DE60030786T2

DE60030786T2 - Murraya koenigii-extrakte zur behandlung von asthma

Info

Publication number: DE60030786T2
Application number: DE60030786T
Authority: DE
Inventors: c/o Indian Institute of Chemical Bio R. BHADRA; c/o Indian Institute of Chemical Bio B. PAL; c/o Indian Institute of Chemical Bio K. DAS; c/o Indian Ins. of Chemical Bio S. BHATTACHARAYA
Original assignee: an Indian Reg body Inc under Reg of Societies Act (Act XXI of 1860) Rafi Marg; Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: an Indian Reg body Inc under Reg of Societies Act (Act XXI of 1860) Rafi Marg; Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2000-10-16
Filing date: 2000-10-16
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2020-10-17
Also published as: DE60030786D1; ATE339216T1; EP1331939B1; EP1331939A1; AU2001235968B2; WO2002032440A1; DK1331939T3; AU3596801A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Bestandteilen, extrahiert aus der Pflanze Murraya koenigii, zur Behandlung von Asthma. Die Erfindung stellt außerdem neue Zusammensetzungen bereit, die bei der Behandlung von Asthma verwendbar sind.
HINTERGRUND DES FACHGEBIETES
Atemwegserkrankungen wie beispielsweise Asthma nehmen gegenwärtig in sowohl der entwickelten als auch der sich entwickelnden Welt epidemische Ausmaße an (Nature, Bd. 402, Supplement, und Nr. 6760, 1999. Ein spezielles Supplement über Allergie und Asthma). In Ländern wie beispielsweise Britannien und Australien wirkt sich das Atemproblem bei 1 von 4 Kindern im Alter unter 14 Jahren mit Asthma aus. Die Krankheit verursacht Leid und Elend bei Millionen und oft zu einer Zeit in ihrem Leben, wenn sie am meisten aktiv sein sollten. Asthma beeinträchtigt den Schlaf, die intellektuelle Tätigkeit und die Freizeitgestaltung. In einem Extrem kann Asthma lebensbedrohlich sein, was zum Auftreten von Todesfällen führt, die vermeidbar sind.
Der Bericht eines Expertengremiums hat Richtlinien für die Diagnose und Behandlung von Asthma angeboten (JAMA Asthma Information Center, www.amaasssm.org/special/asthma/treatmnt/guide/guideline/gudelin.htm). Die Kontrolle von Faktoren, die zur Schwere von Asthma beitragen, ist ein anderer Weg zur Behandlung (JAMA Asthma Information Center, www.amaasssm.org/special/asthma/treatmnt/guide/guidelin/comp2/comp2.htm). Verschiedene Therapien und Medikationen sind ebenfalls vorgeschlagen worden (JAMA Asthma Information Center, www.amaasssm.org/special/asthma/treatmnt/guide/guidelin/comp3/medicat/meditoc.htm und www.amaass.org/special/asthma/treatmnt/guide/guidelin/comp3/comp3.htm). Immuntherapie ist ein anderer Weg für die Behandlung (JAMA Asthma Information Center, www.amasssm.org/special/asthma/treatmnt/guide/guidelin/comp2/immunoth.htm). Komplementäre alternative Medizin wird gegenwärtig ebenfalls versucht (JAMA Asthma Information Center, www.amaasssm.org/special/asthma/treatmnt/guide/guidelin/comp3/medicat/alternat.htm). Jedoch ist keine zufriedenstellende Medikation zur Heilung der Krankheit gefunden worden.
Hier wurden die aktiven Faktoren in Murraya koenigii hergestellt und in einem in-vitro-System verwendet, um ihre Verwendbarkeit zur Linderung, Behandlung und Heilung eines Asthmaproblems zu zeigen. Die Pflanze Murraya koenigii ist untersucht worden und es ist berichtet worden, daß sie verschiedene medizinische Wertstoffe aufweist (Chakraborty, M. P., Phytochemistry 1997, Oct.; Khan B. A., Indian J. of Expt. Biol. 1997, Feb.; Khan B. A. Indian J. of Physiology and Pharmacology 1996, Apr.; Khan B. A. Plant Foods Hum. Nutr. 1996, Jun.).
Das Blatt dieser Pflanze wird in Indien in verschiedenen Nahrungsmittelzubereitungen weitverbreitet verwendet. Weiterhin kommt die Pflanze überall vor. So weist der Stand der Technik darauf hin, daß die Extrakte aus der Pflanze verschiedene medizinische und andere Eigenschaften haben, die weitreichend untersucht worden sind. Dies ist ein angemessener Beweis, daß die Extrakte aus der Pflanze von Menschen sicher ohne irgendwelche Nebenwirkungen verzehrt werden können.
Die Anmelder haben eine Untersuchung über die Extrakte aus dieser Pflanze unternommen, um die therapeutische Verwendung der Bestandteile dieser Pflanze zu identifizieren. Während ihrer Untersuchung haben die Anmelder das Vorhandensein bestimmter Wirkstoffe in dem Blatt von Murraya koenigii entdeckt, von denen überraschenderweise gefunden wurde, daß sie bei der Behandlung und Heilung von Asthma verwendbar sind.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Behandlung von asthmatischen Leiden bereitzustellen, die Wirkstoffe, extrahiert aus der Pflanze Murraya koenigii, in Kombination mit anderen Kräuterextrakten anwendet.
