DE60031442T2

DE60031442T2 - Intravaskuläre nukleinsäurezuführung

Info

Publication number: DE60031442T2
Application number: DE60031442T
Authority: DE
Inventors: A. Jon Madison WOLFF
Original assignee: Mirus Bio Corp
Current assignee: Arrowhead Madison Inc
Priority date: 1999-11-05
Filing date: 2000-11-06
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2020-11-07
Also published as: PT1246649E; ATE342736T1; WO2001032223A1; DE60031442D1; EP1246649A1; US7396821B1; ES2269199T3; EP1246649B1; EP1246649A4

Description

Gebiet
Die Erfindung bezieht sich auf Verbindungen und Verfahren zur Verwendung in biologischen Systemen. Genauer werden Verfahren bereitgestellt, die Nukleinsäuren in Zellen überführen. Nukleinsäuren in Form nackter DNA oder eine mit einer anderen Verbindung kombinierte Nukleinsäure wird Zellen zugeführt.
Hintergrund
Biotechnologie schließt die Zuführung einer genetischen Information zu einer Zelle unter Exprimieren einer exogenen Nukleotidsequenz, Hemmen, Ausschalten, Verstärken oder Verändern der Expression einer endogenen Nukleotidsequenz oder Exprimieren einer speziellen physiologischen Eigenschaft ein, die nicht von Natur aus mit der Zelle verbunden ist. Polynukleotide können zum Exprimieren eines ganzen oder teilweisen Proteins kodiert sein oder können eine Anti-sense- oder nicht-virale DNA sein oder mit chromosomaler DNA rekombinieren.
Eine grundlegende Herausforderung für die Biotechnologie und damit ihren Teilbereich Gentherapie ist das Entwickeln von Wegen zum Zuführen einer genetischen Information an Zellen eines Patienten auf eine Weise, die leistungsfähig und sicher ist. Dieses Problem der „Wirkstoffzuführung", bei der das genetische Material ein Wirkstoff ist, ist besonders herausfordernd. Falls genetisches Material geeignet zugeführt wird, kann es möglicherweise die Gesundheit eines Patienten verbessern und in einigen Fällen zur Heilung führen. Daher beruht ein grundlegender Schwerpunkt der Gentherapie auf Strategien zum Zuführen genetischen Materials in Form von Nukleinsäuren. Nachdem Zufuhrstrategien entwickelt worden sind, können sie im Handel vertrieben werden, da sie dann zum Entwickeln von Wirkstoffen brauchbar sind.
Die Zuführung einer Nukleinsäure bedeutet das Übertragen einer Nukleinsäure aus einem Behältnis außerhalb eines Säugers in die Nähe oder innerhalb der äußeren Zellmembran einer Zelle in dem Säuger. Der Ausdruck Transfektion wird hierin allgemein als Ersatz für den Ausdruck Zuführung oder genauer die Über tragung einer Nukleinsäure von direkt außerhalb einer Zellmembran in die Zellmembran hinein verstanden. Die übertragene (oder transfizierte) Nukleinsäure kann eine Expressionskassette enthalten. Falls die Nukleinsäure ein primäres RNA-Transkript ist, das zu Messenger-RNA verarbeitet wird, translatiert ein Ribosom die Messenger-RNA zum Herstellen eines Proteins innerhalb des Zytoplasmas. Falls die Nukleinsäure eine DNA ist, dringt sie in den Kern ein, wo sie zu einer Messenger-RNA transkribiert, die in das Zytoplasma transportiert wird, wo sie in ein Protein translatiert wird. Falls daher eine Nukleinsäure ihr kognates Protein exprimiert, muß sie in eine Zelle eingedrungen sein. Ein Protein kann danach zu Peptiden abgebaut werden, die dem Immunsystem präsentiert werden können.
Es wurde zuerst beobachtet, daß die Injektion von Plasmid-DNA in vivo in einen Muskel die Expression von Fremdgenen in dem Muskel ermöglicht (Wolff, J A, Malone, R W, Williams, P. et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo [Direkte Genübertragung in einen Mausmuskel in vivo]. Science 1990; 247: 1465–1468). Seit diesem Bericht haben mehrere andere Untersuchungen die Expressionsfähigkeit eine Fremdgens nach der direkten Injektion von DNA in das Parenchym anderer Gewebe mitgeteilt. Nackte DNA wurde nach ihrer Injektion in den Herzmuskel exprimiert (Ascadi, G., Jiao, S., Jani, A., Duke, D., Williams, P., Chong, W., Wolff, J. A. Direct gene transfer and expression into rat heart in vivo [Direkte Genübertragung und Expression in das Rattenherz in vivo]. The New Biologist 3 (1), 71–78, 1991).
Zusammenfassung
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Zuführen eines Polynukleotids in eine parenchymale Zelle eines Säugers beschrieben, das das Herstellen eines Polynukleotids wie etwa einer Nukleinsäure, anschließend Einbringen des Polynukleotids in ein Gefäß eines Säugers wie etwa ein Blutgefäß und Erhöhen der Permeabilität des Gefäßes und schließlich Zuführen des Polynukleotids zu der parenchymalen Zelle und dadurch Verändern der endogenen Eigenschaften der Zelle umfaßt. Das Erhöhen der Permeabilität des Gefäßes besteht aus dem Erhöhen des Drucks gegen Gefäßwände und/oder Hemmen des Flusses der Gefäßflüssigkeit.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Zuführen eines Polynukleotids in vivo zu einer parenchymalen Zelle eines Säugers beschrieben. Zuerst wird das Polynukleotid in ein Blutgefäß eingebracht. Anschließend wird der innere Blutfluß von außen behindert und die nackte DNA wird der parenchymalen Zelle zugeführt. Das Polynukleotid kann aus nackter DNA, einem Virusteilchen/-vektor oder einem nicht-viralen Vektor bestehen oder kann ein blockierendes Polynukleotid zum Verhindern einer Genexpression sein. Die parenchymale Zelle kann aus einer Muskelzelle wie etwa einer Gliedmaßenzelle (Bein oder Arm) bestehen.
Das Verfahren schließt das Behindern des Blutflusses von außen durch das äußerliche Anwenden von Druck auf innere Blutgefäße wie etwa das Zusammendrücken der Säugerhaut durch Anlegen eines Tourniquets über der Haut ein. Das Zusammenpressen der Säugerhaut schließt auch das Anlegen einer Manschette wie etwa einer Blutdruckmanschette über der Haut ein.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht ein Verfahren zum Zuführen eines Polynukleotids in vivo zu einer Säugerzelle aus dem Einführen des Polynukleotids in ein Blutgefäß und Anwenden von Druck auf das Blutgefäß. Der Druck wird äußerlich auf die Säugerhaut angewandt und das Polynukleotid wird der Säugerzelle zugeführt. Es ist jedoch wichtig, daß beim Anwenden dieses Verfahren die vollständige Funktion der Säugergliedmaßen im Anschluß an die Zuführung erhalten wird. Das Verfahren besteht insbesondere aus einem Polynukleotid, das nicht-vaskulären (keine der ein Gefäß umgebenden Glattmuskelzellen) parenchymalen Zellen zugeführt wird.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform wird eine Vorrichtung zum Anwenden von Druck auf Säugerhaut zum Zuführen in vivo eines Polynukleotids zu einer Säugerzelle beschrieben. Die Vorrichtung besteht aus einer in dieser Beschreibung definierten Manschette, die zum Behindern des Blutflusses auf der Säugerhaut angebracht ist, wodurch der Wirkungsgrad der Zuführung des Polynukleotids an die Säugerzelle erhöht wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann es bevorzugt sein, den die Nukleinsäure erhaltenden Wirt einer Immunsuppression zu unterziehen. Die Immunsup pression kann langzeitig oder über eine kurze Dauer, vorzugsweise ungefähr die Zeit der Nukleinsäurezuführung sein. Dies kann durch Behandlung mit (Kombinationen von) immunsuppressiven Wirkstoffen wie Cyclosporin A, ProGraf (FK506), Kortikosteroiden, Deoxyspergualin und Dexamethason bewerkstelligt werden. Andere Verfahren schließen das Blockieren von Wegen zur Immunzellenaktivierung zum Beispiel durch Behandlung mit (oder Expression von) einem gegen CTLA4 gerichteten Antikörper, Umlenkung aktivierter Immunzellen durch Behandlung mit (oder Expression von) Chemokinen wie etwa MIP-1a, MCP-1 und RANTES und Behandlung mit Immunotoxinen wie etwa einem Konjugat zwischen Anti-CD3-Antikörper und Diphtherietoxin ein.
Weitere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden genauen Beschreibung mit den begleitenden Zeichnungen zusammengenommen deutlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Mikrophotographien histochemisch zur β-Galactosidaseexpression angefärbter Muskelschnitte. Tafel A stellt einen Muskel (Pronator teres) mit einem hohen Expressionswert dar; Tafel B stellt einen Muskel (Abductor pollicis longus) mit einem durchschnittlichen Expressionswert dar; Vergrößerung: 160×.
2. Expression von β-Galactosidase (hellgrau) und GFP (weiß) im Rattenmuskel, dem zu unterschiedlichen Zeitpunkten die entsprechenden Expressions-pDNAs intraarteriell injiziert wurden. Tafel A (640× Vergrößerung) ist ein leistungsschwaches Gebiet, das veranschaulicht, daß die Expression von β-Galactosidase GFP typischerweise nicht örtlich zusammenfiel. Tafel B und C sind leistungsstarke Gebiete (1600× Vergrößerung), die ein Beispiel eines örtlichen Zusammenfallens (B) und getrennten Expression (C) zeigen.
3. Muskelschnitte, die 5 min (A und B) und 1 h (C) nachdem 50 μg Rh-pDNA in 10 ml normaler Kochsalzlösung innerhalb 7 sec in die Oberschenkelarterie einer Ratte ohne Behindern des Abflusses (A) oder Behindern des Abflusses (B) und (C) injiziert worden waren, erhalten wurden. Die Pfeile zeigen Rh-pDNA zwischen Zellen an und die Pfeilspitzen zeigen pDNA innerhalb von Muskelfasern an. Vergrößerung: 1260×.
Genaue Beschreibung
Wir haben gefunden, daß ein intravaskulärer Verabreichungsweg das Zuführen eines Polynukleotids zu einer parenchymalen Zelle in einer gleichmäßigeren Verteilung als direkte parenchymale Injektionen gestattet. Der Wirkungsgrad der Polynukleotidzuführung und -expression wird durch Erhöhen der Permeabilität des Blutgefäßes des Gewebes erhöht. Die Permeabilität wird durch eines oder mehrere aus Folgendem erhöht: Erhöhen des intravaskulären hydrostatischen (physikalischen) Drucks, rasches Zuführen der Injektionsflüssigkeit (rasches Injizieren der Injektionsflüssigkeit), Verwenden eines großen Injektionsvolumens, Hemmen des Fließens der Gefäßflüssigkeit und Erhöhen der Permeabilität der Gefäßwand. Vor dem Einbringen, im Anschluß an das Einbringen oder gleichzeitig mit dem Einbringen wird die Permeabilität des Gefäßes mittels einer äußeren Manschette erhöht, wodurch das genetische Material der parenchymalen Zelle zugeführt wird.
Wir beschreiben ein Verfahren zum Einführen eines Polynukleotids in eine Säugerzelle. Genauer wurde in die Gliedmaßen eines Rhesusaffen injiziert und bewirkt, daß das Polynukleotid zugeführt und exprimiert wurde. Sowohl bei Arm- als auch Beininjektionen wurde der Blutstrom durch eine den Arm oder das Bein umgebende Manschette behindert. Die bei Affen erzielten hohen Luciferase- und β-Galactosidasespiegel zeigen, das das Verfahren wahrscheinlich auch bei Menschen wirkungsvoll ist. Es ist bemerkenswert, daß die Expressionswerte bei Affen denen bei Ratten ähnlich waren, da die Wirksamkeit vieler Genübertragungstechniken des Standes der Technik bei größeren Tieren kleiner ist.
