DE60121039T2

DE60121039T2 - Toleranzinduktion

Info

Publication number: DE60121039T2
Application number: DE60121039T
Authority: DE
Inventors: Marco Turini; Bruce German; Sophie Pecquet
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2001-12-20
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2021-12-21
Also published as: JP2004522725A; WO2002051437A1; IL156276A0; MXPA03005643A; AR031962A1; EP1345624A1; ZA200305620B; PT1345624E; NO20032732L; RU2003122333A; PL366226A1; CA2431835A1; EP1345624B1; NZ526974A; ATE330628T1; DE60121039D1; RU2283665C2; BR0116415A; KR20030065539A; NO20032732D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induzierung einer Toleranz gegenüber einem antigenen Material in einer Person durch Verabreichung einer Verbindung, die die COX-2 (Cyclooxygenase 2)-Aktivität in den Zellen der Person erhöht, insbesondere in Zellen, die an einer Immunreaktion beteiligt sind, und die ggf. auch den IFNγ-Spiegel erhöht, sowie eines Material oder antigener Teile davon, gegenüber dem die Person schädliche Immunreaktionen entwickelt. Spezifisch betrifft die vorliegende Erfindung eine Lebensmittelzusammensetzung oder pharmazeutische Zusammensetzung, die derartige Verbindungen, sowie das antigene Material oder Teile davon enthält. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf ein neues ex vivo-Verfahren zur Bestimmung der Tendenz einer Person, eine allergische Reaktion gegen ein spezielles Material zu entwickeln.
Eine derjenigen modernen Erkrankungen, die durch unterschiedliche Umweltfaktoren der Industriegesellschaft gefördert werden, ist Allergie. Die Allergie ist ein Überempfindlichkeitszustand, der von einer übermäßigen Immunreaktion auf ein körperfremdes Mittel ausgelöst wird, der die Leben von Millionen von Lebewesen beeinträchtigt, und der häufig diktiert, was gegessen werden kann, berührt werden kann, gerochen werden kann oder sogar, wo die Lebewesen leben können. Die Körperreaktion auf das fremde Mittel kann von einer geringfügigen Entzündung und von Unwohlsein selbst bis zum Tod in schweren Fällen reichen.
Die klinischen Symptome, die im Verlauf von allergischen Reaktionen erzeugt werden, sind ein Ergebnis von zwei unterschiedlichen Reaktionen, und zwar einer frühen spezifischen Immunreaktion bzw. einer späten inflammatorischen Reaktion. Inhalierte Allergene, wie beispielsweise Pollen oder Milbenstaub sind Mediatoren der Frühphase, indem sie hochaffine Immunoglobulin (IgE)-Rezeptoren stimulieren, z.B. Mastzellen und Basophile, die ihrerseits Histamin und Cytokine freisetzen. Diese Frühphase dauert etwa 30 Minuten. Die während dieser Frühphase freigesetzten Cytokine aus Mastzellen und Basophilen vermitteln dann die Spätphase, indem sie Entzündungszellen in die Wege des Nasentrakts und des oberen Atmungstrakts locken. Der Einstrom von Eosinophilen, Macrophagen, Lymphozyten, Neutrophilen und Plättchen löst den Entzündungszyklus aus. Diese späte Phase dauert im Allgemeinen für bis zu 2 Tage und verstärkt die ursprüngliche Immunreaktion, die ihrerseits die Freisetzung von mehr inflammatorischen Zellen auslöst.
