DE60020981T2

DE60020981T2 - ANT-1 als Arzneimittelziel

Info

Publication number: DE60020981T2
Application number: DE60020981T
Authority: DE
Inventors: Stefan Grimm; Manuel Bauer; Alexis Schubert; Ursula Cramer
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date: 1999-09-10
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2020-09-09
Also published as: EP1212078A2; ATE298243T1; WO2001019384A2; WO2001019384A3; EP1212078B1; AU7652000A; DE60020981D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Adenin-Nukleotid-Translocase-1 (ANT-1), einem zentralen Bestandteil der Permeability-Transition-Pore in Mitochondrien, als ein Arzneimittelziel, insbesondere für die Behandlung von dilatativer Kardiomyopathie. Weiterhin ist ein Assay für den Nachweis von pharmakologisch wirksamen Substanzen, welche die ANT-1-Aktivität hemmen, offenbart. Außerdem wird ANT-1-Expression als diagnostischer Marker für dilatative Kardiomyopathie beansprucht.
Apoptose ist eine Form des Zelltods, die bei der Entwicklung, Gewebehomöostase und -Erkrankung eine Rolle spielt (White, 1996). Ihre Induktion muss genau reguliert werden. Andernfalls können schwerwiegende Folgen auftreten: Eine hyperaktive Apoptoseinduktion könnte zu degenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Erkrankung führen (Loo et al., 1993); eine verminderte Aktivität kann zu dem mehrstufigen Prozess der Tumorgenese beitragen, da Tumorzellen multiplen proapoptotischen Stimuli ausgesetzt sind (McGill, 1997). Die Induktion der Apoptose wird in der Zelle daher durch eine genau ausgearbeitete Anordnung von Kontrollen und Gleichgewichten reguliert. Schließlich wird eine Familie von Cysteinproteasen, die sog. Caspasen, aktiviert (Salvesen und Dixit, 1997). Diese Enzyme können spezifische Substrate in der Zelle spalten, was zu dem typischen apoptotischen Phänotyp und der Selbstzerstörung der Zelle führt.
Der erste Hinweis darauf, dass Mitochondrien bei der Apoptoseinduktion eine Rolle spielen, war die Beobachtung, dass bei einem in vitro-System zur Apoptoseinduktion die Anwesenheit von Mitochondrien erforderlich war (Newmeyer et al., 1994). Der Permeability-Transition-Pore (PT)-Komplex (Zoratti und Szabo, 1995), ein Proteinaggregat, welches in Kontaktstellen der inneren und äußeren mitochondrischen Membran vorliegt, wurde daraufhin als verantwortlich für die Apoptoseinduktion identifiziert (Petit et al., 1995; Zamzami et al., 1995b). Es ist gezeigt worden, dass multiple pharmakologische Stimuli diesen Komplex auf eine bislang unbekannte Weise aktivieren (Fulda et al., 1998; Petit et al., 1995; Zamzami et al., 1998). Der aktivierte Komplex führt zu dem Zusammenbruch des Potenzials über die innere mitochondrische Membran (ΔΨ_m), zum Anschwellen von Mitochondrien und zur Bildung von Sauerstoffradikalen (Vander Heiden et al., 1997; Zamzami et al., 1995a). Die anschließende Freisetzung von apoptogenen Caspasen (Susin et al., 1999a) und einer putativen Oxidoreductase (Susin et al., 1999b) trägt zu der Apoptoseinduktion bei.
Viele an der Apoptose beteiligten Gene besitzen eine dominante Fähigkeit, bei Überexpression Zelltod zu induzieren. Dieses Merkmal ist selbst über Spezien hinweg konserviert (McCarthy und Dixit, 1998). Die Erklärung dafür könnte in der Tatsache liegen, dass die überexprimierten Proteine an Protein-Protein-Kontakten teilnehmen und dadurch das Signal zur Apoptose erzeugen können (Yang et al., 1998). Folglich haben wir vor kurzem ein Screening für dominante, Apoptose-induzierende Gene entwickelt (Grimm und Leder, 1997). Das Screening beruht auf der iterativen Transfektion kleiner Plasmidvorräte einer standardisierten cDNA-Bibliothek in Säugerzellen und der morphologischen Bestimmung der Apoptoseinduktion.
