DE4336498A1

DE4336498A1 - Method for diagnosing renal and vascular diseases

Info

Publication number: DE4336498A1
Application number: DE4336498A
Authority: DE
Inventors: Dontscho Prof Dr Kerjaschki
Original assignee: Bender and Co GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim RCV GmbH and Co KG
Priority date: 1993-10-26
Filing date: 1993-10-26
Publication date: 1995-04-27

Abstract

Method for diagnosing human diseases manifested, primarily or in the course of generalised vascular diseases secondarily, by damage to the renal glomeruli, in which a body fluid is investigated for its content of human MGS 160/170 and/or fragments thereof. Monoclonal antibodies against MGS 160/170 and hybridoma cell lines which produce the antibodies. Immunoassay kits for carrying out the method.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Diagnostik von Nieren- und Gefäßerkrankungen.The present invention relates to the field the diagnosis of kidney and vascular diseases.

Die Hauptaufgabe der Niere ist die Filtration von harnpflichtigen Substanzen aus dem Plasma in den Urinraum. Dies wird bewerkstelligt durch spezialisierte Gefäßabschnitte, die Nierenglomerula, welche feinste Abzweigungen des arteriellen Gefäßsystemes darstellen. Die Filtrationsbarriere wird aus folgenden histologischen Strukturen aufgebaut: dem Endothel, welches in den Nierenglomerula große Poren aufweist, der glomerulären Basalmembran, welche wahrscheinlich die eigentliche Filtrationsbarriere mit einer Durchlaßgrenze von einem Molekulargewicht knapp unter Albumin darstellt, sowie den visceralen glomerulären Epithelzellen oder Podozyten, welche an der Außenseite in den Urinraum hinausragen und durch ihre komplexe Morphologie einen gewissen permanenten Druck in der Basalmembran aufrechterhalten, der dem Filtrationsdruck von der Plasmaseite her einen Widerstand entgegenstellt. Biochemisch weisen einzelne Bestandteile der Glomerula Gemeinsamkeiten mit Blutgefäßen und mit Endothelzellen an anderen Stellen des Organismus auf. Bei einer Reihe von Krankheiten, die das Gefäßsystem in generalisierter Form betreffen, sind daher die Nierenglomerula, die spezialisierte Gefäßabschnitte darstellen, mitbetroffen. Andererseits gibt es Gefäßschädigungen, bei denen kein Zusammenhang mit den Nierenblutgefäßen besteht.The main task of the kidney is the filtration of urinary substances from the plasma in the Urine chamber. This is done by specialized Vascular sections, the kidney glomerula, the finest Represent branches of the arterial vascular system. The filtration barrier is made up of the following histological structures built up: the endothelium, which has large pores in the kidney glomerula, the glomerular basement membrane, which is likely the actual filtration barrier with a Passage limit of a molecular weight just below Albumin represents, as well as the visceral glomerular Epithelial cells or podocytes, which are on the outside protrude into the urine and through their complex A certain permanent pressure in the morphology Maintain basement membrane that the filtration pressure resistance from the plasma side opposed. Biochemically, individual Components of the glomerula common to Blood vessels and with endothelial cells in other places of the organism. With a number of diseases, which affect the vascular system in a generalized form, are therefore the kidney glomerula, the specialized one Represent vessel sections, also affected. On the other hand there is vascular damage that is not related with the kidney blood vessels.

Aufgrund der funktionellen morphologischen und pathomorphologischen Zusammenhänge - zwischen dem Gefäßsystem im allgemeinen und den Nierenglomerula und anderen Gefäßabschnitten der Niere im besonderen - ergibt sich folgende Systematik der die einzelnen Gefäßkomponenten individuell oder in Kombination betreffenden pathologischen Veränderungen, von denen die wichtigsten und am häufigsten auftretenden beispielhaft genannt seien:Due to the functional morphological and pathomorphological relationships - between the Vascular system in general and the renal glomerula and other vascular sections of the kidney in particular - there follows the following system of the individual Vascular components individually or in combination affected pathological changes, of which the most important and most common Examples include:

Erkrankungen mit Primärmanifestation in der Niere, die sich ausschließlich oder hauptsächlich äußern in SchädigungenDiseases with primary manifestation in the kidney, the express themselves exclusively or mainly in Damage

- the glomerular capillary loops (Filtration apparatus),
- the renal vasculature (with consecutive Impairment of the glomerular apparatus),
- The interstitial or tubular structures of the Renal parenchyma.

Zu generalisierten Gefäßerkrankungen mit Beteiligung der Nieren zählenGeneralized vascular diseases with involvement count the kidneys

- generalized inflammatory vascular diseases (e.g. allergic vasculitis, Wegener's Granulomatosis, etc.),
- generalized metabolic disorders (e.g. diabetic vasculopathy, amyloidosis, etc.).

Erkrankungen mit glomerulärer Primärmanifestation sind häufig immunologisch bedingt (z. B. die große Gruppe der Glomerulonephritiden, nichtentzündlichen glomerulären Erkrankungen, wie die Minimal Change Nephrose oder die fokale Sklerose).Diseases with glomerular primary manifestation are often immunological (e.g. the large group of Glomerulonephritis, non-inflammatory glomerular Diseases such as minimal change nephrosis or focal sclerosis).

Erkrankungen, die in unterschiedlichem Ausmaß das Gefäßsystem generell und die Nierenglomerula betreffen, können gleichfalls immunologischen Ursprungs sein (z. B. nekrotisierende Vaskulitiden, Wegener′sche Granulomatose), oder sie haben metabolische Ursachen (z. B. die diabetische Angiopathie mit Nephropathie, die generalisierte Amyloidose, oder die Schwangerschaftsgestose, das hämolytisch-urämische Syndrom).Diseases to varying degrees Vascular system in general and affect the kidney glomerula, can also be of immunological origin (e.g. necrotizing vasculitis, Wegener's Granulomatosis) or they have metabolic causes (e.g. diabetic angiopathy with nephropathy, the generalized amyloidosis, or the Gestational gestosis, the hemolytic-uremic Syndrome).

Interstitielle und tubuläre Schädigungen umfassen z. B. die Pyelonephritis, die Analgetikanephropathie, die Gichtnephropathie und Zystennieren.Interstitial and tubular damage include e.g. B. Pyelonephritis, Analgesicanephropathy, Gouty nephropathy and cystic kidneys.

Angesichts der Schwere sowie der großen Bandbreite des klinischen Verlaufs, der Prognose und der Therapien der Erkrankungen, welche die Nierenglomerula einerseits primär und ausschließlich, andererseits im Rahmen generalisierter Gefäßerkrankungen betreffen, ist es erforderlich, eine exakte Prognose zu stellen, um die therapeutischen Maßnahmen, die Einschätzung der individuellen Prognose und letztlich auch eine wissenschaftlichen Zuordnung treffen zu können.Given the severity and wide range of the clinical course, prognosis and therapies of the Diseases affecting the kidney glomerula on the one hand primarily and exclusively, on the other hand within the framework generalized vascular disease, it is required to make an accurate forecast to the therapeutic measures, the assessment of the individual forecast and ultimately also one to be able to make scientific assignments.

Als verläßlichste Diagnosemaßnahme für pathologische Zustände der Niere wird die Nierenbiopsie angesehen. Diese Maßnahme ist jedoch einerseits als invasive Technik für den Patienten mit Unannehmlichkeiten und Risken, andererseits für den diagnostizierenden Arzt mit großem Aufwand verbunden.As the most reliable diagnostic measure for pathological Kidney biopsy is considered for kidney conditions. However, this measure is considered invasive on the one hand Technology for the patient with inconvenience and Risks, on the other hand, for the diagnosing doctor connected with great effort.

Es besteht daher der Bedarf nach Methoden, mit denen die verschiedenen, klinisch oft nicht genau klassifizierbaren Nierenerkrankungen auf der Grundlage von nicht-invasiven Parametern, die den Ort, den Verlauf und das Stadium pathologischer Veränderungen markieren, diagnostiziert und abgeklärt werden können, um die Zahl der Biopsien verringern bzw. diese langfristig ersetzen zu können.There is therefore a need for methods with which the different, often not clinically accurate classifiable kidney disease based of non-invasive parameters that determine the location Course and stage of pathological changes mark, diagnose and clarify, reduce or reduce the number of biopsies to be able to replace in the long term.

Die genannten Erkrankungen, an denen die Nieren beteiligt sind, resultieren zumeist nach chronischem, therapeutisch nur schwer beeinflußbarem Verlauf in einer chronischen Niereninsuffizienz, die den Einsatz von Nierenersatztherapien (z. B. der Nierentransplantation) als lebenserhaltende Maßnahme notwendig macht. Vor allem transplantierte Patienten bedürfen einer engmaschigen Überwachung, um Komplikationen möglichst früh zu erkennen und zu behandeln und somit den Verlust des Transplantates zu vermeiden. Auch hier spielt die Nierenbiopsie noch immer die vorherrschende Rolle, obwohl das Risiko dieser Maßnahme für den Patienten relativ hoch ist.The diseases mentioned, in which the kidneys mostly result from chronic, therapeutically difficult to influence course in chronic renal failure that use of kidney replacement therapies (e.g. the Kidney transplantation) as a life-supporting measure makes necessary. Mostly transplanted patients require close monitoring in order to Recognize complications as early as possible treat and thus the loss of the graft avoid. The kidney biopsy is still playing here always the predominant role, although the risk this measure is relatively high for the patient.

Die Nierentransplantation stellt daher ein weiteres Indikationsgebiet dar, für das ein Bedarf an nicht invasiven Diagnoseverfahren besteht. Hier besteht die Notwendigkeit, zwischen akuter oder chronischer Abstoßungsreaktion, Infektionen und medikamentös induzierter Schädigung, z. B. durch Cyclosporin, zumeist unter Zeitdruck, zu differenzieren.The kidney transplant therefore represents another Indications area for which there is no need for invasive diagnostic procedures exist. Here is the Need between acute or chronic Rejection, infection and drug induced damage, e.g. B. by cyclosporin, mostly under time pressure to differentiate.

Wie erwähnt, stellen die Nierenglomerula spezialisierte Abschnitte des Gefäßsystemes dar und können als solche von generalisierten Gefäßerkrankungen mitbetroffen werden. Tatsächlich geht eine Reihe von entzündlichen Gefäßerkrankungen mit einer Läsion der glomerulären Kapillarschlingen einher. Dies trifft insbesondere für die Gruppe der autoimmunologisch bedingten Vaskulitiden zu, deren klinischer Verlauf nicht so sehr von der generalisierten Gefäßschädigung, sondern in der Regel vom Ausmaß der Nierenbeteiligung bestimmt wird. In diese Kategorie von Krankheiten fallen z. B. der systemische Lupus erythematodes und der Wegener′sche Granulomatose/Periarteritis nodosa/Rapid progressive Glomerulonephritis Komplex. As mentioned, the renal glomerula represent specialized Sections of the vascular system represent and can be as such affected by generalized vascular diseases become. Indeed, there are a number of inflammatory ones Vascular disorders with a glomerular lesion Capillary loops accompanied. This is especially true for the group of autoimmunological vasculitis too, whose clinical course is not so different from that generalized vascular damage, but usually is determined by the extent of kidney involvement. In this category of diseases fall e.g. B. the systemic lupus erythematosus and Wegener's Granulomatosis / Periarteritis nodosa / Rapid progressive Glomerulonephritis complex.

