DE60112424T2

DE60112424T2 - Protonen-abhängiges na+-kanal hemmendes polypeptid

Info

Publication number: DE60112424T2
Application number: DE60112424T
Authority: DE
Inventors: Michel Lazdunski; Pierre Escoubas; Jan De Weille; Sylvie Diochot
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2000-05-10
Filing date: 2001-05-10
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2021-05-11
Also published as: WO2001085931A2; WO2001085931A3; DE60112424D1; EP1280895A2; EP1280895B1; ATE301190T1

Description

Die Erfindung betrifft ein im wesentlichen reines Polypeptid, das als ein ASIC1a-Kanalblocker wirkt; insbesondere hat dieses Polypeptid die Aminosäuresequenz, die in der Liste von Sequenzen im Anhang unter der Nummer SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist. Es wird auch eine Nukleinsäurekodierung für ein solches Polypeptid und ein Verfahren zur Herstellung eines ASIC1a-Kanalblockers bereitgestellt.
Protonen-abhängige Na⁺-durchlässige Kanäle sind die einfachste Form von Liganden-abhängigen (gated) Kanälen. Sie sind vorhanden in vielen neuronalen Zelltypen im ganzen Zentralnervensystem, was auf eine wichtige Funktion dieser Kanäle bei der Signalübertragung (Transduktion) hinweist, die mit örtlichen pH-Veränderungen während normaler neuronalen Aktivität zusammenhängt. Diese Kanäle spielen möglicherweise auch eine wichtige Rolle in pathologischen Situationen, wie Gehirnischämie oder Epilepsie, welche signifikante extrazellulare Azidifizierung erzeugen. Sie liegen auch vor in nocizeptiven Neuronen und man nimmt an, daß sie für die Schmerzempfindung verantwortlich sind, welche Gewebeazidose bei Muskel- und Herzischämie, Kornea-Verletzung und bei Entzündung und lokaler Infektion begleitet. Erst ganz neuerdings wurde der erste Protonen-abhängige Kanal ASIC (Acid Sensitive Ion Channel) geklont (Waldmann, R., Champigny, G., Bassilana, F., Heurteaux, C. and Lazdunski, M., „A Proton-Gated Cation Channel Involved in Acid-Sensing", Nature, 386, 173–177, 1997). Die ASICs gehören zu einer Superfamilie, welche Amilorid-empfindliche epitheliale Na⁺-Kanäle (ENaCs), den FMRFamid-abhängigen Na⁺-Kanal (FaNaC) und die Nematodendegenerine (DEGs) einschließt, welche wahrscheinlich mechanosensiblen Na⁺-durchlässigen Kanälen entsprechen. Es wurden jetzt mehrere ASIC-Subeinheiten beschrieben: ASIC1a (Waldmann, R., oben) und ASIC1b (Chen, C. C., England, S., Akopian, A. N. and Wood, J. N., „a Sensory Neuron-Specific, Proton- Gated Ion Channel", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 10240–12045, 1998), ASIC2a (Price, M. P., Snyder, P. M. and Welsch, M. J., "Cloning and Expression of a Novel Human Brain Na⁺ Channel", J. Biol. Chem., 271, 7879–7882, 1996) und ASIC2b (Lingueglia, E., de Weille, J. R., Bassilana, F., Heurteaux, C., Sakai, H., Waldmann, R. and Lazdunski, M., "a Modulatory Subunit of Acid Sensing Ion Channels in Brain and Dorsal Root Ganglion Cells", J. Biol. Chem., 272, 29778–29783, 1997), ASIC3 (Waldmann, R., Bassilana, F., de Weille, J., Champigny, G., Heurteaux, C. and Lazdunski, M., „Molecular Cloning of a Non-Inactivating Proton-Gated Na⁺ Channel Specific for Sensory Neurons", J. Biol. Chem., 272, 20975–20978, 1997). Die verschiedenen Subeinheiten liefern Kanäle mit verschiedener Kinetik, verschiedenen externen pH-Empfindlichkeiten und verschiedener Gewebeverteilung. Sie können funktionale Homomultimere sowie Heteromultimere bilden. Sowohl ASIC1a als auch ASIC1b vermitteln rasch Inaktivierungsströme nach einer raschen und mäßigen Ansäuerung des äußeren pH. Während jedoch ASIC1a sowohl in Gehirnneuronen als auch beteiligten sensorischen Neuronen vorhanden ist, findet man seine Spleißvariante ASIC1b nur in sensorischen Neuronen. ASIC2a bildet einen aktiven H⁺-abhängigen Kanal und ist im Gehirn reichlich vorhanden, fehlt jedoch im wesentlichen in sensorischen Neuronen, während seine Spleißvariante ASIC2b sowohl in Gehirn- wie sensorischen Neuronen vorhanden und als ein Homomultimer inaktiv ist. ASIC2b kann mit anderen ASIC-Subeinheiten und besonders ASIC3 funktionale Heteromultimere bilden. ASIC3 findet sich ausschließlich in kleinen sensorischen Neuronen, die als Nocizeptoren wirken. Seine Expression in verschiedenen Heteromultimer-Systemen erzeugt einen zweiphasischen Strom mit einer schnellen Inaktivierungsphase gefolgt von einer aufrechterhaltenen Komponente. Die Assoziierung von ASIC2b mit ASIC3 bildet ein Heteromultimer mit Eigenschaften (Zeitverlauf und ionische Selektivität) ähnlich denen eines nativen aufrechterhaltenen H⁺-sensiblen Kanals, der in Spinalganglionzellen (dorsal root = Hinterwurzelganglionzellen) vorhanden ist und anscheinend eine besonders wichtige Rolle in der Schmerzempfindung spielt.
Gifte von Schlangen, Skorpionen, Seeanemonen, Seeschnecken und Spinnen sind reiche Quellen von Peptidtoxinen, die sich als sehr wertvoll in der funktionellen Erforschung von spannungssensiblen und ligand-abhängigen Ionenkanälen erwiesen haben (Hucho, F. (1995), „Toxins as tools in neurochemistry", Ang. Chem. Int. Ed. Eng., 34, 39–50). Dennoch besteht weiter ein Bedarf neue Materialien zu finden, welche diese Kanäle beeinflussen.
