DE60012802T2

DE60012802T2 - Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Cyanhydrinen

Info

Publication number: DE60012802T2
Application number: DE2000612802
Authority: DE
Inventors: Hisashi Tsuchiura-shi Semba
Original assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Current assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Priority date: 1999-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2020-02-04
Also published as: DE60012802D1; EP1026256B1; EP1026256A2; EP1026256A3; JP2000217590A; EP1026256A9

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Cyanhydrine.
Hintergrund der Erfindung
Optisch aktive Cyanhydrine sind brauchbar als optisch aktive Zwischenprodukte für die Herstellung von Insektiziden, wie Pyrethroiden, oder als Zwischenprodukte für das Synthetisieren von Arzneimitteln. Verschiedene Verfahren zum Synthetisieren optisch aktiver Cyanhydrine wurden bereits vorgeschlagen. Diese Verfahren haben jedoch praktische Probleme, und bis jetzt wurde noch kein Verfahren für eine direkte Synthese der optisch aktiven Cyanhydrine für industrielle Zwecke eingeführt.
Beispielsweise ist ein Verfahren zum Synthetisieren optisch aktiver Cyanhydrine als Zwischenprodukte für die Herstellung Pyrethroid-Insektiziden bekannt. Nach diesem Verfahren wird racemischer Cyanhydrinester chemisch als ein Ausgangsmaterial synthetisiert und asymmetrischer Hydrolyse unter Verwendung eines Enzyms (JP-A-61-5794, JP-A-62-65688) unterzogen. Dieses Verfahren ist jedoch mit Problemen, wie Mehrfachproduktionsstufen und der Notwendigkeit eines Abbaus, einer Racemisierung und einer Rückführung von enantiomerem Ester verbunden, der nach der asymmetrischen Hydrolysereaktion zurückbleibt.
Über ein Enzym wurde jüngst berichtet, welches optisch aktives Cyanhydrin allein direkt aus Aldehyd oder Keton und Cyanwasserstoffsäure synthetisiert, und Verfahren wurden untersucht, die optisch aktive Cyanhydrine unter Verwendung dieses Enzyms synthetisieren. Beispielsweise stammten Verfahren zur Synthese von R-Cyanhydrin durch Verwendung von R-Hydroxynitril-Lyase (EC4.1.2.10) von Mandelbäumen (Prunus amigdalus) oder R-Hydroxynitril-Lyase, die sich von Flachs (Linum ujsitatissimum) herleitet, und Verfahren zum Synthetisieren von S-Cyanhydrinen durch Verwendung von S-Hydroxynitril-Lyase (EC4.1.2.11), die von Sorghum (Sorghum bicolor) stammt, S-Hydroxynitril-Lyase (EC4.1.2.37), die vom Cassavastrauch (Manihot exculenta) stammt, oder S-Hyxdroxynitril-Lyase (EC4.1.2.39), die vom tropischen Gummibaum (Hevea brasiliensis) stammt, sind bekannt. Alle diese in den obigen Verfahren verwendeten Enzyme erhält man durch Extrahieren aus Pflanzengeweben oder durch Immobilisieren solcher Enzyme, die aus den Pflanzengeweben extrahiert wurden. Enzymextraktion aus Pflanzengeweben ist jedoch nicht geeignet für industrielle Zwecke, da Extraktion und Reinigung kompliziert, arbeitsaufwendig und mit einer großen Menge von Enzymverlust verbunden sind. Außerdem können für das Immobilisieren des extrahierten Enzyms die Kosten der Träger für Immobilisierung nicht vernachlässigt werden, und so ist ein solches immobilisiertes Enzym auch nicht geeignet für industrielle Verwendung, da die Verwendung von teurem Reaktionskatalysator erforderlich ist.
