DE60028368T2

DE60028368T2 - Agonisten des peroxisom aktivator-responsiven rezeptors

Info

Publication number: DE60028368T2
Application number: DE60028368T
Authority: DE
Inventors: Teruo Uji-shi KAWADA; Kazuo Hakodate-shi MIYASHITA; Tadayoshi Takasago-shi SHIRAISHI; Masayuki Takasago-shi ABE; Masakazu Akashi-shi KATO; Takehiko Kobe-shi OFUJI
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 1999-04-15
Filing date: 2000-04-13
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2020-04-14
Also published as: AU775774B2; EP1175901B1; DE60028368D1; EP1175901A4; EP1175901A1; AU3678600A; AU775774C; WO2000062772A1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft einen Agonisten, der eine Aktivität zur Förderung der Bindung eines Peroxisom Proliferator-aktivierten Rezeptors (nachstehend abgekürzt als „PPAR") an eine Zielgen-Sequenz und zur Förderung der Genexpression stromabwärts davon aufweist (der Agonist wird nachstehend als „PPAR-Agonist" und die Aktivität als „PPAR-Agonisten-Aktivität" bezeichnet), sowie die Verwendung des PPAR-Agonisten zur Verminderung von viszeralem Fett (Bauchfett), zur Unterdrückung der Anreicherung von viszeralem Fett (Bauchfett), oder zur Verbesserung von Lipidstoffwechselabnormalitäten in Menschen oder Tieren, insbesondere Säugern.
Hintergrund der Erfindung
In Folge einer alternden Gesellschaft besteht ein erhöhter Bedarf an Nahrungsmitteln/Getränken und Arzneimitteln, die wirksam bei der Prävention/Behandlung von Krankheiten des Menschen sind, die mit dem Lebensstil in Verbindung stehen, wobei repräsentative Beispiele Diabetes, Atherosklerose, Bluthochdruck, Hyperlipidämie, Fettleber und Krebs sind. Darüber hinaus sind heutzutage Fettsucht und Diabetes in Haustieren ein Problem und es gibt Aufrufe zur Entwicklung von Nahrungsmitteln und Tierarzneimitteln zur Vorbeugung gegen diese Krankheiten bzw. zur Behandlung davon. Aufgrund kürzlich gemachter Fortschritte in der Erforschung der Fettsucht ist in verstärktem Maße klar geworden, dass Fettsucht – und insbesondere Fettsucht, die mit der Vermehrung von viszeralem Fett (Bauchfett) in Zusammenhang steht – ein wichtiger Risikofaktor bei mit dem Lebensstil in Zusammenhang stehenden Krankheiten ist (Takahashi et al., „Programm und Zusammenfassungen der 19. japanischen Fettsuchtkonferenz" („Program and Abstracts of the 19th Japanese Obesity Conference"), S. 64, 1998 (in japanisch)). Man hofft daher darauf, dass es möglich sein wird, mit dem Lebensstil in Verbindung stehende Krankheiten durch Verminderung der Fettsucht, die mit der Vermehrung von viszeralem Fett (Bauchfett) in Zusammenhang steht, zu behandeln oder zu lindern.
Fettgewebe, das das wichtigste Organ der Anreicherung von viszeralem Fett (Bauchfett) ist, wurde in der Vergangenheit lediglich als ein Ort zur Speicherung von Fettüberschuss angesehen. Aufgrund kürzlich gemachter Fortschritte in der Erforschung der Fettzellen ist klar geworden, dass Fettgewebe nicht lediglich ein Ort zur Speicherung der überschüssigen Energie des Körpers ist, sondern auch ein Organ, das verschiedene physiologisch aktive Stoffe sezerniert und somit eine aktive Rolle in der Energiesteuerung spielt. Man glaubt, dass PPARs, die intranukleare Rezeptoren sind, eine wichtige Rolle bei der funktionellen Steuerung im Fettgewebe spielen. PPARs werden so genannt, da sie durch Stoffe verschiedener Strukturen aktiviert werden, die an der Proliferation von Peroxisomen, intrazellulären Organellen, teilhaben (Issemann et al., Nature 347, 645–650). cDNAs aus verschiedenen Tieren, einschließlich dem Menschen sowie aus Geweben sind kloniert worden und gegenwärtig sind drei Subtypen an PPARs bekannt, nämlich α, β und γ. Diese werden PPARα, PPARβ (oder manchmal PPARδ, FAAR oder NUC1) bzw. PPARγ genannt. PPARα kommt hauptsächlich in Hepatozyten vor, PPARβ wird in großen Mengen im Herzen, der Lunge und den Nieren gefunden und PPARγ in großen Mengen in Fettzellen. Alle PPAR-Subtypen führen ihre Funktionen durch Bildung eines Heterodimeren mit einem Rhetinoid X-Rezeptor (RXR), Bindung an eine PPAR-responsive Sequenz stromaufwärts eines Zielgens und Steuerung der Transkription des Zielgens aus (Lemberger et al., Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 12 (1996), 335–363). Beispiele bekannter PPAR-Zielgene schließen das Gencluster für den Sättigungsfaktor Leptin, Lipoprotein-Lipase, die in die Aufnahme von Fettsäuren involviert ist, Fettsäuretransporter, Fettsäure-bindende Proteine, die in den Fettsäuretransport involviert sind, Malatdehydrogenasen, die in die Fettsäuresynthese involviert sind, Phosphoenolpyruvatcarboxykinase, Acyl-CoA-Synthetase, die in die β-Oxidation involviert ist, Acyl-CoA-Oxidase, Ketoacyl-CoA-Thiolase und weitere ein, wie auch das Gen für das Entkopplungsprotein 1 (UCP-1), das in die Wärmebildung bei braunem Fettgewebe involviert ist. All diese Zielgenprodukte sind Proteine, die eine wichtige Rolle in der Steuerung des Lipidmetabolismus, des Glukosemetabolismus und des Energieumsatzes im Körper spielen und daraus wird gefolgert, dass PPARs wichtige Proteine bezüglich der Steuerung von Lipidsynthese, -abbau und -metabolismus, Glucosemetabolismus und Energieumsatz im Körper sind (Kawada, Igaku no Ayumi, 184 (1998), 519 (in japanisch); Kawada, Rinshoi, 23 (1997), 1300 (in japanisch); Shinra, Igaku no Ayumi, 184 (1998), 513 (in japanisch)). Insbesondere ist für PPARγ als Ergebnis der von Tontonz et al. durchgeführten Versuche zur Expression eines in Fibroblasten eingeführten PPARγ-Gens gezeigt worden, dass PPARγ ein wichtiger Faktor bei der Steuerung der Fettzelldifferenzierung ist (Cell 79 (1994), 1147–1156). Man erwartet daher, dass Stoffe, die PPAR-Agonisten-Aktivität aufweisen, den Abbau und Metabolismus von Fetten erhöhen, den Energieumsatz steigern, Körperfett und insbesondere viszerales Fett (Bauchfett) reduzieren und günstig auf Unregelmäßigkeiten des Fettstoffwechsels wirken (Kawada, Igaku no Ayumi, 184 (1998), 519 (in japanisch); Kawada, Rinshoi, 23 (1997), 1300 (in japanisch); Shinra, Igaku no Ayumi, 184 (1998), 513 (in japanisch)).
Darüber hinaus ist bekannt, dass Thiazolidine, die PPARγ-Agonisten sind, Abnormalitäten des Glukosemetabolismus in hohem Maße verbessern, wie Insulinresistenz in Typ II-Diabetes Patienten. Der zugrunde liegende Mechanismus ist nicht ausreichend aufgeklärt, man glaubt jedoch, dass PPARγ-Agonisten die Differenzierung von Fettzellen fördern und als Ergebnis davon die Produktion von TNFα, einem Insulinresistenz induzierenden Stoff, hemmen, die Glukosetransporter (Glut 4)-Expression in peripherem Gewebe fördern und die Menge an freien Fettsäuren mindern. Man geht ferner davon aus, das als Ergebnis davon die Glukoseaufnahme in Zellen erhöht wird und Hyperglykämie günstig beeinflusst wird (Kawada, Saishin Igaku, 53 (1998), 402 (in japanisch); Araki et al., Igaku no Ayumi 188 (1999), 500 (in japanisch); J.M. Lehmann et al., J. Biol. Chem., 270 (1995), 12953; T. Fujiwara et al., Diabetes 37 (1988), 1549). Darüber hinaus ist berichtet worden, dass PPAR-Agonisten die Zellproliferation stoppen und die Zelldifferenzierung fördern (S. Kitamura et al., Jpn. J. Cancer Res. 90 (1999), 75).
Es ist wohl bekannt, dass die Ansammlung von viszeralem Fett (Bauchfett), Unregelmäßigkeiten des Fettstoffwechsels und des Glukosestoffwechsels wichtige Risikofaktoren bei Erkrankungen sind, die mit dem Lebensstil zusammenhängen wie Hyperlipidämie, Diabetes, Bluthochdruck, Atherosklerose, Fettleber und Herzerkrankungen. Stoffe, welche diese Risikofaktoren mindern, werden daher als vielversprechend als Nahrungsmittel/Getränk, medizinische und Tierfutterzusammensetzungen angesehen, die verschiedene mit dem Lebensstil zusammenhängende Erkrankungen verhindern oder günstig beeinflussen (Mizukami et al., Saishin Igaku 53 (1998), 402 (in japanisch)).
Echte PPAR-Agonisten, die eine physiologische Funktion im Körper erfüllen, sind bislang noch nicht identifiziert worden. Jedoch ist bekannt, dass langkettige Fettsäuren, Leukotrien B4, Clofibrate und Carbaprostacyclin PPARα-Agonisten-Aktivität aufweisen, dass langkettige Fettsäuren, Carbaprostacyclin und Bezafibrin-Säure PPARβ-Agonisten-Aktivität besitzen und dass Thiazolidine (z.B. Troglitazon), 15-Deoxy-Δ ^12,14-Prostaglandin J₂, Indomethacin und hoch-ungesättigte Fettsäuren PPARγ-Agonisten-Aktivität zeigen (Kawada, Saishin Igaku, 53 (1998), 402 (in japanisch); Kawada, Igaku no Ayumi, 184 (1998), 519 (in japanisch); S.A. Kliewer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 4318). Darüber hinaus ist kürzlich berichtet worden, dass konjugierte Linolsäure (nachstehend mit "CLA" abgekürzt) PPARα-, B- und γ-Agonisten-Aktivität aufweist (K.L. Houseknecht, Biochem. Biophys. Res. Comm. 244 (1998), 678; S.Y. Moya-Camarena et al., Biochemica et Biophysica Acta 1436 (1999), 331). Wie klar aus diesen Berichten hervorgeht, ist die Ligandenselektivität unter den verschiedenen PPAR-Subtypen recht breit und eine der Eigenschaften der PPARs ist, dass ein Stoff, welcher als Agonist für einen bestimmten Subtyp wirkt, oft auch als Agonist bei den anderen Subtypen wirkt.
