DE60107672T2

DE60107672T2 - Mikroinjektion von kälteschutzmitteln zur konservierung von zellen

Info

Publication number: DE60107672T2
Application number: DE60107672T
Authority: DE
Inventors: Mehmet Toner; Ali Eroglu; Thomas Toth
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 2000-05-16
Filing date: 2001-05-16
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2021-05-17
Also published as: EP1283670A4; PT1283670E; MXPA02011362A; AU6164401A; IL152745A0; AU2001261644B2; EP1283670B1; WO2001087062A3; IL152745A; ATE284139T1; CA2409102A1; US20020045156A1; JP2003533192A; EP1283670A2; US20020098470A1; DE60107672D1; WO2001087062A2; ES2232624T3; US6673607B2; HK1052835A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Konservierung von biologischem Gewebe durch Verwendung von Mikroinjektion von intrazellulären schützenden Agenzien, die Zucker enthalten, um Zellen durch Gefrieren und/oder Trocknung zu konservieren.
Hintergrund der Erfindung
In den vergangenen Jahren waren Chemotherapie und Bestrahlungstherapie von Patienten mit Krebs zunehmend erfolgreich und es wurde eine stetige Abnahme erreicht. Jedoch sind besondere bezüglich den chronischen Nebenwirkungen dieser Therapien auf die Reproduktionssysteme auf Langzeit-Überlebende Bedenken vorhanden. Diese Wirkungen schließen bei Frauen den Verlust von Ovarienkeimzellen und Sterilität ein. Aufgrund des potentiellen Verlusts einer zukünftigen Fruchtbarkeit bei denjenigen, die einer Krebstherapie ausgesetzt sind, hat sich ein Bedarf an Oozyten-Banken entwickelt. Das Oozyten-Gefrieren kann zusammen mit einer in vitro-Fertilisation für Frauen, die eine zukünftige Fruchtbarkeit erhalten wollen und die einen Verlust der gonadalen Funktion aufgrund einer Ausrottungstherapie, Bestrahlung oder Chemotherapie erleiden, von Nutzen sein. Das Oozyten-Gefrieren kann auch eine mögliche Alternative zum Gefrieren humaner Embryonen darstellen, so dass viele der rechtlichen und ethischen Probleme, die beim Gefrieren von Embryonen auftreten, vermieden werden.
Die erste erfolgreiche Gefrierkonservierung von humanen Embryonen wurde 1983 erreicht und mittlerweile stellt das Embryo-Gefrieren ein Routineverfahren dar. Im Gegensatz dazu wurde von einem sehr mäßigen Erfolg bei einer Gefrierkonservierung von humanen Oozyten berichtet. Es wurde von lediglich fünf erfolgreichen Schwangerschaften berichtet bei mehr als 1500 gefrierkonservierten Oozyten. Daher sind die gegenwärtigen Gefrierverfahren immer noch experimentell und es sind neue Ansätze erforderlich, um die Schwierigkeit, die bei einer Gefrierkonservierung der humanen Oozyte auftreten, zu überwinden.
Bisherige Gefrierschutztechniken umfassen das Einführen von Gefrierschutzmitteln bei Konzentrationen von 1 bis 2 M, beispielsweise mit Dimethylsulfoxid (DMSO), Glycerin oder Ethylenglykol, mit einer anschließenden langsamen Gefrierrate (0,3 bis 0,5°C/min). Typischerweise werden Oozyten durch eine langfristige Aussetzung gegenüber schädlichen Gefrierbedingungen beschädigt, einschließlich einer starken Dehydration und hohen Elektrolytkonzentrationen. Ein alternativer Ansatz, der als Verglasung bezeichnet wird (d.h. die Bildung von glasartigem Material ohne eine Kristallisierung von Eis) verwendet hohe Konzentrationen von Gemischen von Gefrierschutzmitteln (6 bis 8 M) bei einer anschließenden schnellen Abkühlung, um die letalen Wirkungen des Gefrierens auf Oozyten zu vermeiden.
Obwohl sie eine attraktive Alternative darstellen, haben Verglasungsverfahren den Nachteil von toxischen und osmotischen Wirkungen bei einer hohen Gefrierschutzmittelkonzentration auf empfindliche Zellen. Keiner dieser zwei Ansätze (langsames Gefrier-Tauen und schnelle Verglasung) ergab ein zufriedenstellendes Ergebnis für eine Gefrierkonservierung von humanen Oozyten. Daher besteht ein Bedarf an einer verlässlichen Technik einer humanen Oozyten-Lagerung. Um eine Konservierung von Säugetierzellen sicherzustellen, die für eine Anwendung von lebenden Zellen als ein therapeutisches Werkzeug bei der klinischen medizinischen Versorgung notwendig ist, müssen neue Protokolle zur Konservierung von lebenden kernhaltigen Zellen entwickelt werden, die niedrige Spiegel an nicht-toxischen Konservierungsmitteln verwenden und aus einfachen Verfahren bestehen, die für eine Vielzahl von Zellen anwendbar sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Lagerung von lebenden Zellen in einem Ruhezustand und die anschließende Versetzung der Zellen in einen aktiven Zustand zu ermöglichen. Dieses Verfahren umfasst die Mikroinjektion eines schützenden Agens in das Zytoplasma einer Zelle, das im Wesentlichen die Säugetier-Zellmembranen nicht durchdringt und das die Lebensfähigkeit der Zelle so aufrecht erhält, dass sie in einem vorübergehenden Ruhezustand gelagert werden kann und im Wesentlichen wieder in einen aktiven Zustand versetzt werden kann. Die mikroinjizierte Zelle wird Bedingungen ausgesetzt. die es ihr ermöglichen, den Ruhezustand einzunehmen und in diesem Ruhezustand gelagert zu werden. Die gelagerte Zelle kann anschließend in einen aktiven Zustand versetzt werden. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass eine beliebige Säugetierzelle so lange gelagert werden kann, bis sie gebraucht wird, bei Bedingungen, die keine oder minimale unerwünschte Nebenwirkungen in der Zelle verursachen.
Daher stellt die Erfindung in einigen Ausführungsformen ein Verfahren zur Konservierung von lebenden Zellen bereit, das mit einer Mikroinjektion eines schützenden Agens, das einen wirksamen Zucker enthält, in die Zelle, vorzugsweise eine Oozyte, beginnt. Andere bevorzugte Zellen, die konserviert werden können, umfassen differenzierte Zellen wie Epithelzellen, Nervenzellen, epidermale Zellen, Keratinozyten, hämatopoetische Zellen, Melanozyten, Chondrozyten, B-Zellen, T-Zellen, Eryhtrozyten, Makrophagen, Monozyten, Fibroblasten oder Muskelzellen; und nicht-differenzierte Zellen wie embryonale, mesenchymale oder ausgereifte Stammzellen. In einer Ausführungsform bleiben die differenzierten Zellen differenziert, nachdem sie aus einem gefrorenen oder getrockneten Zustand entlassen worden sind, und die nicht-differenzierten Zellen verbleiben nicht-differenziert, nachdem sie entlassen worden sind. Die Zellen können haploid sein (DNA-Gehalt von n; worin "n" die Anzahl der Chromosomen in dem normalen haploiden Chromosomensatz eines Säugetiers eines bestimmten Genus oder Spezies ist), diploid (2n) oder tetraploid (4n) sein. Andere Zellen umfassen solche aus der Blase, Gehirn, Ösophagus, Eileiter, Herz, Darm, Gallenblase, Niere, Leber, Lunge, Ovarien, Pankreas, Prostata, Rückenmark, Milz, Magen, Hoden, Thymus, Schilddrüse, Luftröhre, Harnleiter, Harnröhre oder Uterus. Die Zellen können von einem menschlichen oder nicht-menschlichen Säugetier wie einem Affen, Menschenaffen, Rind, Schaf, Dickhornschaf, Ziege, Büffel, Antilope, Ochsen, Pferd, Esel, Maultier, Wild, Elch, Karibu, Wasserbüffel, Kamel, Lama, Alpaka, Kaninchen, Schwein, Maus, Ratte, Meerschweinchen, Hamster, Hund oder Katze stammen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in vorteilhafter Weise niedrige Spiegel eines Konservierungsmittels verwenden, weniger oder gleich etwa 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 M oder sogar weniger als etwa 0,4 M, und kann einen Zucker alleine als Konservierungsmittel oder einen Zucker in Kombination mit einem konventionellen Gefrierschutzmittel oder in Kombination mit anderen intrazellulären Zuckern oder extrazellulären Zuckern verwenden. Bevorzugter ist die zytoplasmatische Konzentration der Zucker geringer als 0,3, 0,2, 0,1, 0,05 oder 0,01 M nach einer Mikroinjektion und vor dem Gefrieren oder Trocknen der Zelle. Die extrazelluläre Konzentration der Zucker ist vorzugsweise geringer als 0,3, 0,2, 0,1, 0,05 oder 0,01 M nach Verdünnung in einem Flüssigmedium, das die Zelle enthält. Wenn die Zelle auf einem Festträger wie einer Agarplatte wachsen gelassen wird, ist die Zuckerkonzentration in dem Konservierungsmittel, das mit der Zelle in Kontakt gebracht wird, vorzugsweise geringer als 0,3, 0,2, 0,1, 0,05 oder 0,01 M. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die Endkonzentration des extrazellulären Zuckers in dem Medium, das die Zelle enthält, mindestens 2-, 3-, 4-, 5- oder 10fach größer als die zytoplasmatische Konzentration des intrazellulären Zuckers nach einer Mikroinjektion und vor dem Gefrieren oder Trocknen der Zelle. Die intrazellulären und extrazellulären Konservierungsmittel können dieselben sein oder eine andere molekulare Spezies sein.
