DE60118714T2

DE60118714T2 - Festphasensynthese und reagentien hierfür

Info

Publication number: DE60118714T2
Application number: DE60118714T
Authority: DE
Inventors: J. Melvin Carver SWANSON
Original assignee: Surmodics Inc
Current assignee: Surmodics Inc
Priority date: 2000-03-09
Filing date: 2001-02-06
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2021-02-07
Also published as: EP1268505A2; EP1268505B1; US6410643B1; CA2399043C; DE60118714D1; AU3484501A; WO2001066554A2; ATE323098T1; CA2399043A1; JP2003525945A; JP5048193B2; WO2001066554A3; MXPA02007445A

Description

TECHNISCHES GEBIET
In einer Erscheinung betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren, Reagentien und Trägerflächen zur Verwendung in der Festphasensynthese (z.B. repetitiv oder kombinatorisch). In einer anderen Erscheinung betrifft die Erfindung substituierte Polyacrylamidreagentien. In noch einer weiteren Erscheinung betrifft die Erfindung Reagentien zur Verwendung bei der Modifizierung von Trägerflächen und insbesondere die Verwendung von photochemischen Mitteln, um solche Reagentien an solche Flächen anzufügen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Festphasensynthese hat sich seit der bahnbrechenden Arbeit von R.B. Merrifield im Jahre 1963 enorm entwickelt. Typischerweise sind die verwendeten Reaktionen die gleichen wie bei einer gewöhnlichen Synthese, wobei einer der Reaktanten auf einem festen Träger verankert wird. Eine Festphasensynthese kann beispielsweise für die Synthese von Polynukleotiden, Polysacchariden und Polypeptiden verwendet werden, ebenso für andere Anwendungen in Repetitivsynthesen und der kombinatorischen Chemie.
Der Hauptvorteil des Festphasenverfahrens liegt darin, daß der Träger (einschließend alle an diesen angefügte Reagentien) unlöslich verbleibt und daher leicht von allen anderen Reagentien getrennt wird. Überschüssige Reagentien, andere Reaktionsprodukte und Nebenprodukte werden schnell und effizient beim Entfernen der Lösungsmittel entfernt. Eine Reinigung der Festphasenspezies ist schnell und vollständig, und ebenfalls kann das gesamte Verfahren automatisiert werden.
In den letzten Jahren sind die Prinzipien der Festphasensynthese auf eine neue Methodologie angewendet worden, die als „kombinatorische Chemie" bekannt ist. Wissenschaftler verwenden kombinatorische Chemie, um große Populationen von Molekülen, oder Sammlungen, zu erzeugen, die effizient en masse gescreent werden können. Durch Herstellung größerer, diversifizierterer Verbindungsammlungen können Firmen die Wahrscheinlichkeit erhöhen, daß sie neue Verbindungen von beträchtlichem therapeutischen und kommerziellen Wert finden. Das Gebiet stellt eine Annäherung von Chemie und Biologie dar, die durch fundamentale Fortschritte in der Miniaturisierung, der Robotortechnik und der Rezeptorentwicklung möglich ist.
Wie für die herkömmliche Arzneimittelentwicklung beruht die kombinatorische Chemie auf Methodologien organischer Synthese. Der Unterschied ist der Umfang – anstelle der Synthese einer einzelnen Verbindung nutzt die kombinatorische Chemie eine Automation und Miniaturisierung, um große Sammlungen von Verbindungen zu synthetisieren. Da jedoch große Sammlungen keine aktiven Verbindungen unabhängig herstellen, müssen Wissenschaftler ebenfalls die aktiven Komponenten innerhalb dieser enormen Populationen auffinden. Daher ist kombinatorische organische Synthese nicht zufällig, sondern systematisch und repetitiv, unter Verwendung von Sätzen chemischer „Bildungsblöcke", um diverse Sätze von molekularen Einheiten zu bilden.
Es gibt wenigstens drei übliche Ansätze zur kombinatorischen organischen Synthese. Während einer angeordneten, räumlich adressierbaren Synthese werden Bildungsblöcke systematisch in einzelnen Reaktionsbohrungen oder -positionen umgesetzt, um getrennte „diskrete Moleküle" zu bilden. Aktive Verbindungen werden durch ihre Stelle auf dem Gitter identifiziert. Dieses Verfahren ist in großem Maßstab (wie in der Parke-Davis Pharmaceutical „DIVERSOMER"-Methode) und ebenso in der Miniatur (wie in der Affymax „VLSIPS"- Methode) angewendet worden. Die zweite Methode, die als codierte Mischungssynthese bekannt ist, verwendet Nukleotide, Peptide oder andere Arten von inerteren chemischen Markierungen, um jede Verbindung zu identifizieren.
Während einer Dekonvolution, dem dritten Ansatz, wird eine Reihe von Verbindungsmischungen kombinatorisch synthetisiert, wobei jedes Mal einige spezifische Strukturmerkmale fixiert werden. Jede Mischung wird als eine Mischung getestet und die aktivste Kombination verfolgt. Weitere Runden fixieren andere Strukturmerkmale systematisch, bis eine überschaubare Anzahl von diskreten Strukturen synthetisiert und gescreent werden kann. Forscher, die beispielsweise mit Peptiden arbeiten, können eine Dekonvolution verwenden, um die aktivste Peptidsequenz aus Millionen von Möglichkeiten zu optimieren oder zu lokalisieren.
Auf einem verwandten Gebiet sind Oberflächen, die modifiziert worden sind, um reaktive Gruppen oder andere gewünschte Funktionalitäten bereitzustellen, seit langem verwendet worden zur Durchführung von Festphasensynthesen von sowohl polymeren als auch nichtpolymeren Molekülen. Eine Vielzahl von Festphasenharzen ist kommerziell erhältlich, z.B. solche, die von Argonaut Technologies erhältlich sind, einschließend deren Produktlinie von Polystyrol, ArgoGel^TM und ArgoPore^TM-Harze. Zusammen mit ähnlichen Produktlinien beschreibt die veröffentlichte internationale Patentanmeldung WO 9727226 („Highly Functionalized Polyethylene Glycol Grafted Polystyrene Supports"), übertragen an Argonaut Technologies, Polymere und Pfropfcopolymere mit einer Hauptkette von Poly(methylstyrol) und Seitenkettenpolymeren von Poly(ethylenoxid).
Solche Träger werden ebenfalls in JW Labadie („Polymeric Supports for Solid Phase Synthesis"), Current Opinions in Chemical Biology 2:346 (1998) beschrieben. Dieser Artikel beschreibt beispielsweise die Art und Weise, auf die funktionelle Gruppen in leicht vernetztes Polystyrol eingeführt werden können, unter Verwendung von entweder funktionellen Styrolmonomeren oder in einem Nachfunktionalisierungsschritt. In beiden Ansätzen sind jedoch die funktionellen Gruppen offensichtlich an den Polystyrolpolymeren angefügt, die verwendet werden, um den Träger selbst (z.B. Kugel) zu bilden, z.B. entgegengesetzt dazu, daß sie als ein getrennter Überzug zu einem vorher existierenden Träger zugefügt werden.
Der Artikel von Labadie beschreibt ebenfalls die Verwendung von PEG-Pfropfpolystyrol, z.B. in der Form des „TentaGel"-Produkts, das durch Aufpfropfen von Ethylenoxid auf Hydroxyl-funktionelles Polystyrol hergestellt wird. Der Artikel beschreibt ferner die Art und Weise, auf die verschiedene „Nachteile", die mit PEG-Pfropfharzen verbunden sind, durch ein Pfropfharz, das als „ArgoGel^TM" identifiziert wird, überwunden worden sind, das mit einer Verzweigung an der Polystyrol-Pfropfverknüpfung durch die Verwendung eines Polystyroldiols als das Basisharz gekennzeichnet ist. Mit jedem dieser Ansätze erscheinen die resultierenden Polymere auf funktionelle Gruppen an ihren terminalen Enden begrenzt zu sein, im Gegensatz dazu, daß sie funktionelle Gruppen in mehreren Positionen entlang der Länge des Polymers aufweisen.
Auf einem noch weiteren Gebiet ist eine Vielzahl von polymeren Zusammensetzungen zur Verwendung als elektrophoretische Gele beschrieben worden. Siehe im allgemeinen Righetti et al., J. Chromatog. B. Biomed. Sci. 10; 699 (1-2): 63–75 (1997), welcher neueste Fortschritte in der Polyacrylamidgelelektrophorese beschreibt.
Siehe beispielsweise U.S. 5,470,916 für „Formulations for Polyacrylamide Matrices in Electrokinetic and Chromatographic Methodologies". Die U.S. 5,470,916 beschreibt Zubereitungen, die über Polymerisation oder Copolymerisation einer einzigartigen Klasse von Monomeren erhalten werden.
Siehe ebenfalls U.S. 5,785,832 für „Covalently Cross-linked, Mixed-bed Agarosepolyacrylamide Matrices for Electrophoresis and Chromatography", welches Polyacrylamidmatrices beschreibt, die auf einer neuen Klasse von N-Mono und -Disubstituierten Acrylamidmonomeren basiert sind. Die U.S. 5,785,832 beschreibt die Art und Weise, auf die Gemischtbettmatrices des Polyacrylamid-Agarose-Typs, kovalent verknüpft (vernetzt), bei der Trennung von Fragmenten von Nukleinsäure, bestimmter DNA, einer Zwischengröße (von 50 bis 5.000 Basenpaare) und von Proteinen mit hoher molekularer Masse (>500.000 Da) geeignet sind. Die U.S. 5,785,832 liefert kovalent verknüpfte Gemischtbettmatrices aus Polyacrylamid-Agarose, die zur Verwendung bei der Trennung von Fragmenten von Nukleinsäuren einer mittleren Größe geeignet sind.
Substituierte Polyacrylamide, wie solche, die oben beschrieben worden sind, sind auf die Verwendung bei der Herstellung von elektrophoretischen Gelen beschränkt gewesen, und sind, soweit es der Anmelder weiß, bislang nicht an Oberflächen angefügt worden, geschweige denn angefügt worden für die Zwecke der Bereitstellung einer Festphasensynthesefläche, oder durch photochemische Mittel.
Auf einem getrennten Gebiet hat der Rechtsnachfolger der vorliegenden Erfindung zuvor die Modifikation von Oberflächen für eine Vielzahl von Zwecken beschrieben, und unter Verwendung einer Vielzahl von Reagentien. Insbesondere schließen diese Reagentien im allgemeinen die Verwendung von Photochemie ein, und insbesondere photoreaktive Gruppen, z.B. zur Anfügung von Polymeren und anderen Molekülen auf Trägerflächen. Siehe beispielsweise U.S. 4,722,906, 4,979,959, 5,217,492, 5,512,329, 5,563,056, 5,637,460, 5,714,360, 5,741,551, 5,744,515, 5,783,502, 5,858,653 und 5,942,555.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Durchführen einer Festphasensynthese, wobei das Verfahren nach Anspruch 1 die Schritte umfaßt:

a) Bereitstellen eines Trägermaterials mit einer Oberfläche, die für den Einsatz in kombinatorischen Synthesen eingerichtet ist,
b) Bereitstellen eines polymeren Reagenzes, gebildet durch die Polymerisation von Monomeren der Formel:
wobei R₁ Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyle bedeutet, und wobei R₂ und R₃, unabhängig voneinander, Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyle oder Phenyle enthaltend einen oder mehrere reaktive Substituenten ausgewählt aus
OR₅ oder SR₅ bedeuten (wobei R₄ ein C₁-C₆-Alkyl oder ein heterocyclischer Ring enthaltend ein oder mehrere Stickstoffatome ist, und R₅ ein C₁-C₆-Alkyl oder Phenyl ist, enthaltend einen oder mehrere reaktive Substituenten ausgewählt aus
c) Applizieren des Reagenzes auf die Trägeroberfläche und kovalentes Anbinden des polymeren Reagenzes an die Trägeroberfläche,
d) Bereitstellen eines ersten reaktiven Monomers, das zur Festphasensynthese eingerichtet ist, z.B. ausgewählt aus Nukleotiden und Aminosäuren, wobei das Monomer eine korrespondierende Gruppe umfaßt, die thermochemisch mit dem gebundenen reaktiven Substituenten reaktiv ist, und ebenfalls bevorzugt eine oder mehrere Gruppen umfaßt, die mit einer nachfolgenden zweiten Monomereinheit im Verlauf der Festphasensynthese reaktiv ist,
e) Kontaktieren und Reagieren des ersten Monomers mit dem polymeren Reagenz auf der Trägeroberfläche unter Bedingungen, die geeignet sind zum Umsetzen der korrespondierenden Gruppe mit dem gebundenen reaktiven Substituenten, um so eine wachsende polymere Kette bereitzustellen, und
f) Bereitstellen und nachfolgendes Anbringen weiterer Monomere an die wachsende Polymerkette, um ein gewünschtes Polymerprodukt zu erhalten.