Von den Stoffen, die PPAR-Agonisten-Aktivität aufweisen, zeigen CLA und Fischöle mit hohen Konzentrationen an Docosahexensäure (nachstehend als „DHA" abgekürzt) auch diätische Wirkungen (K.L. Houseknecht, Biochem. Biophys. Res. Comm. 244 (1998), 678; veröffentlichte japanische Übersetzung der PCT-Anmeldung H10-508189; T. Kawada et al., J. Agr. Food Chem. 46 (1998) 1225). CLA wird als Gesundheitsnahrung („Health Food") unter den Markennamen Tonalin (eingetragene Marke) und Kassei Rinooru (eingetragene Marke) vermarktet. Fischöle, die große Mengen an DHA enthalten, werden ebenfalls als Bestandteile von Gesundheitsnahrung vermarktet. CLA und Fischöle, die hohe Gehalte an DHA aufweisen, sind jedoch für eine wirksame Verminderung an viszeralem Fett (Bauchfett) oder eine wirksame Unterdrückung der Ansammlung von viszeralem Fett (Bauchfett) nicht ausreichend. Es bleiben auch Ängste hinsichtlich der Sicherheit bestehen. Beispielsweise hat man gefunden, dass CLA in einer ausreichend wirksamen Dosis Nebenwirkungen wie die Vergrößerung der Leber bewirkt (D.B. West et al., Am. J. Physiol. 275 (1998), R667). Ferner schmecken CLA wie auch DHA unangenehm und werden als Gesundheitsnahrung daher in Kapselform oder ähnlicher Form verwendet, wobei viele Probleme bei der Verwendung von CLA und DHA in üblichen Nahrungsmittel-/Getränke-, medizinischen und Tiernahrungs-Zusammensetzungen verbleiben. Weiterhin sind sowohl CLA wie auch DHA teuer und daher ist ihr Einsatz in üblichen Nahrungsmittel- oder Tiernahrungs-Zusammensetzungen beschränkt. Es besteht daher ein Bedarf an der Entwicklung von Nahrungsmittel-/Getränke-, medizinischen und Tiernahrungs-Zusammensetzungen, die hervorragende Wirkungen bei der Verminderung von viszeralem Fett (Bauchfett) und der Hemmung/Prävention des Ansetzens von viszeralem Fett (Bauchfett) aufweisen, darüber hinaus sicher und stark wirksam sind, ausgezeichnet schmecken usw. sowie ökonomisch sind. Weiterhin besteht ein Bedarf für die Entwicklung von Verwendungen davon.
Des weiteren werden Clofibrate als Arzneimittel eingesetzt, um Unregelmäßigkeiten des Fettstoffwechsels wie Hyperlipidämie, günstig zu beeinflussen. Thiazolidine (z.B. TZD) werden verwendet als Arzneimittel gegen Typ II Diabetes und wirken günstig auf die Insulinresistenzwerte. Es besteht jedoch immer noch ein Bedarf an sichereren und wirksameren neuen Zusammensetzungen.
Weiterhin ist berichtet worden, dass cis-Parinarsäure, die eine konjugierte Tetraensäure ist, an das PPARγ-Protein bindet. PPARγ-Agonisten-Aktivität ist jedoch nicht bestätigt worden (C.N.A. Palmer und C.R. Wolf, FEBS Letters 431 (1998), 476). Darüber hinaus ist bekannt, dass cis-Parinarsäure in der Natur lediglich in begrenzten Mengen aus stark limitierten Quellen wie Balsamsamen vorkommt und schon deshalb ist deren industrieller Einsatz problematisch.
Wie vorstehend beschrieben, sind Fischöle mit hohen DHA-Gehalten und CLA im Stand der Technik als Ölzusammensetzungen mit PPAR-Agonisten-Aktivität bekannt, beide weisen jedoch schlechte Wirkungen auf die Verminderung von viszeralem Fett (Bauchfett) auf oder es treten andere Probleme hinsichtlich Geschmack, Schmackhaftigkeit, Kosten und Ähnlichem auf, wenn in Nahrungsmitteln/Getränken verwendet, was dazu geführt hat, dass diese keine weite Verbreitung als Nahrungsmittel-/Getränke-Zusammensetzungen gefunden haben. Ferner sind Clofibrate und Thiazolidine als Arzneimittel-Zusammensetzungen bekannt, weisen jedoch unzureichende Wirkungen bei der Verminderung von viszeralem Fett (Bauchfett) auf. Daher wird nach Zusammensetzungen verlangt, die eine größere Aktivität aufweisen und sicherer sind.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung von Verfahren zur Verminderung von viszeralem Fett (Bauchfett) oder zur Unterdrückung der Anreicherung von viszeralem Fett (Bauchfett), zur günstigen Beeinflussung von Abnormalitäten im Lipidstoffwechsel und im Glukosestoffwechsel und zur Prävention oder Behandlung von Krebs, wobei ein neuer PPAR-Agonist mit hoher Aktivität eingesetzt wird.
Es ist berichtet worden, dass Parinarsäure einen zytotoxischen Effekt auf maligne Zellen ausübt (Palmer und Wolf, FEBS Letters 431 (1998), 476–480, Cornelius et al., Cancer Res. 51 (1991), 6025–6030) und nützlich in der Therapie von Krebs und Atherosklerose ist (EP-A 0 606 012). Die Verwendung von Tungöl-Fettsäurezusammensetzungen für die Behandlung von Neoplasien ist in der US-A 4,851,437 offenbart. Die Ernährungseigenschaften und diätischen Wirkungen von α-Elaeostearinsäure sind in Dhar et al., Lipids 34 (1999), 109–114 und Dhar et al., Ann. Nutr. Metab. 42 (1998), 290–296 untersucht.
Offenbarung der Erfindung
Die hier genannten Erfinder haben viele Jahre lang Untersuchungen zu Ölen und Fetten durchgeführt, die bei Nahrungsmitteln eine Rolle spielen und dabei insbesondere den Mechanismus der Fettzelldifferenzierung wie auch von Stoffen, die diese Differenzierung induzieren und deren Funktionen untersucht. Im Zuge dieser Untersuchungen haben die Erfinder ein System zur wirksamen Bewertung von Agonisten von PPARγ, einem repräsentativen PPAR-Subtyp aufgebaut, und die PPAR-Agonisten-Aktivität von hoch-ungesättigten Fettsäuren unter Einsatz dieses Bewertungssystems evaluiert. Im Ergebnis haben die hier genannten Erfinder entdeckt, dass konjugierte Triensäuren und konjugierte Tetraensäuren eine wesentlich höhere PPAR-Agonisten-Aktivität aufweisen als konjugierte Diensäuren wie CLA. Nach Durchführung weiterer aufwändiger Forschung auf der Basis dieses Ergebnisses haben sie die vorliegende Erfindung fertig gestellt.
Der erfindungsgemäße Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptor-Agonist enthält als aktiven Inhaltsstoff daher Punicinsäure, die eine konjugierte ungesättigte Fettsäure mit 18 Kohlenstoffatomen ist und eine konjugierte Trien-Struktur (-CH=CH-CH=CH-CH=CH-) im Molekül aufweist und Salze und Esterderivate davon.
Darüber hinaus kann die Erfindung auch eine Granatapfelsamenöl-Zusammensetzung sein, die den vorstehend beschriebenen Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor-Agonisten enthält.
Der Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptor-Agonist kann als aktiver Bestandteil eines Arzneimittels zur Verminderung von viszeralem Fett (Bauchfett) oder zur Hemmung der Akkumulation/Speicherung von viszeralem Fett (Bauchfett) eingesetzt werden oder als Wirkstoff zur Prävention oder günstigen Beeinflussung von Abnormalitäten des Lipidstoffwechsels.
Es folgt eine genauere Beschreibung der Erfindung. Der PPAR-Agonist und die diesen enthaltende erfindungsgemäße Fett-/Öl-Zusammensetzung zeigen eine Agonisten-Aktivität gegenüber PPARs, die wichtige Faktoren an der Spitze einer Genkaskade sind, die eine Rolle in der Differenzierung von Fettzellen, der Synthese, Ansammlung, dem Stoffwechsel und Abbau von Lipiden, der Steuerung des Glukosestoffwechsels und der Wärmeerzeugung im Körper spielt. Die PPAR-Agonisten-Aktivität des PPAR-Agonisten und der Öl-/Fett-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann vermittels eines wirksamen Verfahrens gemessen werden, das von den hier genannten Erfindern neu entwickelt wurde. Bei diesem Verfahren werden ein Plasmid (pM-PPAR), das ein chimäres Protein aus einer DNA-Bindungsstelle von GAL4 (einem DNA-bindenden Transkriptionsfaktor aktivierenden Faktor der Hefe) und einer Liganden-Bindungsstelle von PPARγ produziert, das spezifisch in Fettzellen exprimiert wird oder ein Plasmid (pM), in dem die PPARγ-Transmission aus pM-PPAR entfernt wurde und ein Plasmid (4xUASg-luc), in das vier GAL4-responsive Sequenzen (USAg) stromaufwärts vom Reportergen Luziferasegen eingebaut wurden, in Zellen (CV-1) in Kultur vermittels Lipofektion kotransfiziert, die aus den Nieren eines afrikanischen grünen Affen stammen (Kazuaki Yoshikawa, „Forschungsverfahren zur Geneinschleusung/-expression für die Neurophysiologie" („Gene Introduction/Expression Research Methods for Neurophysiology"), Springer Verlag Tokyo, 1997 (in japanisch)); die so erhaltene Transformante wird eine gewisse Zeit kultiviert. Anschließend wird das chimäre PPARγ-Gal4-Protein durch Behandlung mit einer Agonisten-Kandidatensubstanz aktiviert, wobei die Bindung an das USAg stromaufwärts vom 4xUASg-luc erhöht wird und im Ergebnis die Luziferaseproduktion erhöht wird. Die Aktivität des Agonisten kann durch Messung der Aktivität der produzierten Luziferase ermittelt werden (Gebrauchsanweisung für den Pica Gene Luminescence Kit, Toyo B-Net. Co. Ltd.).