Gegenwärtige Allergiebehandlungen konzentrieren sich im Allgemeinen auf zwei Arten von Ansätzen. Ein Ansatz behandelt nur die Symptome der Allergie, wobei Arzneimittel, wie Antihistaminika, verwendet werden. Einer der Nachteile derartiger Methoden liegt darin, dass dieser Ansatz meistens wiederholte Dosen des entsprechenden zu verabreichenden Arzneimittels beinhaltet und unerwünschte Nebenwirkungen auslösen kann. Zusätzlich wirkt er nur im Sinne einer Behandlung von Symptomen, jedoch nicht der zugrunde liegenden Erkrankung, die für den Überempfindlichkeitszustand verantwortlich ist. Ein weiterer Ansatz zur Behandlung einer Allergie ist die sog. Desensibilisierungstherapie, die die Injektion von spezifischen Allergenen in eine Person umfasst. Bevor man jedoch in der Lage ist, mit der Behandlung zu beginnen, müssen zuerst die patientenspezifischen Allergene erkannt werden. Dem Patienten werden wiederholt niedrige Dosen der Allergene injiziert. Dieser Ansatz beinhaltet Unwohlsein und kann bis zu 50 Besuche bei einem praktischen Arzt erfordern. Ferner kann das Allergen, gegenüber dem der Patient überempfindlich ist, nicht immer identifiziert werden, was eine Desensibilisierungsbehandlung unmöglich macht.
Zusätzlich zu den obigen Nachteilen garantiert keiner der obigen Ansätze die Eliminierung des Überempfindlichkeitszustands. In ähnlicher Weise kann keiner gegen die Entwicklung eines Überempfindlichkeitszustands schützen.
Abgesehen von immer mehr Personen, die eine Allergie gegen Mittel entwickeln, denen sie in der Umwelt begegnen, wie bei spielsweise Pollen, Gewebe usw., steigt die Anzahl von Verbrauchern, die an einer Lebensmittelallergie leiden, ständig. Insbesondere trifft man auf ernste Probleme mit allergischen Reaktionen gegen Getreideprodukte, Nüsse oder Milch, da diese Produkte als Grundnahrungsmittel in den meisten Ländern konsumiert werden und eine hohe Anzahl von potentiellen proteinischen Allergenen enthalten.
Zur Behandlung einer Lebensmittelallergie wurden bisher unterschiedliche Ansätze verfolgt. Ein derartiger Ansatz zielt darauf ab, das allergene Lebensmittelmaterial aus der täglichen Diät zu entfernen, was sich jedoch in der Praxis als schwierig erwiesen hat, da es eine strikte Diätumstellung erfordert, üblicherweise einschränkende Maßnahmen beinhaltet und schließlich die Lebensqualität beeinträchtigen kann und/oder das erwartete Wachstum von kleinen Kindern oder Neugeborenen behindern kann.
Ein weiterer Ansatz betrifft die Modifikation der Quelle des allergenen Materials selbst, so dass ihr allergisches Potential vermindert wird. Das wird im Allgemeinen dadurch erreicht, dass man das Lebensmittelmaterial im Hinblick auf die allergene Komponente abreichert, was häufig insofern zu Problemen führt, dass die spezifische antigene Substanz (das Allergen) in dem Lebensmittelmaterial häufig nicht bekannt ist, so dass es in den meisten Fällen nicht klar ist, welche Komponente selektiv entfernt werden sollte. Ein anderer Weg, um die Allergenität des Lebensmittelmaterials zu modifizieren, besteht darin, dieses Lebensmittelmaterial auf eine spezifische Weise zu behandeln, wie beispielsweise durch Hitze oder mit proteolytischen Enzymen.
Diesbezüglich beschreibt US-P-4 293 571 die Herstellung einer hypoallergenen Zusammensetzung, bei der ein proteinisches Material einer Hydrolysebehandlung unterzogen wird, die restlichen, nicht- hydrolysierten Proteine einer Koagulation durch Wärmebehandlung unterworfen werden, gefolgt von einer Ultrafiltrationsstufe, um das koagulierte Material zu eliminieren sowie Makropeptide, die Allergene darstellen könnten.
