DE4339352A1 - Method for labeling cells, cells labeled with this method, use of the wild-type adeno-associated virus for labeling cells and test kits for detecting the wild-type adeno-associated virus in cells - Google Patents
Method for labeling cells, cells labeled with this method, use of the wild-type adeno-associated virus for labeling cells and test kits for detecting the wild-type adeno-associated virus in cellsInfo
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Markierung von Zellen, bei dem die Zellen genetisch dadurch markiert werden, daß diese Zellen mit einem Virus infiziert werden, das in die DNA der zu markierenden Zellen integriert wird.The present invention relates to a method for Labeling cells in which the cells are genetically characterized marked that these cells are infected with a virus be integrated into the DNA of the cells to be labeled becomes.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Zellen ex vivo markiert werden und es wird hierdurch ermöglicht, das weitere Schicksal dieser Zellen, insbesondere nach Rückführung der Zellen in den Spenderorganismus zu verfolgen.With the method according to the invention, cells can be ex vivo be marked and this enables the further fate of these cells, especially after Return of the cells to the donor organism follow.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird zur genetischen Markierung der zu markierenden Zellen das sogenannte Adeno- assoziierte Virus eingesetzt. In besonders bevorzugter Weise werden Virusstämme vom Wildtyp eingesetzt, d. h. diese Virusstämme werden nicht genetisch manipuliert durch Veränderung des Virus.In the context of the present invention, the genetic Labeling the cells to be labeled the so-called adeno- associated virus used. In a particularly preferred manner wild-type virus strains are used, d. H. these Virus strains are not genetically manipulated by Change of virus.
Das Adeno-assoziierte Virus ist bereits bekannt. In der Veröffentlichung von Srivastava et al., Journal of Virology, Februar 1983, Vol. 45, S. 555-564, wird die Nukleotidsequenz und die Organisation des Adeno-assoziierten Virusgenoms offenbart. Auf die in dieser Veröffentlichung offenbarte Nukleotidsequenz wird ausdrücklich Bezug genommen und diese Sequenz wird hiermit zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht.The adeno-associated virus is already known. In the Publication by Srivastava et al., Journal of Virology, February 1983, Vol. 45, pp. 555-564, becomes the nucleotide sequence and the organization of the adeno-associated virus genome disclosed. To the one disclosed in this publication Nucleotide sequence is expressly referenced and this Sequence is hereby the subject of the present Registration made.
Bei dem Adeno-assoziierten Virus handelt es sich um ein Virus vom DNA-Typ, das normalerweise eine Co-Infektion mit einem zweiten Virus benötigt, um eine Infektion zu erzielen. Deshalb wird das Adeno-assoziierte Virus zu den defekten Parvoviren gerechnet. Als Helferviren fungieren das Adenovirus oder das Herpes-Simplex-Virus, die eine effiziente Replikation des Adeno-assoziierten Virus in vitro ermöglichen. Obwohl es sich bei dem Adeno-assoziierten Virus um ein menschliches Virus handelt, ist dessen Wirtsbereich für das lytische Wachstum unüblich breit. Vermutlich jede Säugerzelle, die bisher getestet wurde, einschließlich menschliche Zellen, Kaninchenzellen, Rinderzellen oder Nagerzellinien können mit dem Adeno-assoziierten Virus (im folgenden kurz AAV) infiziert werden, vorausgesetzt ein geeignetes Helfervirus wird verwendet. Die Helferviren müssen natürlich zu den Wirtszellen passen. Trotz des weiten Wirtsbereichs wird durch das AAV weder bei Menschen noch bei Tieren eine Erkrankung beobachtet.The adeno-associated virus is a DNA-type virus that is usually co-infected with a second virus is needed to get an infection. Therefore, the adeno-associated virus becomes the defective one Parvoviruses calculated. They act as helper viruses Adenovirus or the herpes simplex virus, the one efficient replication of the adeno-associated virus in vitro enable. Although it is the adeno-associated virus the host range is a human virus unusually wide for lytic growth. Probably everyone Mammalian cell that has been tested, including human cells, rabbit cells, bovine cells or Rodent cell lines can be linked to the adeno-associated virus (im following shortly AAV), provided one suitable helper virus is used. The helper viruses must of course match the host cells. Despite the wide The AAV does not make the host area either for humans or for Animals observed a disease.