Die Wirkungen des PPAR-Agonisten und der Öl-/Fett-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf die Verminderung des viszeralen Fetts (Bauchfetts) oder die Hemmung der Akkumulation/Speicherung von viszeralem Fett (Bauchfett) werden durch Verabreichung des Kandidatenstoffes in ein Labortier über eine bestimmte Zeit hinweg (z.B. vier Wochen) ermittelt. Anschließend wird das viszerale Fett im Fettgewebe um die Hoden herum, das Fettgewebe um die Nieren usw. gemessen.
Der in der Umsetzung der Erfindung eingesetzte PPAR-Agonist kann eine agonistische Aktivität gegenüber jedem der PPAR-Subtypen aufweisen, da die Selektivität der PPAR-Liganden sehr breit gefasst ist. Wenn man jedoch nach der bestimmten Gewebeverteilung von jedem der Subtypen geht, ist besonders bevorzugt, dass der PPAR-Agonist eine agonistische Aktivität gegenüber PPARγ aufweist. Der erfindungsgemäße PPAR-Agonist enthält als einen aktiven Bestandteil mit agonistischer Aktivität Punicinsäure, die eine konjugierte ungesättigte Fettsäure mit 18 Kohlenstoffatomen ist und eine konjugierte Trienstruktur (-CH=CH-CH=CH-CH=CH-) enthält sowie Salze und Ester davon.
Beispiele von konjugierten ungesättigten Fettsäuren mit agonistischer Aktivität schließen Punicinsäure (18:3, 9c, 11t, 13c), Calendulasäure (18:3, 8t, 10t, 12c) Jacarandasäure (18:3, 8c, 10t, 12c) , α-Elaeostearinsäure (18:3, 9c, 11t. 13t), β-Elaeostearinsäure (18:3, 9t, 11t. 13t), Catalpasäure (18:3, 9t, 11t. 13c), Kamlolensäure (18OH, 9c, 11t. 13t) und weitere konjugierte Octadecatriensäuren wie auch konjugierte Tetraensäuren wie Parinarsäure (18:4, 9c, 11t, 13t, 15c) und konjugierte Eicosatetraensäuren ein. Von der Sicherheit und der einfachen Verfügbarkeit her gesehen sind Fettsäuren mit 18 Kohlenstoffatomen und einer konjugierten Trienstuktur bevorzugt. Von der PPARγ-Agonisten-Aktivität her gesehen ist Punicinsäure, die eine 9-cis, 11-trans, 13-cis Stereoisomerie aufweist, besonders geeignet.
Die konjugierte ungesättigte Fettsäure, die den aktiven Bestandteil des erfindungsgemäßen PPAR-Agonisten darstellt, kann die Ausgestaltung eines Salzes oder eines Esterderivates annehmen. Ein Salz muss ernährungswissenschaftlich, nahrungsmäßig und pharmakologisch annehmbar sein. Darüber hinaus gibt es keine besonderen Beschränkungen. Beispiele schließen Metallsalze wie ein Natriumsalz und ein Kaliumsalz, ein Ammoniumsalz ein, ferner Salze mit organischen Basen wie Methylamin, Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Pyrrolidin, Piperidin, Morpholin, Hexamethylenimin, Anilin und Pyridin wie auch Salze mit Aminosäuren wie Arginin, Glutaminsäure und Ornithin. Ferner muss ein Esterderivat ernährungswissenschaftlich, nahrungsmäßig und pharmakologisch annehmbar sein. Darüber hinaus gibt es keine besonderen Beschränkungen. Bevorzugt sind ein Ethylester, ein Butylester, ein Propylester und ein Glycerinester, wobei ein Ethylester und ein Glycerinester besonders bevorzugt sind. Ein Glycerinester-Derivat kann ein Monoglycerid, ein Diglycerid oder ein Triglycerid sein, obwohl ein Diglycerid oder ein Triglycerid bevorzugt sind und ein Triglycerid besonders bevorzugt ist. Im Falle eines Diglycerids oder eines Triglycerids kann die Position, an der die konjugierte ungesättigte Fettsäure verestert wird, gemäß der Vorgabe ohne besondere Beschränkungen ausgewählt werden. Besondere Beispiele konjugierter ungesättigter Fettsäureesterderivate schließen Ethylpunicat, Butylpunicat, Propylpunicat, 1-Punicyl-sn-Glycerin, 2-Punicyl-sn-Glycerin, 1,2-Dipunicyl-sn-Glycerin, 2,3-Dipunicyl-sn-Glycerin und 1,2,3-Tripunicyl-sn-Glycerin ein.
Ein Granatapfelsamenöl kann als Öl-/Fett-Zusammensetzung mit der erfindungsgemäßen PPAR-Agonisten-Aktivität eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß kann Granatapfelsamenöl, so wie es ist eingesetzt werden oder es kann in die Form von Fettsäuren oder Derivaten davon prozessiert werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Prozessierung in Fettsäuren ist die Vorbehandlung des Pfanzenöles/-fettes, sofern notwendig, dann die Hydrolyse zum Erhalt der Fettsäuren, worauf sich eine Aufreinigung anschließt. Beispiele von Verfahren zur Vorbehandlung schließen physikalische Verfahren ein, wie ein Verfahren, in dem das Öl/Fett bei einer Temperatur oberhalb des Schmelzpunktes stehen gelassen wird, so dass die Bestandteile mit einer hohen spezifischen Schwere ausfallen und entfernt werden können. Sie schließen ferner ein Verfahren ein, in dem Komponenten mit niedriger spezifischer Schwere durch Trennung mittels Zentrifugation entfernt werden wie auch chemische Verfahren einschließlich eines Verfahrens, bei dem Schwefelsäure oder Phosphorsäure zum Öl/Fett hinzugegeben wird und das Erhitzen und Rühren so ausgeführt werden, dass Proteine und organische Pigmente abgebaut werden, worauf die abgebauten Produkte durch Neutralisation und Waschen entfernt werden und ein Verfahren, in dem aktivierter Ton zugegeben wird und die Hitzebehandlung so ausgeführt wird, dass abgebaute Produkte, gefärbte Substanzen, harzreiche Substanzen usw. adsorbiert und somit entfernt werden. Darüber hinaus schließen spezifische Beispiele für Hydrolyseverfahren chemische Verfahren ein, wie ein Verfahren, bei dem das Öl/Fett unter Verwendung einer alkalischen Substanz wie Kaliumhydroxid verseift wird, ein unter mittlerem Druck durchgeführtes katalytisches Abbauverfahren, bei dem der Abbau unter Bedingungen mittleren Druckes und unter Verwendung von Zinkoxid, Kalziumoxid oder Magnesiumoxid als Katalysator durchgeführt wird und ein kontinuierliches, unter hohem Druck durchgeführtes Abbauverfahren, bei dem der kontinuierliche Abbau unter hohem Druck durchgeführt wird, sowie biologische Hydrolyseverfahren unter Verwendung von Lipase, Mikroorganismen oder ähnliche. Verfahren zur Trennung und Aufreinigung von Fettsäuren schließen ein Verfahren ein, in dem die Ziel-Fettsäuren durch Destillation unter Verwendung eines Chargentyp-, halbkontinuierlichen oder kontinuierlichen Typ-Destillationsapparates oder eines Superfraktionierungsapparates gereinigt werden wie auch ein Verfahren, in dem eine übersättigte Lösung oder Schmelze auf eine geeignete Temperatur abgekühlt wird, bei der die Ziel-Fettsäuren Kristalle bilden. Anschließend werden die Kristalle fraktioniert, wobei ein Verfahren wie ein Kompressionsverfahren, das Solexol-Verfahren (US-A 2,293,674, 1942) das Emersol-Verfahren (US-A 2,421,157, 1974) oder das Henkel-Verfahren (W. Stein et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 45 (1968), 471) eingesetzt wird.
Ferner können die konjugierten ungesättigten Fettsäueen, die den aktiven Bestandteil des erfindungsgemäßen PPAR-Agonisten darstellen, durch Kultivierung eines Mikroorganismus wie einer Alge hergestellt werden, wobei ein Öl oder Fett aus der Kultur extrahiert wird und die Fettsäuren daraus dann unter Verwendung bekannter Verfahren erhalten werden. Ferner kann eine konjugierte ungesättigte Fettsäure durch Umsetzung einer bekannten ungesättigten Fettsäure in Gegenwart eines chemischen Katalysators oder unter Verwendung eines Mikroorganismus, von tierischen Zellen oder einem daraus extrahierten Enzym hergestellt werden. Ein Beispiel dafür ist ein Verfahren, mit dem eine hoch-konjugierte ungesättigte Fettsäure mit einer konjugierten Trienstruktur aus Arachidonsäure, γ-Linolensäure oder Eicosapentaensäure unter Verwendung einer Isomerase erhalten wird, die von der Rotalge Ptilota filicina produziert wird (M.L. Wise, Biochemistry 33 (1994), 15223).
