DE60024906T2

DE60024906T2 - Eine am 3'-Ende modifizierte Nukleinsäuresonde, geeignet zur Hybridisierung und Detektion über Fluoreszenz

Info

Publication number: DE60024906T2
Application number: DE60024906T
Authority: DE
Inventors: Ryuichi Zama-shi Horie; Takahiko Yokohama-shi Ishiguro; Takumi Sagamihara-shi Tokunaga; Takashi Yokohama-shi Yamamoto; Juichi Yamato-shi Saitoh; Toshitaka Sagamihara-shi Taya
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1999-03-05
Filing date: 2000-03-06
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2020-03-07
Also published as: EP1035214A3; EP1035214B1; EP1035214A2; DE60024906D1; US6586178B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nucleinsäuresonde, die im Gebiet klinischer Diagnose wie Gendiagnose und im Gebiet der Erforschung unbekannter Gene verwendbar ist, und ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Untersuchung einer DNA oder RNA, die eine spezifische Nucleinsäuresequenz als Ziel-Nucleinsäure enthält, unter Verwendung der Nucleinsäuresonde.
Qualitative oder quantitative Untersuchungen einer Ziel-Nucleinsäure, die (voraussichtlich) eine spezifische Nucleinsäuresequenz enthält, in Proben erfordern hohe Spezifität wie Untersuchungen biogener Komponenten. In für eine Ziel-Nucleinsäure spezifischen Untersuchungen wird ein einzelsträngiges Oligonucleotid (eine Nucleinsäuresonde), welches zu einer spezifischen Nucleinsäuresequenz in der Ziel-Nucleinsäure komplementär ist und sequenzspezifisch an die regionalspezifische Nucleinsäuresequenz in der Ziel-Nucleinsäure bindet, verwendet.
In Untersuchungen einer Ziel-Nucleinsäure unter Verwendung einer Nucleinsäuresonde ist es üblich, die Nucleinsäuresonde mit einer spektroskopisch nachweisbaren Markierung zu verbinden, welche den Nachweis der zwischen der Nucleinsäuresonde und der Ziel-Nucleinsäure spezifisch gebildeten Hybridsequenz ermöglicht. Untersuchungen einer Ziel-Nucleinsäure unter Verwendung einer Nucleinsäuresonde erfordern ebenfalls hohe Nachweisempfindlichkeit. Insbesondere zum Beispiel in klinischen Proben zur Diagnose von Infektionskrankheiten wie Blut sind Ziel-Nucleinsäuren von Viren wie HCV und HIV gewöhnlich in Spurenmengen vorhanden. Daher sind die Verwendung einer Nucleinsäuresonde, die mit einem Enzym markiert ist, zusammen mit einem chemolumineszierenden Substrat des Enzyms und die Verwendung einer Nucleinsäuresonde vorgeschlagen worden, die über einen Linker mit einem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff welcher sich zwischen die Basenpaare einer doppelsträngigen Nucleinsäure einschiebt, verbunden ist.
In den letzten Jahren war es üblich, eine Ziel-Nucleinsäure im Vorhinein durch PCR (Polymerasekettenreaktion) oder dergleichen zu amplifizieren und dann eine Nucleinsäuresonde mit der amplifizierten Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, in der Absicht, die Empfindlichkeit zu erhöhen. Insbesondere weil eine mit einem fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff markierte Nucleinsäuresonde, wie vorstehend erwähnt, kennzeichnenderweise die Notwendigkeit der Verwendung eines Trägers zur Trennung der nicht hybridisierten Ziel-Nucleinsäure aus einem Gemisch einer Ziel-Nucleinsäure und einer Nucleinsäuresonde in herkömmlichen Untersuchungen der Ziel-Nucleinsäure vermeidet, macht die Gegenwart einer derartigen mit einem fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff markierten Nucleinsäuresonde während einer Amplifikationsreaktion wie PCR es möglich, eine Ziel-Nucleinsäure während oder nach der Amplifikation in einem verschlossenen Gefäß ohne Zugabe von Reagenzien während einer Reihe von Verfahren von der Amplifikation bis zur Messung zu messen und die Möglichkeit die Verunreinigung anderer Proben durch Aerosol, das aus einer in Arbeit befindlichen Probe erzeugt wird, zu vermeiden (JP-A-8-211050, Japanische Patenanmeldung JP10-186434 (JP-A-2000-14400, EP-A-969101), EP-A-714986).