Obwohl die molekularen pathogenen Mechanismen der generalisierten Gefäßschädigungen in ihren Grundzügen bekannt sind und für die klinische globale Verlaufskontrolle derzeit einige nicht invasive Monitoringverfahren erprobt werden (Cameron, 1991), ist eine exakte Abschätzung der zumeist sehr schnell einsetzenden Nierenschädigung auch bei diesen Erkrankungen nur durch die Nierenbiopsie zu erreichen.Although the molecular pathogenic mechanisms of generalized vascular damage in its main features are known and for clinical global Follow-up is currently some non-invasive Monitoring methods are tried (Cameron, 1991) an exact estimate of the mostly very quickly onset of kidney damage also in these Diseases can only be achieved by kidney biopsy.

Die Notwendigkeit der Entwicklung klinisch einsetzbarer, nicht invasiver Diagnoseverfahren besteht somit auch für diese primär vaskulären Krankheiten, die mit einer Schädigung der Glomerula einhergehen.The need for clinical development usable, non-invasive diagnostic procedures exist thus also for these primary vascular diseases are accompanied by damage to the glomerula.

Ein Konzept zur Entwicklung von nicht-invasiven Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen, bei denen eine Schädigung der Niere eintritt, besteht darin, Moleküle, die von den Oberflächen der den Urin produzierenden und ableitenden Zellen freigesetzt werden (z. B. durch Abstoßung von Oberflächenmolekülen durch Schädigungen der Zelle oder Zelltod), im Harn quantitativ zu bestimmen und daraus klinisch-diagnostisch relevante Rückschlüsse auf die Erkrankung abzuleiten. Diesem Konzept liegt der Umstand zugrunde, daß Urin von seiner Entstehung als Primärharn in den Glomerula bis zu seiner Ausscheidung mit einer großen Anzahl unterschiedlicher Zellmembranen in Kontakt steht, die einerseits darauf spezialisiert sind, selektiv einzelne Harnkomponenten zurückzugewinnen und die andererseits, vor allem in den ableitenden Harnwegen, eine inerte Oberfläche bieten, um eine Abgrenzung zwischen Flüssigkeit und Organismus zu ermöglichen.A concept for developing non-invasive Procedure for the diagnosis of diseases in which a Kidney damage occurs is molecules from the surfaces of the urine producing and dissipative cells are released (e.g. by Rejection of surface molecules through damage the cell or cell death) in the urine determine and from it clinically-diagnostically relevant To draw conclusions about the disease. This Concept is based on the fact that urine from his Formation as primary urine in the glomerula up to its elimination with a large number different cell membranes is in contact on the one hand specialize in selectively individual Recover urine components and, on the other hand, especially in the urinary tract, an inert Provide a demarcation between surface To allow fluid and organism.

Als Grad der tubulären Schädigung wurden z. B. die Mengen von ausgeschiedenem β2-Mikroglobulin (Sherman et al., 1983, Woo et al., 1981) oder Lysozym (Dyck et al., 1979) bestimmt. Als Ausdruck der direkten, morphologisch faßbaren Tubulusalteration dienen derzeit auch die Bestimmung der Lactatdehydrogenase, sowie der N-Acetyl-β-D-Glukosaminidase (NAG) (Whiting et al., 1980, 1983). Weiters wurden monoklonale Antikörper gegen zum überwiegenden Teil nicht exakt definierte, z. T. auch identifizierte Nierenantigene hergestellt und auf ihre Brauchbarkeit in nicht-invasiven Tests geprüft (Tolkoff-Rubin, 1986; Scherberich, 1989).As a degree of tubular damage z. B. the Amounts of β2-microglobulin excreted (Sherman et al., 1983, Woo et al., 1981) or lysozyme (Dyck et al., 1979) certainly. As an expression of the direct, morphologically comprehensible tubular alteration currently serve also the determination of lactate dehydrogenase, as well as the N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG) (Whiting et al., 1980, 1983). Furthermore, monoclonal antibodies against mostly not exactly defined, e.g. T. also produced and identified kidney antigens tested for their usability in non-invasive tests (Tolkoff-Rubin, 1986; Scherberich, 1989).

In bisher durchgeführten klinischen Versuchen hat sich allerdings gezeigt, daß die eingesetzten Markierungsmoleküle im Harn nicht repräsentativ für den Nachweis der glomerulären Schädigung sind. Ähnliches zeigt sich für die derzeit gebräuchlichen Bestimmungsmethoden der funktionellen Tubulusparameter β2-Mikroglobulin und Lysozym. Beide besitzen zur Erfassung tiefergreifender Schädigungen des Nierengewebes keine zufriedenstellende Spezifität bzw. Sensitivität.In clinical trials conducted so far shown, however, that the used Marking molecules in the urine are not representative of the Evidence of glomerular damage are. Similar thing shows up for those currently in use Methods of determination of the functional tubular parameters β2 microglobulin and lysozyme. Both own Acquisition of profound damage to the Kidney tissue no satisfactory specificity or Sensitivity.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein neues, klinisch relevantes Verfahren zur Diagnose von Schädigungen der glomerulären Strukturen der Niere bereitzustellen.The present invention was based on the object a new, clinically relevant method of diagnosis damage to the glomerular structures of the kidney to provide.

Für der Lösung der gestellten Aufgabe wurde von der Überlegung ausgegangen, genau definierte und präzise lokalisierte Membranproteine ableitender Harnwege, welche in genau regionalisierten Abschnitten, den glomerulären Epithelzellen, regelmäßig exprimiert werden, als für die nicht-invasive Nierendiagnostik verwertbare Parameter heranzuziehen. Solche Moleküle können im Rahmen eines nicht-invasiven Diagnoseverfahrens als Parameter für den Zustand einer Niere bei verschiedenen Krankheitsbildern dienen, indem diese für einen bestimmten Abschnitt des Harntraktes spezifischen Moleküle mit Hilfe monoklonaler Antikörper nachgewiesen und quantifiziert werden. Dadurch wird eine Aussage darüber ermöglicht, ob bei einem bestimmten Patienten eine Schädigung in diesem speziellen Nierenabschnitt vorliegt. Diese Aussage bietet die Grundlage für die den Patienten individuell entsprechende optimale Therapie.For the solution of the task, the Considered, precisely defined and precise localized membrane proteins of the urinary tract, which in precisely regionalized sections, the glomerular epithelial cells, regularly expressed than for non-invasive kidney diagnostics use usable parameters. Such molecules can be done as part of a non-invasive Diagnostic procedure as a parameter for the state of a Serve kidney in various clinical pictures by this for a specific section of the urinary tract specific molecules using monoclonal antibodies be proven and quantified. This will a statement about whether a certain patients have an injury in this special kidney section. This statement provides the basis for the patient individually appropriate optimal therapy.

Bisher wurden lediglich Diagnoseverfahren auf der Grundlage tubulärer Marker entwickelt und versuchsweise eingesetzt (Cordon-Cardo et al., 1984; Bander et al., 1985).So far only diagnostic procedures based on tubular Marker developed and used on a trial basis (Cordon-Cardo et al., 1984; Bander et al., 1985).

Ein Sialoglykoprotein mit einem Molekulargewicht von 140 kD, das zuerst in der Ratte gefunden und "Podocalyxin" genannt wurde (Kerjaschki et al., 1984) ist ein Vertreter der Gruppe von Proteinen, die sowohl an den glomerulären Epithelzellen als auch an den Endothelzellen anderer Gefäße auftreten. Dieses Molekül entspricht dem "glomerulären Polyanion", welches aufgrund seiner histochemischen Färbbarkeit identifiziert wurde und in den Nierenglomerula die höchste Konzentration von negativ geladenen Molekülen im ganzen Organismus verursacht (Mohos und Skoza, 1969; Jones, 1969; Nolte und Ohkuma, 1969). Untersuchungen am Rattengewebe haben gezeigt, daß der Hauptbestandteil dieses sog. glomerulären Polyanions das Sialoglycoprotein "Podocalyxin" ist. Dieses stark negativ geladene Molekül scheint eine Funktion in der Aufrechterhaltung der Morphologie der glomerulären Epithelzellen einerseits und in der Kontrolle der glomerulären Permeabilität andererseits zu erfüllen. Ein Hinweis dafür ist z. B., daß in experimentellen Erkrankungen, die mit Proteinurie einhergehen, die Expression dieses Moleküls drastisch reduziert ist (Blau und Haas, 1973; Michael et al., 1970; Kerjaschki et al., 1985). Die mittels immunelektronenmikroskopischen Untersuchungen an Blutgefäßen festgestellte Lokalisierung von Podocalyxin ausschließlich an der luminalen Seite des Endothels (Horvat et al., 1986) und in höchster Konzentration an der Außenseite der glomerulären Epithelzellen (Sawada et al., 1986) dürfte in Zusammenhang mit dem Schutz der Zelloberfläche stehen.A sialoglycoprotein with a molecular weight of 140 kD, which was first found in the rat and "Podocalyxin" was called (Kerjaschki et al., 1984) is a representative of the group of proteins that both on the glomerular epithelial cells as well as on the Endothelial cells from other vessels occur. This molecule corresponds to the "glomerular polyanion" which due to its histochemical stainability was identified and in the kidney glomerula highest concentration of negatively charged molecules caused in the whole organism (Mohos and Skoza, 1969; Jones, 1969; Nolte and Ohkuma, 1969). Investigations on Rat tissues have been shown to be the main component this so-called glomerular polyanion Sialoglycoprotein "Podocalyxin" is. This strong negatively charged molecule appears to have a function in the Maintaining the morphology of the glomerular Epithelial cells on the one hand and in the control of the on the other hand, to meet glomerular permeability. An indication of this is e.g. B. that in experimental Diseases associated with proteinuria, the Expression of this molecule is drastically reduced (Blau and Haas, 1973; Michael et al., 1970; Kerjaschki et al., 1985). The means immunoelectron microscopic investigations Blood vessels localization of podocalyxin only on the luminal side of the endothelium (Horvat et al., 1986) and in the highest concentration the outside of the glomerular epithelial cells (Sawada et al., 1986) may be related to the protection of the Cell surface.