Hier beschreiben wir die Isolierung von Adenin-Nukleotid-Translocase-1 (ANT-1), einer zentralen Komponente der Permeability-Transition-Pore, unter Verwendung eines solchen Screenings. Es wurde vor kurzem gezeigt, dass ANT-1 für die durch Bax, einer weiteren Komponente des PT-Komplexes, vermittelte Apoptose erforderlich ist (Marzo et al., 1998a). Umgekehrt kann ANT-1 Apoptose in Abhängigkeit von Bax induzieren. Hierfür muss ANT-1 durch das chemische Atraktylosid, welches ANT-1 in einer spezifischen Konformation festhält und PT-Porenöffnung verursacht, pharmakologisch aktiviert werden (Marzo et al., 1998a). In unseren Experimenten mit ANT-1 ist jedoch ein solches sekundäres Signal für die Apoptoseinduktion nicht erforderlich. Die Apoptoseaktivität von ANT-1 scheint nicht von ihrer bekannten Funktion für den ADP/ATP-Austausch abhängig zu sein, da verschiedene Transport-inaktive Mutanten noch immer zu Zelltod führen könnten. Überraschenderweise haben wir herausgefunden, dass ein sehr homologes Protein, der ANT-2-Transporter, für die Apoptoseinduktion inaktiv war. Ferner konnte ANT-1 in Hefe keine Form des Zelltodes auslösen. Dies steht im Gegensatz zu Bax, welches direkt mit ANT-1 wechselwirkt und dominant Zelltod in Hefe induzieren kann. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die durch ANT-1 vermittelte Apoptoseinduktion von Protein-Protein-Wechselwirkungen abhängig ist, die spezifisch für Säugerzellen sind und dass sie unabhängig von der durch Bax vermittelten Apoptose ist. Da ANT-1 durch Überexpression zur Apoptoseinduktion aktiviert wird, ist es interessant festzustellen, dass dieses Gen in Mitochondrien bereits stark exprimiert wird. Dies legt nahe, dass es in einer normalen Zelle durch andere Proteine der PT-Pore inaktiv gehalten werden muss, was wichtige stöchiometrische Beziehungen zwischen den verschiedenen Komponenten dieses Komplexes impliziert. In Übereinstimmung damit haben wir herausgefunden, dass Cyclophilin D, eine weitere Komponente der PT-Pore, die durch ANT-1 induzierte Apoptose unterdrücken kann. Darüber hinaus helfen unsere Daten dabei, die beobachtete Apoptoseinduktion dilatativer Kardiomyophathie (DCM), einer degenerativen Erkrankung des Herzmuskels, die durch eine drastische Steigerung der Expression von ANT-1 und durch übermäßige Apoptoseinduktion gekennzeichnet ist, zu erklären.
Diese Ergebnisse sind bislang der direkteste genetische Beweis dafür, dass die PT-Pore Apoptose signalisieren kann und können zur molekularen Aufklärung darüber führen, wie dieser Komplex für die Apoptoseinduktion aktiviert werden kann.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer wirksamen Menge einer Substanz, die geeignet ist, um die Aktivität von Adenin-Nukleotid-Translocase-1 (ANT-1) zu hemmen, insbesondere die Apoptose induzierende Aktivität von ANT-1, für die Hemmung von Apoptose in einer isolierten Zelle.
Die Zelle ist bevorzugt eine Wirbeltierzelle, weiter bevorzugt eine Säugerzelle und noch weiter bevorzugt eine menschliche Zelle, z.B. ein menschlicher Myozyt.
Die Hemmung kann einen Apoptose-induzierenden Signalübertragungsweg bewirken, wobei der Weg durch ANT-1 aktiviert wird. Die Aktivität von ANT-1 kann auf der Nukleinsäureebene und/oder auf der Proteinebene gehemmt werden. Die Hemmung auf der Nukleinsäureebene kann durch Verringerung der ANT-1-Genexpression, z.B. durch Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden, welche die ANT-1-Gentranskription hemmen können, durch Verwendung von Ribozymen, die in der Lage sind, ANT-1-Transkripte zu spalten oder durch Hemmung der Aktivität des endogenen Promotors, z.B. über ANT-1-spezifische Transkriptionsfaktoren bewirkt werden. Die Verringerung der ANT-1-Expression kann auch durch Beeinflussen der Aktivität der Proteine, welche stromaufwärts dieser Transkriptionsfaktoren wirken, wie beispielsweise Proteinkinasen und Phosphatasen, erreicht werden. Eine Hemmung auf der Proteinebene kann durch Anti-ANT-1-Antikörper, durch ANT-1-regulatorische Proteine, z.B. durch Proteine, welche in Permeability-Transition-Poren auftreten, wie beispielsweise Cyclophilin D oder durch Substanzen mit geringem Molekulargewicht, welche in der Lage sind, die apoptotische oder proapoptotische Aktivität von ANT-1 zu hemmen, bewirkt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer pharmazeutisch wirksamen Menge einer Substanz, die in der Lage ist, die Aktivität von Adenin-Nukleotid-Translocase-1 (ANT-1), insbesondere die Apoptose-induzierende Aktivität von ANT-1 zu hemmen, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von degenerativen Erkrankungen, die mit übermäßiger Apoptose im Zusammenhang stehen. Beispiele von Erkrankungen, welche durch Verabreichung von ANT-1-Antagonisten behandelt werden können, sind dilatative Kardiomyopathie und andere humane pathogene Erkrankungen, die mit übermäßiger Apoptose im Zusammenhang stehen. Weiter bevorzugt ist die Erkrankung dilatative Kardiomyopathie.
Der ANT-1-Antagonist kann als eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche den Wirkstoff ggf. zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln, Trägern oder Hilfsstoffen umfasst, verabreicht werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann für orale, parenterale, z.B. intradermale, intravenöse oder intramuskuläre, rektale, nasale und topische Anwendungen geeignet sein. Die Zusammensetzung kann eine Injektionslösung, Salbe, Creme oder Spray sein. Ferner kann die Zusammensetzung Retardierungseigenschaften aufweisen, beispielsweise kann sie eine verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs zeigen.