Die Probleme, die mit einer Lebensmittelallergie verbunden sind, sind noch bedeutsamer bei Neugeborenen, da diese nicht in der Lage sind, ihr Unwohlsein der betreuenden Person mitzuteilen, so dass der allergische Zustand meistens nur aufgrund feststellbarer allergischer Symptome festgestellt wird, wie beispielsweise einer atopischen Dermatitis, und Atemwegs- und/oder Magen-Darm-Beschwerden.
Die Vermeidung des allergischen Materials kann unterschiedliche Einschränkungen für den Haushalt und die spezifischen Lebensregeln für diese Kinder beinhalten. Die Schlüsselvorsorge in ihrer Diät besteht jedoch darin, eine Sensitivierung durch native Proteine zu vermeiden. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass man dadurch, dass man die Aufnahme von nativen Kuhmilchproteinen drastisch verminderte, das Auftreten einer Kuhmilchallergie dramatisch vermindert werden konnte.
Welche diätetische Option auch immer erwogen wird, es kann eine Vollendung der Immuntoleranz gegenüber Milchproteinen nicht endgültig erreicht werden, ohne das Immunsystem mit den verantwortlichen Proteinen zu reizen. Bis heute kann der Toleranzstatus nur durch Extrapolation geprüft werden, wobei Kleinkinder keine spezifische allergische Reaktion erkennen lassen, und zwar entweder nach einem lokalen Reiz (Prick Tests) oder einem systemischen Reiz (DBPCFC).
Folglich besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und ein neues Mittel zur Behandlung oder Prävention von allergischen Symptomen bereitzustellen. Das Problem wurde gelöst durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Induzierung einer oralen Toleranz gegen ein gegebenes antigenes Lebensmittelmaterial in einem Individuum, das die Verabreichung eines antigenen Lebensmittelmaterials sowie einer Substanz, die die COX-2 (Cyclooxygenase 2)-Aktivität in den Zellen des Individuums erhöht, insbesondere in Zellen, die an einer Immunreaktion beteiligt sind, wie beispielsweise Lymphozyten, und/oder die dem IFNγ (Interferonγ-Spiegel erhöht, an eine Person umfasst.
In den Figuren zeigt
1 die Modulation der zellulären Immunreaktion durch Arzneimittel- und Nährstoffbehandlung während der Tolerierung;
2 eine Modulation der humoralen Immunreaktion gegenüber BLG durch Arzneimittel- und Nährstoffbehandlungen während der Tolerisierung;
3 Messungen von PGE₂ und IFNγ zur Feststellung der oralen Toleranz.
COX-2 ist ein Enzym, das unter anderem die Synthese von Prostaglandinen aus Arachidonsäure katalysiert. Andere bekannte Substrate für COX-2 schließen ein Dihomo-gamma-Linolensäure (20:3n:6) und Eicosapentaensäure (EPA, 20:5n-3), die PGE₁ bzw. PGE₃ erzeugen.
Das humane COX-2-Gen wurde kloniert, und sein Genommuster und die Beeinflussbarkeit seiner Genexpression durch unterschiedlichen Elemente wie cAMP, NF-κB und TGF-β, IL-1 oder TNF-α wurde beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Begriff "Erhöhen der COX-2-Aktivität" so zu verstehen, dass die enzymatische Aktivität selbst erhöht wird, wie beispielsweise durch Erhöhen der Menge von Cofaktoren oder Verbesserung der Kooperation mit diesen Cofaktoren, oder durch Erhöhen der Transkription und/oder Translation des Proteins in den Zellen oder einfach durch Erhöhen der Substratmenge.
In ähnlicher Weise ist der Begriff "schädliche Immunreaktion" so zu verstehen, dass er irgendeine Immunreaktion bezeichnet, die für das Individuum schädlich ist, wie beispielsweise allergische Reaktionen, Autoimmunreaktionen und Organabstoßungen.