Nachfolgende Untersuchungen haben gezeigt, daß es im Menschen ein Molekül gibt, das dieselbe Verteilung wie das Ratten-Podocalyxin aufweist und diesem ähnlich, aber nicht damit identisch ist. Es weist ein anderes Molekulargewicht (Doppelbande entsprechend 160/170 kD) im SDS-Gel auf und zeigt nach tryptischem Verdau ein anderes Peptidmuster. Weiters sind Antikörper, die gegen das menschliche bzw. Rattenmolekül gerichtet sind, nicht kreuzreaktiv. Dieses Sialoglycoprotein wurde daher, um es vom Ratten-Podocalyxin zu unterscheiden, als Major Glomerular Sialoglycoprotein (MGS 160/170) bezeichnet (Kerjaschki et al., 1986).Subsequent studies have shown that in Gives people a molecule that has the same distribution as which has rat podocalyxin and is similar to it, but is not the same. It shows another Molecular weight (double band corresponding to 160/170 kD) in the SDS gel and shows after tryptic digestion different peptide pattern. Antibodies are also the directed against the human or rat molecule are not cross-reactive. This sialoglycoprotein was therefore taken to it from rat podocalyxin distinguish as a major glomerular sialoglycoprotein (MGS 160/170) (Kerjaschki et al., 1986).

Von Hancock und Atkins (1983) wurde ein monoklonaler Antikörper der Bezeichnung PHM5 beschrieben, der gegen nicht definierte Nierenepithelzellantigene gerichtet ist. Dieser Antikörper zeigte eine intensive Färbung der Nierenglomerula an Paraffinschnitten von normalen menschlichen Nieren. Eine ultrastrukturelle Lokalisation oder eine biochemische Definition des Antigens wurden von Hancock und Atkins nicht beschrieben. Kerjaschki et al., 1986, haben gezeigt, daß PHM5 eine Doppelbande von ca. 160/170 kD in glomerulären Lysaten aus menschlichem Material bindet und daß der Antikörper PHM5 ultrastrukturell ein Bild liefert, das der Verteilung Rattenpodocalyxin in der Rattenniere äquivalent ist. Von Hancock und Atkins wird die Möglichkeit erwähnt, diesen Antikörper auf seine Einsetzbarkeit zur Identifizierung und Quantifizierung von Epithelialzell-Antigen zu testen. Eine etwaige Verwendbarkeit des Antikörpers PHM5 für die gezielte Diagnose von Nierenschädigungen hat sich nicht erwiesen.Hancock and Atkins (1983) became a monoclonal Antibodies called PHM5 described against undefined renal epithelial cell antigens is. This antibody showed intense staining the kidney glomerula on paraffin sections from normal human kidneys. An ultrastructural Localization or a biochemical definition of the Antigens were not developed by Hancock and Atkins described. Kerjaschki et al., 1986, have shown that PHM5 a double band of approx. 160/170 kD in binds glomerular lysates from human material and that the antibody PHM5 is ultrastructural an image provides the distribution of rat podocalyxin in the Rat kidney is equivalent. From Hancock and Atkins mentioned the possibility of using this antibody on his Applicability for identification and quantification test of epithelial cell antigen. Any Usability of the antibody PHM5 for the targeted Diagnosis of kidney damage has not been made proven.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde erstmals festgestellt, daß das "Major Glomerular Sialoglycoprotein", im folgenden als "MGS 160/170" bezeichnet, bzw. Fragmente davon bei Schädigungen der glomerulären Strukturen der Niere im Harn und/oder im Serum nachweisbar ist. Da MGS 160/170 ein Membranprotein ist, das hinsichtlich seiner Lokalisierung in der Niere, und zwar an der Glykokalyx der Podozyten, exakt definierbar ist, kann es somit als Marker glomerulärer Läsionen herangezogen werden.In the context of the present invention was the first found that the "Major Glomerular Sialoglycoprotein ", hereinafter referred to as" MGS 160/170 " referred to, or fragments thereof when the glomerular structures of the kidney in the urine and / or in the Serum is detectable. Since MGS 160/170 Membrane protein is that in terms of its Localization in the kidney, namely on the glycocalyx the podocyte is precisely definable, it can therefore be Markers of glomerular lesions can be used.

Die vorliegende Erfindung beruht somit auf der Erkenntnis, daß MGS 160/170 einerseits ein Marker für primäre, isoliert-glomeruläre Läsionen, andererseits ein Marker für Gefäßerkrankungen mit glomerulärer Beteiligung ist.The present invention is therefore based on the Realization that MGS 160/170 is a marker for primary, isolated-glomerular lesions, on the other hand a marker for vascular disease with glomerular Participation is.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen, die sich primär oder im Zuge von generalisierten Gefäßerkrankungen sekundär in einer Schädigung der Nierenglomerula manifestieren, bei welchem Verfahren man eine Körperflüssigkeit auf ihren Gehalt an MGS 160/170 oder Fragmenten davon untersucht.The present invention relates to a method for Diagnosis of diseases that are primary or in the course of generalized vascular diseases secondary in one Manifest damage to the kidney glomerula when what method you put a body fluid on their MGS 160/170 content or fragments thereof examined.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Körperflüssigkeit Harn.In one embodiment of the invention Body fluid urine.

Da MGS 160/170 außer an der Oberfläche glomerulärer visceraler Epithelzellen an der luminalen Seite aller Endothelzellen vorkommt, kann im Harn auftretendes MGS 160/170 entweder vom Gefäßsystem oder von den Nierenglomerula stammen. Die Untersuchung von Harn auf seinen Gehalt an MGS 160/170 dient somit einerseits zur Diagnose von Erkrankungen, die sich primär in der Niere manifestieren. Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren in dieser Ausführungsform zur Diagnose der fokalen Sklerose, einer nicht entzündlichen Erkrankung, von der angenommen wird, daß sie primär die glomerulären Epithelzellen befällt. Eine weitere Einsatzmöglichkeit ist die Diagnose der Minimal Change Nephrose.Because MGS 160/170 except glomerular on the surface visceral epithelial cells on the luminal side of all Endothelial cells can occur in the urine MGS 160/170 either from the vascular system or from the Kidney glomerula originate. Examination of urine its MGS 160/170 content thus serves on the one hand for Diagnosis of diseases that are primarily in the kidney manifest. This is particularly suitable The inventive method in this embodiment to diagnose focal sclerosis, one not inflammatory disease, which is believed to it primarily affects the glomerular epithelial cells. A Another application is the diagnosis of minimal Change nephrosis.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden in einem nicht selektierten Gesamtkollektiv von nicht nierentransplantierten Patienten einer nephrologischen Ambulanz im Harn von Patienten mit glomerulären Erkrankungen wie Minimal Change Nephrose und fokale Sklerose erhöhte MGS 160/170-Werte nachgewiesen.In the context of the present invention were in a unselected total collective of not kidney transplanted patients of a nephrological Ambulance in the urine of patients with glomerular Diseases such as minimal change nephrosis and focal Sclerosis showed increased MGS 160/170 values.

Diese selektiv erhöhten Meßwerte für MGS 160/170 zeigen, daß MGS 160/170 als Suchtest für diese klinisch zumeist chronisch verlaufenden, sehr schwer zu diagnostizierenden fokalen Sklerosen bzw. Minimal Change Nephrosen einsetzbar ist.These selectively increased measured values for MGS 160/170 show that MGS 160/170 as an addiction test for this clinically mostly chronic, very difficult to diagnosing focal sclerosis or minimal Change nephrosis can be used.

MGS 160/170 wurde auch im Harn mancher Patienten mit epimembranöser Glomerulonephritis nachgewiesen, die offensichtlich eine aktive Phase dieser Erkrankung erlitten. Weiters zeigten Patienten mit IgA-Nephritis dann Ausscheidung von MGS 160/170, wenn die Erkrankung besonders aggressiv und mit massiven glomerulären Läsionen verlief.MGS 160/170 was also found in the urine of some patients epimembranous glomerulonephritis demonstrated that obviously an active phase of this disease suffered. Furthermore, patients with IgA nephritis showed then excretion of MGS 160/170 if the disease particularly aggressive and with massive glomerular Lesions.

Diese Befunde deuten darauf hin, daß die renale Ausscheidung von MGS 160/170 bei Glomerulonephritiden ein Indikator für eine floride Phase der Krankheit ist. These findings suggest that the renal Excretion of MGS 160/170 in glomerulonephritis is an indicator of a florid phase of the disease.

Unter die Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen, die sich primär in Schädigungen der glomerulären Strukturen der Niere manifestieren, fällt im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch die Überwachung von Zuständen im Anschluß an Nierentransplantationen.Among the procedures for diagnosing diseases that primarily in damage to the glomerular structures manifest the kidney falls within the framework of the present invention also the monitoring of Conditions following kidney transplants.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung an nierentransplantierten Patienten durchgeführten Untersuchungen haben folgendes ergeben:The scope of the present invention kidney transplant patients Studies have shown that:

1. The concentration of MGS 160/170 in the urine is one good indicator of a rejection episode. These manifests itself in a global deterioration of Kidney function, which is clinically characterized by an increase of serum creatinine.
2. The quantitative determination of MGS 160/170 in urine is a reliable parameter for determining the Therapy success z. B. after corticoid therapy; it was found that the concentration of MGS 160/170 in Urine in parallel with the concentration of serum creatinine falls off.
3. In several of the patients examined surprisingly several days to 2 weeks before Occurrence of a clinically manifest Graft rejection significantly increased MGS 160/170 Concentrations in the urine detected. Evidence of MGS 160/170 in urine transplant patients can thus act as an "early warning system" for upcoming Rejections serve before they become clinically manifest and can lead to kidney damage.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist hinsichtlich der klinischen Diagnostizierbarkeit glomerulärer Schädigungen eine Spezifität auf, die es den bisher bekannten Verfahren überlegen macht. The method according to the invention has in terms of clinical diagnosability of glomerular Damage has a specificity that it has so far makes known methods superior.

Bei den Erkrankungen, die sich primär in einer Schädigung der glomerulären Strukturen manifestieren, wird im Harn das im wesentlichen intakte MGS 160/170 nachgewiesen.For diseases that are primarily in a Manifest damage to the glomerular structures, the essentially intact MGS 160/170 proven.

Andererseits dient die Untersuchung von Harn auf das Vorhandensein von MGS 160/170 zur Diagnose von Schädigungen der Blutgefäße, an denen die Glomerula sekundär beteiligt sind. Beispiele für dieses Anwendung sind generalisierte Gefäßerkrankungen mit Nierenbeteiligung, z. B. Wegener′sche Granulomatose.On the other hand, the examination of urine for this Presence of MGS 160/170 for diagnosis of Damage to the blood vessels to which the glomerula are involved secondarily. Examples of this application are having generalized vascular diseases Kidney involvement, e.g. B. Wegener's granulomatosis.