Die Dosierung des Wirkstoffs hängt von der spezifischen Verbindung, die verabreicht wird, der Art und Schwere der Erkrankung ab. Z.B. ist eine Dosierung des Wirkstoffs von 0,01 mg bis 100 mg pro Tag und pro kg Körpergewicht geeignet.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein in vitro-Verfahren zum Identifizieren von Substanzen, die zur Apoptosehemmung geeignet sind, welches den Schritt der Bestimmung der Fähigkeit einer Testsubstanz, die Aktivität von ANT-1, im Besonderen die Apoptose induzierende Aktivität von ANT-1, zu hemmen, umfasst. Bevorzugt kann die Fähigkeit einer Testsubstanz, ANT-1 oder eine Domäne davon zu binden, bestimmt werden. Insbesondere die N-terminate Domäne von ANT-1, welche die Aminosäuren 1-150, bevorzugt die Aminosäuren 1–200 umfasst, ist für die Bestimmung der Bindung von Testsubstanzen geeignet. Alternativ kann die Fähigkeit von Testsubstanzen, die Bindung von ANT-1 an dessen natürliche Bindungspartner wie beispielsweise Cyclophilin D zu hemmen, bestimmt werden. Somit wird eine Substanz, welche ANT-1 oder eine Domäne davon bindet oder die Bindung von ANT-1 an dessen natürliche Bindungspartner hemmt, als Apoptoseinhibitor identifiziert.
Die Identifikation von ANT-1-Antagonisten kann als ein Hochdurchsatz-Assay durchgeführt werden, welches bevorzugt eine parallele Bestimmung von mindestens 24 und weiter bevorzugt mindestens 96 Testverbindungen umfasst. Der Assay kann als ein Assay auf Zellbasis durchgeführt werden, wobei ein Testsystem, welches ANT-1-haltige Zellfraktionen oder vollständige ANT-1-haltige Zellen umfasst, verwendet wird. Alternativ kann der Assay als ein Assay auf Molekülbasis durchgeführt werden, welcher ein im Wesentlichen gereinigtes und isoliertes Protein ausgewählt aus ANT-1 oder einer Domäne davon, insbesondere einer N-terminalen Domäne davon umfasst. Das im Wesentlichen gereinigte ANT-1-Protein kann ein rekombinantes ANT-1-Protein sein, bei dem es sich um ein lösliches Protein (durch Deletion von Membranankerdomänen) oder ein Membran-gebundes Protein handeln kann.
In einem Assay auf Zellbasis kann der Bestimmungsschritt die Messung der Apoptoseinduktion umfassen. Die Apoptoseinduktion kann durch einen Parameter gemessen werden, der im Zusammenhang mit Apoptose steht, wie beispielsweise DNA-Fragmentierung, Caspase-Aktivierung oder charakteristische Veränderungen der Zellmorphologie oder durch andere qualitative und/oder quantitative Verfahren zur Apoptosemessung, die im Fachbereich bekannt sind. In Assaysystemen auf molekularer Basis kann die Bestimmung die Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, z.B. die Wechselwirkung von ANT-1 mit anderen Proteinen oder eine direkte Messung der Wechselwirkung von Testverbindungen mit ANT-1, umfassen.
Da die Erfindung hochreguliertes ANT-1 als Arzneistoffziel in dilatativer Kardiomyopathie oder anderen degenerativen Erkrankungen beschreibt, ist ein weiterer Aspekt dieser Erfindung die Untersuchung der ANT-1-Expressionsmengen bei Patienten als ein diagnostischer Marker. Die ANT-1-Expression kann durch herkömmliche Verfahren detektiert und quantifiziert werden, z.B. auf der RNA-Ebene durch Hybridisierung und/oder Amplifikationsverfahren oder auf der Proteinebene durch Antikörper und/oder Aktivitätsassays. Somit betrifft die Erfindung ein in vitro-Verfahren für die Diagnose einer degenerativen Erkrankung oder einer Prädisposition dafür, welches die Bestimmung der ANT-1-Expression in einer Gewebeprobe und/oder Körperflüssigkeiten eines zu untersuchenden Subjekts umfasst, wobei eine erhöhte ANT-1-Expression ein Anzeichen für eine degenerative Erkrankung oder eine Prädisposition dafür ist.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Beispiele weiter veranschaulicht.
Beschreibung der Figuren
1. Adenin-Nukleotid-Translocase-1 (ANT-1)-Expression führt zu phänotypischer Apoptoseinduktion. Der leere Vektor oder ein Expressionsplasmid für ANT-1 wurden transient in 293T-Zellen transfiziert. Nach 16 h wurden Phasenkontrastbilder bei einer 200-fachen Vergrößerung aufgenommen.
2. Wirkung der ANT-1-Expression auf Mitochondrien. (A) Eine ANT-1-Überexpression führt zum Zusammenbruch des inneren mitochondrischen Membranpotenzials. HeLa-Zellen wurden mit einem Expressionsvektor für GFP (2 μg) zusammen mit einem Kontrollvektor ("Vektor"; 2 μg) oder einem Plasmid für ANT-1 ("ANT-1"; 2 μg) transfiziert. Nach 16 h wurden die Zellen mit CMXRos behandelt, welches Mitochondrien mit einem intakten Membranpotenzial anfärbt. Anschließend wurden Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopiebilder für GFP und CMXRos-Aktivität aufgenommen. (B) ANT-1 induziert die Freisetzung von Cytochrom c aus Mitochondrien. 293T-Zellen wurden mit einem Kontrollvektor oder einem Expressionsvektor für ANT-1 transfiziert. Cytoplasmaextrakte wurden hergestellt und durch ein Western Blot auf die Anwesenheit von Cytochrom c untersucht. Molekulargewichtsstandards sind links angegeben. Gleiche Beladung des Gels ist durch eine obere unspezifische Bande mit gleicher Intensität gezeigt.