Verfahren zur Synthese optisch aktiver Cyanhydrine durch Verwendung rekombinanter Zellen, die mit Enzymgenen (nachfolgend oftmals als „rekombinante Zellen") umgewandelt wurden, sind auch bekannt. Diese Verfahren verwenden beispielsweise rekombinante Zellen, die mit S-Hydroxynitril-Lyase (EC4.1.2.39)-Gen aus tropischem Gummibaum (Hevea brasiliensis) (WO 98/30711) oder rekombinanten Zellen, die mit S-Hydroxynitril-Lyase (EC4.1.2.34)-Gen vom Cassavastrauch (Manihot esculenta) (Angrew, Chem. Int. Ed. Engl. 35, 437–439, 1996; Biotechnol. Bioeng. 53, 332–338, 1997; JP-A-9-227488) umgewandelt wurden. Nach diesen Verfahren müssen die Enzyme aus den rekombinanten Zellen extrahiert werden, was ebenso mühsam wie das oben beschriebene Verfahren zum Extrahieren der Enzyme aus Pflanzengewebe ist.
P. Pöchlauer beschreibt die Isolierung von S-Hydroxynitril-Lyase aus einer Vielzahl von rekombinanten Fäulnis-Mikroorganismen, die mit ihrem codierenden Gen umgewandelt wurden, welches aus dem Gummibaum (Hevea brasiliensis) erhalten wurde (P. Pöchlauer, 1998, Chimica OGGI, 16:15-19). Das isolierte rekombinante Enzym wurde dann in einen herkömmlichen gerührten Reaktor eingeführt, der in einer wäßrigen und einer organischen Umgebung für optimierte Cyanohidrin-Produktion arbeiten kann.
So ist das Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur wirksamen Herstellung optisch aktiver Cyanhydrine bei niedrigen Kosten bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Der vorliegende Erfinder widmete sich intensiven Studien, um die oben beschriebenen Probleme zu lösen, und fand zunächst, daß eine rekombinante Zelle, die mit einem Hydroxynitril-Lyasegen transformiert wurde, selbst in einer ähnlichen Weise wie das daraus zum Synthetisieren gegebenenfalls aktive Cyanhydrin isolierte Enzym verwendet werden kann, um optisch aktive Cyanhydrine zu synthetisieren, und daß die Verwendung dieser Zelle die Stabilität der enzymatischen Aktivität im Vergleich mit der Verwendung des daraus isolierten Enzyms verbesserte, und machte dabei die vorliegende Erfindung.
So ist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Cyanhydrinen, indem man rekombinante Mikroorganismuszellen, die durch Einführung eines Hydroxynitril-Lyase-Enzymgens transformiert wurden, und die eine Aktivität des Enzyms behalten, zu einem Reaktionssystem zugibt, welches ein Reaktionslösungsmittel, das ein oder mehrere Aldehyde oder Ketone und Wasserstoffcyanid oder eine Substanz, die Cyanidionen in dem Reaktionssystem erzeugen kann, umfaßt.
Diese Beschreibung enthält alles oder einen Teil des Inhalts, wie er in der Beschreibung der japanischen Patentanmeldung 11-25640 beschrieben wurde und die ein Prioritätsdokument der vorliegenden Anmeldung ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung in weiteren Einzelheiten beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Aldehyde oder Ketone als ein reaktives Substrat durch die folgende Formel (I) wiedergegeben werden.
worin R₁ und R₂ (i) ein Wasserstoffatom, (ii) eine substituierte oder unsubstituierte geradkettige oder verzweigtkettige, gesättigte C_1-18-Alkylgruppe oder (iii) eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Gruppe mit 5 bis 22 zyklischen Gliedern ist, worin R₁ und R₂ nicht gleichzeitig Wasserstoffatome bedeuten.
