DE4341005A1

DE4341005A1 - Concn. of leucocytes from blood prods. using a selective sorbent

Info

Publication number: DE4341005A1
Application number: DE19934341005
Authority: DE
Inventors: Ljuba Dr Rer Nat Mavrina; Rudolf Prof Dr Sc Nat Ehwald
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-11-29
Filing date: 1993-11-29
Publication date: 1995-06-01
Anticipated expiration: 2013-11-30
Also published as: DE4341005C2

Abstract

Selective concn. of leucocytes (L) from a blood prod. sample comprises passing the liq. sample through a selective sorbent for L having a sorption-active component (A) that can be solubilised. Also new is an appts. for this process comprising a selective sorbent on a filter plate or packed into a sieve.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum selektiven Konzentrieren der Leukozyten aus einer Probe eines Blutproduktes zum Zwecke der quantitativen Erfassung der Restleu kozyten.The invention relates to a method and an apparatus for selective concentration of leukocytes from a sample of a Blood product for the purpose of quantitative recording of the residual leu cozy.

Die Erfindung kann in der Transfusionsmedizin sowie bei der Beur teilung der Effizienz von Leukozytenfiltern eingesetzt werden.The invention can be used in transfusion medicine and in the assessment division of the efficiency of leukocyte filters.

Bei der Anwendung von konservierten Blutprodukten ist es wün schenswert und in einigen Fällen erforderlich, die weißen Zellen so weit wie möglich zu entfernen, um die verschiedenen Transfu sionsreaktionen, unter anderem die Alloimmunisierung der Patien ten auszuschließen. Zu diesem Zweck sind verschiedene Methoden entwickelt worden, wobei die Filtration der Blutpräparate durch leukozyten- und thrombozytenbindende Adsorber sich immer mehr in der Praxis als effektive, ökonomisch vorteilhafte und handhabbare Technik durchsetzt.When using preserved blood products, it is fine worthwhile and in some cases required the white cells as far as possible to remove the different transfu reaction, including the alloimmunization of the patients rule out. There are several methods for this have been developed, the filtration of blood preparations through leukocyte and platelet binding adsorbers are becoming increasingly popular in practice as effective, economically advantageous and manageable Technology prevails.

Die auf dem Markt vorherrschenden Blutfilter erlauben eine Leuko zytenreduktion von WBC bis auf 0,002·10⁹ Zellen/l. Diese Zahl der Leukozyten, die mit gewöhnlichen Meßmethoden nicht mehr er faßt werden kann, ist wichtig festzustellen, um die Immunogenität und Antigenität des gefilterten Blutes und/oder die Qualität des Filters abzuschätzen.The blood filters prevailing on the market allow leuko Cytic reduction from WBC to 0.002 · 10⁹ cells / l. This number the leukocytes, which no longer exist with ordinary measuring methods It is important to establish the immunogenicity and antigenicity of the filtered blood and / or the quality of the Filters estimate.

Die speziellen Techniken, die dafür eingesetzt werden können (z. B. Durchflußzytometrie mit Anwendung von monoklonalen Antikör pern oder fluoreszenzmarkierten DNS-färbenden Substanzien, Anwen dung von radioaktiven in den Zellkern eindringenden Markern, Aus zählung der Zellzahl von Leukozyten in großvolumigen Zählkammern usw.) sind mit einem sehr hohen apparativen oder zeitlichem Auf wand verbunden.The special techniques that can be used for this (e.g. flow cytometry using monoclonal antibody pern or fluorescence-labeled DNA-staining substances, Anwen formation of radioactive markers penetrating into the cell nucleus, Aus Counting the number of cells in leukocytes in large-volume counting chambers etc.) have a very high apparatus or temporal opening wall connected.

Ein grundsätzliches Problem bei der Leukozytenzahlung ist die unentbehrliche (etwa 10-fache) Verdünnung jeder Probe durch die Zugabe von einer Lösung (z. B. Essigsäure o.ä), die die roten Blutzellen auflösen soll, da die Erythrozyten sich im normalen Lichtmikroskop nicht von Leukozyten unterscheiden. Bei der Aus wertung von Blutproben mit sehr niedrigem Leukozytengehalt bedeu tet die zusätzliche Verdünnung eine besondere Schwierigkeit.A fundamental problem with leukocyte payment is indispensable (about 10 times) dilution of each sample by the Add a solution (e.g. acetic acid or similar) that the red Blood cells should dissolve because the erythrocytes are normal Light microscope does not differentiate from leukocytes. At the end evaluation of blood samples with very low leukocyte content meaning The additional dilution is particularly difficult.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein alternatives Ver fahren und eine Vorrichtung zur Zählung von Restleukozyten in Blutpräparaten mit sehr geringem Leukozytengehalt zu entwickeln, die zusätzlich eine Dokumentation der zu erfassenden Leukozyten als hämatologisches Präparat erlauben und routinemäßig mit gerin gem apparativen Aufwand effizient eingesetzt werden können.The invention has for its object an alternative Ver drive and a device for counting residual leukocytes in Develop blood preparations with very low leukocyte content, which additionally includes documentation of the leukocytes to be recorded allow as a hematological preparation and routinely with gerin can be used efficiently according to equipment expenditure.