Die Erfinder haben den ersten potenten und spezifischen Blockierer der ASIC1a-Kanäle aus dem Gift der südamerikanichen Tarantel Psalmopoeus cambridgei identifiziert und charakterisiert. Dieser erste potente und spezifische Blockierer der ASIC1a-Kanäle wird hiernach Psalmotoxin 1 (PcTX1) genannt.
Das molekulare Gerüst von PcTX1 ist wahrscheinlich ähnlich dem früher für sowohl Kegelschnecken- als auch Spinnentoxine beschriebenen (Narasimhan, L., Singh, Jr., Humblet, C., Guruprasad, K. und Blundell, T., „Snail and Spider Toxins Share a Similar Tertiary Structure and ,Cystine Motif'", Nat. Struct. Biol., 1, 850–852, 1994; Pallaghy, P. K., Nielsen, K. J., Craik, D. J. und Norton, R. S., „A Common Structural Motif Incorporating a Cystine Knot and a Triple-stranded Beta-sheet in Toxic and Inhibitory Polypeptides", Protein Sci., 3, 1833–1839, 1994). Es weist eine dreisträngige antiparallele Beta-Faltblattstruktur auf, die durch drei Disulfid-Brücken vernetzt und dicht zu dem "Knottin"-Faltungsmuster gefaltet ist (Norton, R. S. und Pallaghy, P. K., „The Cystine Knot Structure of Ion Channel Toxins and Related Polypeptides", Toxicon, 36, 1573–1583, 1988). PcTX1 ist gekennzeichnet durch das ungewöhnliche Quadruplet Lys₂₅-Arg₂₆-Arg₂₇-Arg₂₈, das wahrscheinlich an der Oberfläche des Toxinmoleküls einen stark positiven „Patch" bildet, der einen Bereich darstellt, der ein starker Kandidat für Rezeptorerkennung ist.
PcTX1 ist absolut spezifisch für ASIC1a und kann zwischen den zwei ASIC1-Spleißvarianten ASIC1a und ASIC1b unterscheiden, obgleich diese sich nur in ihrer N-endständigen Sequenz unterscheiden. PcTX1 kann auch zwischen ASIC1a, ASIC2 und ASIC3 unterscheiden. Weiterhin verliert PcTX1 seine Fähigkeit zum Blockieren von ASIC1a, sobald diese Subeinheit mit einem anderen Mitglied der Familie, ob ASIC2a oder ASIC3, assoziiert ist.
Ein wichtiger Ort der Wechselwirkung von ASIC1a mit PcTX1 liegt wahrscheinlich in der extrazellularen Strecke von 113 Aminosäuren, die unmittelbar nach der ersten Transmembrandomäne liegt. Dies ist der einzige extrazellulare Ort, wo Unterschiede zwischen ASIC1a und ASIC1b vorhanden sind.
ASIC1a ist vorhanden im Zentralnervensystem (besonders im Hippokampus und der zerebellaren Granulatschicht) sowie in DRG-Neuronen. Elektrophysiologische Untersuchungen haben gezeigt, daß sowohl zerebellare Granulatzellen und eine Subpopulation von DRG-Neuronen H⁺-abhängige Ströme aufweisen, die bei pH 6 mit Zeitkonstanz von 1,95 bis 2,06 s inaktivieren. Das ist sehr ähnlich, wenn nicht identisch, der Zeitkonstante der Inaktivierung (2,10 ± 0,30 s) des homomultimeren ASIC1a-Stroms, exprimiert in COS-Zellen. Die H⁺-abhängigen Ströme in diesen Neuronen werden durch sehr niedrige Konzentrationen von PcTX1 inhibiert. Die Ähnlichkeit der Inaktivierungskinetiken und pH-Abhängigkeit in der selektiven Blockierung des Stroms durch PcTX1 und die nahezu Identität der IC₅₀-Werte für die Blockade von ASIC1a-Kanälen (IC₅₀ = 0,9 nM) und von nativen Kanälen (IC₅₀ = 0,7 nM) weist stark darauf hin, daß der H⁺-abhängige Strom mit τ_inact von ~2 s in sowohl DRG-Zellen als auch zerebellare Granulatzellen vermittelt wird durch eine homomultimere Anordnung von ASIC1a. Diese Ansicht wird gestützt durch die Tatsache, daß keiner der untersuchten heteromultimeren Kanäle (ASIC1a/ASIC2a und ASIC1a/ASIC3) für das Toxin empfindlich ist.
DRG-Neuronen exprimieren auch H⁺-abhängige Ströme mit Zeitkonstanten der Inaktivierung, die entweder schneller oder langsamer als die Zeitkonstante der Inaktivierung des homomultimeren ASIC1a-Stroms sind. Eine Klasse dieser proton-abhängigen Kanäle inaktiviert mit einer schnellen Rate (τ_inact = 0,24 ± 0,03 s), die sehr ähnlich ist der Inaktivierungsrate des in COS-Zellen exprimierten ASIC1a/ASIC3-Kanals (τ_inact = 0,19 ± 0,01 s). Dieser rasch inaktivierende Strom ist wie der von ASIC1a/ASIC3-Heteromultimeren erzeugte Strom unempfindlich gegen PcTX1. Es ist daher wahrscheinlich, daß der schnell inaktivierende H⁺-abhängige Na⁺-Kanal in DRG-Neuronen das ASIC1a/ASIC-Heteromultimer ist.
Der ASIC3-Strom allein oder in Assoziierung mit ASIC2b entspricht dem in DRG-Zellen aufgezeichneten aufrechterhaltenen Strom. Weder ASIC3-Homomultimere, ASIC3/ASIC2b-Heteromultimere noch die nativen nichtaktivierenden H⁺-abhängigen Kanäle werden durch PcTX1 blockiert.