3. Wirkung von ANT-1 auf Protein- und DNA-Degradation. (A) ANT-1 führt zur Degradation von Poly-ADP-Ribosepolymerase (PARP). 293T-Zellen wurden mit einem leeren Kontrollvektor, einem Expressionsvektor für das "Todesdomäne"-Protein RIP oder mit ANT-1 transfiziert. 16 h später wurden nukleare Extrakte der transfizierten Zellen hergestellt und in einem Western Blot auf den Status von PARP untersucht. Das erzeugte PARP-Fragment ist durch einen Pfeil gezeigt. Ein unspezifisches Signal (o) diente als eine innere Kontrolle für eine gleiche Beladung des Gels. (B) Hemmung der ANT-1-Apoptose durch einen spezifischen Inhibitor für Caspasen. ANT-1 (1 μg) und ein Kontrollvektor (10 μg) oder ein Expressionsvektor (10 μg) für den Caspaseinhibitor p35 von Baculovirus wurden cotransfiziert und die spezifische Apoptoseinduktion wurde durch FACS-Analyse bestimmt. Die Mittelwerte und die Standardabweichungen sind angegeben (n=3) (C) ANT-1 induziert internukleosomale DNA-Spaltung. 293T-Zellen wurden mit einem leeren Vektor oder mit einem Expressionskonstrukt für ANT-1 transfiziert. DNA mit niedrigem Molekulargewicht wurde aus transfizierten Zellen isoliert, auf einem 2%-igen Agarosegel abgetrennt und mit Ethidiumbromid eingefärbt.
4. Mutationsanalyse der Apoptoseaktivität von ANT-1 (A) Induktion von Zelltod durch Punktmutationen von ANT-1. Wildtyp-ANT-1 (ANT-1 WT) und sechs Punktmutanten, von denen gezeigt worden ist, dass sie für ADP/ATP-Transport defizient sind, wurden in 293T-Zellen transfiziert. Die WT-Aminosäure, ihre Position sowie der mutierte Rest sind für jedes Mutant-Konstrukt angegeben. Nach 16 h wurde Apoptoseinduktion durch die verschiedenen Konstrukte mittels eines ELISA für internukleosomale DNA-Fragmente gemessen. Die DNA-Fragmentierung als Prozentsatz der Kontrolle ist als ein Index für die Apoptoseinduktion angegeben. Die Mittelwerte und die Standardabweichungen sind angegeben (n=3). (B) Apoptoseaktivität von ANT-1-Deletionsmutanten. Wildtyp-ANT-1 (1 μg) und 3 Mutanten mit C-terminaler Deletion (1 μg) wurden transient in 293T-Zellen transfiziert. Der letzte C-terminale Rest jedes Deletionsmutanten ist angegeben. Nach 16 h wurden die Konstrukte durch ein spezifisches ELISA auf Apoptoseinduktion getestet wie in A beschrieben.
5. Wirkung von ANT-1 und ANT-2 auf transfizierte Zellen. (A) Vergleich der Apoptosefähigkeiten von ANT-1 und ANT-2. Expressionsplasmide für ANT-1 (1 μg) und ANT-2 (1 μg) wurden in 293T-Zellen transfiziert. Nach 16 h wurde Apoptoseinduktion in transfizierten Zellen mittels FACS-Analyse von Sub-G1-positiven Zellen gemessen. Die spezifische Apoptoseinduktion oberhalb des Hintergrunds ist als Prozentsatz von apoptotischen Zellen bezogen auf alle transfizierten Zellen gezeigt. Die Mittelwerte und Standardabweichungen sind angegeben (n=3). (B) Expression und Lokalisierung von ANT-1 und ANT-2. 293T-Zellen wurden mit einem Kontrollvektor oder Expressionsvektoren für HA-markierte ANT-1 und ANT-2 transfiziert. Mitochondrienextrakte von transfizierten Zellen wurden hergestellt und mit einem Anti-HA-Antikörper in einem Western Blot auf die Anwesenheit der Proteine untersucht. Gleiche Beladung des Gels wurde durch zwei unspezifische obere Banden verifiziert.
6. Wirkung von Bax- und ANT-1-Expression auf das Wachstum von Hefezellen. Bax und ANT-1, kloniert in Expressionsvektoren unter der Kontrolle eines Galactose- und Raffinose-induzierbaren Promotors, und der leere Kontrollvektor wurden in Hefezellen eingeführt. 4,5 × 10⁴ Hefezellen von jeweils drei unterschiedlichen Klonen wurden auf Glucose (Glu)- oder Galactose- und Raffinose (Gal/Raf)-haltiges Agar platziert. Das Wachstum der Hefezellen wurde 36 h später untersucht.