Der Ausdruck Manschette bedeutet eine Vorrichtung zum Behindern des Blutflusses durch innere Blutgefäße eines Säugers: Für die Zwecke der Ansprüche bezieht sich Manschette speziell auf eine Vorrichtung, die außen auf der Säugerhaut angebracht ist und die Haut auf nicht-invasive Weise berührt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Manschette eine Vorrichtung, die äußeren Druck auf die Säugerhaut anwendet und dadurch wird innerlich Druck auf die Blutgefäßwände angewendet. Die Gefäßwände werden dazu gezwungen, sich auf einer Fläche unter der Manschette in einem Ausmaß zusammenzuziehen, das ausreicht, das Blut am Fließen mit normaler Geschwindigkeit zu hindern. Das Behin dern des Blutstroms bewirkt ein Erhöhen des Gefäßdrucks und der Gefäßdurchlässigkeit und seine Bestandteile (einschließlich Polynukleotide) werden aus der Gefäßwand und in den extravaskulären Raum getrieben. Ein Beispiel einer Manschette ist eine Blutdruckmanschette, die normalerweise zum Messen des Drucks verwendet wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieser Beschreibung wird die Blutdruckmanschette zum Anwenden von Druck auf die Säugerhaut um ein Körperglied herum zum Zweck des Erhöhens der Gefäßpermeabilität verwendet. Ein weiteres Beispiel ist ein Tourniquet.
Bei noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Verwendung einer Manschette (oder anderen äußeren Druckvorrichtung) zum Erhöhen der Gefäßpermeabilität mit der Verwendung eines Pharmazeutikums oder biologisch aktiven Mittels (wie etwa Papaverin) kombiniert.
Der Ausdruck intravaskulär bezieht sich auf einen intravaskulären Verabreichungsweg, der das gleichmäßiger als direkte Injektionen verteilte Zuführen eines Polymers, Oligonukleotids oder Polynukleotids an Zellen ermöglicht. Intravaskulär bedeutet hierin innerhalb, einer inneren Röhrenstruktur, die ein Gefäß genannt wird, das mit einem Gewebe oder Organ innerhalb eines Tiers einschließlich Säugern verbunden ist. Innerhalb des Hohlraums der Röhrenstruktur fließt eine Körperflüssigkeit zum oder vom Körperteil. Beispiele einer Körperflüssigkeit schließen Blut, Lymphe oder Galle ein. Beispiele von Gefäßen schließen Arterien, Arteriolen, Kapillaren, Venulen, Sinusoide, Venen, Lymphgefäße und Gallengänge ein. Der intravaskuläre Weg schließt die Zuführung durch die Blutgefäße wie etwa eine Arterie oder eine Vene ein.
Afferente Blutgefäße von Organen sind als Gefäße definiert, in denen das Blut unter normalen physiologischen Bedingungen zu dem Organ oder Gewebe fließt. Efferente Blutgefäße sind als Gefäße definiert, in denen das Blut unter normalen physiologischen Bedingungen von dem Organ oder Gewebe wegfließt. Beim Herz sind afferente Gefäße als Koronararterien bekannt, während efferente Gefäße als Koronarvenen bezeichnet werden.
Der Ausdruck nackte Nukleinsäuren zeigt an, daß die Nukleinsäuren nicht mit einem Transfektionsreagenz oder anderem Zuführungsträger, der zum Zuführen der Nukleinsäure zu einer Zielzelle erforderlich ist, assoziiert sind. Ein Transfektionsreagenz ist eine im Stand der Technik verwendete Verbindung oder Verbindungen, die das Eindringen der Nukleinsäure in Zellen vermittelt.
Außerdem kann eine Nukleinsäure zum Blockieren der Genexpression zugeführt werden. Derartige Nukleinsäuren können durch Verhindern der Translation einer Messenger-RNA anti-sense sein oder können die Genexpression durch Verhindern der Gentranskription blockieren. Das Verhindern der RNA-Translation und/oder DNA-Transkription wird als das Verhindern der Expression oder RNA-Verarbeitung angesehen. Ribozyme können ebenfalls zum Zerstören von Zell-RNA verwendet werden. Die Transkription kann durch Binden der Nukleinsäure als Duplex oder Triplex an das Gen blockiert werden. Sie kann die Expression auch durch Binden an Proteine blockieren, die an einem bestimmten zellulären, biochemischen Vorgang beteiligt sind.
Ein Polynukleotid kann eine Nukleinsäure sein, die mit chromosomaler DNA rekombiniert.
Expressionskassette bezieht sich auf eine natürlich oder rekombinant hergestellte Nukleinsäure, die ein Protein (Proteine) exprimieren kann. Eine DNA-Expressionskassette schließt typischerweise einen „Promotor" (der den Transkriptionsstart erlaubt) und eine Sequenz ein, die ein oder Protein(e) („Transgen(e)") kodiert. Gegebenenfalls kann die Expressionskassette Transkriptionsverstärker, Ortskontrollregionen, Matrixbindungsregionen, Gerüstbindungsregionen, nicht-kodierende Sequenzen, Spleißsignale, Transkriptionsstopsignale und Polyadenylierungssignale einschließen. Eine RNA-Expressionskassette schließt typischerweise ein Translationsstartkodon (das den Translationsstart erlaubt) und eine ein oder mehr Proteine kodierende Sequenz ein. Gegebenenfalls kann die Expressionskassette Translationsstopsignale, eine Polyadenosinsequenz, interne Ribosomeneintrittsstellen (IRES) und nicht-kodierende Sequenzen einschließen.
Der Expressionskassettenpromotor kann aus allen bekannten Promotoren ausgewählt sein, die aus der Gruppe isoliert wurden, die aus dem humanen Genom, Säugergenomen, mikrobiellen Genomen und chimären Sequenzen besteht, aber nicht darauf beschränkt ist. Außerdem können künstlich aufgebaute Sequenzen verwendet werden, von denen gezeigt wurde, daß sie bei dem Zielzellentyp eine Promotoraktivität aufweisen. Beispiele viraler Promotoren, die erfolgreich zum Exprimieren von Transgenen verwendet wurden, schließen den Cytomegalovirus-immediate-early-Promotor, Rous-Sarkomavirus, Moloney-Leukämievirus und SV40 ein. Beispiele von Säugerpromotoren schließen den Elongationsfaktor 1, Muskelkreatinkinase, Aktin, Desmin und Troponin ein. Die Wahl des Promotors zusammen mit anderen Expressionskassettenelementen kann die Höhe der Transgenproteinproduktion in den Zielzellen bestimmen. Die Expressionskassette kann zum bevorzugten Exprimieren bei speziellen Zelltypen ausgelegt sein (funktional als 5fach höherer Expressionswert bei dem speziellen Zelltyp verglichen mit dem durchschnittlichen Expressionswert bei anderen Zelltypen definiert). Ein Promotor oder eine Kombination eines Promotors und anderer Regelelemente in der Expressionskassette, die zu einer bevorzugten Expression spezieller Zelltypen führt, wird häufig als „gewebespezifisch" bezeichnet. Ein Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist der Muskelkreatinkinasepromotor, der Transgene in Skelettmuskelzellen in großer Höhe exprimiert, wogegen die Expression in anderen Zelltypen in geringerer Höhe erfolgt. Eine bevorzugte Expression in Muskelzellen kann durch Verwenden von Promotoren und Regelelementen aus muskelspezifischen Genen (z. B. Muskelkreatinkinase, Myosin-leichte-Kette, Desmin, Skelettaktin) oder durch Kombinieren von Transkriptionsverstärkern aus muskelspezifischen Genen mit einem normalerweise bei vielen Zelltypen aktiven Promotor (z. B. der humane Cytomegalovirus-immediate-early-Promotor in Kombination mit dem Myosin-leichte-Kette-Verstärker) erreicht werden.
Protein bezieht sich hierin auf eine gerade Reihe von mehr als 2 Aminosäureresten, die wie einem Polypeptid miteinander verbunden sind. Eine therapeutische Wirkung des Proteins beim Abschwächen oder Verhindern des Krankheitszustandes kann dadurch bewerkstelligt werden, daß sich das Protein entweder innerhalb der Zelle aufhält, in der Membrane an die Zelle gebunden bleibt oder aus der Zelle ausgeschieden und davon getrennt wird, wo es in den allgemeinen Kreislauf oder das Blut eintreten kann. Ausgeschiedene Proteine, die Therapeutika sein können, schließen Hormone, Zytokine, Interferone, Enzyme (z. B. lysosomale Enzyme), Wachstumsfaktoren, Gerinnungsfaktoren, Anti-Protease-Proteine (z. B. alpha 1-Antitrypsin), angiogene Proteine (z. B. vasculo- endothelialer Wachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktoren), anti-angiogene Proteine (z. B. Endostatin, Angiostatin) und andere Proteine ein, die im Blut vorhanden sind. Proteine auf der Membrane können durch Bereitstellen eines Rezeptors für die Zelle zum Aufnehmen eines Proteins oder Lipoproteins (z. B. Rezeptor für ein Lipoprotein niedriger Dichte) eine therapeutische Wirkung aufweisen. Therapeutische Proteine, die innerhalb der Zelle verbleiben („intrazelluläre Proteine") können Enzyme sein, die einen im Kreislauf befindlichen toxischen Metaboliten wie bei Phenylketonurie beseitigen. Sie können auch eine Krebszelle dazu veranlassen, weniger proliferativ oder kanzerös (d. h. weniger metastasierend) zu sein oder die Replikation eines Virus beeinträchtigen. Intrazelluläre Proteine können Teil des Zytoskeletts sein (z. B. Aktin, Dystrophin, Myosine, Sarcoglykane, Dystroglykane) und weisen damit bei Kadiomyopathien und Skelettmuskelkrankheiten (z. B. Duchenne-Muskeldystrophie, Gliedergürtelkrankheit) eine therapeutische Wirkung auf. Andere therapeutische Proteine von besonderem Interesse zum Behandeln einer Herzkrankheit schließen die Herzkontraktilität (z. B. Calcium- und Natriumkanäle) beeinflussende Polypeptide, Restenosehemmer (z. B. Stickoxidsynthetase), angiogene Faktoren und anti-angiogene Faktoren ein.
Konstrukte zum Verbessern eines muskelexprimierten Proteins in das Blut
Proteine werden durch die Anwesenheit eines Signalpeptids zur Ausscheidung zielgerichtet. Während des Durchgangs durch das endoplasmatische Retikulum wird das Signalpeptid durch eine spezielle proteolytische Spaltung entfernt. Es ist zu erwarten, daß die Ausscheidung gewisser Proteine durch Ersetzen des endogenen Signalpeptids mit einem heterologen Signalpeptid verbessert werden kann. Dies kann durch Austauschen der Kodierungsregionen für die Signalpeptide in der Nukleinsäure bewerkstelligt werden. Zum Beispiel kann das Signal aus dem Protein plazentäre alkalische Phosphatase (oft in verkürzter Form als ausgeschiedene alkalische Phosphatase, SEAP, verwendet) zum Ersetzen des Signals aus dem Proteinfaktor IX verwendet werden. Dies kann zu einem besseren Ausscheiden des Faktor-IX-Proteins aus Muskelzellen verwendet werden. Da das Signalpeptid vor dem Ausscheiden abgespalten wird, ist das ausgeschiedene, reife Faktor-IX-Protein unverändert und funktionsfähig. Wahlweise kann man eine Fusion zwischen der vollständigen SEAP und dem Zielprotein aufbauen oder eine andere definierte Proteinsequenz verwenden, von der wie etwa dem TAT-Protein aus dem humanen Immunschwächevirus oder dem VP22-Protein aus Herpesviren bekannt ist, daß sie den Transmembrantransport verstärken.