Obwohl ein bestimmter Prozentsatz der menschlichen Bevölkerung mit AAV infiziert ist, deuten neuere Erkenntnisse darauf hin, daß das AAV nur in bestimmte Zellen integrieren kann. Bekannt ist, daß sich das AAV in das Chromosom 19 der Epithelzellen des Respirationstraktes integrieren kann. Bei anderen Zellen wurde nur in äußerst geringen Prozentsätzen (unter 2%) eine natürliche Integration des AAV-Virus beobachtet. Diese Erkenntnis ermöglicht die Verwendung von AAV als genetischen Marker, da eine Infektion von anderen als den natürlicherweise befallenen Zellen nur dadurch erzielt werden kann, daß in vitro gezielt eine Infektion durchgeführt wird. Although a certain percentage of human Population infected with AAV suggest newer ones Findings suggest that the AAV is only in certain cells can integrate. It is known that the AAV is in the Chromosome 19 of the epithelial cells of the respiratory tract can integrate. Other cells were only in extreme low percentages (below 2%) a natural Integration of the AAV virus observed. This realization enables the use of AAV as a genetic marker because infection other than natural infected cells can only be achieved in that an infection is specifically carried out in vitro.
Insbesondere die hämatopoetischen Vorläuferzellen werden durch das AAV in vivo bei bis zu etwa 98% der Bevölkerung nicht infiziert. Wenn also derartige Zellen in vitro mit AAV infiziert werden, dann integriert dieses Virus stabil in das Chromosom der Zellen und diese Zellen sind dann markiert durch den Gehalt des AAV-Genoms im Genom der markierten Zellen.In particular, the hematopoietic progenitor cells are by the AAV in vivo in up to about 98% of the population not infected. So if such cells in vitro with AAV become infected, then this virus stably integrates into the Chromosome of the cells and these cells are then marked by the content of the AAV genome in the genome of the labeled Cells.
Mit Hilfe dieser genetischen Markierung kann das Schicksal der markierten Zellen weiterverfolgt werden. Da sich das AAV in das Chromosom der markierten Zellen integriert, wird es auch bei der Vermehrung der Zellen mit vermehrt und die sich aus den markierten Zellen entwickelnden Klone können anhand der Markierung erkannt werden. Dies ist besonders vorteilhaft bei der Forschungsarbeit, da das weitere Schicksal der markierten Zellen und der daraus abgeleiteten Nachfahren verfolgt werden kann.With the help of this genetic marker, fate can of the marked cells can be followed up. Since the AAV it is integrated into the chromosome of the labeled cells also with the multiplication of the cells with and which increases Clones developing from the marked cells can be determined using the marking can be recognized. This is special advantageous in research work as the further Fate of the marked cells and those derived from them Descendants can be tracked.
Vorteilhaft an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß lediglich Wildtyp-Adeno-assoziierte Viren verwendet werden, die anerkanntermaßen apathogen sind. Eine Integration des AAV in das Wirtsgenom läßt also keine Krankheiten oder sonstigen Nachteile für den Empfängerorganismus erwarten.An advantage of the method according to the invention is that only wild-type adeno-associated viruses are used, who are recognized to be apathogenic. An integration of the AAV in the host genome thus leaves no diseases or expect other disadvantages for the recipient organism.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäß verwendeten Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus ist, daß sich das Virus zwar ins Wirtsgenom integrieren kann, aber von dort nicht mehr mobilisiert werden kann. Das heißt, das Virus vermehrt sich nicht selbständig und infiziert dann andere Zellen, was zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen könnte.Another advantage of the used according to the invention Wild-type adeno-associated virus is that the virus can integrate into the host genome, but not from there can be mobilized more. That means the virus multiplies does not become independent and then infects other cells what could falsify the test results.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die Wildtyp-Adeno-assoziierten Viren gentechnisch nicht verändert sind oder verändert werden müssen und, daß daher keine Komplikationen mit dem Gentechnikgesetz zu befürchten sind. Another advantage of the method according to the invention is that the wild-type adeno-associated viruses are not genetically engineered are changed or need to be changed and that therefore no complications with the genetic engineering law to fear are.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann grundsätzlich bei Säugern und bei Menschen eingesetzt werden, wobei die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens beim Menschen, insbesondere bei der klinischen Forschung und bei der Therapie bevorzugt ist. Auch bei der Forschung mit Tiermodellen läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren gut einsetzen.The method according to the invention can in principle Mammals and humans are used, the Use of the method according to the invention in humans, especially in clinical research and in Therapy is preferred. Also with the research The method according to the invention can be used well in animal models deploy.