Auch bei Erkrankungen, die sich sekundär in einer Schädigung der glomerulären Strukturen manifestieren, wird im Harn das im wesentlichen intakte Molekül nachgewiesen.Even with diseases that are secondary to one Manifest damage to the glomerular structures, becomes the essentially intact molecule in the urine proven.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Körperflüssigkeit eine Blutflüssigkeit, insbesondere Serum. Die Untersuchung von Serum, gegebenenfalls parallel zur Harnuntersuchung, dient vor allem zur Diagnose von generalisierten Gefäßschädigungen mit glomerulärer Beteiligung. Weiters dient die Bestimmung von MGS 160/170 zur Diagnose von überwiegend vaskulären Transplantatabstoßungen, bei denen MGS 160/170 im Serum der betroffenen Personen nachgewiesen werden kann.In a further embodiment of the invention, the Body fluid is a blood fluid, in particular Serum. Examination of serum, if necessary parallel to the urinalysis, mainly used for Diagnosis of generalized vascular damage with glomerular involvement. The provision also serves of MGS 160/170 for the diagnosis of predominantly vascular Graft rejection in which MGS 160/170 in serum of the data subjects can be proven.

Die parallele Bestimmung von MGS 160/170 im Harn und Serum, gegebenenfalls unter Einsatz von Antikörpern, die verschiedene bzw. verschieden große MGS 160/170-Fragmente erkennen, bietet die Möglichkeit, die bei bestimmten Erkrankungen erhaltenen Werte für MGS 160/170 bzw. Fragmente davon im Serum und Harn in Beziehung zueinander zu setzen. Die erhaltenen Muster können als Vorlage für eine differenzierte Diagnose von Nieren- und Gefäßerkrankungen herangezogen werden. The parallel determination of MGS 160/170 in urine and Serum, if necessary using antibodies, the different or different sized MGS 160/170 fragments recognize, offers the opportunity to at values obtained for certain diseases MGS 160/170 or fragments thereof in serum and urine in To relate to each other. The samples received can be used as a template for a differentiated diagnosis of Kidney and vascular diseases.

Mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, mit dem anhand eines verläßlichen glomerulären Marker-Moleküls Erkrankungen mit primärer oder sekundärer glomerulärer Beteiligung spezifisch erfaßt werden können.The present invention provides a method provided with the help of a reliable glomerular marker molecule diseases with primary or secondary glomerular involvement specific can be detected.

Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, gegen MGS 160/170, zum Nachweis von MGS 160/170 oder Fragmenten davon in Körperflüssigkeiten.The invention relates in a further aspect Antibodies, especially monoclonal antibodies, against MGS 160/170, for the detection of MGS 160/170 or Fragments of it in body fluids.

Beispiele für monoklonale Antikörper mit Spezifität für MGS 160/170, die zum Nachweis von MGS 160/170 im Harn und/oder Serum geeignet sind, sind die monoklonalen Antikörper, die von den Hybridomzellinien der Bezeichnung MGS(160/170)1, MGS(160/170)2 und MGS(160/170)3, die am 13. Februar 1992 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter den Hinterlegungsnummern 92 021 323 (MGS(160/170)1), 92 021 324 (MGS(160/170)2) und 92 021 325 (MGS(160/170)3) hinterlegt wurden, produziert werden.Examples of monoclonal antibodies with specificity for MGS 160/170, which is used to detect MGS 160/170 in urine and / or serum are suitable are the monoclonal Antibodies derived from the hybridoma cell lines of the Designation MGS (160/170) 1, MGS (160/170) 2 and MGS (160/170) 3, on February 13, 1992 at the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) among the Accession numbers 92 021 323 (MGS (160/170) 1), 92 021 324 (MGS (160/170) 2) and 92 021 325 (MGS (160/170) 3) were produced.

Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die Verwendung von anti-MGS 160/170-Antikörpern in Immunoassays zur quantitativen Bestimmung von MGS 160/170, sowie von Fragmenten davon zur weiteren Differenzierung des Ursprungs von MGS 160/170. Dieser Anwendung liegt die Überlegung zugrunde, daß MGS 160/170 im Harn entweder vom Endothel oder von den glomerulären Epithelzelloberflächen oder aus beiden Quellen stammen könnte. Die Größe der im Harn auftretenden Molekülfragmente von MGS 160/170 stellt einen Parameter dar, der es ermöglicht, hinsichtlich der Herkunft von MGS 160/170(fragmenten) zu differenzieren. Ausschließlich vom Endothel stammendes MGS 160/170 muß das Nierenfilter passiert haben, welches unter normalen Bedingungen Moleküle passieren läßt, die kleiner sind als Albumin, größeren Molekülen jedoch den Durchtritt verwehrt: MGS 160/170, das ausschließlich endothelialen Ursprungs ist, sollte somit in Form kleinerer Fragmente (< 50 kD) im Harn auftreten. Abgesehen davon ist aufgrund des endothelialen Ursprungs von MGS 160/170 zu erwarten, daß es auch im Serum des Patienten nachweisbar ist.In a further aspect, the invention relates to Use of anti-MGS 160/170 antibodies in Immunoassays for the quantitative determination of MGS 160/170, and fragments thereof for further Differentiation of the origin of MGS 160/170. This Application is based on the consideration that MGS 160/170 in urine from either the endothelium or the glomerular epithelial cell surfaces or both Sources could come from. The size of the urine occurring molecular fragments of MGS 160/170 represents a parameter that makes it possible with regard to the origin of MGS 160/170 (fragments) differentiate. Exclusively from the endothelium MGS 160/170 must have passed the kidney filter, which molecules pass under normal conditions leaves that are smaller than albumin, larger molecules however, denied entry: MGS 160/170, the is of endothelial origin only, should thus in the form of smaller fragments (<50 kD) in the urine occur. Apart from that, due to the endothelial origin of MGS 160/170 expected that it can also be detected in the patient's serum.

Andererseits ist zu erwarten, daß MGS 160/170, das im Zuge einer Nierenerkrankung von glomerulären Epithelzellen abgestoßen wurde, als im wesentlichen intaktes Molekül, das lediglich um den für die Zellmembranverankerung verantwortlichen Teil verkürzt ist, im Harn auftritt. In diesem Fall sollten im allgemeinen keine meßbaren Konzentrationen von MGS 160/170 im Serum der betroffenen Patienten nachweisbar sein. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde dies für Patienten mit primär glomerulären Erkrankungen (fokale Sklerose, epimembranöse Glomerulonephritis, floride IgA-Nephritis) bestätigt. Bei Patienten mit diesen primär glomerulären Erkrankungen wurden ausschließlich große Fragmente von MGS 160/170, die weit über der Nierengängigkeit liegen, im Harn gefunden. Die betroffenen Patienten wiesen auch keine meßbaren MGS 160/170-Konzentrationen im Serum auf.On the other hand, it can be expected that MGS 160/170, which in In the course of kidney disease from glomerular Epithelial cells were rejected as essentially intact molecule that is only around that for the Shortened part responsible for cell membrane anchoring is in the urine. In this case generally no measurable concentrations of MGS 160/170 in the serum of the affected patients be detectable. Within the scope of the present invention this was for patients with primarily glomerular Diseases (focal sclerosis, epimembranous Glomerulonephritis, florid IgA nephritis) confirmed. In patients with these primarily glomerular Diseases were only large fragments of MGS 160/170, which are far above kidney mobility, found in the urine. The affected patients also indicated no measurable MGS 160/170 concentrations in the serum on.

Eine Methode zur Bestimmung der Größe der Bruchstücke von MGS 160/170 im Harn oder auch im Serum besteht darin, Proben des zu untersuchenden Harns oder Serums in Puffer, vorzugsweise SDS-Puffer, aufzunehmen, elektrophoretisch aufzutrennen, auf Nitrozellulose zu transferieren und mit Hilfe von Anti-MGS 160/170-Antikörpern im Western Blot zu lokalisieren. Die Größe der Moleküle wird mit Hilfe von Molekularstandards von Proteinen bekannter Größe kalibriert, wodurch eine exakte Bestimmung des Molekulargewichts der MGS 160/170-Fragmente möglich ist.A method of determining the size of the fragments of MGS 160/170 in urine or serum in samples of the urine or serum to be examined in buffers, preferably SDS buffers, to separate electrophoretically, towards nitrocellulose transfer and with the help of anti-MGS 160/170 antibodies localize in the Western blot. The size of the molecules is determined using molecular standards from Proteins of known size calibrated, resulting in a exact determination of the molecular weight of the MGS 160/170 fragments is possible.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper konnten MGS 160/170-Fragmente sowohl im Serum als auch im Harn nachgewiesen werden, und zwar außer bei nierentransplantierten Patienten in Patienten, die unter dem Churg-Strauss-Weber Syndrom und unter Wegener′scher Granulomatose litten.With the help of the monoclonal antibodies according to the invention could MGS 160/170 fragments both in serum and are detected in the urine, with the exception of kidney transplant patients in patients who under the Churg-Strauss-Weber syndrome and under Wegener's granulomatosis suffered.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung anwendbaren Immunoassays zum Nachweis von MGS 160/170-(Fragmenten) beruhen auf Standardmethoden, die dem Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet geläufig sind und von denen ein großes Angebot zur Verfügung steht; stellvertretend für die umfangreiche Literatur auf diesem Gebiet wird auf die Übersichten von Schuurs und Van Weemen, 1977, und von Oellerich, 1984, verwiesen.Those applicable in the context of the present invention Immunoassays for the detection of MGS 160 / 170- (fragments) are based on standard methods, which the expert on the relevant area are familiar and of which one wide range is available; representative of the extensive literature in this area is based on the reviews by Schuurs and Van Weemen, 1977, and von Oellerich, 1984.

Diese Methoden basieren auf der Bildung eines Komplexes zwischen der zu bestimmenden antigenen Substanz und einem oder mehreren Antikörpern. Einer oder mehrere der Komplexpartner ist dabei markiert, so daß das Antigen nachgewiesen und/oder quantitativ bestimmt werden kann. Die Markierung kann z. B. in Form eines gekoppelten Enzyms, Radioisotops, Metallchelats, oder einer fluoreszierenden, chemilumineszierenden oder biolumineszierenden Substanz vorliegen.These methods are based on the formation of a complex between the antigenic substance to be determined and one or more antibodies. One or more of the Complex partner is marked so that the antigen can be demonstrated and / or determined quantitatively. The marking can e.g. B. in the form of a coupled Enzyme, radioisotope, metal chelate, or one fluorescent, chemiluminescent or bioluminescent substance.

Im Falle eines kompetitiven Immunoassays konkurriert das Antigen in der zu analysierenden Probe mit einer bekannten Menge von markiertem Antigen um die Bindung an die Antikörper-Bindungsstellen. Die Menge von markiertem Antigen, gebunden an den Antikörper, ist daher verkehrt proportional zur Antigenmenge in der Probe.In the case of a competitive immunoassay competes the antigen in the sample to be analyzed with a known amount of labeled antigen around binding to the antibody binding sites. The amount of labeled antigen bound to the antibody therefore it is proportional to the amount of antigen in the Sample.