Es gibt drei Typen „Reporter-"(oder „Marker-")Genprodukte, die aus Reportergenen exprimiert werden. Die Reportergen-/Proteinsysteme schließen intrazelluläre Genprodukte wie etwa Luciferase, β-Galactosidase oder Chloramphenicol-Acetyltransferase ein. Typischerweise sind sie Enzyme, deren enzymatische Aktivität leicht gemessen werden kann; intrazelluläre Genprodukte wie etwa β-Galactosidase oder grün fluoreszierendes Protein, die das Reportergen exprimierende Zellen identifizieren. Auf der Grundlage der Intensität der Zellanfärbung liefern diese Reportergenprodukte auch eine die Menge des je Zelle produzierten Fremdgens betreffende qualitative Information.
Ausgeschiedene Genprodukte wie etwa Wachstumshormon, Faktor IX, ausgeschiedene alkalische Phosphatase oder alpha 1-Antitrypsin sind zum Bestimmen der Menge eines ausgeschiedenen Proteins, das ein Gentransferverfahren erzeugen kann, nützlich. Das Reportergenprodukt kann in einer kleinen Blutmenge bestimmt werden.
Wir haben eine Genexpression offenbart, die aus Reportergenen in speziellen Geweben erreicht wurde. Die Ausdrücke „therapeutisch" und „therapeutische Ergebnisse" sind in dieser Anmeldung als eine Nukleinsäure definiert, die in vivo in eine Zelle transfiziert wird, was dazu führt, daß ein Genprodukt (z. B. Protein) in der Zelle exprimiert oder aus der Zelle ausgeschieden wird. Die Gehalte eines Genprodukts einschließlich Reporter-(Marker-)Genprodukte werden gemessen, was darauf eine vernünftige Erwartung eines ähnlichen Ausmaßes der Genexpression durch Transfizieren anderer Nukleinsäuren anzeigt. Das Ausmaß einer Behandlung, das von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Gentherapie als nutzbringend erachtet wird, unterscheidet sich von Krankheit zu Krankheit; zum Beispiel werden Hämophilie A und B durch einen Mangel an den X-verknüpften Gerinnungsfaktoren VIII beziehungsweise IX verursacht. Ihr klinischer Verlauf wird durch den Prozentsatz normaler Serumspiegel von Faktor VIII oder IX stark beeinflußt: < 2%: schwer, 2–5%: mäßig und 5–30%: mild. Die zeigt an, daß bei ernsten Patienten eine Zunahme von 1% bis 2% des normalen Spiegels als nutzbringend angesehen werden kann. Höhere Spiegel als 6% verhindern spontane Blutungen, nicht aber die nach einer Operation oder Verletzung. Ein Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Gentherapie würde auf der Grundlage ausreichender Gehalte eines Markergens vernünftigerweise nutzbringende Werte der Expression eines für eine Krankheit spezifischen Gens erwarten. Falls bei dem Beispiel der Hämophilie Markergene unter Liefern eines Proteins in einer Höhe vergleichbar im Volumen mit 2% des normalen Gehalts an Faktor VIII exprimiert werden, kann vernünftigerweise erwartet werden, das das für Faktor VIII kodierende Gen ebenfalls in ähnlicher Höhe exprimiert wird.
Parenchymale Zellen
Parenchymale Zellen sind die unterscheidenden Zellen einer Drüse oder Organs, das in dem Bindegewebegitter enthalten ist und dadurch unterstützt wird. Die parenchymalen Zellen führen typischerweise eine Funktion aus, die für das jeweilige Organ einzigartig ist. Der Ausdruck „parenchymal" schließt oft Zellen aus, die vielen Organen und Geweben gemeinsam sind, wie etwa Fibroblasten und Endotheliumszellen innerhalb von Blutgefäßen.
Im Organ Leber schließen die parenchymalen Zellen Hepatozyten, Kupffer-Zellen und Epitheliumszellen ein, die den Gallentrakt und die Gallenductuli auskleiden. Der Hauptbestandteil des Leberparenchyms sind polygonale Hepatozyten (auch als hepatische Zellen bekannt), die wenigstens eine Seite einem hepatischen Sinusoid und gegenüberliegende Seiten einer Gallenkapillare präsentiert. Leberzellen, die keine parenchymalen Zellen sind, schließen Zellen innerhalb der Blutgefäße wie etwa Endotheliumszellen oder Fibroblastenzellen ein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Hepatozyten durch Injizieren des Polynukleotids in die Schwanzvene eines Nagers wie etwa einer Maus zielgerichtet.
Bei einem striären Muskel schließen die parenchymalen Zellen Myoblasten, Satellitenzellen, Myotubuli und Muskelfasern ein. Beim Herzmuskel schließen die parenchymalen Zellen das als Herzmuskelfasern oder Herzmuskelzellen bekannte Myokard und die Zellen des Impulsverbindungssystems wie etwa die ein, die den Sinusknoten, Atrioventrikularknoten und das atrioventrikuläre Bündel darstellen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein striärer Muskel wie etwa Skelettmuskel oder Herzmuskel durch Injizieren des Polynukleotids in das das Gewe be versorgende Blutgefäß zielgerichtet. Beim Skelettmuskel ist eine Arterie das Zuführungsgefäß, beim Herzmuskel wird eine Arterie oder Vene verwendet.
Polymere
Ein Polymer ist ein Molekül, das durch das wiederholte Aneinanderbinden kleinerer, Monomeren genannter Einheiten aufgebaut ist. Bei dieser Anmeldung schließt der Ausdruck Polymer sowohl Oligomeren, die zwei bis etwa 80 Monomeren aufweisen, als auch Polymeren mit mehr als 80 Monomeren ein. Das Polymer kann vom linearen, verzweigten Netzwerk-, Stern-, Kamm- oder Leitertyp eines Polymers sein. Das Polymer kann ein Homopolymer sein, bei dem ein einziges Monomer verwendet wird oder kann ein Copolymer sein, bei dem zwei oder mehr Monomeren verwendet werden. Copolymertypen schließen die des alternierenden, Random-, Block- und Pfropftyps ein.
Eines von unseren mehreren Verfahren der Nukleinsäurezuführung an Zellen ist die Verwendung von Nukleinsäure-Polykation-Komplexen. Es wurde gezeigt, daß kationische Proteine wie Histone und Protamine oder synthetische Polymeren wie Polylysin, Polyarginin, Polyornithin, DEAE-Dextran, Polybren und Polyethylenimin wirkungsvolle intrazelluläre Zuführungsmittel sind, während kleine Polykationen wie Spermin unwirksam sind.
Ein Polykation ist ein Polymer, das wie zum Beispiel Poly-L-lysin-hydrobromid eine positive Nettoladung enthält. Das Polykation kann Monomereinheiten enthalten, die positiv geladen, ladungsneutral oder negativ geladen sind, die Nettoladung des Polymers muß jedoch positiv sein. Ein Polykation kann auch ein nicht-polymeres Molekül bedeuten, das zwei oder mehr positive Ladungen trägt. Ein Polyanion ist ein Polymer, das wie zum Beispiel Polyglutaminsäure eine negative Nettoladung enthält. Das Polyanion kann Monomereinheiten enthalten, die negativ geladen, ladungsneutral oder positiv geladen sind, die Nettoladung des Polymers muß jedoch negativ sein. Ein Polyanion kann auch ein nicht-polymeres Molekül bedeuten, das zwei oder mehr negative Ladungen trägt. Der Ausdruck Polyanion schließt ein Polykation, Polyanion, zwitterionische Polymeren und neutrale Polymeren ein, die die gleiche Anzahl Anionen und Kationen enthalten. Der Ausdruck zwitterionisch bezieht sich auf das Produkt (Salz) der Reaktion zwischen einer sauren Gruppe und einer basischen Gruppe, die Teil desselben Mole küls sind. Salze sind ionische Verbindungen, die in Kationen und Anionen dissoziieren, wenn sie in einer Lösung gelöst werden. Salze erhöhen die Ionenstärke einer Lösung und verringern folglich Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren mit anderen Kationen.
Bei einer Ausführungsform werden Polykationen mit Polynukleotiden zur intravaskulären Zuführung an Zellen gemischt. Polykationen bieten den Vorteil, das Anhaften von DNA an der Zielzellenoberfläche zu erlauben. Das Polymer bildet eine Querbrücke zwischen den polyanionischen Nukleinsäuren und den polyanionischen Oberflächen der Zellen. Als Ergebnis kann der Hauptmechanismus der DNA-Translozierung in den intrazellulären Raum eine nicht-spezifische, adsorptive Endozytose sein, die wirkungsvoller als eine Flüssigkeitsendozytose oder rezeptorvermittelte Endozytose sein kann. Weiterhin sind Polykationen eine sehr geeignete Verbindungsgruppe für das Anbringen spezifischer Rezeptoren an DNA und als Ergebnis können DNA-Polykation-Komplexe auf spezielle Zelltypen zielgerichtet werden.
Außerdem schützen Polykationen DNA in Komplexen gegen Nukleaseabbau. Dies ist sowohl bei der extra- als auch intrazellulären Konservierung von DNA wichtig. Der endozytische Schritt bei der intrazellulären Aufnahme von DNA-Polykation-Komplexen wird durch Ergebnisse nahegelegt, bei denen die DNA-Expression nur durch Einbeziehen eines Schritts der milden, hypertonen Lysis (entweder Glycerin oder DMSO) erhalten wird. Die Genexpression wird auch durch Verhindern einer Endosomansäuerung mit NH₄Cl oder Chloroquin ermöglicht oder erhöht. Polyethylenimin, das die Genexpression ohne zusätzliche Behandlungen erleichtert, unterbricht wahrscheinlich die endosomale Funktion selbst. Das Unterbrechen der endosomalen Funktion ist auch durch Verknüpfen des Polykations mit endosomal-unterbrechenden Mitteln wie etwa Fusionspeptiden, membranaktiven Verbindungen oder Adenoviren bewerkstelligt worden.
Membranaktive Verbindungen
Viele biologisch aktive Verbindungen, insbesondere große und/oder geladene Verbindungen, sind unfähig zum Durchqueren biologischer Membranen. Damit diese Verbindungen in Zellen eindringen, müssen die Zellen sie entweder durch Endozytose in Endosome aufnehmen oder es muß eine Unterbrechung der Zell membran geben, um der Verbindung das Durchqueren zu erlauben. Im Fall des endosomalen Eindringens muß die endosomale Membran unterbrochen sein, um den Eintritt der Verbindung in das Innere der Zelle zu erlauben. Daher erfordert jedes Eindringen in die Zelle eine Unterbrechung der Zellmembrane. Es gibt membranaktiv genannte Verbindungen, die Membranen unterbrechen. Man kann sich vorstellen, daß falls das membranaktive Mittel eine bestimmte Zeit und an einem bestimmten Ort wirksam ist, es den Transport der biologisch aktiven Verbindung durch die biologische Membran erleichtert. Die Kontrolle, wann und wo die membranaktive Verbindung aktiv ist, ist für einen wirkungsvollen Transport entscheidend. Wenn die membranaktive Verbindung zu aktiv oder zur falschen Zeit aktiv ist, dann erfolgt kein Transport oder der Transport ist mit einem Zellbruch und dadurch Zelltod verbunden. Die Natur hat verschiedene Strategien entwickelt, um einen Membrantransport biologisch aktiver Verbindungen zu erlauben, wobei die Membranfusion und die Verwendung membranaktiver Verbindungen, deren Aktivität so moduliert wird, daß den Transport eine Aktivität ohne Toxizität begleitet, eingeschlossen sind. Viele Transportformulierungen auf Lipidgrundlage beruhen auf einer Membranfusion und die Aktivitäten einiger membranaktiver Peptide werden durch den pH moduliert. Insbesondere sind Virushüllproteine oft pH-empfindlich, bei neutralem oder basischem pH inaktiv und unter den im Endosom vorgefundenen sauren Bedingungen aktiv.