7. Hemmung von ANT-1-induzierter Apoptose. (A) ANT-1-induzierte Apoptose kann durch Bongkreksäure, einen spezifischen Inhibitor der PT-Pore, unterdrückt werden. Ein Expressionvektor für ANT-1 (1 μg) wurde in Platten mit 293T-Zellen transfiziert. Eine Gruppe der Platten wurde unbehandelt belassen, zu der anderen wurden 50 μM Bongkreksäure ("BA") für 16 h nach der Transfektion zugegeben. Apoptose wurde wie in 5 quantifiziert. (B) ANT-1-Apoptose kann durch Cyclophilin D, eine weitere Komponente der Permeability-Transition-Pore, unterdrückt werden. ANT-1 (1 μg) und ein Expressionsplasmid (10 μg) für Cyclophilin D ("Cyclo D") oder ein Kontrollvektor (10 μg) wurden in 293T-Zellen transfiziert und Apoptose wurde wie in 5 beschrieben bestimmt.
Beispiele 1. Materialien und Methoden
1.1 Plasmide
Die Punktmutanten von ANT-1 wurden durch rekombinante PCR unter Verwendung geeigneter Primer konstruiert. Für die PCR-Reaktion wurde Pwo, eine thermostabile Polymerase mit Korrektur-Funktion (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) eingesetzt. Alle Aminosäureänderungen wurden durch Sequenzierung verifiziert. Deletionsmutagenese von ANT-1 wurde mit PCR unter Verwendung desselben Enzyms erzielt. ANT-2 wurde aus einer Mäuseniere-cDNA-Bibliothek amplifiziert, Cyclophilin D wurde aus einer 293T-Bibliothek amplifiziert, jeweils unter Verwendung spezifischer Primer. Die korrekte Sequenz wurde durch Sequenzierung verifiziert. Der eukaryotische Expressionsvektor für Baculovirus p35 ist beschrieben worden (Clem und Miller, 1994).
1.2 Immunoblot
Für die Bestimmung von Cytochrom c wurden 293T-Zellen mit einem Expressionsvektor für ANT-1 transfiziert. Nach 18 h wurden die Zellen geerntet und Cytoplasma-Extrakte wurden wie beschrieben isoliert (Ferrari et al., 1998). Proteinproben von 30 μg wurden auf SDS-Polyacrylamidgele (10%) geladen und anschließend elektrophoretisch auf PVDF-Membranen (Amersham, Braunschweig, Deutschland) transferiert. Western Blots wurden vor ECL-basierter Detektion (Amersham) mit einem monoklonalen Cytochrom c-Antikörper (Pharmingen, San Diego, CA) und Meerrettichperoxidasegekoppeltem Anti-Maus Antikörper sondiert. Für den Poly-ADP-Ribosepolymerase (PARP)-Western Blot wurden nukleare Fraktionen durch differenzielle Zentrifugation wie zuvor beschrieben erhalten (Schreiber et al., 1989). Aliquote von 50 μg Protein wurden SDS-PAGE (8% Polyacrylamid) unterzogen und auf PVDF-Membranen geblottet. PARP und Spaltungsprodukte wurden unter Verwendung eines polyklonalen Serums, welches gegen vollständiges PARP gerichtet ist (Roche Diagnostics), Meerrettichperoxidasegekoppeltem Anti-Hasen-Antikörper (Amersham, Braunschweig) und dem ECL-System detektiert. Für die Detektion von HA-markierten ANT-Isoformen wurden Mitochondrien durch differenzielle Zentrifugation isoliert wie zuvor beschrieben (Brustovetsky und Klingenberg, 1996). 30 μg Proteinproben wurden auf 10%-igen Polyacrylamidgels aufgetrennt und auf PVDF-Membranen geblottet. Die Detektion wurde unter Verwendung eines monoklonalen Maus-Antikörpers, der gegen das Influenzavirus HA-Peptid gerichtet ist (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) und mit dem ECL-System (Amersham, Braunschweig) durchgeführt.
1.3 Hefeverfahren
Es wurden Standard-Hefeverfahren angewendet (Ausubel et al., 1991). Für die induzierbare Expression von Bax und ANT-1 wurden die cDNAs in pYESTrp2 (Invitrogen), in welchen die B42-Fusionsgruppe entfernt war, subkloniert.
1.4 Apoptosedetektion
DNA mit niedrigem Molekulargewicht aus apoptotischen Zellen wurde wie beschrieben isoliert und detektiert (Grimm und Leder, 1997). Apoptoseinduktion wurde durch ein ELISA (Roche Diagnostics) gemessen, welches spezifisch für nukleosomale DNA-Fragmente ist, die während der Apoptose freigesetzt werden. Die Empfehlungen des Herstellers wurden befolgt. Gleiche Transfektionswirksamkeiten wurden durch Cotransfizieren eines Expressionsplasmids für GFP überwacht. Weitere Apoptosequantifizierungen wurden durch Flusszytometrie (Bitzer et al., 1999) durchgeführt. Ein cotransfiziertes GFP-Expressionsplasmid wurde verwendet, um die Transfektionseffizienz zu bestimmen. Die apoptotische Population wurde zu dem Prozentsatz von GFP-positiven Zellen in Beziehung gesetzt. Der apoptotische Hintergrund der Vektorkontrolle wurde abgezogen, um die spezifische Apoptoseinduktion zu erhalten. Jede Bedingung wurde in wenigstens drei unabhängigen Experimenten untersucht.