Angewendet werden kann das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise bei Patienten, die nicht mit dem entsprechenden Subtyp der Adeno-assoziierten Viren infiziert sind. Sofern eine Infektion in einem Adeno-assoziierten Virusstamm vorliegt, kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein anderer Wildtyp-Stamm verwendet werden, wobei jedoch darauf zu achten ist, daß ausreichende Unterschiede in den Nukleotidsequenzen vorliegen, so daß eine Unterscheidung zwischen dem zur Markierung eingesetzten Wildtypstamm und dem Stamm des Adeno-assoziierten Virus möglich ist, mit dem die zu untersuchenden Patienten infiziert sind.The method according to the invention can be used for example in patients who do not use the corresponding subtype of the adeno-associated virus infected are. Unless an infection in an adeno-associated Virus strain is present in the method according to the invention another wild-type strain can be used, however It is important to ensure that there are sufficient differences in the Nucleotide sequences are present, so that a distinction between the wild type strain used for marking and the strain of the adeno-associated virus is possible with which the patients to be examined are infected.
Es hat sich herausgestellt, daß das erfindungsgemäße Markierungsverfahren besonders geeignet ist, wenn es zur Markierung von mobilisierten Blutstammzellen verwendet wird.It has been found that the inventive Marking process is particularly suitable when it comes to Labeling of mobilized blood stem cells is used.
Insbesondere bei Tumorerkrankungen können periphere Blutstammzellen durch Chemotherapie und eine anschließende Behandlung mit verschiedenen Wachstumsfaktoren mobilisiert und ex vivo expandiert werden. Dieses Verfahren ist beispielsweise beschrieben in Brugger et al., Blood, 1993, Vol. 81, S. 2579-2582.Especially with tumor diseases peripheral can Blood stem cells through chemotherapy and a subsequent one Treatment mobilized with various growth factors and be expanded ex vivo. This procedure is for example, described in Brugger et al., Blood, 1993, Vol. 81, pp. 2579-2582.
Wenn also periphere Blutstammzellen ex vivo expandiert werden, können die hierbei gewonnenen Blutstammzellen mit dem Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus transduziert werden. Die Transduktion der zu infizierenden Blutstammzellen erfolgt in Zellkulturmedium, in bevorzugter Weise in Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium. In bevorzugter Weise ist das Zellkulturmedium mit autologem Patientenplasma supplementiert. Weiterhin enthält das Zellkulturmedium in bevorzugter Weise Wachstumsfaktoren, wobei die rekombinant hergestellten Wachstumsfaktoren Interleukin-1, Interleukin- 3, Interleukin-6, Erythropoetin und Stammzellfaktor bevorzugt sind. Die Konzentrationen der einzelnen Wachstumsfaktoren liegen bei 50 bis 200 ng/ml, bevorzugt bei 100 ng/ml. Das Medium mit Zellen und Viren wird bei 37°C über sechs Stunden inkubiert. Das AAV liegt vor in einem Virusstock von verpackten AAV-Partikeln, die in Zellkulturen hergestellt wurden. Die Herstellung von AAV erfolgt nach allgemein bekannten Verfahren. Diese Partikel sind zur einmaligen Infektion der Zellen in der Lage. Da die Wildtypviren die genetische Information zur Mobilisierung der Viren nicht besitzen, ist eine weitere Infektion der markierten Zellen nach dem Transduktionsschritt nicht mehr möglich.So when peripheral blood stem cells expand ex vivo the blood stem cells obtained can be used the wild-type adeno-associated virus. The transduction of the blood stem cells to be infected takes place in cell culture medium, preferably in Iscove's Modified Dulbecco's Medium. Preferably is the cell culture medium with autologous patient plasma supplemented. The cell culture medium also contains in preferably growth factors, the recombinant produced growth factors interleukin-1, interleukin 3, interleukin-6, erythropoietin and stem cell factor are preferred. The concentrations of each Growth factors are 50 to 200 ng / ml, preferably 100ng / ml. The medium with cells and viruses is at 37 ° C incubated for six hours. The AAV exists in one Virus stock of packaged AAV particles in cell cultures were manufactured. The production of AAV takes place after generally known methods. These particles are for able to infect cells once. Since the Wild-type viruses provide the genetic information for mobilization who do not own viruses is another infection of the no longer marked cells after the transduction step possible.