Die vorstehend erwähnte Amplifikation durch PCR oder dergleichen in Gegenwart einer Nucleinsäuresonde erzeugt die ausgezeichnete Wirkung des Ermöglichens von Untersuchungen in verschlossenen Gefäßen, was durch herkömmliche Verfahren unmöglich war. Jedoch wird gebräuchliche Amplifikation in Gegenwart einer Nucleinsäuresonde von Verlängerung der Nucleinsäuresonde vom 3'-Ende begleitet, was zu einem erkennbaren Signal der Markierung auch in Abwesenheit der Ziel-Nucleinsäure führen kann.
Für die DNA-Amplifikation durch PCR ist es bekannt, eine oder zwei Basen am 3'-Ende einer Nucleinsäuresonde, das zu einer Ziel-Nucleinsäure nicht komplementär ist, einzuführen (JP-A-8-211050). Aber im Fall der Amplifikation einer RNA als Ziel-Nucleinsäure, umfassend die Synthese einer zu der RNA komplementären DNA unter Verwendung eines Primers und einer reversen Transkriptase entlang der RNA als Matrize, DNA-Verlängerung durch einen zu der so erhaltenen komplementären DNA teilweise komplementären Promotorprimer, ausgelöst durch deren Hybridisierung und anschließend Großproduktion der Ziel-RNA durch die Wirkung einer RNA-Polymerase auf die so erhaltene doppelsträngige DNA, ist festgestellt worden, dass die Verwendung einer derartigen Nucleinsäuresonde zu einem, obgleich schwachen, Signal der Markierung aufgrund von DNA-Verlängerung vom 3'-Ende der Nucleinsäuresonde während der reversen Transkription führen kann.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Nucleinsäuresonde bereitzustellen, welche keine DNA-Verlängerung vom 3'-Ende während der Nucleinsäureamplifikation erfährt, welche die Synthese einer komplementären Nucleinsäure unter Verwendung einer Ziel-Nucleinsäure als Matrize wie die vorstehend erwähnte DNA- und RNA-Amplifikation umfasst. Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Nucleinsäureamplifikation in Gegenwart einer Nucleinsäuresonde durch Verwendung der Nucleinsäuresonde zu verwirklichen.
Um die vorstehend erwähnten Aufgaben zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Anmeldung eine Nucleinsäuresonde bereit, bei der es sich um eine zu einer spezifischen Nucleinsäuresequenz komplementäre einzelsträngige Nucleinsäure handelt, die so markiert ist, dass bei Hybridisierung mit einer Nucleinsäure, die die spezifische Nucleinsäuresequenz enthält, ein messbares fluoreszierendes Signal abgegeben wird, wobei das 3'-Ende der Sonde, wie durch Formel (1) wiedergegeben, modifiziert ist.
Um die vorstehend erwähnten Aufgaben zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung gemäß Anspruch 2 der vorliegenden Anmeldung ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Untersuchung einer Ziel-Nucleinsäure bereit, die eine spezifische Basensequenz enthält, umfassend die Amplifikation der Ziel-Nucleinsäure in Gegenwart einer zu der spezifischen Nucleinsäuresequenz komplementären einzelsträngigen Nucleinsäuresonde, die so markiert ist, dass bei Hybridisierung mit einer Nucleinsäure, die die spezifische Nucleinsäuresequenz enthält, ein messbares Signal abgegeben wird, und Messen der mit der Nucleinsäuresonde hybridisierten amplifizierten Ziel-Nucleinsäure während und/oder nach der Amplifikation, wobei das 3'-Ende der einzelsträngigen Nucleinsäuresonde, wie durch Formel (2) wiedergegeben, modifiziert ist.
1 ist ein Schema, das die Herstellung von in Beispiel 1 erhaltenen Verbindungen zeigt.