Außerdem soll der Begriff Zellen eines Individuums alle Zellen umfassen, die COX-2 exprimieren und die an tolerogenen Aktivi täten beteiligt sind. Diese Zellen schließen spezielle Zellen ein, die an Immunreaktionen beteiligt sind, wie beispielsweise Antigen präsentierende Zellen, Lymphozyten, insbesondere T-Lymphozyten, Neutrophile, Granulocyten, Monocyten, usw.
Das dem Individuum zu verabreichende antigene Material kann im Allgemeinen ein Lebensmittelmaterial selbst sein. Beispiele für derartige Lebensmittelmaterialien sind Milch, Ei, Soja, Erdnuss, Krustentiere, Fisch, Fleisch, Sesam, Molke, Beeren oder Äpfel.
Die Substanz zur Erhöhung der COX-2-Aktivität in den Zellen des Individuums, insbesondere in Zellen, die an einer Immunreaktion beteiligt sind, wie beispielsweise Lymphozyten, kann irgendeine Substanz sein, die in der Lage ist, einen derartigen Effekt auszulösen. Diese Substanzen können leicht mit Hilfe ihrer Wirkung auf die Synthese von z.B. PGE₂ (Prostaglandin E₂) aus Arachidonsäure in T-Lymphozyten identifiziert werden, die mit üblichen enzymatischen Immunoassays untersucht werden können. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann eine derartige Substanz, die in der Lage ist, eine erhöhte Aktivität von COX-2 in den Zellen eines Individuums auszulösen und ggf. auch einen erhöhten Spiegel an IFNγ, aus der Gruppe ausgewählt werden, die umfasst Butyrat, n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs) wie Arachidonsäure oder Ceramide.
Das antigene Material kann wie gewünscht vorbehandelt werden. Statt beispielsweise das gesamte Material, das eine schädliche Immunrektion hervorruft, in die pharmazeutische Zusammensetzung einzuarbeiten, können die entsprechenden antigenen Verbindungen, die in dem Material oder in Teilen davon enthalten ist, wie beispielsweise spezielle allergene Peptide, isoliert werden, und diese Verbindungen können in die pharmazeutische Zusammensetzung eingearbeitet werden. Die Zielsubstanz kann auch in ein Lebensmittelmaterial eingearbeitet werden. In diesem Falle sind drei Alternativen vorstellbar.
Zuerst wird das antigene Material in ein übliches Lebensmittelmaterial zusammen mit der Zielsubstanz eingearbeitet. Diese Ausführungsform sieht daher die Zugabe eines bekannten Antigens wie beispielsweise oben erwähnt in ein Lebensmittelmaterial vor, das mit einer Zielverbindung ergänzt ist. Als ein solches Lebensmittelmaterial kann irgendeine Flüssigkeit, wie Wasser oder sogar Milch, Gelees, Süßigkeiten usw. vorgeschlagen werden.