Polykationen bewirken auch eine DNA-Kondensation. Das Volumen, das ein DNA-Molekül in einem Komplex mit Polykationen einnimmt, ist entscheidend niedriger als das Volumen eines freien DNA-Moleküls. Die Größe des DNA/Polymer-Komplexes kann zur Genzuführung in vivo wichtig sein. Als intravenöse Injektion muß die DNA die endotheliale Sperre durchqueren und die interessierenden parenchymalen Zellen erreichen.
Der durchschnittliche Durchmesser der Leberfenestrae (Löcher in der endothelialen Sperre) ist etwa 100 nm und Erhöhungen des Drucks und/oder der Permeabilität können die Größe der Fenestrae erhöhen. Die Größe der Fenestrae ist bei anderen Organen üblicherweise kleiner. Die Größe der DNA-Komplexe ist für den Zellaufnahmevorgang ebenfalls wichtig. Nach dem Binden an die Zielzellen wird erwartet, daß der DNA-Polykationkomplex durch Endozytose aufgenommen wird.
Polymere können Verbindungen einbauen, die ihre Brauchbarkeit erhöhen. Diese Gruppen können vor der Polymerbildung in Monomeren eingebaut werden oder nach seiner Bildung an das Polymer gebunden werden. Das die Genübertragung verstärkende Signal (Signal) ist in dieser Beschreibung als Molekül definiert, das den Nukleinsäurekomplex modifiziert und ihn auf einen Zellort (wie etwa Gewebezellen) oder Ort in einer Zelle (wie etwa den Kern) entweder in Kultur oder in einem gesamten Organismus lenken kann. Durch Modifizieren des Zell- oder Gewebeorts des Fremdgens kann die Expression des Fremdgens verstärkt werden.
Das die Genübertragung verstärkende Signal kann ein Protein, Peptid, Lipid, Steroid, Zucker, Kohlenhydrat, Nukleinsäure oder synthetische Verbindung sein. Die die Genübertragung verstärkenden Signale verstärken die Zellbindung an Rezeptoren, den zytoplasmatischen Transport zum Kern und den Kerneintritt oder die Freisetzung aus Endosomen oder anderen intrazellulären Vesikeln.
Nukleäre Lokalisierungssignale verstärken das Zielrichten des Gens in die Nähe des Kerns und/oder seinen Eintritt in den Kern. Derartige Kerntransportsignale können ein Protein oder ein Peptid wie etwa das SV40-large-T-ag-NLS oder das Nucleoplasmin-NLS sein. Diese Kernlokalisierungssignale treten mit einer Vielfalt Kerntransportfaktoren wie etwa dem NLS-Rezeptor (Karyopherin alpha) in Wechselwirkung, der anschließend mit Karyopherin beta in Wechselwirkung tritt. Die Kerntransportsignale selbst können auch als NLS wirken, da sie auf Kernporen und den Kern zielgerichtet sind.
Signale, die die Freisetzung aus intrazellulären Kompartementen verstärken (Freisetzungssignale), können eine DNA-Freisetzung aus intrazellulären Kompartementen wie etwa Endosomen (early und late), Lysomen, Phagosomen, Vesikeln, endoplasmatischen Retikulum, Golgi-Apparat, Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) und sarkoplasmatischen Retikulum bewirken. Die Freisetzung schließt die Wanderung aus einem intrazellulären Kompartement in das Zytoplasma oder in eine Organelle wie etwa den Kern ein. Freisetzungssignale schließen Chemikalien wie etwa Chloroquin, Bafilomycin oder Brefeldin A1 und das ER-Rückhaltesignal (KDEL-Sequenz), Viruskomponenten wie etwa Influenzavirus-Hämagglutininuntereinheit-HA2-Peptide und andere Typen amphipathischer Peptide ein.
Zellrezeptorsignale sind alle Signale, die die Assoziation des Gens mit einer Zelle verstärken. Dies kann entweder durch Erhöhen der Bindung des Gens an die Zelloberfläche und/oder seine Assoziation mit einem intrazellulären Kompartement, zum Beispiel Liganden, die die Endozytose durch Verstärken der Bindung der Zelloberfläche verstärken, bewerkstelligt werden. Dies schließt Mittel ein, die durch Verwenden von Asialoglykoproteinen oder Galactoseresten auf das Asialoglykoprotein zielgerichtet sind. Andere Proteine wie etwa Insulin, EGF oder Transferrin können zum Zielrichten verwendet werden. Peptide, die die RGD-Sequenz einschließen, können zum Zielrichten auf viele Zellen verwendet werden. Chemische Gruppen, die mit Sulfhydryl- oder Disulfidgruppen auf Zellen reagieren, können ebenfalls zum Zielrichten auf viele Zelltypen verwendet werden. Folat und andere Vitamine können ebenfalls zum Zielrichten verwendet werden. Andere zielgerichtete Gruppen schließen Moleküle ein, die wie etwa Lipide, Fettsäuren, Cholesterin, Dansylverbindungen und Amphotericinderivate mit Membranen in Wechselwirkung treten. Außerdem können Virusproteine zum Binden von Zellen verwendet werden.
Polynukleotide
Der Ausdruck Nukleinsäure ist ein Ausdruck der Technik, der sich auf einen Strang aus wenigstens zwei Base-Zucker-Phosphat-Kombinationen bezieht. (Ein Polynukleotid unterscheidet sich von einem Oligonukleotid durch das Enthalten mehr als 120 monomerer Einheiten.) Nukleotide sind die monomeren Einheiten von Nukleinsäurepolymeren. Der Ausdruck schließt Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA) in Form einer Oligonukleotid-Messenger-RNA, Anti-sense, Plasmid-DNA, Teile einer Plasmid-DNA oder aus einem Virus stammenden genetischen Materials ein. Anti-sense ist ein Oligonukleotid, das die Funktion von DNA und/oder RNA beeinträchtigt. Der Ausdruck Nukleinsäuren bezieht sich auf einen Strang aus wenigstens zwei Base-Zucker-Phosphat-Kombinationen. Natürliche Nukleinsäuren weisen ein Phosphatrückgrat auf, künstliche Nukleinsäuren können andere Rückgrattypen enthalten, enthalten aber dieselben Basen. Nukleotide sind die monomeren Einheiten von Nukleinsäurepolymeren. Der Ausdruck schließt Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA) ein. RNA kann in Form einer tRNA (Transfer-RNA), snRNA (kleine nukleäre RNA), rRNA (ribosomale RNA), mRNA (Messenger-RNA), anti-sense-RNA und Ribozymen vorliegen. DNA kann in Form von Plasmid-DNA, viraler DNA, linearer DNA oder chromosomaler DNA oder Abkömmlingen dieser Gruppen vorliegen. Außerdem können diese DNA- und RNA-Formen einzel-, doppel-, dreifach- oder vierfachsträngig sein. Der Ausdruck schließt auch PNAs (Peptidnukleinsäuren), Phosphorthioate, Phosphordiamidatmorpholino und andere Varianten des Phosphatrückgrats natürlicher Nukleinsäuren ein.
Ein Polynukleotid kann einer Zelle zum Exprimieren einer exogenen Nukleotidsequenz, zum Hemmen, Beseitigen, Erhöhen oder Verändern der Expression einer endogenen Nukleotidsequenz oder zum Exprimieren eines speziellen physiologischen Merkmals, das von Natur aus nicht mit der Zelle verbunden ist, zugeführt werden. Polynukleotide können zum Exprimieren eines ganzen oder teilweisen Proteins kodiert sein oder können anti-sense sein.
Ein zugeführtes Polynukleotid kann innerhalb des Zytoplasmas oder Kerns von dem endogenen genetischen Material getrennt bleiben. Wahlweise kann das Polymer das endogene genetische Material rekombinieren (ein Teil davon werden). Zum Beispiel kann DNA entweder durch homologe oder nicht-homologe Rekombination in chromosomale DNA inseriert werden.
Vektoren sind aus einem Virus, einem Plasmid oder der Zelle eines höheren Organismus stammende Polynukleinmoleküle, in die ein weiteres Nukleinfragment geeigneter Größe integriert werden kann. Vektoren führen typischerweise Fremd-DNA in Wirtszellen ein, wo sie reproduziert werden kann. Beispiele sind Plasmide, Cosmide und künstliche Hefechromosomen. Vektoren sind oft rekombinante Moleküle, die DNA-Sequenzen aus mehreren Quellen enthalten. Ein Vektor schließt einen Virusvektor, zum Beispiel Adenovirus:DNA, adenoassoziierte virale Vektoren (AAV), die aus adenoassoziierten Viren abgeleitet sind und kleiner als Adenoviren sind und ein Retrovirus ein (jedes Virus aus der Familie Retroviridae, das RNA als seine Nukleinsäure aufweist und das Enzym reverse Transkriptase zum Kopieren seines Genoms in die DNA des Chromosoms der Wirtszelle verwendet; Beispiele schließen VSV G und Retroviren ein, die Komponenten eines Lentivirus einschließlich Viren des HIV-Typs enthalten).
Ein in dieser Beschreibung verwendeter Vektor bedeutet jedes DNA-Molekül, das Assoziatmoleküle einschließen kann, um DNA-Sequenzen in eine Zelle zur Ex pression zu übertragen. Beispiele schließen nackte DNA, nicht-virale DNA-Komplexe (z. B. DNA plus Polymere [kationisch oder anionisch], DNA plus die Transfektion verstärkende Verbindungen und DNA plus amphipathische Verbindungen) und Virusteilchen ein.
Ein nicht-viraler Vektor ist als ein Vektor definiert, der nicht innerhalb einer eukaryotischen Zelle aufgebaut wird, wobei nicht-virale DNA/Polymer-Komplexe, DNA mit die Transfektion verstärkenden Verbindungen und DNA + amphipathische Verbindungen eingeschlossen sind.
Haut ist die äußere Bedeckung eines Säugerkörpers einschließlich der Epidermis, der Dermis und des subkutanen Gewebes.
Permeabilität
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Permeabilität des Gefäßes erhöht. Der Wirkungsgrad der Polynukleotidzuführung und Expression wurde durch Erhöhen der Permeabilität eines Blutgefäßes innerhalb des Zielgewebes erhöht. Die Permeabilität wird hier als die Neigung von Makromolekülen wie etwa Polynukleotide zum Bewegen durch Gefäßwände und Eindringen in den extravaskulären Raum definiert. Ein Maß für die Permeabilität ist die Rate, mit der sich Makromoleküle durch die Gefäßwand und aus dem Gefäß bewegen. Ein weiteres Maß für die Permeabilität ist das Fehlen einer Kraft, die der Bewegung von Polynukleotiden widersteht, die unter Verlassen des intravaskulären Raums zugeführt werden.