2 ist ein Schema, das die Herstellung von in Beispiel 1 erhaltenen Verbindungen zeigt.
3 ist ein Schema, das die Herstellung von in Beispiel 2 erhaltenen Verbindungen zeigt.
4 ist ein Schema, das die Herstellung von in Beispiel 2 erhaltenen Verbindungen zeigt.
5 zeigt die Ergebnisse der Messung in Beispiel 3. Die Fluoreszenzintensität der positiven Probe (voller Kreis) zeigte einen zeitabhängigen Anstieg, während die Fluoreszenzintensität der negativen Probe (volles Quadrat) kaum anstieg.
Die Nucleinsäuresonde der vorliegenden Erfindung kann während des nachstehend erwähnten Verfahrens zur Nucleinsäureamplifikation vorhanden sein. Eine Ziel-Nucleinsäure kann mit der Nucleinsäuresonde der vorliegenden Erfindung nach oder während der Amplifikation der Ziel-Nucleinsäure gemessen werden.
Die Untersuchung einer Ziel-Nucleinsäure basiert auf dem Nachweis der mit einer Ziel-Nucleinsäure hybridisierten Nucleinsäuresonde. Daher weist die Nucleinsäuresonde der vorliegenden Erfindung eine spektroskopisch nachweisbare Markierung wie ein Enzym, eine lumineszierende Substanz oder eine fluoreszierende Substanz auf. Ein fluoreszierender interkalierender Farbstoff ist als Markierung besonders bevorzugt, weil der vorstehend erwähnte Nachweis in einem verschlossenen Gefäß während oder nach Amplifikation einer Ziel-Nucleinsäure bewirkt werden kann.
Obgleich jeder interkalierende Farbstoff wie Oxazolgelb, Thiazolorange, Ethidiumbromid und Acridinorange, der seine Fluoreszenzkennzeichen bei Interkalation zwischen Basenpaaren in einer doppelsträngigen Nucleinsäure ändert, ohne besondere Einschränkung verwendet werden kann, ist Thiazolorange oder Oxazolgelb angesichts der Einfachheit des Nachweises, weil sich ihre Fluoreszenzintensität bei Interkalation merklich erhöht, besonders bevorzugt. Verwendung eines fluoreszierenden interkalierenden Farbstoffs als Markierung macht es möglich, die Ziel-Nucleinsäure, wie vorstehend beschrieben, ohne Verwendung eines festen Trägers zur Trennung der hybridisierten Nucleinsäuresonde von der nicht hybridisierten Nucleinsäuresonde nachzuweisen.
Der interkalierende Farbstoff ist mit der Nucleinsäuresonde über einen geeigneten Linker verbunden.
Die Nucleinsäuresonde der vorliegenden Erfindung ist durch die in Formel (1) wiedergegebene 3'-Modifikation gekennzeichnet, wobei R für -COOH, -CONH₂, -(CH₂)_nOH, -CH(OH)-CH₂OH oder -CH[(CH₂)_n-NHR₁]-CH₂OH steht, R₁ für H, einen Farbstoff oder eine Amino-Schutzgruppe wie Fmoc (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) steht und n eine ganze Zahl von mindestens 1 ist.
Die Herstellung der Nucleinsäuresonde der vorliegenden Erfindung wird durch Verwendung einer mit einem fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff markierten Nucleinsäuresonde als Beispiel erklärt. Zuerst wird ein zu einer spezifischen Nucleinsäuresequenz in der Ziel-Nucleinsäure komplementäres DNA-Oligomer durch ein DNA-Synthesegerät unter Verwendung einer durch die folgende Formel (3) oder (4) wiedergegebenen festen Phase als Ausgangsmaterial synthetisiert.
wobei R₂ für eine Hydroxyl-Schutzgruppe wie eine DMTr (4,4'-Dimethoxytrityl)-Gruppe steht, CGP für einen Träger wie Glas mit kontrollierter Porengröße oder Silica-Gel steht und X für einen beliebigen Linker steht,
wobei R₃ für eine Hydroxyl-Schutzgruppe wie eine DMTr-Gruppe steht, R₄ für -(CH₂)_n-, -CH(OH)-CH₂- oder -CH[(CH₂)_n-NHR₅]-CH₂- steht, R₅ für H, einen Farbstoff oder eine Amino-Schutzgruppe wie Fmoc steht, n eine ganze Zahl von mindestens 1 ist, CGP für einen Träger wie Glas mit kontrollierter Porengröße oder Silica-Gel steht und X für einen beliebigen Linker steht.