Noch eine andere Aufgabe ist es, neue Zusammensetzungen bereitzustellen, die Wirkstoffe, extrahiert aus der Pflanze Murraya koenigii und verwendbar bei der Behandlung von Asthma, enthalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine Behandlung von Asthma bereit, die Bestandteile, extrahiert aus der Pflanze Murraya koenigii, in Kombination mit anderen Kräuterextrakten, wie in Anspruch 1 beschrieben, anwendet. Die Erfindung stellt auch neue Zusammensetzungen bereit, die bei der Behandlung von Asthma verwendbar sind.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein Verfahren zum Herstellen eines Extrakts aus der Pflanze Murraya koenigii, verwendbar bei der Behandlung von Asthma, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, Pflanzenteile zu pulverisieren, die pulverisierten Teile der Pflanze mit einem Lösungsmittel bei Umgebungstemperatur zu extrahieren, den Extrakt durch Filtrieren und Verdampfen unter vermindertem Druck zu konzentrieren und das Konzentrat zu lyophilisieren, um einen lyophilisierten Extrakt zu erhalten, der Wirkstoffe der Pflanze Murraya koenigii enthält, wird offenbart, ist aber kein Teil der beanspruchten Erfindung.
In einer Ausführungsform werden die Pflanzenmaterialien aus Pflanzenteilen von Murraya koenigii, ausgewählt aus gartenfrischen Blättern oder im Schatten getrockneten Blättern, erhalten.
In einer anderen Ausführungsform werden die Blätter nach herkömmlichen Verfahren pulverisiert, um homogenisierte Blätter zu erhalten.
In noch einer anderen Ausführungsform werden die Pflanzenmaterialien mit Lösungsmitteln extrahiert, die aus Kohlenwasserstofflösungsmitteln, chlorierten Lösungsmitteln, Esterlösungsmitteln, ketonischen Lösungsmitteln, Alkoholen, Wasser und Puffern ausgewählt sind. So können die Lösungsmittel aus der Gruppe, bestehend aus Petrolether (Kp. 40–60°C), Petrolether (Kp 60–80°C), Benzol, Pentan, Hexan, Chloroform, Dichlormethan, Tetrachlorkohlenstoff, Diethylether, Tetrahydrofuran, Dioxan, Aceton, Cyclopentanon, Ethylacetat, Ethylformiat, Methanol, Ethanol, n-Butanol, Wasser und Puffern, ausgewählt werden.
In einer anderen Ausführungsform wird die Konzentration des Extrakts durch Filtrieren und Verdampfen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck in einem Temperaturbereich von 20°C–80°C, vorzugsweise bei Umgebungstemperatur, und Lyophilisieren des Konzentrats mit herkömmlichen Verfahren beeinflußt, um ein Gemisch der Wirkstoffe zu erhalten.
In noch einer anderen Ausführungsform umfaßt der aus der Pflanze Murraya koenigii erhaltene Extrakt Wirkstoffe, die als dunkel gefärbte Feststoffe erscheinen, die in Dimethylsulfoxid löslich sind.
In einer anderen Ausführungsform sind die aus der Pflanze Murraya koenigii erhaltenen Wirkstoffe biokompatibel und nichttoxisch in der Beschaffenheit. Es wurde gefunden, daß die Wirkstoffe, wenn sie der Chromatographie unterworfen werden, die R_f-Werte 0,73, 0,60 0,34 und 0,14 in Chloroform und Methanol im Verhältnis 19:1 haben und die R_f-Werte 0,60, 0,38, 0,24 und 0,15 in Chloroform haben. Die Wirkstoffe zeigen vier Peaks mit der Retentionszeit von 3,37, 3,49 4,0 und 5,69, Methanol wird als Lösungsmittel bei 254 nm verwendet. Das Extraktionsverfahren wird für einen Zeitraum, reichend von 1–120 h, vorzugsweise zwischen 12–16 h, ausgeführt.
In noch einer anderen Ausführungsform wird das Pflanzenmaterial mit geeigneten Lösungsmitteln wie beispielsweise Methanol oder Wasser oder Puffern in einem Perkolator extrahiert.
In sogar noch einer anderen Ausführungsform wird der Pflanzenextrakt, hergestellt durch das Methanol/das geeignete Lösungsmittel oder Wasser, unter vermindertem Druck eingeengt, um ein Gemisch zu erhalten, das die Wirkstoffe enthält.
In einer anderen Ausführungsform wurde das Konzentrat des Pflanzenextrakts lyophilisiert, um die Bestandteile im wesentlichen frei von Lösungsmittel oder Wasser zu machen.
In sogar noch einer anderen Ausführungsform wird der lyophilisierte Feststoff, erhalten als Gemisch von aktiven Faktoren, vorhanden in dem Blatt von Murraya koenigii, zur Linderung, Behandlung und Heilung eines Asthmaproblems verwendet.
Das Verfahren zur Herstellung der aktiven Faktoren umfaßt die folgenden Schritte:

1) Sammeln der frischen Blätter von den örtlichen Lieferanten,
2) Trocknen der Blätter im Schatten zu einem mäßigen Grad oder um die frischen Blätter als Ausgangsmaterial zu nehmen,
3) Pulverisieren der getrockneten oder Homogenisieren der frischen Blätter,
4) Eingeben des Pulvers oder Homogenisats in einen Perkolator unter das Volumen von geeigneten Lösungsmitteln; Auswählen von Kohlenwasserstofflösungsmitteln wie beispielsweise Petrolether (Kp. 40–60°C), Petrolether (Kp. 60–80°C), Pentan, Hexan, Benzol usw.; chlorierten Lösungsmitteln wie Chloroform, Dichlormethan, Tetrachlorkohlenstoff usw.; etherischen Lösungsmitteln wie beispielsweise Diethylether, Tetrahydrofuran, Dioxan usw.; ketonischen Lösungsmitteln wie beispielsweise Aceton, Cyclopentanon usw.; Esterlösungsmitteln wie beispielsweise Ethylacetat, Ethylformiat usw.; allen Alkoholen wie beispielsweise Methanol, Ethanol, n-Butanol usw.; Wasser und Puffern zur Extraktion,
5) Extrahieren des perkolierten Pflanzenmaterials unter Verwendung eines Perkolators für einen Zeitraum, der von 1 bis 12 Stunden reicht,
6) Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck bei einer Temperatur, die von 20 bis 80°C reicht,
7) Lyophilisieren oder Trocknen des Materials,
8) Lagern des verarbeiteten Materials an einem kühlen und trockenen Platz in einem luftdichten Behälter und
9) Bewerten der Bioaktivität des Materials.

