspeicheldrüsensekret zustande kommt. Die Kombination eines geringen pH-Wertes und Peptidaktivität führt wahrscheinlich zur Denaturierung der meisten Nahrungsproteine, wodurch Bindungen, die anfällig gegenüber weiterer Hydrolyse im Dünndarm sind, der weiteren Hydrolyse ausgesetzt werden.
Die Epithelien, welche den Magen-Darm-Trakt auskleiden, wirken ebenso deutlich als Barriere zwischen der äußeren Umgebung und dem internen Milieu des Körpers. Diese enthalten selektive physiologische Mechanismen, um zum Teil den Eintritt und Austritt von Molekülen aus dem Körper zu kontrollieren, fungieren in einer Weise als Ventil mit biomechanischen Eigenschaften bemerkenswert ähnlich sind zu denen der Niere, einem weiteren Organ mit "Auslassventil"-Eigenschaften, wobei der Begriff "Ventil" die aktiven metabolischen Prozesse, die diese Funktion ausüben, schmälert. Das Darm-Epithel fungiert zu einem wichtigen Grad als physiologische Barriere, eine bemerkenswerte Aufgabe für eine Einzelschicht von potentiell zerbrechlichen Zellen, welche mit physiologisch und chemisch schädlichem aufgenommenem Material bombardiert wird. Jedoch muss festgestellt werden, dass diese keine "absolute" Barriere darstellt, wie es häufig angenommen wurde. Daher müssen ältere Konzepte, dass intakte Proteine im gesamten Organismus nicht einfach in den Blutkreislauf gelangen können, dass der Eintritt über den Magen-Darm-Trakt ausnahmslos hochselektiv ist und dass partikuläres Material ausnahmslos ausgeschlossen ist, zugunsten einer wesentlich umsichtigeren und komplexeren Anschauung der Barrierefunktion verworfen werden. Genauso wie ihre unvollständige physikalische Barrierefunktion fungieren die Epithelien des Magen-Darm-Traktes als immunologische Barriere und enzymatische Barrieren und diese recht komplexen Mechanismen sind ebenso zentral und untrennbar von Abwägungen hinsichtlich der Absorption von Proteinen und Peptiden in deren intakter Form.
Die enzymatischen Barrieren von Peptiden und Proteinen über verschiedenartige Wege wurden im Falle der oralen und enteralen Verabreichung studiert. Der enzymatische Abbau vor (oder während) der Absorption stellt zweifelsfrei das kritische Hindernis der Absorption von Peptid-Arzneimitteln im Dünndarm und eine Hauptbarriere der Absorption von Peptiden und Proteinen durch den Magen-Darm-Trakt dar.
Daher ist für die pharmazeutische Verabreichung von Peptiden über enterale Wege die Inhibierung von Proteasen oder Peptidasen oder die Erfindung von Formulierungen, welche Schutz gegenüber derartigem Abbau vitaler Targets liefern, möglicherweise bedeutender als absorptionsverbessernde Strategien. Obwohl die Teleologie vermieden werden sollte, könnte die Multiplizität der Barrieremechanismen in dem Magen-Darm-Trakt eine evolutionäre Widerspiegelung von schwerwiegenden Konsequenzen des unkontrollierten Zutritts von exogenem biologisch aktivem Material widerspiegeln. Daher stellen diese Mechanismen unweigerlich die beträchtliche Schwierigkeit der Erfindung von wirksamen Verabreichungsmodi für Peptid- und Proteinarzneimittel dar. Das Konzept einer verdauenden Oberfläche mit einer Schutzfunktion deutet darauf hin, dass an der Grenzfläche gebundene Proteasen und Peptidasen eine Rolle als "hydrolytische" Barriere haben und die "physiologische Barriere" und die "immunologische Barriere", jede mit Schutzfunktion, zu ergänzen, wobei die cytoplasmatischen Peptidasen (lediglich) eine verdauende Funktion haben. Dieses Modell gewinnt sogar noch mehr an Bedeutung, wenn in großem Maßstab die Passage durch paracelluläre Wege (angetrieben durch den Lösungsmittelwiderstand) nachgewiesen wird, so dass die luminale und Oberflächenhydrolyse (vor der paracellulären Passage) hinsichtlich der Minimierung des Eintritts biologisch aktiver Peptide von der partiellen Verdauung von diätetischen Proteinen in dem Körper, kritisch sein würde.
Prinzipiell können potentielle Wege durch die Epithelien hindurch eingeteilt werden in (a) transzelluläre (einschließlich carrier-vermittelter Mechanismen und endocytotischer Mechanismen; ebenso auf Diffussion beruhendem Wege entweder durch Wasserkanäle oder Lipid-reiche Teile der Membran) und (b) paracellulär (einschließlich der Passage durch "tight" junctions und extrusiver Zonen hindurch, welche beide während der natürlichen Zellumwandlung und infolge von physiologischen und chemischen Verletzungen auftretend gebildet werden).
Es ist eine allgemeine Meinung, dass die Absorption von intakten Peptiden oder Proteinen aus der Nahrung von geringfügiger direkter ernährungsphysiologischer Signifikanz aufgrund der kleinen Mengen, welche absorbiert werden im Vergleich zu den Mengen von freien Aminosäuren, welche in den Blutkreislauf eintreten, ist. Jedoch gibt es zwei Gründe, weshalb die Absorption dieser Moleküle in ihrer intakten Form nützlich ist oder sein könnte. Der erste ist die Aufnahme von Antigenen über den M-Zellweg. Dieser ist ein grundlegender Teil des natürlichen Prozesses der Akquisition der mucosalen Immunität. Der zweite kann potentiell für therapeutische Zwecke ausgenutzt werden. Abgesehen von der relativen Einfachheit, Sicherheit (das heißt, sterile Instrumente sind nicht notwendig), nicht-invasiven Natur und der Akzeptanz des oralen Weges verglichen mit dem parenteralen oder rektalen Wegen der Patienten, kann der enterale Weg günstiger großen Zugang zu der Leber liefern (relevant im Falle der Insulin-Verabreichung). Andererseits kann der Zugang von einigen intakten Pepitiden und Proteinen in den Blutkreislauf nachteilig sein, obwohl der tatsächliche Nachweis hierfür zum jetzigen Zeitpunkt nicht vollständig erbracht ist und viele Behauptungen pathologischer Konsequenzen von Nahrungsproteinen oder Peptiden auch nicht mehr als auf Anekdoten oder subjektiven Beweisen basieren. Trotz dieser Vorbehalte ist die Magen-Darm-Nahrungsmittelallergie mittlerweile ein akzeptiertes Phänomen und die Absorption intakter Proteine, um Zugang zu den sub-epithelialen Mastzellen zu erhalten, ist Teil dieses Mechanismus'.
Wirkungsvolle biologische Effekte von absorbierten intakten Proteinen sind natürlich nicht auf immunologische Effekte beschränkt.
Agenzien, welche die intestinale Absorption verbessern, sind von besonderer Bedeutung auf dem Gebiet der oralen Verabreichung von biologisch aktiven Peptiden und Proteinen für verschiedenartige Anwendungen. Ein gültiger Einwand gegenüber der Verwendung derartiger Enhancer beruht auf der Tatsache, dass diese im Wesentlichen Membran- oder Junction-schädigende Agenzien sind. Enhancer, insbesondere mit chronischer Verwendung, haben wahrscheinlich toxische Effekte und fördern den Zutritt von ungewünschten Molekülen. Dass die Verabreichung von Tryptophan, welches toxische Effekte durch einen drastischen Anstieg an paracellulärer Permeabilität hervorrufen kann, ist ein verblüffendes Resultat. Es ist möglich, dass einige Individuen besonders empfindlich gegenüber Tryptophan sind.
Die Anwendung des Liposomeneinschlusses, um die Peptide und Proteine vom Abbau zu fördern, ist untersucht worden, und spätere Resultate wurden als enttäuschend angesehen. Ein weiterer Ansatz, um den Lipid-löslichen Weg zu verwenden, beispielsweise mittels transcellulare Diffusion, ist es, das Peptid oder Protein in einer Mikroemulsion zu formulieren. Eine große Anstrengung ist unternommen worden, um Wege zu finden, Insulin oral verabreichbar zu machen. Beinahe jede Anstrengung war erfolgreich, allerdings mit einem sehr begrenzten Ausmaß. Eine Wasser-in-Öl-Mikroemulsion enthaltend Cholesterin, Lecithin und eine Fettsäure in kritischen Anteilen, welche die Zusammensetzung von Chylomikronen simulieren, wurde entwickelt. Unglücklicherweise wurde die Glaubwürdigkeit dieser Entdeckungen in Frage gestellt, als sich nachträglich herausstellte, dass eine Charge der Formulierung mit Glibenclamid verunreinigt war.
Aus der Literatur geht eindeutig hervor, dass die anale Verabreichung von Proteinen in einer größeren Absorption und Gewebeanreicherung resultiert als sie es bei der oralen Verabreichung der gleichen Dosis tut. Dies wirft die Frage auf, wie auch die Aufnahme über den oralen Weg verbessert werden kann. Das Potential könnte darin liegen, zumindest die oralen Aufnahmewerte auf die, welche rektal erreicht werden, zu erhöhen. Verschiedene Methoden zum Schutz von pharmakologisch aktiven Peptiden und Proteinen vor der Wirkung des Darmes wurden in Erwägung gezogen einschließlich enterischer und ähnlicher schützender Beschichtung, Co-Verabreichung mit Antisäuren und Enzym-Inhibitoren und die Verabreichung im Inneren von bakteriellen Zellen und lebenden Nahrungsmitteln (Bioverkapselung).
Beispielsweise stieg die Aufnahme von HRP (Meerretich-Peroxidase) an, wenn diese der Regenbogenforelle mit dem Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor gemeinsam gegeben wird. In der gleichen Studie stellt sich heraus, dass die gemeinsame Verabreichung des künstlichen Detergenz Mega-9 zu einer beinahe doppelt so hohen Anwesenheit der HRP verglichen mit den Kontrollen führte. Die gesteigerten Proteinkonzentrationen wurden aufgrund der Gelatinisierung der Darmverkleidung und einem konsequenten Anstieg der Protein-Enterocyten-Interaktionen erreicht. Ebenso kann es sein, dass die Integrität der GI-Epithelien unterbrochen wurde, was die transcellulare Aufnahme erlaubt. Mega-9, oral intubiert mit dem rekombinanten Wachstumshormon (rbGH) und einer Anti-Säure, steigert das Wachstumsverhalten des Coho-Lachses über eine 7-wöchige Versuchsperiode im Vergleich zu Fischen, dem das Wachstumshormon (GH) alleine verabreicht wurde.
Detergenzien (L-lyso-phosphatidylcholin) wurden ebenfalls gemeinsam mit einem Gonadotropin-Freisetzungshormon-Agonisten (GnRHA) während induzierter Ovulationsstudien am Kohlenfisch A. fimbria, als Maßstab zur jeweiligen Maximierung der GI-Absorption und Steigerung des Magen-pHs verabreicht. Die orale Intubierung eines Goldfisches mit Lachs-Hypophysen-Extrakt und 0,2 % Polyacrylsäure bewirkte das Gegenteil.
Das Antibiotikum Monensin wurde als Enhancer-Agens untersucht. Der rationale Hintergrund der Auswahl dieser Verbindung lag in dessen Eignung, den Transfer von Pinocytose-Proteinen zwischen Vesikeln und dem lysosomalen Compartment zu vermindern. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Monensin den pH-Wert von sauren Compartimenten innerhalb einer Vielzahl von Zellen anhebt. Es wurde jedoch kein Effekt hinsichtlich der HRP-Absorption beobachtet. Die Verwendung von biologisch abbaubaren Mikropartikeln zur Verkapselung und dadurch zum Schutz der Proteine vor Abbauprozessen wurde unter Verwendung komplexer Proteinmakromoleküle untersucht. In diesen Studien, die mit HGG an dem atlantischen Lachs Salmo salar angestellt wurden, war die Anwesenheit des Proteins im Plasma infolge der oralen Intubation stark verlängert (bis zu 8 Wochen), wodurch vorgeschlagen werden kann, dass das eingeschlossene HGG Zugang über paracelluläre, ebenso wie auch transcelluläre Wege erhalten hat, was zu der anhaltenden Anwesenheit im Plasma führt. GH wurde ebenfalls in der geschützten Form verabreicht, wobei das Molekül in eine Polymermatrix eingebracht wurde, welche unter sauren Bedingungen intakt blieb, jedoch unter den alkalischen Bedingungen des Darmes abgebaut wurde. Mit der Nahrung verabreicht steigerte das eingeschlossene GH das Wachstum der Regenbogenforelle über das bei der Kontrolle beobachtete. Ein alternatives Verfahren zum Schutz von oral verabreichten Pharmazeutika, die bei der Beimpfung von Fischen verwendet wurden, ist deren Verabreichung mit einem anderen Organismus. Im Hinblick auf die bioaktiven Proteine wurde diese Strategie nur bei einer Gelegenheit unter Verwendung rekombinanter Hefen für Regenbogenforellen GH geprüft. In einer eleganten Studie führte die Fütterung von gestreiften Meerbarben mit Nahrungsmitteln, denen für GH-rekombinante Hefen zugegeben waren, zu einer signifikanten Wachstumsrate der behandelten Tiere im Vergleich zu den Kontrollen. Dieses Verfahren ist jedoch auf diese Organismen begrenzt, wie beispielsweise auf Hefen, welche in der Lage sind, rekombinante Produkte in deren unmodifizierter Form zu lagern. Die jüngste Vergangenheit hat ebenfalls Zeugnis darüber abgelegt, dass die Entwicklung einer Anzahl von genetisch veränderten Pflanzen, die Gene von pharmazeutischem Interesse exprimieren, entwickelt wurden. Studien haben eine aufrecht erhaltende Bioaktivität von auf Pflanzen basierenden rekombinanten Produkten gezeigt, wenn diese oral verabreicht werden. Ähnliche Verfahren für die Verabreichung von auf Aqua-Kultur bezogenen produktionsorientierten Proteinen würden aufgrund ihrer Herstellungsökonomie sehr attraktiv sein.
Entwicklungen in dem Bereich der Biotechnologie haben Hilfsmittel zur Produktion von beinahe unbeschränkten Mengen von bioaktiven Peptiden und Proteinen in wirtschaftlich brauchbaren Mengen zur Verfügung gestellt. Daher ist es absehbar, dass die natürliche Permeabilität von Lebewesen, einschließlich denen des menschlichen Darms, als Hilfsmittel für die Verabreichung von Peptiden und Proteinwirkstoffen, um Einfluss auf physiologische Kontrollprozesse zu erhalten, verwendet wird. Offensichtlich orientierte Anwendungsgebiete der Erfindung umfassen die kontrollierte Reproduktion, Wachstumsbeschleunigung, Verbesserung des Immunsystems, therapeutische und ernährungsphysiologische Verbesserung.
Der orale Weg zur Impfung liefert signifikante Vorteile, indem er Laborkosten senkt, zeitsparend ist, die Möglichkeiten der Kreuz-Kontamination mit Nadeln senkt und keine aufwendige Handhabung beansprucht, oder die Entsorgung von Behandlungsflüssigkeiten benötigt. In Anbetracht der vorliegenden Zusammenfassung kann jedoch die orale Impfung nur auf Basis antigener Verbindungen in Betracht gezogen werden. Versuche mit synthetischen Virus-Impfstoffen, basierend auf Peptiden, in höheren Wirbeltieren wurden als erfolgreich dargestellt, obwohl gegenteilige Ergebnisse in großen Feldversuchen auftraten. Für Impfprogramme ist es vorstellbar, dass Impfstoffe mit rekombinanten Untereinheiten, die aus Glycoprotein/Nukleoproteinen bestehen, in die Nahrung eingebracht werden können.
Eine Strategie, die Infektionen in allen Individuen kontrollieren könnte, wäre jede Art der Immunisierung, die den Transport und somit die Übertragung von Mikroben verhindert oder im Wesentlichen verhindert. Im Falle der Immunisierung von jungen Kindern mit Haemophilus influenzae, beispielsweise mit Polysaccharid-Konjugaten der Gruppe b wurde festgestellt, dass die Übertragung von etwa 4% auf weniger als 1 % vermindert wurde, eine mögliche Erklärung für die gleichzeitige Immunität der Herde. Falls ein Impfstoff die Kolonisation von Mikroben verhindern könnte, wäre zu erwarten, dass ein derartiger Impfstoff beinahe alle Infektionen der gleichen Art von Mikroben in den immunisierten Patienten oder Tieren verhindern könnte. Da auch nicht immunisierte Patienten Mikroben von anderen akquirieren müssen, sollte ein Impfstoff, der die Übertragung reduziert, die Infektionen in immunisierten ebenso wie auch nicht immunisierten Patienten vermindern. In der Tat könnte ein aggressives Immunisierungsprogramm, gepaart mit antibiotischer Behandlung von nachgewiesenen Überträgern, in der Lage sein, das Reservoir dieser Organismen zu eliminieren.