Bevorzugte schützende Agenzien umfassen Zucker wie Monosaccharide, Disaccharide und andere Oligosaccharide. Vorzugsweise ist das Agens im Wesentlichen nicht permeabel, so dass mindestens 50, 60, 70, 80, 90 oder 95% des Agens nicht durch die Plasmamembran in oder aus der Zelle durch eine aktive oder passive Diffusion migriert. Bevorzugte Zucker haben eine Glasübergangstemperatur der maximal Gefrier-konzentrierten Lösung (Tg'), die mindestens –60, –50, –40, –30, –20, –10 oder 0°C beträgt. Beispiele von solchen Zuckern sind solche, die in der 14 aufgelistet sind. Die Tg' der anderen Zucker können routinemäßig bestimmt werden unter Verwendung von Standardverfahren wie solchen, die von Levine und Slade beschrieben worden sind (J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1, 84:2619–2633, 1988). Der Zucker oder das konventionelle Gefrierschutzmittel mit einer Tg' unterhalb von –50°C kann mit einem Zucker kombiniert werden mit einer Tg' oberhalb von –50°C, so dass das entstehende Gemisch eine Tg' von mindestens –60, –50, –40, –30, –20, –10 oder 0°C aufweist und dieses Gemisch wird für eine Gefrierkonservierung verwendet.
Geeignete Monosaccharide umfassen solche, die eine Aldehydgruppe (d.h. Aldosen) oder eine Ketogruppe (d.h. Ketosen) besitzen. Monosaccharide können linear oder zyklisch sein und sie können in einer Vielzahl von Konformationen vorliegen. Andere Zucker umfassen solche, die modifiziert worden sind (z.B. in denen eine oder mehrere der Hydroxylgruppen mit Halogen, Alkoxyresten, aliphatischen Gruppen ersetzt wurden oder sind als Ether, Ester, Amine oder Carboxylsäuren funktionalisiert). Beispiele von modifizierten Zuckern umfassen α- oder β-Glykoside wie Methyl-α-D-glucopyranosid oder Methyl-β-D-glucopyranosid; N-Glykosylamine; N-Glykoside; D-Gluconsäure; D-Glucosamin; D-Galactosamin; und N-Acetyl-D-glucosamin. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist das Konservierungsmittel ein Oligosaccharid, das mindestens 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 1000 oder mehr Monomere einschließt. Das Oligosaccharid kann aus identischen Monomeren bestehen oder aus einer Kombination unterschiedlicher Monomere. Andere geeignete Oligosaccharide schließen Hydroxylethylstärke, Dextran, Cellulose, Cellobiose und Glucose ein. Andere geeignete Konservierungsmittel umfassen Verbindungen, die einen Zuckerrest enthalten und die hydrolytisch gespalten werden können, um einen Zucker zu erzeugen. Andere geeignete Konservierungsmittel umfassen Glykoproteine und Glykolipide, die vorzugsweise durch den Zusatz von 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr Zuckerresten, die sich aus Zuckern mit einer Tg' von mindestens –60, –50, –40, –30, –20, –10 oder 0°C ableiten, modifiziert worden sind, oder ein Molekulargewicht von mindestens 120 Daltonaufweisen. "Zuckerrest" bezeichnet einen schützenden Zucker, der eine Gruppe einschließt, die an eine andere Verbindung gebunden werden kann. Zum Beispiel kann eine reaktive Gruppe wie ein Alkohol, primäres Amin oder sekundäres Amin in einem Zucker mit einer Verbindung reagieren, um ein Produkt zu bilden, das den Zuckerrest einschließt.
Ein anderes geeignetes extrazelluläres Konservierungsmittel ist ein Lectin oder ein beliebiges Protein, das nicht-kovalent oder kovalent an einen Zucker, der einen Teil eines Zelloberflächen-Glykoproteins oder -Glykolipids bildet, binden kann. Diese Bindung kann die zelluläre Membran während der Lagerung der Zelle stabilisieren.
Beispiele von anderen Gefrierschutzmitteln, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, umfassen Zucker, Polyole, Glucoside, Polymere und lösliche Proteine mit einem Molekulargewicht von mindestens 120 Dalton. Wie aus den 8 und 9 hervorgeht, tendieren Verbindungen mit höheren Molekulargewichten eher dazu, die Glasbildung bei einer höheren Temperatur zu fördern, als kleinere Verbindungen, was es ermöglicht, die Zellen bei einer höheren Lagerungstemperatur zu lagern.
Nach der Behandlung mit dem mikroinjizierten schützenden Agens und gegebenenfalls mit dem externen schützenden Agens ist die Zelle auf eine Lagerung vorbereitet. Im Allgemeinen kann die Zelle auf eine Lagerung durch Gefrieren und/oder Trocknen vorbereitet werden. Tauchgefrieren, Vakuumtrocknung, Lufttrocknung und Gefriertrocknungstechniken können eingesetzt werden. Typischerweise werden Oozyten bei einer Rate von einschließlich 0,1 bis 10°C/min, vorzugsweise zwischen 0,3 und 5°C/min und bevorzugter zwischen 0,5 und 2°C/min abgekühlt. Somatische Zellen werden bei einer Rate von einschließlich 0,1 bis 200°C/min, vorzugsweise zwischen 0,5 und 100°C/min und bevorzugter zwischen 1 und 10°C/min oder 10 und 50°C/min abgekühlt. Die Zellen werden auf eine Endtemperatur von mindestens –60, –50, –40, –30, –20, –10, 0, 10 oder 20°C abgekühlt (die Reihenfolge entspricht der zunehmenden Bevorzugung). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform inhibiert oder verhindert das Konservierungsmittel die Kernbildung oder die Zunahme an intrazellulärem Eis während des Gefrierens der Zellen.
Extrazelluläre Konservierungsmittel können den auf die Zellen wirkenden osmotischen Schock verringern, der hauptsächlich auf den Zusatz eines intrazellulären Konservierungsmittels zurückzuführen ist. Zusätzlich können extrazelluläre Konservierungsmittel Plasmamembranen stabilisieren und die Zellen mechanisch während des Gefrierens oder der Trocknung stabilisieren.
Wenn die Zelle für eine Lagerung vorbereitet ist, wird sie auf eine ihrer Präparation angemessene Weise gelagert. Gefrorene Zellen können bei Gefrier-Temperaturen gelagert werden und getrocknete Zellen können bei mittleren oder anderen Temperaturen, soweit zweckdienlich, trocken gelagert werden. Die Gewinnung von gelagerten Zellen ist auf das Präparationsverfahren zur Lagerung ausgerichtet. Getrocknete Zellen werden rehydriert und gefrorene Zellen werden aufgetaut. Vorzugsweise sind mindestens 25, 35, 50, 60, 70, 8 0, 90, 95 oder 100% der gewonnenen Zellen lebensfähig. Die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch Verwendung eines beliebigen Standard-Assays wie einem "Lebend-/Tot"-Assay gemessen werden, indem der grüne Farbstoff Calcein-AM verwendet wird, um lebensfähige Zellen zu kennzeichnen und der rote Farbstoff Ethidiumhomodimer, um tote Zellen zu kennzeichnen, entsprechend dem Protokoll des Herstelles (Molecular Probes, Inc.). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können mindestens 5, 10, 15, 25, 35, 50, 60, 70, 80, 90 oder 95% der gewonnenen Oozyten unter Verwendung von Standard-in vitro- Fertilisationstechniken befruchtet werden (siehe z.B. Summers et al., Biol. Reprod. 53:431–437, 1995). Vorzugsweise entwickeln sich die befruchteten Oozyten zu Embryonen im 2-Zell-Stadium, Embryonen im 4-Zell-Stadium, Embryonen im Morula-Stadium, Embryonen im Blastozysten-Stadium, Embryonen im fötalen Stadium oder lebenden Nachkommen.
Mit "Embryo" ist eine sich entwickelnde Zellmasse gemeint, die sich nicht in die Uterusmembran eines weiblichen Wirts implantiert hat. Daher bezeichnet der Ausdruck "Embryo" eine befruchtete Oozyte, eine sich entwickelnde Zellmasse im Vor-Blastozysten-Stadium oder eine andere sich entwickelnde Zellmasse, die sich in einem Entwicklungsstadium vor der Implantation in die Uterusmembran eines weiblichen Wirts und vor der Ausbildung einer Geschlechtsreife befindet. Ein Embryo kann mehrere Stadien einer Zellentwicklung darstellen. Zum Beispiel kann ein einzelliger Embryo als eine Zygote bezeichnet werden; eine feste kugelförmige Masse von Zellen, die aus einem gespaltenen Embryo stammt, kann als Morula bezeichnet werden und ein Embryo mit einem Blastocoel kann als Blastozyste bezeichnet werden.
Mit "Fötus" oder "fötal" ist eine sich entwickelnde Zellmasse gemeint, die sich in die Uterusmembran eines weiblichen Wirts implantiert hat. Ein Fötus kann definierenden Merkmale wie Geschlechtsreife aufweisen, die durch den Fachmann leicht identifiziert werden können.