Gemäß der vorliegenden Erfindung gibt es keine besonderen Beschränkungen bezüglich des Verfahrens, wie eine konjugierte ungesättigte Fettsäure in ein Esterderivat umgesetzt wird. Ein bekanntes Verfahren kann dafür eingesetzt werden, beispielsweise ein direktes Veresterungsverfahren, in dem ein Ester aus der in Frage kommenden Fettsäure und einem Alkohol wie Ethylalkohol oder Glycerol (Glycerin) durch eine Dehydrierungsreaktion synthetisiert wird, ein Umesterungsverfahren, in dem ein Ester mit einem Alkohol, ein Ester mit der in Frage kommenden Fettsäure oder ein Ester mit einem Ester umgesetzt wird, um einen neuen Ester zu synthetisieren, ein Verfahren, in dem ein Ester aus dem Chlorid der in Frage kommenden Fettsäure und einem Alkohol synthetisiert wird, ein Verfahren, in dem eine Epoxyverbindung und die in Frage kommende Fettsäure umgesetzt werden oder ein Verfahren, in dem ein Olefin und die in Frage kommende Fettsäure umgesetzt werden. Das direkte Veresterungsverfahren und das Umesterungsverfahren sind jedoch bevorzugt. Ein spezifisches Beispiel des direkten Veresterungsverfahrens ist ein Verfahren, in dem die in Frage kommende Fettsäure und der Alkohol gemischt werden, sofern nötig, ein azotropher dehydrierender Wirkstoff wie Xylen hinzugefügt wird und das Gemisch anschließend in Gegenwart eines Katalysators wie Schwefelsäure, p-Toluolsulfonsäure, Zinkchlorid, aktivierter Tonerde, Titanoxid oder Tetraisopropyltitanat erhitzt wird. Darüber hinaus sind spezifische Beispiele des Umesterungsverfahrens eine Umesterungsreaktion zwischen zwei Fettsäureestern (Nenokichi Hirao, „Diskurs über die Öl- und Fettchemie" („Discourse on Oil and Fat Chemistry"), letzter Band, S. 522; Hrsg. Kazama Shobo 1950 (in japanisch)), eine Reaktion zwischen einem Fettsäureester und einem Alkohol (H.J. Wright et al., Oil & Soap 21 (1944), 145) und das Verfahren nach A.T. Gros, R.O. Feuge et al., in dem eine Lauge als Katalysator eingesetzt wird (J. Am. Oil Chem. 26 (1949), 704).
Die Öl-/Fett-Zusammensetzung mit der PPAR-Agonisten-Aktivität der vorliegenden Erfindung kann als Nahrungsmittel/Getränk so wie es ist oder in einer geeigneten Beimischung eingesetzt werden. Darüber hinaus kann die Öl-/Fett-Zusammensetzung als Rohmaterial für eines der verschiedenen industriell hergestellten Nahrungsmittel oder als prozessierter Nahrungsmittelinhaltsstoff verwendet werden. Es gibt keine besonderen Beschränkungen bezüglich der Öl-/Fett-Zusammensetzung in den Nahrungsmitteln/Getränken. Jedoch beträgt der Gehalt vorzugsweise 0,01 bis 99 Gewichts-%, bevorzugt 0,1 bis 90 Gewichts-%. Darüber hinaus können verschiedene, als Nahrungsstoffe zugelassene Träger und Zusatzstoffe wunschgemäß beigemischt werden. Es können irgendwelche Träger und Zusatzstoffe unter der Voraussetzung eingesetzt werden, dass keine negativen Auswirkungen auf die PPAR-Agonisten-Aktivität der Öl-/Fett-Zusammensetzung auftreten. Spezifische Beispiele für Träger schließen Streckmittel, Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Dispersionsmittel, Exzipienten wie Glukose und Laktose, Bindemittel wie Hydroxypropylcellulose (HPC) und Polyvinylpyrrolidon (PVP), Lösungsmittel wie Wasser, Ethanol und Pflanzenöle, Lösungsvermittler, Pufferwirkung-vermittelnde Stoffe wie Natronbikarbonat, Lösungs-Beschleuniger, Gelierstoffe wie Natrium-CMC, HPMC, Agar und Gelatine wie auch suspendierende Wirkstoffe wie Natrium-CMC und Natriumalginat ein. Spezifische Beispiele von Zusatzstoffen schließen Würzmittel für eine verbesserte Essbarkeit oder Genießbarkeit wie Mononatriumglutamat und Inosinsäure, Geschmacksstoffe wie Vanille, Minze, Rosmarin, Linalool und andere natürliche Geschmackstoffe, Vitamine wie Vitamin A, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B6, Vitamin C, Vitamin E, Pantothensäure und Nikotinsäure, Süßmittel wie Stevia (Süßkraut), organische Säuren wie Zitronensäure, Äpfelsäure, Fumarsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure und Milchsäure, Farbstoffe, Feuchtigkeit-verhindernde Wirkstoffe, Fasern, Elektrolyte, Mineralien, Nährstoffe, Antioxidantien, Konservierungsstoffe, Aromastoffe, Netzmittel, und natürliche Pflanzenextrakte wie Teeextrakt, Kaffeeextrakt, Kakaoextrakt, und Extrakte von Früchten wie Orange, Traube, Apfel, Pfirsich, Ananas, Birne, Pfaume, Kirsche, Papaya, Tomate, Melone, Erdbeere und Himbeere ein.
Ein Nahrungsmittel/Getränk, das die erfindungsgemäße Öl-/Fett-Zusammensetzung enthält, kann jede Form annehmen, vorausgesetzt, es gibt keine nachteiligen Wirkungen auf die PPAR-Agonisten-Aktivität der Öl-/Fett-Zusammensetzung. Spezifische Beispiele schließen Kaffee, Teegetränke wie schwarzen Tee, grünen Tee und Oolong Tee, Sojamilch, Frucht- und Gemüsegetränke wie Gemüsesäfte und Fruchtsäfte, Milchsäurebakteriengetränke wie Joghurtgetränke, Milchgetränke wie Kuhmilch, mit Kohlensäure versetzte Getränke wie Cola, verschiedene Sportgetränke, Bäckereiprodukte wie Brot, Reis, Nudeln, prozessierte Sojabohnenprodukte wie Tofu, prozessierte Fisch- und Fleischprodukte wie Würstchen und Schinken, Kuchen, Süßigkeiten wie Kekse, Bohnenmarmelade-Buns („manju"), Reiscracker, Eiskrem, Puddings, Bohnenmarmelade-Gelee („yokan"), Konfekt und Schokolade, Molkereiprodukte wie Butter, Joghurt und Käse, prozessierte Öl-/Fett-Nahrungsmittel wie Margarine und Backfett, Zutaten wie Mayonnaise, Dressings, Miso, Sojasauce und weitere Saucen, Gartenlilien-Wurzelpaste („konnyaku") und Gewürzgurken ein.
Ein Nahrungsmittel/Getränk, das die erfindungsgemäße Öl-/Fett-Zusammensetzung enthält, kann als ein Nahrungsmittel/Getränk verwendet werden, das Wirkungen bei der Beibehaltung der Gesundheit, Verbesserung der Gesundheit oder Verbesserung der physischen Fitness zeigt. Insbesondere kann das Nahrungsmittel/Getränk, das die erfindungsgemäße Öl-/Fett-Zusammensetzung enthält, als Nahrungsmittel/Getränk eingesetzt werden, das Wirkungen vermittelt wie die Verbesserung oder Unterdrückung von Fettsucht, die Verminderung von gespeichertem Fett, insbesondere von viszeralem Fett (Bauchfett), die Unterdrückung von Fettaufbau (Fettspeicherung), insbesondere Akkumulation von viszeralem Fett (Bauchfett), die Verbesserung von Unregelmäßigkeiten des Lipid-Metabolismus wie einer Tendenz zur Hyperlipidämie oder einer Tendenz zu hohen Blut-Cholesterinwerten, Verbesserung von Abnormalitäten des Glukose-Metabolismus wie einer Tendenz zu Diabetes oder einer Tendenz zu hohen Glukosewerten im Blut nach Mahlzeiten, die Verbesserung einer Tendenz zu Bluthochdruck und Unterdrückung der Verdickung von Arterienwänden oder als ein therapeutisches Nahrungsmittel/Getränk während der Krebsbehandlung.
Wenn sie als aktiver Bestandteil eines Arzneimittels eingesetzt wird, wird die Öl-/Fett-Zusammensetzung mit der erfindungsgemäßen PPAR-Agonisten-Aktivität einem Menschen oder anderem Säuger als solche oder zu 0,01 bis 99,5 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 bis 90 Gew.-% in einem medizinisch annehmbaren nicht-toxischen inaktiven Träger verabreicht. Die Menge an dem Menschen oder anderen Säuger verabreichtem Arzneimittel kann im Einklang mit dem avisierten Ziel gewählt werden, solange diese Menge sich innerhalb eines Bereiches bewegt, bei der der gewünschte Effekt erreicht wird, ohne dass Toxizität auftritt. Es ist jedoch bevorzugt, dass eine effektive Dosis dergestalt verabreicht wird, dass die Aufnahme der Öl-/Fett-Zusammensetzung sich im Bereich von 1 mg bis 3 g pro kg Körpergewicht entweder einmal pro Tag oder auf mehrere Dosen pro Tag verteilt bewegt. Die genaue Arzneimittel-Dosis kann innerhalb eines breiten Bereiches variieren und zwar abhängig von dem Verabreichungsverfahren, der Arzneimittelformulierung, dem medizinischen Befinden und dem Körpergewicht des behandelten Patienten (Subjektes) usw. Sie wird somit vorzugsweise durch die Erfahrung und Einschätzung des verantwortlichen Arztes oder Tierarztes ermittelt. Darüber hinaus gibt es keine besonderen Beschränkungen bezüglich des Trägers, wobei es möglich ist, dass jeder Träger eingesetzt wird, der üblicherweise bei der Herstellung eines festen, halbfesten oder flüssigen Arzneimittels eingesetzt wird. Insbesondere eingesetzt werden können eine oder mehrere Komponenten, ausgewählt aus Exzipienten wie Glukose und Laktose, Disintegratoren wie Stärke und Calcium-Carboxymethylcellulose (CMC-Ca), Bindemitteln wie Hydroxypropylcellulose (HPC) und Polyvinylpyrrolidon (PVP), Gleitmitteln wie Talg und Magnesiumstearat, Regulatoren des pH-Wertes wie Natriumbikarbonat, Stabilisatoren, Verdünnungsmitteln, Pigmenten, anderer nach Verschreibung zu verwendender Hilfsstoffe usw. Allgemein ist bevorzugt, dass ein Arzneimittel in Form einer Einheitsdosis verabreicht wird. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann oral als Tablette, Kapsel, Granulat, Pulver, als Zucker-beschichtete Tablette, als Suspension, Lösung, Sirup, Drops, als sublinguale Tablette, als Emulsion usw. oder nicht-oral als Injektion, Zäpfchen usw. verabreicht werden. Wenn es einer verlängerten Verabreichung bedarf, ist die orale Verabreichung bevorzugt.