Bei Tests, in denen markierte Antikörper verwendet werden, ist die Menge an markiertem, gebundenem Antikörper direkt proportional zur Menge an Antigen.In tests where labeled antibodies are used is the amount of labeled, bound Antibodies directly proportional to the amount of antigen.

Assays, die auf der Bildung eines Antikörper-Antigen- Komplexes basieren, wobei zwei Antikörper eingesetzt werden, die einander bei der Bindung an das Antigen nicht behindern, werden als "Sandwich"-Immunoassays bezeichnet.Assays based on the formation of an antibody-antigen Complex based, using two antibodies be mutually exclusive in binding to the antigen do not hinder, are called "sandwich" immunoassays designated.

Da monoklonale Antikörper in unbegrenzter Menge in konstanter Qualität verfügbar sind, weisen Immunoassays unter Verwendung monoklonaler Antikörper aufgrund ihrer konstanten Qualität und Reproduzierbarkeit gegenüber Assays, die sich polyklonaler Antikörper bedienen, Vorteile auf. Es werden daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt monoklonale Antikörper als Beschichtungs- und markierte Antikörper eingesetzt, wobei jedoch der Beschichtungsantikörper oder der markierte Antikörper gegebenenfalls durch polyklonale Antikörper ersetzt werden kann.Since monoclonal antibodies in unlimited quantities immunoassays exhibit constant quality using monoclonal antibodies due to their constant quality and reproducibility Assays using polyclonal antibodies Advantages on. It is therefore within the scope of present invention prefers monoclonal antibodies used as coating and labeled antibodies, however, the coating antibody or labeled antibodies if necessary by polyclonal Antibodies can be replaced.

Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in einem Sandwich-Immunoassay, insbesondere in einem Sandwich-ELISA verwendet. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind in Sandwich-Immunoassays als Beschichtungs- und Markierungs-gekoppelte Antikörper einsetzbar.The monoclonal according to the invention are preferred Antibodies in a sandwich immunoassay, in particular used in a sandwich ELISA. The monoclonal antibodies according to the invention are in Sandwich immunoassays as coating and Label-coupled antibodies can be used.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Immunoassay-Kits, insbesondere Sandwich- Immunoassay-Kits, die monoklonale Antikörper gegen MGS 160/170 enthalten. In another aspect, the present concerns Invention immunoassay kits, especially sandwich Immunoassay kits that use monoclonal antibodies against MGS 160/170 included.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Sandwich-Immunoassay-Kit, vorzugsweise ein Sandwich- ELISA-Kit, in dem eine Kombination von mgs(160/170)1 und mgs(160/170)2 den Beschichtungsantikörper und eine Kombination von mgs(160/170)1 und mgs(160/170)3 den markierten, vorzugsweise enzymgekoppelten Antikörper darstellt.One embodiment of the present invention is a Sandwich immunoassay kit, preferably a sandwich ELISA kit in which a combination of mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 2 the coating antibody and one Combination of mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 3 den labeled, preferably enzyme-linked antibodies represents.

In den im Rahmen der erfindungsgemäß durchgeführten Versuchen hat sich in den Lagen (Beschichtungs- bzw. Markierungslage) ein Verhältnis der Antikörper von 1 : 1 als geeignet erwiesen; das Verhältnis der Antikörper innerhalb der Kombinationen ist jedoch nicht kritisch.In those carried out in accordance with the invention Attempts have been made in the layers (coating or Marking position) a ratio of the antibodies of 1: 1 proven suitable; the ratio of antibodies within the combinations, however, is not critical.

In den im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Versuche wurde als MGS 160/170-Standard ein Extrakt aus humanen Glomerula verwendet. Für den klinischen Routineeinsatz wird als Standard, d. h. als MGS 160/170-Präparation mit definiertem Gehalt an MGS 160/170, zweckmäßigerweise reines MGS 160/170, das vorzugsweise mittels rekombinanter Methoden hergestellt wird, eingesetzt. Rekombinantes MGS 160/170 kann hergestellt werden, indem z. B. mit Hilfe von monoklonalen anti-MGS 160/170-Antikörpern Expressions- Libraries auf Expression von MGS 160/170 gescreent werden und die positiven Klone mittels molekularbiologischen Standardmethoden kloniert und die für MGS 160/170 kodierende DNA zur Expression gebracht wird. Der Standard kann als Lyophilisat oder als Lösung vorliegen.In the context of the present invention Attempts have been made as MGS 160/170 standard an extract from human glomerula is used. For the clinical routine use is standard, i.e. H. when MGS 160/170 preparation with a defined content of MGS 160/170, suitably pure MGS 160/170, the preferably produced by recombinant methods is used. Recombinant MGS 160/170 can are made by z. B. with the help of anti-MGS 160/170 monoclonal antibody expression Libraries screened for expression from MGS 160/170 and the positive clones using standard molecular biological methods cloned and the DNA coding for MGS 160/170 brought to expression becomes. The standard can be used as a lyophilisate or as a solution available.

Ein bevorzugter Sandwich-ELISA-Kit zur Bestimmung von humanem MGS 160/170 in Körperflüssigkeiten enthält als voneinander getrennte Einheiten eine oder mehrere handelsübliche ELISA-Platten; eine Kombination der Antikörper mgs(160/170)1 und mgs(160/170)2 (gegebenenfalls sind die ELISA-Platten mit diesen Antikörpern vorbeschichtet); eine Kombination der Antikörper mgs(160/170)1 und mgs(160/170)3, die mit einem Enzym konjugiert sind (z. B. Meerrettichperoxidase), das mit einem geeigneten Substrat ein meßbares Reaktionsprodukt liefert, z. B. ein mittels ELISA-Photometer kolorimetrisch erfaßbares Produkt; das für die Enzymreaktion erforderliche Substrat; ein oder mehrere Verdünnungspuffer für die Antikörper; gegebenenfalls einen oder mehrere Waschpuffer; einen Standard, enthaltend eine definierte Menge an humanem MGS 160/170, vorzugsweise rekombinantes MGS 160/170 als Lyophilisat oder als Lösung.A preferred sandwich ELISA kit for the determination of contains human MGS 160/170 in body fluids as separate units one or more commercially available ELISA plates; a combination of the Antibodies mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 2 (If necessary, the ELISA plates are with these Pre-coated antibodies); a combination of the Antibodies mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 3 with are conjugated to an enzyme (e.g. Horseradish peroxidase) with a suitable Substrate provides a measurable reaction product, e.g. B. a colorimetric using an ELISA photometer detectable product; that for the enzyme reaction required substrate; one or more Dilution buffer for the antibodies; possibly one or more wash buffers; a standard, containing a defined amount of human MGS 160/170, preferably recombinant MGS 160/170 as Lyophilisate or as a solution.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Assays konnte MGS 160/170 im Harn und im Serum von Patienten mit glomerulären Schädigungen bzw. von nierentransplantierten Patienten nachgewiesen werden.With the help of the assay according to the invention MGS 160/170 in the urine and serum of patients with glomerular damage or from kidney transplant patients can be detected.

Weitere Antikörper bzw. Antikörperkombinationen, die sich aufgrund ihrer Fähigkeit, mit MGS 160/170 Antigen/Antikörper-Komplexe zu bilden, für die Verwendung in Immunoassays eignen, können z. B. mit Hilfe von Kompetitionsassays ermittelt werden.More antibodies or antibody combinations that because of their ability to work with MGS 160/170 Form antigen / antibody complexes for which Suitable for use in immunoassays, z. B. with Be determined with the help of competition assays.

Antikörper, die sich zum Nachweis kleinerer Bruchstücke von MGS 160/170, wie sie im Harn von Patienten mit generalisierten Gefäßschäden auftreten, eignen, können erhalten werden, indem z. B. Mäuse mit Antigenen aus Harn, Serum, Blutgefäßextrakten oder glomerulären Lysaten von normalen Personen oder von Personen mit einschlägigen Erkrankungen immunisiert werden und die erhaltenen Antikörper daraufhin untersucht werden, ob und welche MGS 160/170-Fragmente sie erkennen. Antibodies that are used to detect smaller fragments of MGS 160/170, as found in the urine of patients with generalized vascular damage can occur can be obtained by z. B. mice with antigens Urine, serum, blood vessel extracts or glomerular Lysates from normal people or from people with relevant diseases are immunized and the Antibodies obtained are examined to determine whether and which MGS 160/170 fragments they recognize.

Figure overview

Fig. 1 Lokalisation von MGS 160/170 in humanen Nierenglomerula. A: Lokalisation in den peripheren Glomerulumschlingen (Vergrößerung: 600 ×). B: Lokalisation in den glomerulären Epithelzellen (Vergrößerung: 1400 ×). Fig. 1 localization of MGS 160/170 in human renal glomerula. A: Localization in the peripheral glomerular loops (magnification: 600 ×). B: Localization in the glomerular epithelial cells (magnification: 1400 ×).

Fig. 2 Lokalisation von MGS 160/170 in humaner Plazenta. Fig. 2 Localization of MGS 160/170 in human placenta.

Fig. 3 Charakterisierung der monoklonalen Antikörper im Screeningtest an Lysaten isolierter humaner Glomerula. Fig. 3 Characterization of the monoclonal antibody in the screening test on lysates of isolated human glomeruli.

Fig. 4 Nachweis von MGS 160/170 in humaner Plazenta mittels Immunoblot. Fig. 4 Detection of MGS 160/170 in human placenta by means of immunoblot.

Fig. 5 Bestimmung von MGS 160/170 im Harn von nierentransplantierten Patienten. Fig. 5 Determination of MGS 160/170 in the urine of kidney transplant patients.

Fig. 6 Immunhistochemische Lokalisation von MGS 160/170 mittels monoklonalem Antikörper mgs(160/170)1. A: ohne Natriumperjodat- Vorbehandlung. B: mit Natriumperjodat- Vorbehandlung. Fig. 6 Immunohistochemical localization of MGS 160/170 by means of monoclonal antibodies mgs (160/170). 1 A: Without sodium periodate pretreatment. B: with sodium periodate pretreatment.

Fig. 7 Immunhistochemische Lokalisation von MGS 160/170 mittels monoklonalem Antikörper mgs(160/170)2. Fig. 7 Immunohistochemical localization of MGS 160/170 by means of monoclonal antibodies mgs (160/170) of 2.

Fig. 8 Immunhistochemische Lokalisation von MGS 160/170 mittels monoklonalem Antikörper mgs(160/170)3. A: ohne Natriumperjodat- Vorbehandlung. B: mit Natriumperjodat- Vorbehandlung. Fig. 8 Immunohistochemical localization of MGS 160/170 by means of monoclonal antibodies mgs (160/170) of 3. A: Without sodium periodate pretreatment. B: with sodium periodate pretreatment.