Die Aufgabe wird durch die eingangs beschriebene selektive Sorp tion der Leukozyten an einer Vorrichtung, die ein Sorbens ent hält, das oder dessen sorptionsfähige Komponente solubilisierbar ist, und nachfolgendes Suspendieren der Leukozyten durch Solubi lisierung des Sorbens oder seiner sorptionsfähigen Komponente gelöst.The task is solved by the selective Sorp described at the beginning tion of the leukocytes on a device that ent a sorbent holds the or its sorbable component solubilizable and subsequent suspension of the leukocytes by Solubi lization of the sorbent or its sorbable component solved.

Das selektive Sorbens ist in der Lage, die Leukozyten nahezu quantitativ zu binden und läßt die bei der Zählung störenden Ery throzyten frei passieren. Dadurch wird die Störung der Leukozy tenzählung durch die Erythrozyten ohne die übliche Verdünnung der Probe durch die erythrozytenlösenden Flüssigkeiten aufgehoben und gleichzeitig eine Konzentrierung der Leukozyten im Packungsvolu men des Sorbens erreicht.The selective sorbent is able to almost the leukocytes bind quantitatively and leaves the Ery disturbing in the count pass throcytes freely. This will disrupt the leukocyte erythrocyte counting without the usual dilution of the Sample picked up by the erythrocyte-dissolving liquids and at the same time a concentration of the leukocytes in the pack volume men of sorbent reached.

Die am Sorbens gebundenen Leukozyten können noch nicht in einer optimalen Weise gezählt werden. Daher enthält die Vorrichtung erfindungsgemäß ein Sorbens, das bzw. dessen sorptionsfähige Kom ponente solubilisierbar sein muß. Die Solubilisierung der sorp tionsfähigen Komponente kann je nach ihrer Art enzymatisch oder nicht enzymatisch erfolgen.The leukocytes bound to the sorbent cannot yet be in one be counted optimally. Therefore, the device contains according to the invention a sorbent, or its sorbable com component must be solubilizable. The solubilization of the sorp tionable component can be enzymatic or not done enzymatically.

Als sorptionsfähige Komponente sind besonders enzymatisch hydro lisierbare Biopolymere wie Pektinstoffe und Proteine geeignet. Von einem vesikulären Trägermaterial, dessen Oberfläche aus Zel lulose und Pektinstoffen besteht, ist bereits bekannt, daß es die selektive Bindung von Leukozyten mit hoher Effizienz bewirkt (Mavrina u. a., 1992). Überraschend zeigte sich, daß die Beschich tung der genannten Träger mit Kollagen die Bindungskapazität noch erhöht. Sowohl Pektinstoffe als auch Kollagen lassen sich mit Hilfe preiswerter kommerzieller Enzyme solubilisieren, ohne daß die weißen Blutzellen unter den Hydrolysebedingungen ihre Inte grität und Nachweisbarkeit verlieren.As a sorptive component are particularly enzymatically hydro Suitable biopolymers such as pectin substances and proteins are suitable. From a vesicular carrier material, the surface of which is made of cellulose lulose and pectin substances, it is already known that it selective binding of leukocytes with high efficiency (Mavrina et al., 1992). It was surprisingly found that the Beschich tion of the said carrier with collagen still the binding capacity elevated. Both pectin substances and collagen can be used Solubilize using inexpensive commercial enzymes without the white blood cells under the hydrolysis conditions their int lose quality and traceability.

Die genannten Stoffe sind nicht die einzigen, die als sorptions fähige und solubilisierbare Komponenten in Frage kommen. Es ist für die Erfindung auch nicht essentiell, ob die sorptionsfähige Komponente enzymatisch oder nichtenzymatisch solubilisiert werden kann. Beispielsweise ist es möglich, daß diese Komponente, ein Pektinstoff, mit Hilfe eines Lektins an den Träger gebunden ist und die Solubilisierung mit Hilfe eines Zuckers erfolgt. Jede an dere Affinitätsbindung zur Verankerung der sorptionsfähigen Kom ponente ist ebenso geeignet für die Gewährleistung der Solubili sierbarkeit.The substances mentioned are not the only ones that are considered sorption capable and solubilizable components. It is not essential for the invention whether the sorptive Component are solubilized enzymatically or non-enzymatically can. For example, it is possible that this component, a Pectin substance, bound to the carrier with the help of a lectin and the solubilization is done with the help of a sugar. Everyone at their affinity binding for anchoring the sorbable com component is also suitable for ensuring the solubili adjustability.

Für die Erfindung ist es ausreichend, wenn ausschließlich die sorptionsfähige Komponente solubilisierbar ist. Es ist aber von Vorteil, wenn die Sorbenspartikeln vollständig auflösbar sind, wie es beispielsweise bei den oben genannten aus Pflanzenzellwän den bestehenden vesikulären Trägern oder Kollagenmatrices gegeben ist.It is sufficient for the invention if only that sorbable component is solubilizable. But it is from Advantage if the sorbent particles can be completely dissolved, as is the case, for example, with plant cell walls mentioned above the existing vesicular carriers or collagen matrices is.