Es können Säugetierzellen in vitro kultiviert werden, indem die Zellen in einem hypertonen Medium mit einer Osmolarität von mehr als 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 oder mehr mosm inkubiert werden. Vorzugsweise schließt das Medium einen oder mehrere der in 7 aufgeführten Bestandteile oder ein oder mehrere erfindungsgemäße Gefrierschutzmittel ein. Vorzugsweise enthält das Medium Nährstoffe wie Aminosäuren, Zucker, Lactat oder Pyruvat. Dieses Medium kann verwendet werden, um eine beliebige Säugetierzelle zu kultivieren, einschließlich der vorstehend aufgeführten bevorzugten Zellen. In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen wird dieses Medium verwendet, um Zellen vor, während und nach einer Gefrierkonservierung zu kultivieren.
Die vorliegende Erfindung besitzt eine Reihe von Vorteilen bezüglich der Gefrierkonservierung von Zellen. Zum Beispiel können diese Verfahren allgemein für die Konservierung einer beliebigen Zelle von einem beliebigen Säugetier angewendet werden. Diese Zellen können in einem gefrorenen oder getrockneten Zustand für einen beliebigen Zeitraum gelagert werden, bis sie benötigt werden. Zusätzlich beinhalten diese Gefrierkonservierungsverfahren die Verwendung von relativ geringen Konzentrationen an nicht-toxischen Konservierungsmitteln, die keine oder nur geringe schädliche Nebenwirkungen in den gelagerten Zellen verursachen. Darüber hinaus vermindern oder verhindern die Konservierungsmittel die Bildung von intrazellulärem Eis während des Gefrierens, das ansonsten die Zellen beschädigen würde. Wenn erwünscht, können sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Konservierungsmittel verwendet werden, um den osmotischen Druck, der durch den Zusatz eines intrazellulären Konservierungsmittels zu den Zellen bedingt ist, zu vermindern. Extrazelluläre Konservierungsmittel können auch Plasmamembranen stabilisieren und die Zellen während des Gefrierens oder der Trocknung mechanisch verstärken. Weiter kann die vorliegende Erfindung eine höhere Lagerungstemperatur ermöglichen (vorzugsweise mehr als –60°C) im Vergleich zu konventionellen Gefrierschutzmitteln (typischerweise weniger als –80°C) aufgrund der hohen Tg' von Zuckern.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird ausgehend von der folgenden detaillierten Beschreibung zusammen mit den anhängendenZeichnungen genauer verstanden werden:
1 ist eine Fließzeichnung, die die Schritte in dem erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
2 ist ein schematisches Flussdiagramm, das eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Gefrierkonservierungsablaufs aufführt. Dies er Ablauf kann durch einen Fachmann für die Konservierung von anderen Zellen unter Verwendung von anderen Gefrierkonservierungsmitteln, Abkühlraten, Verdünnungsschritten und Medien modifiziert werden.
3A ist ein Diagramm, das das Volumen von Maus-Oozyten in isotonischem DMEM/F-12-Medium vor einer Mikroinjektion, DMEM/F-12 mit 0,1 M extrazellulärer Trehalose (hypertones Medium) vor einer Mikroinjektion und DMEM/F-12 mit 0,1 M extrazellulärer Trehalose (hypertones Medium) nach einer Mikroinjektion von 0,1 M Trehalose zeigt. 3B–3D sind Phasenkontrat- Mikroskopaufnahmen der Oozyten bei den jeweiligen drei vorstehend aufgeführten Bedingungen.
4A–4D sind Breitfeld-Mikroskopaufnahmen humaner Oozyten in einem isotonen DMEM/F-12-Medium vor einer Mikroinjektion, DMEM/F-12 mit 0,15 M extrazellulärer Trehalose (hypertones Medium) vor einer Mikroinjektion, DMEM/F-12 mit 0,15 M extrazellulärer Trehalose (hypertones Medium) während einer Mikroinjektion bzw. DMEM/F-12 mit 0,15 M extrazellulärer Trehalose (hypertones Medium) nach einer Mikroinjektion von 0,15 M Trehalose.
5 ist ein Säulendiagramm, das die Kalibrierung einer Mikropipette zeigt, die für die Mikroinjektion eines erfindungsgemäßen Gefrierschutzmittels verwendet wird.
6A und 6B sind Phasendiagramme von DMSO und Trehalose.
7 ist eine Tabelle, welche die Bestandteile von HTF-, modifizierten isotonen HTF- und modifizierten hypertonen HTF-Medien aufführt.
8 ist eine Tabelle, die den Prozentsatz von Maus-Ooyzten in der Metaphase II mit oder ohne intrazelluläre Trehalose, die befruchtet wurden und sich in Blastozysten entwickelten, während sie in modifiziertem HTF-, isotonem oder modifiziertem hypertonen HTF Medium kultiviert worden sind.
9A und 9B sind ein Satz von Diagrammen, die das prozentuale Überleben von Metaphase II-Maus-Oozyten mit 0 oder 0,10–0,15 M intrazellulärer Trehalose in der Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von extrazellulärer Trehalose zeigen.
10 zeigt das Überleben von gekühlten Metaphase II-Maus-Oozyten nach einer Übernacht-Kultur.
11 zeigt das Überleben von gekühlten humanen Oozyten nach einer Übernacht-Kultur.
12A ist ein Diagramm eines Kurvensatzes, das das normalisierte Wasservolumen in Oozyten als Funktion der Temperatur für verschiedene Abkühlraten zeigt. 12B ist ein Diagramm, das die berechnete Dehydrationszeit als eine Funktion der Temperatur zeigt. Die Dehydrationszeit ist definiert als die Zeit, die notwendig ist, damit eine Oozyte in ihrem Volumen um 50% bei einer gegebenen Temperatur schrumpft.
13 ist ein Graph eines Kurvensatzes, der das kumulative Auftreten von intrazellulärem Eis als eine Funktion der Temperatur in der Gegenwart oder Abwesenheit von Konservierungsmitteln zeigen.
14 ist eine Tabelle, die das Molekulargewicht und die Glasübergangstemperatur für Zucker aufführt mit einer Glasübergangstemperatur von mehr als –55°C (Levine und Slade, J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1, 84:2619-2633, 1988). Viele dieser Zucker sind kommerziell verfügbar von Lieferanten wie Sigma und British Sugar.
15 ist ein Diagramm, das die gleich bleibende Beziehung zwischen Tg' und dem Molekulargewicht mehrerer Zucker und traditionellen Gefrierschutzmitteln zeigt.
16 ist eine Breitfeld-Mikroskopaufnahme eines Mikrotropfens vor und nach Injektion von Trehaloselösung.
17 ist ein Diagramm des Injektionsvolumens (pl) für verschiedene. Injektionszeiten (msec) bei einem Injektionsdruck von 3 PSI für einen Mikrotropfen, der mit Trehaloselösung injiziert wurde.
18 sind Aufnahmen von Fluoreszenzbildern von Oozyten, die einmal ("1X") oder zweimal ("2X") mit dem fluoreszierenden Zucker, Oregon-grün-markierten Dextran, wie hier beschrieben, injiziert worden sind.
19 ist ein Diagramm einer Standardkurve der fluoreszierenden Intensität bei verschiedenen Konzentrationen des OG-markierten Dextrans innerhalb der Mikrotropfen.
Detaillierte Beschreibung
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Konservieren von biologischem Gewebe, das in 1 und 2 veranschaulicht ist, beginnt mit der Selektion oder Isolation der zu konservierenden Zellen oder Gewebe (10). Während das erfindungsgemäße Verfahren zur Konservierung eines beliebigen biologischen Materials mit Lipidmembranen verwendet werden kann, ist es am meisten zur Konservierung von lebenden kernhaltigen Zellen und insbesondere anderweitig schwierig zu konservierenden Säugetierzellen wie Oozyten verwendbar.
Oozyten können erhalten werden, indem Eileiter und/oder Ovarien isoliert werden und die Oozyten freigesetzt werden. Die Oozyten werden einer Hyaluronidase ausgesetzt, einem Enzym, das Extrazellen aufbricht. Die Oozyten werden dann zweimal in einem Gemisch aus HEPES-gepuffertem Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium/Nährstoüff F-12 (DMEM/F-12) (Gibco) und BSA (bovines Rinderserum) gewaschen. Die Oozyten werden dann in modifiziertes, isotonisches HTF überführt, das mit Embryo-getestetem Mineralöl (Sigma) oder einem anderen geeigneten Medium bedeckt ist. Die DMEM/F-12-Medien sind bevorzugt mit 4 mg/ml BSA ergänzt. Wenn erwünscht, können die Oozyten auch mit extrazellulärem Zucker bei derselben Konzentration wie die geplante Menge zur Mikroinjektion inkubiert werden. Zum Beispiel können zur Injektion von 0,1 M Zucker Oozyten in DMEM/F-12 mit 0,1 M Zucker equilibriert werden. Wie in den 3A–3C gezeigt, verursacht die Hyperosmotizität der externen DMEM/F-12+-Zuckerlösung, dass die Maus-Oozyten schrumpfen. Diese Abnahme im Zellvolumen kann quantifiziert werden, indem der Durchmesser der Zellen unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie visuell gemessen wird. Die Abnahme im Zellvolumen ermöglicht die Bestimmung der Menge an Zucker, der anschließend in die Oozyten mikroinjiziert wird. Zum Beispiel bedeutet ein Anschwellen von Zellen während einer Mikroinjektion auf ihr anfängliches isotonisches Volumen (d.h. das Zellvolumen vor der Equlibrierung mit einem externen Zucker), dass die Konzentration des injizierten Zuckers nahe an der der extrazellulären Zuckerkonzentration liegt (3A–3D). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, als humane Oozyten in 0,15 M extrazellulärer Trehalose inkubiert wurden, was zu einer Volumenabnahme führt, und dann mit Trehalose injiziert werden, bis das Volumen der Oozyten auf deren Anfangsvolumen in isotonischen Medien zurückgeht, was darauf hinweist, dass 0,15 M Trehalose injiziert worden sind (4A–D). Alternativ können die Oozyten gegebenenfalls mit einem anderen im Wesentlichen nicht-permeablen Lösungsmittel wie NaCl equilibriert werden, um deren Zellvolumen vor einer Mikroinjektion zu erniedrigen. Diese anfängliche Abnahme im Zellvolumen kann zu einem kleineren Endvolumen der mikroinjizierten Oozyten im Vergleich zu Oozyten, die nicht in einem hypertonen Medium vor Mikroinjektion inkubiert worden sind, führen. Dieses kleinere Endvolumen kann jede potentielle schädliche Wirkung aufgrund des Anschwellens der Oozyten minimieren. Dieses allgemeine Verfahren zur Herstellung von Zellen zur Mikroinjektion kann auch für andere Zelltypen verwendet werden.