Behindern ist in dieser Beschreibung das Blockieren oder Hemmen des Einströmens oder Ausströmens von Blut in einem Gefäß. Eine rasche Injektion kann mit dem Behindern des Ausströmens unter Erhöhen der Permeabilität kombiniert sein. Zum Beispiel wird in ein afferentes Gefäß, das ein Organ unterstützt, rasch injiziert und das efferente Gefäß, das das Gewebe entleert, wird vorübergehend abgebunden. Das ableitende Gefäß (auch venöser Abfluß oder Trakt genannt), das den Abfluß aus dem Gewebe ableitet, ist ebenfalls über einen Zeitraum, der ausreicht, die Zuführung eines Polynukleotids zu erlauben, teilweise oder völlig behindert. Umgekehrt wird in ein ableitendes Gefäß injiziert und ein zuführender Gefäßstrom wird behindert.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der intravaskuläre Druck eines Blutgefäßes durch Erhöhen des osmotischen Drucks innerhalb des Blutgefäßes erhöht. Typischerweise werden hypertone Lösungen, die Salze wie etwa NaCl, Zucker oder Polyole wie etwa Mannit enthalten, verwendet. Hyperton bedeutet, daß die Osmolarität der Injektionslösung größer als die physiologische Osmolarität ist. Isoton bedeutet, daß die Osmolarität der Injektionslösung dieselbe wie die physiologische Osmolarität ist (die Tonizität oder der osmotische Druck der Lösung ist ähnlich dem von Blut). Hypertone Lösungen weisen eine erhöhte Tonizität und einen osmotischen Druck ähnlich dem osmotischen Druck von Blut auf und veranlassen Zellen zum Schrumpfen.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Permeabilität des Blutgefäßes auch durch ein biologisch aktives Molekül erhöht werden. Ein biologisch aktives Molekül ist ein Protein oder eine einfache Chemikalie wie etwa Papaverin oder Histamin, das die Permeabilität des Gefäßes dadurch erhöht, daß es eine Änderung der Funktion, Aktivität oder Gestalt von Zellen innerhalb der Gefäßwand wie etwa der endothelialen oder Glattmuskelzellen bewirkt. Typischerweise treten biologisch aktive Moleküle mit einem speziellen Rezeptor oder Enzym oder Protein innerhalb der Gefäßzelle unter Verändern der Permeabilität des Gefäßes in Wechselwirkung. Biologisch aktive Moleküle schließen den vaskulären Permeabilitätsfaktor (VPF) ein, der auch als vaskulärer, endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) bekannt ist. Ein weiterer Typ biologisch aktives Molekül kann auch die Permeabilität durch Verändern des extrazellulären Bindematerials erhöhen. Zum Beispiel kann ein Enzym das extrazelluläre Material verdauen und die Anzahl und Größe der Löcher des Bindematerials erhöhen. Ein weiterer Typ biologisch aktives Material ist ein Chelatbildner, der Calcium bindet und dadurch die Permeabilität des Endotheliums erhöht.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird ein nicht-viraler Vektor zusammen mit einem Polynukleotid intravaskulär in einem großen Injektionsvolumen injiziert. Das Injektionsvolumen hängt von der Größe des Tiers ab, in das injiziert wird und kann von 1,0 bis 3,0 ml oder mehr bei kleinen Tieren (d. h. Schwanzveneninjektionen in Mäuse) sein. Das Injektionsvolumen bei Ratten kann von 6 bis 35 ml oder mehr sein. Das Injektionsvolumen bei Primaten kann von 70 bis 200 ml oder mehr sein. Das Injektionsvolumen als ml/Körpergewicht kann 0,03 ml/g bis 0,1 ml/g oder mehr sein.
Das Injektionsvolumen kann auch vom Zielgewebe abhängen. Zum Beispiel kann die Zuführung eines nicht-viralen Vektors mit einem Polynukleotid an ein Körperglied durch Injizieren eines größeren Volumens als 5 ml je Rattengliedmaß oder mehr als 70 ml bei einem Primaten unterstützt werden. Die Injektionsvolumina als ml/Gliedmaßenmuskel sind üblicherweise innerhalb des Bereichs von 0,6 bis 1,8 ml/g Muskel, können aber größer sein. Bei einem weiteren Beispiel kann die Zuführung eines Polynukleotids zur Leber in Mäusen durch Injizieren des nicht-viralen Vektor-Polynukleotids in einem Injektionsvolumen von 0,6 bis 1,8 ml/g Leber oder mehr unterstützt werden. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, dem Zuführen eines Polynukleotid-nicht-viralen Vektors an ein Körperglied eines Rhesusaffenprimaten, kann sich der Komplex in einem Injektionsvolumen von 0,6 bis 1,8 ml/g Körpergliedmuskel oder irgendwo innerhalb dieses Bereichs befinden.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird die Injektionsflüssigkeit rasch in ein Gefäß injiziert. Die Geschwindigkeit der Injektion ist zum Teil von dem zu injizierenden Volumen, der Größe des Gefäßes, in das injiziert werden soll und der Größe des Tieres abhängig. Bei einer Ausführungsform kann das gesamte Injektionsvolumen (1–3 ml) in 5 bis 15 Sekunden in das Gefäßsystem von Mäusen injiziert werden. Bei einer weiteren Ausführungsform kann das gesamte Injektionsvolumen (6–35 ml) in 20 bis 7 Sekunden in das Gefäßsystem von Ratten injiziert werden. Bei einer weiteren Ausführungsform kann das gesamte Injektionsvolumen (80–200 ml) in 120 Sekunden oder weniger in das Gefäßsystem von Affen injiziert werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird ein großes Injektionsvolumen verwendet und die Geschwindigkeit der Injektion wird verändert. Injektionsgeschwindigkeiten von weniger als 0,012 ml je Gramm (Tiergewicht) je Sekunde werden bei dieser Ausführungsform angewendet. Bei einer weiteren Ausführungsform werden Injektionsgeschwindigkeiten von weniger als ml je Gramm (Zielgewebegewicht) je Sekunde zur Genzuführung an Zielorgane angewendet. Bei einer weiteren Ausführungsform werden Injektionsgeschwindigkeiten von weniger als 0,06 ml je Gramm (Zielgewebegewicht) je Sekunde zur Genzuführung in einen Körpergliedmuskel und andere Muskeln von Primaten angewendet.
Spaltbare Polymere
Eine Vorbedingung für die Genexpression ist, daß sobald die DNA/Polymer-Komplexe in eine Zelle eingedrungen sind, daß Polynukleotid von dem kationischen Polymer abdissoziieren kann. Dies kann innerhalb zytoplasmatischer Vesikel (z. B. Endosomen) im Zytoplasma oder dem Kern erfolgen. Wir haben Massepolymere entwickelt, die aus eine Disulfidbindung enthaltenden Comonomeren und kationischen Comonomeren hergestellt wurden, um diesen Vorgang besser zu erleichtern. Von diesen Polymeren ist gezeigt worden, daß sie Polynukleotide kondensieren und die Nukleotide nach der Reduktion der Disulfidbindung freisetzen. Diese Polymeren können zum wirkungsvollen Komplexieren mit DNA verwendet werden und können auch DNA vor DNasen während der intramolekularen Zuführung an die Leber und andere Organe schützen. Nach der Verinnerlichung in die Zellen werden die Polymeren zu Monomeren reduziert, wodurch die DNA als Ergebnis der in der Zelle vorgefundenen schärferen Reduktionsbedingungen (Glutathion) wirkungsvoll freigesetzt wird. Negativ geladene Polymeren können auf ähnliche Weise hergestellt werden, was es den kondensierten Nukleinsäureteilchen (DNA + Polykation) erlaubt, mit einem abspaltbaren anionischen Polymer „wiederaufgeladen" zu werden und zu einem Teilchen mit einer negativen Nettoladung führt, das nach der Reduktion von Disulfidbindungen die Polynukleinsäure freisetzt. Das Reduktionspotential der Disulfidbindung in dem reduzierbaren Comonomer kann durch chemisches Verändern der Disulfidbindungsumgebung eingestellt werden. Dies erlaubt den Aufbau von Teilchen, deren Freisetzungseigenschaften so maßgeschneidert werden können, daß die Polynukleinsäure am richtigen Punkt des Zuführungsverfahrens freigesetzt wird.
pH-Spaltbare Polymeren zur intrazellulären Kompartementfreisetzung
Ein zellulärer Transportschritt, der für die Genübertragung und Wirkstoffzufuhr Bedeutung aufweist, ist der der Freisetzung aus intrazellulären Kompartementen wie etwa Endosomen (early und late), Lysosomen, Phagosomen, Vesikel, endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Apparat, Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) und sarkoplasmatisches Retikulum. Die Freisetzung schließt die Wanderung aus einem intrazellulären Kompartement heraus in das Zytoplasma oder in eine Organelle wie etwa den Kern ein. Chemikalien wie etwa Chlorquin, Bafilomycin oder Brefeldin A1. Chloroquin verringert die Ansäuerung der endosomalen und lysosomalen Kompartemente, beeinflußt aber auch andere Zellfunktionen. Brefeldin A, ein isoprenoider Pilzmetabolit, läßt den Golgi-Apparat reversibel in das endoplasmatische Retikulum und das frühe endosomale Kompartement in das Trans-Golgi-Netzwerk (TNG) unter Bilden von Tubuli zusammenfallen. Bafilomycin A₁, ein Makrolidantibiotikum, ist ein spezifischerer Hemmer der endosomalen Ansäuerung und vakuolärer Typ H⁺-ATPase als Chloroquin. Von dem ER-Rückhaltesignal (KDEL-Sequenz) wurde vorgeschlagen, daß es die Zuführung an das endoplasmatische Retikulum verstärkt und die Zuführung an Lysosomen verhindert.
Zum Erhöhen der Stabilität von DNA-Teilchen im Serum werden positiv geladenen DNA-Polykation-Teilchen Polyanionen zugesetzt, die eine dritte Schicht in dem DNA-Komplex bilden und das Teilchen negativ geladen machen. Zum Unterstützen des Aufbrechens der DNA-Komplexe haben wir Polymere synthetisiert, die unter den im Endosom angetroffenen Bedingungen, pH 5–7, gespalten werden. Wir haben auch Grund anzunehmen, daß die Spaltung von Polymeren in den DNA-Komplexen in dem Endosom beim Aufbrechen des Endosoms behilflich ist und DNA in das Zytoplasma freisetzt.
Es gibt zwei Wege zum Spalten eines Polyions: Spaltung des Polymerrückgrats, die zu kleineren Polyionen führt oder Spaltung der Verknüpfung des Polymerrückgrats und der ionenhaltigen Gruppen, was zu kleinen ionisierten Molekülen und einem Polymer führt. In jedem Fall wird die Wechselwirkung zwischen dem Polyion und der DNA unterbrochen und die Molekülanzahl im Endosom erhöht sich. Dies verursacht einen osmotischen Schock bei den Endosomen und bricht die Endosomen auf. Fall das Polymerrückgrat im zweiten Fall hydrophob ist, kann es mit der Membran des Endosoms in Wechselwirkung treten. Jeder Effekt kann das Endosom aufbrechen und dadurch bei der DNA-Freisetzung behilflich sein.
Zum Aufbauen spaltbarer Polymeren können die Ionen oder Polyionen mit Bindungen, die wie Disulfidbindungen, Diole, Diazobindungen, Esterbindungen, Sulfonbindungen, Acetale, Ketale, Enolether, Enolester, Imine, Imminium und Enamine von sich aus labil sind, zusammen verbunden werden. Ein weiterer Weg ist das Aufbauen des Polymers auf eine solche Weise, daß reaktionsfähige Gruppen, d. h. Elektrophile und Nukleophile in enge Nähe gebracht werden, so daß die Reaktion zwischen den Funktionsgruppen rasch ist. Beispiele schließen die ein, die Carbonsäurederivate (Säuren, Ester, Amide) und Alkohole, Thiole, Carbonsäuren oder Amine im selben Molekül aufweisen, um beim Zusammenreagieren Ester, Thiolester, Säureanhydride oder Amide zu bilden.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die Verwendung Silizium-Stickstoff-Verknüpfungen (entweder in der Polymerhauptkette oder in einer Polymernebenkette) enthaltender Polymeren (Silazane) bereit, die der Hydrolyse zugänglich sind. Die Hydrolyse von Silazanen führt zur Bildung eines Silanols und eines Amins. Silazane sind von sich aus einer Hydrolyse zugänglicher als es eine Silizium-Sauerstoff-Kohlenstoff-Verknüpfung ist, die Hydrolysegeschwindigkeit wird jedoch unter sauren Bedingungen erhöht. Die Substitution sowohl am Siliziumatom als auch dem Amin kann die Hydrolysegeschwindigkeit aufgrund sterischer und elektronischer Effekte beeinflussen. Dies erlaubt die Möglichkeit des Abstimmens der Hydrolysegeschwindigkeit der Hydrolyse des Silazans durch Ändern der Substitution entweder am Silizium oder dem Amin, um die gewünschte Wirkung zu erleichtern.