Unter Bezugnahme auf (II) oben ist der Substituent, wenn R₁ und R₂ substituierte Alkylgruppen sind, eine oder mehrere Aminogruppen, Iminogruppen, Hydroxylgruppen, C_1-8-Alkoxygruppen, Halogenatome, Carboxylgruppen, C_3-20-Cycloalkylgruppen oder aromatische Gruppen mit Kohlenstoffatomzahlen bis zu 22, welche mit einem Heteroatom N, O oder S substituiert sein können (wenn hier der Substituent ein zyklischer Substituent ist, kann der Substituent selbst mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxylgruppen, geradkettigen oder verzweigtkettigen C_1-8-Alkylgruppen oder geradkettigen oder verzweigtkettigen C_2-8-Alkenylgruppen substituiert sein):
In Bezug auf das (iii) oben kann die aromatische Gruppe eine heteroaromatische Gruppe sein, worin bis zu 4 zyklische Glieder mit N, O und/oder S substituiert sind. Wenn R₁ und R₂ substituierte aromatische Reste bedeuten, kann der Substituent ein oder mehrere Aminogruppen, Iminogruppen, Hydroxylgruppen, C_1-8-Alkoxygruppen, Allyloxygruppen, Halogenatome, Carboxylgruppen, geradkettige oder verzweigtkettige, gesättigte oder ungesättigte C_1-22-Alkylgruppen bedeuten (hier kann ein aromatischer Rest mit wenigstens zwei Substituenten substituiert sein).
Um die oben beschriebenen Aldehyde oder Ketone in optisch aktive Cyanhydrine umzuwandeln, wird Cyanwasserstoffsäure als das Substrat verwendet. Die Cyanwasserstoffsäure kann entweder in der Form einer Flüssigkeit oder eines Gases zugeführt werden. Eine wäßrige Lösung von Cyanwasserstoffsäure, d.h. Hydrocyansäure (oder Blausäure), kann auch gleich verwendet werden. Irgendeine Substanz, die Cyanidionen (CN^–) bei Zugabe zu einem Reaktionssystem erzeugen kann, kann verwendet werden. Beispiele solcher Substanzen sind etwa Salze von Cyanwasserstoffsäure, wie Natriumcyanid und Kaliumcyanid, oder Cyanhydrinverbindungen, wie Acetoncyanhydrin.
Rekombinante Mikroorganismuszellen, die in geeigneten Medien gezüchtet wurden und worin Enzymproduktion induziert wurde, werden als der Katalysator in den Reaktionen verwendet.
Speziell enthalten Beispiele von Genen, die für Hydroxynitril-Lyase codieren, Gene, die für R-Hydroxynitril-Lyase codieren, welche von Pflanzen stammt, die zu Rosaceae gehören, wie Mandelbaum (Prunus amigdalus) (EC4.1.2.10) und Brombeere (Prunus serotina). Ein für R-Hydroxynitril-Lyase codierendes Gen, das sich von Flachs (Linum usitatissimum) herleitet, gehört zu Linaceae. Ein für S-Hydroxynitril-Lyase codierendes Gen (EC4.2.2.11) kommt von Sorghum (Sorghum bicolor), ein für S-Hydroxynitril-Lyase codierendes Gen (EC4.1.2.37) stammt von dem Cassava-Strauch (Manihot escuzlenta). Ein für S-Hydroxynitril-Lyase codierendes Gen (EC4.1.2.39) wurde aus tropischem Gummibaum (Hevea brasiliensis) gewonnen, und ein für S-Hydroxynitril-Lyase codierendes Gen stammte von Ximenia (Ximenia americana).
Die Mikroorganismen, die durch Einführung der oben beschriebenen Enzymgene transfomiert werden können, sind nicht speziell beschränkt, solange sie die oben erwähnten Enzymgene einarbeiten können und zulassen, um die Enzyme zu exprimieren und zu produzieren. Solche Mikroorganismen sind beispielsweise Eukaryotes, wie Hefe, und Prokaryotes, wie E. coli.
Die rekombinanten Mikroorganismen können als ein Katalysator der Reaktion in der Form nasser Zellen direkt aus dem Medium erhalten werden oder stärker in der Form trockener Zellen, die vor der Verwendung einer Trocknung oder Entwässerung unterzogen werden, um die übermäßige Menge an Feuchtigkeit zu entfernen und so die Dispergierbarkeit in dem Reaktionssystem zu verbessern.
Das Trocknungs- oder Entwässerungsverfahren der Zellen ist nicht speziell beschränkt, solange die Enzymaktivität der Zellen erhalten bleibt. Beispiele eines solchen Verfahrens schließen Heißlufttrocknung, Vakuumtrocknung, Gefriertrocknung, Sprühtrocknung oder Trocknung mit einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton, ein.