Sobald es auf diese Weise gebildet ist, kann das resultierende polymere Produkt entweder zurückbehalten und in situ verwendet werden (z.B. in seinem gebundenen Zustand), oder es kann aus seiner Position auf dem Träger geschnitten und entfernt werden, um in einer unterschiedlichen Art und Weise verwendet zu werden.
In einer weiteren Erscheinung liefert die vorliegende Erfindung eine polymere Reagenzzusammensetzung, die angepaßt ist, um auf einer Trägeroberfläche aufgezogen zu werden, um diese Oberfläche mit einer hohen Dichte an reaktiven Gruppen zu versehen. Die so beschichtete Oberfläche kann für jeden geeigneten Zweck verwendet werden und ist insbesondere gut geeignet zur Verwendung als eine Festphasensyntheseträgeroberfläche. Die Syntheseträgeroberfläche kann wiederum in repetitiven und kombinatorischen Synthesen, wie der Synthese von Polynukleotiden, Polypeptiden und Polysacchariden, verwendet werden. Die polymere Beschichtung kann verwendet werden, um eine vergrößerte effektive Oberfläche bereitzustellen, insbesondere in Situationen, bei denen die effektive Fläche auf der Oberfläche selbst begrenzt ist, wie auf der Oberfläche einer Kugel oder eines Siliciumwafers. Auf diese Weise liefert die polymere Beschichtung eine optimale Kombination solcher Eigenschaften wie der Dichte an reaktiven Gruppen und der Oberfläche oder des Volumens.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das polymere Reagens in der Form eines hydrophilen oder amphiphilen polymeren Reagens bereitgestellt, das angepaßt ist, um auf eine Trägeroberfläche über stabile kovalente Bindungen beschichtet zu werden, um die Oberfläche mit einer hohen, jedoch steuerbaren Dichte an funktionellen Gruppen zu versehen, die zur Festphasensynthese von Peptiden, Oligonukleotiden und anderen Oligomeren (z.B. Peptidnukleinsäuren) oder nicht-polymeren organischen Verbindungen geeignet sind.
Das Reagenz kann hergestellt werden durch die Polymerisation von einem oder mehreren, funktionelle Gruppen enthaltenden Monomeren der Formel:
wobei R₁ Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyle darstellt und wobei R₂ und R₃, unabhängig voneinander, Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyle oder Phenyle darstellen, die eine oder mehrere reaktive Substituenten enthalten, die ausgewählt sind aus
OR₅ oder SR₅ (wobei R₄ ein C₁-C₆-Alkyl oder ein heterocyclischer Ring enthaltend ein oder mehrere Stickstoffatome ist, und R₅ ein C₁-C₆-Alkyl oder Phenyl ist, enthaltend einen oder mehrere reaktive Substituenten ausgewählt aus
Bestimmte Monomere dieses Typs werden beispielsweise in Righetti ('832) beschrieben, wobei die Offenbarung derselben hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das polymere Reagenz aus Monomeren hergestellt, die N-Acryloyl-Amino-Ethoxy-Ethanol (AAEE) einschließen, ein hoch hydrophiles Monomer, das äußerst resistent gegenüber einer Hydrolyse ist (Chiari, Micheletti, Nesi, Fazio, Righetti; Electrophoresis 15, 1994, 177–186). Andere Monomere dieses Typs werden in der US 5,858,653 beschrieben, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Das Verfahren und Reagenz dieser Erfindung findet insbesondere Anwendung in Situationen, in denen es gewünscht ist, die Synthesekapazität zu erhöhen, ohne daß notwendigerweise eine korrespondierende oder übermäßige Zunahme des Reaktionsvolumens benötigt wird. Das Reagenz der vorliegenden Erfindung liefert eine vorgebildete Polymerzusammensetzung, in der die Polymermoleküle gereinigt, charakterisiert und in einer Weise gesteuert werden können, die bislang nicht möglich gewesen ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform schließt das Reagenz die Anfügung von vorgebildeten synthetischen Polymeren an einer Oberfläche ein (was es unterscheidet von solchen, die durch Polymerisation in situ auf dem Träger gebildet werden), insbesondere die Anfügung der vorgebildeten Polymere durch photochemische Mittel. Es ist ebenfalls bevorzugt, daß die funktionellen Gruppen an einer Vielzahl von Positionen entlang der Polymerhauptkette vorliegen. Die Anzahl (oder durchschnittliche Anzahl) und die Position der funktionellen Gruppen kann durch die Wahl der verwendeten Monomere gesteuert werden, um das Polymer zu bilden, z.B. durch das Verhältnis von funktionelle Gruppen enthaltenden Monomeren zu „Verdünnungsmittel"-Monomeren.
Eine Polymerreagenzzusammensetzung dieser Erfindung liefert eine optimale Kombination solcher Eigenschaften wie Quellbarkeit, Dichte funktioneller Gruppen, Reaktivität, Permeabilität, Hydrophilie und hydrolytische Stabilität. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Reagenzzusammensetzung ein polymeres Derivat bereitstellend eine oder mehrere unterschiedliche reaktive Gruppen. Die Reagenzzusammensetzung kann an die Oberfläche auf irgendeine geeignete Weise angefügt werden, und sie wird bevorzugt kovalent an der Oberfläche angebunden, bevorzugter durch die Verwendung von photoreaktiven Gruppen.
Geeignete Trägermaterialien schließen Kugeln, Folien, Wafer, Filme, Scheiben und Platten (z.B. Mikrobohrungsplatten) ein, hergestellt aus solchen Materialien, wie Organosilan-behandeltem Glas, Organosilan-behandeltem Silicium, Polypropylen, Polyethylen und Polystyrol (optional vernetzt mit Divinylbenzol). Zusätzliche Trägermaterialien schließen aufgepfropfte Polyacrylamidkugeln, Latexkugeln, Dimethylacrylamidkugeln (optional vernetzt mit N,N'-Bis-acryloylethylendiamin), Glasteilchen beschichtet mit hydrophoben Polymeren, etc. ein (d.h. mit einer starren oder halbstarren Oberfläche). Divinylbenzolvernetzte, Polyethylenglykol-gepfropfte Polystyrol-artige Kügelchen können ebenfalls verwendet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Reagenz ein Hydroxylsubstituiertes Polyacrylamidreagenz. Ein solches Reagenz kann an eine Oberfläche beispielsweise photochemisch in irgendeiner gewünschten Weise und Konzentration angefügt werden, um die Oberfläche mit einer gewünschten Dichte von reaktiven Gruppen (z.B. primären Hydroxylgruppen) zu versehen.
Ein Polymer dieser Erfindung kann hergestellt werden unter Verwendung irgendwelcher geeigneten Mittel, z.B. durch die Reaktion von Monomeren, die eine oder mehrere funktionelle Gruppen bereitstellen, mit einem oder mehreren reaktiven Comonomeren (z.B. Monomeren, die eine photoreaktive Gruppe bereitstellen) und/oder mit einem oder mehreren nicht-reaktiven Comonomeren (z.B. „Verdünnungs"-Monomeren, die keine photoreaktive Gruppe oder funktionelle Gruppe aufweisen). Fachleute auf dem Gebiet werden auf der Basis der vorliegenden Beschreibung die Art und Weise erkennen, auf die ein Polymer dieser Erfindung durch freie Radikalpolymerisation unter Verwendung von Konzentrationen und Verhältnissen von Monomeren, maßgeschneidert, um die gewünschten Oberflächeneigenschaften herzustellen, synthetisiert werden kann. Somit können die relativen und absoluten Konzentrationen von funktionellen Gruppen und das Molekulargewicht des Polymers (und das Ausmaß der Verzweigung, etc.) und die Mittel zum Immobilisieren des Polymers (wie die Anzahl und/oder die Stellen der photoaktivierbaren Gruppen entlang seiner Länge) alle eingestellt werden, um die Leistung zu optimieren.
Comonomere mit funktionellen Gruppen verschiedener Arten und Reaktivitäten können ebenfalls ausgewählt werden. Obwohl es nicht der einzige bestimmende Faktor ist, kann die Länge irgendeines Abstandshalters, der zwischen einer funktionellen Gruppe und der schließlichen Polymerhauptkette eingeschlossen ist, einen vorhersagbaren oder bestimmbaren Effekt auf die Reaktivität der funktionellen Gruppe haben. Zusätzlich können verhältnismäßig inerte Monomere eingeschlossen werden, um als Verdünnungsmonomere zu wirken, um die Dichte der funktionellen Gruppen auf gewünschte Niveaus einzustellen und die gewünschten Polymereigenschaften zu erzielen, z.B. seine hydrophile, hydrophobe oder amphiphile Natur einzustellen, was wiederum seine Lösungseigenschaften beeinflussen kann.
Schließlich können Comonomere ebenfalls eingeschlossen werden, die reaktive Gruppen zum Immobilisieren des Polymers auf einer Oberfläche bereitstellen. Solche Monomere enthalten bevorzugt photoaktivierbare Gruppen oder können thermochemisch reaktive Gruppen einschließen, die verwendet werden können, um entweder das Polymer direkt an einer entsprechenden reaktiven Stelle oder Gruppe auf der Oberfläche anzufügen, oder an ein anderes Reagenz, das selbst eine photoaktivierbare Gruppe bereitstellt. Beispielsweise können.
Hydroxylgruppen mit einer Vielzahl von Aktivierungsagentien aktiviert werden (z.B. 1,1-Carbonyldiimidazol, 2,2,2-Trifluorethansulfonylchlorid oder 2-Fluor-1-methylpyridinium-p-toluolsulfonat). Solche Reaktionen können verwendet werden, um ein Hydroxylpolymer auf einer Oberfläche enthaltend Amingruppen (z.B. glasbeschichtet mit 3-Aminopropyltriethoxysilan) zu immobilisieren. In diesem Beispiel kann jeder Überschuß an aktivierten Hydroxylgruppen, der nicht mit Aminen auf der Oberfläche reagiert, zurück zu freien Hydroxylgruppen hydrolysiert werden. Die Comonomere können ebenfalls mit unterschiedlichen Polymerisationsgeschwindigkeiten ausgewählt werden, um die Verteilung von Comonomeren im Polymer zu optimieren. Optional oder zusätzlich kann die Comonomerverteilung durch die Herstellung und Verwendung von Blockcopolymeren gesteuert und beeinflußt werden.
Hydrophile oder amphiphile Polymere können ebenfalls bereitgestellt werden, mit Mitteln zur Immobilisierung auf einer Oberfläche über stabile kovalente Bindungen und mehrere funktionelle Gruppen des hier beschriebenen Typs. Solche Polymere finden insbesondere Anwendung zur Festphasensynthese von Peptiden, Oligonukleotiden, ähnlichen Arten von Polymeren (z.B. Peptidnukleinsäuren) und nicht-polymeren organischen Verbindungen. Die Verwendung von vorsynthetisierten Polymeren, z.B. im Gegensatz zu gepfropften Polymeren oder solchen, die in situ gebildet werden, liefert eine Anzahl von Vorteilen, einschließend die Fähigkeit, das Polymer vor der Immobilisierung zu reinigen und zu charakterisieren.