Der beliebige Linker, X, in der vorstehenden Formel (3) oder (4) kann ohne besondere Einschränkung jede Verbindung sein, die gegenüber den indem DNA-Synthesegerät durchgeführten Umsetzungen unempfindlich ist.
Nach der DNA-Synthese wird das DNA-Oligomer vom Träger mit einem durch die folgende Formel (5) wiedergegebenen modifizierten 3'-Ende durch herkömmliche Behandlung mit 28%igem Ammoniak oder dergleichen mit begleitender Entfernung der Schutzgruppe von Nucleinsäurebasen und Phosphatresten freigesetzt.
wobei R für -COOH, -CONH₂, -(CH₂)_nOH, -CH(OH)-CH₂OH oder -CH[(CH₂)_n-NHR₁]-CH₂OH steht, R₁ für H, einen Farbstoff oder eine Amino-Schutzgruppe wie Fmoc steht und n eine ganze Zahl von mindestens 1 ist.
Dann wird das so erhaltene DNA-Oligomer mit einem fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff gemäß JP-A-8-211050 oder EP-A-714986 verbunden.
Die Gegenwart der Nucleinsäuresonde der vorliegenden Erfindung während der Amplifikation einer Ziel-Nucleinsäure ist zur Messung der Ziel-Nucleinsäure während und/oder nach der Amplifikation geeignet. Die Nucleinsäuresonde der vorliegenden Erfindung ist am meisten wirksam bei Amplifikation, umfassend DNA-Synthese oder reverse Transkription in DNA unter Verwendung einer Ziel-Nucleinsäure als Matrize, wie DNA-Amplifikation durch PCR durch Verlängerung des Primers entlang einer Ziel-Nucleinsäure (DNA) als Matrize durch die Wirkung einer DNA-Polymerase oder Amplifikation einer RNA als Ziel-Nucleinsäure, umfassend die Synthese einer zu der RNA komplementären DNA unter Verwendung eines Primers und einer reversen Transkriptase entlang der RNA als Matrize, DNA-Verlängerung durch einen zu der so erhaltenen komplementären DNA teilweise komplementären Promotorprimer, ausgelöst durch deren Hybridisierung und anschließend Großproduktion der Ziel-RNA durch die Wirkung einer RNA-Polymerase auf die so erhaltene doppelsträngige DNA.
Es gibt keine besondere Beschränkung des Verfahrens zur später erwähnten RNA-Amplifikation, so lange es DNA-Synthese oder reverse Transkription in DNA unter Verwendung einer Ziel-Nucleinsäure als Matrize beinhaltet, obgleich verschiedene Verfahren wie das NASBA (Nucleinsäure-Sequenz-basierte Amplifikation)-Verfahren, das 3SR (selbstunterhaltende Sequenzreplikation)-Verfahren und das in der Japanischen Patentanmeldung JP10-186434 (JP-A-2000-14400, EP-A-969101) offenbarte Verfahren erwähnt werden können.
Wie vorstehend beschrieben, macht es die Gegenwart der Nucleinsäuresonde der vorliegenden Erfindung während der vorstehend erwähnten Amplifikation möglich, die Ziel-Nucleinsäure während oder nach der Amplifikation der Ziel-Nucleinsäure nachzuweisen und quantitativ zu bestimmen. In diesem Fall ist es, weil es möglich ist, eine Reihe von Verfahren von der Amplifikation bis zur Messung der Ziel-Nucleinsäure ohne Zugabe von Reagenzien von außen durchzuführen, möglich, alle Arbeitsvorgänge in einem geschlossenen Zustand zu beenden, nachdem eine Probe, die notwendigen Amplifikationsreagenzien und die Nucleinsäuresonde der vorliegenden Erfindung in ein Reaktionsgefäß eingebracht wurden.