Weiterhin stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, verwendbar bei der Behandlung von Asthma, bereit, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge von Extrakt, erhalten aus der Pflanze Murraya koenigii, zusammen mit Pulver oder Extrakten von Pflanzen, ausgewählt aus M. paniculata Linn, H. abelmoschus, T. ammi, S. aromaticum, A. vasica Nees, E. hirta und Murraya koenigii, umfaßt. Diese Zusatzstoffe sind in dem Bereich von 80–100 mg von M. paniculata Linn, 40–60 mg von H. abelmoschus, 38–62 mg von T. ammi, 7–13 mg von S. aromaticum, 85–115 mg von A. vasica Nees und 90–110 mg von E. hirta vorhanden.
In einer Ausführungsform umfaßt die Zusammensetzung:
Weiterhin stellt diese Erfindung eine Behandlung von Asthma bereit, wobei die Behandlung die Schritte umfaßt, eine wirksame Menge der Zusammensetzung an einen Patienten zu verabreichen, der ihrer bedarf.
In einer Ausführungsform wird der lyophilisierte Extrakt, erhalten aus Murraya koenigii, verabreicht, wie in Anspruch 11 beschrieben ist.
In noch einer anderen Ausführungsform ist die Art der Verabreichung oral für die Behandlung von mildem oder akutem Asthma.
In sogar noch einer anderen Ausführungsform liegt das Dosierungsniveau der Zusammensetzung, umfassend den Extrakt aus der Pflanze Murraya koenigii, zwischen 325–600 mg zweimal täglich für den Zeitraum, der von 3 bis 30 Tagen reicht.
In einer anderen Ausführungsform liegt das Dosierungsniveau zwischen 325–600 mg zweimal täglich für einen Zeitraum, der von 3 bis 15 Tagen für mildes asthmatisches Leiden und 15–30 Tagen für akutes asthmatisches Leiden reicht.
Wie vorstehend gesagt sind Zusatzstoffe in einem Bereich von 80–100 mg M. paniculata Linn, 40–60 mg H. abelmoschus, 38–62 mg T. ammi, 7–13 mg S. aromaticum, 85–115 mg A. vasica Nees, 90–110 mg E. hirta und 87–105 mg Murraya koenigii pro Dosis vorhanden.
Die Zusammensetzung kann in verschiedenen physikalischen Formen formuliert werden, die für orale oder systemische Verwendung geeignet sind, obwohl orale Verwendung empfohlen wird.
In einer anderen Ausführungsform werden die Zusatzstoffe, erhalten aus den Pflanzen M. paniculata Linn, H. abelmoschus, T. ammi, S. aromaticum, A. vasica Nees, E. hirta und Murraya koenigii, verabreicht, um der Zusammensetzung Eigenschaften wie beispielsweise durchfallbekämpfend, antiseptisch, karminativ, zur Stimulation, gegen Husten, gegen Bronchitis und als Nahrungsmittel zu verleihen.
In einer anderen Ausführungsform werden die Zusatzstoffe erhalten aus: M. paniculata Linn (Rinde oder Wurzel), H. abelmoschus aus getrockneten Blütenknospen, T. ammi aus Blättern, S. aromaticum aus der ganzen Pflanze, A. vasica Nees aus der Wurzel, E. hirta aus der Rinde und Murraya koenigii aus Blättern.
Außerdem stellt die Erfindung eine antioxidierend wirkende Zusammensetzung für Menschen und Tiere bereit, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge von Extrakt, erhalten aus der Pflanze Murraya koenigii, zusammen mit oder gegebenenfalls verbunden mit Zusatzstoffen umfaßt.
In noch einer anderen Ausführungsform umfassen die Zusatzstoffe Pulver oder Extrakte von Pflanzen, ausgewählt aus M. paniculata Linn, H. abelmoschus, T. ammi, S. aromaticum, A. vasica Nees, E. hirta und Murraya koenigii.
In einer Ausführungsform sind die Zusatzstoffe in dem Bereich von 80–100 mg M. paniculata Linn, 40–60 mg H. abelmoschus, 38–62 mg T. ammi, 7–13 mg S. aromaticum, 85–115 mg A. vasica Nees, 90–110 mg E. hirta und 87–105 mg Murraya koenigii pro Dosis der antioxidierend wirkenden Zusammensetzung vorhanden.
Wie vorstehend gesagt sind der aktive Faktor (die aktiven Faktoren) in Murraya koenigii zur Linderung, Behandlung und Heilung eines Asthmaproblems verwendbar, deren Herstellung umfaßt Trocknen, Pulverisieren und Extrahieren der getrockneten Blätter der Pflanze, Murraya koenigii, in einem Perkolator bei einer Umgebungstemperatur unter Verwendung geeigneter Lösungsmittel und Einengen des Extrakts unter vermindertem Druck und schließlich Lyophilisieren des Konzentrats, um die aktiven Faktoren herzustellen.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung angegeben und sollten daher nicht als Begrenzung des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden.
Sammeln von Pflanzenmaterial
Die Blätter von Murraya koenigii wurden aus verschiedenen Gebieten von West Bengal, Indien, von Sträuchern in den Monaten von März bis August 2000 gesammelt. Ein Belegexemplar ist bei dem Department of Medicinal Chemistry in dem Indian Institute of Chemical Biology, 4, Raja S. C. Mallick Road, Calcutta, 700 032, India, hinterlegt.
Extraktion der Wirkstoffe aus Murraya koenigii
BEISPIEL 1
Frisches Blatt enthaltende Zweige von Murraya koenigii wurden gesammelt, gesäubert und mit Wasser gewaschen und als Ausgangsmaterial verwendet. Es wurde im Schatten luftgetrocknet und das Trocknen wurde fortgesetzt, bis es spröde war, um es zum Pulverisieren in der Mischmühle geeignet zu machen.
87 g der pulverisierten Blätter von Murraya koenigii wurden in einen Glasperkolator (5-l-Kapazität) gegeben, wobei 1000 ml Methanol hinzugegeben wurden, um das Material zufriedenstellend unterzutauchen. Dies wurde für 12 bis 16 Stunden (über Nacht) bei Raumtemperatur gehalten. Filtration des Extrakts durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 wurde ausgeführt, um das Perkolat zu sammeln. Das Verfahren der Extraktion wurde vier Mal wiederholt und der vereinigte Extrakt wurde unter vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft, wobei die Temperatur bei 40°C (Bad) gehalten wurde. Der hinterlassene feste Rückstand war viskos im Aussehen, und er wurde durch Lyophilisierung weiter getrocknet. Die Ausbeute betrug 14,84 g und das Material wurde getestet und es wurde gefunden, daß es im sowohl Neutrophilen- oder auch ex-vivo-Blutsystem biologisch aktiv war.
BEISPIEL 2
Die luftgetrockneten Blätter von Murraya koenigii, die 90 g wogen, wurden pulverisiert und in einen Perkolator gebracht. Er wurde in 800 ml Chloroform eingetaucht. Das untergetauchte Material wurde für 12 bis 16 Stunden (über Nacht) durch das Lösungsmittel extrahieren gelassen. Der Extrakt wurde durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert und gesammelt; dieses Verfahren wurde drei Mal wiederholt. Der Extrakt wurde im Flashverdampfer unter vermindertem Druck bei 40°C zur Trockene eingedampft. Die rückständige Substanz wurde dann in einem Exsikkator unter Hochvakuum getrocknet und die feste Masse, die 11,5 g wog, wurde getestet und als biologisch aktiv gefunden.
BEISPIEL 3
150 g von frischen Blättern von Murraya koenigii, sorgfältig in sterilem Wasser gewaschen, wurden mit 750 ml glasdestilliertem Wasser in einem Mixer-Mischer homogenisiert und dann in einen Ultraschallbad mit 5 Bursts, jeweils für 15 min, mit Ultraschall behandelt. Filtrieren durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 wurde ausgeführt, um das in Wasser extrahierte Material abzutrennen. Diese Art von Behandlung zur Extraktion wurde drei Mal wiederholt. Der vereinigte Extrakt wurde lyophilisiert und ergab ein pulverförmiges Material mit einem Gewicht von 11 g. Dieses wurde dann auf biologische Aktivität getestet.
Eigenschaften der Materialien
Das durch die Beispiele 1 oder 2 oder 3 erhaltene biologisch aktive Material hat die folgenden Eigenschaften:

1. Der getrocknete Feststoff, hergestellt wie vorstehend angegeben, war ein dunkel gefärbtes Material, das in DMSO oder Dimethylsulfoxid löslich war.
2. Dünnschichtchromatographische Analyse des aktiven Materials zeigt vier Flecken mit den Rf-Werten 0,60, 0,38, 0,24 bzw. 0,15 und Rf 0,73, 0,60, 0,34 und 0,14 im Lösungsmittelsystem von Chloroform und Methanol, genommen im Verhältnis von 19:1.
3. Die HPLC-Analyse der Wirkstoffe, erhalten aus Murraya koenigii, wurde unter Verwendung der analytischen Säule Intersil ODS-3 (4,6 × 250 mm) mit Methanol als dem Lösungsmittelsystem und einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min ausgeführt. Der Nachweis bei 254 nm löste das Material in vier Peaks mit den Retentionszeiten 3,37, 3,49, 4,00 bzw. 5,69 min auf.

BEWERTUNG DER ANTIOXIDIEREND WIRKENDEN AKTIVITÄT IN EINEM IN-VITRO-SYSTEM
Die biologische Bewertung wurde nach der folgenden Verfahrensweise ausgeführt.
a) Hemmung der Arachidonsäureoxidation in Anwesenheit des aktiven Materials durch neutrophilen Granulozyten
Neutrophiler Granulozyt von menschlichem peripheren Blut wurde nach einem Standardverfahren [Downey, G. P., Fukushima, T., Fialkow, L. und Waddel, T. K. (1995) Semin. Cell. Biol. 6 345] hergestellt. Kurz gesagt wurde heparinisiertes Blut mit 2% Gelatine (in normaler Kochsalzlösung) für eine halbe Stunde behandelt, um die Absonderung der roten Blutkörperchen am Boden zu erlauben. Der Rest des Gemisches wurde genommen und einer Gradiententrennung unter Verwendung von Histopaque unterworfen. Das Zentrifugieren wurde mit 1400 U/min bei Raumtemperatur für 12 min ausgeführt. Der neutrophile Granulozyt, der als abgetrennte Schicht am Boden zugänglich war, wurde gesammelt und in sterilem PBS oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung in eine Suspension überführt.

(i) Der neutrophile Granulozyt (1 × 10⁴/Vertiefung einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen) wurde mit aktivem Material (20 g/ml), d.h. dem Extrakt, erhalten in den vorstehenden Beispielen 1, 2 und 3, für 60 min behandelt, während die Kontrolle keinerlei aktives Material enthielt.
(ii) Der neutrophile Granulozyt wurde mit Phorbolmyristatacetat (PMA) (10 M) für 30 min sensibilisiert mit nachfolgender Zugabe von aktivem Material (20 g/ml) oder ohne es für 30 min.
(iii) Der neutrophile Granulozyt, behandelt für 30 min mit aktivem Material (dem Extrakt) (20 g/ml), nachfolgend Aktivierung mit PMA (10 M) für 30 min.

Der Sauerstoffverbrauch durch den behandelten neutrophilen Granulozyten wurde nach 10 Minuten der Zugabe von Arachidonsäure 10,2 μl (12,2 mg/ml in absolutem Alkohol) (Method. Enzymol. Hrsg. von Murphy, R. C., und Fitzpatrick, F. A., Bd. 187, S. 268, in 2 ml Volumen der Neutrophilensuspension gemessen. Die Prüfung des Sauerstoffverbrauchs wurde mit einem Sauerstoffsensor ausgeführt (von Hansatec mit O₂-Elektrodensteuerung mit Sonde vom Clark-Typ). Die Ergebnisse der Hemmung des Sauerstoffverbrauchs aufgrund der Arachidonsäureoxidation sind in Tabelle-1 angegeben.
TABELLE 1 Hemmung der Arachidonsäureoxidation durch neutrophilen Granulozyten
Calciumionophor ergab bessere Ergebnisse, weil es etwa 60% Hemmung gab, während PMA 46% Hemmung des O₂-Verbrauchs durch aktives Material, vorhanden im Murraya-koenigii-Blatt, im in-vitro-Neutrophilentest bewirkt. Bei beiden Stimulierungen zeigt die bemerkenswerte Hemmung des O₂-Verbrauchs durch die Stimulierung die Wirksamkeit des Materials an.
Die Ergebnisse in Tabelle-1 veranschaulichten, daß die aktiven Faktoren im Murraya-koenigii-Blatt als Inhibitor des Sauerstoffverbrauchs in Gegenwart von normalem wie auch aktiviertem menschlichen neutrophilen Granulozyten und Arachidonsäure wirkten. Dies läßt darauf schließen, daß die Oxidation von Arachidonsäure durch aktive Faktoren, vorhanden in Murraya-koenigii-Blättern, stark gehemmt wird. Die Leukotriene sind die biologischen Mediatoren von Asthma und die Oxidation von Arachidonsäure ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Synthese der Leukotriene. Die Strategie der Asthmaarzneimittelentwicklung ist es, Verbindungen zu suchen oder zu synthetisieren oder Substanzen herzustellen, die die Synthese von Leukotrienen hemmen oder präzise die Hemmung der Oxidation von Arachidonsäure verursachen. Das aktive Material oder die Verbindungen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellt werden, hemmen nicht nur die Oxidation von Arachidonsäure, sondern sind auch frei von Toxizität und verträglich zur Verwendung bei Menschen, da die Pflanzenblätter ausgiebig als Nahrungsmittelbestandteile verwendet werden. Deshalb qualifiziert es sich als Arzneimittel für Asthma.
b) Hemmung der Arachidonsäureoxidation in Anwesenheit des aktiven Materials durch menschliches ex-vivo-Blut.
500 μl heparinisiertes menschliches Vollblut wurden in jede Vertiefung einer Mikrometerplatte mit 6 Vertiefungen gebracht, in die das aktive Material aus Murraya koenigii oder nichts gegeben wurde, um eine endgültige Konzentration von 50 g/ml zu haben, wenn das Gesamtvolumen mit PBS auf 2 ml eingestellt wurde. Die Platten wurden bei konstantem Schütteln für 2 Stunden inkubiert. Danach wurden 10 μl Arachidonsäure (12,2 g/ml in absolutem Alkohol, aufbewahrt unter Argon bei –200°C; Method. Enzymol. Hrsg. von Murphy, R. C. und Fitzpatrick, F. A. Bd. 187, S. 268) für 10 min in jede Vertiefung gegeben, bevor Phorbolmyristatacetat (PMA, 10M) oder Calciumionophor A23187 (20 g/ml), (Spaethe S. M., Snyder D. W., Pechous, P. A., Clarke T., VanAlstyne E. L., Biochem. Pharmacy, 43; 1992, 377–82) hinzugegeben wurde. Nach 30 min der Zugabe des Stimulators überwachte eine YSI-Clark-Sauerstoffsonde, die eine sauerstoffüberwachende Ausstattung enthielt, den Sauerstoffverbrauch. TABELLE-2 Hemmung von Arachidonsäure in menschlichem ex-vivo-Vollblut in Anwesenheit von Murraya-koenigii-Blattmaterial