Die Zielzellen werden dann mit einem biokonservierenden Agens mikroinjiziert (30). Mikroinjektions-Equipment und -verfahren sind auf dem Gebiet gut charakterisiert und ein Mikroinjektions-Equipment, das zur Injektion von kleinen Molekülen in Zellen bekannt ist, kann für die Erfindung verwendet werden. In einem beispielhaften Mikroinjektionsschritt können Oozyten bei einem Druck von 10 psi für 30 Millisekunden mikroinjiziert werden. Ein anderes Beispiel einer Standard-Mikroinjektionstechnik ist das von Nakayame und Yanagimachi (Nature Biotech. 16:639–642, 1998) beschriebene Verfahren.
Zur Mikroinjektion von Konservierungsagenzien werden Injektionspipetten aus 1 mm Borsilikat-Dünnwand-Glaskapillaren (B100-75-10, Sutter, Novato, CA) hergestellt. Zuerst wurden die Pipetten unter Verwendung einer horizontalen Mikropipetten-Abziehvorrichtung (Modell P-97, Sutter) so abgezogen, dass sie einen langen Schaft aufweisen (~ 1,3 cm). Um eine scharfe Spitze mit einem inneren Durchmesser von etwa 0,5 μm zu erhalten, wurden die Injektionspipetten mit einem Winkel von 40° auf einer modifizierten Sutter-Mikropipetten-Abkantvorrichtung (BV-10, Sutter) abgekantet, wobei eine variable Rotationsgeschwindigkeit der Schleifplatte ermöglicht wurde.
Wenn erwünscht, kann die Mikropipette, die zur Mikroinjektion des Gefrierkonservierungsmittels verwendet wird, vor einer Injektion kalibriert werden (5). Für diese Kalibrierung wurde ein Mikrotropfen von DMEM/F-12-Medium, das in einer Lösung Dimethypolysilaxen suspendiert war, mit einer Zuckerlösung von Interesse injiziert. Vorzugsweise hat der Mikrotropfen eine ähnliche Größe wie die Zellen, die mikroinjiziert werden. Zum Beispiel wurden Mikrotropfen mit einem Durchmesser von 70–100 verwendet, um eine Mikropipette für die Mikroinjektion von Oozyten zu kalibrieren. Um unterschiedliche Injektionsvolumina bei einer gegebenen Injektionspipette zu messen, wurden mehrere Mikrotropfen bei variierender Injektionszeit und -druck injiziert. Es wurden Bilder von jedem Mikrotropfen unter Verwendung von Breitfeldmikroskopie vor und nach Injektion aufgenommen, um die Volumenzunahme der Tropfen und damit das Injektionsvolumen zu berechnen (16). Da die Mikrotropfen beinahe perfekte Sphären sind, wurden die Tropfenvolumina unter Einbeziehung der Tropfendurchmesser berechnet. Zum Beispiel kann das Volumen anhand eines Querschnittabbildes mit Hilfe der Formel V = 0,75226 (A)^3/2 berechnet werden, worin A die Querschnittsfläche des Mikrotropfens darstellt. Um sehr kleine Injektionsvolumina zu bestimmen, wurden 10 aufeinander folgende Mikroinjektionen in einem Mikrotropfen verwendet, um ein messbares Volumen zu erzeugen. Dieser Totalanstieg im Volumen wurde durch 10 geteilt, um das durchschnittliche Volumen pro Injektion zu erhalten. Bei einer gegebenen Injektionspipette waren der Injektionsdruck und die Pulsdauer (d.h. die Dauer der Injektion) zwei Hauptfaktoren, die eine Wirkung auf die Injektionsvolumina hatten. Um die Injektionspipetten zu kalibrieren, wurde der Injektionsdruck bei einem geeigneten Wert gehalten und die Pulsdauer wurde verändert. Das Injektionsvolumen variierte linear als eine Funktion der steigenden Pulsdauer (17). Durch das Variieren der Pulsdauer und das Sammeln von genügend Datenpunkten wurde eine Steigung für eine gegebene Injektionspipette erzeugt. Diese Steigung war insbesondere bei der Auswahl von verschiedenen Injektionsvolumina bei den tatsächlichen Experimenten nützlich. Nach der Kalibrierung wurden die Mikropipetten mit destilliertem Wasser gewaschen, indem sie angesaugt und das Wasser ausgeblasen wurde. Als nächstes wurde jegliches verbleibende Dimethylpolysilaxen entfernt, indem die Mikropipetten in Methylenchlorid eingetaucht wurden (Fisher, Pittsburgh, PA) und dann die Mikropipetten mit destilliertem Wasser und reinem Ethanol gewaschen wurden. Die Mikropipetten wurden dann für die eigentliche Zell-Mikroinjektion weiter präpariert, indem sie Dämpfen von Hexamethyldisilaxen in einem Exsikkator für mehrere Stunden ausgesetzt wurden, um eine Anlagerung von Zelltrümmern an die Pipette zu vermeiden.
Die Genauigkeit dieser Prä-Kalibrierungstechnik wurde bestätigt, indem eine alternative Technik verwendet wurde, die eine Mikroinjektion von Oregon-Grün-(OC) markiertem Dextran (Molecular Probes, Eugene, OR) in Oozyten und Mikrotropfen beinhaltete. Zur Mikroinjektion von Oozyten wurden 80 μl DMEM/F-12-Medium und 20 μl OG-markierte Dextranlösung (1 mM), hergestellt in 10 mM Tris (pH 7,4) in eine 60 × 10 mm-Falcon-Plastikkulturschale (Fisher) platziert und mit Mineralöl überlagert. Als nächstes wurden die Oozyten auf den Injektionstropfen übertragen. Vor der Mikroinjektion wurden sowohl die Halte – als auch die Injektionspipetten so gebogen, dass sich der Spitzenteil horizontal zur Fokusebene befand. Die Haltepipette wurde mit dem Medium gefüllt und mit einer manuellen Spritze (Sutter) über eine Plastikschlauch, der mit Mineralöl gefüllt war, verbunden. In gleicher Weise wurde die Injektionspipette an die Mikroinjektionsvorrichtung über einen Plastikschlauch verbunden und die Dextranlösung wurde in die Injektionspipette angesaugt. Später wurde ein leichter, bestimmter Druck auf das System während des gesamten Mikroinjektionsverfahrens angewendet, um ein Ansaugen des Außenmediums in die Injektionspipette zu verhindern. Während der Mikroinjektion wurde eine Oozyte mit der Spindel bei der 12- oder 6-Uhr-Position auf der Spitze der Haltepipette gehalten, indem sie über eine manuelle Spritze angesaugt wurde, während die Injektionspipette in die Oozyte von der gegenüberliegenden Seite eingeführt wurde. Es wurde eine Piezo-Injektionsvorrichtung (PM-20, Stoelting) verwendet, um das Einführen der Injektionspipette durch eine schnelle Einstichbewegung zu ermöglichen. Als nächstes wurde die OG-markierte Dextranlösung in die Oozyte bei einer geeigneten Zeit- und Druckeinstellung injiziert. In gleicher Weise wurden Mikrotropfen von DMEM/F-12-Medium mit der OG-markierten Dextranlösung bei derselben Zeit- und Druckeinstellung und derselben Mikroinjektionspipette injiziert. Nach der Mikroinjektion wurden Fluoreszenzaufnahmen von injizierten Oozyten und Mikrotropfen unter Verwendung eines invertierten Nikon TMD-Mikroskops eingefangen, das mit einer Hochdruck-Quecksilberdampflampe, einem Fluorescein-selektiven Filtersatz und einer CCD-Kamera ausgerüstet war. Um Fehler aufgrund möglicher Fluktuationen beim Output der Quecksilberdampflampe minimal zu halten, wurde jedes Fluoreszenzbild durch eine Mittelwertbildung von 64 Rahmen aufgenommen. 18 stellt typische Fluoreszenzbilder von Oozyten dar, die nach der vorstehend beschriebenen Mikroinjektion aufgenommen wurden. Die Fluoreszenzintensität der aufgenommenen Bilder wurde auf einem kleinen Punkt im Zentrum der Zelle oder des Tropfens mit Hilfe des Metamorph-Softwarepakets (Universal Imaging Co., West Chester, PA) auf einem Personalcomputer gemessen. Als nächstes wurde eine Standardkurve mit Hilfe unterschiedlicher Konzentrationen des OG-markierten Dextrans innerhalb der Mikrotropfen erzeugt (19). Die mikroinjizierten Dextrankonzentrationen in den Oozyten und den Mikrotropfen wurden anhand der Standardkurve geschätzt. Schließlich wurden die Injektionsvolumina aus den in den mikroinjizierten Oozyten und Mikrotropfen gefundenen Dextrankonzentrationen berechnet. Eine Auswertung der Injektionsvolumina zeigte, dass die Injektion in Mikrotropfen die Injektionsvolumina in Oozyten mit einer Sensitivität im pl-Bereich widerspiegelt (5).