Spinnengifte sind Cocktails von neuroaktiven Peptiden, die ihre Beute durch eine Vielzahl von molekularen Mechanismen lähmen können. PcTX1 ist ein potentes Werkzeug, welches jetzt den Weg zu einer genaueren Analyse der physiologischen Funktion der wichtigen Klasse von H⁺-abhängigen Na⁺-Kanälen eröffnet.
So betrifft die Erfindung ein im wesentlichen reines Polypeptid, das als ein ASIC1a-Kanalblocker wirkt. Die Erfindung betrifft besonders ein im wesentlichen reines Polypeptid, das als ein ASIC1a-Kanalblocker wirkt und aus dem Gift der südamerikanischen Tarantel Psalmopoeus cambridgei extrahiert ist. Dieses als ein ASIC1a-Kanalblocker wirkende Polypeptid hat vorteilhafterweise ein berechnetes Molekulargewicht von etwa 4689 Da. Die Wirkungen dieses als ein ASIC1a-Kanalblockers wirkenden Polypeptids sind vorteilhafterweise reversibel
Vorzugsweise weist das als ein ASIC1a-Kanalblocker wirkende Polypeptid die folgende Aminosäuresequenz auf EDCIPKWKGCVNRHGDCCEGLECWKRRRSFEVCVPKTPKT, die im Anhang in der Liste von Sequenzen unter der Nummer SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, und deren pharmazeutisch annehmbare Salze.
Die Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist oder daraus besteht, die für ein als ein ASIC1a-Kanalblocker funktionierendes Polypeptid kodiert. Die Erfindung betrifft auch ein Nukleinsäuremolekül, das für ein als ein ASIC1a-Kanalblocker funktionierendes Polypeptid kodiert, dessen Aminosäuresequenz im Anhang in der Liste von Sequenzen unter der Nummer SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist.
Ein anderes Ziel der Erfindung sind polyklonale oder monoklonale Antikörper, die gegen ein erfindungsgemäßes, als ein ASIC1a-Kanalblocker funktionierendes Polypeptid, ein Derivat oder ein Fragment derselben gerichtet sind. Diese Antikörper können nach den in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Gemäß Methoden nach dem Stand der Technik werden polyklonale Antikörper gebildet durch Injektion von Proteinen, die aus dem Epithel eines Wirts extrahiert oder durch genetische Transformation hergestellt sind, in Tiere und anschließende Gewinnung von Antiseren und Antikörpern aus den Antiseren durch beispielsweise Affinitätschromatographie. Die monoklonalen Antikörper können hergestellt werden durch Verschmelzen von Myelomazellen mit Milzzellen von Tieren, die zuvor unter Verwendung der Rezeptoren der Erfindung immunisiert werden. Diese Antikörper sind nützlich bei der Suche nach neuen Polypeptiden, die als ein ASIC1a-Kanalblocker wirken, oder den Homologen dieses Polypeptids in anderen Spezies.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der wenigstens ein Molekül der obigen Nukleinsäure aufweist, vorteilhafterweise assoziiert mit angepaßten Kontrollsequenzen, zusammen mit einem Herstellungs- oder Expressionsverfahren in einem zellularen Wirt eines erfindungsgemäßen, als ein ASIC1a-Kanalblocker wirkenden Polypeptids oder eines Fragments desselben. Die Gewinnung dieser erfindungsgemäßen Vektoren sowie die Herstellung oder Expression in einem Proteinwirt kann nach dem Fachmann bekannten Methoden der Molekularbiologie und Gentechnik durchgeführt werden.
Ein Nukleinsäuremolekül, das für ein erfindungsgemäßes, als ein ASIC1a-Kanalblocker wirkendes Polypeptid oder einen erfindungsgemäßen Vektor kodiert, kann auch zur Transformation von Tieren und zur Erzeugung einer Linie von transgenen Tieren verwendet werden. Der verwendete Vektor wird in Abhängigkeit vom Wirt gewählt, in den er transferiert werden soll; er kann irgendein Vektor wie ein Plasmid sein. So betrifft die Erfindung auch zellulare Wirte, die ein Polypeptid exprimieren, das als ein ASIC1a-Kanalblocker wirkt, das gemäß den vorangehenden Verfahren erhalten wurde.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäure- und Oligonukleotid-Testsubstanzen, die aus den Molekülen von Nukleinsäure gemäß der Erfindung hergestellt sind. Diese Testsubstanzen, die vorteilhafterweise markiert sind, sind nützlich zur Detektion von Hybridisierung ähnlicher Polypeptide, die als ein ASIC1a-Kanalblocker in andern Individuen oder Spezies wirken. Gemäß Methoden des Standes der Technik werden diese Testsubstanzen mit einer biologischen Probe in Berührung gebracht. Es können verschiedene Hybridisierungsmethoden verwendet werden, wie Dot-Blot-Hybridisierung oder Replika-Hybridisierung (Southern Technique) oder andere Methoden (DNA-Chips). Diese Oligonukleotid-Testsubstanzen sind nützlich für PCR-Untersuchungen beispieslweise die Suche nach Genen in anderen Spezies oder mit anderer diagnostischer Zielsetzung.