Um das erfindungsgemäße Verfahren auswerten zu können, müssen Nachweismethoden zur Verfügung gestellt werden, die Auskunft darüber geben, ob die zu untersuchende Zelle vor der Infektion mit Adeno-assoziiertem Virus infiziert war oder nicht. Weiterhin ist es zur Auswertung erforderlich, daß nach der Markierung der Zellen die markierten Zellen von den nicht markierten Zellen unterschieden werden können.In order to be able to evaluate the method according to the invention, detection methods must be provided that Provide information about whether the cell to be examined is present the infection was infected with adeno-associated virus or not. Furthermore, for evaluation it is necessary that after marking the cells, the marked cells of the unmarked cells can be distinguished.
Eines der Nachweisverfahren ist die an sich wohlbekannte Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Zur Durchführung dieser PCR-Reaktion müssen geeignete Oligonukleotide synthetisiert werden, die als Primer für die PCR-Reaktion dienen. Die Sequenz der Oligonukleotidsequenzen kann anhand der im Journal of Virology (1983, Vol. 45, S. 555-564) offenbarten Nukleotidsequenz festgelegt werden. Üblicherweise wird man zur Durchführung der PCR-Reaktion solche Oligonukleotidsequenzen auswählen, die an den Enden der Genomsequenz des AAV lokalisiert sind. One of the detection methods is the well known one Polymerase chain reaction (PCR). To carry out this PCR reaction must have suitable oligonucleotides synthesized that serve as primers for the PCR reaction. The Sequence of the oligonucleotide sequences can be based on the im Journal of Virology (1983, Vol. 45, pp. 555-564) Nucleotide sequence can be set. Usually you will to carry out the PCR reaction Select oligonucleotide sequences that are at the ends of the Genome sequence of the AAV are localized.
Eine andere Möglichkeit stellt die in situ-Hybridisierung oder die Durchführung von Southern Blots dar. Bei den an sich bekannten Southern Blots (Southern-Analyse) werden elektrophoretisch aufgetrennte DNA-Fragmente auf spezielle Filter oder Membranen übertragen. Durch anschließende Hybridisierung mit homologen DNA-Sonden können Aussagen über Vorkommen, Kopiezahl, Größe und Nukleotidsequenz gemacht werden.Another possibility is in situ hybridization or performing Southern blots known Southern blots (Southern analysis) electrophoretically separated DNA fragments on special Transfer filters or membranes. By subsequent Hybridization with homologous DNA probes can provide information about Occurrence, number of copies, size and nucleotide sequence made become.
Zum Nachweis der Markierung von Zellen wird daher erfindungsgemäß die DNA aus den markierten Zellen isoliert, elektrophoretisch in einem Agarosegel aufgetrennt und die DNA wird durch Alkalibehandlung des Gels und anschließende Neutralisierung des Gels in Salzlösung denaturiert. Nun wird die DNA auf Nitrozellulose oder Nylonfilter übertragen und an den Filter gebunden. Diese Bindung wird dann durch Hitze (Einbacken) oder UV-Bestrahlung stabilisiert. Nach Prähybridisierung zur Absättigung von unspezifischen Bindungen und anschließendem Waschen werden die Filter mit einer markierten DNA-Sonde hybridisiert. Die DNA-Sonden können radioaktiv markiert sein oder auch andere Markierungen tragen. Für die markierten DNA-Sonden werden aus der bekannten DNA-Sequenz geeignete Bereiche ausgewählt und in bevorzugter Weise synthetisch hergestellt. Diese DNA- Sonden hybridisieren dann mit dem AAV-Genom, sofern dieses in die markierte Zelle integriert wurde. Wenn kein Hybridisierungssignal erhalten wird, ist die Zelle nicht markiert.It is therefore used to detect the labeling of cells according to the invention, the DNA is isolated from the labeled cells, electrophoretically separated in an agarose gel and the DNA is made by alkali treatment of the gel and subsequent Neutralization of the gel denatured in saline. Well now transfer the DNA to nitrocellulose or nylon filters and tied to the filter. This bond is then caused by heat (Baking) or UV radiation stabilized. To Prehybridization to saturate unspecific Bindings and then washing the filters with a labeled DNA probe hybridizes. The DNA probes can be radiolabelled or others Wear markings. For the labeled DNA probes Suitable regions are selected from the known DNA sequence and preferably synthetically produced. This DNA Probes then hybridize to the AAV genome, if this was integrated into the marked cell. If not Hybridization signal is obtained, the cell is not marked.