Wie zuvor beschrieben, wurde auch ein anderer Ansatz verwendet, um die Konzentration des injizierten Zuckers zu bestimmen, der das Vergleichen des Volumens einer Oozyte in hypertonem Medium (d.h: 0,1 M Trehalose) vor und nach einer Mikroinjektion beinhaltete. Da der Beitrag von 10 mM Tris auf die Gesamtosmolarität des Injektionspuffers (der typischerweise auch 800 oder 1000 mM Zucker einschließt) vernachlässigbar ist, ist die Re-Expansion der geschrumpften Oozyten in einem 0,10 M-Zucker/Medium-Gemisch nach Mikroinjektion von Zucker auf die Einführung von Zucker in die Zellen zurückzuführen. Daher zeigt das Ausmaß der Re-Expansion nach einer Mikroinjektion die intrazelluläre Konzentration des injizierten Zuckers. Tatsächlich zeigten einzelne Maus-Oozyten eine ähnliche volumetrische Antwort auf dieselbe Menge injizierter Trehalose. Ein solches Experiment ist in den 3B–3D zusammengefasst, die eine typische Oozyte bei einem isotonischen Volumen (3B), eine geschrumpfte Oozyte in hypertonem Medium vor Mikroinjektion von Trehalose (3C) und eine re-expandierte Oozyte in hypertonem Medium nach Mikroinjektion von Trehalose, die gleich der extrazellulären Trehalosekonzentration ist (3D).
Um eine gewünschte zytoplasmatische Zuckerkonzentration nach einer Mikroinjektion und vor einer Konzentration des intrazellulären Zuckers aufgrund des Gefrierens oder Trocknens der Zelle zu erreichen, kann entweder das Volumen des Konservierungsmittels, das in die Zelle injiziert wird, die Anfangskonzentration des Zuckers in dem Konservierungsmittel oder beides angepasst werden. Zum Beispiel kann zur Erreichung einer relativ hohen zytoplasmatischen Zuckerkonzentration nach einer Mikroinjektion ein relativ großes Volumen an Konservierungsmittel injiziert werden oder es kann eine relativ hohe Zuckerkonzentration injiziert werden. Alternativ kann, wenn eine geringe zytoplasmatische Zuckerkonzentration erwünscht ist, das Volumen des zu injizierenden Konservierungsmittels erniedrigt werden, die Zuckerkonzentration in dem Konservierungsmittel kann verringert werden oder es können beide Änderungen durchgeführt werden. Das Volumen des zu injizierenden Konservierungsmittels kann so gewählt werden, dass das Volumen nicht so groß ist, dass der entstehende Volumenanstieg des Zytoplasmas zu einer Lyse der Zelle führt. Zusätzlich kann das Volumen des Konservierungsmittels so ausgewählt werden, dass es nicht zu gering ist, um genau gemessen und injiziert zu werden.
In ähnlicher Weise kann zum Erreichen einer gewünschten extrazellulären Zuckerkonzentration nach einer Verdünnung in ein Flüssigmedium, das die Zelle enthält, entweder das Volumen des Konservierungsmittels, das dem Medium zugeführt wird, die Anfangszuckerkonzentration in dem Konservierungsmittel, das dem Medium zugeführt wird, oder beides angepasst werden. Daher kann die extrazelluläre Zuckerkonzentration erhöht werden, indem ein größeres Volumen oder eine konzentriertere Lösung des Flüssigmediums zugesetzt wird. Bei einem Konservierungsmittel, das einer Zelle, die auf einem Festmedium wie Agar wächst, zugesetzt wird, kann die erwünschte extrazelluläre Zuckerkonzentration erreicht werden, indem die Zelle mit einem Konservierungsmittel, das den Zucker bei der gewünschten Konzentration enthält, in Kontakt gebracht wird.
Ein Bio-Konservierungsmittel, das für diesen Prozess verwendbar ist, umfasst eine beliebige Chemikalie, die Gefrierschutzeigenschaften aufweist und die gewöhnlich nicht-permeabel ist. Insbesondere kann das Bio-Konservierungsmittel Zucker einschließen, entweder einzeln oder zusammengemischt mit anderen herkömmlichen Bio-Konservierungsmitteln. Kohlenhydratzucker wie Trehalose, Saccharose, Fructose und Raffinose können bei Konzentrationen von weniger als oder gleich etwa 1,0 M und bevorzugter weniger als oder gleich etwa 0,4 M mikroinjiziert werden. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration zwischen einschließlich 0,05 und 0,20 M. Zusätzlich kann ein extrazellulärer Zucker oder ein herkömmliches Bio-Konservierungsmittel vor der Lagerung zugesetzt werden. Wenn die Zellen in einer hypertonen Lösung vor einer Mikroinjektion inkubiert wurden, kann es dem im Wesentlichen nicht-permeablen gelösten Stoff ermöglicht werden, in den Medien nach einer Mikroinjektion zu verbleiben oder sie können aus den Medien entfernt werden, indem die Zellen mit Medien, die eine geringere Konzentration oder keine dieses gelösten Stoffs enthält, gewaschen werden.
Bestimmte Zucker oder Polysaccharide, die normalerweise nicht die Zellmembranen durchdringen, da sie zu groß sind, um durch die Membran hindurchzugehen, weisen hervorragende physiochemische und biologische Eigenschaften für Gefrierkonservierungszwecke auf. Während diese Zucker normalerweise nicht Zellmembranen selbst durchdringen, können diese normalerweise nicht-durchdringenden Zucker unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens intrazellulär mikroinjiziert werden, um eine vorteilhafte Wirkung hervorzurufen.
Nicht-durchdringende Zucker, die eine stabilisierende oder Konservierungswirkung auf Zellen besitzen und die als Konservierungsmittel in dem vorliegenden Verfahren speziell verwendbar sind, umfassen Saccharose, Trehalose, Fructose, Dextran und Raffinose. Von diesen Zuckern hat sich Trehalose, ein nicht-reduzierendes Disaccharid von Glucose, als außerordentlich wirksam bei der Stabilisierung von Zellstrukturen bei geringen Konzentrationen erwiesen. Trehalose ist der am meisten bevorzugte Zucker zur Verwendung in dem vorliegenden Verfahren. Es besitzt eine außergewöhnliche Fähigkeit, Proteine, Viren und Bakterien zu stabilisieren und zu konservieren und besitzt auch eine ungewöhnliche Fähigkeit, stabile Vergläserungen bei hohen Temperaturen auszubilden. Trehalose besitzt physiochemische Eigenschaften zur Verwendung als ein Oozytenzelle-Gefrierkonservierungsmittel (CPA), die den herkömmlichen Agenzien weit überlegen sind. Des weiteren ist Trehalose, das in vielen Lebensmittelprodukten enthalten ist, relativ ungiftig und kann Gefrierkonservierungsprotokolle ermöglichen, die keine CPA-Entfernung erforderlich machen, was zu einem unauflösbaren Endprodukt führt. Saccharose, die ähnliche Eigenschaften aufweist wie Trehalose und das weit verbreitet verfügbar ist und relativ billig ist, kann auch für bestimmte Anwendungen bevorzugt sein. Es gibt auch Vorteile bei der Verwendung von Dextran, entweder einzeln oder in Kombination mit anderen Zuckern wie Trehalose oder Saccharose. Dextran hat eine sehr hohe Glasübergangstemperatur (Tg'), besitzt aber nicht die Vorteile, die bei Saccharose oder Trehalose vorhanden sind, wie die Fähigkeit, biologische Bestandteile zu stabilisieren. Daher kann ein Dextra-Trehalose-Gemisch oder ein Dextran-Saccharose-Gemisch zusätzliche Vorteile besitzen.
Der Zusatz von extrazellulären Glykolipiden oder Glykoproteinen kann auch die Zellmembran stabilisieren. Ohne die Erfindung auf eine bestimmte Theorie zu beschränken, besteht eine Hypothese darin, dass die Zuckergruppen in Glykolipiden mit den hydrophilen Kopfgruppen der Membran-Phospholipide über eine Wasserstoffbindung gebunden sind, was die Membran gegenüber gefrierinduziertem Stress stabilisiert. Zusätzlich ist es möglich, dass die Glykolipide in die Lipid-Doppelschicht eingeführt werden können und die Integrität der Membran erhöhen.
Nach der Mikroinjektion des Konservierungsmittels werden die Zellen zur Lagerung präpariert 40. Eine Vielzahl von Verfahren zum Gefrieren und/oder Trocknen können eingesetzt werden, um die Zellen zur Lagerung zu präparieren.
Insbesondere sind hier drei Ansätze beschrieben: Vakuum- oder Lufttrocknung 50-, Gefriertrocknung 60- und Gefrier-/Auftau- 70-Protokolle.