Die trockenen Zellen werden pulverisiert oder granuliert, indem man sie mit einem Bindemittel vermischt. Alternativ können die trockenen Zellen mit unlöslichen Trägern vermischt oder nach bekannter Methode immobilisiert werden.
Wenn die Zellen in einem Reaktionslösungsmittel als eine Suspension verwendet werden, kann die Reaktion durch Verwendung eines Ansatz- oder Halbansatzsystems durchgeführt werden. Andererseits ist ein kontinuierliches System von Vorteil, wo die verwendeten Zellen in einen Füllbehälter eingefüllt werden, der es zuläßt, eine Flüssigkeit hindurchfließen zu lassen.
Wenn eine große Menge Wasser in dem Reaktionssystem vorhanden ist, werden die optisch aktiven Cyanhydrine, die aus den Enzymreaktionen stammen, wahrscheinlich racemisiert, oder die Verwendung von Aldehyden oder Ketonen mit geringer Löslichkeit in Wasser, wie das Rohmaterial, wird die Produktionseffizienz vermindern. Demnach ist es bevorzugt, daß das Reaktionslösungsmittel hauptsächlich aus einem organischen Lösungsmittel besteht, das Löslichkeit in reinem Wasser hat oder mit Wasser unmischbar ist. Ein solches organisches Lösungsmittel ist nicht speziell beschränkt, solang es nicht die enzymatische Reaktion zum Synthetisieren optisch aktiver Cyanhydrine beeinflußt, und kann zweckmäßig je nach den physikalischen Eigenschaften der Substrate (d.h. Aldehyde oder Ketone) ausgewählt werden, die für die Synthesereaktion und bezüglich der physikalischen Eigenschaften des herzustellenden Cyanhydrins verwendet werden. Speziell schließen Beispiele für ein solches organisches Lösungsmittel lineare oder verzweigte oder zyklische gesättigte oder ungesättigte, aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstofflösungsmittel ein, die gegebenenfalls halogeniert sein können, wie Pentan, Hexan, Toluol, Xylol, Methylenchlorid und dergleichen, geradkettige oder verzweigtkettige oder zyklische, gesättigte oder ungesättigte, aliphatische oder aromatische Alkohollösungsmittel, die gegebenenfalls halogeniert sein können, wie Isopropylalkohol, n-Butanol, Isobutanol, Tertiär-Butanol, Hexanol, Cyclohexanol, n-Amylalkohol und dergleichen, geradkettige oder verzweigtkettige oder zyklische gesättigte oder ungesättigte aliphatische oder aromatische Etherlösungsmittel, die gegebenenfalls halogeniert sein können, wie Diethylether, Dipropylether, Diisopropylether, Dibutylether, Methyl-t-butylether und dergleichen sowie geradkettige oder verzweigkettige oder zyklische, gesättigte oder ungesättigte, aliphatische oder aromatische Esterlösungsmittel, die gegebenenfalls halogeniert sein können, wie Methylformiat, Methylacetat, Ethylacetat, Butylacetal, Methylproprionat usw. Diese Lösungsmittel können alleine verwendet werden oder zwei oder mehr von ihnen können miteinander vereinigt verwendet werden. Diese organischen Lösungsmittel können mit einem wäßrigen Puffer von pH 7 oder weniger, wie einem Citratpuffer, einem Phosphatpuffer oder einem Acetatpuffer, gesättigt sein.
Die Konzentration des in dem Reaktionslösungsmittel enthaltenen Aldehyds oder Ketons ist vorzugsweise im Bereich von 0,01 mM bis 5 M. Cyanwasserstoffsäure oder die Substanz, die Cyanidionen in dem Reaktionssystem bilden kann, wird für 1 bis 20 Mol je Mol Aldehyd oder Keton verwendet, und die rekombinante Mikroorganismuszelle wird für eine Menge verwendet, die eine enzymatische Aktivität von 1 Einheit/mmol bis zu der Aldehyd- oder Ketonkonzentration.