Das die erfindungsgemäße Öl-/Fett-Zusammensetzung enthaltende Arzneimittel kann als Wirkstoff gegen Fettsucht, als Wirkstoff zur Verminderung von viszeralem Fett (Bauchfett), als Wirkstoff zur Unterdrückung des Aufbaus von viszeralem Fett (Bauchfett), als Wirkstoff zur Behandlung von Hyperlipidämie, wie auch als Wirkstoff zur Behandlung von hohen Cholesterinwerten im Blut eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäße Öl-/Fett-Zusammensetzung kann als solche als Tierfutter eingesetzt werden oder in einer geeigneten Mischung zusammen mit Gewürzen, Aromastoffen usw., wodurch die Essbarkeit und der Geschmack verbessert werden. In diesem Fall können zur Aufrechterhaltung der physikalischen Eigenschaften auch Emulgatoren und Stabilisatoren zugemischt werden. Ferner kann die erfindungsgemäße Öl-/Fett-Zusammensetzung als Rohmaterial für verschiedene prozessierte, industriell hergestellte Tier- und Haustierfutter eingesetzt werden. Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Öl-/Fett-Zusammensetzung direkt auf ein Tierfutter gesprüht werden. Es gibt keine besonderen Beschränkungen hinsichtlich des Gehaltes an Öl-/Fett-Zusammensetzung im Tierfutter. Dieser Gehalt liegt jedoch beispielsweise im Bereich von 0,1 bis 99,5 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 90 Gew.-%, bezogen auf den Gesamtgehalt an Feststoffen im Tierfutter. Das Tierfutter kann eingesetzt werden, um Fettsucht zu verhindern oder günstig zu beeinflussen, zur Verhinderung oder Behandlung von Diabetes oder zur Verhinderung oder Behandlung von Krebs beim Vieh oder bei Haustieren.
Wenn die erfindungsgemäße Öl-/Fett-Zusammensetzung darüber hinaus in Nahrungsmitteln/Getränken, Arzneimitteln oder Tierfutter eingesetzt wird, kann sie zusammen mit anderen Nahrungsmitteln/Getränken, Arzneimittel- oder Tierfutterzusammensetzungen verwendet werden, die ähnliche Wirkungen aufweisen.
Beste Art und Weise zur Ausführung der Erfindung
Es folgt eine genauere Beschreibung der Erfindung durch die Beispiele, obwohl zu vermerken ist, dass die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
(Beispiel 1) Herstellung von konjugierten ungesättigten Fettsäure-Glycerinestern und konjugierten ungesättigten Fettsäuren aus Pflanzensamen.
Granatapfelsamen, erhalten durch Aufschneiden von Granatäpfeln (kalifornisches Produkt, USA) , die in einem Früchtegeschäft gekauft worden waren, anschließendes Entfernen des Fruchtmarks um die Samen herum und Trocknen der Samen, Samen der Ringelblume, Bittermelonesamen und Balsamsamen, die von einem Samenhändler gekauft worden waren und Trompetenbaumsamen, die von einem medizinischen Kräuterladen erstanden wurden, wurden jeweils pulverisiert. Anschließend wurde die doppelte Gewichtsmenge an n-Hexan zugegeben und zwei Extraktionen für 6 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt, wodurch ein wässriger Extrakt aus jeder der Samenarten erhalten wurde. Das Lösungsmittel wurde aus jedem der wässrigen Extrakte entfernt, wodurch Granatapfelsamenöl, Ringelblumesamenöl, Bittermelonesamenöl und Trompetenbaumsamenöl erhalten wurden. Wenn eine Hexanlösung jedes dieser Samenöle wie auch von käuflich erwerbbarem Tungöl (Nacalai Tesque) auf eine Siliziumdioxid (Silica)-Gel 60F254-TLC-Platte (E. Merck) gespottet wurde, erfolgte die Entwicklung unter Verwendung eines 60:40:1 Gemisches an n-Hexan, Ethylether und Essigsäure und anschließend wurde eine Färbung unter Verwendung von Jod durchgeführt, wobei ein wichtiger Punkt (Spot) den Triglyceriden von Rf 0,5 bis 0,7, wie bei Tungöl beobachtet, entsprach. 1 g von jedem der wie vorstehend erhaltenen Pflanzensamenöle und Tungöl wurden in Ethanol gelöst. Anschließend wurde KOH zugegeben und erhitzt, wodurch eine Hydrolyse herbeigeführt wurde. Nicht verseifbares Material wurde anschließend aus den Hydrolyseprodukten entfernt, die wässrige Phase abgetrennt und auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt. Anschließend wurde eine Extraktion mit n-Hexan durchgeführt, bevor das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt wurde, wodurch freie Fettsäuren erhalten wurden. Jede der Fettsäure-Fraktionen wurde, wie vorstehend beschrieben, einer TLC-Analyse unterworfen, wodurch heraus gefunden wurde, dass die wesentlichen Bestandteile freie Fettsäuren waren. Die so erhaltenen freien Fettsäuren wurden einer Chromatographie über eine Siliziumdioxidgel-Säule (Wakogel C-200, Wako Pure Chemical Industries) zugeführt, es wurde mit n-Hexan gewaschen und mit n-Hexan enthaltend 20 Vol.-% Ethylester eluiert. Mit diesem Verfahren wurden gereinigte Fettsäurefraktionen erhalten. Die Ausbeuten waren 0,88 g Granatapfelsamenöl, 0,91 g Ringelblumensamenöl, 0,92 g Tungöl, 0,90 g Bittermelonensamenöl, 0,90 g Tompetenbaumsamenöl und 0,89 g Balsamsamenöl.
Jede der wie vorstehend erhaltenen Fettsäuren und kommerziell erhältliches CLA (Kenko Tsusho) wurde mit einer Schwefelsäure – Methanol-Lösung (2:230 Volumenverhältnis) in Gegenwart von Dimethylsulfoxid behandelt, wodurch Fettsäuremethylesterderivate erhalten wurden. Anschließend wurde eine Gaschromatographieanalyse unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.
System: HP (Hewlett Packard) 5890 Serie II
Säule: SPELUCO SP-2380, 100 mm × 0,25 mm ID
Säulentemperatur: 185°C
Injektionstemperatur: 200°C
Detektortemperatur: 210°C
Darüber hinaus und im Einklang mit dem Verfahren nach Takagi (Takagi, Nihon Kagaku Zasshi, 86 (1965) 296 (in japanisch)) wurden 60 mL Ethanol und 10 mL Hydrazinhydrat zu 0,5 g von jeder der Fettsäuren zugegeben, ein Kühler wurde angebracht und es wurde für 2 Stunden gemischt, wobei Luft bei 50°C zugeführt wurde. Anschließend wurden die Reaktionsprodukte mit Diethylether extrahiert, der Extrakt wurde mit einer wässrigen Salzsäurelösung gewaschen und der Ether anschließend entfernt. Zu den Produkten wurden 10 mL Methanol enthaltend 2% Schwefelsäure gegeben und das Gemisch wurde über Nacht unter einer Stickstoffatmosphäre belassen, wodurch Methylester erhalten wurden. Die so erhaltenen Produkte wurden analysiert, wobei Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von in Silbernitrat eingetauchtem Siliziumoxid verwendet wurde. Darüber hinaus wurden die Disulfiddimethyl-Additionsprodukte gebildet und unter Verwendung von GC/MS analysiert (ThermoQuest GC-9).
Auf der Grundlage der Ergebnisse der Analysen wurden die Anzahl der Kohlenstoffatome, die Anzahl der ungesättigten Bindungen, die Positionen der ungesättigten Bindungen und die Stereoisomerie für die Fettsäuren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Zusammensetzung von Fettsäuren aus Pflanzensamenölen

ND* = nicht detektiert (d.h. unterhalb der Detektionsgrenze)

Man sieht, dass der Hauptbestandteil der Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl Punicinsäure ist, die Hauptkomponenten der Fettsäuren aus Ringelblumensamenöl Calendulasäure und Linolsäure sind, die Hauptkomponente der Fettsäuren aus Tungöl und aus Bittermelonesamenöl α-Elaeostearinsäure ist, die Hauptkomponenten der Fettsäuren aus Trompetenbaumsamenöl Catalpasäure und Linolsäure sind, und der Hauptbestandteil der Fettsäuren aus Balsamsamenöl Parinarsäure ist.