Ein anderer Zweck dieser Erfindung ist ein pharmazeutisches Präparat, das ein als ein ASIC1a-Kanalblocker wirkendes Polypeptid, wie erfindungsgemäß offenbart, oder die pharmazeutische annehmbare Salze desselben und einen pharmazeutischen annehmbaren Träger enthält.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines ASIC1a-Kanalblockers, welches folgende Stufen aufweist:

(a) Beschaffung von wenigstens einer Psalmopoeus cambridgei-Spinne;
(b) Gewinnung von Gift von der wenigstens einen Spinne durch elektrisches Melken dieser wenigstens einen Spinne;
(c) Trennung der Komponenten dieses Giftes durch Umkehrphasen-Chromatographie, so daß Toxine dieses Giftes getrennt werden;
(d) Trennung der Komponenten des Giftes durch Kationenaustausch-Chromatographie;
(e) Rückgewinnung und Isolierung der getrennten Toxine dieses Giftes; und
(f) Kombination des isolierten Toxins mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, so daß das Toxin als ein ASIC1a-Kanalblocker wirken kann.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung erschließen sich beim Lesen der folgenden Beispiele, welche die Reinigung, die Peptidcharakterisierung und die Wirkung von PcTX1 auf die Aktivität von ASIC1a-, ASIC1b-, ASIC2a- und ASIC3-Kanäle betreffen und welche sich auf die beigefügten Zeichnungen beziehen, worin
1 hat mehrere Teile, welche die Reinigung und Charakterisierung von PcTX1 betreffen. Teil A ist eine graphische Wiedergabe einer Umkehrphasen-HPLC-Trennung von rohem Psalmopoeus cambridgei-Gift. Teil B ist eine graphische Darstellung einer Kationenaustausch-Chromatographie der PcTX1 enthaltenden Fraktion der Umkehrphasen-HPLC-Trennung. Teil C ist eine graphische Darstellung der Kationenaustausch-Chromatographie von PcTX1n und PcTX1n + PcTX1s. Teil D zeigt die Sequenz von PcTX1s und Fragmenten desselben. Teil E ist ein Vergleich von PcTX1 und kurzen Spinnenpeptiden mit ähnlicher Struktur und bekannter Wirkungsweise. Teil F zeigt die aufrechterhaltenen Disulfid-Brücken in PcTX1.
2 hat mehrere Teile, welche die selektive Blockierung von H⁺-abhängigen Kanälen durch PcTX1 betreffen. Teil A ist eine graphische Darstellung der Wirkung von 10 nM PcTX1 auf ASIC1a-Strom. Teil B ist ein Graph, der die Schließ-Antwort-Kurve für eine Blockierung von ASIC1a-Strom mit einem pH-Abfall von 7,4 auf 6 durch synthetisches PcTX1 zeigt. Teil C ist eine graphische Darstellung der Wirkung von 10 nM PcTX1 auf ASIC1b-Strom mit einem pH-Abfall von 7,4 auf 6. Teil D ist eine graphische Darstellung der Wirkung von 10 nM PcTX1 auf ASIC2a-Strom. Teil E ist eine graphische Darstellung der Wirkung von 10 nM PcTX1 auf ASIC3-Strom.
3 hat mehrere Teile betreffend die Wirkung von PeTX1 auf Homomultimere und Heteromultimere. Teil A ist ein Graph, der die Wirkung von PcTX1 auf das ASIC1a-Homomultimer zeigt. Teil B ist ein Graph, der die Wirkung von PcTX1 auf ein ASIC1a + ASIC2a-Heteromultimer zeigt. Teil C ist ein Graph, der die Wirkung von PcTX1 auf ein ASIC1a + ASIC3-Heteromultimer zeigt.
4 hat mehrere Teile, welche die Wirkung von PcTX1 auf eine Subpopulation von H⁺-abhängigen Strömen in Spinalganglion-Neuronen zeigen. Teil A zeigt Inhibierung von H⁺-abhängigen Strömen durch PcTX1 in 23 von 48 Neuronen. Teil B zeigt die Wirkung von PcTX1 (50 nM) auf einen Teil der verbleibenden 25 der 48 Neuronen, welche keine Antwort zeigten. Teil C zeigt die Wirkung von PcTX1 (5 nM) auf einen Teil der verbleibenden 25 der 48 Neuronen, welche keine Antwort zeigten. Teil D ist ein Profil der Verteilung der Zeitkonstanten in verschiedenen Zellen. Teil E ist ein Graph, der eine Dosis-Inhibierungskurve zeigt, die von Zellen erhalten wurde, welche die PcTX1-sensiblen Kanäle exprimieren. Teil F ist ein Graph, der die Unterdrückung der Aktivität in DRG-Neuronen durch PcTX1 zeigt.
5. Teil A ist eine graphische Darstellung der Strominhibierung in zerebellaren Granulatzellen durch PcTX1. Teil B ist ein Graph, der die pH-Abhängigkeit von protonen-abhängigen Strom in zerebellaren Zellen zeigt.
I. Methoden
I.1. Gift- und Toxinreinigung
Psalmopoeus cambridgei (Araneae Theraphosidae)-Gift wurde erhalten durch elektrische Stimulierung von anästhesierten Spinnen (Invertebrate Biologics, Los Gatos, USA). Gefriergetrocknetes rohes Gift wurde in destilliertem Wasser resuspendiert, zentrifugiert (140000 UpM, 4°C, 20 Minuten) über 0,45 μm Mikrofilter (SJHVL04NS, 4 mm Durchmesser, Millipore, Japan) filtriert und vor der Analyse bei –20°C gelagert. Rohgift, das auf das Zehnfache des Anfangsvolumens verdünnt war, wurde durch Umkehrphasen C8 HPLC aufgetrennt (10 × 250 mm, 5C8MS, Nacalai Tesque, Japan) unter Verwendung eines linearen Gradienten von Acetonitril/Wasser in konstant 0,1% Trifluoressigsäure (TFA). In einer zweiten Reinigungsstufe wurde Kationaustausch-Chromatographie an einer Tosoh TSK-Gel SPSPW-Sulfopropylsäule (4,6 × 70 mm) (Tosoh, Japan) mit einem linearen Gradienten von Ammoniumacetat in Wasser (20 mM bis 2 M) angewandt. Insgesamt 160 μl Gift wurden in zwei getrennten Chargen (10 und 150 μl) gereinigt. Alle verwendeten Lösungsmittel waren HPLC-Grad. Die Trennung wurde durchgeführt an einem Hewlett-Packard HP1100-System gekoppelt mit einem Dioden-Anordnungsdetektor und einem Mikrocomputer, auf dem die Chemstation^®-Software lief. Die Elution wurde bei 215 und 280 nm verfolgt.