Nun wird eine Art der Durchführung der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf Beispiele beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch keinesfalls auf diese Beispiele beschränkt. Für die Basenzahlen von HCV-RNA sollte auf die in Kato et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87, 9425-9528) offenbarten Basennummern von HCV-cDNA Bezug genommen werden.
BEISPIEL 1 Herstellung einer mit 3'-Glykolsäure modifizierten Nucleinsäuresonde (1 und 2)
(1) Herstellung von DMTr-Glykolsäure (Verbindung 1 in 1)
DMTr-Glykolsäure wurde aus Glykolsäure (0,078 g, 1,03 mmol) hergestellt. Glykolsäure wurde in 2 ml DMF gelöst und zusammen mit Diisopropylethylamin (0,55 ml, 3,16 mmol) und DMTr-Cl (0,382 g, 1,13 mmol) bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde zur Trockene konzentriert und durch eine Silica-Gelsäule gereinigt, um 0,249 g DMTr-Glykolsäure (Verbindung 1), wie beabsichtigt, in einer 64 % Ausbeute zu ergeben.
(2) Herstellung von DMTr-Glykolyl-CPG (Verbindung 2 in 1)
Trichloressigsäure in Methylenchlorid wurde durch eine mit DMTr-dC CPG (1 μmol, Perkin-Elmer) gepackte Säule geführt, um DMTr-Gruppen zu entfernen. Die Säule wurde mit wasserfreiem Acetonitril gewaschen, mit DMTr-Glykolsäure (Verbindung 1, 0,104 g, 0,275 mmol) und Carbonyldiimidazol (44 mg, 0,27 mmol) in 1 ml THF beladen, dann verschlossen und über Nacht stehen gelassen. Nach der Umsetzung wurde die Säule mit THF gewaschen und mit Essigsäureanhydrid und Methylimidazol-THF zur Acetylierung der nicht umgesetzten Hydroxylgruppen behandelt, um DMTr-Glycolyl-CPG (Verbindung 2) zu ergeben.
(3) Herstellung einer mit 3'-Glykolsäure modifizierten Nucleinsäuresonde (Verbindung 5 in 1)
Ein synthetisches Oligonucleotid (Verbindung 4) aus SEQ ID NO:1 wurde unter Verwendung der vorstehend hergestellten Verbindung 2 (DMTr-Glycolyl-CPG) als fester Phase und CG-Amiditdimer (Verbindung 3) und G-, C-, T-Amiditen als Ausgangsmaterialien durch einen DNA-Synthetisator (Perkin-Elmer, DNA-Synthetisator Model 391) hergestellt. In SEQ ID NO:1 ist ein Linker zwischen dem Cytosin und dem Guanin an den fünften und sechsten Positionen vom 5'-Ende verbunden.
Das so erhaltene Oligonucleotid aus SEQ ID NO:1 wurde mit 28%igem NH₄OH aus der CPG-Säule eluiert und bei 60°C für 2 h zum Entfernen der Schutzgruppe erwärmt. Das so erhaltene synthetische Oligonucleotid (Verbindung 5) wurde durch HPLC (TSK-Gel ODS-120T, Tosoh Corporation) gereinigt und lyophilisiert. Ausbeute 18,2 OD, 159 nmol.
Wie in 2 gezeigt, wurde die auf diese Weise erhaltene Verbindung 5 (18,2 OD) in 50 μl destilliertem Wasser gelöst und mit 50 μl 0,2 M Na₂HPO₄ und 100 μl 5%iger SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat)/DMSO-Lösung gemischt. Nach 2 h Stehen bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung mit 0,5 ml destilliertem Wasser verdünnt und mit Chloroform gewaschen. Die wässrige Schicht wurde konzentriert, durch Gelfiltration entsalzt und durch HPLC (TSK-Gel ODS-120T, Tosoh Corporation) gereinigt, um Verbindung 6 zu ergeben. Ausbeute 2,4 OD, 21 nmol.