Fig. 9 Immunelektronenmikroskopische Lokalisation von MGS 160/170 mittels monoklonalem Antikörper mgs(160/170)2. FIG. 9 Localization of MGS 160/170 by means of monoclonal antibody mgs (160/170) 2 by means of immunoelectron microscopy.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert:The invention is illustrated by the following examples explains:

example 1 Preparation of human MGS 160/170

Generell wurde die von Kerjaschki et al., 1986, publizierte Methodik angewandt. Insgesamt wurden 8 Nieren, die wegen hypernephroiden Nierenkarzinoms exstirpiert worden waren, direkt aus dem urologischen Operationssaal verarbeitet: Die Nierenrinde wurde mit Rasierklingen von der Medulla disseziert, in kleine Gewebsbröckchen zerschnitten und in flüssigem Stickstoff eingefroren und gelagert. Das gesamte Material wurde in insgesamt 5 Batches aufgetaut, die Glomerula durch Durchpressen des Nierenrindenparenchyms durch Metallsiebe unterschiedlicher Porenweite (Kerjaschki et al., 1986) bis etwa 80-90% Reinheit angereichert. Die derart isolierten Glomerula wurden in SDS-Sample-Puffer (7.5% SDS, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 mM Dithiothreitol) durch 5 min Kochen aufgelöst, die unlöslichen Bestandteile in einer Micro- Zentrifuge (10 000 g für 15 min) abzentrifugiert und der Überstand bis zur weiteren Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert. Für die präparative SDS-Gel- Elektrophorese wurden 5-10%ige Gradientengele verwendet. Die glomerulären Lysate wurden nach der Stickstofflagerung nochmals für 1 min aufgekocht und sodann in einer Konzentration von etwa 100 µg Protein pro Slot auf 3 mm dicke SDS-Gele in einem Laemmli- Puffer-System (Laemmli, 1970) geladen. 3 mm dicke, 5-10%ige präparative SDS-Gele (nach Laemmli) wurden mit je 200 µg Protein pro Slot beladen, bei 20 mA über Nacht laufen gelassen, ein Teil des Gels mit 50% Methanol, 7% Essigsäure und 0.2% Coomassie-Blau R gefärbt und mit 25% Methanol ohne Essigsäure entfärbt und in dieser Form gelagert. Ein kleiner Streifen des Gels jeweils von der Mitte und von beiden Rändern wurde zur Lokalisation der MGS 160/170-Bande in einem Towbin- Transfer-Puffer-System (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol, pH 8.3) auf Nitrozellulose transferiert, mit radioaktiv markiertem WGA-Lectin inkubiert (Kerjaschki et al., 1984) und autoradiographiert. Nach einer exakten Markierung der WGA-aufnehmenden Banden bei 160 und 170 kD wurde das Röntgenbild mit den präparativen SDS-Gelen überlagert und die Banden in korrespondierender Position ausgeschnitten.Generally, that of Kerjaschki et al., 1986, published methodology applied. Overall, were 8 kidneys due to hypernephroid kidney cancer had been extirpated, straight from the urological Operating room processed: The kidney cortex was with Razor blades dissected from the medulla, into small ones Tissue pieces cut up and in liquid Frozen and stored nitrogen. The entire Material was thawed in a total of 5 batches Glomerula by pressing through the renal cortex parenchyma through metal sieves of different pore sizes (Kerjaschki et al., 1986) to about 80-90% purity enriched. The glomerules isolated in this way were described in SDS sample buffer (7.5% SDS, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 mM dithiothreitol) by boiling for 5 min dissolved the insoluble components in a micro Centrifuged (10,000 g for 15 min) and the supernatant until further use in liquid Nitrogen stored. For the preparative SDS gel Electrophoresis was 5-10% gradient gels used. The glomerular lysates were after the Nitrogen storage boiled again for 1 min and then in a concentration of about 100 µg protein per slot on 3 mm thick SDS gels in a Laemmli Buffer system (Laemmli, 1970) loaded. 3 mm thick, 5-10% preparative SDS gels (according to Laemmli) were used loaded with 200 µg protein per slot, at 20 mA above Run at night, part of the gel at 50% Methanol, 7% acetic acid and 0.2% Coomassie Blue R colored and decolorized with 25% methanol without acetic acid and stored in this form. A small strip of the Gels were from the center and from both edges to localize the MGS 160/170 band in a Towbin Transfer buffer system (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol, pH 8.3) transferred to nitrocellulose, incubated with radiolabelled WGA lectin (Kerjaschki et al., 1984) and autoradiographed. To an exact marking of the WGA-receiving bands at 160 and 170 kD, the X-ray image with the preparative SDS gels overlaid and the bands in corresponding position cut out.

Die derartig exzidierten WGA-bindenden Banden, die dem humanen MGS 160/170-Molekül entsprechen, wurden in Tris-Puffer (100 mM pH 7.4) neutralisiert, nach kurzer Inkubation im gleichen Puffer mit 0.1%igem SDS eine Stunde inkubiert und dann in einer Bio-Rad-Kammer elektroeluiert. Das gesammelte, leicht blau gefärbte Eluat wurde danach auf einer PDG-6 Bio-Rad-Säule (Dimensionen 50 × 0.8 cm) entsalzt und der Puffer gegen 0.1%ige wäßrige SDS-Lösung ausgetauscht. Die blau erscheinenden Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert und in dieser Form gelagert, bis etwa 200 µg des eluierten Proteins vorhanden waren.The excised WGA-binding bands that the human MGS 160/170 molecule have been described in Tris buffer (100 mM pH 7.4) neutralized after a short time Incubate in the same buffer with 0.1% SDS one Incubated for one hour and then in a Bio-Rad chamber electroeluted. The collected, slightly blue colored Eluate was then on a PDG-6 Bio-Rad column (Dimensions 50 × 0.8 cm) desalted and the buffer against 0.1% aqueous SDS solution exchanged. The blue appearing fractions were collected and lyophilized and stored in this form until about 200 µg of the eluted protein were present.

Das SDS-haltige lyophilisierte Proteinpulver nach der Elektroelution wurde in 10 ml 90%igem Aceton, 10% HCl bei -20°C über Nacht aufgenommen, wobei das Protein präzipierte und das SDS weitgehend ausgelöst wurde. Das präzipierte Protein wurde durch Zentrifugation gesammelt und in einem Stickstoffstrom getrocknet. Danach wurde das Pellet in 1 ml steriler PBS aufgenommen und zu gleichen Teilen mit komplettem Adjuvans emulgiert. The SDS-containing lyophilized protein powder after the Electroelution was carried out in 10 ml of 90% acetone, 10% HCl taken at -20 ° C overnight, taking the protein precipitated and the SDS was largely triggered. The precipitated protein by centrifugation collected and dried in a stream of nitrogen. The pellet was then placed in 1 ml of sterile PBS recorded and in equal parts with complete Adjuvant emulsified.

Example 2 Production of monoclonal antibodies against human MGS 160/170 a) Immunization

Es wurden 2 Mäuse (Balb-c, 4 Wochen alt, 20 g schwer, weiblich) mit dem gereinigten Antigen nach folgendem Schema immunisiert:Two mice (Balb-c, 4 weeks old, weighing 20 g, female) with the purified antigen according to the following Immunized scheme:

1. Immunisierung:
30 µg gereinigtes Antigen pro Maus in komplettem Freund′schem Adjuvans, subcutan.
2. Immunisierung:
30 µg gereinigtes Antigen pro Maus in inkomplettem Freund′schem Adjuvans, subcutan, 3 Wochen nach der 1. Immunisierung.
3. Immunisierung:
30 µg gereinigtes Antigen pro Maus in inkomplettem Freund′schem Adjuvans, 1/2 subcutan, 1/2 intramuskulär, 4 Wochen nach der 2. Immunisierung.
4. Immunisierung:
30 µg gereinigtes Antigen pro Maus in inkomplettem Freund′schem Adjuvans, subcutan, 1/3 intravenös, 2/3 intraperitoneal (Maus Nr. 1: 4 Wochen nach 3. Immunisierung, 3 Tage vor Fusion; Maus Nr. 2: 10 Wochen nach 3. Immunisierung, 3 Tage vor Fusion). Während dieser Zeit wurde im Abstand von jeweils 3 Wochen aus Blut aus der Schwanzvene Serum gewonnen, das in der indirekten Immunfluoreszenz an unfixierten Kryostatschnitten menschlicher Nieren (s. Beispiel 3) ausgetestet und auch zum Blotten auf SDS-glomerulären Lysaten humaner Nieren verwendet wurde.1. Immunization:
30 µg of purified antigen per mouse in complete Freund's adjuvant, subcutaneously.
2. Immunization:
30 µg of purified antigen per mouse in incomplete Freund's adjuvant, subcutaneously, 3 weeks after the first immunization.
3. Immunization:
30 µg of purified antigen per mouse in incomplete Freund's adjuvant, 1/2 subcutaneously, 1/2 intramuscularly, 4 weeks after the second immunization.
4. Immunization:
30 µg purified antigen per mouse in incomplete Freund's adjuvant, subcutaneously, 1/3 intravenously, 2/3 intraperitoneally (mouse No. 1: 4 weeks after the 3rd immunization, 3 days before fusion; mouse No. 2: 10 weeks after 3. Immunization, 3 days before fusion). During this time, blood was extracted from the tail vein at intervals of 3 weeks, which was tested in indirect immunofluorescence on unfixed cryostat sections of human kidneys (see Example 3) and also used for blotting on SDS-glomerular lysates of human kidneys.

b) Fusion

Die Zellfusion wurde durchgeführt, nachdem die Tiere einen Immunfluoreszenz-Titer von 1 : 6.400 bzw. 1 : 3.000 im Serum erreicht hatten. Zur Herstellung von Hybridomen wurde im wesentlichen die Methode von Köhler und Milstein, 1975, verwendet.Cell fusion was carried out after the animals an immunofluorescence titer of 1: 6,400 or 1: 3,000 in the serum. For production of Hybridoma became essentially the Köhler method and Milstein, 1975.