Die enzymatische Aktivität der Zellen kann folgendermaßen berechnet werden. Die in Wasser oder Puffer zerlegten Zellen werden dann einer Zentrifugierung unterzogen, um das oben Schwimmende zu gewinnen. Bei Verwendung des oben Schwimmenden und von DL-Mandelnitril als ein Substrat wird die Veränderung der Adsorption bei einer Wellenlänge von 249,6 nm bei Benzaldehydproduktion bestimmt, indem der Abbau des Substrats mit dem Enzym gemessen wird.
Der pH-Wert des Reaktionslösungsmittels braucht nicht eingestellt zu werden, wenn das oben beschriebene organische Lösungsmittel nicht mit einem wäßrigen Puffer gesättigt vorliegt. Wenn das organische Lösungsmittel mit einem wäßrigen Puffer gesättigt ist, wird der pH-Wert des wäßrigen Puffers in dem Bereich 3 – 7, vorzugsweise im Bereich 3 – 6 eingestellt.
Die Reaktionstemperatur ist so niedrig wie möglich in einem Bereich eingestellt, der Enzymaktivität erlaubt, allgemein 0 bis 40°C, vorzugsweise 0 bis 30°C, um Nebenproduktion von racemischem Cyanhydrin zu unterdrücken, welche für die enzymatische Reaktion irrelevant ist.
Wenn die Reaktion vollständig abgelaufen ist, werden die Reaktionslösung und die Zellen voneinander getrennt, um eine Lösung zu erhalten, die das Reaktionsprodukt enthält. Andere Komponenten als das optisch aktive Cyanhydrin werden aus der Lösung entfernt, so daß man das interessierende Cyanhydrin in optisch aktiver Form erhält. Das Produkt wird nach einer Routinemethode, wie Destillation, Säulenchromatographie, Extraktion oder dergleichen, abgetrennt. Nach dieser Abtrennung kann ein Entwässerungsmittel zur Entwässerung, ein Stabilisator oder dergleichen zugegeben werden.
Beispiel
Nachfolgend ist die vorliegende Erfindung in weiteren Einzelheiten beispielhalber beschrieben.
Beispiel 1: Herstellung von rekombinanten Zellen
(1) Herstellung von Enzymgen
Die Gesamt-mRNA wurde aus einem Cassavabuschblatt extrahiert. Die erhaltene mRNA wurde als ein Templat für cDNA-Synthese verwendet, um eine cDNA-Bibliothek von Cassavastrauch zu konstruieren. Die folgenden PCR-Primer wurden unter Bezugnahme auf die Sequenz-Information von Cassava-stammendem S-Hydroxynitril-Lyase-Gen synthetisiert, das aus einer Veröffentlichung (Arch. Biochem. Biophys. 311, 496–502, 1994) der Öffentlichkeit zugänglich ist.
Unter Verwendung dieser Primer und der oben erhaltenen cDNA als Template wurde PCR für insgesamt 35 Zyklen durchgeführt: 95°C während 0,5 Minuten, 55°C während 0,5 Minuten, 72°C während 1 Minute. Ein Gen entsprechend dem Gen, das für S-Hydroxynitril-Lyase erhalten wurde. Das erhaltene Gen wurde bezüglich seiner Sequenz analysiert, und man fand, daß diese übereinstimmend mit der in der Publikation beschrieben Sequenz ist.
(2) Herstellung von rekombinanter Zelle mit Enzymgen
YEp352-GAP-Vektor wurde durch Einführung eines GAP-Promotors und eines Terminators in YEp352-Plasmidvektor erhalten, der ein E. coli/Hefe-Shuttle-Vektor ist und ein Ampicillin-resistentes Gen enthält, das eine Sequenz von Hefe 2μ-Plasmid und eine Sequenz von URA3 (eines selektiven Markergens für die rekombinante Hefe) ist. Die cDNA von S-Hydroxynitril-Lyase, erhalten in (1) oben, wurde zwischen dem GAP-Promotor und dem Terminator des YEp352-GAP-Vektors zwischengeschaltet, und dadurch wurde Hefeepisom-Expressions-Vektor YEp352-GC hergestellt.