Ein Verfahren zum Bereitstellen von reaktiven Gruppen auf einer Oberfläche wird ebenfalls offenbart. Das Verfahren schließt den Schritt eines Beschichtens der Oberfläche mit einer hierin beschriebenen Reagenzzusammensetzung ein.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Ein Reagenz dieser Erfindung kann hergestellt werden durch die Polymerisation von Monomeren enthaltend funktionelle Gruppen, optional und bevorzugt in Kombination mit anderen Monomeren, wie solchen, die andere geeignete Gruppen, Verdünnungsmonomere und dergleichen enthalten.
Ein Polymer der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden durch Polymerisieren eines oder mehrerer Monomere, das bzw. die ausgewählt wird bzw. werden aus der Gruppe:
wobei R₁ Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyle darstellt und wobei R₂ und R₃, unabhängig voneinander, Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyle oder Phenyle darstellen, die einen oder mehrere reaktive Substituenten enthalten, die ausgewählt sind aus
OR₅ oder SR₅ (wobei R₄ ein C₁-C₆-Alkyl oder ein heterocyclischer Ring enthaltend ein oder mehrere Stickstoffatome ist, und R₅ ein C₁-C₆-Alkyl oder Phenyl ist, enthaltend einen oder mehrere reaktive Substituenten ausgewählt aus
Optional und bevorzugt werden die resultierenden Polymere ebenfalls an der Oberfläche über photochemische Mittel, z.B. durch die Integration einer oder mehrerer Photogruppen in das Polymer über Photogruppen-enthaltende copolymerisierbare Monomere angefügt.
Comonomere können ausgewählt werden, um irgendeine gewünschte Eigenschaft oder Funktion bereitzustellen, einschließend irgendeine gewünschte Reaktivität. Obwohl es nicht der einzige bestimmende Faktor ist, hat die Länge des Abstandshalters zwischen den funktionellen Gruppen und der Polymerhauptkette häufig einen Einfluß auf die Reaktivität der funktionellen Gruppen.
Zusätzlich können „inerte" oder „Verdünnungs"-Monomere verwendet werden, um die Dichte der funktionellen Gruppen auf optimale Niveaus einzustellen und die gewünschten Polymereigenschaften zu erhalten, wie hydrophile oder amphiphile Polymere, um optimale Solvatationseigenschaften zu erzielen. Beispiele solche Monomere schließen beispielsweise Acrylamid, N-Vinylpyrrolidon, Methacrylamid, N-Isopropylacrylamid, N-Vinylpyridin, N-Vinylcaprolactam, Styrol, Vinylacetat und N-Acryloylmorpholin ein.
Eine bevorzugte Zusammensetzung dieser Erfindung schließt eine oder mehrere anhängende, latent reaktive (bevorzugt photoreaktive) Gruppen ein, die kovalent angefügt sind oder angepaßt sind, um angefügt zu werden, direkt oder indirekt, an ein copolymerisierbares Monomer. Photoreaktive Gruppen werden hierin definiert, und bevorzugte Gruppen sind ausreichend stabil, um unter Bedingungen gelagert zu werden, in denen sie solche Eigenschaften bewahren. Siehe beispielsweise US 5,002,582 , deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Latent reaktive Gruppen können ausgewählt werden, die auf verschiedene Bereiche des elektromagnetischen Spektrums ansprechen, wobei solche, die auf ultraviolette und sichtbare Bereiche des Spektrums (hierin bezeichnet als „photoreaktiv") ansprechen, besonders bevorzugt sind.
Photoreaktive Gruppen antworten auf spezifische applizierte externe Stimuli, um einer aktiven Spezieserzeugung mit resultierender kovalenter Bindung an eine angrenzende chemische Struktur zu unterliegen, wie sie beispielsweise durch das gleiche oder ein anderes Molekül bereitgestellt wird. Photoreaktive Gruppen sind solche Gruppen von Atomen in einem Molekül, die ihre kovalenten Bindungen unter Bedingungen der Lagerung unverändert bewahren, die jedoch bei Aktivierung durch eine externe Energiequelle kovalente Bindungen mit anderen Molekülen bilden.
Die photoreaktiven Gruppen erzeugen aktive Spezies, wie freie Radikale und insbesondere Nitrene, Carbene und angeregte Zustände von Ketonen bei Absorption von elektromagnetischer Energie. Photoreaktive Gruppen können ausgewählt werden, um auf verschiedene Bereiche des elektromagnetischen Spektrums anzusprechen, und photoreaktive Gruppen, die beispielsweise auf ultraviolette und sichtbare Bereiche des Spektrums ansprechen, sind bevorzugt und können hierin gelegentlich als „photochemische Gruppe" oder „Photogruppe" bezeichnet werden.
Photoreaktive Arylketone sind bevorzugt, wie Acetophenon, Benzophenon, Antrachinon, Anthron und Anthron-artige Heterocyclen (d.h. heterocyclische Analoga von Anthron, wie solche mit N, O oder S in der 10-Position), oder deren substituierten (z.B. Ring-substituierten) Derivate. Beispiele von bevorzugten Arylketonen schließen heterocyclische Derivate von Anthron, einschließend Acridon, Xanthon und Thioxanthon, und deren Ring-substituierten Derivate ein.
Die funktionellen Gruppen solcher Ketone sind bevorzugt, da sie leicht in der Lage sind, einem hierin beschriebenen Aktivierungs/Inaktivierungs/Reaktivierungszyklus zu unterliegen. Benzophenon ist eine besonders bevorzugte photoreaktive Einheit, da es in der Lage ist zur photochemischen Anregung mit der anfänglichen Bildung eines angeregten Singlettzustands, der einem Intersystemübergang zu dem Triplettzustand unterliegt. Der angeregte Triplettzustand kann in Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen durch Abstraktion eines Wasserstoffatoms (beispielsweise von einer Trägeroberfläche) insertieren, wodurch ein Radikalpaar erzeugt wird. Ein nachfolgender Kollaps des Radikalpaares führt zur Bildung einer neuen Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung. Wenn eine reaktive Bindung (z.B. Kohlenstoff-Wasserstoff) zur Bindung nicht verfügbar ist, ist die durch ultraviolettes Licht induzierte Anregung der Benzophenongruppe reversibel und das Molekül kehrt zu seinem Grundzustandsenergieniveau bei Entfernen der Energiequelle zurück. Photoaktivierbare Arylketone, wie Benzophenon und Acetophenon, sind von besonderer Bedeutung, da diese Gruppen Gegenstand einer mehrfachen Reaktivierung in Wasser sind und somit eine erhöhte Beschichtungseffizienz bereitstellen.
Die Azide bilden eine zusätzliche bevorzugte Klasse von photoreaktiven Gruppen und schließen Arylazide (C₆R₅N₃), wie Phenylazid und insbesondere 4-Fluor-3-nitrophenylazid, Acylazide (-CO-N₃), wie Benzoylazid und p-Methylbenzoylazid, Azidoformate (-O-CO-N₃), wie Ethylazidoformat, Phenylazidoformat, Sulfonylazide (-SO₂-N₃), wie Benzolsulfonylazid, und Phosphorylazide (RO)₂PON₃, wie Diphenylphosphorylazid und Diethylphosphorylazid, ein. Diazoverbindungen bilden eine weitere Klasse von photoreaktiven Gruppen und schließen Diazoalkane (-CHN₂), wie Diazomethan und Diphenyldiazomethan, Diazoketone (-CO-CHN₂), wie Diazoazetophenon und 1-Trifluormethyl-1-diazo-2-pentanon, Diazoazetate (-O-CO-CHN₂), wie t-Butyldiazoacetat und Phenyldiazoacetat, und beta-keto-alpha-Diazoacetat (-CO-CN₂-CO-O-), wie t-Butyl-alpha-diazetoacetat, ein. Andere photoreaktive Gruppen schließen die Diazirine (-CHN₂), wie 3-Trifluormethyl-3-phenyldiazirin, und Ketene (-CH=C=O), wie Keten und Diphenylketen, ein.
Bei Aktivierung der photoreaktiven Gruppen werden die Reagenzmoleküle kovalent aneinander und/oder an die Materialoberfläche durch kovalente Bindungen durch Reste der photoreaktiven Gruppen gebunden. Beispielhafte photoreaktive Gruppen und deren Reste bei Aktivierung sind wie folgt gezeigt (wobei R und R' irgendwelche nicht-störenden organischen Gruppen sind).
Die photoaktivierbaren Monomere der Erfindung können auf irgendeine Oberfläche mit Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen appliziert werden, mit denen die photoreaktiven Gruppen reagieren können, um das resultierende Polyacrylamid auf Oberflächen zu immobilisieren. Beispiele von geeigneten Substraten schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Polypropylen, Polystyrol, Poly(vinylchlorid), Polycarbonat, Poly(methylmethacrylat), Parylen und irgendeines der zahlreichen Organosilane, die verwendet werden, um Glas oder andere organische Oberflächen vorzubehandeln.
Polymere dieser Erfindung werden bevorzugt durch freie Radikalpolymerisation unter Verwendung von Konzentrationen und Verhältnissen von Monomeren synthetisiert, die maßgeschneidert sind, um die gewünschten Oberflächeneigenschaften zu erzielen. Somit können die Gehalte an funktionellen Gruppen, das Molekulargewicht des Polymers und die Mittel zum Immobilisieren des Polymers (z.B. durch Integration von photoaktivierbaren Gruppen) von Fachleuten auf dem Gebiet eingestellt werden, um irgendein gewünschtes Produkt zu erhalten und/oder die Leistung oder die physikalisch/chemischen Eigenschaften in einer oder mehreren Beziehungen zu optimieren.
Ein Reagenz der vorliegenden Erfindung kann in einer Vielzahl von Wegen verwendet werden, um funktionalisierte Trägeroberflächen zur Verwendung in der Festphasensynthese bereitzustellen. In einer Ausführungsform kann das Reagenz abgepackt sein und getrennt bereitgestellt werden, und optional in Bulkware, um auf eine Oberfläche durch den Verwender zum Zeitpunkt der Verwendung aufgetragen zu werden. In einer weiteren Ausführungsform kann das Reagenz aufgetragen und kovalent an einen Träger gebunden werden (z.B. durch photochemische Mittel) zum Zeitpunkt der Herstellung des Trägers selbst, und das resultierende beschichtete Trägermaterial kann abgepackt und in einer Form verkauft werden, die im wesentlichen zur Verwendung fertig ist.
TABELLE DER STRUKTUREN
VERBINDUNG I
VERBINDUNG II
VERBINDUNG III
VERBINDUNG IV
VERBINDUNG V
VERBINDUNG VI
VERBINDUNG VII
VERBINDUNG VIII