Trocknungsprozesse haben den Vorteil, dass das stabilisierte biologische Material transportiert und bei Raumtemperaturen gelagert werden kann.
6 zeigt ein Phasendiagramm eines konventionellen penetrierenden Gefrierschutzmittels (DMSO) gegenüber einem herkömmlichen Zucker (Trehalose). Typischerweise werden Oozyten mit 1 bis 2 M DMSO beladen und bei einer sehr niedrigen Abkühlrate (0,3 bis 0,5°C/min) auf eine Zwischentemperatur (–60 bis –80°C) abgekühlt, bevor sie zur Lagerung in flüssigen Stickstoff eingetaucht werden. Als Ergebnis der langsamen Abkühlrate haben die Oozyten genügend Zeit zum Dehydrieren und der Equilibrierungsschmelzkurve (Tm) der Gefrierschutzmittellösung (z.B. DMSO) auf einen Temperaturbereich zwischen –30 und –50°C herunter zu folgen. Da die Permeabilität der Plasmamembran gegenüber Wasser exponentiell als eine Funktion der abnehmenden Temperatur bei Temperaturen unterhalb von –50°C abnimmt, wird die zelluläre Dehydrierung für lediglich praktische Zwecke vernachlässigbar. Da die Temperatur weiter auf die Lagerungstemperatur abgesenkt wird, wird die nicht-gefrorene Lösung im Inneren der Oozyten konzentrierter, bis die Temperatur die Tg-Kurve bei dem Punkt Tg' erreicht und die Lösung glasartig wird. Als ein Ergebnis kristallisiert die Fraktion des zellulären Wassers, das in der Zelle verbleibt, während der weiteren Abkühlung auf die Lagerungstemperaturen (typischerweise unterhalb der Glasübergangstemperatur, Tg'). Die Eisbildung im Inneren der Zellen führt vermutlich zu Zelltod, wenn die Fraktion des zellulären Wassers, das in die Eisphase gewechselt hat, eine bestimmte Grenze überschreitet (gewöhnlicherweise 5%). Andererseits ist das Phasendiagramm von Trehalose so, dass die Tm- und Tg-Kurven sich bei einer sehr hohen Unter-Null-Temperatur (etwa –30°C) miteinander kreuzen im Vergleich zu DMSO (etwa –80°C). Als Ergebnis kann man die Oozyte einfrieren und sehr nahe an ihre Glasübergangstemperatur dehydrieren, während die Wasserpermeabilität der Membran noch sehr hoch ist, und kann danach in flüssigen Stickstoff eingetaucht werden, um die Probe zu verglasen. Die Probe kann bei dieser Temperatur dann gelagert werden. Dieser Prozess ermöglicht es den Oozyten, den so genannten "Flaschenhals"-Effekt zu überwinden, der unterhalb von –50°C bei den meisten herkömmlichen penetrierenden Gefrierschutzmitteln beobachtet wird. Die vorteilhaften Ergebnisse können auch erhalten werden, indem extrazelluläre Zucker zusätzlich zu den intrazellulären Zuckern auf die Zelle angewendet werden.
Das suspendierte Material kann dann bei gefrierkonservierenden Temperaturen gelagert werden 90, 100, z.B. indem die Fläschchen in LN₂ für die gewünschte Zeit verbleiben. Vorzugsweise werden die Zellen bei einer Temperatur gelagert, die gleich oder weniger als die Tg' des Gefrierschutzmittels ist, so dass die Zellen in ihrem glasigen Zustand verbleiben. Bevorzugte Lagerungstemperaturen sind mindestens 5, 10, 15, 20, 30 oder 40°C unterhalb der Tg'. Die Zellen werden auch vorzugsweise bei einer relativ konstanten Temperatur während der Lagerung gehalten. Vorzugsweise verändert sich die Lagerungstemperatur um weniger als 20, 10, 5 oder 3°C während der Lagerung. Die suspendierten Zellen können dann aus der Lagerung 110 durch Auftauen 120 in einem 37°C-Wasserbad bei einer gleichmäßigen, sanften Bewegung für 5 Minuten entlassen werden.
Protokolle zum Vakuum- oder Lufttrocknen 50 oder zum Gefriertrocknen 60 von Proteinen sind auf dem Gebiet gut charakterisiert [Franks et al., "Materials Science and the Production of Shelf-Stable Biologicals", BioPharm, Oktober 1991, Seite 39; Shalaev et al., "Changes in the Physical State of Model Mixtures during Freezing and Drying: Impact on Product Quality", Cryobiol. 33, 14–26 (1996)] und solche Protokolle können verwendet werden, um Zellsuspensionen für eine Lagerung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herzustellen. Neben der Lufttrocknung können andere konvektive Verfahren verwendet werden, um Wasser aus den Zellsuspensionen zu entfernen, einschließlich des Konvektionsflusses von Stickstoff oder anderen Gasen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Gas, das für eine konvektive Trocknung verwendet wird, keinen Sauerstoff, der für bestimmte Zellen schädlich sein könnte.
Ein beispielhaftes Protokoll zur evaporativen Vakuumtrocknung 130, das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendbar ist, kann die Platzierung von jeweils 20 μl in Vertiefungen auf Platten mit 12 Vertiefungen und die Vakuumtrocknung für 2 Stunden bei Raumtemperatur einschließen. Natürlich können auch andere Trocknungsverfahren verwendet werden, einschließlich der Trocknung von Zellen in Fläschchen. Zellen, die auf diese Art hergestellt werden, können trocken gelagert werden 140 und rehydriert werden 160, indem sie in DMEM oder einem anderen geeigneten Medium verdünnt werden.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren, das die Gefriertrocknung 60 zur Präparation der Zellen für die Lagerung 40 präpariert, beginnt mit dem Gefrieren 80 der Zellsuspension. Während zum Stand der Technik gehörende Gefrierverfahren verwendet werden können, kann das hier beschriebene einfache Eintauch-Gefrierverfahren als das Gefrier-/Auftauverfahren für den Gefrierschritt 80 in dem Gefriertrocknungsprotokoll verwendet werden.
Nach dem Gefrieren wird ein zweistufiger Trocknungsprozess 150 durchgeführt. Auf der ersten Stufe wird Sublimationsenergie zugeführt, um gefrorenes Wasser zu verdampfen. Bei der Gefriertrocknung von Zellen besteht das primäre Kriterium zur Selektion der Temperatur der primären Trocknungsphase darin, dass sie unterhalb der Glasphasen-Übergangstemperatur der gefrierkonzentrierten Lösung ist, um einen Zerfall und unerwünschte chemische Reaktionen zu vermeiden. Im Allgemeinen sollte die höchst mögliche Temperatur, die der Probe keinen Schaden zufügen wird, verwendet werden, so dass die Sublimation schnell stattfindet. Typischerweise findet die primäre Trocknung bei einer konstanten Temperatur statt, die unterhalb der Glasübergangstemperatur für die gefrierkonzentrierte Lösung gehalten wird.
Eine sekundäre Trocknung wird durchgeführt, nachdem das reine kristalline Eis in der Probe sublimiert worden ist. Die sekundäre Trocknung kann nicht stattfinden, bis die Temperatur oberhalb der Glasphasen-Übergangstemperatur des gefrierkonzentrierten gelösten Stoffes ist, jedoch ist es kritisch, dass die Probentemperatur nicht oberhalb der Zerfalltemperatur ansteigt, von der angenommen wird, dass sie zu einem mechanischen Zerfall des Probenkörpers aufgrund des viskosen Flusses führt.
Gefriergetrocknete Zellen können auf dieselbe Art und Weise, wie vorstehend bei der Vakuumtrocknung beschrieben, gelagert 140 und hydriert 160 werden. Lebensfähige Zellen können dann gewonnen werden.
Nach der Gewinnung von Zellen aus einem gefrorenen oder getrockneten Zustand kann jede externe Gefrierkonservierung aus den Kulturmedien gegebenenfalls beseitigt werden. Zum Beispiel können die Medien durch den Zusatz der entsprechenden Medien mit einer geringeren Konzentration an Gefrierkonservierungsmittel verdünnt werden. Zum Beispiel können die gewonnenen Zellen für etwa 5 Minuten in den Medien, die eine geringere Zuckerkonzentration als die der Zelllagerung enthalten, inkubiert werden. Für diese Inkubation können die Medien denselben Zucker enthalten, der als das Gefrierkonservierungsagens verwendet worden ist; ein anderes Gefrierkonservierungsagens wie Galactose oder eine beliebige andere, im Wesentlichen nicht-permeable gelöste Substanz. Um einen osmotischen Schock, der durch den Abfall der Osmolarität der Medien induziert worden ist, zu minimieren, kann die Konzentration des extrazellulären Gefrierkonservierungsmittels langsam erniedrigt werden, indem dieser Verdünnungsschritt mehrere Male durchgeführt wird, jedes Mal mit einer geringeren Konzentration des Gefrierkonservierungsmittels (2). Diese Verdünnungsschritte können solange wiederholt werden, bis kein extrazelluläres Gefrierkonservierungsmittel vorliegt oder bis die Konzentration des Gefrierkonservierungsmittels oder die Osmolarität der Medien auf einen gewünschten Spiegel abgesenkt worden ist.