Verwendung des Expressions-Vektors YEp352GC, der Wirtshefezelle Saccharomyces cerevisiae Inv-Sc1-Stamm wurde transformiert. Rekombinante Klone wurden in einem uracilfreien minimum-selektiven Medium mit der folgenden Zusammensetzung selektiert. Tabelle 1

Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren (Difco)	6,7 g/l
Glucose	20 g/k
Adenin	40 mg/ml
L-Arginin	20 mg/ml
L-Aspariginsäure	100 mg/ml
L-Glutaminsäure	100 mg/ml
L-Histidin	20 mg/ml
L-Isoleucin	30 mg/ml
L-Lysin	30 mg/ml
L-Methionin	20 mg/ml
L-Phenylalanin	50 mg/ml
L-Serin	375 mg/ml
L-Threonin	200 mg/ml
L-Tryptophan	40 mg/ml
L-Tyrosin	30 mg/ml
L-Valin	150 mg/ml
L-Leucin	60 mg/ml

Der rekombinante Hefestamm (Yep352-GC-X2-Stamm), erhalten wie oben beschrieben, wurde 24 Stunden in einem flüssigen Medium YNBDCas mit der folgenden Zusammensetzung gezüchtet. Tabelle 2

Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren (Difco) 6,7 g/l

Glucose 20 g/l

Casaminsäure 20 g/l

L-Tryptophan 40 mg/ml
Die Kultur wurde zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die erhaltenen nassen Zellen wurden mit Aceton vermischt, gerührt und abfiltriert, um getrocknete Zellen in Aceton zu erhalten.
Die enzymatischen Aktivitäten der nassen und trockenen Zellen wurden folgendermaßen bestimmt:
Die Zellen wurden mit 0,1 ml Glasperlen (0,5 mm Durchmesser) versetzt und mit flüssigem Stickstoff gefroren. Sodann wurden 0,2 ml eines 0,15 M Natriumcitratpuffers (pH5) zu dem Gemisch zugegeben, und die Zellen wurden durch Rühren zerrissen. Die Lösung, welche die zerrissenen Zellen enthielt wurde einem Zentrifugieren unterzogen, um das oben Schwimmende für die Bestimmung der enzymatischen Aktivitäten zu erhalten. Die Aktivitäten wurden unter Verwendung von DL-Mandelnitril als ein Substrat als Absorptionsveränderung bei einer Wellenlänge von 249,6 nm bei Benzaldehyproduktion, die aus dem Abbau des Substrats mit dem Enzym resultiert, bestimmt. Die Aktivität einer Verschlechterung von 1 μmol des Substrats je Minute wurde als eine Einheit angenommen.
Gemäß der oben beschriebenen Bestimmung war die enzymatische Aktivität der nassen Zellen des rekombinanten Stammes (YEp352-GC-S2-Stamm) nach der Erfindung 200 Einheiten/g (Naßgewicht), wehrend die enzymatische Aktivität der trockenen Zellen 1000 Einheiten/g war.
Beispiel 2
Zu 2,5 ml Diisopropylether wurden 120 mg der mit Aceton getrockneten Zellen, hergestellt in Beispiel 1, 0,5 mmol Benzaldehyd und 56,6 μl Cyanwasserstoffsäure zugegeben, um eine Synthesereaktion bei Raumtemperatur (20 – 25°C) unter Rühren zu erlauben. Nach 24 Stunden wurde die Reaktionslösung durch Flüssigchromatographie unter folgenden Bedingungen analysiert:

Säule: Chiracel-OJ (Daicel Chemical Industries, Ltd.)

Säulentemperatur 25°C

Eluiermittel: n-Hexan:Isopropylalkohol = 80:20

Fließgeschwindigkeit: 0,7 ml/Min.