wobei x = 0 bis 5 Mol-%, y = 5 bis 100 Mol-% und z = 0 bis 95 Mol-%

VERBINDUNG IX

wobei x = 0 bis 5 Mol-%, y = 5 bis 100 Mol-% und z = 0 bis 95 Mol-%

VERBINDUNG X

wobei m = 15 bis 45 und n = 50 bis 150 (statistisch auftretend)

VERBINDUNG XI

wobei x = 0 bis 5 Mol-%, y = 5 bis 100 Mol-% und z = 0 bis 95 Mol-%

Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, jedoch nicht zu begrenzen. Während die Erfindung in bezug auf ihre bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, werden Fachleute auf dem Gebiet erkennen, daß die Erfindung mit Modifikationen innerhalb des Geistes und Umfangs der beigefügten Ansprüche durchgeführt werden kann.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung von 4-Benzoylbenzoylchlorid (BBA-Cl) (Verbindung I)
Um eine reaktive Photogruppe herzustellen, wurde 4-Benzoylbenzoesäure (BBA), 1,0 kg (4,42 mol), zu einem trockenen 5-Liter Mortonkolben, ausgerüstet mit Rückflußkondensator und Überkopfrührer, zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 645 ml (8,84 mol) Thionylchlorid und 725 ml Toluol. Dimethylformamid (3,5 ml) wurde dann zugegeben und die Mischung unter Rückfluß für 4 Stunden erwärmt. Nach dem Abkühlen wurden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und das restliche Thionylchlorid durch drei Verdampfungen unter Verwendung von 3 × 500 ml Toluol entfernt. Das Produkt wurde aus 1:4 Toluol:Hexan umkristallisiert, um 988 g (91% Ausbeute) nach Trocknen in einem Vakuumofen zu ergeben. Der Produktschmelzpunkt war 92–94°C. Eine kernmagnetische Resonanzanalyse (NMR) bei 80 MHz (¹H-NMR (CDCl₃)) war mit dem gewünschten Produkt konsistent. Aromatische Protonen 7,20–8,25 (m, 9H). Alle chemischen Verschiebungswerte sind in ppm Tieffeld von einem internen Tetramethylsilanstandard. Die Endverbindung wurde zur Verwendung bei der Herstellung eines Monomers zur Verwendung in der Synthese von photoaktivierbaren Polymeren, wie es beispielsweise in Beispiel 3 beschrieben ist, gelagert.
Beispiel 2
Herstellung von N-(3-Amino-propyl)-methacrylamidhydrochlorid (AMPA) (Verbindung II)
Um ein Amin enthaltendes Monomerzwischenprodukt zu bilden, wurde eine Lösung von 1,3-Diaminopropan, 1.910 g (25,77 mol), in 1.000 ml CH₂Cl₂ zu einem 12-Liter-Mortonkolben zugegeben und in einem Eisbad gekühlt. Eine Lösung von t-Butylphenylcarbonat, 1.000 (5,15 mol), in 250 ml CH₂Cl₂ wurde dann tropfenweise mit einer Geschwindigkeit zugegeben, die die Reaktionstemperatur unter 15°C hielt. Folgend der Zugabe wurde die Mischung auf Raumtemperatur erwärmt und 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 900 ml CH₂Cl₂ und 500 g Eis verdünnt, gefolgt von der langsamen Zugabe von 2.500 ml 2,2 N NaOH. Nach Testen, um zu gewährleisten, daß die Lösung basisch war, wurde das Produkt zu einem Scheidetrichter überführt und die organische Schicht entfernt und als Extrakt #1 beiseitegestellt. Die wäßrige Lösung wurde dann mit 3 × 1.250 ml CH₂Cl₂ extrahiert, wobei jede Extraktion als eine getrennte Fraktion bewahrt wurde. Die vier organischen Extrakte wurden dann aufeinanderfolgend mit einer einzelnen Menge von 1.250 ml 0,6 N NaOH beginnend mit Fraktion #1 und fortschreitend bis zu Fraktion #4 gewaschen. Dieses Waschen wurde ein zweites Mal mit einer frischen Menge von 1.250 ml 0,6 N NaOH wiederholt. Die organischen Extrakte wurden dann vereinigt und über Na₂SO₂ getrocknet. Eine Filtration und Verdampfung des Lösungsmittels auf ein konstantes Gewicht ergab 825 g N-Mono-t-BOC-1,3-diaminopropan, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
Eine Lösung von Methacrylsäureanhydrid, 806 g (5,23 mol) in 1.020 ml CHCl₃ wurde in einem 12-Liter-Mortonkolben angeordnet, der mit Überkopfrührer ausgerüstet war, und in einem Eisbad gekühlt. Phenothiazin, 60 mg, wurde als ein Inhibitor zugegeben, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von N-Mono-t-BOC-1,3-diaminopropan, 825 g (4,73 mol), in 825 ml CHCl₃. Die Zugabegeschwindigkeit wurde gesteuert, um die Reaktionstemperatur immer unter 10°C zu halten. Nachdem die Zugabe vollständig war, wurde das Eisbad entfernt und die Mischung über Nacht rühren gelassen. Das Produkt wurde mit 2.400 ml Wasser verdünnt und zu einem Scheidetrichter überführt. Nach gründlichem Mischen wurde die wäßrige Schicht entfernt und die organische Schicht mit 2.400 ml 2 N NaOH gewaschen, was gewährleistete, daß die wäßrige Schicht basisch war. Die organische Schicht wurde dann über Na₂SO₄ getrocknet und filtriert, um das Trocknungsagens zu entfernen. Ein Teil des CHCl₃-Lösungsmittels wurde unter vermindertem Druck entfernt, bis das vereinigte Gewicht des Produkts und des Lösungsmittels etwa 3.000 g war. Das gewünschte Produkt wurde dann durch langsame Zugabe von 11,0 l Hexan zu der gerührten CHCl₃-Lösung ausgefällt, gefolgt von einer Lagerung über Nacht bei 4°C. Das Produkt wurde durch Filtration isoliert und der Feststoff zweimal mit einer Lösungsmittelkombination aus 900 ml Hexan und 150 ml CHCl₃ gespült. Gründliches Trocknen des Feststoffes ergab 900 g N-[N'-(t-Butyloxycarbonyl)-3-aminopropyl]-methacrylamid, Schmelzpunkt 85,8°C durch Differentialscanningkalorimetrie (DSC). Eine Analyse an einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) Amid-NH's 6,30-6,80, 4,55-5,10 (m, 2H), Vinylprotonen 5,65, 5,20 (m, 2H), Methylen benachbart zu N 2,90-3,45 (m, 4H), Methyl 1,95 (m, 3H), verbleibendes Methylen 1,50-1,90 (m, 2H) und t-Butyl 1,40 (s, 9H).
Ein 2-Liter-Dreihalsrundkolben wurde mit einem Überkopfrührer und einem Gaseinblasrohr ausgerüstet. Methanol, 700 ml, wurde zu dem Kolben zugegeben und auf einem Eisbad gekühlt. Während des Rührens wurde HCl-Gas in das Lösungsmittel eingeblasen mit einer Geschwindigkeit von etwas 5 l/min für insgesamt 40 Minuten. Die Molarität der fertigen HCl/MeOH-Lösung wurde auf 8,5 M durch Titration mit 1 N NaOH unter Verwendung von Phenolphthalein als ein Indikator bestimmt. Das N-[N'-(t-Butyloxycarbonyl)-3-aminopropyl]methacrylamid, 900 g (3,71 mol), wurde zu einem 5-Liter-Mortonkolben zugegeben, der mit einem Überkopfrührer und einem Gasauslaßadapter ausgerüstet war, gefolgt von der Zugabe von 1.150 ml Methanollösungsmittel. Einige Feststoffe verblieben im Kolben mit diesem Lösungsmittelvolumen. Phenothiazin, 30 mg, wurde als ein Inhibitor zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 655 ml (5,57 mol) der 8,5 M HCl/MeOH-Lösung. Die Feststoffe lösten sich langsam mit der Entwicklung von Gas, jedoch war die Reaktion nicht exotherm. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten. Jegliche Feststoffe wurden dann durch Filtration entfernt und weitere 30 ml Phenothiazin zugegeben. Das Lösungsmittel wurde dann gestrippt unter vermindertem Druck und der resultierende Feststoffrückstand mit 3 × 1.000 ml Isopropanol mit Verdampfung unter vermindertem Druck azeotropiert. Schließlich wurde das Produkt in 2.000 ml Isopropanol unter Rückfluß gelöst und 4.000 ml Ethylacetat wurden langsam unter Rühren zugegeben. Die Mischung konnte sich langsam auf Raumtemperatur abkühlen und wurde bei 4°C über Nacht gelagert. Verbindung II wurde durch Filtration isoliert und auf konstantes Gewicht getrocknet, ergebend eine Ausbeute von 630 g mit einem Schmelzpunkt von 124,7°C durch DSC. Eine Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistet mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (D₂O) Vinylprotonen 5,60, 5,30 (m, 2H), Methylen benachbart zu Amid-N 3,30 (t, 2H), Methylen benachbart zu Amin-N 2,95 (t, 2H), Methyl 1,90 (m, 3H) und verbleibendes Methylen 1,65-2,10 (m, 2H). Das Endprodukt wurde zur Verwendung bei der Herstellung eines Monomers gelagert, das in der Synthese von photoaktivierbaren Polymeren, wie es beispielsweise in Beispiel 3 beschrieben wird, verwendet wird.
Beispiel 3
Herstellung von N-[3-(4-Benzoylbenzamido)propyl]methacrylamid (BBA-APMA) (Verbindung III)