Der bestimmende Faktor der spezifischen Immunität auf der Oberfläche der Magenschleimhaut ist das sekretorische IgA (S-IgA), welches physiologisch und funktionell von den Bestandteilen des Immunsystems des Kreislaufssystems getrennt ist. Die mukosale S-IgA-Antwort wird vorwiegend von dem allgemeinen mukosalen Immunsystem (CMIS) eingeleitet, in dem Immunogene von spezialisierten lymphepithelialen Strukturen, allgemein als Mukose-assoziiertes Lymphgewebe (MALT) bezeichnet, aufgenommen werden.
Daher kann die Immunisierung in dem Darm die mukosale Immunität in den oberen Atemwegen und umgekehrt auslösen. Die am besten bekannten MALT-Strukturen sind die intestinalen Peyer'schen Platten. Weiterhin ist es wichtig anzumerken, dass die orale Immunisierung eine Antigen-spezifische IgG-Antwort in der Körperregion zusätzlich zu den mukosalen IgA-Antikörpern auslöst.
Die meisten löslichen, nicht-replizierenden Antigene sind schlechte mukosale Immunogene, besonders über den peroralen Weg, wahrscheinlich weil die Verdauungsenzyme diese abbauen und diese wenig oder keinen Tropismus für das Darmassoziierte Lymphgewebe (GALT) haben. Eine beachtenswerte Ausnahme ist das Choleratoxin (CT). CT ist ein wirkungsvolles mukosales Immunogen, wahrscheinlich aufgrund der GM1 gangliosid-Bindungseigenschaft seiner Bindungs-Untereinheit, CTB, welches es ihm ermöglicht, von M-Zellen der Peyer'schen Platten aufgenommen zu werden und zu den darunter liegenden immunokompetenten Zellen zu gelangen. Um zusätzlich ein gutes mukosales Immunogen zu sein, ist CT ein Förderer, der die mukosale Immunogenität von anderen löslichen Antigenen, die mit ihm gemeinsam verabreicht werden, verstärkt. Ebenso verbleibt es in gewisser Weise kontrovers, da reines oder rekombinantes CTB höchst wahrscheinlich diese Eigenschaften nicht aufweist, wenn es über den Magen (i.g.) als ein Verstärker verabreicht wird. Sehr kleine Mengen (< 1 mg) von intaktem CT können jedoch synergistisch mit CTB als oraler Verstärker wirken. Diese Ergebnisse können die offensichtlich verstärkende Aktivität von vielen kommerziellen Präparationen von CTB, die gewöhnlich kleine Mengen von CT enthalten, erklären.
Während die Entdeckung von Peptidverbindungen, die einen Nährwert und therapeutischen Wert haben, in den letzten Jahren stark anstieg, so weist die Entwicklung von brauchbaren physiologisch aktiven Versorgungssystemen für viele dieser Komponenten die oft nachgewiesene Problematik auf. Der Magen-Darm-Trakt sekretiert eine Vielzahl von Stoffen, die Polypeptide metabolisieren.
Beispielhaft für solche katabolischen Stoffe sind Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Carboxypolypeptidasen, Aminopolypeptidasen und Dipeptidasen. Polypeptide, die dem Katabolismus in dem Magen und Dünndarm entkommen, werden durch die Zellen, die den Magen-Darm-Trakt auskleiden, zum Eingang des Kreislaufsystems transportiert, welches absorbierte Polypeptide zu der Leber transportiert. Die absorbierten Polypeptide werden einem weiteren Abbau durch eine Vielzahl von metabolischen Prozessen in der Leber unterworfen. Ein derartiger Abbau von absorbierten Stoffen aus dem Blut in der Leber, bevor derartige Materialien in den allgemeinen systemischen Blutkreislauf gelangen, ist in der Pharmazie als "der erste Überführungseffekt" bekannt.
Aus diesem Grunde müssen die meisten, wenn gar nicht alle dieser Komponenten parenteral, wie beispielsweise subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal injiziert werden. Da die meisten Patienten sich parenterale Arzneimittelformulierungen nicht selbst verabreichen können, ist es häufig notwendig, dass Arzneimittel dieses Typs ambulant verabreicht werden, was zu zusätzlichen Kosten, die mit deren Verwendung verbunden sind, führt.
Darauf aufbauend auf der Annahme, dass die orale Verabreichung bioaktiver Peptide und Proteine gegenüber einigen tierischen Spezies wie beispielsweise gegenüber gezüchteten und aquakulturierten Spezies den Nutzen mit sich bringt, könnte es als vorteilhaft angesehen werden, die Aufnahme von pharmazeutischen Formulierungen zu verbessern.
Aus diesem Grunde besteht dringender Bedarf für ein neues, effizientes, kosteneffektives und nicht invasives Verfahren zur Verabreichung an Patienten und Tieren einer Zusammensetzung, die Nahrungsmittel und therapeutisch wirksame Zusammensetzungen, insbesondere Peptide enthält, die andererseits ungeeignet für die orale Verabreichung sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung zur oralen Verabreichung an einem Mensch oder einem Tier, einschließlich Säugetieren, Vögeln, Insekten und Fischen zur intestinalen Abgabe eines physiologisch aktiven Agens zur Verfügung zu stellen, wobei diese Zusammensetzung ein neutralisierendes Agens, das zur Anhebung des im Magen herrschenden pH-Wertes auf Werte zwischen 6,5 bis 9 in dem Verdauungssystem des Tieres geeignet ist, um die chemische Denaturierung des besagten physiologisch aktiven Agens zu verhindern, einen Inhibitor von Verdauungsenzymen zur Verhinderung der enzymatischen Verdauung des besagten physiologisch aktiven Agens, und eines die Aufnahme verstärkenden Agens, das die intestinale Absorption eines physiologisch aktiven Agens erhöht, ist. Die Erfindung basiert ebenso auf der Entdeckung, dass die Kombination dieser drei Agentien zusätzliche und synergistische intestinale Abgabe und Aufnahme liefert, wenn sie gleichzeitig verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, die Verwendung der Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von intestinalen mikrobiellen Infektionen in einem Tier, welches die Verabreichung einer ausreichenden Menge einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, wobei das physiologisch aktive Agens ein antimikrobielles Agens ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zur oralen Verabreichung an einem Tier zur intestinalen Abgabe eines physiologisch aktiven Agens zur Verfügung gestellt, wobei die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zumindest ein neutralisierendes Agens in einer Konzentration zwischen etwa 1 bis 60 Gew.-%, einen enzymatischen Inhibitor in einer Konzentration von etwa 1 bis 50 Gew.-% und das die Aufnahme fördernde Agens in einer Konzentration zwischen etwa 0,1 bis 50 Gew.-% vorhanden ist, enthält.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst weiter ein physiologisch aktives Agens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus therapeutischen Agenzien, Ernährungsprodukten, Mucopolysacchariden, Lipiden, Kohlenhydraten, Steroiden, Hormonen, Wachstumshormon (GH), Wachstumshormon abgebendes Hormon (growth hormone releasing hormone, GHRH), epithelialem Wachstumsfaktor, vaskulärem endothelialem Wachstums- und Permeabilitätsfaktor (vascular endothelial growth and permeability factor (VEGPF), Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor), Cytokinen, Interleukinen, Interferonen, GMCSF, hormonähnlichem Produkt, neurologischem Faktor, neurotropem Faktor, Neurotransmitter, Neuromodulator, Enzym, Antikörper, Peptid, proteinartiges Fragment, Vaccin, Zusatzstoff, ein Antigen, immunstimulierender oder -inhibierender Faktor, hämatopoetischer Faktor, Antikrebsprodukt, antiinflammatorisches Agens, antiparasitäre Verbindung, antimikrobielles Agens, Nukleinsäurefragment, Plasmid-DNA-Vektor, Zellprolieferationsinhibitor oder -aktivator, Zelldifferenzierungsfaktor, Blutgerinnungsfaktor, Immunglobulin, antiangiogenetisches Produkt, negative selektive Marker oder "Suizid"-Agens, toxische Verbindung, Antiangiogenese-Agens, Polypeptid, Antikrebs-Agens, Säureproduktions-Medikamente und Histamin H2-Rezeptor Antagonist.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst ein neutralisierendes Agens, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreichend ist zur Neutralisierung des Abbaus durch Säure in dem Verdauungssystem des Wirts-Tieres, um die Abgabe eines physiologisch aktiven Agens zu dem Tierdarm zu gestatten, wobei das neutralisierende Agens aus der Gruppe bestehend aus Antisäuren, Natriumbicarbonat, Natriumcarbonat, Natriumcitrat, Natriumhydrogencarbonat, Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Magnesiumsalzen, Magnesiumcarbonat, Magnesiumtrisilikat, Magnesiumhydroxid, Magnesiumphosphat, Magnesiumoxid, Bismuthsubcarbonat und Kombinationen davon ausgewählt sein kann.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann ein neutralisierendes Agens umfassen, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natriumcarbonat in einer Konzentration von 10 bis 20 Gew.-% und Calciumcarbonat in einer Konzentration von 10 bis 20 Gew.-% bezogen auf die Zusammensetzung.
Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die zumindest einen Enzyminhibitor in einer Menge umfasst, die ausreichend ist, um den Abbau des physiologisch aktiven Agens durch Verdauungsenzyme in dem Verdauungssystem eines Menschen oder Tieres im Wesentlichen zu verhindern und um die Abgabe des besagten physiologisch aktiven Agens zu dem Darm des Menschen oder Tieres zu gestatten.
Der Inhibitor der Verdauungsenzyme kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Antiproteasen, Eialbumin, Inhibitoren auf Pflanzenbasis aus Ölsaaten, Sojabohnen, Kidneybohnen, Saubohnen, Reiskleie, Weizenkleie, Ethylendiamintetraacetat, alpha-1-Antitrypsin, Albumin, Ovalbumin und Proteosomen.
Die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann Pepsininhibitoren, Enteropeptidase-Inhibitoren und/oder Albumin in einer Konzentration zwischen 10 bis 20 Gew.-% enthalten.
Die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Aufnahmeverstärkendes Agens enthalten, welches aus Gallensalz, Saponin, Deoxycholat, Natriumsalicylat, Natriumlaurylsulfat, Ölsäure, Linolsäure, Monoolein, Lecithin, Lysolecithin, Polyoxyethylen-Sorbitanester, p-t-Octylphenoxypolyoxyethylen, N-lauryl-fi-D-maltopyranosid, 1-Dodecylazacycloheptan-2-azon und Phosphorlipiden bestehen kann.
Das die Aufnahme-verstärkende Agens kann das Natriumdeoxycholat in einer Konzentration zwischen 1 bis 5 % sein.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann weiterhin mindestens einen zusätzlichen Bestandteil ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylendiamintetraacetat, Konservierungsmitteln, Antioxidantien, Farbstoffen, Bindern, Tracern, einem oder mehreren Süßungsmitteln, oberflächenaktiven Mitteln, Trennmitteln, Aromastoffen, Mehl, Bohnen, Hefe, Brauereihefe, Mineralöl, Pflanzenöl, tierisches Öl, Gleitmittel, Salbe und Kombinationen davon enthalten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, dass das physiologisch aktive Agens bei der Abgabe in dem Mensch- oder Tierdarm von dem Darm zur systemischen Abgabe absorbiert wird oder einen effektiven physiologischen Effekt auf die Darmwand ausübt.
Ebenso kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung es einem physiologisch aktiven Agens, wenn dieses einem Menschen- oder Tierdarm verabreicht wird erlauben, einen physiologischen Effekt auf den Inhalt des Darmes auszuüben. Die Applikation kann weiterhin verwendet werden, um den Nahrungstransport durch den Darm oder die Behandlung von Infektionskrankheiten zu stimulieren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das physiologisch aktive Agen geeignet, um eine mukosale oder systemische Immunantwort in dem Wirts-Menschen oder -Tier gegen Schleimhaut-Infektionskrankheiten auszulösen. Es wird die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikamentes zur Immunisierung eines Trägers gegenüber mukosalen Mikroorganismen zur Verfügung gestellt, welches die orale Verabreichung an dem jetzt in einer immunisierenden Menge des mikrobiellen Oberflächenproteins in Form von abgetöteten ganzen Mikroorganismen, einem Lysat von Mikroorganismen oder eines isolierten Antigens oder eines immunologischen Fragments davon umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Zusammensetzung zur oralen Verabreichung an einen Wirt, bevorzugt zur Verabreichung in den Darm (Magen, Verdauungstrakt) oder einen Wirt zur Verfügung, um diesen zu schützen oder um eine Immunantwort gegenüber den mikrobiellen Infektionen auszulösen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung intestinaler mikrobieller Infektionen an einem Tier zur Verfügung gestellt, welche das Verabreichen der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die ein antimikrobielles Agens in einer Menge, die ausreichend für therapeutische Effektivität ist, umfasst.
Die mikrobiellen Infektionen können durch Mikroorganismen ausgelöst werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Pilzen, Hefen, Viren, Staphylokokken, Streptokokken, Mikrokokken, Peptokokken, Peptostreptokokken, Enterokokken, Bazillen, Clostridium, Lactobazillus, Listeria, Erysipelothrix, Propionibakterium, Eubakterium, Corynobakterium, Mycoplasmen, Ureaplasmen, Streptomyces, Haemophilus, Nesseria, Eikenellus, Moraxellus, Actinobazillus, Pasteurella, Bakteroide, Fusobakterien, Prevotella, Porphyromonas, Veillonella, Treponema, Mitsuokella, Capnocytophaga, Campylobacter, Klebsiella, Chlamydia und Koliformen.
Das antimikrobielle Agens, welches zur Behandlung der mikrobiellen Infektionen verwendet wird, kann aus der Gruppe ausgewählt sein bestehend aus Antibiotika, Bacteriocinen, Lantibiotika, Probiotika, Antipilzmittel, Antimykotika, antiparasitären Mitteln, Aminoglycosiden, Vancomycin, Rifampin, Lincomycin, Chloramphenicol und des Fluorquinol, Penicillin, beta-Lactame, Amoxicillin, Ampicillin, Azlocillin, Carbencillin, Mezlocillin, Nafcillin, Oxacillin, Piperazillin, Ticarcillin, Ceftazidim, Ceftizoxim, Ceftriaxon, Cefuroxim, Cephalexin, Cephalothin, Imipenen, Aztreonam, Gentamicin, Netilmicin, Tobramycin, Tetracycline, Sulfonamide, Niacrolide, Erythromicin, Clarithromicin, Azithromycin, Polymyxin B, Clindamycin Antibiotika sowie Kombinationen dieser.
Die Erfindung stellt ebenso die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikamentes zur syntemischen Verabreichung zur Verfügung, welche die orale Verabreichung eines therapeutischen Agens zur Behandlung von gesundheitlichen Beeinträchtigungen eines Tieres, die ferner einen geeigneten pharmazeutischen Träger umfassen kann, zur Verfügung.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann bei der Herstellung von Medikamenten oder Nahrungsmitteln verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein Verfahren zur Verbesserung der intestinalen Aufnahme beim Menschen oder Tier zur Verfügung gestellt, welches die orale Verabreichung einer physiologisch effektiven Menge eines physiologisch aktiven Agens umfasst.
Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe wie nachfolgend definiert.
Der Begriff "therapeutisches Agens" wird im allgemeinen Sinne verwendet und umfasst Behandlungsagenzien, prophylaktische Agenzien, Ersatzagenzien und mikrobielle Agenzien.
Der Begriff "allgemeines Immunsystem der Magenschleimhaut" bezieht sich auf die Tatsache, dass die Immunisierung an jeder Stelle der Magenschleimhaut eine Immunantwort an allen anderen Stellen der Magenschleimhaut hervorrufen kann.
Die Begriffe "Protein", "Peptid" und "Polypeptid" beziehen sich auf beide, die natürlich vorkommenden chemischen Einheiten und die strukturell ähnlichen bioaktiven Äquivalente, erhalten von entweder endogenen, exogenen oder synthetischen Quellen und werden unter der Bedeutung von Polymeren von Aminosäuren verknüpft über eine Verbindung des Amidtyps, bekannt als Peptidbindung, verwendet.
Der Begriff "strukturell ähnliche bioaktive Äquivalente" bedeutet ein Polypeptid mit einer Aminosäurensequenz, welche – obwohl nicht identisch mit dem natürlich vorkommenden Peptid – in der Struktur ausreichend ähnlich ist, um im Wesentlichen äquivalente therapeutische Wirkung hervorzurufen im Hinblick auf den Effekt, der von dem natürlichen Peptid selbst hervorgerufen wird.
Unter dem Begriff "therapeutisch effektive Menge" eines Medikamentes ist eine ausreichende Menge einer Verbindung gemeint, um den angestrebten therapeutischen Nutzen zu erreichen in einem vernünftigen Nutzen/Risiko-Verhältnis, anwendbar bei jeglicher medizinischer Behandlung. Es wird jedoch verstanden werden, dass die gesamte tägliche Dosis des Medikamentes und der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung durch den behandelnden Arzt unter Einbeziehung des medizinischen Beurteilungsvermögens festgelegt werden wird. Die spezifische therapeutische effektive Höhe der Dosis für jeden besonderen Patienten wird von einer Vielzahl von Faktoren einschließlich der zu behandelnden Krankheit und der Schwere der Krankheit, der Aktivität der verwendeten Verbindung, der verwendeten spezifischen Zusammensetzung, dem Alter, dem Körpergewicht, der generellen Gesundheit, dem Geschlecht und der Ernährung des Patienten, der Zeit der Verabreichung, des Verabreichungsweges und der Ausscheiderate der verabreichten spezifischen Komponente, der Dauer der Behandlung, der Arzneimittel, die in Kombination oder übereinstimmenden spezifischen Verbindungen gegeben werden und ähnlicher Faktoren, die auf dem Gebiet der Medizin bekannt sind, variieren. Beispielsweise ist es auf diesem Gebiet sehr wohl bekannt, mit geringeren Dosen als benötigt zu beginnen, um den gewünschten therapeutischen Effekt zu erreichen und die Dosis graduell zu steigern, bis der gewünschte Effekt erreicht ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt den Einfluss von ansteigendem Natriumdeoxycholat (g Natriumdeoxycholat/kg Bypass-Cocktail) auf die Gewichtszunahme der Regenbogenforelle in allen Tanks;
2 zeigt den Einfluss von ansteigendem Natriumdeoxycholat (g Natriumdeoxycholat/kg Bypass-Cocktail) auf die Gewichtszunahme der Regenbogenforelle in den außergewöhnlichen Tanks;
3 zeigt den prozentualen Anstieg des Gewichts von Bachsaiblingen in bST-supplementiertem Bypass-Cocktail mit ansteigenden Spiegeln von Natriumdeoxycholat;
4 zeigt die Gewichtszunahme von Fischen der Kontrolle und injizierten Fischen;
5 zeigt die Inhibitionskurve für gefriergetrocknetes Ovalbumin von der Oralject^TM-Formulierung;
6 zeigt die Inhibitionskurve für rote Kidneybohnen der Oralject^TM-Formulierung;
7 zeigt die Inhibitionskurve für Sojabohnen der Oralject^TM-Formulierung;
8 zeigt die Inhibitionskurve für Saubohnen der Oralject^TM-Formulierung;
9 zeigt die Inhibitionskurve für EDTA der Oralject^TM-Formulierung;
10 zeigt die Inhibitionskurve der Weizenkleie der Oralject^TM-Formulierung;
11 zeigt die Inhibitionskurve für sprühgetrocknetes Ovalbumin der Oralject^TM-Formulierung;
12 zeigt die Inhibitionskurve für kombinierte Inhaltsstoffe der Oralject^TM-Formulierung;
13 zeigt die Standardkurve für HRP in dem Plasma von Regenbogenforellen; und
14 zeigt den Effekt der Oralject^TM auf die HRP-Aufnahme.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verabreichung von therapeutischen Proteinen und Polypeptiden in oraler Dosierungsform. Die Erfindung liefert eine gesteigerte Absorption durch den Magen-Darm-Trakt und stark verbesserte Bioverfügbarkeit der Proteine/Peptide im Vergleich zu den Formulierungen aus dem Stand der Technik. Die Erfindung ist sowohl bei der humanen als auch der veterinären Ernährung, Therapie und Behandlung von Nutzen. Wie hierin und in den anhängigen Ansprüchen verwendet, umfasst der Begriff "Polypeptide" Proteine und Peptide, ebenso wie Polypeptide nach dem Schutzbereich der Erfindung fallen.
Die Verbindungen und Zusammensetzungen des Gegenstandes der Erfindung sind zur Verabreichung biologischer oder chemischer aktiver Agenzien zu vielerlei Tieren wie beispielsweise Vögeln, Fischen, Säugetieren (wie beispielsweise Primaten und insbesondere Menschen) und Insekten geeignet. Das System ist insbesondere vorteilhaft zur Verabreichung physiologischer, biologischer oder chemisch aktiver Agenzien, die sonst abgebaut oder durch Bedingungen, die vorstehend beschrieben wurden, weniger effektiv gemacht wurden, bevor das aktive Agens sein Zielgebiet (d.h. das Gebiet, in dem das aktive Agens der abgebenden Zusammensetzung freigesetzt werden soll) innerhalb des Körpers des Tieres, dem es verabreicht wird, erreicht. Insbesondere sind die Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur oralen Verabreichung aktiver Agenzien, insbesondere derer, die üblicherweise nicht oral verabreichbar sind, nützlich.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere nützlich für die Verabreichung von Polypeptiden einschließlich Proteinen, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf therapeutische Agenzien, Ernährungsprodukte, Mucopolysaccharide, Lipide, Kohlenhydrate, Steroide, Hormone, das Wachstumshormon (GH), Wachstumshormon abgebendes Hormon (growth hormone releasing hormone) (GHRH), epithelialen Wachstumsfaktor, vaskuläre endothelialem Wachstums- und Permeabilitätsfaktor (vascular endothelial growth and permeability factor (VEGPF), Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor), Cytokinen, Interleukinen, Interferonen, CMCSF, hormonähnlichem Produkt, neurologischem Faktor, neurotropem Faktor, Neurotransmitter, Neuromodulator, Enzym, Antikörper, Peptid, proteinartiges Fragment, Vaccin, Adjuvanz, ein Antigen, immunstimulierender oder -inhibierender Faktor, hämatopoietischer Faktor, Antikrebsprodukt, antiinflammatorisches Agens, antiparasitäre Verbindung, antimikrobielles Agens, Nukleinsäurefragment, Plasmid-DNA-Vektor, Zellprolieferationsinhibitor oder -aktivator, Zelldifferenzierungsfaktor, Blutgerinnungsfaktor, Immunoglobolin, antiangiogenetisches Produkt, negative selektive Marker oder "Suidzid"-Agenzien, toxische Verbindung, Antiangiogeneseagenz, Polypeptid, Antikrebsreagenz, Nukleotide und dergleichen und strukturell ähnliche bioaktive Äquivalente dieser.
In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zur oralen Verabreichung und intestinaler Freisetzung einer Nahrungsmittelkomponente oder eines therapeutischen Polypeptids, welches ausgestattet sein kann, jedoch ohne Beschränkung auf die hierin beschriebenen Produkte mit Desoxycholat und Saponinen in einem Verhältnis, um eine wesentlich verbesserte Absorption und systemische Bioverfügbarkeit des Peptides durch die Magen-Darm-Schleimhaut des Wirtes zu erhalten, zur Verfügung zu stellen. Die Zusammensetzung umfasst ebenfalls ein pH-neutralisierendes Agens; wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf Natriumcarbonat und Calciumcarbonat und zumindest einen Inhibitor für Verdauungsenzyme, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf Eialbumin. Diese Zusammensetzung ist bevorzugt fest, so dass sie einfach bei der Formulierung oraler Zusammensetzungsformen zu handhaben ist. Die Neutralisierung des pH ist in erster Linie deshalb angestrebt, um den pH in dem Verdauungstrakt auf das Säure-Base-Gleichgewicht, verglichen mit den meisten bekannten aktiven biologischen natürlichen oder synthetischen Produkten herzustellen. Der pH des Verdauungstraktes wird auf Werte zwischen 6,5 und 9 angehoben.
Es sollte selbstverständlich sein, dass die vorstehende Arzneimittel-Liste lediglich zu illustrativen Zwecken dient und nicht als eine alles umfassende Liste aller Arzneimittel, die unter Verwendung der oralen Verabreichungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nützlich zusammengesetzt oder neu zusammengesetzt sein können. Weitere physiologisch aktive Verbindungen, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein können, umfassen biologisch aktive Verbindungen wie beispielsweise Proteine, Enzyme, Anti-Enzyme, Peptide, Catecholamine, Antihistamine, Schmerzmittel und dergleichen. Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung wird "biologisch" derart definiert, dass er jegliche Ernährungs- oder medizinisch nützliche Zusammensetzung, abgeleitet aus einer biologischen Quelle und/oder eines synthetisch pharmakologischen Äquivalents daraus wie beispielsweise Insulin, Häm, Heoglobin (bovines, humanes oder synthetisches) und Hormone, bedeutet; "Enzyme" oder "Enzymsystem" ist definiert als jegliches Protein oder Proteinkonjugat, welches biologisch oder synthetisch hergestellt ist und das als Biokatalysator fungiert, zu bedeuten. Weitere medizinisch nützliche Zusammensetzungen, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise Globulin, eines oder mehrere Glycoproteine wie beispielsweise Erythropoeitin, können ebenso in die erfindungsgemäße Zusammensetzung eingeschlossen sein.
Die Menge des therapeutischen Polypeptides kann in Abhängigkeit von verschiedenartigen Faktoren wie beispielsweise in Abhängigkeit des zur Verfügung gestellten Peptids, der zu behandelnden Krankheit, dem jeweiligen Patienten und dergleichen in weiten Schranken variieren. Die Menge wird eine therapeutisch wirksame Menge sein, worunter zu verstehen ist, dass die Menge einen therapeutischen Effekt liefern wird, was mit Hilfe der in der Medizin etablierten Methoden untersucht werden kann.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung enterischer Beschichtungen, die für Tabletten und Kapseln verfügbar sind. Enterische Beschichtungen werden in dem Magen intakt bleiben, werden sich aber schnell auflösen, nachdem sie in dem Dünndarm angelangt sind, woraufhin sie den Wirkstoff an Stellen stromabwärts des Dünndarmes (beispielsweise dem Krummdarm und Dickdarm) freisetzen. Enterische Beschichtungen sind dem Fachmann gut bekannt. Alternativ kann eine orale Verabreichungskapsel, die den Wirkstoff kontrolliert freisetzt hergestellt werden, um den Wirkstoff nach einer vorbestimmten Zeitdauer freizusetzen und somit, nachdem die Kapsel in den Krummdarm oder Dickdarm eingedrungen ist, kann diese verwendet werden, um die Formulierung der vorliegenden Erfindung dort freizusetzen. Derartige Kapseln umfassen das CHRONSET^TM-Freisetzungshilfsmittel (ALZA Corporation, Palo Alto, Californien) und das Pulsincap^TM-Freisetzungshilfsmittel (R.P. Scherer Co.).
Die Zusammensetzung kann weiterhin ein Ionenpaar bildendes Reagenz umfassen, wobei das molare Verhältnis des Ionenpaar bildenden Reagenzes zu dem Wirkstoff von etwa 2 : 1 bis etwa 10 : 1 reicht. Das Ionenpaar bildende Reagenz wird deshalb hinzugegeben, um die Lipophilie des gelösten physiologischen aktiven Agens oder des Wirkstoffes zu steigern und dadurch dessen Membranpermeabilität zu verbessern. Die Verbesserung der Lipophilie des Wirkstoffes kann ebenfalls einen gewissen Schutz des Wirkstoffes vor enzymatischer Deaktivierung ebenso wie vor Abbau des Peptides, der in vivo in der wässrigen Umgebung des Magen-Darm-Traktes vorkommt, liefern. Typische Ionenpaar bildende Reagenzien umfassen Natriumdecansulfonat, Natriumlaurylsulfonat und Natriumbenzoat.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Zusammensetzung optional von etwa 1% bis etwa 5% bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung eines Darmschleimhautmembran-transportverbessernden Agens, Deoxycholat enthalten. Derartige Agenzien fördern die Absorption des therapeutischen Agens über das Darmgewebe in die intestinale Mukosa und direkt in den Blutstrom des Probanden. Ebenso können Gewebetransport-verbessernde Agenzien nützlich für die Verwendung der vorliegenden Zusammensetzung sein. Diese sind ausgewählt aus essentiellen oder flüchtigen Ölen oder aus nicht-toxischen, pharmazeutisch anwendbaren organischen oder anorganischen Säuren oder Salzen und Estern dieser. Essentielle oder flüchtige Öle, die in der Zusammensetzung verwendet werden können, sind ausgewählt aus Sojabohnenöl, Saubohnenöl, Reisöl, Fischöl. Das bevorzugte essentielle Öl ist Fischöl.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Zusammensetzung zusätzlich Agenzien wie beispielsweise Konservierungsmittel und Antioxidantien enthalten. Typische Konservierungsmittel umfassen Natriumbenzoat, Sorbinsäure und die Methyl- und Propylester von para-Hydroxybenzoesäure (Parabene). Charakteristische Antioxidantien umfassen butylierte Hydroxyanisole, butylierte Hydroxytoluole, Nordihydroguaiaretinsäure, die Gallate wie beispielsweise Propylgallat, Hydrochinon, Propylethylmethylguaethol und Alkylthiopropionate oder wasserlösliche Agenzien wie beispielsweise Alkanolamine, Alkohole und Propylenglykol. Das am meisten bevorzugt Antixodans ist Tenox^TM GT1 (1:1 Vitamin E-Sojabohnenöl), vorliegend in einer Konzentration zwischen etwa 5 % bis etwa 25 % bezogen auf das Gesamtvolumen des Tröpfchens.
Die orale Absorption von rekombinantem humanem GH durch den Karpfen ist um etwa das 1000-fache erhöht, wenn dieses gemeinsam mit Deoxycholat gegeben wird.
Um die pharmazeutische Formulierung der vorliegenden Erfindung herzustellen, werden die Bestandteile im trockenen Zustand gemeinsam gemischt, woran anschließend die kleine Menge des Öles hinzugefügt wird. Diese Verbindungen werden gemeinsam gemischt, bis eine homogene Mischung der Bestandteile daraus resultiert. Die daraus resultierende Feststoffformulierung kann in Tabletten gepresst werden und diese mit einer geeigneten enterischen Beschichtung versehen werden. Alternativ kann die Feststoffformulierung in einer Kapsel, gebildet aus Gelatine oder dergleichen und beschichtet mit einer enterischen Verbindung oder in einem Freisetzungshilfsmittel zur kontrollierten Freisetzung, wie beispielsweise dem CHRONSET^TM platziert werden. Die Feststoffformulierung stellt ein Hilfsmittel zur leichten und einfachen Herstellung einer Dosierungsform dar.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Zusammensetzung:

Wirkstoff	5 mg/ml
Eialbumin	10–20 %
Natriumcarbonat	10–20 %
Calciumcarbonat	10–20 %
EDTA	1–10 %
Sojabohnen	5–10 %
Saubohnen	5–10 %
Reishülsen	5–10 %
Deoxycholat	1–5 %
Fischöl	5–10 %
Bierhefe	1–5 %

Eine Ausführungsform der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Freisetzung von Hormonen und Pharmazeutika an einem tierischen oder menschlichen Wirt zur Verfügung zu stellen.
Auf dem Gebiet der Viehzucht hat sich die Produktion von verschiedenen Spezies von Fischen als besonders bedeutend herausgestellt. Die Kontrolle der Reproduktionsphysiologie ist von besonderer Bedeutung. Der erste Anhaltspunkt der Erfindung zur Manipulation der Fischreproduktion durch das Füttern bioaktiven Materials wurde von Studien geliefert, die sich mit Säugetieren und amphibischen Hypophysen beschäftigten. Demnach wurde beobachtet, dass der diätetische Ersatz oder die Ergänzung mit Hypophysenpräparationen die Hochzeitsfärbung des teilweise geschlechtsreifen Bitterlings Acheilognathus inter-medeium einleitet, und den Eidurchmesser der Schmerle Misgurnus anguillicaudatus erhöht, was zur Ovulation und einer Verkürzung des Brutintervalles um 10 bis 15 Tage bei dem Schwertträger Xiphophorus helleri führt und zu einer Vergrößerung der Eigröße und einer Induzierung früherer Geschlechtsreife bei weiblichen Seeforellen Salvelinus fontinalis führt. In ähnlicher Weise induzierte die orale Verabreichung von Lachs-Hypophysenextrakt an dem Goldfisch C. auratus die Ovulation und gesteigerte Spermeation. Die Bedeutung dieser Daten betrifft die begleitende Erhöhung von Gonadotropin (sGtH) im Plasma von Lachsen, Testosteron und 17α-20fi-Diphydroxy-4-pregnan-3-on, die eine wahrscheinliche endokrin basierende Erklärung für die beobachteten Effekte von weiteren Hypophysenpräparationen während früherer Untersuchungen (d.h. die Aufnahme von GtH) liefern.
Aufgrund der Probleme, welche der Verwendung von Hypophysenpräparationen und teilweise gereinigten Hormonen anhaften, würde es unwahrscheinlich erscheinen, dass derartige Präparationen im Hinblick auf die Kontrolle der Reproduktion bei der Viehzucht unter Verwendung des oralen Weges einen großen Nutzen bieten, so lange diese nicht in einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung formuliert sind. Eine relativ neue Innovation bei der Kontrolle der Reifung war die Applikation des Gonadotropin-Freisetzungshormons. Viele der analogen Formen des GnRH sind 50–100 mal effektiver bei der Auslösung der Ovulation als die natürlichen Formen und umfassen diese, welche D-Aminosäuren enthalten und haben terminale Enden, die mit Ethylamid substituiert sind. Diese Manipulationen haben den Effekt, dass sie den Widerstand des Moleküls gegenüber der Proteolyse erhöhen. GnRHs stimulieren die natürliche Freisetzung des GtH, weisen eine Wirksamkeit in vielen Spezies auf, sind vergleichsweise einfach herzustellen und aus diesen Gründen ökonomisch. Darüber hinaus sind diese Peptide über einen weiten Temperaturbereich stabil und zeigen eine nicht variierende Wirksamkeit. Bedeutsamerweise sind diese Peptide für eine undefinierte Zeitperiode stabil, vorausgesetzt diese werden unter sterilen Bedingungen bei Temperaturen unterhalb von –20% gelagert. Als solche stellen GnRHAs exzellente Kandidaten-Moleküle für die Verwendung bei dem oralen Ansatz zur Kontrolle der Reproduktion dar. Tatsächlich wurden ausreichend experimentelle Beweise gesammelt, so dass die diätetische Freisetzung von GnRHAs mit oder ohne Dopamin-Agonisten mittlerweile als ein Verfahren zur Kontrolle der letzten Stadien der Reifung von Fischen angesehen wird. Obwohl sie teurer als traditionelle Verfahren (Injektion, Implantation) ist, liefert die diätetische Verabreichung den Vorteil, stressfrei zu sein. Dieser Vorteil bei der reproduktiven Biotechnologie ist besonders für Spezies, die verwundbar bei der Handhabung und/oder zu klein für eine sichere Injektion (d.h. bei zur Zierde gehaltenen Arten), besonders nützlich. Zusätzlich liefert die chronische Behandlung mit GnRHAs Hilfsmittel, um die frühere Reife einzuleiten, was bei der Herstellung von Rogen als vorteilhaft angesehen wird, oder zur Verwendung mit Zuchtbecken zur Geschlechtsänderung geeignet ist.
Ebenso wie die Kontrolle der Reproduktion liefern Studien unter Verwendung von Hypophysen als Nahrungsergänzungsmittel einen frühen Hinweis auf die Möglichkeit der Manipulation des Wachstums von Knochenfischen unter Verwendung von oralen Verabreichungstechniken. Daher wurde untersucht, dass die Fütterung von Guppys Lebistes reticulatus mit einem Puder des Hypophysenvorderlappens zu einem signifikant gesteigerten Wachstumsverhalten im Vergleich zu den Kontrollen führte. Ebenso wurde ein 50%iger Anstieg der Länge, was bei den Schwertträgern, die ausschließlich mit getrockneten Hypophysenvorderlappen von Geburt an gefüttert wurden, beobachtet, während weitere Experimente eine Verdoppelung des Gewichtes und eine Verdreifachung in der Länge von Seeforellen, die 2 × wöchentlich mit Hypophysenvorderlappen gefüttert wurden, zeigten. Die Behandlung von kultivierten Knochenfischen mit dem Wachstumshormon (GH) und verwandten Peptiden liefert eine Vielzahl von potentiellen Vorteilen, und verschiedene Studien haben bestätigt, dass oral verabreichtes GH nicht nur in den Blutstrom eintritt, sondern auch die Wachstumsrate der Fische steigert. Der Nachschub von rekombinantem GH ist derzeit stabil und die Produktion könnte bei gesteigerter Nachfrage um ein Vielfaches gesteigert werden. Darüber hinaus sind derartige rekombinante Proteine kosteneffektiv, wenn sie im industriellen Maßstab hergestellt werden und können leicht in kommerzielle Nahrungsmittel eingearbeitet werden. Während die strukturelle Integrität des GH-Moleküls als Precursor für post-translational modifizierte Formen von Bedeutung sein kann, so können Verfahren zur Verbesserung der strukturellen Integrität des Moleküls oder Wirksamkeit einen Nutzen aus Sicht der oralen Verabreichungsmethode liefern. Die Beschreibung von wachstumsfördernden Fragmenten des GH-Moleküls kann ebenso Produkte zur Verfügung stellen, die eine größere Stabilität gegenüber dem luminalen Abbau aufweisen.
Eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen und die Verwendung, die es erlaubt, den oralen Weg zur Impfung, was den signifikanten Vorteil mit sich bringt, dadurch, dass es Laborkosten reduziert, zeitsparend ist, die Möglichkeiten der Cross-Kontamination mit Nadeln einschränkt und dadurch, dass es keine aufwendige Handhabung oder Entsorgung oder Behandlungsflüssigkeiten bedarf.
Der in erster Linie bestimmende Faktor der spezifischen Immunität der Darmoberfläche ist das sektorische IgA (S-IgA), welches physiologisch und funktionell unterschiedlich von den Komponenten des Immunsystems des Blutkreislaufes ist. S-IgA-Antikörper-Antworten können lokal durch die Applikation von geeigneten Immunogenen an einer besonderen Stelle des Darmes eingeleitet werden. Der Großteil der mukosalen S-IgA-Antwort resultiert jedoch in der Immunität, die über das gemeinsame mukosale Immunsystem (CMIS) generiert wird, indem Immunogene von spezialisierten lympho-epithelialen Strukturen, allgemein bekannt als Mukosa-assoziiertes Lymphgewebe (MALT), aufgenommen werden. Die besten immunologischen lympho-epithelialen Strukturen sind das Darm-assoziierte Lymphgewebe (GALT) wie beispielsweise die intestinalen Peyer'schen Platten. Andere strukturell und funktionell ähnliche Lymphoidfolikel kommen an anderen mukosalen Oberflächen vor, einschließlich denen des Verdauungstraktes.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Wirt durch orale Verabreichung von bakteriellen Protein-Immunogenen, bevorzugt gemischt mit einem Adjuvanz wie beispielsweise Choleratoxin (CT) immunisiert werden. Selbstverständlich ist das Adjuvanz, die Menge an Choleratoxin, welches verwendet wird, nicht giftig für den Wirt.
Die Fähigkeit eines Impfstoffes, um gegenüber mikrobieller Besiedelung zu schützen, wird hierdurch zur Verfügung gestellt und bedeutet, dass die aktive Komponente gegen eine Krankheit nicht nur in dem immunisierten Wirt, sondern durch Eliminierung der Übertragung zwischen immunisierten Individuen, schützt und das Pathogen und somit jegliche Krankheit, die es hervorruft, von der gesamten Population eliminiert wird.
Die orale Verabreichung kann ebenso Vergiftungen, welche von der Verabreichung von Mikroben herrühren, verhindern, so dass die Impfung gegen beides – mikrobielle Besiedlung und Sepsis – (systemische Infektion) schützen kann.
Beispielsweise ist PspA ein bevorzugtes Antigen für pneumokokkale Infektionen. In der veröffentlichten internationalen Patentanmeldung WO 92/14488, deren gesamter Inhalt durch Bezugnahme hier mit eingebracht ist, sind DNA-Sequenzen für das PspA-Gen von S. pneumoniae R×1, die Herstellung einer verkürzten Form von PspA mittels Gentechnik und der Nachweis, dass derartig verkürzte Formen von PspA-Mäusen, die mit lebenden Pneumokokken in Kontakt gebracht wurden, Schutz verleiht, beschrieben.
Von den Sequenzen des PspA-Gens wurde gezeigt, dass PspA-Proteine von variabler Größe sind (in etwa 70 kDa). Die C-terminalen 37% des Moleküls sind größtenteils aus den 20 Aminosäuren-repeats zusammengesetzt, die eine Bindestelle ausbilden, die es dem PspA erlaubt, an die Phosphocholinreste der Lipoteichonsäuren des Pneumokokkos zu binden. Der zentrale Bereich des PspA ist reich an Prolinen und ist mutmaßlich der Teil des Moleküls, der durch die Zellwand hindurchgelangt. Die Sequenz der N-terminalen 80% des Moleküls ist größtenteils beta-helical und enthält die Region des PspA, die Antikörper, die schützend gegenüber der Sepsis sind, auslösen kann. Obwohl PspAs allgemein zumindest leicht voneinander verschieden sind, gibt es ausreichende Querreaktivität untereinander, so dass Antikörper oder eine immunologische Antwort gegenüber einem PspA wirksam gegenüber den PspAs aller Pneumokokken sind. Darüber hinaus kann die Immunisierung mit einem PspA entweder gegen den Tod oder eine Verzögerung des Todes mit nahezu allen unterschiedlichen Erregerstämmen führen. Entsprechend kann eine Mischung einer geringen Anzahl von PspAs eine wirksame Immunität gegen die meisten Pneumokokken liefern.
Die immunprotektiven verkürzten PspAs, die in der WO 92/14488 beschrieben sind, können in der vorliegenden Erfindung als die vorstehend beschriebenen PspA-Fragmente zur oralen Verabreichung verwendet werden.
Unterschiedliche Vektorsysteme für in vitro und in vivo-Expression von rekombinanten Proteinen sind bekannt, beispielsweise bakterielle Systeme wie zum Beispiel E. Coli und Virussysteme, wie beispielsweise bakterielle Viren, Poxyviren (Vaccinen, Avipoxviren, beispielsweise Canarypox Virus, Fowlpox Virus), Baculovirus, Herpesvirus; Hefen und dergleichen und diese Systeme können verwendet werden, um rekombinantes PspA unter Verwendung der kodierenden Gene dieser herzustellen.