(Beispiel 2) Agonistische PPAR-Aktivität von Fettsäuren aus Pflanzensamenölen
2 × 10⁴ CV-1 Zellen (kultivierte Zellen, die aus der Niere eines männlichen afrikanischen grünen Affen stammen, erworben von der Human Sciences Foundation) wurden in eine Platte mit 24 Vertiefungen überführt, in die 500 μL DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium, Gibco) enthaltend 10% fötales Rinderserum (Gibco), Penicillin und Streptomycin (jeweils 10.000 Einheiten/mL, 10.000 μg/mL, Gibco) und Ascorbinsäure (37 μg/mL, Wako Pure Chemical Industries) gegeben worden waren. Die Züchtung wurde 24 Stunden unter Bedingungen von 37°C und 5% CO₂ durchgeführt und die Waschschritte wurden mit OPTI-MEM (Gibco) durchgeführt. Anschließend wurden pM-PPAR [ein ein chimäres Protein exprimierendes Plasmid, hergestellt durch Einfügen eines PPARγ-Ligandenbindungsstellen-Gens (Aminosäuresequenz 204–505) in die C-terminale Stelle von GAL4 eines pSV40 Expressionsvektors, der ein aus Hefe stammendes GAL4-Transkriptionsfaktorgen (Aminosäuresequenz 1-147) enthält], zuvor gemäß dem Verfahren nach Yoshikawa (Kazuaki Yoshikawa, „Forschungsverfahren zur Geneinschleusung/-expression für die Neurophysiologie" („Gene Introduction/Expression Research Methods for Neurophysiology"), Springer Verlag Tokyo, 1997 (in japanisch)) aufbereitet und gelagert und 4xUASg-luc [ein Reporter-Plasmid, in das eine GAL4-responsive Sequenz (UASg) vier Mal stromaufwärts des Luciferasegens eingeführt wurde, das ein Reportergen ist] oder pM [ein Plasmid, in dem die PPARγ-Liganden Bindungsstellensequenz aus dem vorstehend erwähnten pM-PPAR entfernt worden war] und 4xUASg-luc unter Verwendung von „Lipofect Amine" (Gibco) transfiziert. 5 Stunden nach Beendigung der Transfektion wurde DMEM enthaltend 20% fötales Rinderserum zugegeben, die Serumkonzentration auf 10% justiert und es wurde über Nacht kultiviert. Am nächsten Morgen wurden Ligandenreagenz-addierte Gruppen durch Austausch mit Kulturmedien hergestellt, präpariert durch Trocknung einer Hexanlösung von konjugierter Linolsäure (CLA, gekauft von Kenko Tsusho) oder von Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl, Fettsäuren aus Ringelblumenöl, Fettsäuren aus Tungöl, Fettsäuren aus Trompetenbaumsamenöl, Fettsäuren aus Bittermelonesamenöl oder Fettsäuren aus Balsamsamenöl, hergestellt wie in Beispiel 1, unter einem Stickstoffstrom, Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) und Verdünnung um einen Faktor 1000 unter Verwendung von DMEM enthaltend 10% mit Aktivkohle behandeltes fötales Rinderserum (Fettsäureendkonzentration 20 μM). Darüber hinaus wurden unbehandelte Kontrollgruppen durch Austausch mit einem Kulturmedium etabliert, das durch Verdünnung von lediglich DMSO mit DMEM enthaltend 10% mit Aktivkohle behandeltes fötales Rinderserum hergestellt wurde. Ferner wurden positive Kontrollgruppen durch Austausch mit einem Troglitazon (Sankyo, nachstehend abgekürzt als „TZD") (1 μM), einem im Stand der Technik bekannten starken PPARγ-Agonisten enthaltenden Kulturmedium hergestellt. Einen Tag nach dem Austausch des Kulturmediums wurde das Kulturmedium entfernt, die Zellen wurden mit phosphatgepufferter Saline (PBS) gewaschen, eine Zell-Lösung wurde unter Verwendung von „PicaGene cell solution Luc" (Toyo Ink) hergestellt, 20 μL der Zell-Lösung wurden mit 100 μL eines PicaGene Lumineszenzsubstrats (Toyo Ink.) umgesetzt und die Luziferase-Aktivität wurde unter Verwendung eines Luminometers (Berthold Lumat LB9501) gemessen, wobei die für die Messung aufgewendete Zeit auf 10 Sekunden eingestellt wurde.
Die erhaltenen Ergebnisse wurden wie folgt analysiert. Wenn man davon ausgeht, dass das Verhältnis der Messgruppe (die Gruppe mit den pM-PPAR- und 4xUASg-luc-Transfektionen) zur Kontrollgruppe (der Gruppe mit den pM- und 4xUASg-luc-Transfektionen) im Falle der unbehandelten Kontrollgruppe (a) ist und das Verhältnis der Messgruppe zur Kontrollgruppe im Falle der Ligandenreagenz-addierten Gruppen (b) ist, wurde die durch das Ligandenreagenz verursachte PPARγ-Agonisten-Aktivität unter Verwendung des Verhältnisses (b)/(a) berechnet. Um Fehler zu vermeiden, die aufgrund der Unterschiede in den Transfektionseffizienzen in den verschiedenen Experimenten entstehen könnten, wurde TZD (1 μM) als positive Kontrollgruppen eingeführt und die Werte zwischen den Experimenten wurden korrigiert.
Tabelle 2: PPAR-Agonisten-Aktivitäten von konjugierten ungesättigten Fettsäuren von Pflanzensamenölen
Wie in Tabelle 2 dargestellt, weisen alle Gruppen, denen von Pflanzensamen stammende Fettsäuren mit konjugierten Triensäuren als wichtigste Bestandteile zugegeben wurden, eine stärkere PPAR-Agonisten-Aktivität auf als CLA. Eine starke PPAR-Agonisten-Aktivität, die besser als die von CLA war, wurde für andere Fettsäuren als die in den Fettsäurefraktionen enthaltenen konjugierten Triensäuren nicht beobachtet. Somit ist klar, dass die konjugierten Triensäuren eine starke PPAR-Agonisten-Aktivität aufweisen.
(Beispiel 3) Vergleich der PPAR-Agonisten-Aktivität zwischen Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl und CLA
Die PPAR-Agonisten-Aktivität für CLA und Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl wurde wie in Beispiel 2 beschrieben, ermittelt, wobei nur die Konzentrationen von CLA und der Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl unterschiedlich waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Der kann entnommen werden, dass die aus Granatapfelsamenöl stammenden Fettsäuren etwa dieselbe PPARγ-Agonisten-Aktivität aufweisen, die der zehnfachen Konzentration an CLA entspricht und dass die Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl bei einer Konzentration von 57 μM oder höher dieselbe Aktivität wie 1 μM TZD aufweisen.
Tabelle 3: PPAR-Agonisten-Aktivität von Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl und CLA
(Beispiel 4) Wirkungen von Granatapfelsamenöl auf die Verminderung von viszeralem Fett (Bauchfett) und die Verbesserung des Lipidmetabolismus
10 Wochen alte weibliche C57BL/6J Mäuse (Clea Japan) wurden fett gemästet, indem sie 3 Wochen mit einem Futter (hergestellt von Oriental Yeast) gefüttert wurden, das einen hohen Fettgehalt wie auch einen hohen Zuckergehalt besaß und die in Tabelle 4 dargestellte Zusammensetzung aufwies. Die Mäuse wurden dann in Gruppen zu je acht Tieren aufgeteilt und drei weitere Wochen bei einem Testfutter gehalten, das aus einem fettfreien Standardmischfutter zur Verwendung in Wachstumsperioden bestand (AIN-93G, hergestellt von Oriental Yeast) mit 2 Gew.-% Sojabohnenöl als essentieller Fettsäurenquelle und entweder 7 Gew.-% eines Testöls oder 7 Gew.-% eines Kontrollöls als Zutat. Nach drei Wochen wurden die Mäuse zum letzten Mal gefüttert und anschließend für 16 Stunden nicht gefüttert. Danach wurde den Mäusen das gesamte Blut entnommen, wobei eine heparinisierte Spritze unter Ether-Anästhesie eingesetzt wurde. Anschließend wurden die Mäuse seziert, wobei das Fettgewebe um die Nieren herum, das Fettgewebe um die Eierstöcke, die Leber, die Nieren und die Milz extrahiert und das Gewicht davon gemessen wurde. Das so erhaltene Gewicht jeden Organs wurde durch das Körpergewicht dividiert, wodurch das Verhältnis des Organgewichts zum Körpergewicht erhalten wurde. Das Fettgewebe um die Nieren herum wie auch das Fettgewebe um die Eierstöcke herum wurde als viszerales Fettgewebe (Bauchfettgewebe) eingestuft. Das gesammelte Blut wurde 15 Minuten bei 3.000 UpM unter Kühlung zentrifugiert, wodurch das Plasma erhalten wurde. Anschließend wurde die Gesamt-Cholesterinkonzentration unter Verwendung des Cholesterin C Tests Wako ermittelt (Wako Pure Chemical Industries), die neutrale Lipidkonzentration (Konzentration der neutralen Lipide) unter Verwendung des Triglycerid G Tests Wako (Wako Pure Chemical Industries) und die freie Fettsäurekonzentration unter Verwendung des NEFA C Tests Wako (Wako Pure Chemical Industries). Die zusammengestellten Gruppen waren eine Testgruppe, bei der wie in Beispiel 1 hergestelltes Granatapfelsamenöl zum Futter gegeben wurde (Granatapfelsamenölgruppe), eine Kontrollgruppe, bei der Sojabohnenöl zum Futter gegeben wurde (Sojabohnenölgruppe) und eine Vergleichsgruppe, bei der ein Fischöl mit hohem DHA-Gehalt (DHA-Gehalt bei 20 Gew.-%, Harima Chemicals), das bekanntermaßen Fettsucht einschränkende Wirkung aufweist, zum Futter gegeben wurde (Fischölgruppe). Ebenfalls aufgestellt wurde eine Gruppe, bei der 6,5 Gew.-% Sojabohnenöl und 0,5 Gew.-% CLA (Kenko Tsusho, 70% Reinheit) zum Futter gegeben wurden (CLA-Gruppe). Gemäß den Ergebnissen der vorläufigen Tests wird eine signifikante Vergrößerung der Leber (1,4 mal im Vergleich zur Kontrolle) beobachtet, wenn 1 Gew-% oder mehr an CLA zu dem Futter zugegeben wird und man beobachtet eine Verminderung in der Futteraufnahme der Mäuse. Es wurde somit entschieden, dass eine wesentliche Dosis 0,5 Gew.-% oder weniger beträgt und man entschied sich daher für 0,5 Gew.-%. Darüber hinaus wurde eine Gruppe aufgestellt, an die Standardfutter verfüttert wurde, das 9 Gew.-% Sojabohnenöl enthielt und zwar während der gesamten Testphase vom Start an (Standardfuttergruppe, n=3). Während der Testphase wurde den Mäusen Wasser ad libitum gegeben, die Futtergabe wurde jedoch so beschränkt, dass die Aufnahme die gleiche wie bei der Sojabohnenölgruppe war.