Als zweite Alternative kann das Lebensmittelmaterial das antigene Material als solches repräsentieren, d.h. das Lebensmittelmaterial enthält inhärent das potentiell antigene Material. In diesem Falle kann, um eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhalten, die Zielsubstanz einfach zu dem Lebensmittelmaterial zugesetzt werden. Von einem solchen Lebensmittelmaterial kann irgendein Lebensmittel, gegen das ein Individuum eine allergische Reaktion entwickeln kann, umfasst werden, einschließlich beliebige Arten von Beeren, Äpfeln, Pfirsichen usw. Besonders Lebensmittelprodukte, die sich von Getreide oder Kuhmilch ableiten, stellen eine bevorzugte Art von Nahrungsmitteln dar, da es bekannt ist, dass diese Lebensmittelprodukte hochallergene Verbindungen enthalten. Beispiele für derartige Lebensmittelprodukte sind Joghurt, Frischkäse, Käse, fermentierte Milchprodukte, fermentierte Produkte auf Milchbasis, Eiscreme oder Getreideprodukte, wie beispielsweise Produkte auf der Basis von fermentierten Getreiden, Pulver auf Milchbasis, Drinks, Gelees auf Wasserbasis, Kleinkinder-Formulanahrungen oder sogar Haustierfutter.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein neues und interessantes Konzept zum Induzieren einer oralen Toleranz gegen ein potentiell allergenes Lebensmittelmaterial in einem Individuum, indem man einfach dem Lebensmittelmaterial eine Substanz zusetzt, die in der Lage ist, die COX-2-Aktivität in den Zellen des Individuums zu erhöhen, insbesondere in Zellen, die an Immunreaktionen beteiligt sind, wie beispielsweise Lymphozyten, vorzugsweise T-Zellen, und die ggf. in der Lage ist, den IFNγ-Spiegel zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindung lehrt daher ein Verfahren zur Induzierung einer oralen Toleranz gegen ein Lebensmittelmaterial in einem Individuum. Dieses Konzept ist besonders geeignet für Neugeborene, die dabei sind, gegenüber einem Lebensmittelmaterial eine Toleranz oder Allergie zu entwickeln. Indem man die Lehren der vorliegenden Erfindung anwendet, kann eine Kleinkinder-Formulanahrung geschaffen werden, gegenüber der Neugeborene keine allergische Reaktion entwickeln werden. Was darüber hinausgeht, ist, dass das Immunsystem der Neugeborenen stattdessen eher gelehrt wird, die Kuhmilchproteine zu tolerieren, so dass keine Probleme auftauchen, wenn man die Neugeborenen mit dem entsprechenden Lebensmittelmaterial füttert.
Alternativ kann eine antigene Komponente irgendeinem anderen gewünschten Lebensmittelmaterial zugesetzt werden. Beispielsweise können Erdnüsse oder die relevanten allergenen Bestandteile davon fermentierten Milchprodukten zugesetzt werden, wie beispielsweise einem Joghurt, um einen Joghurt mit Erdnussgeschmack bereitzustellen, und, indem man die Zielsubstanz vorsieht, auch das gewünschte Behandelungsregime. Das gilt in ähnlicher Weise für die Zugabe von Stücken von Beeren, Äpfeln usw. zu derartigen fermentierten Milchprodukten.
Es versteht sich, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen perfekt geeignet sind, die Entwicklung einer Allergie in einem Individuum zu bekämpfen, bevor diese auftreten kann. Ohne dass wir wünschen, von irgendeiner Theorie eingeschränkt zu werden, wird angenommen, dass dann, wenn das Immunsystem dem Antigen gleichzeitig mit dem Auslösen eines biologischen Schritts, der an der Unterdrückung einer überschießenden Immunreaktion gegenüber dem Material beteiligt ist, ausgesetzt wird, das Immunsystem im Allgemeinen gelehrt wird, auf das spezifische präsentierte Antigen nicht negativ zu reagieren. Somit beruht das Konzept, das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, im Wesentlichen darauf, dass man die Biochemie/den Metabolismus der Zellen eines Individuums, die an der Auslösung der oralen Toleranz beteiligt sind, vorzugsweise von Zellen, die an einer Immunreaktion beteiligt sind, moduliert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es daher möglich, nicht nur den Beginn einer Allergie zu verhindern, sondern auch einen bereits existierenden allergischen Zustand zu behandeln, indem man das Immunsystem "lehrt", nicht auf ein Material zu reagieren, das gleichzeitig mit einer Substanz präsentiert wird, die in der Lage ist, die COX-2-Aktivität in Zellen eines Individuums zu erhöhen, vorzugsweise in Zellen, die an einer Immunreaktion beteiligt sind, sowie den IFNγ-Spiegel zu erhöhen.