Die Immunogenität könnte verbessert werden, wenn das Antigen gemeinsam mit einem Zusatz verabreicht wird, allgemein verwendet als 0,001 %ige bis 50 %ige Lösung in phosphatgepufferter Salzlösung. Die Adjuvanzien verbessern die Immunogenität des Antigens, sind jedoch nicht selbst notwendigerweise immunogen. Adjuvanzien können dadurch wirken, indem sie das Antigen näher an die Stelle der Verabreichung bringen, um einen Depoteffekt zu erreichen, wodurch eine langsame, konstante Freisetzung des Antigens zu Zellen des Immunsystems zustande kommt. Adjuvanzien können ebenso Zellen des Immunsystems an ein Antigen-Depot anlocken und derartige Zellen zur Auslösung der Immun-Antwort stimulieren.
Immunostimulierende Agenzien oder Adjuvanzien wurden seit vielen Jahren verwendet, um die Immunantwort des Wirtes beispielsweise bei Impfungen zu verbessern. Intrinsische Hilfsstoffe, wie beispielsweise Lipopolysaccharide, sind normalerweise Verbindungen von abgetöteten oder abgeschwächten Bakterien, die als Impfstoffe verwendet werden. Extrinsische Hilfsstoffe sind Immunomodulatoren, die typischerweise nicht kovalent mit dem Antigen verknüpft sind und derart formuliert sind, um die Immunantwort des Wirtes zu verbessern. Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphate (allgemein bekannt als Alum) sind routinemäßig verwendete Hilfsstoffe bei menschlichen und tierischen Impfstoffen. Die Effizienz von Alum bei der Steigerung der Antikörperantwort gegenüber Diphterie- und Tetanustoxinen ist gut bekannt, und erst kürzlich wurde ein HBsAg-Impfstoff mit Alum unterstützt.
Ein weites Spektrum an extrinsischen Adjuvanzien kann eine starke Immunantwort gegenüber Antigenen auslösen. Diese umfassen Saponine, die an Membranprotein Antigene komplexiert sind (immunstimulierende Komplexe), Pluronic Polymere mit Mineralöl, getöteten Bakterien in Mineralöl, Freund's vollständige Hilfsstoffe, bakterielle Produkte, wie beispielsweise Muramyldipeptid (MDP) und Lipopolysaccharid (LPS), ebenso wie Lipid A und Liposomen. Um die humorale Immunantwort (HIR) und die zellvermittelte Immunität (CMI) effizient einzuleiten, werden Immunogene bevorzugt in Adjuvanzien emulgiert.
Zusammensetzungen der Erfindung, besonders zu oralen Verabreichung, könnnen bequem als wässrige Präparationen zur Verfügung gestellt werden, beispielsweise als isotonische wässrige Lösungen, Suspensionen, Emulsionen oder zähflüssige Zusammensetzungen, die auf einen ausgewählten pH-Wert gepuffert sein können. Jedoch, da die Freisetzung in dem Verdauungstrakt bevorzugt ist, kann die Zusammensetzung der Erfindung in einer festen Form von Pillen, Tabletten, Kapseln, Caplets und dergleichen, einschließlich fester Präparate mit Retardzeit oder eine flüssige Füllung, beispielsweise Gelatine umschlossene Flüssigkeit in Retardform, wobei die Gelatine im Magen und/oder Dünndarm zur Freisetzung in den Darm und/oder das Verdauungssystem gelöst wird, vorliegen.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann ebenfalls pharmazeutisch annehmbare Aromastoffe und/oder Färbemittel enthalten, um diese attraktiver zu machen. Die viskosen Zusammensetzungen können in Form von Gelen, Lotionen, Salben, Cremes und dergleichen sein und werden typischerweise eine ausreichende Menge eines Verdickungsmittels enthalten, so dass die Viskosität zwischen etwa 2.500 bis 6.500 cps, wenngleich bei viskoseren Zusammensetzungen sogar bis zu 10.000 cps verwendet werden können. Viskose Zusammensetzungen haben eine bevorzugte Viskosität von 2.500 bis 5.000 cps, da sie im Bereich darüber schwieriger zu verabreichen sind. Jedoch können die Zusammensetzungen im Bereich darüber feste oder gelatineartige Formen annehmen, die dann leicht als eine geschluckte Pille zur oralen Aufnahme verabreicht werden können.
Flüssige Präparate sind normalerweise leichter herzustellen als Gele und andere viskose Zusammensetzungen und feste Zusammensetzungen. Zusätzlich sind flüssige Zusammensetzungen in gewisser Weise leichter zu verabreichen, insbesondere an Tiere, Kinder, insbesondere Kleinkinder und andere, die Probleme haben könnten, eine Pille, Tablette, Kapsel oder dergleichen zu schlucken oder in Fällen von Mehrfachdosierungen. Viskose Zusammensetzungen können andererseits innerhalb eines geeigneten Viskositätsbereiches formuliert sein, um längere Kontaktdauern mit der Magenschleimhaut, ebenso mit der Auskleidung des Magens oder Dünndarmes zu erreichen.
Geeignete nicht-toxische pharmazeutisch annehmbare Träger und speziell orale Träger sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Pharmazie und besonders oraler oder peroraler pharmazeutischer Formulierungen bekannt. Offensichtlich wird die Auswahl der geeigneten Träger von der exakten Natur der besonderen Dosierungsform abhängen, beispielsweise der flüssigen Dosierungsform (zum Beispiel wenn die Zusammensetzung in einer Lösung, einer Suspension, einem Gel oder in einer anderen Flüssigkeit formuliert ist oder einer festen Dosierungsform, oder beispielsweise wenn die Zusammensetzung in einer Pille, Tablette, Kapsel, Caplet, Retardform oder flüssigkeitsgefüllten Form formuliert ist).
Lösungen, Suspensionen und Gele enthalten normalerweise eine Hauptmenge an Wasser (bevorzugt gereinigtes Wasser) zusätzlich zu dem Antigen. Kleinere Mengen von anderen Inhaltsstoffen wie beispielsweise pH-entstellenden Mitteln (beispielsweise eine Base wie z.B. NaOH), Emulgatoren oder dispergierende Agenzien, puffernde Agenzien, Konservierungsmittel, Netzmittel, Geliermittel (beispielsweise Methylcellulose), Färbemittel und/oder Aromastoffe können anwesend sein. Die Zusammensetzungen können isotonisch sein, das heisst diese können den gleichen osmotischen Druck wie Blut und Tränenflüssigkeit haben.
Die angestrebte Isotonie der Zusammensetzung dieser Erfindung kann durch die Verwendung von Natriumchlorid oder anderer pharmazeutisch annehmbare Agenzien wie beispielsweise Dextrose, Borsäure, Natriumtartrat, Propylenglykol oder andere anorganische oder organisch lösliche Substanzen eingestellt werden. Natriumchlorid ist besonders bevorzugt für Puffer, die Natriumionen enthalten.
Die Viskosität der Zusammensetzungen kann auf der ausgewählten Höhe aufrechterhalten werden unter Verwendung eines pharmazeutisch annehmbaren Verdickungsmittels. Methylcellulose ist bevorzugt, da sie leicht erhältlich ist und mit ihr leicht umzugehen ist. Andere geeignete Verdickungsmittel umfassen beispielsweise Xanthan, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carbomer und dergleichen. Die bevorzugte Konzentration des Verdickungsmittels wird von dem ausgewählten Agens abhängen. Der wichtige Punkt hierbei ist, eine Menge zu verwenden, die die ausgewählte Viskosität erreichen lässt. Viskose Zusammensetzungen werden normalerweise aus Lösungen durch Zugabe derartiger Verdickungsmittel hergestellt.
Ein pharmazeutisch annehmbares Konservierungsmittel kann verwendet werden, um die Haltbarkeit der Zusammensetzung zu erhöhen. Benzylalkohol kann geeignet sein, obwohl eine Vielzahl von Konservierungsmitteln einschließlich beispielsweise Paraben, Thimerosal, Chlorbutanol oder Benzalkoniumchlorid ebenfalls verwendet werden können. Eine geeignete Konzentration des Konservierungsmittels wird von 0,02 Gew.-% bis 2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht sein, obwohl es beträchtliche Abweichungen in Abhängigkeit des ausgewählten Agens geben kann.
Die Fachleute werden erkennen, dass die Verbindungen der Zusammensetzung derart ausgewählt sein müssen, so dass sie chemisch inert hinsichtlich mikrobieller Antigene sind. Dies wird für die Fachleute auf dem chemischen und pharmazeutischen Gebiet kein Problem darstellen oder das Problem kann in einfacher Weise durch Bezugnahme auf Standardtests oder durch einfache Experimente (ohne Einbeziehung nicht durchgeführter Experimente) aufgrund dieser Beschreibung vermieden werden.
Die immunologisch wirkungsvollen Zusammensetzungen dieser Erfindung werden durch Mischung der Bestandteile mit nachfolgenden allgemein akzeptierten Verfahrensschritten hergestellt. Beispielsweise können die ausgewählten Verbindungen einfach in einem Mischer oder in einem Standardhilfsmittel, um konzentrierte Mischungen herzustellen, gemischt werden, die daraufhin auf ihre endgültige Konzentration und Viskosität durch die Zugabe von Wasser oder Verdickungsmitteln und möglicherweise eines Puffers, um den pH einzustellen oder einen zusätzlichen gelösten Stoff, um die Tonizität kontrollieren zu können. Im Allgemeinen kann der pH-Wert von etwa 3 bis 7,5 betragen. Die Zusammensetzungen können dann in Dosierungen und mittels Techniken, die der Fachmann auf dem Gebiet der Medizin und Veterinärmedizin in Betracht zieht, wie beispielsweise Faktoren wie Alter, Geschlecht, Gewicht und Zustand des besonderen Patienten oder Tieres und der Zusammensetzungsform, die zur Verabreichung verwendet wird (beispielsweise fest gegenüber löslich), verabreicht werden. Die Dosierungen für Menschen oder andere Säugetiere können ohne aufwendige Experimente durch den Fachmann bestimmt werden.
Wenn CT als ein Hilfsstoff zur oralen Immunisierung verwendet wird, so werden spezifische IgA Antikörper in Sekreten induziert. Starke Immunantworten in dem Kreislauf können ebenso mit IgG und IgA Antikörpern in dem Serum und IgG und IgA Antikörper-sekretierenden Zellen in der Milz induziert werden. Die Kreislauf- (oder systemische) Immunantwort, ausgelöst durch orale (peroral; intragastral) Verabreichung von mikrobiellen Antigenen, gemeinsam mit CT, sind vergleichbar mit oder sogar stärker als jene, die durch die Verabreichung von ähnlichen Immunogenen über den Magen-Darm-Trakt verabreicht wurden. Demgemäß erscheint es, dass die orale Immunisierung ein effektiver Weg zur Auslösung der allgemeinen mukosalen Immunantwort ebenso wie der Antikörperantwort des Kreislaufsystems ist und dass diese weniger Antigen als andere Immunisierungswege benötigt.
Die meisten löslichen oder nicht-replizierenden Antigene sind schlechte Immunogene, insbesondere über den peroralen Weg, wahrscheinlich, weil sie über Verdauungsenzyme abgebaut werden und wenig oder kein Tropismus für die GALT aufweisen. Eine bemerkenswerte Ausnahme ist CT, welches ein starkes mukosales Immunogen ist, wahrscheinlich wegen der G.sub.M1 Gangliosid-Bindeeigenschaft dieser Binde- Untereinheit, CTB, welches es ihm ermöglicht, von den M-Zellen der Peyer'schen Platten aufgenommen zu werden und zu den darunterliegenden immunokompetenten Zellen zu gelangen. Zusätzlich ein gutes mukosales Immunogen zu sein, ist CT ein wirkungsvoller Hilfsstoff wenn es in Mikrogramm-Dosen verabreicht wird, verstärkt CT wesentlich die Immnunogenität von anderen löslichen Antigenen, mit denen es gemeinsam verabreicht wurde.