Die reaktive Photogruppe von Beispiel 1 und das Aminmonomer von Beispiel 2 wurden umgesetzt (über eine Amidverknüpfung), um ein Photogruppen-enthaltendes Monomer auf die folgende Art und Weise zu bilden. Verbindung II 120 g (0,672 mol), hergestellt gemäß der allgemeinen, in Beispiel 2 beschriebenen Methode, wurde zu einem trockenen 2-Liter-Dreihalsrundkolben, ausgerüstet mit einem Überkopfrührer, zugegeben. Phenothiazin, 23–25 mg, wurde als ein Inhibitor zugegeben, gefolgt von 800 ml Chloroform. Die Suspension wurde unter 10°C auf einem Eisbad abgekühlt, und 172,5 g (0,705 mol) Verbindung I, hergestellt gemäß der allgemeinen in Beispiel 1 beschriebenen Methode, wurde als ein Feststoff zugegeben. Triethylamin, 207 ml (1,485 mol), in 50 ml Chloroform wurde dann tropfenweise über eine Dauer von 1–1,5 Stunden zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt und das Rühren bei Umgebungstemperatur für 2,5 Stunden fortgeführt. Das Produkt wurde dann mit 600 ml 0,3 N HCl und 2 × 300 ml 0,07 N HCl gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wurde das Chloroform unter vermindertem Druck entfernt und das Produkt zweimal aus 4:1 Toluol:Chloroform unter Verwendung von 23–25 mg Phenothiazin in jeder Umkristallisation umkristallisiert, um eine Polymerisation zu verhindern. Typische Ausbeuten der Verbindung III waren 90% mit einem Schmelzpunkt von 147–151°C. Eine Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) aromatische Protonen 7,20–7,95 (m, 9H), Amid-NH 6,55 (breites t, 1H), Vinylprotonen 5,65, 5,25 (m, 2H), Methylen benachbart zu Amid-N's 3,20-3,60 (m, 4H), Methyl 1,95 (s, 3H) und verbleibendes Methylen 1,50-2,00 (m, 2H). Das Endprodukt wurde zur Verwendung in der Synthese von photoaktivierbaren Polymeren gelagert, wie sie beispielsweise in Beispielen 8–11 und 13 beschrieben wird.
Beispiel 4
Herstellung von N-(3-Hydroxypropyl)acrylamid (HPA) (Verbindung IV)
Ein Monomer enthaltend eine funktionelle Gruppe in der Form einer Hydroxylgruppe wurde auf die folgende Art und Weise hergestellt. Acryloylchlorid, 53 ml (0,66 mol) wurde auf –40°C in einem Dreihalsrundkolben, eingetaucht in einen Isopropanol/Trockeneis-Bad, gekühlt. Der Kolben wurde mit einem Zugabetrichter, einem Thermometer und einem Argoneinlaß ausgerüstet. Ethanol (1.000 ml) wurde auf –40°C gekühlt und zu dem kalten Acryloylchlorid zugegeben. 3-Amino-1-propanol, 100 ml (1,3 mol), wurde in 1.000 ml Ethanol gelöst. Diese Lösung wurde zum Zugabetrichter überführt und zu dem Acryloylchlorid tropfenweise zugegeben. Die Lösung wurde in dem Ethanol/Trockeneis-Bad für 2 Stunden gerührt, gefolgt von einem Rühren bei 4°C über Nacht. Das Lösungsmittel wurde verdampft. Nach der Zugabe von 25 ml Phenothiazin wurde der Rückstand in Chloroform gelöst und auf Silicagel gereinigt. Nach dem Waschen mit Chloroform wurde das Produkt mit Aceton eluiert, was 96,1 g (82% Ausbeute) ergab.
Beispiel 5
Herstellung von N-(2-Ethoxy-(2-hydroxyethyl)acrylamid (HEEA) (Verbindung V)
Ein weiteres Monomer enthaltend eine Hydroxylgruppe wurde durch die im wesentlichen gleiche Vorgehensweise wie in Beispiel 4 hergestellt, außer daß 40,4 ml (0,5 mol) Acryloylchlorid mit 100,2 ml (1,0 mol) 2-(2-Aminoethoxy)ethanol umgesetzt wurden. Die Verbindung wurde aus Silicagel mit Aceton eluiert, um 94,6 g (119% Ausbeute) zu ergeben.
Beispiel 6
Herstellung von N-Acrylamido-D-glucosamin (AGA) (Verbindung VI)
Ein weiteres alternatives Monomer enthaltend eine funktionelle Gruppe in der Form einer Hydroxylgruppe wurde auf die folgende Art und Weise hergestellt. Glucosaminhydrochlorid, 10,0 g (0,0464 mol), wurde zu 12 ml 3,8-M Natriumhydroxid zugegeben. Kaliumcarbonat. 0,30 g (0,0022 mol) und Natriumnitrit, 0,35 g (0,0051 mol), wurden dann zugegeben und die Mischung gerührt, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Zu der klaren Lösung wurden 10 ml Chloroform zugegeben, und die Mischung wurde heftig gerührt, während sie in einem Eisbad war. Eine Lösung von Acryloylchlorid, 4,45 g (4,0 ml; 0,0492 mol), in 5 ml Chloroform wurde in Anteilen von 100 Mikrolitern mit wechselweisen Zugaben von 55 μl 10 N Natriumhydroxid (4,95 ml insgesamt) unter Rühren in einem Eisbad zugegeben. Das Rühren wurde für 30 Minuten fortgeführt, nachdem die Zugaben beendet war. Das Chloroform wurde entfernt. Der pH-Wert wurde auf 3 eingestellt, gefolgt von 3 × 10 ml Extraktionen von Chloroform, um Acrylsäure zu entfernen. Die Wasserlösung wurde bei ungefähr 4°C gelagert. Die Verwendung von AGA in der Polymerisation ist in Beispielen 12 und 13 beschrieben.
Beispiel 7
Herstellung von N-(2-Mercaptoethyl)-2,6-bis(4-benzoylbenzamido)hexanamid (Verbindung VII)
Ein photoaktivierbares Chain-Transfer-Reagenz wurde auf die folgende Art und Weise hergestellt. Lysinmonohydrochlorid, 3,65 g (20 mmol), wurde in 8 ml 2 N Natriumhydroxid gelöst und in einem Eisbad gekühlt. Eine Lösung von 10,77 g (44 mmol) 4-Benzoylbenzoylchlorid hergestellt gemäß dem allgemein in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, in 17 ml Chloroform wurde gleichzeitig mit 4,48 g Natriumhydroxid in 19 ml Wasser zugegeben. Die Reaktion wurde auf dem Eisbad für 2 Stunden gerührt und konnte sich dann auf Raumtemperatur für 3 Stunden erwärmen. Salzsäure wurde verwendet, um den pH-Wert auf 1 einzustellen und weitere 60 ml Chloroform wurden zugegeben. Eine Zentrifuge wurde verwendet, um die Schichten zu trennen, und die wäßrige Schicht wurde mit 3 × 50 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet. Ein Ansatz wurde durchgeführt, um das resultierende feste Produkt aus 80% Essigsäure umzukristallisieren, jedoch war die Wiedergewinnung des Produkts schlecht. Die Mutterlösungen wurden mit Wasser verdünnt, um das Produkt auszufällen, welches dann in Chloroform gelöst und mit 10% Natriumbicarbonat, 1 N Salzsäure und schließlich Wasser gewaschen wurde. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Produkt ohne Reinigung verwendet. Eine Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) Säureproton 8,45 (breites s, 1H), aromatische und Amid-Protonen 7,00-8,10 (m, 20H), CH 4,50-4,90 (m, 1H), Methylen benachbart zu N 3,30-3,70 (m, 2H), verbleibende Methylene 1,10-2,25 (m, 6H).
Das Lysinderivat, 4,35 g (7,73 mmol), und N-Hydroxysuccinimid, 0,901 g (7,83 mmol), wurden in 40 ml trockenem 1,4-Dioxan gelöst, gefolgt von der Zugabe von 1,951 g (9,45 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 10 ml 1,4-Dioxan. Die Mischung konnte über Nacht bei Raumtemperatur gerührt werden. Der resultierende weiße Feststoff wurde abfiltriert und mit 2 × 25 ml 1,4-Dioxan gewaschen. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit 3 × 25 ml Hexan gespült, um überschüssiges DCC zu entfernen. Der resultierende N-Oxysuccinimidester (NOS), 4,10 g (81% Ausbeute), wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
2-Aminoethanthiolhydrochlorid, 0,75 g (6,6 mmol), wurde mit 15 ml Chloroform und 1,09 ml Triethylamin unter einer Argonatmosphäre verdünnt. Der NOS-Ester, 4,10 g (6,22 mol), in 25 ml Chloroform wurde tropfenweise bei Raumtemperatur über eine Dauer von 30 Minuten zugegeben. Nach 4-stündiger Reaktion wurde die Mischung mit Wasser und 0,05 N Salzsäure gewaschen, gefolgt von einem Trocknen über Natriumsulfat. Das Produkt wurde unter Verwendung einer Silicagelflashchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus 95:5 CHCl₃:CH₃OH gereinigt, um 2,30 g des Produkts in einer 59%igen Ausbeute zu ergeben. Eine Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) aromatische und Amid-Protonen 6,90-8,00 (m, 21H), CH 4,40-4,85 (m, 1H), Methylene benachbart zu N 3,00-3,75 (m, 4H), verbleibende Methylene 1,00-2,95 (m, 8H) und SH 1,40 (t, 1H).
Beispiel 8
Herstellung von Copolymer aus Acrylamid BBA-APMA und (HPA) (statistisches Photo-PA-HPA) (Verbindung VIII)