Bei Zellen, die sich relativ schnell teilen, wie Fibroblasten, sinkt die interne Zuckerkonzentration schnell, da der Zucker zwischen den Mutter- und Tochterzellen aufgeteilt wird. Daher kann die interne Osmolarität der Zellen auf. einen Spiegel abfallen, der nahe dem eines herkömmlichen isotonischen Mediums liegt, was es den gewonnenen Zellen ermöglicht, in eine m isotonen Medium kultiviert zu werden, ohne einem signifikanten Anschwellen oder Nebenwirkungen, die durch einen Unterschied zwischen der internen und externen Osmolarität der Zellen verursacht werden.
Zur Kultivierung von gewonnenen Zellen, die sich nicht teilen oder die sich langsam teilen, wie Oozyten, kann die Verwendung eines hypertonen Mediums das Anschwellen der Zellen verhindern oder reduzieren, das andererseits vorkommen würde, wenn sie in ein isotones Medium zurückgeführt werden würden. Daher wurde ein hypertones Medium zur Kultivierung von bestimmten gewonnenen Zellen entwickelt unter Verwendung eines Zwei-Stufen-Ansatzes. Als erstes wurde ein Standard-Kulturmedium, das als HTF (humanes tubuläres Flüssigmedium) bezeichnet wird, modifiziert, um die Elektrolytkonzentration zu minimieren (siehe 7, Bestandteile sind mit Pfeilen nach unten markiert) und um andere Nährstoffe und Aminosäuren zu erhöhen (siehe 7, Bestandteile sind mit Pfeilen nach oben markiert). Die Osmolarität dieses Mediums wurde unter Verwendung eines Osmometers bestimmt. Da die Osmolarität dieses Mediums etwa 285 mosm betrug, was nahe der normalen internen Osmolarität der Zellen ist, wurde dieses Medium als modifiziertes, isotonisches HTF bezeichnet. Als zweites wurde der Wassergehalt des Mediums reduziert, um in gleicher Weise die Konzentrationen von jedem Bestandteil zu erhöhen, um eine Endosmolarität von 320 mosm zu erreichen. Dieses Medium wurde als modifiziertes, hypertones HTF bezeichnet (siehe 7, letzte Spalte).
Um die Fähigkeit der modifizierten isotonen und hypertonen HTF-Medien, die Befruchtung und Entwicklung von Oozyten zu unterstützen, wurden diese Medien verwendet, um frische Maus-Metaphasen II-Oozyten, die noch nicht gefrierkonserviert worden sind, zu kultivieren. Wie in 8 veranschaulicht, hatten Kontroll-Maus-Oozyten ohne intrazelluläre Trehalose, die entweder in modifiziertem, isotonem HTF oder modifiziertem, hypertonem HTF-Medium kultiviert wurden, eine hohe Befruchtungshäufigkeit (90%) und entwickelten sich bis zum Blastozysten-Stadium (über 85%). Maus-Oozyten, die mit 0,07 M Trehalose injiziert worden sind, zeigten auch eine hohe Befruchtungshäufigkeit und Blastozysten-Entwicklung in modifiziertem, hypertonem HTF-Medium. Bei einer intrazellulären Trehalose von 0,15 M waren die Befruchtungshäufigkeiten und die Blastozystenbildung reduziert, aber noch immer signifikant. Wenn erwünscht, können die Zusammensetzung und die Hypertonizität des Kulturmediums weiter optimiert werden, um die Anzahl der Blastozysten oder der lebenden, sich gebildeten Nachkommen zu erhöhen. Zum Beispiel entspricht ein Kulturmedium mit einer höheren Osmolarität (wie 330, 340, 350, 360, 370 oder 380 mosm) eher einer oviduktalen Flüssigkeit (die eine Osmolarität von mindestens 360 mosm besitzen kann) und kann daher die Entwicklung eines lebensfähigen Nachkommens weiter entwickeln (Van Winkle et al., J. Expt. Zool. 253:215–219, 1990). Ein anderes geeignetes hypertones Medium mit einer Osmolarität von mindestens 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 oder mehr mosm kann in bevorzugten Verfahren zur Kultivierung von Zellen in vitro verwendet werden. Diese Verfahren können verwendet werden, um Zellen mit oder ohne intrazellulären Zucker zu kultivieren. Diese bevorzugten Medien können auch vor, während oder nach einer Lagerung von gefrierkonservierten Zellen verwendet werden.
Die 9A und 9B sind ein Satz Graphen, die das Überleben von gekühlten Metaphase II-Maus-Oozyten nach einer Übernacht-Kultur in modifizierten, hypertonen HTF-Medien als eine Funktion der extrazellulären Trehalosekonzentration bei –15 bzw. –30°C zeigt. Diese Experimente wurden unter Verwendung einer Abkühlrate von 1°C/min mit oder ohne etwa 0,10 bis 0,15 M intrazellulärer Trehalose durchgeführt. Die Zelllebensfähigkeit wurde bestimmt, indem der hier beschriebene Lebend-/Tot-Assay verwendet wurde. Zusätzlich wurde Lichtmikroskopie verwendet, um visuell zu bestimmen, ob die lebenden Oozyten eine intakte Membran besaßen und Anzeichen einer Degenerierung und Fragmentierung fehlten. Sowohl bei –15 als auch bei –30°C erhöhte der Zusatz von etwa 0,10 bis 0,15 M Trehalose im Inneren der Oozyten dramatisch die Überlebensrate. Weiterhin führte bei –30°C das Fehlen von interner Trehalose zu ein paar lebensfähigen Oozyten nach dem Gefrieren. Die Menge an extrazellulärer Trehalose hatte eine dramatische, dosenabhängige Wirkung auf das Überleben. Da die extrazelluläre Trehalosemenge in der Gefrierlösung von 0,15 M (etwa dieselbe Menge wie die intrazelluläre Trehalose) auf 0,30 M oder 0,50 M erhöht wurde, verbesserte sich die Überlebensrate von etwa 18 bis 55 bzw. 85%. Dieses Ergebnis zeigt den Vorteil der Verwendung sowohl von internen als auch von externen Gefrierkonservierungsmitteln während des Abkühlens von Zellen.
10 zeigt das Überleben von gekühlten Metaphase II-Maus-Oozyten nach einer Übernacht-Kultur in modifizierten isotonen HTF-Medien. 11 zeigt das Überleben von gekühlten humanen Oozyten nach einer Übernacht-Kultur in HTF-Medien plus 0,1 M extrazellulärer Trehalose. Das Zellüberleben wurde unter Verwendung des Lebend-/Tot-Assays gemessen. Lichtmikroskopie wurde auch verwendet, um visuell zu bestimmen, ob die lebensfähigen Oozyten eine intakte Membran aufwiesen und Anzeichen einer Degenerierung und Fragmentierung fehlten. Die in Klammern markierte Tg' in 10 und 11 zeigt mögliche langfristige Lagerungstemperaturen, wenn Trehalose sowohl intra- als auch extrazellulär vorhanden ist. In 10 wurden Oozyten mit einer sehr niedrigen Abkühlrate bis auf eine Zwischentemperatur (–60°C) abgekühlt. Die Oozyten ohne Trehalose ergaben eine Überlebensrate von 0%. Oozyten, die mit 0,50 M extrazellulärer Trehalose geladen waren, erfuhren etwas Verbesserung im Vergleich zur Kontrolle, aber erlitten einen gleichmäßigen Abfall bei der Überlebensrate, als die Temperatur absank. Die Oozyten, die mit 0,15 M intrazellulärer und 0,50 M extrazellulärer Trehalose beladen waren, hielten andererseits eine Überlebensrate zwischen 80 und 100% aufrecht. Im Vergleich zur Kontrolle und mit den Oozyten in einer extrazellulären Trehaloselösung erfuhren Oozyten, die intrazelluläre Trehalose enthalten, einen signifikanten Anstieg bei der Überlebensrate.
12A ist ein Graph mit mehreren Kurven, die den Wassergehalt von Maus-Oozyten als eine Funktion der Temperatur bei verschiedenen Abkühlraten, basierend auf den nachstehenden wohl etablierten Gleichungen für die Rate des Wassertransports während des Gefrierens, veranschaulicht (Karlsson et al., Human Reproduction 11:1296–1305, 1996; Toner et al., J. of Membrane Biology 115:261–272, 1990).
worin R die Gaskonstante ist; T die Temperatur ist; B die Abkühlrate ist; v_w das partielle molare Volumen von Wasser und a_w ^ex und a_w ⁱⁿ die Wasseraktivitäten in den externen bzw. intrazellulären Lösungen sind. Lp bezeichnet die Wasserpermeabilität, gegeben durch
worin Lpg die Referenz-Wasserpermeabilität bei T_R ist; ELp die Aktivierungsenergie oder die Temperaturabhängigkeit der Wasserpermeabilität ist und T_R die Referenztemperatur ist (typischerweise 0°C).
Wie in diesen Kurven veranschaulicht, hängt das Ausmaß der Dehydration von Oozyten von der Abkühlrate ab. Zum Beispiel können sehr langsame Abkühlraten eine sehr starke Dehydration von Oozyten bewirken. Alternativ können sehr langsame Abkühlraten (z.B. 30 oder 60°C/min) eine minimale Dehydration bewirken. Daher sind mittlere Abkühlraten wie solche zwischen 0,1 und 5°C/min bevorzugt. Bei diesen Raten sagt das Wassertransportmodell voraus, dass das intrazelluläre Wasservolumen anfangs abnehmen wird und dann in asymptotischer Weise einen konstanten Wert erreichen wird. Wie in dieser Figur veranschaulicht, ist die Wasserpermeabilität eine exponentielle Funktion der Temperatur mit einer Aktivierungsenergy, ELp von 14,5 kcal/mol für Maus-Oozyten. Daher fällt Lp stark ab und erreicht beinahe einen Wert von 0 bei Temperaturen unterhalb von –50°C/min, wenn die Temperatur während des Gefrierens abgesenkt wird. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen der Temperaturabhängigkeit von Lp (d.h. dem Wert von ELp) für Maus-Oozyten und Oozyten aus anderen Säugetieren wie Ratten, Rindern und Menschen wird ein ähnliches Dehydrierungsverhalten für andere Oozyten erwartet. Zum Beispiel beträgt ELp 14,70 kcal/mol bei menschlichen Oozyten im Vergleich zu 14,5 kcal/mol bei Maus-Oozyten (Paynter et al., Human Reproduction 14:2338–2342, 1999).