Gemäß einer Ausführungsform und gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krankheiten oder Funktionsstörungen eines Wirtes durch Zurverfügungstellen eines therapeutischen Agens für den Wirt nach oraler Verabreichung zur Verfügung gestellt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfassen Krebszellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, bösartige Tumore. Bösartige Tumore (einschließlich primärer Tumore und Metastasen), die behandelt werden können, sind jedoch nicht beschränkt auf derartige, die in der Nebenniere, der Blase, den Knochen, der Brust, der Gebärmutter, den endokrinen Drüsen (einschließlich der Schilddrüse, der Hypophyse und dem Pankreas), Darm, Mastdarm, Herz, hematopoietischem Gewebe, Niere, Leber, Lunge, Muskel, Nervensystem, Gehirn, Auge, Mundhöhle, Rachen, Kehlkopf, Eierstöcke, Prostata, Haut (einschließlich Melanome), Hoden, Thymus und Uterus vorkommen. Es sollte jedoch verstanden werden, dass der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung nicht auf die Behandlung eines dieser besonderen Tumore beschränkt ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Agens, das geeignet ist, die Krebszellen nach der Verabreichung eines solchen Agens zu inhibieren, verhindern oder zu zerstören, ein negativer Selektionsmarker, beispielsweise ein Material, welches in Kombination mit einem Chemotherapeutikum oder interagierenden Agens das Wachstum der Krebstumorzellen inhibiert, verhindert oder diese zerstört.
Damit wird aufgrund der systemischen Zurverfügungstellung des negativen Selektionsmarkers ein interagierendes Agens dem tierischen oder menschlichen Wirt verabreicht. Das interagierende Agens interagiert mit dem negativen Selektionsmarker, um das Wachstum der Krebszellen zu verhindern, inhibieren oder diese zu zerstören. Negative Selektionsmarker, welche beispielsweise verwendet werden können, sind jedoch nicht beschränkt auf Thymidinkinase und Cytosindeaminase.
Das interagierende Agens wird in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist, um das Wachstum der Krebszellen zu inhibieren, verhindern oder zu zerstören. Beispielsweise kann das interagierende Agens in einer Menge von 5 mg bis 15 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt etwa 10 mg/kg, in Abhängigkeit der Gesamttoxizität einem Patienten verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die dargestellt sind, um die Erfindung zu illustrieren und nicht um den Schutzbereich einzuschränken, leichter verstanden werden.
BEISPIEL 1
Wachstumsbeschleunigung von Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) und Bachforellen (Salvelinus fontinalis): Fütterung des rekombinanten bovinen Wachstumshormons unter Verwendung eines neuartigen Abgabesystems
Die Aquakuitur-Industrie ist weltweit während der vergangenen zwei Jahrzehnte stark gewachsen und repräsentiert zum jetzigen Zeitpunkt das am schnellsten wachsende agrarwirtschaftliche Segment. Der Sektor ist mit einer jährlichen Wachstumsrate von 10,9 seit 1984 im Vergleich mit 3,1 für die Landtierhaltung zur Fleischproduktion gewachsen. Der am schnellsten wachsende Tierzuchtsektor über die gleiche Zeitperiode war die Hühnerfleischproduktion mit einer APR von 5,3, gefolgt von Schweinefleisch 3,4, Hammel und Lanzen 1,4 und Rind und Kalb mit 0,9. Der Beitrag der Aquakulturen zur gesamten weltweiten Fischanlandung hat sich seit 1984 mehr als verzweifacht von 11,5 Gew.-% auf 25,6 Gew.-% in 1995. Die projektierte gesteigerte Nachfrage für Meeresprodukte, gekoppelt an sinkende Fischereianlandungen von wilden Beständen, hat und wird weiterhin zu dem Wachsen der Aquakultur-Industrie beitragen.
Die Aquakultur-Industrie, wie andere Sektoren der Landwirtschaft, stellt sich vielen der Produktionsherausforderungen, welche mit der traditionellen Viehzucht assoziiert sind. 40 bis 50 % der Kosten der Lachsproduktion wird der Fütterung zugeschrieben. Die Rationen enthalten einen hohen Prozentsatz an teurem Fischprotein und die Lachse benötigen eine vergleichsweise lange Fütterungsperiode, um ihr Marktgewicht zu erreichen. In schnell wachsenden Fischen ist eine übermäßige Fettablagerung gegenüber beiden, den Herstellern und den Konsumenten, in Betracht zu ziehen.
Das Ziel der tierischen Nahrungsmittelindustrie ist es, die Produktionseffizienz zu optimieren durch Minimierung des Inputs an Futter, Arbeit und investiertem Kapital, während die Ausbeute von hochqualitativem Protein maximiert wird. In der Vergangenheit wurden die wirtschaftlich bedeutenden Parameter durch genetische Selektion oder Nahrungsmodifikation verändert. Vor noch kürzerer Zeit wurde eine Vielzahl von Ansätzen verfolgt einschließlich Manipulationen an dem endokrinen System, um das Wachstum und die Körperzusammensetzung der domestizierten Tiere zu beeinflussen. Die Möglichkeit von exogenen Verbindungen, erfolgreich das Wachstumsverhalten von domestizierten Tieren zu verändern und die Möglichkeit der Einsparung an Produktionskosten haben Nachforschungen bei der Verwendung dieser Agenzien am Fisch aufkommen lassen.
Die Verabreichung des Wachstumshormons (GH), erhalten von verschiedenartigen Quellen, hat den Beweis erbracht, dass dieses Hormon eine Schlüsselrolle bei der Stimulation des somatischen Wachstums und bei der Reduktion der Fettablagerung im Fisch bewirkt. Beide, natives und rekombinantes Fisch GH wurde verschiedenen Spezies an Fischen verabreicht und diese sind gleichwirkend, wenn sie in gesunde Lachse injiziert werden. Ebenso ist berichtet worden, dass GH abgeleitet von Säugetier- und Geflügelquellen effektiv bei der Veränderung des Wachstumsverhaltens von jugendlichen Lachsen ist. Die Verabreichung von bovinem GH (bGH) an Lachse führt zu einem 2 bis 3-fachen Anstieg der Wachstumsrate, einer Steigerung des Appetits und der Fütterungseffektivität und einer Reduktion an Fettgewebe. Exogenes GH ist ebenso wirkungsvoll in älteren (subadulten) Fischen und bei geringeren Wassertemperaturen, wenn die Wachstumsrate gering ist.
Die orale Verabreichung von GH ist eine praktische Methode und hat histochemische und biologische Beweise für einen Mechanismus, der intakte Proteine in den Blutkreislauf von Knochenfischen infolge oraler Verabreichung transportiert, geliefert. Es wurde nun gezeigt, dass oral verabreichte Meerrettich-Peroxidase innerhalb 1 Stunde in den Blutkreislauf transportiert wird.
Es wird berichtet, dass der Transfer des bGH in das Kreislaufsystem von Jährlings-Regenbogenforellen infolge der Einführung des Hormons in das Lumen des Verdauungstraktes geschieht. In gleicher Weise ist gezeigt worden, dass oral verabreichtes rekombinantes Lachs-Wachstumshormon (rsGH) signifikant die Plasma rsGH-Konzentrationen erhöht. Die gleichen Ergebnisse zeigen, dass die wöchentliche intragastrische Verabreichung von rsGH zu einem 50%igen Anstieg bei der Gewichtszunahme und der Fischlänge im Vergkleich mit den Kontrollfischen führt.
Die vorstehenden Untersuchungen unterstreichen, dass oral verabreichtes GH von verschiedenen Quellen die Wachstumseigenschaften verschiedener Knochenfischspezies beeinflusst, indem sie vor dem Magen- und Dünndarmverdau geschützt wurden, so dass diese intakt und biologisch aktiv bleiben. Dies hat zu einer Steigerung verschiedenartiger Versuche geführt, Systeme zu entwickeln, die bioaktive Proteine (Wachstumshormone, Antigene etc.) vor der sauren Umgebung des Magens schützen. Die orale oder rektale Intubation von Fischen sind wirkungsvolle Methoden, um bioaktive Proteine durch den Magen hindurch zu verabreichen, jedoch sind diese für kommerzielle Anwendungen nicht brauchbar. Anstrengungen sind unternommen worden, um bioaktive Proteine gemeinsam mit Detergenzien und Antisäuren zu verabreichen, um die saure Umgebung im Magen zu reduzieren. Während dieser Studien wurde ein verminderter Proteinabbau nachgewiesen, die verwendeten Behandlungen können genutzt werden, um die Aufnahme von weiteren wichtigen Nahrungsfaktoren zu beeinflussen. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von pH-sensitiven Polymeren, welche die Peptide einkapseln und vor saurem Abbau im Magen schützen und deren Freisetzung erst im Dünndarm erlauben.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist deutlich nachgewiesen worden, dass Verbindungen (Hormone, Impfstoffe, Antikörper etc.), die oral verabreicht wurden, den Magen von einmägigen Tieren (einschließlich Menschen) passierten, um den Abbau im Magen bis zur Absorption in dem kleinen und/oder großen Darm zu umgehen. Heutzutage hat sich ein Großteil der Forschung auf die Entwicklung von Umkapselungsstrategien unter Verwendung einer Vielzahl von Formulierungen und interessanter Formen konzentriert. Diese Formulierungen und Formen können in einfacher Weise die Freisetzung einer spezifischen Verbindung in einer vorherbestimmten Art und Weise steuern oder können spezifische physiologische Determinanten (beispielsweise pH-Wert, Temperatur etc.) zur Auslösung der Freisetzung des eingeschlossenen Materials nutzen.
Das komplexe Polymer, welches in den anderen Arten von Freisetzungssystemen verwendet wird, ist manchmal schwierig zu charakterisieren. Ebenso macht die Verwendung von gewissen Polymeren, die nicht allgemein als sicher (GRAS) betrachtet werden, die regulatorische Verwendung dieser Systeme zu einem langen und risikoreichen Prozess. Darüber hinaus sind viele Polymersysteme relativ teuer, was die Verwendung im großen Maßstab unpraktikabel macht.
Das aktuelle Experiment unterstreicht eine neue Strategie, um die orale Verabreichung eines bioaktiven Peptids (in diesem Fall bST) zu ermöglichen. Durch die Fütterung einer gewünschten bioaktiven Verbindung gemeinsam mit einem Cocktail von antinutritiellen Faktoren, um die Funktion der Verdauungsenzyme zeitweise zu unterdrücken, und Produkten, die die intestinale Absorption steigern (bezogen auf die des "Bypass-Cocktails"), haben wir gezeigt, dass wir die enzymatischen Prozesse effektiv umgehen können und die intestinale Aufnahme der vorstehend genannten Verbindung erhöhen können, um einen gewünschten biologischen Effekt zu erreichen.
Materialien und Methoden
Bypass-Cocktail Zusammensetzung
Die Zusammensetzung des Bypass-Cocktails ist in Tabelle 1 gezeigt. Unbehandelte Ölsaat und Hülsenfrüchte wurden von lokalen Händlern erhalten und mechanisch enthüllt. Fischmehl, Reiskleie, Bierhefe, Natriumcarbonat, Calciumcarbonat und EDTA hatten alle Futterqualität und wurden von lokalen Händlern bezogen. Natriumdeoxycholat und rohres Ei-Albumin wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis MO) erhalten. Die Kur wurde wie gezeigt gemischt und unter Verwendung einer 1 mm-Masche gemahlen. Tabelle 1 Bypass-Cocktail Zusammensetzung