1.5 Bestimmung des Mitochondrien-Membrangradienten
Nach Transfektion eines Expressionsvektors für ANT-1 zusammen mit einem Plasmid für GFP wurden Zellen mit Mitotracker RedCMXRos (Molecular probes, OR, USA) gemäß der Empfehlungen des Herstellers beladen. Bilder wurden unter Verwendung eines Zeiss Axioplan-Fluoreszenzmikroskops (Zeiss Oberkochen, Deutschland) dokumentiert. RedCMXRos-Fluoreszenz wurde bei 546 nm angeregt und Emission wurde bei > 590 nm abgebildet. GFP-Fluoreszenz wurde bei 450 bis 490 nm angeregt und Emission wurde bei 515 bis 565 nm überwacht.
2. Ergebnisse
2.1 ANT-1 induziert Zelltod
Bei Verwendung unseres Screenings auf dominante, Apoptose induzierende Gene isolierten wir eine cDNA, deren Expression eine besonders schnelle und starke Apoptoseantwort in Zellen auslöste. Sequenzierung ergab, dass das Gen für ANT-1, das ADP/ATP-Translocatorprotein der PT-Pore codiert (Marzo et al., 1998b). ANT-1 war in einer breiten Vielfalt von Zelltypen aktiv: Jede bislang getestete Zelllinie durchlief nach der Stimulation durch ANT-1 Apoptose (nicht gezeigt). 1 zeigt den Phänotyp von Kontroll- und ANT-1-transfizierten HEK 293T-Zellen: Während die vektortransfizierten Zellen eine normale Morphologie zeigten, zeigten ANT-1 exprimierende Zellen ein geschrumpftes Zytoplasma und Blebbing der Plasmamembran.
Da ANT-1 eine Komponente der PT-Pore ist, deren Aktivierung zu einer Dissipation des Protonengradienten ΔΨ_m über die innere mitochondrische Membran führt (Marzo et al., 1998b), untersuchten wir ANT-transfizierte Zellen auf diesen Membrangradienten. Bislang cotransfizierten wir ANT-1 und einen Expressionsvektor für das grüne Fluoreszenzprotein (GFP) in HeLa-Zellen. Der Membrangradient in transfizierten und daher GFP-positiven Zellen wurde mit CMXRos, einem Farbstoff, dessen Fluoreszenz von einem intakten Membranpotenzial abhängt, untersucht. 2A zeigt, dass ANT-1 exprimierende Zellen eine verringerte mitochondrische Fluoreszenz mit diesem Farbstoff zeigten. Diese differenzielle Anfärbung ist ein sehr frühes Merkmal von ANT-1-vermittelter Apoptoseinduktion, da es in Zellen beobachtet werden konnte, die noch keinen veränderten Phänotyp zeigten.
Eine der Konsequenzen von Mitochondrienschädigung ist die Freisetzung von Cytochrom c aus dem inneren mitochondrischen Membranraum (Kluck et al., 1997; Yang et al., 1997). Daher untersuchten wir Cytoplasma von ANT-1-transfizierten Zellen auf die Anwesenheit von Cytochrom c. Unter Verwendung eines Western Blots konnten wir dieses Protein in der Cytoplasmafraktion von ANT-1-transfizierten Zellen nachweisen (2B). Das freigesetzte Cytochrom c kann Apaf-1, ein Säugerhomolog des C. elegans-Gens ced-4, welches zur Aggregierung und Aktivierung von stromabwärtigen Caspasen führt, binden (Srinivasula et al., 1998). Wir untersuchten daher den Zustand von Poly-ADP-Ribosepolymerase (PARP), einem der bekanntesten Caspasesubstrate in ANT-1-transfizierten Zellen. Ein Western Blot für PARP (3A) ergab, dass ANT-1-transfizierte Zellen PARP abbauten und die erwarteten Proteinfragmente erzeugten. Da wir auch in MCF-7-Zellen Apoptoseinduktion beobachtet haben (Daten nicht gezeigt), einer Zelllinie, welche Caspase-3 nicht exprimiert (Janicke et al., 1998), schließen wir daraus, dass ANT-1-induzierte Apoptose nicht von diesem bestimmten Isoenzym abhängig ist.
Es ist vor kurzem gezeigt worden, dass Bax, ein Mitglied der Bcl-2-Genfamilie, direkt mit ANT-1 wechselwirkt (Marzo et al., 1998a) und dafür bekannt ist, Apoptose zu induzieren (Oltvai et al., 1993). Caspaseaktivierung scheint jedoch kein notwendiges Ereignis für Bax-induzierten Zelltod zu sein (Xiang et al., 1996). Daher wollten wir wissen, ob Caspaseaktivierung für ANT-1-Apoptoseinduktion erforderlich ist. Um dies anzugehen, cotransfizierten wir ANT-1 und einen Expressionsvektor für p35, einen Breitband-Caspaseinhibitor aus Baculovirus (Clem und Miller, 1994). Ein quantitativer Apoptoseassay ergab eine sechsfache Verringerung der Apoptoseinduktion, wenn p35 cotransfiziert wurde (3B). Ein weiteres Substrat für Caspase ist ICAD, ein Inhibitor der DNAse CAD (Sakahira et al., 1998). Sein Abbau führt zu der Aktivierung von CAD und dem internukleosomalen Abbau der DNA, einem bekannten biochemischen Anzeichen für Apoptose. Um den Zustand der DNA zu untersuchen, transfizierten wir 293T-Zellen mit einem Kontrollvektor oder ANT-1 und isolierten die DNA mit niedrigem Molekulargewicht. Nur ANT-1-transfizierte Zellen zeigten die typische DNA-Leiter (3C). Diese Ergebnisse zeigen, dass ANT-1 zu sämtlichen phänotypischen und biochemischen Veränderungen führt, die mit Apoptose im Zusammenhang stehen.