Ein photoaktivierbares Copolymer der vorliegenden Erfindung wurde auf die folgende Art und Weise hergestellt. Acrylamid, 1,69 g (23,8 mmol), zur Verwendung als ein „Verdünnungs"-Monomer, wie es hierin beschrieben wird, wurde in 43,5 ml DMSO zusammen mit 0,17 g (0,49 mmol) BBA-AMPA (Photogruppen-enthaltendes Monomer, Verbindung III), hergestellt gemäß dem allgemein in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren, 3,14 g (24,3 mmol) HPA (ein OH-enthaltendes Monomer, Verbindung IV), hergestellt gemäß dem allgemein in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren, 0,10 g (0,58 mmol) 2,2'- Azobisisobutyronitril (AIBN) und 0,049 ml (0,32 mmol) N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) gelöst. Die Lösung wurde mit einem Heliumgasrohr für 4 Minuten von Sauerstoff befreit. Der Kopfraum wurde durch Argon ersetzt, und das Gefäß wurde für ein Erwärmen über Nacht bei 55°C versiegelt. Die Reaktionslösung wurde in Dialyseröhrchen (12–14.000 MWCO) angeordnet und gegenüber DI-Wasser für 5 Tage dialysiert. Die Wasserlösung wurde lyophilisiert, um 4 g weißen Feststoff mit einer Photobeladung von 0,094 μmol/mg (Theorie 0,097 μmol/mg) zu ergeben.
Beispiel 9
Herstellung eines Copolymers aus BBA-APMA und (HPA) (statistisches Photo-HPA) (Verbindung VIII)
Ein photoaktivierbares Copolymer der vorliegenden Erfindung wurde auf die folgende Art und Weise hergestellt (und ohne die Verwendung eines „Verdünnungs"-Monomers, wie Acrylamid). BBA-AMPA (Verbindung III), hergestellt gemäß dem allgemein in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren, 0,17 g (0,49 mmol), wurde in 33 ml DMSO zusammen mit 4,87 g (37,73 mmol) HPA (Verbindung IV), hergestellt gemäß dem allgemein in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren, 0,08 g (0,46 mmol) AIBN und 0,038 ml (0,25 mmol) TEMED gelöst. Die Lösung wurde mit einem Heliumgasrohr für 4 Minuten von Sauerstoff befreit. Der Kopfraum wurde durch Argon ersetzt, und das Gefäß wurde für ein Rühren über Nacht bei 55°C versiegelt. Die Reakionslösung wurde in einem Dialyseröhrchen (12–14.000 MWCO) angeordnet und gegen DI-Wasser für 5 Tage dialysiert. Die Wasserlösung wurde lyophilisiert, um 4,27 g weißen Feststoff mit einer Photobeladung von 0,073 μmol/mg (Theorie 0,076 μmol/mg) zu ergeben.
Beispiel 10
Herstellung eines Copolymers aus Acrylamid BBA-APMA und (HEEA) (statistisches Photo-PA-HEEA) (Verbindung IX)
Ein photoaktivierbares Copolymer der vorliegenden Erfindung wurde in der folgenden Art und Weise hergestellt. Acrylamid, 1,48 g (20,8 mmol), wurde in 37,3 ml DMSO zusammen mit 0,15 g (0,42 mmol) BBA-AMPA (Verbindung III), hergestellt gemäß dem allgemeinen in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren, 3,38 g (21,2 mmol) HEEA (Verbindung V), hergestellt gemäß dem allgemein in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren, 0,084 g (0,51 mmol) AIBN und 0,043 ml (0,28 mmol) TEMED gelöst. Die Lösung wurde mit einem Heliumgasrohr für 4 Minuten von Sauerstoff befreit. Der Kopfraum wurde durch Argon ersetzt und das Gefäß für ein Rühren über Nacht bei 55°C versiegelt. Die Reaktionslösung wurde in einem Dialyseröhrchen (12–14.000 MWCO) angeordnet und gegen DI-Wasser für 5 Tage dialysiert. Die Wasserlösung wurde lyophilisiert, um 3,7 g weißen Feststoff mit einer Photobeladung von 0,092 μmol/mg (Theorie 0,085 μmolmg) zu ergeben.
Beispiel 11
Herstellung eines Copolymers von BBA-APMA und (HEEA) (statistisches Photo-HEEA) (Verbindung IX)
Ein photoaktivierbares Copolymer der vorliegenden Erfindung wurde in der folgenden Art und Weise hergestellt. BBA-APMA (Verbindung III), hergestellt gemäß dem allgemein in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren, 0,11 g (0,31 mmol), wurde in 26 ml DMSO zusammen mit 4,89 g (30,72 mmol) HEEA (Verbindung V), hergestellt gemäß dem allgemein in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren, 0,06 g (0,37 mmol) AIBN und 0,031 ml (0,21 mmol) TEMED gelöst. Die Lösung wurde mit einem Heliumgasrohr für 4 Minuten von Sauerstoff befreit. Der Kopfraum wurde durch Argon ersetzt und das Gefäß für ein Rühren über Nacht bei 55°C versiegelt. Die Reaktionslösung wurde in einem Dialyseröhrchen (12–14.000 MWCO) angeordnet und gegen DI-Wasser für 6 Tage dialysiert. Die Wasserlösung wurde lyophilisiert, um 4,35 g weißen Feststoff zu ergeben, der als Verbindung IX mit einer Photobeladung von 0,061 μmol/mg (Theorie 0,062 μmol/mg) bezeichnet wurde.
Unter Verwendung der obigen Vorgehensweise wurde eine Verbindung, die ähnlich ist zu derjenigen, die im vorangehenden Absatz beschrieben worden ist, hergestellt, jedoch wurde rohes HEEA anstelle des gereinigten HEEA verwendet. Die folgende Bestandteilsbeladung wurde verwendet, um das Photo-HEEA (Verbindung IX) zu ergeben. BBA-APMA (Verbindung III), hergestellt gemäß dem allgemein in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren, 0,043 g (0,12 mmol), wurde in 10,4 ml DMSO zusammen mit 1,96 g (12,29 mmol) HEEA (Verbindung V), hergestellt gemäß dem allgemein in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren, 0,024 g (0,15 mmol) AIBN und 0,12 ml (0,083 mmol) TEMED gelöst. Die Lösung wurde mit einem Heliumgasrohr für 4 Minuten von Sauerstoff befreit. Der Kopfraum wurde durch Argon ersetzt und das Gefäß für ein Rühren über Nacht bei 55°C versiegelt. Die Reaktionslösung wurde in einem Dialyseröhrchen (12–14.000 MWCO) angeordnet und gegen DI-Wasser für 6 Tage dialysiert. Die Wasserlösung wurde lyophilisiert, um 1,33 g weißen Feststoff zu ergeben, der als Verbindung IX mit einer Photobeladung von 0,078 μmol/mg (Theorie 0,062 μmol/mg) bezeichnet wurde.
Beispiel 12
Herstellung eines Endpunktphotoglucosaminpolymers (Endpunkt-Di-BBA-AGA) (Verbindung X)
Acrylamid (400 mg, 5,6 mmol) wurde in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 400 mg (1,48 mmol) N-Acryloylglucosamin (Verbindung VI) zugegeben. Zusätzlich wurden 34 mg N-(2-Mercaptoethyl)-2,6-bis(4-benzoylbenzamido)hexanamid, 200 mg AIBN und 50 μl TEMED zugegeben. Die Lösung wurde mit Stickstoff gespült, dann in einem 55°C Ofen über Nacht angeordnet. Die resultierende Polymerlösung wurde gegen deionisiertes Wasser unter Verwendung einer SpectraPor I (Spektrum) Dialysemembran dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Lösung lyophilisiert. Das erhaltene getrocknete Polymer war 0,58 Gewichts-gm. Bei 0,1 mg/ml in deionisiertem Wasser wies das Polymer eine Extinktion bei 265 nm von 0,202 auf.
Beispiel 13
Herstellung eines Copolymers aus Acrylamid, BBA-APMA und AGA (statistisches Photo-PA-AGA) (Verbindung XI)
Zu einer Lösung von 200 mg (0,74 mmol) N-Acryloylglucosamin (Verbindung VI) in 5 ml DMSO wurden 500 mg Acrylamid (7,0 mmol) 98 mg BBA-APMA (0,28 mmol, Verbindung III), 50 mg Azobiscyanovalerat und 100 μl TEMED zugegeben. Die Lösung wurde mit Stickstoff gespült, dann in einem 55°C Ofen über Nacht angeordnet. Das Polymer wurde gegen deionisiertes Wasser dialysiert und dann lyophilisiert.
Beispiel 14
Herstellung einer mit PolyHPA-beschichteten Oberfläche
Ein Polymer aus PA wird hergestellt unter Verwendung von HPA-Monomer, synthetisiert gemäß Beispiel 4, und einer Polymerisationsreaktion folgend der Vorgehensweise aus Beispiel 9, außer daß das BBA-APMA weggelassen wurde. Das lyophilisierte Polymer wird in einer Lösung von 1,1'-Carbonyldiimidazol in Formamid gelöst und konnte für eine Stunde reagieren. Glasträger werden mit Aminopropyltrimethoxysilan beschichtet, gewaschen und getrocknet. Die aktivierte PolyHPA-Lösung wird auf den Amin-modifizierten Träger aufgetragen und für eine Stunde inkubiert. Die Träger werden dann in 0,1 M Natriumcarbonatlösung enthaltend 0,1 M Ethanolamin für eine Stunde eingetaucht, um verbleibende Carbonylimidazolgruppen zu blockieren oder zu hydrolysieren. Die Träger werden dann in deionisiertem Wasser gewaschen und getrocknet.
Beispiel 15
Herstellung einer mit PhotopolyHEEA-beschichteten Oberfläche
Ein Copolymer aus HEEA (Verbindung V) und BBA-APMA (Verbindung III), hergestellt gemäß Beispiel 10, wird in deionisiertem Wasser mit 2,0 mg/ml gelöst. Polystyrolmikroskopträger werden in die Polymerlösung eingetaucht, dann auf einer flachen Oberfläche angeordnet und für 1 Minute bestrahlt, während sie feucht sind, unter Verwendung eines Dymax-Lichtsystems mit einer 400 Watt Mitteldruckquecksilberlampe bei einem Abstand, so daß die Bestrahlungsintensität etwa 2,0 mW/cm² bei 330–340 nm Wellenlänge ist. Die Träger werden dann mit deionisiertem Wasser gewaschen und getrocknet.