I.2. Peptidcharakterisierung und Synthese
I.2.1. Aminosäureanalyse
Proben wurden in einer Waters Pico-Tag-Station mit 6N HCl (0,6% Phenol) bei 110°C unter Vakuum während 20 Stunden hydrolysiert. Die hydrolysierten Peptide wurden mit PITC derivatisiert und die derivatisierten Aminosäuremischungen wurden mittels C18RP-HPLC analysiert unter Verwendung eines Gradienten von 60% Acetonitril in 50 mM Phosphatpuffer (100 nM NaCl04).
I.2.2. Sequenzbestimmung
Das Peptid wurde reduziert und mit 4-Vinyl-pyridin alkyliert, mittels C8 RP-HPLC entsalzt und einer automatisierten N-Ende-Sequenzierung auf einem Applied Biosystems Modell 477A-Gasphasen-Sequenzer unterworfen.
I.2.3. Enzymatische Spaltungen
Reduziertes alkyliertes Toxin wurde den folgenden Behandlungen unterworfen: (a) TPCK-behandeltes Trypsin (Sigma Co, USA), 2% G/G, 37°C, 14 h in 100 mM Ammoniumbicarbonat, 0,1 mM CaCl₂ pH 8,1. (b) V8-Protease, 37°C, 24 h in 40 mM Ammoniumbicarbonat pH 7,8 in 10% Acetonitril und (c) BNP-Skatol (2-(Nitrophenylsulfenyl)-3-methyl-3-bromoindolenin), 37°C, 24 h in 75%-iger Essigsäure. Die erhaltenen Peptide wurden getrennt mittels RP-HPLC unter Verwendung eines linearen Gradienten von Acetonitril/Wasser in konstant 0,1% TFA.
I.2.4. Massenspektrometrie
Massenspektren von nativem PcTX1 gelöst in α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (α-CHCA)-Matrix wurden aufgezeichnet auf einem MALDI-TOF Perseptive Voyager Elite-Spektrometer (Perseptive Biosystems, USA) in positiv-ionen-linearem Modus unter Verwendung einer internen Eichmethode mit einer Mischung von β-Insulin (3495,94 Da) und Rinderinsulin (5733,5 Da). Die Daten wurden unter Verwendung der GRAMS 386-Software analysiert. Theoretische Molekulargewichte und pl-Werte wurden aus Sequenzdaten unter Verwendung der GPMAW-Proteinanalysesoftware (http://130.225-147.138/gpmaw/default.htm) berechnet. Synthetisches PcTX1 wurde in einem Micromass Platform II Electrospray-System (Micromass, Altrincharn, UK) in positivem Modus (Kegelspannung 20 kV, Temperatur 60°C) analysiert.
I.2.5. Database-Recherchen
Sequenzhomologien wurden bestimmt unter Verwendung von Sequenzen, die aus einer nichtredundanten Recherche von Proteindatabasen über den BLAST-Server (blast program http://www.ncbi.nlm.nih-gov/ erhalten wurden. Sequenzausrichtungen und Prozente der Ähnlichkeit wurden mit ClustalW (http://www.caos.kun.nl/cammsa/CLUSTALW/clustalw.html) berechnet.
I.2.6. Peptidsynthese
Die Synthese von nativem PcTX1 wurde durchgeführt unter Verwendung von Fmoc/tert-Butyl und maximaler temporärer Schutzstrategie auf einem Applied Biosystems 433A-Synthesizer. Das chemische Verfahren verwendete 0,05 nM Fmoc-Thr(OtBu)-4-hydroxymethylphenoxyharz (0,39 mmol/g), einen 20-fachen Überschuß von jeder Aminosäure und Dicyclohexylcarbodiimid/1-Hydroxy-7-azabenzotriazol-Aktivierung. Schutzentfernung (1 bis 5 h) und Spaltung (200 mg Peptid + Harz) wurden erreicht unter Verwendung von 10 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/Triisopropylsilan/Wasser (9,5/0,25/0,25, v/v/v). Die saure Mischung wurde dann zweimal in 100 ml kaltem Diethylether gefällt. Das feste Produkt wurde in 50 ml 10%-iger Essigsäure in Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Das rohe reduzierte Toxin wurde gereinigt durch RP-HPLC an einer C18-präparativen Säule (21 × 250 mm, Jupiter) unter Verwendung eines 40 Min-Gradienten von Acetonitril/Wasser in 0,1% TFA (0% bis 18% B in 4 Minuten, 30% B in 30 Minuten, 100% B in 6 Minuten mit B: 90% Acetonitril/H₂O/0,1% TFA).
Die Oxidation des reduzierten Toxins wurde erreicht bei 0,1 mg/10 ml in entgastem Kaliumphosphatpuffer (10 mM, pH = 7,8) unter Verwendung des Redox-Paares reduziertes Glutathion (5 mM)/oxidiertes Glutathion (0,5 mM). Das Verschwinden des reduzierten Peptids wurde verfolgt durch RP-HPLC an einer C18-analytischen Säule (10 × 15 mm, Vydac, USA) unter Verwendung eines 40 Min-Gradienten (0% bis 18% B in 8 Minuten, 30% B in 26 Minuten, 60% B in 14 Minuten mit B: 90% Acetonitril/H₂O/0,1% TFA).