Es versteht, sich, dass die Menge der Zielsubstanz in der Lebensmittelzusammensetzung ausreichend ist, um den gewünschten Effekt zu liefern, d.h. eine Zunahme der Aktivität der COX-2 in den entsprechenden Zellen des Individuums, vorzugsweise in Lymphozyten, stärker bevorzugt in T-Lymphozyten, zu erhöhen und ggf. eine Erhöhung des IFNγ-Spiegels in peripheren Geweben zu bewirken, so dass das Immunsystem des Individuums in wirksamer Weise gelehrt wird, das antigene Material zu tolerieren, wenn es einmal als Fremdantigen erkannt ist, gegen das eine überschießende Immunreaktion ausgelöst wird.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung in näheren Einzelheiten, ohne sie darauf zu beschränken.
Die folgenden Materialien wurden verwendet und die folgenden Verfahren angewandt:
Tiere
Weibliche Balb/c-Mäuse, erhalten von IFFA-Crédo (L'Abresle, Frankreich) wurden für alle Versuche verwendet, die an drei Wochen alten Mäusen durchgeführt wurden. Alle Mäuse wurden mit einer kuhmilchfreien Diät gezüchtet und aufgezogen. Für alle Versuche wurden die Mäuse an dem Tag gewogen, an dem sie gefüttert wurden, um die Menge an Sondenernährung gemäß ihrem Körpergewicht zu bestimmen.
Antigene
BLG (bovines Lactoglobulin; 3 × kristallisiert) und OVA (Ovalbumin; Qualität V) wurden von Sigma Chemical Co., erhalten.
Molkenproteinkonzentrat (Lacprodan 80) wurde von Danmark Protein AS (MD-Foods) erhalten. Es wurde durch Ultrafiltration von Sauermolke hergestellt, und der Proteingehalt betrug 80 %.
Statistiken
Serum-IgE-Reaktionen wurden verglichen, unter Anwendung des ANOVA-Einzelfaktortests. Eine Signifikanz war bei p < 0,05 erreicht.
Beispiel 1
Behandlung von Mäusen
Zu Beginn des Versuchs wurden die Mäuse mit Butyrat (das die COX-2-Aktivität positiv beeinflusst), Ibuprofen (das die COX-Aktivität inhibiert) oder Salzlösung (Kontrolle) täglich zwangsgefüttert und/oder i.p. injiziert, und zwar von Tag –3 bis –4. Am Tag 0 wurden den Mäusen per Magenfütterung Molkenproteine (3 mg/g Körpergewicht) oder das gleiche Volumen Salzwasser verfüttert. Die Sondenernährungsprodukte wurden in 0,3 ml Salzwasser aufgelöst. Am Tag 4 eines jeden Versuchs wurden alle Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 0,08 mg BLG sowie von 0,08 mg OVA in 0,04 ml einer sterilen Salzlösung, vermischt mit 0,16 ml 2 % Al(OH)₃ (Superfos Biosecotr A/S, Dänemark) immunisiert.
Am Tag 4, oder am Tag 26 wurden per Herzaortapunktierung unter 3 % Isofluran-Anästhesie (Abbott SA) Blutproben gewonnen. Sofort nach ihrem Tod, der durch Halswirbelverlagerung ausgelöst wurde, wurden jeweils die Milz entfernt und entsprechend der Behandlungsgruppe in 20 ml gekühltem RPMI, ergänzt mit 5 % FCS, gekühlt. Milzzelllösungen wurden durch ein Zellsieb (Falcon) homogenisiert und unter Anwendung der Histopaque-Dichtezentrifugation (Sigma) bei 390 × g für 20 min von roten Zellen gereinigt. Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 36 Vertiefungen mit flachem Boden (Costar) kultiviert, und zwar für 48 Stunden bei einer Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640 (Bioconcept), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin (Seromed), 100 U Penicillin/100 mg Streptomycin (Seromed), 10 % FCS (Bioconcept) bei 37 °C in 5 % CO₂, und zwar in Gegenwart von 5, 2,5, 0,5 oder 0,1 mg/ml BLG (Sigma) oder 250, 50, 10, 2 µg/ml Phytohämagglutinin A (Seromed). (³H)Tdr (Amersham, Zürich) wurde für die abschließenden 6 Kulturstunden zugesetzt und die Platten wurden geerntet und mittels Szintillationszählung analysiert (TopCount, Canberra Packard, Zürich). (³H)Tdr-Inkorporierungsergebnisse wurde in cpm ausgedrückt, und zwar als Mittel von dreifachen Kulturen, und das Leerproben-verminderte Mittel wurde dann gegen die BLG-Konzentration aufgetragen. Stimulationsindices wurden als Verhältnis von Leerproben-verminderten Test- und Kontrollwerten bei 2,5 mg BLG/ml und 50 µg PHA/ml errechnet.