Bei einer Ausführungsform werden Estersäuren und Amidester, die in saurer Umgebung (pH kleiner 7, größer 4) labil sind, unter Bilden eines Alkohols und Amins und eines Anhydrids bei einer Vielfalt von Molekülen und Polymeren verwendet, die Peptide, Lipide und multimolekulare Verbindungen wie etwa Liposomen einschließen.
Bei einer Ausführungsform werden Ketale, die in saurer Umgebung (pH kleiner 7, größer 4) labil sind, unter Bilden eines Diols und eines Ketons bei einer Vielfalt von Molekülen und Polymeren verwendet, die Peptide, Lipide und Liposomen einschließen.
Bei einer Ausführungsform werden Acetale, die in saurer Umgebung (pH kleiner 7, größer 4) labil sind, unter Bilden eines Diols und eines Aldehyds bei einer Vielfalt von Molekülen und Polymeren verwendet, die Peptide, Lipide und Liposomen einschließen.
Bei einer Ausführungsform werden Enole, die in saurer Umgebung (pH kleiner 7, größer 4) labil sind, unter Bilden eines Ketons und eines Alkohols bei einer Vielfalt von Molekülen und Polymeren verwendet, die Peptide, Lipide und Liposomen einschließen.
Bei einer Ausführungsform werden Imminiumverbindungen, die in saurer Umgebung (pH kleiner 7, größer 4) labil sind, unter Bilden eines Amins und eines Aldehyds oder eines Ketons bei einer Vielfalt von Molekülen und Polymeren verwendet, die Peptide, Lipide und Liposomen einschließen.
pH-Empfindliche Spaltung von Peptiden und Polypeptiden:
Bei einer Ausführungsform werden Peptide und Polypeptide (die beide als Peptide bezeichnet werden) durch ein Anhydrid modifiziert. Die Amin- (Lysin), Alkohol- (Serin, Threonin, Tyrosin) und Thiolgruppen (Cystein) der Peptide werden durch ein Anhydrid unter Erzeugen eines Amids, Esters oder Thioestersäure modifiziert. In der sauren Umgebung der internen Vesikeln (pH kleiner 6,5, größer 4,5) (frühe Endosomen, späte Endosomen oder Lysosom) werden das Amid, der Ester oder Thioester gespalten, um die ursprüngliche Amin-, Alkohol- oder Thiolgruppe und das Anhydrid aufzuweisen.
Eine Vielfalt endosomolytischer und amphipathischer Peptide kann bei dieser Ausführungsform verwendet werden. Ein positiv geladenes, amphipathisches/endosomolytisches Peptid wird durch die Reaktion mit den Anhydriden unter Bilden der Amidsäuren in ein negativ geladenes Peptid umgewandelt und diese Verbindung wird anschließend mit einer Polykation-kondensierten Nukleinsäure komplexiert. Nach dem Eindringen in die Endosomen wird die Amidsäure gespalten und das Peptid wird positiv geladen und ist nicht mehr mit der Polykation-kondensierten Nukleinsäure kondensiert und wird amphipathisch und endosomolytisch. Bei einer Ausführungsform enthalten die Peptide Tyrosine und Lysine. Bei noch einer weiteren Ausführungsform befindet sich der hydrophobe Teil des Peptids (nach der Spaltung der Estersäure) an einem Ende des Peptids und der hydrophile Teil (z. B. nach der Spaltung negativ geladen) befindet sich an einem anderen Ende. Der hydrophile Teil kann mit Dimethylmaleinanhydrid modifiziert sein und der hydrophile Teil kann mit Citraconylanhydrid modifiziert sein. Da die Dimethylmaleylgruppe rascher als die Citraconylgruppe gespalten wird, bildet sich der hydrophobe Teil zuerst. Bei einer weiteren Ausführungsform bildet der hydrophile Teil alpha-Helix- oder Coiled-coil-Strukturen.
pH-Empfindliche Spaltung von Lipiden und Liposomen
Bei einer weiteren Ausführungsform ist der Ester, das Amid oder die Thioestersäure mit Lipiden und Liposomen kondensiert, so daß die Lipide in sauren Umgebungen modifiziert werden und das Liposom fusogen oder endosomolytisch aufgebrochen wird. Das Lipid Diacylglycerin wird mit einem Anhydrid unter Bilden einer Estersäure umgesetzt. Nach dem Ansäuern in einem intrazellulären Vesikel bildet sich das Diacylglycerin erneut und verhält sich sehr stark die Lipiddoppelschicht aufbrechend und fusogen.
Nicht-spaltbare Polymeren
Viele kationischen Polymeren wie etwa Histon (H1, H2a, H2b, H3, H4, H5), HMG-Proteine, Poly-L-lysin, Polyethylenimin, Protamin und Polyhistidin werden zum Verdichten von Polynukleinsäuren verwendet, um beim Erleichtern der Genzuführung in vitro und in vivo behilflich zu sein. Der Schlüssel zu einer wirkungsvollen Genzuführung unter Anwenden von Verfahren des Standes der Technik ist, daß nicht-spaltbare Polymeren (sowohl in vitro als auch in vivo) im Ladungsüberschuß gegenüber der DNA vorhanden sein müssen, so daß die gesamte Nettoladung des DNA/Polykation-Komplexes positiv ist. Umgekehrt haben wir beim Anwenden unseres Schwanzveneninjektionsverfahrens mit nicht-spaltbaren, kationischen Polymer/DNA-Komplexen gefunden, daß die Genexpression am wirkungsvollsten ist, wenn die Gesamtnettoladung der Komplexe negativ ist (DNA-Negativladung > Polykation-Positivladung). Schwanzveneninjektionen unter Verwenden gemeinhin zur DNA-Kondensation verwendeter kationischer Polymeren und die Genzuführung in vitro zeigten, daß eine hohe Genexpression erfolgte, wenn die Nettoladung der Komplexe negativ war.
Beispiele
Die bei Affen erreichten hohen Luciferase- und β-Galactosidasespiegel zeigen, daß das Verfahren voraussichtlich bei Menschen wirkungsvoll ist. Die Expressionswerte waren bei Ratten etwas höher als bei Affen.
Das intraarterielle Verfahren erfordert, daß der Blutfluß im wesentlichen weniger als die für eine Gewebeschädigung erforderlichen einige Stunden Ischämie behindert wird. Tatsächlich schließt eine übliche Anästhesie zur humanen Gliedmaßenchirurgie (z. B. Carpaltunnelreparatur) die Blockade des Blutstroms während mehr als einer Stunde ein. Wir haben keine weitverbreiteten histologischen Anzeichen einer ischämischen Muskelschädigung bei Ratten oder Primaten auf die Injektionen folgend beobachtet. Die minimalen Anstiege aus Muskeln stammender Enzyme im Serum sprechen auch gegen eine darauffolgende Muskelschädigung.
In Anbetracht, daß ~150 ml Flüssigkeit ~10 kg Tier verabfolgt werden, könnte die große Flüssigkeitsmenge den kardiovaskulären oder hämodynamischen Status der Tiere beeinflussen. Es wurden jedoch keine nachteiligen Wirkungen bei den Tieren beobachtet.
Der intravaskuläre Druck kann für die Arterien schädigend sein. Wir haben bei den Arterien minimale Intimaveränderungen beobachtet, von denen angenommen wird, daß sie vorübergehend und ohne Folgen sind. Nichtsdestotrotz kann diese minimale Arterienschädigung durch eine bessere Kontrolle des intravaskulären Drucks verhindert werden.
Bei diesem pDNA-Verabreichungsverfahren schränken mehrere Faktoren die Expression auf das Nicht-Zielgewebe ein: 1) das Tourniquet verhindert das sofortige Ausbreiten des Vektors außerhalb des Körperglieds; 2) eine wirkungsvolle pDNA-Expression in den nicht-vaskulären parenchymalen Zellen erfordert das Austreten der injizierten pDNA aus dem Gefäß.
Das Verfahren erfordert, daß verhältnismäßig große Mengen pDNA verabfolgt werden. Dies ist nicht mit irgendwelchen toxischen Wirkungen bei Nagern oder Affen verbunden. Angenommen, daß das Tourniquet die pDNA-Verteilung außerhalb des Körperglieds verzögert und die intravaskuläre pDNA durch im Kreislauf befindliche DNasen rasch abgebaut wird, ist eine pDNA-Toxizität unwahrscheinlich. Außerdem sind die Kosten für das Herstellen einer pDNA klinischer Qualität wesentlich weniger hoch als virale Vektoren und stellen kein Hindernis für ihre klinische Verwendung dar.
Beispiel 1: Intraarterielle Injektionen in Affen
Sieben Rhesusaffen (5 Männchen : 2 Weibchen) mit 6 bis 13,7 kg Körpergewicht erfuhren intraarterielle Injektion in ihre Gliedmaßen auf die Anästhesie mit Ketamin und Halothan folgend. Bei den Unterarminjektionen wurde ein ~3 cm langer Längsschnitt auf der Haut entlang des Innenrands des Biceps brachii und 2 cm über dem Ellbogen ausgeführt. Nach dem Trennen der Arterie von umgebendem Gewebe und Venen wurde ein 20er Katheter in die Oberarmarterie anterograd eingeführt und dort ligiert. Bei den Unterschenkelinjektionen war das Verfahren im wesentlichen dasselbe wie das beim Arm verwendete, der Schnitt befand sich aber auf dem oberen Rand der Kniekehle und der 20er Katheter wurde in die Kniearterie eingeführt.
Sowohl bei den Arm- als auch den Beininjektionen wurde der Blutstrom durch eine den Arm oder das Bein proximal zur Injektionsstelle umgebende Blutdruckmanschette behindert. Nachdem das Blutdruckmeßgerät auf über 300 mmHg Druck aufgeblasen worden war, wurden in die katheterisierten Gefäße 30 ml 5 mg Papaverin (Sigma Co.) enthaltende, normale Kochsalzlösung injiziert. Fünf min später wurde eine 100 μg pDNA/ml Lösung enthaltende Kochsalzlösung innerhalb 30 bis 45 sec rasch injiziert. Bei den Armen war das Volumen jeder Injektion 75 ml und 90 ml bei den ersten beiden Tieren und 120 ml danach. Das Injektionsvolumen war ~180 ml bei den Unterschenkeln. Die DNA-Lösungen wurden mittels eines unter Stickstoffdruck stehenden Zylinders injiziert. Zwei min nach der Injektion wurden die Katheter entfernt und das Blutdruckmeßgerät entlüftet.