¹ Die variierte in den Experimenten, vgl. den Abschnitt Materialien und Methoden

Fisch und Fütterung
Eine Serie von Experimenten unter Verwendung von zwei Lachsarten wurde unternommen (Experiment 1: Regenbogenforelle; Experiment 2: Bachforelle). Diese Arten wurden ausgewählt, da sie zwei sehr gut studierte experimentelle Modelle ebenso wie wirtschaftlich interessante kultivierte Spezien darstellen.
Für Experiment 1 wurden Regenbogenforellen (n = 20; Anfangsgewicht = 52 g) in zylindrische 6 bis 60 Litertanks mit einem geschlossenen Wasser-Rezirkulationssystem 2 Wochen vor dem Start der Experimente gegeben. Die Wassertemperatur wurde bei 15°C gehalten und die Lichtperiode wurde auf 12 hL:12hD-Zyklen eingestellt. In Experiment 2 wurden Bachforellen (n = 400; Anfangsgewicht 38 g) in zylindrische 8 bis 800 Litertanks mit einem geschlossenen Wasser-Rezirkulationssystem 2 Wochen vor dem Beginn der Experimente gegeben. Die Wassertemperatur wurde für die Dauer der Experimente auf 11°C eingestellt, die Fische wurden der natürlichen Photoperiode (schätzungsweise 14 hL:10hD) ausgesetzt. Während beider Experimente wurde die Wasserqualität (Ammoniak, Nitrat) wöchentlich überwacht und die Sauerstoffkonzentrationen täglich gemessen. Die Fische wurden mit einem kommerziell erhältlichen Futter (Corey Feed Mills Ltd. Fredericton, NB) während der Akklimatisierungsperiode und während der Nichtbehandlungsperioden gefüttert.
Experimentelle Manipulationen
In Experiment 1 wurde rekombinantes Rindersomatotropin (rbST; Monsanto Co. St Louis MO) zugegeben, um die Fische mit 20 μg/g Fisch zu versorgen. Drei Zweifachgruppen wurden mit variierenden Stufen gefüttert, um entweder 0 (Kontrolle), 4 oder 40 g Natriumdeoxycholat pro kg Bypass-Cocktail zu erhalten. Im zweiten Experiment erhielten vier Duplikatbehandlungsgruppen Futter, welches mit 0, 1, 5 oder 10 mg Deoxycholat pro kg Bypass-Cocktail mit 20 μg rbST/g Fisch ergänzt war.
In beiden Experimenten 1 und 2 wurden das Fischgewicht und der Futterverbrauch auf wöchentlicher Basis beobachtet. Die Fische wurden gewogen und daraufhin für 36 Stunden vor der Fütterung des Bypass-Cocktails, der bST enthält, hungern gelassen. Infolge der Fütterung wurde das Futter für weitere 12 Stunden zurückbehalten. Von diesem Punkt an wurden die Fische 2 × täglich bis nahe der Sättigung gefüttert.
Ergebnisse
In beiden Experimenten wurde keine behandlungsbedingte Sterblichkeit festgestellt, was auf keine negativen gesundheitlichen Effekte des bST oder des Bypass-Cocktails auf die Regenbogen- und Bachforellen schließen lässt. Die Fische, die mit bST in dem Bypass-Cocktail gefüttert wurden, hatten signifikant größere Wachstumsraten im Vergleich zu den Kontrollen. In Experiment 1 hatten die behandelten Fische eine durchschnittliche Steigerung der Wachstumsraten von 25%, die am schnellsten wachsenden Tanks wuchsen über 40 % schneller als die Kontrollen (1 und 2). In Experiment 2 zeigten die bST-behandelten Gruppen verbesserte Wachstumsraten im Vergleich zu den Kontrollen, obwohl diejenigen mit dem Bypass-Cocktail, der 5 g/kg Deoxycholat enthielt, die höchsten Wachstumsraten mit einer 90%igen Steigerung der Wachstumsraten gegenüber den Kontrollen aufwiesen (3).
Beispiel 2 (Vergleichsbeispiel)
Wachstumsbeschleunigung von Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) Intraperitoneale Injektion von rekombinantem bovinem Wachstumshormon
Methode
Die intraperitoneale (IP) Verabreichungsdosis pro Fisch und Woche lag bei 20 μg bST/g Lebendgewicht für 6 Wochen.
Ergebnisse
4 zeigt, dass rekombinante bST injizierte IP signifikant die Zunahme des Körpergewichts von Regenbogenforellen induziert.
Beispiel 3
Bewertung der proteolytischen Enzyminhibitoren vorhanden in den Nahrungsergänzungsbestandteilen
Extrakt Enzymprotokoll
Materialien

1. Zentrifuge, Model Sorvall
2. Labormischer
3. Sezierbesteck (Scheren)
4. Zentrifugenröhrchen
5. Einwegküvetten für das Spektrometer
6. Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml
7. Spektrometer
8. Vortexer
9. Mikroplattenleser von Biorad
10. 50 mM Tris-HCl pH = 7,5
11. Commassie blue Färbelösung
12. BSA (1 mg/ml) Standardlösung
13. TCA 20%
14. Gewebe von der Bauchspeicheldrüse und des Zwölffingerdarms der Regenbogenforellen
15. 0,5% Kasein in 50 mM Tris-HCl pH = 9
16. 50 mM Tris-HCl+CaCl₂ 10 mM pH = 7,5

Enzymextraktion

1. Die Regenbogenforellen wurden gewogen und geopfert.
2. Eine Sektion wurde vorgenommen, um den proximalen Dünndarm von dem Fisch zu entfernen.
3. Nach dem Wiegen wurde das Gewebe in 50 mM Tris-HCl pH = 7,5 (1:10 w/v) homogenisiert.
4. Zentrifugieren bei 16.000 × g für 30 Minuten bei 4°C.
5. Abnahme des Überstandes, aliquotieren (gleichmäßiges aufteilen) und lagern bei 20°C für spätere Verwendung.
6. Durchführung Commassie Assay, um die Proteinmenge in dem Enzymextrakt zu bestimmen.

Commassie blue Färbeprotokoll

1. Einwiegen von 160 mg BSA in 10 ml von 50 ml Tris-HCl pH = 7,5.
2. Vorbereitung einer Standardkurve von BSA (0 μg/ml bis 1600 μg/ml).
3. Hinzufügen von jeweils 4 μl BSA und Enzymextrakt und Verdünnen (1:1) des Enzymextraktes in einer 96-Lochplatte.
4. Hinzufügen von 200 μl Commassie blue.
5. Auslesen bei 655 nm mit einem Mikroplattenleser von Biorad.

Enzymatisches Protokoll:
Die Experimente werden jeweils doppelt durchgeführt.
BLINDWERT:

1. zu 500 μl von 50 mM Tris-HCl+10 mM CaCl₂ pH = 7,5 Lösung
2. Hinzugeben von 500 μl von TCA 20% (destilliertes Wasser) Lösung
3. Hinzugeben von 20 wl des Enzymextraktes
4. Hinzugeben von 500 μl von Kasein 0,5% (50 mM Tris-HCl pH = 9) Lösung
5. Inkubieren für 15 Minuten bei 4°C (auf Eis). Zentrifugieren bei 12000 × g für 5 Minuten und Auslesen bei 280 nm.

TEST:

1. Zu 500 μl einer 50 mM Tris-HCl+10 mM CaCl₂ pH = 7,5 Lösung.
2. Hinzufügen von 20 μl Enzymextrakt
3. Hinzufügen von 500 μl Kasein 0,5% (50 mM Tris-HCl pH = 9) Lösung
4. Inkubieren für 0, 5, 10, 15 und 30 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Stoppen der Reaktion durch Hinzufügen von 500 μl TCA 20%. Inkubieren für 15 Minuten bei 4°C (auf Eis). Zentrifugieren bei 12000 × g für 5 Minuten und Auslesen bei 280 nm.

Extraktion des Inhibitors

1. Durch Zermahlen mit der Industriemühle wird das kommerziell erhaltene Futter in feines Pulver überführt.
2. Einwiegen von 250 mg des Pulvers und eingeben in 10 ml 50 mM Tris-HCl ph = 7,5 Lösung (die Endkonzentration sollte bei 25 mg/ml liegen).
3. Homogenisierung der Lösung der Handgewebemühle.
4. Zentrifugieren bei 2000 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur*.
5. Aufnahme des Überstandes. Dieser wird das Inhibitorextrakt für das enzymatische Protokoll sein.

Enzymatisches Protokoll:
Die Experimente werden immer 2-fach durchgeführt
BLANK:

1. zu 500 μl 50 mM Tris-HCl+10 mM CaCl₂ pH = 7,5 Lösung
2. Hinzugeben von 500 μl von TCA 20% (destilliertes Wasser) Lösung
3. Hinzugeben der verschiedenen Volumina des Inhibitorextraktes oder 50 mM Tris-HCl pH = 7,5 Lösung
4. Hinzugeben von 10 μl des Enzymextraktes.
5. Hinzugeben von 500 μl Kasein 0,5% (50 mM Tris-HCl pH = 9) Lösung
5. Inkubieren für 15 Minuten bei 4°C (auf Eis). Zentrifugieren bei 12000 × g für 5 Minuten und Auslesen bei 280 nm.

KONTROLLE:

1. zu 500 μl einer 50 mM Tris-HCl+10 mM CaCl₂ pH = 7,5 Lösung
2. Hinzugeben verschiedener Volumina von 50 mM Tris-HCl pH = 7,5 Lösung
3. Hinzugeben von 10 μl1 Enzymextrakt.
4. Inkubieren für 60 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Hinzugeben von 500 μl Kasein 0,5% (50 mM Tris-HCl pH = 9) Lösung
6. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
7. Stoppen der Reaktion durch Hinzugabe von 500 μl TCA 20%. Inkubieren für 15 Minuten bei 4°C (auf Eis). Zentrifugieren bei 12000 × g für 5 Minuten und Auslesen bei 280 nm.

TEST:

1. Zu 500 μl einer 50 mM Tris-HCl+10 mM CaCl₂ pH = 7,5 Lösung.
2. Hinzugeben der verschiedenen Volumina des Inhibitorextraktes.
3. Hinzugeben von 10 μl Enzymextrakt.
4. Inkubieren für 60 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Hinzufügen von 500 μl Kasein 0,5% (50 mM Tris-HCl pH = 9) Lösung
6. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur
7. Stoppen der Reaktion durch Hinzufügen von 500 μl TCA 20%. Inkubieren für 15 Minuten bei 4°C (auf Eis).
8. Zentrifugieren bei 12000 × g für 5 Minuten und Auslesen bei 280 nm.

Resultate
Die 5–12 zeigen die Effekte der einzelnen Protease-Inhibitorkomponenten des Oralject^TM Cocktails auf die proteolytische Inhibition in vitro, ebenso wiedie Gesamtinhibition des Oralject^TM Cocktails. Die Daten sind als Grad der proteolytischen Enzyminhibition gegen den ansteigenden Spiegel des Inhibitoreinschlusses dargestellt. Die Daten zeigen, dass die einzelnen Bestandteile (lyophylisiertes Ovalbumin, rote Kidneybohnen, Sojabohnen, Saubohnen, EDTA, Weizenkleie, sprühgetrocknetes Ovalbumin, jeweils 5–12) des Oralject^TM Cocktails die verschiedenen Inhibitionsgrade der in vitro proteolytischen Enzymaktivität beeinflussen. Darüber hinaus ist der Gesamtcocktail bei der Einleitung der gesamten proteolytischen Enzyminhibition wirkungsvoll. Schließlich wurde unter Verwendung der in 5 bis 12 generierten Kurven der Punkt der maximalen Inhibition, ebenso wie die Konzentration des Inhibitors, welche 50% der maximalen Inhibition liefert, extrapoliert.
Beispiel 4
Enzym assay für die Quantifizierung von Meerrettichperoxidase im Blut der Regenbogenforelle
Material

1. 96 Lochplatten (Immulon^TMII von VWR)
2. Mikroplattenleser von Biorad
3. Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml
4. Zentrifugenröhrchen für 15 ml oder 50 ml
5. TMB Tabletten
6. Meerrettichperoxidase Typ 1 (Sigma)
7. Anti-Meerrettichperoxidase von Schaf IgG (ICN)
8. 0,1M Carbonat-Bicarbonat pH = 9,6 Puffer
9. 0,1M Phosphat-Citrat pH = 5 Puffer
10. PBS 1X+BSA 1% + 0,5% Tween 20 Puffer
11. PBS 1X pH = 7,4 Puffer
12. Hydrogenperoxid 30%
13. Saranhüllen
14. Inkubator mit 37°C
15. destilliertes Wasser
16. Regenbogenforellen (Plasma)

Methode
Beschichtung der Platte mit Antigen

1. Vorlegen der 200 μl der anti-HRP aus IgG 1:1000 Verdünnungslösung (in 0,1M Carbonat-Bicarbonat pH = 9,6 Puffer) in jede Kavität einer 96 Lochplatte.
2. Einhüllen der beschichteten Platte in Saran^TMVerpackung zum Versiegeln und Inkubation über Nacht bei 4°C für 2 Stunden bei 37°C.
3. Dreimaliges Waschen der Platte mit PBS 1X pH = 7,4. Jedesmal ausschlagen der PBS-Lösung über einem Waschbecken und 3-maliges Waschen mit destilliertem Wasser.
4. Die Platten werden trockengeschlagen und bei 4°C bis zur Verwendung gelagert.