2.2 Die N-terminate Hälfte von ANT-1 ist zur Apoptoseinduktion ausreichend
ANT-1 wurde ursprünglich als ein ADP/ATP-Transporter beschrieben (Riccio et al., 1975). Wir haben daher die Theorie entwickelt, dass überexprimiertes ANT-1 zu einem erhöhten ADP/ATP-Austausch führt, welcher zu einem Nettoimport positiver Ladungen über die innere mitochondrische Membran, dem anschließenden Zusammenbruch des Membranpotenzials und Apoptoseinduktion führt. Um zu untersuchen, ob die Transporteraktivität von ANT-1 für dessen Apoptoseinduktion erforderlich ist, erzeugten wir sechs unterschiedliche Punktmutationen, von denen jeweils gezeigt wurde, dass sie die Aktivität von ANT-1, ADP und ATP zu transportieren, behindern (Muller et al., 1996; Muller et al., 1997). Bei Transfektion in 293T-Zellen haben wir jedoch keinerlei Unterschied im Vergleich zu dem Wildtyp (WT) in ihrem Potenzial, Apoptose zu induzieren, beobachtet, wie durch die Freisetzung internukleosomaler DNA-Fragmente gemessen wurde (4A). ANT-1 ist ein Mitglied der Familie mitochondrischer Träger, welche aus Proteinen mit drei Wiederholungen von 100 Resten besteht, in welchen abwechselnde Bereiche von hydrophilen und hydrophoben Resten vorliegen. Als integrale Membranproteine überspannen sie die Membran sechsmal, unterbrochen durch kurze amphipatische Helices, die wahrscheinlich die transportaktive Gruppe bilden (Klingenberg und Nelson, 1994). Um die für die Apoptoseinduktion verantwortlichen Domänen zu kartographieren, haben wir verschiedene Deletionsmutanten von ANT-1 erzeugt: ANT-1Δ 217 fehlt die letzte Transmembrandomäne und die letzte amphipatische Helix, ANT-1Δ 142 halbiert das Molekül und umfasst nur die ersten beiden Transmembrandomänen und die erste amphipatische Helix. ANT-1Δ 102 enthält nur die erste membranüberspannende Domäne. 4B veranschaulicht, dass ANT-1Δ 217 für die Apoptoseinduktion ebenso wirksam ist wie WT-ANT-1, während ANT-1Δ 142 eine 50%-ige Verringerung seines Apoptosepotenzials ergab. Die größte Deletion, ANT-1Δ 102, war für die Apoptoseinduktion inaktiv.
2.3 ANT-2 ist nicht in der Lage, Apoptose zu induzieren
Man geht davon aus, dass der PT-Porenkomplex durch die Umwandlung des spezifischen ADP/ATP-Austauschtransporters in eine unselektive Pore funktioniert (Zoratti und Szabo, 1995). Da jedoch über die Hälfte des ANT-1-Proteins für die Apoptoseinduktion entbehrlich ist, wollten wir wissen, ob ANT-1 Apoptose induziert, indem es selbst eine unspezifische Pore bildet. Wir untersuchten daher die Spezifität der Apoptoseinduktion durch ANT-1. Bislang haben wird ANT-2 verwendet, ein zu mehr als 90% zu ANT-1 identisches Gen, welches ebenso allgegenwärtig exprimiert wird (Doerner et al., 1997). Transfektion von ANT-2 führte nicht zur Apoptoseinduktion, wie mittels FACS-Analyse gemessen wurde (5A). Die korrekte mitochondrische Lokalisierung und wirksame Expression von ANT-2 wurde durch Western Blot verifiziert (5B).
2.4 Wachstum von Hefezellen wird durch ANT-1 nicht beeinträchtigt
Bax, ein Mitglied der Bcl-2-Genfamilie, kann eine Form des Zelltods durch Überexpression in Hefezellen induzieren (Greenhalf et al., 1996; Jurgensmeier et al., 1997; Zha et al., 1996), möglicherweise durch Aktivierung von ANT-1 und der PT-Pore (Greenhalf et al., 1996; Marzo et al., 1998a). Wir wollten daher bestimmen, ob ANT-1 dieselbe Fähigkeit besitzt. Um dies anzugehen, subklonierten wir ANT-1 und Bax in einen Galactose- und Raffinoseinduzierbaren Hefevektor. Die Induktion dieser Gene auf geeigneten Agarplatten ergab, dass Bax zu einer Verringerung des Wachstums dieser Zellen führte, was Zelltod anzeigt. Im Gegensatz dazu waren ANT-1 exprimierende Hefezellen völlig unbeeinflusst und wuchsen ebenso gut wie auf der Kontrollplatte (6).