Das Verfahren wurde zuerst an vier Affen durchgeführt, bei denen in einen Arm und Bein injiziert wurde und Muskelbiopsien wurden nach einer (#1–3) oder zwei Wochen (#4) genommen. Affe #2 mußte wegen einer (mit unserem Verfahren nicht zusammenhängenden) Augenentzündung zwei Wochen nach der Injektion getötet werden. Drei weitere Affen (#5–7) erhielten eine Injektion in alle vier Extremitäten (ein Arm und Bein an einem Tag und die anderen beiden Extremitäten zwei Tage später). Muskelbiopsien wurden nach einer Woche erhalten und die Tiere wurden zwei Wochen nach den Injektionen getötet. Bei den Affen #6 und #7 wurde in einen Arm und Bein pCI-LacZ injiziert, alle anderen Injektionen erfolgten mit pCI-Luc^–.
Beispiel 2: Reportergensysteme
Die Plasmide pCI-Luc⁺ (Promega, Madison, WI) und pCI-LacZ exprimieren eine zytoplasmatische Luciferase beziehungsweise Escherichia coli LacZ aus dem humanen Cytomegalovirus-immediate-early-Promotor (CMV). Der Vektor pCI (Promega) enthält auch ein SV40-Polyadenylierungssignal. pMI-Luc⁺ wurde durch Ersetzen des CMV-Promotors bei pCI-Luc^– mit einem Maus-Muskelkreatinkinasepromotor mit 3300 bp aufgebaut. Der Vektor pEBFP-N1 exprimiert ein kernlokalisierendes, blauverschobenes, grün fluoreszierendes Protein (GFP) aus dem CMV-Promotor (Clontech, Palo Alto, CA).
Luciferasebestimmungen wurden wie zuvor mitgeteilt an Muskelbiopsien, ganzen Muskeln und verschiedenen Geweben ausgeführt. Die relativen Lichteinheiten (RLU) wurden durch Verwenden von Luciferasestandards (Molecular Probes, Eugene, OR) und einer Standardkurve, bei der Luciferaseprotein (pg) = RLU × 5,1 × 10^–5 war, in Nanogramm Luciferase umgerechnet.
Bei den β-Galactosidasebestimmungen wurden Muskelproben aus proximalen, mittleren und distalen Stellen jedes Muskels entnommen, in kleine Stücke geschnitten, in kaltem Isopentan gefroren und bei –80°C aufbewahrt. Muskelstücke wurden aus jeder Muskelprobe (bei jeder Stelle) zufällig ausgewählt und es wurden 10 μm dicke Kryostatschnitte hergestellt. Jeder zehnte Schnitt bei insgesamt 20 Schnitten wurde angefärbt und analysiert. Die Schnitte wurden in X-gal-Anfärbelösung (5 mM Kaliumferricyanid, 5 mM Kaliumferrocyanid, 1 mM Magnesiumchlorid, 1 mM X-gal in 0,1 M PBS, pH 7,6) 4–8 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und mit Hämatoxylin und Eosin gegengefärbt. Drei Schnitte wurden aus den 20 Schnitten jeder Stelle zufällig (üblicherweise der 4., 11. und 17. Schnitt, es wurde aber ein Nachbarschnitt verwendet, falls diese Schnitte nicht unversehrt waren) ausgewählt. Wie zuvor beschrieben wurde die Anzahl der β-Galactosidase-positiven und gesamten Zellen innerhalb einer Querschnittsfläche bei jedem Schnitt durch Bewegen des Zählgitters vom oberen Rand des Schnitts zum unteren und vom linken Rand zum rechten bestimmt. Der Prozentsatz β-Galactosidase-positiver Zellen bei jedem Muskel wurde aus dem Ergebnis der positiven Anzahl geteilt durch die Zellengesamtzahl erhalten. Das gewichtete Mittel für den Prozentsatz transfizierter Zellen bei jedem Extremitätenmuskel wurde wie folgt bestimmt: (ΣAi·Mi)/M, worin Ai der Prozentsatz transfizierter Zellen bei einem Muskel, Mi das Gewicht dieses Muskels und M das Gesamtgewicht aller Muskeln ist.
Zur gemeinsamen Lokalisierung von β-Galactosidase und GFP-Expression wurden 10 μm dicke Kryostatschnitte 5–10 min lang mit 4% Formaldehyd fixiert. Maus-anti-β-Galactosidase-Antikörper und TRITC-markiertes Ziege-anti-Maus-IgG (Sigma) wurden als primärer beziehungsweise sekundärer Antikörper verwendet. Mittels eines Nikon Optiphot Epifluoreszenzmikroskops mit einer SenSys CCD-Kamera (Photometrics, Tucson, AZ) wurden von derselben Ansicht für TRITC-markierte β-Galactosidase und für GFP zwei Bilder aufgenommen und mittels des Programms Adobe Photoshop 4.0 übereinandergelegt.
Beispiel 3: Luciferase- und β-Galactosidaseexpression
Sieben (6–20 Jahre) alte Rhesusaffen erhielten pDNA-Injektionen in ihre Gliedmaßenarterien. Alle sieben Affen tolerierten das Verfahren gut und wiesen nach dem Verfahren die vollständige Funktion ihrer Arme, Hände, Beine und Füße auf. Dies zeigt insbesondere ein Fehlen einer Schädigung des Radialnervs an, der gegenüber der den Oberarm umgebenden Blutdruckmanschette empfindlich hätte sein können. Eine Schwellung bei den Zielgliedmaßen, ein angenommenes Korrelat einer erfolgreichen Genübertragung, wurde danach beobachtet, war aber am nächsten Tag völlig abgeklungen. Als die Affen 15 bis 30 min nach dem Vorgang aus der Betäubung erwachten, schienen sie keine Beschwerden über denen eines normalen Aufwachens aus einer Operation aufzuweisen. Gelegentlich wies die Haut bei dem Zielkörperglied einige Blutungsflecke auf, die sich innerhalb mehrerer Tage auflösten.
Vier der Affen wurden 14 bis 16 Tage nach der Injektion getötet und alle Zielmuskeln ihrer Körperglieder wurden entweder auf Luciferase- oder β-Galactosidaseexpression (Tabelle 1) untersucht. Diese Ergebnisse zeigen, daß die intraarterielle Injektion von pCI-Luc⁺-DNA von 345 bis 7332 ng/g Muskel (Tabelle 1) reichende Werte der Luciferaseexpression in allen Muskeln von Oberarm, Hand, Unterschenkel und Fuß lieferte. Die Schwankungen bei der Luciferaseexpression in Armmuskeln bei verschiedenen Tieren scheint davon abhängig zu sein, ob die Katheterspitze in der Speichen- oder Ellenarterie angebracht war. Die durch schnittlichen Luciferaseexpressionswerte bei den Körpergliedmuskeln waren 991,5 ± 187 ng/g beim Arm und 1186 ± 673 ng/g beim Bein.
Nach der intraarteriellen Injektion von pCI-LacZ-DNA wurde in Muskelfasern eine β-Galactosidaseexpression gefunden. Eine große Zahl β-Galactosidase-positiver Muskelfasern wurde sowohl in Bein- als auch Armmuskeln gefunden, die von weniger als 1% bis mehr als 30% bei verschiedenen Muskeln reichte (Tabelle 1 und 1). Der durchschnittliche Prozentsatz bei allen vier Gliedmaßen, in die injiziert wurde, war 7,4% und reichte von 6,3% bis 9,9% für jedes Körperglied. Die Prozentsätze β-Galactosidase für spezielle Muskelgruppen korrelierten positiv mit den Luciferasewerten in denselben Muskeln (r = 0,79).
Tabelle 1. Mittlere Muskel-β-galactosidase- oder -luciferaseexpression in vier Muskeln aus Affen, die zwei Wochen nach der Injektion von pCI-LacZ oder pCI-Luc^– getötet worden waren. „±" bezeichnet die Standardabweichung; n bezeichnet die Zahl der untersuchten Gliedmaßen. A. Armmuskeln
B. Beinmuskeln
Beispiel 4: Toxizität
Serumchemische und histologische Analysen wurden ausgeführt, um zu bestimmen, ob das Verfahren bei den Affen irgendwelche nachteiligen Wirkungen verursacht hatte. Die Serumspiegel von Kreatinphosphatkinase (CK), Alaninaminotransferase, Asparaginataminotransferase (AST) und Lactatdehydrogenase (LDH) waren nach dem Eingriff mehrfach höher als vor dem Eingriff. Die Werte erreichten 48 Stunden nach der Injektion den Höchstwert und kehrten innerhalb mehrerer Tage auf den Normalwert zurück. Andere Serumenzyme wie etwa γ-Glutamyltransferase (GGT) und alkalische Phosphatase, hämatologische Tests (Hämatokrit- und RBC-Indizes, Blutplättchen), Serumelektrolyte (Na, Cl, K), Serummineralien (Calcium, Phosphat, Eisen), Serumproteine (Albumin, Gesamtprotein), Serumlipide (Cholesterin, Triglyceride), Nierenindizes (Harnstoff, Kreatinin) und Bilirubin waren unbeeinflußt. Die Gesamt-WBC waren innerhalb des typischen postoperativen Bereichs erhöht.
Körpergliedmuskeln wurden 14 bis 16 Tage nach der intraarteriellen Injektion erhalten und histologisch untersucht. Die große Mehrheit des Muskelgewebes war gut erhalten und zeigte keine pathologischen Anzeichen. Bei einigen Schnitten wurden β-Galactosidase-positive Muskelfasern umgebende mononukleäre Zellen bemerkt, wovon einige eine Degeneration erfahren hatten. Die Immunanfärbung auf CD-Marker zeigte, daß die Mehrheit der infiltrierenden Zellen CD3-positiv (T-Lymphozyten) bei nur wenigen B-Zellen war.
Beispiel 5: Zeitlicher Verlauf der Muskelexpression nach der intravaskulären Injektion bei Ratten
Die Muskelluciferaseexpression wurde zu mehreren Zeitpunkten nach der intravaskulären Zuführung des Luciferasegens unter der Kontrolle entweder des CMV-Promotors (pCI-Luc⁺) oder MCK-Promotors (pMI-Luc⁺) in a) unbehandelte Ratten, b) kontinuierlich immununterdrückte (mit 2,5 mg/kg FK506 oral und 1 mg/kg Dexamethason subkutan einen Tag vor, eine Stunde vor und täglich da nach mit FK506 behandelte) oder c) vorübergehend immununterdrückte (mit 10 mg/kg FK506 oral und 1 mg/kg Dexamethason subkutan einen Tag vor, eine Stunde vor und einen Tag nach der intraarteriellen pDNA-Zuführung mit FK506 behandelte) Ratten gemessen (Tabelle 2). Bei unbehandelten Ratten ging die Luciferaseexpression 7 Tage bei dem CMV-Promoter oder 21 Tage bei dem MCK-Promoter verloren. Sowohl bei Ratten, denen pCI-Luc⁺ als auch denen pMI-Luc⁺ injiziert worden war, wurden mittels eines ELISA an Tag 21 Anti-Luciferase-Antikörper nachgewiesen und lagen an Tag 56 und 70 nach der intravaskulären pDNA-Zuführung in höheren Werten vor (Daten nicht dargestellt).
Tabelle 2: Zeitlicher Verlauf der Luciferaseexpression (ng/g Muskel) in den hinteren Gliedmaßen nach intraarteriellen Injektionen von 500 μg pCI-Luc⁺ (A) oder pMI-Luc⁺ (B) in nach verschiedenen Immununterdrückungsvorschriften behandelte Ratten A. pCI-Luc⁺
B. pM1-Luc⁺
Beispiel 6: Wiederholte Injektionen
Sprague-Dawley-Ratten (150 g) wurden unter Bedingungen erhöhten Drucks an Tag 0 500 μg pCI-Luc⁺ intraarteriell in das rechte Bein injiziert. An Tag 7 und 14 wurden den Ratten langsam 300 μg pCI-Luc⁺ in 1 ml in die Schwanzvene injiziert. An Tag 24 wurden in das linke Bein 500 μg pCI-Luc⁺ intraarteriell injiziert. An Tag 26 wurden die Tiere getötet und das linke Bein zeigte eine Luciferaseexpression (Mittel = 4500 ng Gesamtiuciferase/Beinmuskel; n = 2), die den Werten ähnlich war, die bei Tieren erzielt wurden, denen vorher keine pDNA (Mittel = 6940 ng/Beinmuskel, n = 26) injiziert worden war.