Spezifische Proliferationsassays wurden für jede Gruppe durchgeführt. Isoliertes Serum wurde rasch bei –20 °C gefroren, bis es auf IgE, die für BLG spezifisch sind, untersucht wurde.
Beispiel 2
Messung von spezifischem IgE-Antikörper durch ELISA
Serumproben wurden im Doppel auf Anti-BLG-IgE mittels ELISA untersucht. Kurz gesagt wurden Mikrotiterplatten (NUNC Immunoplate Maxisorp F96, Dänemark) mit 100 µl pro Vertiefung BLG 0, 5 mg/ml verdünnt in Carbonat-Bicarbonat-Puffer, pH 9,6 beschichtet, und zwar über Nacht bei 4 °C. Vier Waschschritte mit PBS-Tw (Phosphat-gepufferte Salzlösung-Tween 0,05 %) wurden durchgeführt, vor jeder aufeinanderfolgenden Reagenzzugabe. Unbesetzte Bindungsstellen der Platte wurden mit 200 µl pro Vertiefung einer 0,5 %-igen Fischgelatine (Sigma) in PBS-Tw für 1 Stunde bei RT blockiert. Serienverdünnungen von Proben (dreifach pro Serum) von individuellen Mäusen wurden im Doppel untersucht. Sera wurden vor dem Test zuerst 1/20 in PBS-Tw verdünnt. Nach der Zugabe von Peobenverdünnungen und einer Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde ein Ratten-Anti-Maus-IgE Peroxydase-markierter Antikörper (Harlan Sera-Lab, USA) für 2 Stunden zugesetzt, gefolgt von dem OPD-Substrat (Sigma). Optische Dichten wurden bei 492 nm gemessen und zwar nach 15 mit Inkubationen bei Raumtemperatur, unter Verwendung eines Dynatech MR500 ELISA-Lesegeräts (Dynatech, Embrach- Embraport, Schweiz). Gepoolte Proben von zwanzig nicht- immunisierten weiblichen Mäusen wurden als negative Kontrollen in jeder Platte verwendet. Die Cut-Off-Verdünnungen wurden dadurch bestimmt, dass man die Verdünnung derjenigen Proben errechnete, die die doppelte Absorption der negativen Kontrollen lieferte. Titer wurden ausgedrückt als log₁₀ des Reziproken der Cut-Off-Verdünnung.
Beispiel 3
Cytokin-ELISA
Cytokin-Sekretionen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Costar) induziert, wobei 5 × 10⁵ Milzzellen mit 2,5 mg/ml BLG pro Vertiefung stimuliert wurden. Zellkulturüberstände wurden nach einer 48-stündigen Stimulation gesammelt. IFNγ-Spiegel wurden gemessen unter Verwendung eines Cytokinspezifischen ELISA-Kits Endogen, wobei nach den Anweisungen des Herstellers vorgegangen wurde. Alle Cytokinproben wurden im Doppel untersucht.
Beispiel 4
Prostaglandin E₂ und Interferon-Gamma-Messung
PGE₂-Spiegel im Kulturmedium, von Lymphozyten, die für 6 Stunden oder 12 Stunden kultiviert worden waren, wurden unter Verwendung eines Enzymimmunoassey (EIA) Kits bestimmt (Cayman Chemical). Bei jeder der zwei Verdünnungen wurden jeweils 3-fach-Proben untersucht.