Die Milz der Maus wurde am vierten Tag nach der letzten Immunisierung steril entnommen, mechanisch zerkleinert und mit serumfreien Kulturmedium (RPMI 1640, Gibco, USA) gewaschen. Die Milzzellen wurden unter Zusatz von 50%igem 4000GK Polyäthylenglykol (Merck) in 75 mM HEPES mit X63 A8653-Myelomzellen (Verhältnis Milz- zu Myelomzellen 1 : 10) fusioniert. Die Zellmischung wurde bei 100 g 6 min lang zentrifugiert. Das Medium wurde vorsichtig mit 20 ml RPMI-Kulturmedium bei 37°C verdünnt und das Zellpellet in selektivem HAT-Medium (HATKonc von Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 1 097 130; RPMI 1640, komplettiert mit 100 U/ml Natrium-Penicillin G, 100 U/ml Streptomycin und 10% FCS - mit 10^-4 M Hypoxanthin, 4×10^-7 M Aminopterin und 1.6×10^-5 M Thymidin) resuspendiert. Aliquots der Zellsuspension wurden auf 16 96-well Mikrotiterplatten à 100 µl verteilt. Nach etwa zweiwöchigem Anwachsen der Zellen im HAT-Medium wurden die Überstände sämtlicher gelb verfärbter Vertiefungen in einem ELISA-System auf die Produktion von Maus IgG geprüft. Dafür wurden Mikrotiterplatten verwendet, die mit Schaf-anti-Maus IgG als stabiler Phase überzogen waren. Die Kulturüberstände wurden aufgetragen, und nach Inkubation und Waschen mit einem Kaninchen-anti-Maus- Peroxidase-Konjugat entwickelt.The mouse spleen was removed sterile on the fourth day after the last immunization, mechanically comminuted and washed with serum-free culture medium (RPMI 1640, Gibco, USA). The spleen cells were fused with X63 A8653 myeloma cells (ratio spleen to myeloma cells 1:10) with the addition of 50% 4000GK polyethylene glycol (Merck) in 75 mM HEPES. The cell mixture was centrifuged at 100 g for 6 min. The medium was carefully diluted with 20 ml of RPMI culture medium at 37 ° C. and the cell pellet in selective HAT medium (HATKonc from Boehringer Mannheim, Catalog No. 1 097 130; RPMI 1640, completed with 100 U / ml sodium penicillin G, 100 U / ml streptomycin and 10% FCS - with 10 ^-4 M hypoxanthine, 4 × 10 ^-7 M aminopterin and 1.6 × 10 ^-5 M thymidine) resuspended. Aliquots of the cell suspension were distributed on 16 96-well 100 µl microtiter plates. After the cells had grown in the HAT medium for about two weeks, the supernatants of all the yellow-colored wells were checked in an ELISA system for the production of mouse IgG. For this purpose, microtiter plates were used which were coated with sheep anti-mouse IgG as a stable phase. The culture supernatants were applied and developed after incubation and washing with a rabbit anti-mouse peroxidase conjugate.

c) Screening of the hybridoma culture supernatants

Für die indirekte Immunofluoreszenz wurden Anteile einer Nierenrinde eines humanen Operationspräparates in flüssigem Stickstoff eingefroren, in einem Kryostat wurden 4 µm dicke unfixierte Schnitte hergestellt, die mit den Kulturüberständen der Hybridome inkubiert wurden. Alternativ wurden Cryostatschnitte einer unfixierten humanen Placenta verwendet. Darauf erfolgte eine Inkubation mit Fluorescein-markiertem Schaf-anti- Maus IgG, und Auswertung in einem Fluoreszenzmikroskop (Fig. 1 und 2, siehe Beispiel 3).For indirect immunofluorescence, parts of the renal cortex of a human surgical preparation were frozen in liquid nitrogen, and 4 μm thick unfixed sections were made in a cryostat, which were incubated with the culture supernatants of the hybridomas. Alternatively, cryostat sections of an unfixed human placenta were used. This was followed by incubation with fluorescein-labeled sheep anti-mouse IgG and evaluation in a fluorescence microscope ( FIGS. 1 and 2, see Example 3).

Für die Austestung mittels Immunoblot wurden humane Glomerula isoliert, in SDS-Buffer aufgelöst, die Proteine elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Danach wurden dünne Nitrozellulosestreifen zuerst in den Überständen inkubiert, danach mit Schaf-anti-Maus-Alkalische- Phosphatase Konjugat (Promega) inkubiert, und mit einem kommerziellen Chromogen (Kierkegaard and Perry) nach Vorschrift des Herstellers entwickelt (Fig. 3, siehe auch Beispiel 3).For testing by immunoblot, human glomerules were isolated, dissolved in SDS buffer, the proteins separated electrophoretically and transferred to nitrocellulose. Thereafter, thin strips of nitrocellulose were first incubated in the supernatants, then incubated with sheep-anti-mouse-alkaline-phosphatase conjugate (Promega), and developed with a commercial chromogen (Kierkegaard and Perry) according to the manufacturer's instructions ( FIG. 3, see also example) 3).

Sofern nicht anders angegeben, wurden für alle ELISA-Versuche die folgenden Puffer verwendet:
Beschichtungspuffer: Carbonat-Bicarbonat Puffer, pH 9.6
Waschpuffer: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7.4 mit 0.05% Tween 20
Blocking-Solution: PBS mit 2.5% Rinderserumalbumin (BSA)
Substratlösung: O-Phenylen-Diamin (Fluka, 40 mg in 100 ml Citratpuffer, pH 6.0)
Stopp-Lösung: 8 N Schwefelsäure
96 well-Mikrotiterplatten: Immunoplate/Maxisorb, Nunc, Dänemark)
MicroELISA: Zum Beschichten der Platten wurden 100 µl Kaninchen-anti-Maus IgG pro Vertiefung (5 µg/ml) verwendet. Inkubation: 3 h bei Raumtemperatur. Die Platten wurden 5 × mit Waschpuffer gewaschen und 1 h lang mit 200 µl/Vertiefung Blocking-Solution blockiert. Nach neuerlichem Waschen wurden die Vertiefungen mit 50 µl Zellüberstand 1 h bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit 100 µl eines Peroxidase gekoppelten Kaninchenantikörpers gegen Maus- Immunglobuline (Jackxell, Rabbit anti-MouseIgG(H+L), Verdünnung 1 : 4000 in PBS) 1 h lang bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten wurden 100 µl Substratlösung in die Vertiefungen hinzugefügt und nach 5 min die Reaktion mit 50 µl Stopp-Lösung gestoppt. Die Absorption der Lösung wurde in einem Dynatech-ELISA- Reader bei einer Wellenlänge von 492 nm (Referenzfilter: 630 nm) gemessen. Die positiven Überstände wurden danach in der indirekten Immunfluoreszenz an humanen Nierenschnitten einerseits und an Immunblots von glomerulären Lysaten (siehe oben) andererseits ausgetestet. Nur jene Hybridome, die sowohl in der Immunfluoreszenz als auch in der Immunoblot-Methode positiv waren (insgesamt 4), wurden weiter verfolgt. Sie wurden in neue 96-Well Platten auseinandergesetzt und, wie oben beschrieben, auf Antikörperproduktion getestet.Unless otherwise stated, the following buffers were used for all ELISA tests:
Coating buffer: carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6
Wash buffer: Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 with 0.05% Tween 20
Blocking solution: PBS with 2.5% bovine serum albumin (BSA)
Substrate solution: O-phenylene diamine (Fluka, 40 mg in 100 ml citrate buffer, pH 6.0)
Stop solution: 8 N sulfuric acid
96-well microtiter plates: Immunoplate / Maxisorb, Nunc, Denmark)
MicroELISA: 100 µl rabbit anti-mouse IgG per well (5 µg / ml) was used to coat the plates. Incubation: 3 h at room temperature. The plates were washed 5 × with wash buffer and blocked with 200 µl / well of blocking solution for 1 hour. After washing again, the wells were incubated with 50 μl of cell supernatant at 37 ° C. for 1 h. The plates were washed and incubated with 100 .mu.l of a peroxidase-coupled rabbit antibody against mouse immunoglobulins (Jackxell, Rabbit anti-MouseIgG (H + L), dilution 1: 4000 in PBS) for 1 h at 37 ° C. After washing the plates, 100 ul substrate solution were added to the wells and after 5 min the reaction was stopped with 50 ul stop solution. The absorption of the solution was measured in a Dynatech ELISA reader at a wavelength of 492 nm (reference filter: 630 nm). The positive supernatants were then tested in indirect immunofluorescence on human kidney sections on the one hand and on immunoblots of glomerular lysates (see above) on the other hand. Only those hybridomas that were positive in both the immunofluorescence and the immunoblot method (4 in total) were followed up. They were disassembled in new 96-well plates and tested for antibody production as described above.

d) Cloning the hybridomas

Die positiven Kulturen wurden nach der Methode der limitierenden Verdünnung ("limiting dilution") kloniert. Dabei wurde derart verdünnt, daß 100 µl Kulturmedium 1 Zelle enthielten. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatten wurden mit je 100 µl dieser Zellsuspension, gemischt mit Thymuszellen, beschickt. Die Kulturüberstände wurden mittels ELISA und Indirekte Immunfluoreszenz, wie oben beschrieben, getestet. Die positiven Klone (4) der einzelnen Kulturen wurden ein zweites Mal kloniert, aufgezüchtet, getestet und eingefroren oder zur Produktion von Antikörpern in vivo verwendet. Insgesamt konnten vier verschiedene Klone aus der zweiten Zellfusion (Maus Nr. 2) hergestellt werden, die für die weiteren Versuche verwendet wurden. Die Klone wurden mit mgs(160/170)1, mgs(160/170)2, mgs(160/170)3 und mgs(160/170)4 bezeichnet.The positive cultures were cloned using the limiting dilution method. It was diluted such that 100 ul culture medium contained 1 cell. The wells of the microtiter plates were charged with 100 µl of this cell suspension, mixed with thymus cells. The culture supernatants were tested by ELISA and indirect immunofluorescence as described above. The positive clones ( 4 ) of the individual cultures were cloned a second time, grown, tested and frozen or used for the production of antibodies in vivo. A total of four different clones could be produced from the second cell fusion (mouse No. 2), which were used for the further experiments. The clones were named mgs (160/170) 1, mgs (160/170) 2, mgs (160/170) 3 and mgs (160/170) 4.

e) Production of monoclonal antibodies

Die monoklonalen Antikörper wurden in größerer Menge im Aszites von Balb-c-Mäusen, die 10 Tage vorher mit 0.5 ml Pristan (Sigma) vorbehandelt worden waren, produziert. Dabei wurden von den Hybridomkulturen je ca. 10⁷ Zellen intraperitoneal in die Mäuse injiziert. Nach 10 bis ca. 14 Tagen wurde die Aszitesflüssigkeit entnommen und eine Titerbestimmung der Antikörper mittels indirekter Immunfluoreszenz durchgeführt.The monoclonal antibodies were in large quantities in the Ascites from Balb-c mice taken 10 days beforehand 0.5 ml pristan (Sigma) had been pretreated, produced. The hybridoma cultures were each about 10⁷ cells injected intraperitoneally into the mice. After 10 to about 14 days, the ascitic fluid became taken and a titer of the antibodies carried out by means of indirect immunofluorescence.