Claims

Verfahren zum Durchführen einer Festphasen-Synthese, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Trägermaterials mit einer Oberfläche, die für den Einsatz in kombinatorischen Synthesen eingerichtet ist, b) Bereitstellen eines Polymerreagenzes, gebildet durch die Polymerisierung eines Monomers der Formel
wobei R₁ Wasserstoff oder C₁-C₆ Alkyle bedeutet, und wobei R₂ und R₃, unabhängig voneinander, Wasserstoff, C₁-C₆ Alkyle oder Phenyle enthaltend einen oder mehrere reaktive Substituenten ausgewählt aus
OR₅ oder SR₅ bedeuten (wobei R₄ ein C₁-C₆ Alkyl oder ein heterozyklischer Ring enthaltend ein oder mehrere Stickstoffatome ist, und R₅ ein C₁-C₆ Alkyl oder Phenyl ist enthaltend einen oder mehrere reaktive Substituenten ausgewählt aus
c) Applizieren des Reagenzes auf die Trägeroberfläche und kovalentes Anbinden des polymeren Reagenzes an die Trägeroberfläche- d) Bereitstellen eines ersten reaktiven Monomers ausgewählt aus Nukleotiden und Aminosäuren, wobei das Monomer eine Gruppe umfasst, die thermochemisch reaktiv ist mit dem gebundenen reaktiven Substituenten, e) In Kontakt bringen und Reagieren des ersten Monomers mit dem Polymerreagenz auf der Trägeroberfläche unter Bedingungen, die zum Reagieren der zugehörigen Gruppe mit dem gebundenen reaktiven Substituenten geeignet sind, um so eine wachsende Polymerkette bereitzustellen, und f) Bereitstellen und nachfolgendes Anbringen weiterer Monomere an die wachsende Polymerkette, um ein gewünschtes Polymerprodukt zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erhaltene Polymerprodukt zurückbehalten und in situ benutzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erhaltene Polymerprodukt geschnitten und von seiner Position auf dem Träger entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polymerprodukt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden, Polysacchariden und Polypeptiden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Träger bereitgestellt wird in der Form einer Perle, eines Wafers, eines Films, einer Scheibe oder einer Platte.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Träger umfasst: ein Material ausgewählt aus organosilan-behandeltem Glas, organosilan-behandeltem Silizium, Polypropylen, Polyethylen und Polystyren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polymerreagenz die Formel hat:
wobei X = 0–5 Mol-%, Y = 5–100 Mol-% und Z = 0–95 Mol %.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polymerreagenz die Formel hat:
wobei x = 0–5 Mol-%, y = 5–100 Mol-% und z = 0–95 Mol-%.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polymerreagenz die Formel hat:
wobei m = 15–5 und n = 50–150.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polymerreagenz die Formel hat:
wobei x = 0–5 Mol-%, y = 5–100 Mol-% und z = 0–95 Mol-%.
Polymerreagenzzusammensetzung der Formel:
wobei m = 15–45 und n = 50–150.
Polymerreagenzzusammensetzung der Formel:
wobei x = 0–5 Mol-%, y = 5–100 Mol-% und z = 0–95 Mol-%.