Zum Erforschen der Fähigkeit, unterschiedliche Populationen von Muskelfasern anzusprechen, wurden in dasselbe Bein bei den Ratten 500 μg β-Galactosidasevektor (pCI-LacZ) und zwei Tage danach 500 μg des nukleären GFP-Vektors (pEBFP-N1) injiziert. Zwei Tage nach der letzten Injektion wurden die Muskeln auf die Expression der beiden Reportergene analysiert. Die Expression von GFP und β-Galactosidase war am häufigsten in unterschiedlichen Muskelfasern lokalisiert (2A und C), in einigen Zellen traf die Expression jedoch zusammen (2B).
Beispiel 7: Verteilung markierter pDNA im Muskel
Rhodamin-markierte pDNA (Rh-pDNA) wurde in die Oberschenkelarterie von Ratten unter verschiedenen Bedingungen injiziert, um den Aufnahmemechanismus im Muskel zu erforschen, so wie es bei der Leber durchgeführt wurde. Als die Injektionen durchgeführt wurden, ohne den Blutausstrom zu hemmen (niedriger intravaskulärer Druck), wurde nahezu keine DNA innerhalb des Muskelgewebes oder der Gefäße nachgewiesen. 3A stellt einen selten Bereich dar, wo einige DNA zwischen Muskelzellen zu erkennen ist. Als die Injektionen mit Ausstromverschluß (hoher intravaskulärer Druck) ausgeführt wurden, wurde Rh-pDNA überall im Muskel nachgewiesen (3B und C). 5 min nach der Injektion zeigte die Untersuchung von Gewebeschnitten, daß die Mehrheit der Rh-pDNA die Muskelzellen umgab und kein intrazelluläres Anfärben vorlag (3B, Pfeil). Eine Stunde nach der Injektion sind wesentliche Mengen DNA innerhalb der Zellen zu erkennen (3C, Pfeilspitze). Eine Untersuchung serieller, konfokaler Schnitte zeigt, daß das intrazelluläre Anfärbungsmuster punktiert ist, was wahrscheinlich nicht mit einer T-tubulären Verteilung vereinbar ist.
Beispiel 8: Expression eines therapeutischen Gens in Skelettmuskelgewebe
Eine das das humane Faktor-IX-Gen (cDNA) unter Transkriptionskontrolle des humanen Cytomegaloviruspromotors exprimierende Plasmid-DNA (pCI-hF9) wurde dem Skelettmuskel eines hinteren Rattenkörperglieds zugeführt. Ein Bauchdecken-Mittelschnitt wurde durchgeführt und die Hautlappen wurden zum Freilegen der Zielfläche mit Klammern weggeklappt. Der Darm wurde entfernt, um die Hüftvenen und -arterien sichtbar zu machen. Mikrogefäßklammern wurden auf der äußeren Hüft-, kaudalen Bauchdecken-, inneren Hüft-, Samenleiter- und Gesäßarterien und -venen angebracht, um sowohl den Blutausstrom als auch -einstrom zum Bein zu blockieren. Eine Ausfließverstärkerlösung (0,5 mg Papaverin in 3 ml Kochsalzlösung) wurde durch eine 25er Nadel in die äußere Hüftarterie injiziert, 5 Minuten später gefolgt von der pDNA-haltigen Lösung (500 μg in 10 ml Ringer). Die pDNA-Lösung wurde in ungefähr 10 Sekunden injiziert. Die Mikrogefäßklammern wurden 2 Minuten nach der Injektion entfernt und das Bauchfell und die Haut wurden mit Nähten geschlossen. Die Ratten wurden durch orale Behandlung mit 10 mg/kg FK506 und 1 mg/kg Dexamethason subkutan einen Tag vor, eine Stunde vor und einen Tag nach der Plasmid-DNA-Zuführung immununterdrückt. Die Ratten wurden nach 3 Wochen getötet, zu welchem Zeitpunkt die Skelettmuskeln des hinteren Körperglieds entfernt und in einem Gesamtvolumen von 60 ml homogenisiert wurden. Die humaner Faktor-IX-Werte im Rattenserum wurden mittels eines ELISA bestimmt und mit normalem Humanserum verglichen. Die Expressionswerte bei 3 Ratten waren 1400, 1000 beziehungsweise 1150 ng/ml Extrakt. Daher war die Gesamtmenge des in dem Rat tenmuskelgewebe drei Wochen nach der pDNA-Zuführung vorhandenen humanen Faktors IX ungefähr 70 μg.
Beispiel 9: Expression ausgeschiedener alkalischer Phosphatase aus Rattenskelettmuskelzellen
Ein Plasmid-DNA-Expressionsvektor (pMIR54) wurde aufgebaut, bei dem das ausgeschiedene alkalische Phosphatasegen (SEAP) (aus Plasmid pSEAP-2 basisch, Clontech, erhalten) unter der Transkriptionskontrolle des humanen Cytomegaloviruspromotors steht. Eine Lösung von 500 μg pMIR54 in 10 ml Ringer wurde wie in den Beispielen vorstehend beschrieben in die Hüftarterie von Sprague Dawley-Ratten injiziert. Die Ratten wurden durch orale Behandlung mit 2,5 mg/kg FK506 und 1 mg/kg Dexamethason subkutan einen Tag vor und eine Stunde vor der Plasmid-DNA-Zuführung immununterdrückt. Nach der pDNA-Zuführung wurden die Ratten mit 2,5 mg/kg FK506 täglich behandelt. Blutproben wurden aus diesen Ratten zu mehreren Zeitpunkten nach der Plasmid-DNA-Zuführung erhalten. Die SEAP-Expression wurde mittels eines Chemilumineszenztests (Tropix) bestimmt und mit einer Standardkurve verglichen.
SEAP-Expression (ng SEAP je ml Serum)
Beispiel 10: Expression in multiplen Muskelgruppen
500 μg pCI.Luc in 10 ml normaler Kochsalzlösung wurden in die Oberschenkelarterie erwachsener Ratten injiziert, bei denen ein Tourniquet an die Außenseite des Beins proximal (das Tourniquet war an den oberen Teil der Quadrizepsmuskelgruppe angelegt) zur Injektionsstelle angelegt war. Fünf Tage nach der Injektion wurden die verschiedenen Muskelgruppen aus dem Bein entnommen und in gleichgroße Schnitte zerschnitten. Jeder Schnitt wurde in Lysispuffer gelegt, die Muskeln wurden homogenisiert und 10 μl der sich daraus ergebenden Lysate wurden auf Luciferaseaktivität untersucht.
Hohe Werte der Luciferaseexpression wurden in allen Muskelgruppen exprimiert, die distal zu dem Tourniquet gelegen waren. Diese schlossen den Bizeps femoris, die hinteren Muskeln des Oberschenkels, Gastrocnemius, Muskeln des Unterschenkels und Muskeln der der Fußsohlenoberfläche ein.
Tabelle 3: Luciferaseexpression in den verschiedenen Muskeln des Rattenbeins nach der Injektion von 500 μg pCILuc in die Oberschenkelarterie mit einem um die Außenseite der Oberschenkelmuskeln herum angelegten Tourniquet Intravaskuläre Zuführung an das Rattenbein (mit äußerem Tourniquet)
Intravaskuläre Zuführung an das Rattenbein (ohne Tourniquet)
Die intravaskulär verabfolgte Plasmid-DNA wird in mehreren Muskelgruppen wirkungsvoll exprimiert, wenn der Blutstrom mittels eines äußeren Tourniquets behindert wird.

Claims

Verwendung eines Polynukleotids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer parenchymalen Zelle durch Polynukleotidzuführung, wobei die Verwendung das – Einbringen des Polynukleotids in ein Blutgefäß, – äußerliche Anwenden von Druck auf die Säugerhaut zum Verhindern des Blutflusses und – Zuführen des Polynukleotids zu der parenchymalen Zelle umfaßt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid nackte DNA ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid aus der aus einem viralen Vektor und einem nicht-viralen Vektor bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid ein zum Verhindern einer Genexpression geeignetes blockierendes Polynukleotid ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die parenchymale Zelle eine Muskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die Muskelzelle eine Beinmuskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die Muskelzelle eine Armmuskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Armmuskelzelle eine vordere Muskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die vordere Muskelzelle eine vordere, oberflächliche Muskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die vordere Muskelzelle eine vordere, tiefe Muskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei die Muskelzelle aus der aus Palmaris longus, Pronator teres, Flexor carpi radialis, Flexor carpi ulnaris und Flexor digitorum spf. bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei die Muskelzelle aus der aus Flexor digitorum prof. und Pronator quadratus bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Armmuskelzelle eine hintere Muskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei die hintere Muskelzelle eine hintere, oberflächliche Muskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei die hintere Muskelzelle eine hintere, tiefe Muskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die Muskelzelle aus der aus Brachioradialis, Extensor carpi radialis longus, Extensor carpi radialis brevis, Extensor digitorum, Anconeus, Extensor carpiulnaris und Extensor pollicis longus bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei die Muskelzelle aus der aus Supinator, Abductor pollicis longus, Extensor digiti secundi et tertii und Extensor digiti quarti et minimi bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Armmuskelzelle eine Handmuskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei die Handmuskelzelle eine Daumenmuskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei die Handmuskelzelle eine interossäre Zelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei die Beinmuskelzelle eine hintere Muskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 21, wobei die hintere Muskelzelle eine oberflächliche Zelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 21, wobei die hintere Muskelzelle eine tiefe Zelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die oberflächliche Zelle aus der aus Gastrocnemius und Soleus bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 23, wobei die tiefe Zelle aus der aus Popliteus, Flexor digitorum longus, Flexor hallucis longus und Tibialis posterior bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei die Beinmuskelzelle eine vordere Muskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei die Beinmuskelzelle eine innere Muskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei die Beinmuskelzelle eine Fußmuskelzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 26, wobei die vordere Muskelzelle aus der aus Tibialis anterior, Extensor hallucis longus, Extensor digitorum longus und Abductor hallucis longus bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei die innere Muskelzelle aus der aus Peronaus longus und Peronaus brevis bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 28, wobei die Fußmuskelzelle aus der aus Extensor digitorum brevis und Extensor hallucis brevis bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das äußerliche Anwenden von Druck auf die Säugerhaut aus dem Anlegen eines Tourniquets über der Haut besteht.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das äußerliche Anwenden von Druck auf die Säugerhaut aus dem Anlegen einer Manschette über der Haut besteht.
Verwendung gemäß Anspruch 33, wobei die Manschette eine Blutdruckmanschette ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Zuführung hauptsächlich zu Gliedmaßenzellen erfolgt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid nicht-vaskulären, parenchymalen Zellen zugeführt wird.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Behandlung weiter den – vollständigen Funktionserhalt der Gliedmaßen des Säugers im Anschluß an die Zuführung umfaßt.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 37, wobei die Behandlung weiter das – Anwenden einer Immunsuppression umfaßt.
Verwendung gemäß Anspruch 38, wobei die Immunsuppression eine andauernde Immunsuppression ist.
Verwendung gemäß Anspruch 39, wobei die Immunsuppression eine vorübergehende Immunsuppression ist.
Verwendung gemäß Anspruch 40, wobei die Immunsuppression aus der aus einer oralen Immunsuppression und subkutanen Immunsuppression bestehenden Gruppe ausgewählt ist.