2.5 Cyclophilin D kann die durch ANT-1 induzierte Apoptose unterdrücken
Unsere Versuche mit ANT-2 und Zelltod in Hefe legten nahe, dass die apoptotische Aktivität von ANT-1 eher durch spezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen vermittelt wird als durch Bildung einer eigenen aktiven PT-Pore. Um zu überprüfen, ob ANT-1-Expression dennoch die endogene PT-Pore aktiviert, setzten wir Bongkreksäure, einen spezifischen Inhibitor für die PT-Pore ein (Klingenberg et al., 1970). 50 μm dieser Verbindung unterdrückte die ANT-1-induzierte Apoptose in einem quantitativen Apoptoseassay mehr als zweifach (7A). Wir vermuteten daher, dass ANT-1 einige Komponenten der endogenen PT-Pore austitrieren könnte und dass eine Ergänzung dieser Proteine Apoptose unterdrücken könnte. Folglich cotransfizierten wir ANT-1 und einen Expressionsvektor für Cyclophilin D, eine Komponente der PT-Pore auf der Matrixseite, welche direkt mit ANT-1 wechselwirkt (Woodfield et al., 1998). Quantifizierung der Apoptoseinduktion ergab einen mehr als zweifach verringerten Zelltod durch ANT-1, wenn Cyclophilin D cotransfiziert wurde (7B).
Literaturverzeichnis

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Claims

Verwendung einer wirksamen Menge einer Substanz, die in der Lage ist, die Aktivität von Adenin-Nukleotid-Translocase-1 (ANT-1) zu hemmen, zur Hemmung von Apoptose in einer isolierten Zelle.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zelle eine Säugerzelle ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Zelle mit einer pathogenen Erkrankung im Zusammenhang steht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Aktivität von ANT-1 auf der Nukleinsäureebene gehemmt wird.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Aktivität durch Verringerung der ANT-1 Genexpression bewirkt wird.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Aktivität des endogenen ANT-1 Promotors verringert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Aktivität von ANT-1 auf der Proteinebene gehemmt wird.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Hemmung durch Zugabe von ANT-1 Proteinantagonisten bewirkt wird.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Antagonist Cyclophilin D ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei ein Apoptose-induzierender Signalübertragungsweg gehemmt wird, wobei der Weg durch ANT-1 aktiviert wird.
Verwendung einer pharmazeutisch wirksamen Menge einer Substanz, die in der Lage ist, die Aktivität von Adenin-Nukleotid-Translocase-1 (ANT-1) zu hemmen, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von degenerativen Erkrankungen die mit übermäßiger Apoptose im Zusammenhang stehen.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Erkrankung eine menschliche Erkrankung ist.
Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Erkrankung dilatative Kardiomyopathie ist.
Verwendung nach einerm der Ansprüche 11 bis 13, wobei das Medikament eine pharmazeutische Zusammensetzung ist, die pharmazeutisch annehmbare Verdünnungsmittel, Träger oder Hilfsstoffe umfasst.
In-vitro Verfahren zum Identifizieren von Substanzen, die zur Apoptosehemmung geeignet sind, umfassend den Schritt des Bestimmens der Fähigkeit einer Testsubstanz, die Aktivität von ANT-1 zu hemmen, durch Bestimmen der Fähigkeit der Testsubstanz (i) ANT-1 oder eine Domäne davon zu binden, oder (ii) die Bindung von ANT-1 an deren natürliche Bindungspartner zu hemmen, wobei eine Substanz, die ANT-1 oder eine Domäne davon bindet oder die Bindung von ANT-1 an deren natürliche Bindungspartner hemmt, als Apoptoseinhibitor identifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Fähigkeit einer Testsubstanz, die N-terminale Domäne von ANT-1 zu binden, bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, welches als Hochdurchsatz-Assay durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, welches eine parallele Bestimmung von wenigstens 96 Testverbindungen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, welches als ein Assay auf Zellbasis durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, welches als ein Assay unter Verwendung von ANT-1-haltigen Zellfraktionen oder vollständigen ANT-1-haltigen Zellen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, welches als ein Assay auf molekularer Basis unter Verwendung eines isolierten Proteins ausgewählt aus ANT-1 oder einer Domäne davon, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei ein rekombinantes Protein verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Bestimmungsschritt die Messung der Apoptoseinduzierung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Apoptoseinduzierung durch einen Parameter gemessen wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA-Fragmentierung, Caspaseaktivierung oder charakteristischen Veränderungen der Zellmorphologie.
In-vitro Verfahren zur Diagnose eines apoptotischen Vorgangs bei einer degenerativen Erkrankung oder einer Prädisposition dafür, umfassend Detektion der ANT-1 Expression in einer Gewebeprobe und/oder Körperflüssigkeitsprobe eines zu untersuchenden Subjekts, wobei eine erhöhte ANT-1 Expression ein Anzeichen für einen apoptotischen Vorgang ist, der bei einer degenerativen Erkrankung oder einer Prädisposition dafür auftritt.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die degenerative Erkrankung dilatative Kardiomyopathie ist.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die als einen Wirkstoff Cyklophilin D umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von degenerativen Erkrankungen, die mit Apoptose im Zusammenhang stehen.