Tabelle 4: Zusammensetzung des Futters mit hohem Fettgehalt, hohem Zuckergehalt
Bezugnehmend auf die Ergebnisse wurden während der Testperiode zwischen den Gruppen keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Aufnahme von Futter oder der Zunahme des Körpergewichts festgestellt. Wie in Tabelle 5 dargestellt, erhöhte sich das Verhältnis des Gewichts von viszeralem Fett (Bauchfett) zu Körpergewicht jedoch deutlich bei der Sojabohnenölgruppe im Vergleich zur Standardfuttergruppe. Dies legt nahe, dass die Mäuse Fettsucht hinsichtlich des viszeralen Fetts als Folge der Aufnahme der Nahrung mit hohem Fettgehalt und hohem Zuckergehalt zeigten. Der Vergleich des Verhältnisses des Gewichts von viszeralem Fett zum Körpergewicht für jede Gruppe zeigt, dass die Reihenfolge die folgende ist: Fischölgruppe > Sojabohnenölgruppe > CLA-Gruppe > Granatapfelsamenölgruppe. Dies belegt klar, dass die Granatapfelsamenöl eine bessere Wirkung bezüglich der Verminderung von viszeralem Fett aufweist als Fischöl oder CLA. Tabelle 5: Auswirkung von Granatapfelsamenöl auf die Verminderung von viszeralem Fett (Bauchfett)

NE: nicht ermittelt
*: P<0,05

Darüber hinaus sind die Ergebnisse der Analyse der Gesamt-Cholesterin-Konzentration, der Konzentration an neutralen Lipiden und der Konzentration an freien Fettsäuren im Plasma in Tabelle 6 dargestellt. Beim Granatapfelsamenöl wurde eine Tendenz zur Verminderung von neutralen Lipiden und ein statistisch signifikanter Effekt bezüglich der Verminderung von freien Fettsäuren beobachtet. Demzufolge wurde eine verbesserte Wirkung auf den Lipidmetabolismus in vivo beobachtet. Tabelle 6: Wirkungen von Granatapfelsamenöl auf die Verbesserung des Lipidmetabolismus

NE: nicht ermittelt
*: P<0,05, **: P<0,01

(Beispiel 5) Wirkungen des Granatapfelsamenöls auf die Unterdrückung der Ansammlung von viszeralem Fett (Bauchfett)
Sechs Wochen alte weibliche ICR-Typ CD-1 Mäuse (Charles River) wurden in Gruppen zu je acht aufgeteilt und vier Wochen bei einem Futter gehalten, das durch Zugabe einer vorgeschriebenen Menge eines Testöls zu einem fettfreien Standard Mischfutter für Mäuse/Ratten (zur Verwendung in der Wachstumsphase, AIN-93G, Oriental Yeast) hergestellt wurde. Nach vier Wochen wurden die Mäuse mit Ether anästhesiert und seziert, das Fettgewebe um die Nieren, das Fettgewebe um die Eierstöcke, sowie die Leber, die Nieren und die Milz entnommen und das jeweilige Gewicht davon gemessen. Die Summe der Gewichte des Fettgewebes um die Nieren und des Fettgewebes um die Eierstöcke wurde verwendet, um das viszerale Fett (Bauchfett) zu ermitteln. Die zusammen gestellten Testgruppen bestanden aus einer Gruppe, bei der 1,7 Gew.-% (1 Gew.-% bezogen auf Punicinsäure) Granatapfelsamenöl, hergestellt gemäß Beispiel 1 und 5,3 Gew.-% Sojabohnenöl zum Futter gegeben wurden (Granatapfelsamenölgruppe), einer Kontrollgruppe, bei der 7 Gew.-% Sojabohnenöl zum Futter gegeben wurde (Sojabohnenölgruppe) und einer Vergleichsgruppe, bei der 7 Gew.-% eines Fischöls mit hohem DHA-Gehalt (DHA-Gehalt 20 Gew.-%, Harima Chemicals), das bekanntermaßen eine bessernde Wirkung auf Fettleibigkeit aufweist, zum Futter gegeben wurde (Fischölgruppe).
Von den Ergebnissen her wurden während der Testphase zwischen den Gruppen keine signifikanten Unterschiede bei der Aufnahme von Futter oder der Erhöhung des Körpergewichts gefunden. Die Messergebnisse für die Gewichte der einzelnen Organe sind in Tabelle 7 als das Verhältnis des Organgewichts zum Körpergewicht dargestellt. Eine statistisch signifikante Unterdrückung der Speicherung von viszeralem Fett (Bauchfett) wurde bei der Fischölgruppe beobachtet. Eine der Unterdrückung der Bauchfettansammlung bei der Fischölgruppe nahezu gleichwertige Unterdrückung wurde bei der Granatapfelsamenölgruppe gefunden. Tabelle 7: Unterdrückende Wirkungen von Granatapfelsamenöl auf die Ansammlung von viszeralem Fett (Bauchfett)

*: P<0,05

(Beispiel 6) Supprimierende Wirkungen von hoch-konjugierten ungesättigten Fettsäuren auf die Krebszellproliferation (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
200μL eines mit 10% fötalem Rinderserum versetzten RPMI-1640 Kulturmediums (Gibco BRL), in das menschliche DLD-1 Kolonkrebszellen (5 × 10⁵ Zellen/mL) suspendiert worden waren, wurden in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen überführt und eine Kultivierung 24 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ durchgeführt. Eine Fettsäurelösung, vorab hergestellt durch Hernahme einer Hexanlösung, entweder von Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl oder Fettsäuren aus Tungöl, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, ausreichendes Eindampfen des Lösungsmittels unter einem Stickstoffstrom, Lösen in Dimethylsulfoxid und anschließende Verdünnung in phosphatgepufferter Saline (PBS) wurde dann in jede Vertiefung gegeben und für weitere 20 Stunden kultiviert. 1 μCi/10μL/Vertiefung an [3H]Thymidin (Amersham Japan) wurde anschließend zugegeben und für weitere vier Stunden kultiviert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, dann in 100 μL einer 2N NaOH-Lösung aufgelöst, mit 50 μL 4N HCl neutralisiert und anschließend wurde die Radioaktivität in einem Flüssigszintillationszähler gemessen. Ein Experiment, bei dem anstelle von der Testprobe PBS eingesetzt wurde, wurde als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. Es wurde gefunden, dass sowohl Tungöl als auch Granatapfelsamenöl supprimierende Wirkungen auf die Proliferation von Krebszellen aufweisen.
Tabelle 8: Supprimierende Wirkungen von Fettsäuren aus Tungöl und Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl auf die Krebszellproliferation
(Beispiel 7) Bewertung der Sicherheit von Granatapfelsamenöl
Fünf sechs Wochen alten weiblichen ICR-Typ CD-1 Mäusen (Charles River) wurden 10g/kg Granatapfelsamenöl unter Zwang oral verabreicht und das Gesamtbefinden der Mäuse nach einer Woche begutachtet. Im Ergebnis wurden keine besonderen Toxizitätssymptome beobachtet. Darüber hinaus wurden Gruppen dieser Mäuse zu je acht vier Wochen lang bei einem fettfreien Standard Mischfutter für Mäuse/Ratten (zur Verwendung in der Wachstumsphase, AIN-93G, Oriental Yeast) gehalten, dem 2 Gew.-% Sojabohnenöl und 7 Gew.-% Granatapfelsamenöl, hergestellt wie in Beispiel 1, zugegeben worden waren (Granatapfelsamenölgruppe) oder dem 8,5 Gew.-% Sojabohnenöl und 0,5 Gew.-% Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl, hergestellt wie in Beispiel 1 zugegeben worden waren (Granatapfelsamenöl-abgeleitete Fettsäuregruppe) oder dem 9 Gew.-% Sojabohnenöl zugegeben worden war (Sojabohnenölgruppe). Es wurden Änderungen im Körpergewicht, Änderungen in der Nahrungsaufnahme und der Allgemeinzustand der Mäuse begutachtet. Ferner wurden die Gewichte wichtiger Gewebe nach den vier Wochen gemessen. Im Ergebnis wurde festgestellt, dass es zwischen den Gruppen keinen Unterschied bei der Veränderung des Körpergewichts oder der Nahrungsaufnahme und keine besonderen Anzeichen einer Toxizität gab.
(Beispiel 8) Herstellung von Margarine enthaltend Granatapfelsamenöl
80 Gewichtsanteile einer Fettzusammensetzung bestehend aus 60 Gew.-% gehärtetem Sojabohnenöl (Schmelzpunkt 40°C), 20 Gew.-% Palmöl und 20 Gew.-% Getreideöl, 0,3 Gewichtsanteile Lezithin, 0,3 Gewichtsanteile Monoglycerid, 16 Gewichtsanteile Wasser, 2 Gewichtsanteile eines üblichen Salzes, 5 Gewichtsanteile Granatapfelsamenöl, hergestellt wie in Beispiel 1 und eine kleine Menge an Vitamin E als Antioxidans wurden 15 Minuten bei 60°C unter Verwendung eines TK Homomixers bei 50V und Einblasen von gasförmigem Stickstoff emulgiert. Anschließend wurde unter rascher Abkühlung auf 15°C geknetet, wodurch eine blattförmige Margarine erhalten wurde, die keinerlei Probleme hinsichtlich des Geschmacks aufwies.
(Beispiel 9) Herstellung einer Torte unter Verwendung von Margarine, die Granatapfelsamenöl enthält
1250 g der in Beispiel 8 erhaltenen, Granatapfelsamenöl enthaltenden blattförmigen Margarine, 1500 g schwaches Mehl (niedriger Glutengehalt), 1000 g starkes Mehl (hoher Glutengehalt) und 60 g Trockenmilch wurden vermischt, eine wässrige Lösung, hergestellt durch Auflösen von 45 g Tafelsalz und 1500 g Zucker in 1250 mL Wasser, zugegeben und das Gemisch vorsichtig gemischt, wodurch ein Teig erhalten wurde. Der Teig wurde in eine Blattform gestreckt, eine Form durch fünfmaliges Falten in drei (Lagen) erreicht. Gebacken wurde in einem Ofen, wodurch eine Torte erhalten wurde.
(Beispiel 10) Herstellung von Brot, das Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl enthält
Beim Zusammenmischen von Backzutaten (100 Gewichtsanteile starken Weizenmehls, 3 Gewichtsanteile Hefe, 3 Gewichtsanteile Trockenmilch, 5 Gewichtsanteile Zucker, 70 Gewichtsanteile Wasser, 2 Gewichtsanteile Salz und 7 Gewichtsanteile Margarine) wurde 1 Gewichtsanteil Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl, erhalten wie in Beispiel 1, zu 100 Gewichtsanteilen des Weizenmehls zugegeben. Das Gemisch wurde geknetet, der Fermentation überlassen, wodurch ein Brotteig hergestellt wurde, der Brotteig wurde 60 Minuten bei 25°C einer Bodenzeit überlassen, in Portionen unterteilt, 30 Minuten bei Raumtemperatur einer Bankzeit überlassen, anschließend in Brotformen überführt, 60 Minuten bei einer Temperatur von 38°C und einer Feuchte von 90% belassen und dann in einem Ofen gebacken (45 Minuten bei 190°C), wodurch Brot hergestellt wurde.