Nach der Auflösung des Sorbens oder der sorptionsfähigen Kompo nente der Sorbenspartikeln können die Leukozyten leicht, bei spielsweise durch Zentrifugation, Wirkung eines Magnetfeldes oder Flüssigkeitsströmung vom Sorbens getrennt und danach ausgezählt werden.After dissolving the sorbent or the sorptive compo The leukocytes can easily absorb the sorbent particles for example by centrifugation, the effect of a magnetic field or Liquid flow separated from sorbent and then counted become.

Ist die Vorrichtung nach Art eines Zytozentrifugenaufsatzes ge baut, ergibt sich die günstige Möglichkeit, die abgelösten Leuko zyten durch Zentrifugation auf den Objektträger zu überführen und auf diese Weise in einem zweiten Schritt noch einmal zu konzen trieren. Die Zellen können in üblicher Weise fixiert, gefärbt, ausgewertet und als jederzeit verfügbares Dokument (hämatolo gisches Präparat) gelagert werden. Is the device ge in the manner of a cytocentrifuge attachment builds, there is a cheap option, the replaced Leuko transfer the cytes to the slide by centrifugation and in this way to concentrate again in a second step wear. The cells can be fixed, stained in the usual way, evaluated and as a document available at any time (hematolo pharmaceutical preparation).

Die Erfindung soll nach stehend an 2 Ausführungsbeispielen und einer Tabelle näher erläutet werden.The invention is based on 2 embodiments and be explained in more detail in a table.

example 1 Adsorption of blood cells on plant cell wall particles and Detachment of the adsorbed cells by different solutions

Für die Versuche wurde das frisch abgenommene Heparinblut der ge sunden Spender (2 ml) verwendet, das mit jeweiligem Sorbens (2 ml Feuchtvolumen) vermischt und nach einer 5 min Inkubation durch die Sorbensschicht mit 2 ml physiologischer Kochsalzlösung her auseluiert. Mit den zusätzlichen 4 ml der 0,9%-igen NaCl-Lösung oder anderer enzymhaltigen isotonen Lösung wurde versucht, die am Trägerpartikel adsorbierten Leukozyten herauszuwaschen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt.The freshly drawn heparin blood of the ge healthy donor (2 ml) used with the respective sorbent (2 ml Wet volume) and mixed after a 5 min incubation the sorbent layer with 2 ml of physiological saline eluted. With the additional 4 ml of 0.9% NaCl solution or other enzyme-containing isotonic solution has been tried to wash out leukocytes adsorbed on the carrier particle. The Results are shown in the following table.

Example 2 Influence of the cellulose / pectin dissolving enzymes on the detectable of leukocytes

Als Ausgangsmaterial diente eine erythrozytenarme Leukozytensu spension mit bestimmter Zellzahl, die für eine routinemäßige Zäh lung optimal war. Die Leukozytensuspension wurde mit einer isoto nen Enzymlösung vermischt (Endkonzentration gleich 6%) und bei 36°C etwa 1 Stunde inkubiert. In bestimmten Zeitabschnitten wur den Proben abgenommen und ausgezählt. Die Ausgangszahl der Zellen war bei der Auswertung der Versuche als 100% genommen.A low-erythrocyte leukocyte served as the starting material pension with a certain cell number, which is necessary for a routine count was optimal. The leukocyte suspension was treated with an isoto NEN enzyme solution mixed (final concentration equal to 6%) and at Incubated at 36 ° C for about 1 hour. In certain periods of time taken from the samples and counted. The initial number of cells was taken as 100% in the evaluation of the tests.

Nach der mathematischen Auswertung der Versuchsergebnisse (Krus kal Wallis - Test und Regressionsanalyse) war keine negative Wir kung der o.g. Enzyme auf die Integrität der Leukozyten erwar tungsgemäß feststellbar. Die Abb. 1 zeigt keine signifikante Unterschiede in der Zellzahl bei verschiedenen Inkubationszeiten.After the mathematical evaluation of the test results (Krus kal Wallis test and regression analysis), no negative effect of the above-mentioned enzymes on the integrity of the leukocytes was found, as expected. Fig. 1 shows no significant differences in the number of cells at different incubation times.

Claims

1 . Method for selectively concentrating the leukocytes from a sample of a blood product, characterized in that the liquid blood preparation flows through a selective sorbent for the leukocytes, the sorbable component of which can be solubilized.

2. The method according to claim 1, characterized in that the sorptive component of the carrier with the help of enzymes so is lubilizable.

3. The method according to claim 1, characterized in that the selective sorbent contains a pectin substance on its surface.

4. The method according to claim 1, characterized in that the selective sorbent contains a protein on its surface.

5. The method according to claim 1, characterized in that the selective sorbent contains collagen on its surface.

6. The method according to claim 1, characterized in that the selective sorbent is magnetic.

7. The device for performing the method according to claim 1 to 6, characterized in that the selective sorbent a filter plate or a sieve is packed.

8. The device according to claim 7, characterized in that it a cytocentrifuge attachment with the possibility of connection to one Own slide.