I.3. Elektrophysiologische Aufzeichnungen
I.3.1. Expression in Xenopus Oozyten
Das Klonen von cDNA und die Synthese von komplementärer RNA wurden vorgenommen wie oben beschrieben. Xenopus laevi wurden gekauft von C.R.B.M. (Montpellier, Frankreich). Stücke des Ovars wurde chirurgisch entfernt und einzelne Oozyten wurden in Salzlösung (ND96), die 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ und 5 mM HEPES enthielt (pH 7,4 mit NaOH), seziert. Stufe V und VI-Oozyten wurden zwei Stunden mit Kollagenase (1 mg/ml, Typ Ia, Sigma, USA) in ND96 behandelt, um follikulare Zellen zu entfernen. cRNA (ASIC1a, ASIC2a, Kv2.1, Kv2.2) oder DNA (ASIC1b, ratASIC3, Kv4.2, Kv4.3)-Lösungen wurden injiziert (5 bis 10 ng/μl für cRNA und 50 bis 100 ng/μl für DNA, 50 nl/Oozyt) unter Verwendung eines Druckmikroinjektors. Die Oozyten wurden bei 19°C in der ND96-Salinlösung ergänzt mit Gentamyzin (5 μg/ml) gehalten. Die Oozyten wurden zwei bis vier Tage nach der Injektion von cRNA untersucht. In einer 0,3 ml Perfusionskammer wurde ein einzelner Oozyt mit zwei Standard-Glas-Mikroelektroden (1 bis 2,5 M-Widerstand) gefüllt mit 3M KCl und unter einer Spannungklammer unter Verwendung eines Dagan TEV 200-Verstärkers aufgespießt. Die Stimulierung der Präparation, Gewinnung der Daten und Analyse wurden unter Verwendung der pClamp-Software (Axon Instruments, USA) durchgeführt. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur (21 bis 22°C) in ND96 durchgeführt. 0,1% Rinderserumalbumin wurde zu PcTX1-enthaltenden Lösungen zugesetzt, um seine Absorption an Schläuchen und Behältern zu verhindern. Zur Messung von ASIC-Strömen wurden Veränderungen im extranzellularen pH durch rasche Perfusion mit oder ohne PcTX1 nahe dem Oozyten induziert. Testlösungen mit einem pH von 4 oder 5 wurden mit MES statt mit HEPES gepuffert. Spannungsabhängige K⁺-Kanäle wurden aktiviert durch Depolarisationstests auf +10 mV von einem Haltepotential von –80 mV, und die Toxinlösungen wurden extern angewandt, indem man sanft 100 μl nahe dem Oozyten einblies.
Im anfänglichen Screening wurden 1 μl Aliquots von rohem Gift bei einer 1:1000 Verdünnung in ND96-Lösung getestet. Während des Fraktionierungsverfahrens wurden Aliquots (1/10) von chromatogaphischen Fraktionen getrocknet, wieder in ND96 gelöst und dem Oozyten durch Perfusion zugeführt.
I.3.2. Expression in COS-Zellen
COS-Zellen mit einer Dichte von 20000 Zellen pro 35 mm Durchmesser Petrischale wurden mit einem Gemisch von CD8 und einem der folgenden Plasmide: PCI-ASIC1a, PCI-ASIC1b, PCI-ASIC2a oder PCI-ASIC3 (1:5) unter Verwendung der DEAE-Dextranmethode transfiziert. Die Zellen wurden für elektrophysiologische Messungen einen bis drei Tage nach Transfizierung verwendet. Erfolgreich transfizierte Zellen wurden erkannt durch ihre Fähigkeit CD8-antikörper-beschichtete Perlen (Dynal, Norwegen) zu fixieren.
I.3.3. DRG-Neuronenkulturen
Spinalganglien von zwei bis drei Tage alten Wistar-Ratten wurden mechanisch dissoziiert und in Kultur in Eagle's Medium mit 100 ng/ml Nervenwachstumsfaktor supplementiert gehalten. Die Zellen wurden zwei bis drei Tage nach dem Ausplattieren für elektrophysiologische Aufzeichnungen verwendet.
I.3.4. Zerebellare Granulatzellen-Kulturen
Zerebella von 4 bis 8 Tage alten Mäusen wurden seziert, mechanisch dissoziiert und wie oben beschrieben kultiviert. Die Zellen wurden 10 bis 14 Tage nach dem Ausplattieren für elektrophysiologische Aufzeichnungen verwendet.
I.3.5. Elektrophysiologie an COS-Zellen und Neuronen
Ionenströme wurden aufgezeichnet unter Verwendung entweder der Gesamtzellen- oder Außenseite-Außen-Patch-Clamp-Methode und die Ergebnisse wurden auf einer Festplatte gespeichert. Die Datenanalyse wurde unter Verwendung der Serf-Freeware (http://ipmc.cnrs.fr/deweille/serf.html) durchgeführt. Statistische Signifikanz von Unterschieden zwischen Sätzen von Daten wurde abgeschätzt durch den einseitigen Student-Test. Die Pipettenlösung enthielt (in mM): KCl 140, MgCl₂ 2, EGTA 5, HEPES 10 (pH 7,2). Die Badlösung enthielt (in mM): NaCl 140, KCl 5, MgCl₂ 2, HEPES 10 (pH 7,3). Veränderungen im extrazellularen pH wurden induziert durch Verschiebung eines von sechs Auslässen eines Mikroperfusionssystems vor der Zelle oder dem Patch. Die Experimente wurden bei Raumtemperatur (20 bis 24°C) durchgeführt.
II. Ergebnisse
II.1. Reinigung
Das Screening mehrerer Tarantula-Gifte wurde durchgeführt gegen geklonte ASIC-Kanäle exprimiert in Xenopus Oozyten. Dabei zeichnet sich Psalmopoeus cambridgei -Gift aus als eines, welches einen potenten Inhibitor des ASIC1a-protonen-abhängigen Stroms enthielt. Eine verdünnte Lösung von 1 μl rohem Gift (1:1000) auf die Oozyte aufgebracht bewirkte eine 90%-ige Blockierung des ASIC1a-Stroms. Die Auftrennung führte zur Reinigung des geringeren Giftbestandteils Psalmotoxin 1 (PcTX1) in einem Zweistufenverfahren (1A, B). PcTX1 ist ein 40-Aminosäuren-Peptid, das sechs Halb-Cysteine besitzt, die durch drei Disulfid-Brücken verbunden sind. Seine volle Sequenz wurde nachgewiesen durch den N-endständigen Edman-Abbau des reduzierten-alkylierten Toxins und der mehreren Spaltfragmente. Diese Fragmente sind in 1D gezeigt. Das berechnete Molekulargewicht (MW 4689,40 Da Durchschnitt) stimmte überein mit dem gemessenen Molekulargewicht (4689,25 DA) und legte eine freie Carbonsäure am C-endständigen Ende nahe.