Die Induzierung einer Toleranz durch Füttern der Mäuse mit Molkenprotein führte zu einer erhöhten PGE₂ und INFγ-Produktion durch BLG-stimulierte Lymphozyten in Kultur, und zwar verglichen mit nicht-tolerisierten Kontrollmäusen, 5 Tage nach der Tolerisierung.
Diese Produktion von PGE₂ und INFγ wird nicht beobachtet, wenn die Mäuse mit Ibuprofen behandelt werden, einem COX-Inhibitor. Andererseits zeigen Mäuse, die mit Butyrat behandelt wurden, eine noch weiter erhöhte Produktion von sowohl PGE₂ und INFγ-, und zwar verglichen mit positiven Molkenprotein-gefütterten Kontrollmäusen.
Beispiel 5
Proliferation
Die Indizierung einer Toleranz durch Füttern von Mäusen mit Molkenproteinen führt zu einem verminderten proliferativen Reaktionsindex, 4 Tage nach der Tolerisierung (3). Ein Stimulationsindex unter 0,5 zeigt an, dass die Mäuse tolerisiert wurden. Der verminderte Proliferationsreaktionsindex wird nicht beobachtet, wenn die Mäuse mit Ibuprofen behandelt werden, einem COX-Inhibitor. Andererseits zeigten Mäuse, die mit Butyrat behandelt wurden, einen weiter verminderten proliferativen Reaktionsindex, verglichen mit den positiven Molkenprotein-gefütterten Kontrollmäusen.
Ähnliche und stärkere Ergebnisse wurden am Tag 26 nach der Tolerisierung bei in Mäusen beobachtet, die mit BLG 4 Tage nach dem Verfüttern des Tolerogens gereizt wurden.
Beispiel 6
IgE
Die Induzierung einer Toleranz durch Fütterung von Mäusen mit Molkenprotein führte zu verminderten humoralen Anti-BLG-IgE-Titern, und zwar 26 Tage nach der Tolerisierung. Diese Verminderung war statistisch signifikant (p<0,05) und zwar im Vergleich mit nicht-tolerisierten Mäusen. Diese verminderten humoralen Anti-BLG-IgE-Titer werden nicht beobachtet, wenn die Mäuse mit Ibuprofen behandelt werden, einem COX-Inhibitor (vergleiche 2).
Andererseits zeigen Mäuse, die mit Butyrat behandelt werden, weiter verminderte humorale Anti-BLG-IgE-Titer, verglichen mit den positiven Molkenprotein-gefütterten Kontrollmäusen. Diese weitere Verminderung der humoralen Anti-BLG-IgE-Titer war statistisch signifikant (p<0,05), verglichen mit tolerisierten Mäusen (positive Kontrolle).

Claims

Verwendung eines antigenen Lebensmittelmaterials, oder von antigenen Teilen davon, sowie von wenigstens einer Substanz, die in Zellen der Person die Aktivität von COX-2 (Cyclooxygenase 2) erhöht und/oder den Spiegel an IFN-γ (Interferon-γ) erhöht, bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Induzierung einer oralen Toleranz gegenüber dem antigenen Lebensmittelmaterial.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Lebensmittelmaterial sich von Milch, Ei, Soja, Nüssen, Krustentieren, Fisch, Fleisch, Sesam, Molke, Beeren oder Äpfeln ableitet.
Verwendung nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche, wobei die wenigstens eine Substanz, die in der Lage ist, die COX-2 Aktivität in Zellen des Individuums sowie ggf. den Spiegel an IFN-γ zu erhöhen, ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Butyrat, n-6 PUFA (n-6 polyungesättigten Fettsäuren) oder Ceramiden.