Verbindung 6 (2,4 OD) wurde lyophilisiert und der Rückstand wurde in 200 μl destilliertem Wasser gelöst, mit 20 μl 1 M Tris-HCl (pH-Wert 5,1) und 20 μl 1 M DTT (Dithiothreitol) gemischt und für 30 min. stehen gelassen. Die mit DTT behandelte Reaktionslösung wurde mit einem 200 μl-Teil einer Lösung von Verbindung 7 (1 mg) in einem Gemisch aus 200 μl DMF, 600 μl destilliertem Wasser und 200 μl 0,5 M Na₂HPO₄ (pH-Wert 9,5) gemischt und bei Raumtemperatur für 1 h stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit Butanol gewaschen und konzentriert und Ethanol wurde zugegeben, um das Rohprodukt auszufällen.
Die Ausfällung wurde durch HPLC (TSK-Gel ODS-120T, Tosoh Corporation) gereinigt, um, wie beabsichtig, die mit 3'-Glykolsäure modifizierte fluoreszierende Sonde (Verbindung 8), zu ergeben. Ausbeute 0,43 OD, 3,74 nmol.
BEISPIEL 2 Herstellung einer mit 3'-Glycerin modifizierten Nucleinsäuresonde (Verbindung 12) (3 und 4)
Wie in 3 gezeigt, wurde ein synthetisches Oligonucleotid aus SEQ ID NO:2 (Verbindung 9) unter Verwendung von DMTr-Glycerol-CPG (0,2 μmol × 2, Peninsula Laboratories, Inc.) als fester Phase und der vorstehend erwähnten Verbindung 3 und G-, C-, T-Amiditen als Ausgangsmaterialien durch ein DNA-Synthetisator (Perkin-Elmer, DNA-Synthetisator Model 391) hergestellt. In SEQ ID NO:2 ist ein Linker zwischen dem Cytosin und dem Guanin an den fünften und sechsten Positionen vom 5'-Ende verbunden.
Das so erhaltene Oligonucleotid aus SEQ ID NO:2 (Verbindung 9) wurde mit 28%igem NH₄OH aus der CPG-Säule eluiert und bei 60°C für 2 h zum Entfernen der Schutzgruppe erwärmt. Das so erhaltene synthetische Oligonucleotid (Verbindung 10) wurde durch HPLC (TSK-Gel ODS-120T, Tosoh Corporation) gereinigt und lyophilisiert. Ausbeute 3,75 OD, 33 nmol. Unter den 13 Basen im synthetischen Oligonucleotid aus SEQ ID NO:2 sind die 11 Basen vom 5'-Ende komplementär zu der nachstehend erwähnten Ziel-Nucleinsäure.
Wie in 4 gezeigt, wurde die auf diese Weise erhaltene Verbindung 10 (OD 3,75) in 50 μl destilliertem Wasser gelöst und mit 50 μl von 0,2 M Na₂HPO₄ und 100 μl 5%iger SPDP/DMSO-Lösung gemischt. Nach 2 h Stehen bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung mit 0,5 ml destilliertem Wasser verdünnt und mit Chloroform gewaschen. Die wässrige Schicht wurde konzentriert, durch Gelfiltration entsalzt und durch HPLC (TSK-Gel ODS-120T, Tosoh Corporation) gereinigt, um Verbindung 11 zu ergeben. Ausbeute 0,10 OD, 0,87 nmol.
Verbindung 11 (0,11 OD) wurde lyophilisiert und der Rückstand wurde in 200 μl destilliertem Wasser gelöst, mit 20 μl 1 M Tris-HCl (pH-Wert 5,1) und 20 μl 1 M DTT gemischt und für 30 min. stehen gelassen. Die mit DTT behandelte Reaktionslösung wurde mit einem 200 μl-Teil einer Lösung der vorstehend erwähnten Verbindung 7 (1 mg) in einem Gemisch aus 200 μl DMF, 600 μl destilliertem Wasser und 200 μl 0,5 M Na₂HPO₄ (pH-Wert 9,5) gemischt und bei Raumtemperatur für 1 h stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit Butanol gewaschen und konzentriert und Ethanol wurde zugegeben, um das Rohprodukt auszufällen. Die Ausfällung wurde durch HPLC (TSK-Gel ODS-120T, Tosoh Corporation) gereinigt, um, wie beabsichtigt, eine mit 3'-Glycerol modifizierte Nucleinsäuresonde (Verbindung 12), zu ergeben. Ausbeute 0,018 OD, 0,16 nmol.