PcTX1 hat eine begrenzte Gesamthomologie zu anderen Spinnengifttoxinen, die bisher identifiziert wurden. 1E zeigt einen Vergleich zwischen PcTX1 und anderen Spinnengifttoxinen. Die Homologie schwankt von 55,6 bis 68,9%. Jedoch enthält auch PeTX1 eine konservierte Cysteinverteilung, die sowohl in Spinnengift als auch Kegelschnecken- und Polypeptidtoxinen gefunden wird, wie in 1F gezeigt. PcTX1 ist ein basisches (pi 10,38) Polypeptid mit neun basischen und sechs sauren Resten.
II.2. Synthese
Die chemische Synthese von PsTXI-OH bestätigte unzweideutig die Struktur von PcTX1. Das gereinigte wiedergefaltete synthetische Toxin (PcTX1s) und die native Form haben identische gemessene MW und bei der Ko-Injektion in zwei getrennten Versuchen unter Verwendung von Umkehrphasen- und Kationenaustausch-HPLC waren natives und synthetisches PcTX1 ununterscheidbar in ihrer Wanderung und eluierten zusammen in beiden Systemen (1C). Die meisten elektrophysiologischen Untersuchungen wurden daher mit dem synthetischen Toxin durchgeführt.
II.3. Selektive Blockierung von ASIC1a
Der Effekt von PcTX1 auf die Aktivität von ASIC1a-, ASIC1b-, ASIC2a- und ASIC3-Kanäle exprimiert in Xenopus laevi Oozyten ist in 2 gezeigt. Das natürliche sowie das synthetische Toxin blockieren den bei pH 6 aufgezeichneten ASIC1a-Strom mit einem IC₅₀ von 0,9 nM (2A und B). Die Blockade ist rasch und reversibel. PcTX1 bei 10 nM Konzentration blockiert auch vollständig den ASIC1a-Strom, der durch einen pH-Abfall auf pH 5 oder pH 4 aktiviert ist (nicht gezeigt). PcTX1 ist hoch selektiv. Weder das natürliche noch das synthetische PcTX1 (10 nM oder 100 nM) blockierten bei pH 6 aktivierte ASIC1b-Ströme ( 2C). Ähnlich war der ASIC2a-Kanal aktiviert bei einem pH-Abfall auf pH 5 unempfindlich gegen die Einwirkung von PcTX1 bei 10 nM (2D) oder 100 nM (nicht gezeigt). Die schnellen und langsamen Komponenten des ASIC3-Kanals waren ebenfalls unempfindlich gegenüber der Perfusion von PcTX1 bei 10 nM ( 2E) und 100 nM (nicht gezeigt). Das Toxin wurde auch getestet am epithelialen ENaC-Kanal gebildet durch die Vereinigung von Alpha, Beta und Beta-Subeinheiten, und keine Inhibierung trat auf bei Konzentrationen von 10 nM oder 100 nM PcTX1 (N = 3, nicht gezeigt).
Sequenzhomologien von PcTX1 mit anderen Spinnentoxinen, die verschiedene Subtypen von spannungsabhängigen K⁺-Kanälen blockieren, wie Hanatoxine (Kv2.1), Heteropodatoxine (Kv4.2) und Phrixotoxine (Kv4.2, Kv4.3) (1E) veranlaßten das Testen der Wirkung von PcTX1 gegen Kv2.1-, Kv2.2-, Kv4.2- und Kv4.3-Kanäle exprimiert in Xenopus Oozyten. Diese Kanäle wurden nicht beeinflußt von 10 nM oder 100 nM PcTX1 (nicht gezeigt).
Untersuchungen, die mit den gleichen ASIC-Kanäle exprimiert in COS-Zellen durchgeführt wurden, bestätigten die in Oozyten erhaltenen Ergebnisse. ASIC1a wurde durch PcTX1 vollständig inhibiert, während ASIC1b, ASIC2a und ASIC3 unempfindlich waren (N = 10 für jeden Kanal) bei der gleichen Toxinkonzentration (50 nM, nicht gezeigt).
PcTX1 wurde dann assayed an Heteromultimeren der ASIC1a-Subeinheit (3). Koexpresssion von ASIC1a und ASIC3 in COS-Zellen erzeugte einen rasch inaktivierenden H⁺-abhängigen Strom (τ = 0,19 ± 0,01 s bei pH 6, N = 5), der unempfindlich ist gegen PcTX1 (N = 10) (3C), während ASIC1a-Homomultimere einen Strom erzeugen, der bei dem gleichen pH 6 langsamer inaktiviert (τ = 2,10 ± 0,30 s, N = 10), der aber durch PcTX1 (10 nM) vollständig blockiert wird (3A). ASIC1a/ASIC2a-Heteromultimere waren ebenfalls unempfindlich gegenüber PcTX1 (3B), was die Spezifizität von PcTX1 zeigt.
Der ASIC1a-Kanal kann auch durch Amilorid blockiert werden, aber der IC₅₀-Wert ist 10 μm, d.h. 10⁴ niedriger in Affinität als PcTX1. Außerdem ist Amilorid nicht selektiv. Es blockiert alle vorübergehenden Expressionen von Strom erzeugt durch ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a und ASIC3. Amilorid inhibiert epitheliale Na⁺-Kanäle, das FMRF-Amid Na⁺-Kanal, T-Typ Ca²⁺-Kanäle und viele andere Transportsysteme, wie die Na⁺/H⁺- und Na⁺/Ca²⁺-Austauscher.