* Patient mit Eosinophil-Zählung 13 mit 7 Jahren chronischem Asthma.

Es wurde auch gefunden, daß der Blattextrakt von Murraya koenigii bei dem Nitroblau-Tetrazolium-Reduktionstest hochwirksam war, was anzeigt, daß der Extrakt ein kraftvolles Antioxidationsmittel ist.
Wieder wurde der Nitroblau-Tetrazolium-(NBT)-Reduktionstest nach dem Standardverfahren ausgeführt [Rouiller, Y. B., und Manuel, J. (1987) Infec. Immun. 55, 587]. Neutrophiler Granulozyt wurde hergestellt und mit oder ohne PMA (30 min) und nachfolgend Blattextrakt von Murraya koenigii (60 min) oder ohne es behandelt. Dann wurden 100 μl NBT-Lösung (3 mg/ml) hinzugegeben und Zellen wurden für verschiedene Zeitabschnitte (0 bis 120 min) inkubiert. Die Formazanabscheidung wurde bei 550 nm in einem ELISA-Lesegerät gemessen (Labsystem Multi Skan MS). Die Ergebnisse zeigten, daß die Aktivierung von neutrophilem Granulozyten mit PMA stark gehemmt war, etwa um das 6-fache in Anwesenheit des aktiven Materials aus den Murraya-koenigii-Blättern bei 120 min. Die Blattzubereitung hat starke antioxidierend wirkende Eigenschaft, die eine starke Unterstützung gewährt, um von dem Leiden, das bei Asthma auftritt, wieder gesund zu werden.
BEWERTUNG VON M. koenigii FÜR ASTHMA
Die Blätter dieser Pflanzen werden häufig als Geschmacksverstärker in südindischer zubereiteter Nahrung verwendet. Jedoch denaturiert Erhitzen der Blätter ihre antiasthmatische Eigenschaft. Ihre Verwendung als Kochgegenstand oder in der Nahrungsmittelrezeptur ist seit Jahrhunderten bekannt und es ist noch kein ungünstiges Ereignis ersichtlich, was anzeigt, daß alle Komponenten dieses Blatts völlig sicher für den menschlichen Verzehr sind. Die Verwendung dieser Pflanze speziell in südindischer Nahrung erzeugte niemals Darmbeschwerden oder Erbrechen oder Magenverstimmung oder irgendein anderes Problem. Insbesondere ist sie weder bitter im Geschmack noch seltsam im Geschmack. Nach dem Einnehmen der Blattzubereitung wurde von keinem der gesunden Freiwilligen über Darmbeschwerden oder Erbrechen oder Magenverstimmung oder irgendein gastrointestinales Problem berichtet. Aus allen diesen Informationen ist es ziemlich überzeugend, daß eine beliebige Zubereitung aus diesem Blatt als Arzneimittel für Asthma absolut sicher ist.
Der aus der Pflanze Murraya koenigii erhaltene Extrakt zeigt Eigenschaften, die ihn bei der Behandlung von Asthma verwendbar machen. Dementsprechend können Zusammensetzungen, die den Extrakt, vorzugsweise den lyophilisierten Extrakt, umfassen, für die Behandlung von Asthma bei Menschen verwendet werden. Der Extrakt erscheint, wenn er getrocknet ist, als dunkle Feststoffe. Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend den Extrakt dieser Pflanze zusammen mit Zusatzstoffen, können in einer Vielzahl von physikalischen Formen, wie beispielsweise Tabletten, Pulver, Sirupe oder andere eßbare Produkte, hergestellt werden. Für die Zubereitung von Tabletten werden etwa 80–120 mg des Extrakts aus der Pflanze verwendet. Die so hergestellten Tabletten können im allgemeinen gekaut oder geschluckt werden. Die Zusammensetzung hat keine Nebenwirkungen und kann ohne ungebührliche Einschränkung verwendet werden. Die Zusammensetzung wurde zweimal täglich über einen Zeitraum von 30 Tagen eingenommen, und jeder von den gesunden Freiwilligen hat ohne irgendwelche Klagen gefunden, daß sie vollkommen zufriedenstellend war.
Ein Beispiel der gemäß der Erfindung hergestellten Zusammensetzung wird hier nachstehend veranschaulicht.
Nachstehend finden sich repräsentative Beispiele von Fallstudien, bei denen Patienten die Zusammensetzung der Erfindung verabreicht wurde. Alle diese Patienten litten an Asthma, obwohl die Chronizität der Krankheit von Fall zu Falle variierte.
Fünf Freiwillige (sowohl weiblich als auch männlich) wurden im Hinblick auf ihr asthmatisches Leiden in Abhängigkeit von ihrer Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen verursachenden Mitteln, die ihr Asthma manifestieren, ausgewählt.
FALLSTUDIEN:
FALL I
Eine Patientin, bekannt dafür, seit den letzten sieben Jahren an staub- und kälteempfindlichem schweren Asthma zu leiden. Brustenge, Keuchen, Husten, schwere Kurzatmigkeit, nächtliche Schlaflosigkeit und starke Schleimabsonderung während der späten Nachtstunden waren die primären Symptome. Sie mußte den Inhalator zwei- oder dreimal täglich benutzen.
Zur Medikation wurden von ihr zwei Löffel voll der Zubereitung der ganzen Pflanze zweimal täglich für fünfzehn Tage eingenommen. Die beobachteten Auswirkungen dieser Medikation:

a) Sie brauchte den Inhalator außer gelegentlich einmal am Tag nicht zu benutzen.
b) Keuchen und Husten hatten völlig aufgehört.
c) Sie war völlig frei von Brustenge.
d) Sie erschien physisch normal und imstande zu anstrengenden Aktivitäten, wie Wandern, Treppensteigen bis in den dritten Stock.

FALL II
Zwei freiwillige Patienten (einer männlich und ein anderer weiblich) mit genetischer Prädisposition für Asthma, leidend an Schlaflosigkeit während der Nachtzeit, sehr anfällig für asthmatisches Leiden, resultierend aus Empfindlichkeit gegenüber Verschmutzung, und Kurzatmigkeit, sie mußten einen Inhalator nehmen, wenn es einen schweren nächtlichen Anfall gab. Sie folgten der Medikation wie im Fall-1 für einen Monat.

i) Bis zum neunten Monat der Beobachtung hatten sie keinerlei asthmatischen Anfall,
ii) Von ihnen wurde über keine Kurzatmigkeit berichtet,
iii) Im Fall des Patienten war Rauchen ein Risikoverstärker für häufige Episoden eines Asthmaanfalls. Aber er hatte keinerlei Atembeschwerden, sogar wenn er gelegentlich mehr als gewöhnlich rauchte.
iv) Früher hatte die Patientin Kurzatmigkeit, während sie lange Wanderungen machte oder Treppen nur bis zum ersten Stock stieg, aber nach der Behandlung hatte sie keine der vorstehend beschriebenen Schwierigkeiten mit der Atmung, sogar wenn sie bis zum dritten Stock stieg.

FALL III
Ein anderer junger freiwilliger Patient, der an periodischem schweren Anfall mit akuter Kurzatmigkeit leidet und oft zur Versorgung mit frischem Sauerstoff ins Krankenhaus gebracht werden mußte, um aus akutem Atemzustand befreit zu werden.
Während einer derartigen Episode eines akuten Anfalls von Kurzatmigkeit nahm er die Blattzubereitung ein, und die beobachteten Auswirkungen waren:

i) Er mußte nicht ins Krankenhaus gehen,
ii) Seitdem nahm er diese Medikation für einen Monat ein und
iii) Seine alltäglichen Aktivitäten haben sich bemerkenswert erhöht und seit dem Tag gab es kein Auftreten von hochakuten Atemberschwerden.

FALL IV
Eine ältere Patientin, die an Schlaflosigkeit während der Nacht und extremer Kurzatmigkeit leidet und kein Ansprechen auf moderne Medikation einschließlich Inhalator zeigt.
Ihr wurde die Blattzubereitung verabreicht, die zweimal täglich für fünfzehn Tage eingenommen werden mußte, und ihr Leiden hat sich bemerkenswert gebessert.
So stellt die Anmeldung hier ein einfaches, schnelles und preisgünstiges Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung aus einer reichlich verfügbaren Pflanze zur Linderung, Behandlung und zufriedenstellenden Heilung eines Asthmaproblems bereit. Das Verfahren der Verabreichung des Pflanzenmaterials ist ebenfalls einfach. Die Erfolgsrate unter den Freiwilligen ist 100%. Es gab keinen Fall eines Rückfalls während der Beobachtungszeit von 6 Monaten. Nach der Behandlung wurden keine nachteiligen oder Nebenwirkungen beobachtet.
Die Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung sind:

1. Es wird erwartet, Linderung, Behandlung und Heilung eines Asthmaproblems zufriedenstellend bereitzustellen.
2. Es wird aus einem Pflanzenmaterial hergestellt, das seit Jahrhunderten in der Nahrung verwendet worden ist, biokompatibel und nicht toxisch ist.
3. Die Pflanze ist reichlich verfügbar.
4. Das Verfahren der Herstellung des aktiven Materials/Wirkstoffs ist einfach, schnell und preisgünstig.
5. Ihre Kultivierung und Vermehrung ist leicht, da sie auf jeder Art von Boden wächst.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Asthma, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge von Extrakt, erhalten aus der Pflanze Murraya koenigii, zusammen mit Pulver oder Extrakten der Pflanzen M. paniculata Linn, H. abelmoschus, T. ammi, S. aromaticum, A. vasica Nees und E. hirta umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Pulver oder die Extrakte in dem Bereich von 80–100 mg von M. paniculata Linn, 40–60 mg von H. abelmoschus, 38–62 mg von T. ammi, 7–13 mg von S. aromaticum, 85–115 mg von A. vasica Nees und 90–110 mg von E. hirta vorhanden sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 in Tablettenform, wobei der Extrakt der Pflanze Murraya koenigii in dem Bereich 80–120 mg vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Extrakt der Pflanze Murraya koenigii in dem Bereich von 87–105 mg pro Dosis vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Pulver oder die Extrakte in einer Menge von 90 mg von M. paniculata Linn, 50 mg von H. abelmoschus, 50 mg von T. ammi, 10 mg von S. aromaticum, 100 mg von A. vasica Nees und 100 mg von E. hirta und 100 mg von Murraya koenigii pro Dosis vorhanden sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Extrakt der Pflanze Murraya koenigii Wirkstoffe umfaßt, welche dunkel gefärbte Feststoffe, löslich in Dimethylsulfoxid, sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Wirkstoffe, erhalten aus der Pflanze Murraya koenigii, biokompatibel und nichttoxisch in der Beschaffenheit sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Extrakt aus der Pflanze Murraya koenigii, wenn der Chromatographie unterworfen, Wirkstoffe mit den R_f-Werten 0,73, 0,60, 0,34 bzw. 0,14 in Chloroform zeigt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Extrakt aus der Pflanze Murraya koenigii, wenn der Chromatographie mit Methanol und Chloroform in dem Verhältnis 19:1 unterworfen, die R_f-Werte 0,60, 0,38, 0,24 bzw. 0,15 zeigt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Wirkstoffe in dem Extrakt aus der Pflanze Murraya koenigii vier Peaks mit den Retentionszeiten 3,37, 3,49, 4,0 bzw. 5,69 in Methanol als Lösungsmittel bei 254 nm zeigen.
Verwendung von Extrakt, erhalten aus der Pflanze Murraya koenigii, zusammen mit Pulver oder Extrakten der Pflanzen M. paniculata Linn, H. abelmoschus, T. ammi, S. aromaticum, A. vasica Nees und E. hirta für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Asthma.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung oral für die Behandlung von mildem oder akutem Asthma verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Dosierungsniveau der Zusammensetzung zwischen 325–600 mg zweimal täglich für einen Zeitraum, reichend von 3 bis 30 Tagen, liegt.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Dosierungsniveau zwischen 325–600 mg zweimal täglich für einen Zeitraum, reichend von 3 bis 15 Tagen für mildes asthmatisches Leiden und 15–30 Tagen für akutes asthmatisches Leiden, liegt.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Pulver oder die Extrakte in einem Bereich von 80–100 mg von M. paniculata Linn, 40–60 mg von H. abelmoschus, 38–62 mg von T. ammi, 7–13 mg von S. aromaticum, 85–115 mg von A. vasica Nees, 90–100 mg von E. hirta und 87–105 mg von Murraya koenigii pro Dosis vorhanden sind.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Pulver oder die Extrakte in einer Menge von 90 mg von M. paniculata Linn, 50 mg von H. abelmoschus, 50 mg von T. ammi, 10 mg von S. aromaticum, 100 mg von A. vasica Nees, 100 mg von E. hirta und 100 mg von Murraya koenigii pro Dosis vorhanden sind.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Pulver oder die Extrakte von M. paniculata Linn, H. abelmoschus, T. ammi, S. aromaticum, A. vasica Nees, E. hirta und Murraya koenigii verabreicht werden, um Eigenschaften, ausgewählt aus durchfallbekämpfend, antiseptisch, karminativ, zur Stimulation, gegen Husten, gegen Bronchitis und als Nahrungsmittel einzuschließen.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Pulver oder die Extrakte als: M. paniculata Linn, aus Rinde oder Wurzel, H. abelmoschus, aus getrockneten Blütenknospen, T. ammi, aus Blättern, S. aromaticum, aus der gesamten Pflanze, A. vasica Nees, aus der Wurzel, E. hirta aus Rinde und Murraya koenigii aus Blättern erhalten werden.
Antioxidierend wirkende Zusammensetzung für Menschen und Tiere, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge von Extrakt, erhalten aus der Pflanze Murraya koenigii, zusammen mit Pulver oder Extrakten der Pflanzen M. paniculata Linn, H. abelmoschus, T. ammi, S. aromaticum, A. vasica Nees und E. hirta umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei das Pulver oder die Extrakte aus M. paniculata Linn, H. abelmoschus, T. ammi, S. aromaticum, A. vasica Nees, E. hirta und Murraya koenigii in der Form von Rinde oder Wurzel; Samen; Frucht; getrockneten Blütenknospen; Blättern; der ganzen Pflanze bzw. Wurzel, Rinde, Blättern sind.