Wenn die expandierten peripheren Blutstammzellen erfolgreich retransplantiert wurden, kann der Nachweis der mit AAV markierten Zellen durch die beim erfolgreichen Angang des Transplantats von diesen Stammzellen gebildeten reifen peripheren Blutzellen verschiedener Zellinien nachgewiesen werden. In bevorzugter Weise erfolgt die Anfärbung von auf Objektträgern fixierten Einzelzellen gleichzeitig, einerseits durch "Fluorescent In Situ Hybridization" (FISH) für Teile des Genoms von AAV und andererseits mit Hilfe gefärbter Antikörper für zellinienspezifische Oberflächenmarker. Auf diese Weise können einerseits die untersuchenden Zellen identifiziert werden mit Hilfe der Antikörper für die zellinienspezifischen Oberflächenmarker und andererseits kann durch die Fluorescent In Situ Hybridization festgestellt werden, ob diese Zellen markiert sind oder nicht markiert sind.If the expanded peripheral blood stem cells succeed Retransplanted can provide evidence of having AAV marked cells by the successful start of the Graft mature from these stem cells peripheral blood cells of different cell lines detected become. Staining is preferably carried out from Slides fixed single cells at the same time, on the one hand through "Fluorescent In Situ Hybridization" (FISH) for parts of the AAV genome and on the other hand with the help stained antibody for cell-specific Surface marker. In this way, on the one hand, the investigating cells are identified using the Antibodies for cell-specific surface markers and on the other hand, through the Fluorescent In Situ Hybridization will determine whether these cells are labeled are or are not marked.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Zellen, die mit Wildtyp-Adeno-assoziiertem Virus markiert sind, wobei diese Zellen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden können. In besonders bevorzugter Form handelt es sich bei diesen Zellen um menschliche periphere Blutstammzellen, die die Markierung mit Wildtyp-Adeno assoziiertem Virus tragen.The present invention also relates to cells which are labeled with wild-type adeno-associated virus, where these cells using the method according to the invention can be obtained. In a particularly preferred form these cells are human peripheral Blood stem cells that mark with wild-type adeno associated virus.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Testkits, die zum Nachweis des Adeno-assoziierten Virus in Zellen geeignet sind. Diese Testkits weisen Nukleotidsequenzen auf, die zu der DNA-Sequenz von Wildtyp-Adeno-assoziiertem Virus komplementär sind. Bei diesen Testkits kann es sich um Zusammenstellungen handeln, die zur Durchführung der an sich wohlbekannten Polymerase-Kettenreaktion geeignet sind und die als Primer Oligonukleotid-Sequenzen aufweisen, die spezifisch sind für AAV. Durch die Polymerase-Kettenreaktion kann dann nachgewiesen werden, ob sich AAV in den zu untersuchenden Zellen befindet oder nicht.The present invention also relates to test kits, those used to detect the adeno-associated virus in cells are suitable. These test kits have nucleotide sequences that to the DNA sequence of wild-type adeno-associated virus are complementary. These test kits can be Compilations act to carry out the itself well-known polymerase chain reaction are suitable and which have as primers oligonucleotide sequences which are specific to AAV. Through the polymerase chain reaction can then be demonstrated whether AAV is in the investigating cells or not.
Ein weiteres Testkit kann eine Zusammenstellung betreffen, die zur in situ-Hybridisierung geeignet ist. Wesentlicher Bestandteil dieser Zusammensetzung ist dann eine markierte DNA-Sequenz, die zu der Sequenz von AAV komplementär ist.Another test kit can relate to a compilation, which is suitable for in situ hybridization. More essential Part of this composition is then a marked one DNA sequence that is complementary to the sequence of AAV.