BEISPIEL 3
Das folgende Verfahren zur HCV-RNA-Amplifikation bei konstanter Temperatur wurde mit einer positiven Probe (enthaltend eine Standard-HCV-RNA als Ziel-Nucleinsäure (eine aus den Basen 113 bis 267 in HCV-RNA bestehende RNA)) oder einer negativen Probe (die Ziel-Nucleinsäure nicht enthaltend) in Gegenwart einer mit einem fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff markierten Nucleinsäurensonde (Verbindung 8) durchgeführt und die Veränderung des Fluoreszenzsignals wurde gemessen.
18,25 μl einer Reaktionslösung mit der folgenden Zusammensetzung wurde in jedes PCR-Röhrchen gegossen.

1,20 μl 1 M Trisacetat (pH-Wert 8,1)
0,40 μl 1 M Magnesiumacetat
1,88 μl 2 M Kaliumacetat
8,00 μl 60%iges Sorbit
0,60 μl DMSO (Dimethylsulfoxid)
3,00 μl 100 mM DTT (Dithiothreit)
1,50 μl 20 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP
0,30 μl 20 μM Promotorprimer (SEQ ID NO:3; die Basen 113 bis 137 in HCV-RNA enthaltend)
0,30 μl 20 μM Antisense-Primer (SEQ ID NO:4; einzelsträngige Oligo-DNA komplementär zu den Basen 248 bis 267 in HCV-RNA)
1,07 μl entionisiertes Wasser

50 μl Mineralöl wurden über die Reaktionslösung gelegt und 4 μl der Standard-HCV-RNA (1000 Kopien/4 μl) als positive Probe oder TE-Puffer als negative Probe wurden zugegeben. Dann wurde die Umsetzung bei 50°C für 5 min. durchgeführt. Nach der Umsetzung wurden 5,25 μl einer Reaktionslösung mit der folgenden Zusammensetzung zugegeben.

3,40 μl 50 U/μl SP6-RNA-Polymerase
1,24 μl 34 U/μl reverse AMV-Transkriptase
0,15 μl 20 mg/ml BSA
0,46 μl 130 U/μl RNase-Inhibitor

Anschließend zur Zugabe der Reaktionslösung wurde die Umsetzung bei 50°C für 5 min. durchgeführt. Ferner wurden jeweils 1,50 μl 20 mM von ATP, GTP, CTP und UTP zugegeben und die Umsetzung wurde bei 50°C für 5 min. durchgeführt. Dann wurde 1,00 μl 0,75 μM mit 3'-Glykolsäure modifizierter Nucleinsäuresonde (Verbindung 8) zugefügt und die Fluoreszenzintensität wurde durch einen Fluoreszenzdetektor (Anregungswellenlänge; 490 nm, Emissionwellenlänge; 510 nm) in 5-min. Abständen beginnend mit der Zugabe von ATP, GTP, CTP und UTP gemessen.
Der auf diese Weise erhaltene Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität ist in 5(a) gezeigt. Bei der negativen Probe stieg die Fluoreszenzintensität während der 120 minütigen Messung kaum, während bei der positiven Probe die Fluoreszenzintensität bei etwa 50 min. zu steigen begann und bei etwa 100 min. ein Plateau erreichte.
Zum Vergleich wurde dasselbe Verfahren mit einer aus dem synthetischen Oligonucleotid von SEQ ID NO:5 erhaltenen Nucleinsäuresonde durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 5(b) gezeigt. Die zum Vergleich verwendete Sonde ist dieselbe, wie die vorstehend erwähnte mit 3'-Glykolsäure modifizierte Nucleinsäuresonde, außer dass sie eine verschiedene 3'-Endsequenz aufweist und am 3'-Ende nicht modifiziert ist.