(Beispiel 11) Herstellung von Granatapfelsamenöl enthaltender Schokolade
22 Gewichtsanteile Kakaomasse, 10 Gewichtsanteile Kakaobutter, 10 Gewichtsanteile eines anderen Kakaobutterfetts, 8 Gewichtsanteile Vollmilchpulver und 1 Gewichtsanteil Granatapfelsamenöl, hergestellt wie in Beispiel 1, wurden bei 60°C gut gemischt, das Gemisch wurde durch einen Refiner passiert, es wurde conchiert und eine Wärmebehandlung durchgeführt und dann wurde das Gemisch in Formen gegossen und gekühlt, wodurch Schokoladenriegel hergestellt wurden.
(Beispiel 12) Herstellung einer Granatapfelsamenöl enthaltenden schlagbaren Creme
0,8 Gewichtsanteile synthetisches Diglycerolstearat als Emulgator, 0,6 Gewichtsanteile Sojalecithin und 3 Gewichtsanteile Granatapfelsamenöl wurden zu einem Ölgemisch gegeben, bestehend aus 70 Gewichtsanteilen gehärtetem Rübsamenöl mit einem Gleitpunkt („slipping point") von 34°C und 30 Gewichtsanteilen gehärtetem Kokosnussöl mit einem Gleitpunkt von 32°C, während es bei einer Öltemperatur von 70°C schmolz, wodurch eine Ölzusammensetzung hergestellt wurde. Getrennt davon wurden 0,1 Gewichtsanteile Natriumhexametaphosphat zu 54,9 Gewichtsanteilen Magermilch gegeben und die Magermilch wurde unter Rühren auf 55°C erhitzt. 45 Gewichtsanteile der vorstehend genannten, einen Emulgator enthaltenden Ölzusammensetzung wurde dann zu der Magermilch gegeben, eine vorläufige Emulgierung durchgeführt, bei der die Temperatur bei 65°C gehalten wurde, das Gemisch wurde durch einen Homogenisator passiert und die Homogenisierung wurde zuerst bei einem Druck von 80 kg/cm² und dann bei einem Druck von 20 kg/cm² durchgeführt. Anschließend wurde eine Sterilisierung für 15 Sekunden bei 95°C durchgeführt, das Gemisch wurde auf 5°C unter Verwendung eines Platten-artigen Kühlgerätes abgekühlt, dann wurde ein Alterungsprozess für 24 Stunden in einem Inkubator bei 5°C durchgeführt, wodurch eine schlagbare synthetische Creme erhalten wurde. Es gab keinerlei Problem mit dem Geschmack der so erhaltenen Creme.
(Beispiel 13) Herstellung eines Granatapfelsamenöl enthaltenden French Dressing
150 Gewichtsanteile Salatöl, 30 Gewichtsanteile Granatapfelsamenöl, 100 Gewichtsanteile Weinessig und kleine Mengen an Salz und Pfeffer wurden zusammen vermischt. Dadurch wurde ein French Dressing erhalten, mit dem es keinerlei Probleme hinsichtlich des Geschmacks gab.
(Beispiel 14) Herstellung eines Getränkes, das konjugierte ungesättigte Fettsäuren oder Triglyceride davon enthielt
1 Gewichtsanteil Granatapfelsamenöl, Bittermelonesamenöl, Ringelblumensamenöl, Balsamsamenöl, Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl, Fettsäuren aus Tungöl, Fettsäuren aus Ringelblumensamenöl oder Fettsäuren aus Balsamsamenöl, hergestellt wie in Beispiel 1, 8,5 Gewichtsanteile eines gemischten Emulgators und 90,5 Gewichtsanteile einer verzuckerten Substanz mit verminderter Stärke wurden vermischt, wodurch eine Emulsion hergestellt wurde. Sofort anschließend wurde eine Sterilisierung durch Erhitzung auf 80°C für 10 Minuten durchgeführt. 5 Gewichtsanteile der Emulsion wurden dann mit 5 Gewichtsanteilen gekörntem Zucker, 14 Gewichtsanteilen flüssigem Zucker, 1 Gewichtsanteil Aromastoffen, 0,5 Gewichtsanteilen Zitronensäure, 0,2 Gewichtsanteilen Natriumcitrat und 74 Gewichtsanteilen Wasser gemischt, wodurch ein Getränk mit einem pH-Wert von 3,3 erhalten wurde.
(Beispiel 15) Herstellung einer Kapsel für die orale Verabreichung
40 mg Granatapfelsamenöl, Bittermelonesamenöl, Ringelblumesamenöl oder Balsamsamenöl, erhalten wie in Beispiel 1 oder im Handel erhältliches Tungöl, 200 mg Laktose, 70 mg Stärke, 50 mg Polyvinylpyrrolidon und 35 mg kristalline Zellulose wurden vermischt, das Gemisch wurde in eine #3 Gelatinekapsel gefüllt und die Oberfläche mit Gelatine beschichtet, wodurch eine Kapsel für die orale Verabreichung erhalten wurde.
(Beispiel 16) Herstellung von Tabletten für die orale Verabreichung
5 g Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl, Fettsäuren aus Tungöl, Fettsäuren aus Ringelblumensamenöl oder Fettsäuren aus Balsamsamenöl, hergestellt wie in Beispiel 1, 70 g Laktose und 30 g Getreidestärke wurden zu einem einheitlichen Gemisch vermischt. Anschließend wurden 25 mL einer 10%-igen Hydroxypropylzelluloselösung zugesetzt und es wurde gerührt, woraufhin sich ein Granulat bildete. Das Granulat wurde getrocknet und sortiert, 2 g Magnesiumstearat und 2 g Talg wurden zugegeben, es wurde gemischt und es wurden Tabletten unter Verwendung einer Rundläufer-Tablettiermaschine hergestellt.
(Beispiel 17) Herstellung einer Emulsion enthaltend konjugierte Triensäure-Triglyceride
5 Gewichtsanteile Granatapfelsamenöl, Ringelblumensamenöl, Trompetenbaumsamenöl, Bittermelonesamenöl oder Balsamsamenöl, hergestellt wie in Beispiel 1, oder Tungöl wurden zu 95 Gewichtsanteilen Intralipid (Baxter) gegeben und eine Emulgierung durchgeführt, wodurch eine Emulsion enthaltend konjugierte Triensäure-Triglyceride erhalten wurde.
(Beispiel 18) Herstellung von Haustiernahrung, die konjugierte ungesättigte Fettsäuren oder Triglyceride davon enthielt
80 Gewichtsanteile einer Hühnchenpaste, 10 Gewichtsanteile von zerkleinertem rotem Fleisch vom Rind, 10 Gewichtsanteile Sojaprotein, 3 Gewichtsanteile Granatapfelsamenöl, Bittermelonesamenöl, Ringelblumensamenöl, Balsamsamenöl, hergestellt wie in Beispiel 1, Fettsäuren aus Granatapfelsamenöl, Fettsäuren aus Tungöl, Fettsäuren aus Ringelblumensamenöl oder Fettsäuren aus Balsamsamenöl, hergestellt wie in Beispiel 1, 1 Gewichtsanteil chemische Gewürze, 1 Gewichtsanteil Tocopherol und kleine Mengen an Calcium, Vitaminen, Stärke und Sorbit wurden zusammen geknetet, wobei ein Nahrungmittelschneider eingesetzt wurde, in Schafdarm gefüllt, durch Erhitzen auf 90 bis 95°C gekocht und unter einem Luftstrom bei 50°C getrocknet, wodurch eine trockene wurstartige Haustiernahrung erhalten wurde.
Industrielle Anwendbarkeit
Die Öl-/Fett-Zusammensetzung enthaltend konjugierte Triensäuren oder konjugierte Tetraensäuren mit PPAR-Agonisten-Aktivität oder Salze oder Ester-Derivate davon zeigt Wirkungen bei der Verminderung von viszeralem Fett (Bauchfett), supprimierende Wirkungen auf die Akkumulation von viszeralem Fett, günstige Wirkungen auf Abnormalitäten des Lipidstoffwechsels sowie auf Abnormalitäten des Glucosestoffwechsels und supprimierende Wirkungen auf die Krebszellproliferation. Sie kann somit als Gesundheitsgetränk, Gesundheitsnahrung, Nahrungsergänzungsmittel oder Arzneimittelzusammensetzung eingesetzt werden, mit dem Ziel zur Verbesserung der Ernährung oder von Tendenzen zu einer der vorstehend genannten physischen Störungen im Menschen. Sie kann ferner als Inhaltsstoff einer Tiernahrung zur Vorbeugung oder Behandlung von Neigungen zur Fettleibigkeit oder zu Diabetes oder einer Tiernahrung zur Vorbeugung oder Behandlung von Krebs in Haustieren eingesetzt werden.

Claims

Verwendung eines Agonisten, umfassend mindestens einen ausgewählt aus Punicinsäure, die eine konjugierte ungesättigte Fettsäure mit 18 Kohlenstoffatomen ist und eine konjugierte Trien-Struktur (-CH=CH-CH=CH-CH=CH-) in dem Molekül enthält, und Salzen und Esterderivaten davon, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verminderung der Menge an Bauchfett, zur Unterdrückung der Anreicherung von Bauchfett, oder zur Verhinderung oder Verbesserung einer Lipidstoffwechselabnormalität in einem Menschen oder Tier durch die Förderung der Bindung eines Peroxisom-Proliferator-aktivierenden Rezeptors an eine Zielgensequenz und Förderung der nachgeordneten Genexpression in einem Menschen oder Tier.
Verwendung des Agonisten nach Anspruch 1, wobei die Punicinsäure aus Granatapfelsamenöl extrahiert wird.
Verwendung von Granatapfelsamenöl für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verminderung der Menge an Bauchfett, zur Unterdrückung der Anreicherung von Bauchfett, oder zur Verhinderung oder Verbesserung einer Lipidstoffwechselabnormalität in einem Menschen oder Tier durch die Förderung der Bindung eines Peroxisom-Proliferator-aktivierenden Rezeptors an eine Zielgensequenz und Förderung der nachgeordneten Genexpression in einem Menschen oder Tier.