12B ist ein Diagramm, das die berechnete Dehydrationszeit veranschaulicht, die notwendig ist, dass sich das Volumen einer Oozyte um 50% bei einer gegebenen Temperatur verringert. Dieses Diagramm wurde erzeugt unter Verwendung der vorstehend aufgeführten Wassertransportgleichung und zeigt klar, dass der Wassertransport bei niedrigen Temperaturen signifikant verringert ist, speziell bei Temperaturen unterhalb von –50°C. Daher werden die Zellen vorzugsweise unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren auf eine Endtemperatur von mindestens –50, –40, –40, –20 oder –10°C abgekühlt, um eine weitere Dehydration bei einer signifikanten Rate zu ermöglichen. Am Ende der Dehydration können die Zellen bei dieser Temperatur oder bei einer geringeren Temperatur gelagert werden, um die Zellen in einem glasartigen Zustand zu halten, bis sie benötigt werden.
13 ist ein Diagramm mit einem Kurvensatz, der den Prozentsatz von Oozyten mit intrazellulärem Eis bei verschiedenen Temperaturen zeigt. Bei diesem Assay wurden Standard-Kryomikroskopverfahren verwendet, um die Oozyten mit einer Rate von 3,5°C/min abzukühlen (Cosman et al., Cryo-Letters 10:17–38, 1989). Die Oozyten wurden unter Verwendung eines Kryomikroskops untersucht, um zu bestimmen, ob sich intrazelluläres Eis gebildet hatte. Die Gegenwart von intrazellulärem Eis wurde leicht nachgewiesen, basierend auf der schwarzen Farbe, die auftrat, wenn das Licht von den Eiskristallen gestreut wurde. Dieser Assay wurde verwendet, um Kontroll-Oozyten, die in isotonen Medien alleine inkubiert worden sind, Oozyten, die in Medien mit 0,1 M extrazellulärer Trehalose und Oozyten, die mit 0,1 M Trehalose injiziert wurden und in Medien mit 0,1 M extrazellulärer Trehalose inkubiert worden sind, zu testen. Wie in 13 veranschaulicht, verringerte extrazelluläre Trehalose das Auftreten von intrazellulärer Eisbildung in Oozyten. Die Häufigkeit von intrazellulärem Eis wurde weiter durch die Anwesenheit von intrazellulärer Trehalose zusätzlich zu der extrazellulären Trehalose verringert. Wenn erwünscht, kann die Menge an intrazellulärem Eis weiter verringert werden, indem die Konzentration des intrazellulären oder des verwendeten extrazellulären Zuckers erhöht wird. Die Fähigkeit von Trehalose, internes Eis signifikant zu verringern, ermöglicht schnellere Abkühlraten. Auf dem Gebiet der Kryobiologie steht fest, dass je schneller die Abkühlrate ohne Bildung von letalem intrazellulärem Eis ist, desto größer ist die Chance des Zellüberlebens.
14 ist eine Tabelle, die Zucker mit einer Glasübergangstemperatur von mehr als –55°C aufführt. Wie in dieser Tabelle veranschaulicht, tendieren Zucker mit höheren Molekulargewichten dazu, höhere Glasübergangstemperaturen zu haben. Lineare Polymere tendieren auch dazu, höhere Glasübergangstemperaturen zu haben als verzweigte Polymere mit demselben Molekulargewicht. Ein Vergleich zwischen linearen und zyklischen α-(1→4)-verbundenen Glucosehexameren zeigte, dass ein zyklisches Oligomer (Cyclodextrin, Tg' = –9°C) eine höhere Glasübergangstemperatur aufwies als ein lineares Oligomer (Maltohexaose, Tg' = –14,5°C) (Levine und Slade, supra).
Eine Kurve von Tg' als eine Funktion des Molekulargewichts für einige Zucker und herkömmliche Gefrierschutzmittel ist in 15 gezeigt. In einer umfassenderen Zeichnung in Levine und Slade (supra) ergab die monotonische Beziehung zwischen einem steigenden Tg' und dem Molekulargewicht für 84 kleine Zucker eine lineare Korrelation von r = –0,93. Daher ist bei Zuckern mit einem Molekulargewicht von mindestens 120 Dalton deren Tg' mindestens –50°C.

Claims

Verfahren zur Behandlung einer lebenden Zelle, umfassend die Schritte: (a) Mikroinjektion eines schützenden Agens in das Zytoplasma der Zelle, wobei das schützende Agens (i) einen Zucker umfasst, (ii) im Hinblick auf Säuger-Zellmembranen diese im wesentlichen nicht durchdringt und (iii) die Lebensfähigkeit der Zelle aufrechterhält, so dass die Zelle in einem vorübergehenden Ruhezustand gelagert werden kann und im wesentlichen wieder in einen aktiven Zustand versetzt werden kann; (b) Behandlung der Zelle, um den Eintritt in den Ruhezustand auszulösen; und (c) Lagerung der Zelle im Ruhezustand.
Verfahren gemäß Anspruch 1, weiter umfassend den Schritt (d) der Behandlung der Zelle, um die Zelle wieder in einen aktiven Zustand zu versetzen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zelle eine Säugerzelle ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Zelle eine Oozyte, Epithelzelle, Neuralzelle, epidermale Zelle, Keratinozyte, hämatopoietische Zelle, Melanozyte, Chondrozyte, B-Zelle, T-Zelle, Erythrozyte, Makrophage, Monozyte, Fibroblast, Muskelzelle, embryonale Stammzelle oder adulte Stammzelle ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, weiter umfassend das In-Kontaktbringen der Zelle mit einem extrazellullären schützenden Agens, das im Hinblick auf Säuger-Zellmembranen diese im wesentlichen nicht durchdringt und das die Zellmembran der Zelle stabilisiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das schützende Agens wenigstens einen Zucker umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sukrose, Trehalose, Fruktose, Dextran, Raffinose, Glukose, Sorbitol, Mannitol, Laktose, Maltose und Stachyose.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das schützende Agens wenigstens einen Zucker mit einer Glasübergangstemperatur höher als –50°C umfasst, oder wobei das schützende Agens ein Glykolipid oder ein Glykoprotein umfasst, das wenigstens einen Zuckerrest umfasst, abgeleitet von einem Zucker mit einer Glasübergangstemperatur höher als –50°C.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das schützende Agens wenigstens einen Zucker umfasst mit einem Molekulargewicht größer als 120 Dalton.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das schützende Agens wenigstens einen Zucker mit einer Glassübergangstemperatur höher als –30°C und einem Molekulargewicht größer als 120 Dalton umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die cytoplasmatische Konzentration dieses Zuckers weniger als etwa 1,0 M oder etwa 1,0 M beträgt nach Schritt (a) und vor Schritt (b).
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die cytoplasmatische Konzentration dieses Zuckers weniger als etwa 0,2 M oder etwa 0,2 M beträgt nach Schritt (a) und vor Schritt (b).
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das extrazelluläre schützende Agens einen extrazellulären Zucker umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Zelle in einem flüssigen Medium kultiviert wird, und wobei die extrazelluläre Konzentration des extrazellulären Zuckers nach Verdünnung in diesem flüssigen Medium weniger als etwa 1,0 M oder etwa 1,0 M beträgt, oder wobei die Zelle in einem festen Medium kultiviert wird und wobei die Konzentration des extrazellulären Zucker weniger als etwa 1,0 M oder etwa 1,0 M nach Verabreichung an die Zelle beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Schritt (b) das Einfrieren der Zelle auf eine kryogene Temperatur umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Zelle durch Eintauchen eingefroren wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Zelle in Schritten von zwischen 0,3 und 6°C pro Minute auf eine endgültige Temperatur von wenigstens –50°C abgekühlt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Zelle in Schritten von zwischen 0,3 und 3°C pro Minute auf eine endgültige Temperatur zwischen –50°C und –10°C abgekühlt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei Schritt (d) das Auftauen der Zelle umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Schritt (b) die Trocknung der Zelle bis zu einem Ausmaß umfasst, das die trockene Lagerung ermöglicht.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei Schritt (b) die Gefriertrocknung der Zelle umfasst, oder wobei Schritt (b) die Vakuum- oder konvektive Trocknung der Zelle umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei Schritt (d) die Rehydrierung der Zelle umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei nur das schützende Agens verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei vor Schritt (a) die Zelle in einem hypertonen Medium kultiviert wird, das eine Osmolarität von größer als 300 mosm aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei nach Schritt (d) die Zelle in einem hypertonen Medium kultiviert wird, das eine Osmolarität von größer als 300 mosm aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei ein penetrierendes Kryo-Schutzgemisch zu dem konservierenden Agens zugegeben wird.