Feststellung: (i) UV-Detektor, Wellenlänge 254 nm (ii) Polarimeter
Als Ergebnis wurde S.Mandelnitril mit einer optischen Reinheit von 94,1%ee mit einer Umwandlungsrate von 89,7% hergestellt.
Beispiel 3
Die trockenen Zellen, die in Beispiel 2 verwendet wurden, wurden von der Reaktionslösung getrennt und mit Isopropylether gewaschen. Zu 2,5 ml Diisopropylether wurden 120 mg der gewaschenen Zellen, 0,5 mmol Benzaldehyd und 56,6 μl Cyanwasserstoffsäure zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde einer Syntheseaktion bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) unter Rühren unterzogen. Nach 24 Stunden wurde die Reaktionslösung durch Flüssigchromatographie, wie oben beschrieben, analysiert. Es wurde gefunden, daß S-Mandelnitril mit einer optischen Reinheit von 93,6 %ee bei einer Umwandlungsrate von 71% erzeugt wurde. Die Umsetzung wurde unter den gleichen Bedingungen durch Rückführung nur der Zellen wiederholt. Die enzymatische Aktivität der Zellen nahm nach insgesamt 5-fachen Reaktionen nicht ab.
Vergleichsbeispiel 1
Zu 2,5 ml Diisopropylether wurden ein immobilisiertes Enzym (hergestellt durch Vermischen von 75 μl enzymatischer Lösung (491,3 Einheiten/ml) von teilgereinigtem Enzym, hergestellt aus Enzym-gen-rekombinantem E. coli mit 75 mg Avicel-Cellulose), 0,5 mmol 3-Phenoxybenzaldehyd und 55,6 mg Cyanwasserstoffsäure zugegeben, und das Gemisch wurde einer Synthesereaktion bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) unter Rühren unterzogen. Nach 24 Stunden wurde die Reaktionslösung durch Flüssigchromatographie, wie oben beschrieben, analysiert, und es wurde gefunden, daß S-3-Phenoxybenzaldehyd-Cyanhydrin mit einer optischen Reinheit von 92%ee bei einer Umwandlungsrate von 62% produziert worden war. Die Reaktion wurde unter den gleichen Bedingungen durch Rückführung des immobilisierten Enzyms wiederholt. Als ein Ergebnis nahmen die Umwandlungsrate und die optische Reinheit auf 24% bzw. 22%ee bei der zweiten Analyse ab, und nach der dritten Analyse wurde keine enzymatische Aktivität festgestellt.
Beispiel 4
Die nassen Zellen des rekombinanten Hefestammes (YEp352-GC-S2-Stamm), gesammelt wir in Beispiel 1, wurden einer Gefriertrocknung unterzogen, um gefriergetrocknete Zellen zu erhalten. Zu 2,5 ml Diisopropylether wurden 120 mg der gefriergetrockneten Zellen, 0,5 mmol Benzaldehyd und 56,6 μl Cyanwasserstoffsäure zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde einer Synthesere aktion bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) unter Rühren unterzogen. Nach 45 Stunden wurde die Reaktionslösung durch Flüssigchromatographie, wie oben beschrieben, analysiert. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß S-Mandelsäurenitril mit einer optischen Reinheit von 65,1%ee mit einer Umwandlungsrate von 65% produziert wurde.
Beispiel 5
zu 2,5 ml Diisopropylether, die mit 0,15 M Natriumcitratpuffer (pH 4) gesättigt waren, wurden 120 mg der mit Aceton getrockneten Zellen, hergestellt wie in Beispiel 1,1 mmol 3-Phenoxybenzaldehyd und 300 μl Cyanwasserstoffsäure zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde einer Synthesereaktion bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) unter Rühren unterzogen. Nach 60 Stunden wurde die Reaktionslösung durch Flüssigchromatographie, wie oben beschrieben, analysiert. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß S-3-Phenoloxybenzaldehyd-Cyanhydrin mit einer optischen Reinheit von 58,6%ee bei einer Umwandlungsrate von 96,9% produziert wurde.
Nach der vorliegenden Erfindung kann optisch aktives Cyanhydrin leicht und wirksam synthetisiert werden, indem man eine rekombinante Hydroxynitril-Lyase-Genzelle selbst ohne Notwendigkeit einer Extraktion von Hydroxynitril-Lyase daraus hat.

Claims

Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Cyanhydrine, bei dem man rekombinante Mikroorganismuszellen, die durch Einführung eines Gens für das Enzym Hydroxynitril-Lyase transformiert wurden und die eine Aktivität des Enzyms behalten, einem Reaktionssystem zusetzt, das ein Lösungsmittel umfaßt, welches Aldehyde oder Ketone und Cyanwasserstoffsäure oder eine Substanz, die Cyanidionen in dem Reaktionssystem bilden kann, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Cyanhydrine nach Anspruch 1, bei dem man die rekombinanten Mikroorganismuszellen durch Trocknen oder Dehydrieren kultivierter Zellen erhält.
Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Cyanhydrine nach Anspruch 1, bei dem das Reaktionslösungsmittel ein organisches Lösungsmittel ist, welches in Wasser schlecht löslich oder mit Wasser unmischbar ist.