Blockieren der Bindekapazität der Platte

1. Füllen jeder Kavität mit 200 μl PBS 1X mit BSA 1% + 0,5% Tween 20 Puffer.
2. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Hinzufügen von 100 μl der Probe enthaltend die HRP 1:10 Verdünnung in einige Kavitäten.
4. Hinzufügen von 100 μl des Standardkurvenplasmas in den weiteren Kavitäten.
5. Einpacken der Platte in der Saranverpackung und Inkubation für 1 Stunde bei 37°C.
6. Dreimaliges Waschen mit PBS 1X + BSA 1% + 0,5% Tween 20 Puffer.

Standardkurvenverfahren

1. Verdünnung des Plasmas der Regenbogenforelle 1:10 mit PBS 1x pH = 7,4
2. Hinzufügen der HRP, um eine Endkonzentration von 0,5 bis 8 ng/ml zu erreichen.

Enzym assay

1. Hinzufügen von 200 μl TMB (in 50 mM Citrat-Phosphat pH = 5 Puffer + 30% von Hydrogenperoxid) in jeder Kavität.
2. Warten für 30 Minuten und Hinzufügen von 50 μl einer einmolaren schwefeligen Säure, um die Farbbildung zu fixieren.
3. Auslesen bei 415 nm mit dem Mikroplattenleser von Biorad.

Erlebnisse
Ein ELISA für die Meerrettichperoxidase (HRP) wurde entwickelt, der es ermöglicht, als Tracer für die Plasma-Aufnahmestudien infolge der oralen Verabreichung verwendet zu werden. Dieses Verfahren hat ein extrem sensitives Verfahren zur Verfügung gestellt, um die HRP-Aufnahme bei geringen Nachweisgrenzen von schätzungsweise 2,5 ng HRP/ml Plasma und einen linearen Bereich bis zu 8 ng/ml (13) zu beobachten.
Unter Verwendung dieses Verfahrens zur Überwachung der HRP-Aufnahme wurde eine Fischmehl-basierte Kontrollmatrix und der Oralject^TMCocktail enthaltend HRP (2,5 ng/g) den Regenbogenforellen gefüttert und infolge der Verabreichung zu ausgewählten Zeitpunkten Blutproben entnommen. Wie in 14 dargestellt, war die Plasmaaufnahme von oral verabreichter HRP in der Oralject^TM-Formulierung signifikant höher als die der Fische mit dem Kontrollfutter. Darüber hinaus wurden die Blutkreislaufkonzentrationen von HRP nach einer Zeitdauer von 6 Stunden nach Verabreichung untersucht.
Während die Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen dieser beschrieben wurde, ist zu verstehen, dass diese in Form weiterer Modifikation durchgeführt werden kann, und dass diese Verabreichung alle Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung, die im Allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen, und derartige Richtungen der vorliegenden Erfindung, die hierdurch zur bekannten oder anwendbaren Praxis im Stand der Technik werden, zu dem die Erfindung beiträgt und die hieraus abgeleiteten wesentlichen Eigenschaften einfließt, wie es wie folgt aus dem Schutzbereich der nachfolgenden Ansprüche hervorgeht, umfasst.

Claims

Zusammensetzung zur oralen Verabreichung an einem Menschen oder einem Tier zur intestinalen Abgabe eines physiologisch aktiven Agens, wobei diese Zusammensetzung enthält: a) wenigstens ein neutralisierendes Agens, das zur Anhebung des im Magen herrschenden pH-Werts auf Werte zwischen ungefähr 6,5 bis 9 in dem Verdauungssystem des besagten Tiers geeignet ist, um die Denaturierung des besagten physiologisch aktiven Agens zu verhindern; b) wenigstens einen Inhibitor von Verdauungsenzymen zur Verhinderung der enzymatischen Verdauung des besagten physiologisch aktiven Agens; und c) wenigstens eines die Aufnahme verstärkenden Agens, das die intestinale Absorption des besagten physiologisch aktiven Agens erhöht.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das neutralisierende Agens in einer Konzentration zwischen 1 bis 60 Gew.-%, der besagte Inhibitor in einer Konzentration zwischen 1 bis 50 Gew.-%, und das die Aufnahme fördernde Agens in einer Konzentration zwischen 0,1 bis 50 Gew.-% vorhanden ist.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, die weiterhin enthält ein physiologisch aktives Agens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus therapeutischen Agenzien, Ernährungsprodukten, Mucopolysaccariden, Lipiden, Kohlenhydraten, Steroiden, Hormonen, Wachstumshormon (GH), Wachstumshormon abgebendes Hormon (growth hormone releasing hormone GHRH), epithelialem Wachstumsfaktor, vaskulärem endothelialem Wachstums- und Permeabilitätsfaktor (vascular endothelial growth and permeability factor VEGPF), Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor), Cytokinen, Interleukinen, Interferonen, GMCSF, hormonähnlichem Produkt, neurologischem Faktor, neurotropem Faktor, Neurotransmitter, Neuromodulator, Enzym, Antikörper, Peptid, Protein-artiges Fragment, Vaccin, Adjuvans, ein Antigen, Immunstimulierender oder -inhibierender Faktor, hämatopoetischer Faktor, Anti-Krebsprodukt, antiinflammatorisches Agens, antiparasitäre Verbindung, antimikrobielles Agens, Nukleinsäurefragment, Plasmid-DNA-Vektor, Zellproliferationsinhibitor oder -aktivator, Zelldifferenzierungsfaktor, Blutgerinnungsfaktor, Immunoglobulin, antiangionetisches Produkt, negative selektive Marker oder "Suizid"-Agens, toxische Verbindung, Anti-Angionese- Agens, Polypeptid, Antikrebsagens, Säureproduktions-Medikamente und Histamin H2-Rezeptor Antagonist.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das besagte neutralisierende Agens in einer Menge vorhanden ist, die ausreichend ist zur Neutralisierung des Abbaus durch Säuren in dem Verdauungssystem des besagten Tieres, um die Abgabe des besagten physiologischen Agens zu dem besagten Tierdarm zu gestatten.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das besagte neutralisierende Agens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Anti-Säuren, Natriumbicarbonat, Natriumcarbonat, Natriumcitrat, Natriumhydrogencarbonat, Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Magnesiumsalze, Magnesiumcarbonat, Magnesiumtrisilikat, Magnesiumhydroxid, Magnesiumphosphat, Magnesiumoxid, Wismutsubcarbonat und Kombinationen davon.
Zusammensetzung wie in Anspruch 5 beansprucht, wobei das neutralisierende Agens zumindest eines aus der Gruppe bestehend aus Natriumcarbonat in einer Konzentration von 10 bis 20 Gew.-% und Calciumcarbonat in einer Konzentration von 10 bis 20 Gew.-% bezogen auf die Zusammensetzung ist.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der besagte Inhibitor in einer Menge vorhanden ist, die ausreichend ist zur Verhinderung des Abbaus des besagten physiologisch aktiven Agens durch Verdauungsenzyme in dem Verdauungssystem des besagten Tieres, und um die Abgabe des besagten physiologisch aktiven Agens zu dem Darm des besagten Tiers zu gestatten.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der besagte Inhibitor der Verdauungsenzyme ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antiprotease, Eialbumin, Inhibitoren auf Pflanzenbasis aus Ölsaat, Sojabohne, Kidneybohne, Saubohne, Reiskleie, Weizenkleie, Ethylendiamintetraacetat, alpha-1-Antitrypsin, Albumin, Ovalbumin, und Proteosomen.
Zusammensetzung wie in Anspruch 8 beansprucht, wobei der besagte Inhibitor wenigstens einen aus der Gruppe Pepsin-Inhibitor und Enteropeptidase-Inhibitor enthält.
Zusammensetzung wie in Anspruch 8 beansprucht, wobei der besagte Inhibitor Albumin in einer Konzentration zwischen 10 bis 20 Gew.-% ist.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das besagte, die Aufnahme verstärkende Agens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gallensalz, Saponin, Desoxycholat, Natriumsalicylat, Natriumlaurylsulfat, Ölsäure, Linolsäure, Monoolein, Lecithin, Lysolecithin, Polyoxyethylen-Sorbitanestern, p-t-Octylphenoxypolyoxyethylen, N-Lauryl-p-D-maltopyranosid, 1-Dodecylazacyloheptan-2-azon, und Phospholipid.
Zusammensetzung wie in Anspruch 11 beansprucht, wobei das besagte, die Aufnahme verstärkende Agens Desoxycholat in einer Konzentration von 1 bis 5 % ist.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, weiterhin enthaltend wenigstens einen zusätzlichen Bestandteil ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylendiamintetraacetat, Konservierungsmittel, Antioxidans, Farbstoff, Binder, Tracer, Süßungsmittel, oberflächenaktives Mittel, Trennmittel, Aromastoff, Mehl, Bohne, Hefe, Brauereihefe, Mineralöl, Pflanzenöl, tierisches Öl, Gleitmittel, Salbe, und Kombinationen davon.
Zusammensetzung wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei das besagte physiologisch aktive Agens bei der Abgabe in dem besagten Mensch- oder Tierdarm von dem besagten Darm zur systemischen Abgabe absorbiert wird.
Zusammensetzung wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei das besagte physiologisch aktive Agens bei der Abgabe in dem besagten Menschen- oder Tierdarm einen effektiven physiologischen Effekt auf die Darmwand ausübt.
Zusammensetzung wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei das besagte physiologisch aktive Agens bei der Abgabe in dem besagten Menschen- oder Tierdarm einen physiologischen Effekt auf den Inhalt des Darms hat.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das besagte Tier ein Vogel, ein Säugetier, ein Insekt, oder ein Fisch ist.
Zusammensetzung wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei das besagte physiologisch aktive Agens in der Lage ist, eine Immunantwort in dem besagten Menschen oder Tier gegen Schleimhaut-Infektionskrankheiten auszulösen.
Medikament enthaltend die Zusammensetzung wie in irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht.
Medikament enthaltend eine ausreichende Menge der Zusammensetzung wie in Anspruch 3, 14, 15 oder 16 beansprucht.
Medikament wie in Anspruch 20 beansprucht, zur systemischen Abgabe eines physiologisch aktiven Agens an einen Menschen oder ein Tier.
Medikament wie in Anspruch 20 beansprucht, wobei das besagte physiologisch aktive Agens ein antimikrobielles Agens ist.
Medikament wie in einem der Ansprüche 19 bis 22 beansprucht, zur Behandlung einer mikrobiellen Darminfektion in einem Menschen oder einem Tier.
Medikament wie in Anspruch 23 beansprucht, wobei die besagten mikrobiellen Infektionen hervorgerufen werden durch Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Pilzen, Hefen, Viren, Staphylokokken, Streptokokken, Mikrokokken, Peptokokken, Peptostreptokokken, Enterokokken, Bazillus, Clostridium, Lactobazillus, Listeria, Erysipelothrix, Propionibakterium, Eubacterium, Corynobakterium, Mykoplasma, Ureaplasma, Steptromyces, Hämophilus, Nesseria, Eikenellus, Moraxellus, Actinobazillus, Pasteurella, Bakteroides, Fusobacteria, Prevotella, Porphyromonas, Veillonella, Treponema, Mitsuokella, Capnocytophaga, Camphylobacter, Klebsiella, Chlamydia, und Coliforme.
Medikament wie in Anspruch 22 beansprucht, wobei das besagte antimikrobielle Agens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antibiotika, Bakteriozinen, Lantibiotika, Probiotika, Antipilzmittel, Antimykotika, antiparasitären Mitteln, Aminoglykosiden, Vancomycin, Rifampin, Lincomycin, Chloramphenicol und den Antibiotika Fluorquinol, Penicillin, beta-Lactame, Amoxicillin, Ampicillin, Azlocillin, Carbenicillin, Mezlocillin, Nafcillin, Oxacillin, Piperacillin, Ticarcillin, Ceftazidim, Ceftizoxim, Ceftriaxon, Cefuroxim, Cephalexin, Cephalothin, Imipenen, Aztreonam, Gentamicin, Netilmicin, Tobramycin, Tetracycline, Sulfonamide, Macrolide, Erythromycin, Clarithromcin, Azitrhomycin, Polymyxin B, und Clindamycin-Antibiotika.
Medikament enthaltend eine physiologisch wirksame Menge einer Zusammensetzung wie in Anspruch 3 beansprucht, zur Verbesserung der Darmaufnahme des physiologisch aktiven Agens in Menschen oder Tieren.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1 bis 18 zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der Darmaufnahme des physiologisch aktiven Agens in Menschen oder Tieren.