II.4. Aktivität von PcTX1 an nativen protonabhängigen Strömen
Die kleinen Hinterwurzelganglion (dorsal root ganglion = DRG)-Neuronen, die von zwei Tage alten Ratten isoliert waren, wurden bei –60 MV an Spannung geklemmt und durch einen pH-Abfall von pH 7,3 auf pH 6 stimuliert. Wie zuvor in kleinen sensorischen Neuronen in Trigeminal Ganglia beobachtet, bewirkt diese pH- Veränderung drei verschiedenen Typen von Antworten, die in 4A bis C dargestellt sind. Die in 4A dargestellten Ströme wurden durch 3 bis 10 nM des Toxins PcTX1 blockiert, während H⁺-evozierte Ströme in anderen Neuronen gegenüber diesem Toxin unempfindlich waren (4B–C). DRG-Neuronen exprimieren wenigstens zwei Subpopulationen von vorübergehenden Strömen nach Beurteilung ihrer Inaktivierungskonstanten (4A–b, 4D). Eine Population inaktiviert sehr rasch mit einer Zeitkonstante der Inaktivierung unter 0,5 s, während die andere Zeitkonstanten zwischen 1 und 3 s hat, wobei die durchschnittliche Zeitkonstante der Inaktivierung 1,95 ± 0,14 s beträgt (N = 13). Die Daten zeigen klar, daß die am raschesten inaktivierenden Ströme mit einer durchschnittlichen Zeitkonstante der Inaktivierung von 0,24 ± 0,03 s (N = 22) unempfindlich gegen PcTX1 sind. Nur die langsamer inaktivierenden H⁺-Kanäle sind hochempfindlich gegen PcTX1.
Die in 4E gezeigte Dosis-Antwortkurve wurde von der PcTX1-sensiblen Population von Neuronen erhalten. Der IC₅₀-Wert für die Halbmaximum-Inhibierung ist 0,7 nM, sehr ähnlich dem Wert von 0,9 mN, der für in Xenopus Oozyten exprimierte ASIC1a-Kanäle erhalten wurde.
4F zeigt, daß eine Veränderung des extrazellularen pHs von pH 7,3 zu pH 6 in Neuronen, welche den in 4A gezeigten Kanaltyp exprimieren, eine rasche Depolarisierung hervorruft, die zu einer Abfolge von Aktionspotentialen führt. Dieser Effekt wird durch sehr niedrige Konzentrationen von PcTX1 blockiert, und diese Inhibierung ist reversibel, wie sich in der Rückkehr zum Kontrollverhalten nach Waschen zeigt.
ASIC-Kanalsubeinheiten sind hoch exprimiert in zerebellaren und besonders in granularen Zellen. Es wurden daher diese Zellen verwendet, um die Eigenschaften dieser Kanäle in CNS-Neuronen zu analysieren (5). Zerebellare Granularzellen in Kultur antworteten alle auf einem pH-Abfall von pH 7,3 auf pH 6 mit einem vorübergehenden einwärtsgerichteten Na⁺-Strom gekennzeichnet durch eine Zeitkonstante der Inaktivierung von 2,06 ± 0,17 s (N = 10) (5A). Sowohl die Rate der Inaktivierung als auch die pH-Abhängigkeit dieses H⁺-abhängigen Na⁺-Kanals (pH_0,5 6,6 gegen pH_0,5 6,4) sind sehr ähnlich denjenigen des ASIC1a-Kanals (5B). H⁺-abhängige Na⁺-Kanäle mit den gleichen Eigenschaften wurden kürzlich in kortikalen Neuronen identifiziert. Der vorübergehende H⁺-abhängige Na⁺-Kanal, der durch Granularzellen exprimiert war, wurde vollständig inhibiert durch 10 nM PcTX1 (N = 10) (5A).
SEQUENZLISTE

Claims

Ein im wesentlichen reines Polypeptid, das als ein ASIC1a-Kanalblocker wirkt, und die Aminosäurensequenz, die in der Liste von Sequenzen im Anhang unter Nummer SEQ ID No. 1 dargestellt ist, beinhaltet.
Ein im wesentlichen reines Polypeptid, das als ein ASIC1a-Kanalblocker wirkt, dadurch gekennzeichnet daß es aus dem Gift der süd-amerikanischen Tarantel Psalmopoeus cambridgei extrahierbar ist.
Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß es ein berechnetes Molekulargewicht von etwa 4689 Da hat.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet daß seine Effekte reversibel sind.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet daß es die Aminosäuresequenz, die in der Liste von Sequenzen im Anhang unter Nummer SEQ ID No. 1. dargestellt ist, beinhaltet und dessen pharmazeutisch annehmbare Salze.
Nukleinsäuremolekül, das aus einer für ein Polypeptid entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 5 kodierenden Nukleinsequenz besteht oder diese aufweist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, das für die in der Liste von Sequenzen im Anhang unter Nummer SEQ ID No. 1 dargestellte Aminosäuresequenz codiert.
Ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, der gegen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 gerichtet ist, ein Derivat oder ein Fragment derselben.
Ein Vektor, der wenigstens ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 6 oder 7 beinhaltet, assoziert mit angepaßten Kontrollsequenzen.
Ein zellularer Wirt transformiert durch ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 6 oder 7.
Ein zellularer Wirt transformiert durch einen Vektor nach Anspruch 9.
Eine Nukleinsäure- oder Oligonukleotid-Sonde hergestellt mit einem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 6 oder 7.
Ein pharmazeutisches Präparat enthaltend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder dessen pharmazeutisch akzeptierbare Salze und einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger.
Verfahren zur Herstellung eines ASIC1a-Kanalblockers mit folgenden Schritten: (a) Beschaffen mindestens einer Psalmopoeus cambridgei-Spinne; (b) Gewinnen von Gift von besagter mindestens einen Spinne durch elektrisches Melken dieser mindestens einen Spinne; (c) Trennen der Bestandteile des besagten Gifts durch Umkehrphasen-Chromatographie, so daß die Toxine besagten Giftes getrennt werden; (d) weiteres Trennen der Bestandteile des Giftes durch Kationen-Austauschchromatographie; (e) Zurückgewinnen und Isolieren der getrennten Toxine des Giftes; und (f) Kombinieren des isolierten Toxins mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, so daß das Toxin als ein ASIC1a-Kanalblocker wirken kann.