5(b) zeigt, dass bei der Sonde, welche nicht zur Ziel-Nucleinsäure am 3'-Ende komplementär ist und am 3'-Ende nicht modifiziert ist, obgleich die Fluoreszenzintensität der positiven Probe einen zeitabhängigen Anstieg zeigte, die Fluoreszenzintensität der negativen Probe als Hintergrundfluoreszenz während der 120 minütigen Messung anstieg.
Diese Ergebnisse zeigen, dass bei der Amplifikation einer Nucleinsäure in Gegenwart einer mit einem fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff verbundenen DNA-Sonde eine Nucleinsäuresonde mit einer 3'-Modifikation wie einer 3'-Glykolsäuremodifikation wirksam ist, um die Empfindlichkeit und Präzision durch Verhindern von Amplifikation der Nucleinsäuresonde selbst oder Verringern des Hintergrundsignals zu verbessern.
Aufgrund der chemischen Modifikation am 3'-Ende erfährt die Nucleinsäursonde der vorliegenden Erfindung keine Nucleinsäureverlängerungsreaktion vom 3'-Ende, auch wenn sie während der Amplifikation einer Nucleinsäure, umfassend die Synthese einer komplementären Nucleinsäure unter Verwendung einer Ziel-Nucleinsäure als Matrize wie DNA- oder RNA-Amplifikation vorhanden ist. Daher ist es, sobald die zur Amplifikation einer Ziel-Nucleinsäure notwendigen Reagenzien und die zur Messung der Ziel-Nucleinsäuresonde notwendige Nucleinsäuresonde der vorliegenden Erfindung in ein Reaktionsgefäß gegeben werden, möglich, alle Arbeitsvorgänge zu beenden, während das Reaktionsgefäß verschlossen bleibt. Infolgedessen ist es möglich, eine Ziel-Nucleinsäure mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit ohne die Möglichkeit der Verunreinigung anderer Proben aufgrund der Erzeugung von Aerosol durch Kombinieren der Nucleinsäuresonde mit verschiedenen Verfahren zur Amplifikation einer Ziel-Nucleinsäure zu untersuchen.
Sequenzprotokoll

Claims

Nucleinsäuresonde, bei der es sich um eine zu einer spezifischen Nucleinsäuresequenz komplementäre einzelsträngige Nucleinsäure handelt, die so markiert ist, dass bei Hybridisierung mit einer Nucleinsäure, die die spezifische Nucleinsäuresequenz enthält, ein messbares fluoreszierendes Signal abgegeben wird, wobei das 3'-Ende der Sonde wie durch die folgende Formel (1) wiedergegeben modifiziert ist:
wobei R für -COOH, -CONH₂, -(CH₂)_nOH, -CH(OH)-CH₂OH oder -CH[(CH₂)_n-NHR₁]-CH₂OH steht, R₁ für H, einen Farbstoff oder eine Amino-Schutzgruppe, wie z.B. Fmoc, steht, und n eine ganze Zahl von mindestens 1 ist.
Verfahre n zum Testen einer Ziel-Nucleinsäure, die eine spezifische Basensequenz enthält, umfassend die Amplifikation der Ziel-Nucleinsäure in Gegenwart einer zu der spezifischen Nucleinsäuresequenz komplementären einzelsträngigen Nucleinsäuresonde, die so markiert ist, dass bei Hybridisierung mit einer Nucleinsäure, die die spezifische Nucleinsäuresequenz enthält, ein messbares Signal abgegeben wird, und den Nachweis oder die quantitative Bestimmung der spezifischen Nucleinsäure unter Verwendung einer Hybridisierung der amplifizierten Ziel-Nucleinsäure mit der Nucleinsäuresonde während und/oder nach der Amplifikation, wobei das 3'-Ende der einzelsträngigen Nucleinsäuresonde wie durch die folgende Formel (2) wiedergegeben modifiziert ist:
wobei R für -COOH, -CONH₂, -(CH₂)_nOH, -CH(OH)-CH₂OH oder -CH[(CH₂)_n-NHR₁]-CH₂OH steht, R₁ für H, einen Farbstoff oder eine Amino-Schutzgruppe, wie z.B. Fmoc, steht, und n eine ganze Zahl von mindestens 1 ist.