Weiterhin kann es sich bei den erfindungsgemäßen Testkits um eine Zusammenstellung handeln, die zur Durchführung des an sich bekannten Southern Blots geeignet ist. Diese Zusammenstellung enthält eine DNA-Sequenz, die komplementär zur DNA-Sequenz von AAV ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist das Testkit die Reagenzien auf, die einerseits zur Fluorescent In Situ Hybridization für Teile des Genoms von AAV erforderlich sind und andererseits mit Farbe markierte Antikörper für zellinienspezifische Oberflächenmarker.Furthermore, the test kits according to the invention can be act a compilation to carry out the known Southern blots is suitable. These Compilation contains a DNA sequence that is complementary to the AAV DNA sequence. In a particularly preferred Embodiment, the test kit has the reagents that on the one hand for fluorescent in situ hybridization for parts of the genome of AAV are required and on the other hand with Color-labeled antibodies for cell-specific Surface marker.
Darüber hinaus weisen die Zusammenstellungen diejenigen Komponenten auf, die zur Durchführung des jeweiligen Testverfahrens benötigt werden, wie Puffer, Enzyme etc.In addition, the compilations indicate those Components on which to carry out the respective Test procedures are needed, such as buffers, enzymes etc.
Vorteilhaft bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß das Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus gleichzeitig Vektor und Marker in einem ist. Man spart sich also den Schritt der Klonierung des Markers in den Vektor. Außerdem ist das erfindungsgemäß verwendete Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus nachgewiesenermaßen apathogen. Vorteilhaft ist auch, daß sich das Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus spezifisch an einer bekannten Stelle in das Chromosom 19 integriert und, daß daher keine "Random"-Mutagenese erfolgt oder, daß das Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus kein tumorgenes Potential entfaltet, wie das beispielsweise bei den Retroviren der Fall ist. Weiterhin ist vorteilhaft, daß das AAV zellzyklusunhabhängig ist und mit sehr hoher Effizienz in die zu markierenden Zellen integriert. Da die zu markierenden Zellen keinen Behandlungsschritten ausgesetzt werden müssen, die den Stoffwechsel beeinträchtigen können, wie beispielsweise Bestrahlung, sind die Zellen in ihrer Leistungs- und Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt.An advantage of the method according to the invention is that Wild-type adeno-associated virus simultaneously vector and Marker in one. So you save the step of Cloning the marker in the vector. Besides, that is Wild-type adeno-associated virus used according to the invention proven to be apathogenic. It is also advantageous that the wild-type adeno-associated virus specifically targets one known place integrated into chromosome 19 and that therefore no "random" mutagenesis occurs or that the Wild-type adeno-associated virus has no tumorigenic potential unfolds, as is the case with the retroviruses of Case is. It is also advantageous that the AAV cell cycle independent and with very high efficiency in integrated the cells to be marked. Since that too marking cells not exposed to any treatment steps need to be, which can affect the metabolism, like radiation, the cells are in theirs Performance and viability not impaired.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele näher erläutert.The present invention is illustrated by the examples explained.
Durch Leukapherese wurden humane CD 34⁺-angereicherte periphere Blutstammzellen gewonnen. Die gewünschten Zellen lagen in einer Konzentration von 1 × 10⁶ und in einer Reinheit von 50% vor. Die PBSC-Zellen wurden in 2 ml vorgewärmtem Expansionsmedium resuspendiert. Bei dem Expansionsmedium handelte es sich um Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium, das angereichert war mit 2% autologem ACD-Plasma und je 100 ng/ml der Zytokine rhSCF, rhIL-1, rhIL-3, rhIL-6 und EPO. Nun wurden die Zellen mit AAV- Wildtyp-Virus-Stocks versetzt und für zwei Stunden bei 37°C im Wasserbad belassen, wobei mit 5% CO₂ in Luft begast wurde. Nach einer Inkubationsdauer von einer Stunde wurden die Zellen aufgeschüttelt. Schließlich wurde mit 10 ml Expansionsmedium aufgefüllt und anschließend zweimal mit Expansionsmedium gewaschen, wobei die Zellen bei 800 g für fünf Minuten abzentrifugiert wurden. Das Pellet wurde resuspendiert und die Zellzahl bestimmt. Als Kontrolle wurde ein Zytospin durchgeführt. Hierbei werden die Zellen nebeneinander auf Glasobjektträger aufgebracht, wobei sie gut angefärbt werden können.Human CD 34⁺-enriched by leukapheresis peripheral blood stem cells obtained. The desired cells were in a concentration of 1 × 10⁶ and in one Purity of 50%. The PBSC cells were in 2 ml preheated expansion medium resuspended. In which Expansion medium was Iscove's Modified Dulbecco’s medium that was enriched with 2% autologous ACD plasma and 100 ng / ml each of the cytokines rhSCF, rhIL-1, rhIL-3, rhIL-6 and EPO. Now the cells with AAV Wild-type virus stocks spiked and at 37 ° C for two hours Leave in a water bath, gassing with 5% CO₂ in air has been. After an incubation period of one hour the cells shaken. Finally, with 10 ml Expansion medium filled and then twice with Expansion medium washed, the cells at 800 g for centrifuged for five minutes. The pellet was resuspended and the cell number determined. As a control performed a cytospin. Here the cells applied side by side to glass slides, being can be well stained.
Humane allogene Knochenmarks-Langzeitkulturen, die ein konfluentes Stroma aufweisen und 3-4 Wochen alt sind, werden in 10 ml Kulturflaschen mit 15 Gy Cs-gamma bestrahlt. Die Dosisrate beträgt 3-5 Gy/min.Long-term human allogeneic bone marrow cultures, the one have confluent stroma and are 3-4 weeks old irradiated with 15 Gy Cs-gamma in 10 ml culture bottles. The Dose rate is 3-5 Gy / min.
Zunächst werden diese Zellen zweimal mit PBS gespült und dann mit je 5 × 10⁴ Zellen des Infektionsansatzes in Langzeitkulturmedium inokuliert. Bei dem Langzeitmedium handelt es sich um Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium, das 10% FCS, 10% Pferdeserum und 5 × 10-7 M Hydrocortison enthält.First, these cells are rinsed twice with PBS and then inoculated with 5 × 10⁴ cells of the infection batch in long-term culture medium. The long-term medium is Iscove's Modified Dulbecco's medium, which contains 10% FCS, 10% horse serum and 5 × 10 -7 M hydrocortisone.
Jede Woche wird die Hälfte des Kulturmediums durch neues Medium ersetzt. Vom Überstand wird die Zellzahl bestimmt und eine Bestimmung der Anzahl der koloniebildenden Zellen erfolgt in 0,9% Methylcellulose, 20% FCS, 100 ng/ml rhIL-3 und 100 ng/ml rhGM-CSF.Every week, half of the culture medium is replaced by new ones Medium replaced. The cell number is determined from the supernatant and a determination of the number of colony forming cells takes place in 0.9% methyl cellulose, 20% FCS, 100 ng / ml rhIL-3 and 100 ng / ml rhGM-CSF.
Die Zellen des Überstandes werden auf Glasobjektträger nebeneinander aufgebracht, wodurch eine gute Anfärbbarkeit gewährleistet ist (Zytospin-Preps).The cells of the supernatant are placed on glass slides applied side by side, which makes it easy to dye is guaranteed (cytospin preps).
Die Analyse der Virusintegration erfolgt durch Southern Blot, wobei die DNA von 5 × 10⁵ bis 2 × 10⁶ Zellen isoliert wird. Diese DNA wird mit dem Restriktionsenzym Bgl II verdaut und elektrophoretisch aufgetrennt. Als Nachweissonde dient ein 1,8 kB langes Fragment aus dem Adeno-assoziierten Virus-rep-Gen, das mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und XhoI ausgeschnitten werden kann.The analysis of the virus integration is carried out by Southern Blot, isolating the DNA from 5 × 10⁵ to 2 × 10⁶ cells becomes. This DNA is mixed with the restriction enzyme Bgl II digested and separated electrophoretically. As a detection probe serves a 1.8 kB fragment from the adeno-associated Virus rep gene associated with the restriction endonucleases XbaI and XhoI can be cut out.
Alternativ hierzu wird eine in situ-Hybridisierung der Zellen auf Objektträgern durchgeführt.Alternatively, in situ hybridization of the Cells performed on slides.
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