Weiters wurden sämtliche Zellinien in ein im wesentlichen proteinfreies Medium mit Nutridoma (Boehringer Mannheim) gebracht und die Überstände mit Ammoniumsulfat gefällt. Zur IgG-Fällung wurden die Nutridoma-Zellüberstände mit gleichen Volumina von gesättigtem Ammoniumsulfat gemischt und 1 h bei Zimmertemperatur leicht gerührt. Die Suspension wurde bei 3000 g 10 min lang zentrifugiert und das Pellet wurde in PBS gelöst und 48 h lang gegen PBS dialysiert. Die Proteinkonzentration der Antikörper-Lösung wurde bei 280 nm Absorption gemessen. Die monoklonalen Antikörper wurden mit Natriumazid in einer Endkonzentration von 0.1 M bei 4°C, oder ohne Azid in flüssigem Stickstoff gelagert. Furthermore, all cell lines were merged into one essential protein-free medium with Nutridoma (Boehringer Mannheim) brought and the supernatants with Ammonium sulfate precipitated. For IgG precipitation, the Nutridoma cell supernatants with equal volumes of saturated ammonium sulfate and mixed for 1 h Room temperature slightly stirred. The suspension was Centrifuged at 3000 g for 10 min and the pellet was dissolved in PBS and dialyzed against PBS for 48 hours. The protein concentration of the antibody solution was measured at 280 nm absorption. The monoclonal Antibodies were mixed with sodium azide in a Final concentration of 0.1 M at 4 ° C, or without azide in stored liquid nitrogen.

Example 3 Characterization of the monoclonal antibodies and their Use to establish a sandwich ELISA system a) Indirect immunofluorescence

Zu Screeningzwecken und zur Charakterisierung der monoklonalen Antikörper wurden Gefrierschnitte von normalem humanem Nierengewebe von Hypernephrom-Nieren oder Nierenbiopsien hergestellt. Die Schnitte (4 µm) wurden 10 min bei -20°C in Aceton fixiert und mit 10 µl des Zellüberstandes oder der Aszitesflüssigkeit (verdünnt in PBS) inkubiert. Nach dem Spülen mit PBS wurden sie mit Fluoreszein-Isothiozyanat-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus IgG (FITC, 1 : 100 verdünnt) inkubiert, gewaschen und in einem Leitz- Fluoreszenzmikroskop untersucht. Fig. 1 zeigt die Lokalisation von MGS 160/170 in humanen Nierenglomerula. In A ist die ausschließliche Lokalisation des Antigens in den peripheren Glomerulumschlingen deutlich sichtbar (Vergrößerung 600×). B zeigt die Lokalisation von MGS 160/170 an einem 1/2 µm dicken Gefrierschnitt eines normalen humanen Glomerulums. In diesen hochauflösenden Präparationen wird die Lokalisation von MGS 160/170 bevorzugt an den glomerulären Epithelzellen und deren Fußfortsätzen (Pfeilspitzen) sichtbar. CL: Kapillarlichtung. Vergrößerung 1400×.Frozen sections of normal human kidney tissue from hypernephroma kidneys or kidney biopsies were made for screening purposes and to characterize the monoclonal antibodies. The sections (4 µm) were fixed in acetone at -20 ° C for 10 min and incubated with 10 µl of the cell supernatant or the ascites fluid (diluted in PBS). After rinsing with PBS, they were incubated with fluorescein-isothiocyanate-conjugated rabbit anti-mouse IgG (FITC, diluted 1: 100), washed and examined in a Leitz fluorescence microscope. Fig. 1 shows the localization of MGS 160/170 in human kidney glomerula. In A, the exclusive localization of the antigen in the peripheral glomerular loops is clearly visible (magnification 600 ×). B shows the localization of MGS 160/170 on a 1/2 μm thick frozen section of a normal human glomerule. In these high-resolution preparations, the localization of MGS 160/170 is preferably visible on the glomerular epithelial cells and their foot processes (arrowheads). CL: capillary clearing. Magnification 1400 ×.

Ergänzend zur Immunfluoreszenz an humaner Niere wurden die Antikörper auch an humaner Lunge, Herz, Magen, Duodenum, Nabelschnur und Placenta ausgetestet. Auch an diesen Gewebsschnitten zeigte sich die charakteristische Lokalisation von MGS 160/170 an den Gefäßendothelien. Fig. 2 zeigt die Lokalisation von MGS 160/170 an einem unfixierten Gefrierschnitt von menschlicher Plazenta. Das Antigen befindet sich ausschließlich in relativ hoher Konzentration in den Blutgefäßen und hier wiederum an den Kapillaroberflächen. Eine Kreuzreaktion mit Rattengewebe, insbesondere Rattennieren, wurde durch die indirekte Immunfluoreszenzmethode ausgeschlossen. Die Antikörpertiter der monoklonalen Antikörper anti- mgs(160/170)1-4 (Aszites) fielen in einen Bereich größer 1 : 100 000. Neben den Zellüberständen, Nutridoma, sowie der Ascitesflüssigkeit wurde das durch Ammoniumsulfatfällung aus Nutridoma gewonnene und an Biotin gekoppelte anti-mgs(160/170)1-4 IgG in der Immunfluoreszenz untersucht. Die biotinylierten Antikörper wurden für einen Kompetitionstest zur Epitopbestimmung an Nierenschnitten verwendet. (Die Biotinylierung wurde durchgeführt, wie unter d) angegeben.)In addition to immunofluorescence on human kidneys, the antibodies were also tested on human lungs, heart, stomach, duodenum, umbilical cord and placenta. The characteristic localization of MGS 160/170 on the vascular endothelia was also evident in these tissue sections. Figure 2 shows the location of MGS 160/170 on an unfixed frozen section of human placenta. The antigen is found only in a relatively high concentration in the blood vessels and here again on the capillary surfaces. A cross-reaction with rat tissue, especially rat kidneys, was excluded by the indirect immunofluorescence method. The antibody titers of the monoclonal antibodies anti-mgs (160/170) 1-4 (ascites) fell in a range greater than 1: 100,000. In addition to the cell supernatants, Nutridoma, and the ascites fluid, the anti obtained from ammonium sulfate precipitation from Nutridoma and coupled to biotin -mgs (160/170) 1-4 IgG examined in immunofluorescence. The biotinylated antibodies were used for a competition test for epitope determination on kidney sections. (The biotinylation was carried out as indicated under d).)

b) Western blot

Nitrozellulose-Transfers humaner glomerulärer Proteine (Kerjaschki et al., 1986, siehe auch Beispiel 2c) oder in SDS-Sample Puffer aufgelöste Placentaproteine wurden zuerst 1 h lang mit 2% Trockenmilchpulver in PBS, Tween 20 inkubiert. Die Streifen wurden dann zuerst mit Mausaszites (Verdünnung 1 : 6000), darauf mit Alkalischer-Phosphatase-konjugiertem Kaninchen-anti- Maus IgG (Promega, Verdünnung 1 : 7500) inkubiert und mit Nitroblau-Tetrazolium-Bromchlorindolylphosphat Farbreagens (Kierkegaard and Perry, Verdünnung 1 : 1 : 20) entwickelt.Nitrocellulose transfers of human glomerular proteins (Kerjaschki et al., 1986, see also Example 2c) or placenta proteins were dissolved in SDS sample buffer first for 1 hour with 2% dry milk powder in PBS, Tween 20 incubated. The strips were then first with Mouse ascites (dilution 1: 6000), with Alkaline Phosphatase Conjugated Rabbit Anti Mouse IgG (Promega, dilution 1: 7500) and incubated with nitro blue tetrazolium bromochloroindolyl phosphate Color reagent (Kierkegaard and Perry, dilution 1: 1: 20) developed.

Alle monoklonalen Antikörper erkannten eine Doppelbande mit 160/170 kD Molekulargewicht. Fig. 3 zeigt die Charakterisierung der monoklonalen Antikörper im Screeningtest an Lysaten von isolierten humanen Glomerula. Jeder einzelne Streifen repräsentiert einen separaten monoklonalen Antikörperüberstand. Die mit MGS 1 bis MGS 4 bezeichneten Antikörper zeigen, wie die Überstände von zahlreichen anderen Klonen auch, Spezifität für eine Doppelbande bei 160/170 kD. Fig. 4 zeigt den Nachweis von MGS 160/170 in humaner Plazenta mittels Immunoblot mit den monoklonalen Antikörpern mgs(160/170)1 (A) und mgs(160/170)2 (B). C ist eine Kontrolle, in welcher der erste Antikörper ausgelassen wurde. Sowohl in A und B zeigt sich, daß die monoklonalen Antikörper ausschließlich die Doppelbande von einem Molekulargewicht von 160/170 kD erkennen. Humane Plazenta ist somit ein zweites verläßliches, in großen Mengen zu erhaltendes humanes Gewebe, in welchem MGS 160/170 enthalten ist.All monoclonal antibodies recognized a double band with a 160/170 kD molecular weight. Fig. 3 shows the characterization of the monoclonal antibodies in the screening test on lysates of isolated human glomeruli. Each individual strip represents a separate monoclonal antibody supernatant. The antibodies labeled MGS 1 to MGS 4, like the supernatants of numerous other clones, show specificity for a double band at 160/170 kD. Fig. 4 shows the detection of MGS 160/170 in human placenta by immunoblot with the monoclonal antibodies mgs (160/170) 1 (A) and mgs (160/170) 2 (B). C is a control in which the first antibody was omitted. Both A and B show that the monoclonal antibodies recognize only the double band with a molecular weight of 160/170 kD. Human placenta is thus a second reliable human tissue that can be obtained in large quantities and contains MGS 160/170.

c) Determination of the antibody subclass

Die Subklasse der monoklonalen Antikörper wurde mit der Ouchterlony Immundiffusion in 1% Agarose/PBS mit den konzentrierten Überständen und Subklassen-spezifischen Antisera (Sigma) durchgeführt.The subclass of monoclonal antibodies was identified with the Ouchterlony immunodiffusion in 1% agarose / PBS with the concentrated supernatants and subclass-specific Antisera (Sigma) performed.

Die monoklonalen Antikörper mgs( 160/170)1, mgs(160/170)2 und mgs(160/170)4 gehören zur Subklasse der IgG1, mgs(160/170)3 zur Subklasse IgG2.The monoclonal antibodies mgs (160/170) 1, mgs (160/170) 2 and mgs (160/170) 4 belong to the subclass the IgG1, mgs (160/170) 3 to the IgG2 subclass.

d) Determination of the epitope specificity

Zur Bestimmung der Epitope, die von den Antikörpern erkannt werden, wurden die vier Antikörper biotinyliert und mittels indirekter Immunfluoreszenz und ELISA charakterisiert. Die Biotinylierung der 4 verschiedenen monoklonalen Antikörper erfolgte an N-OH- Succinimidobiotin (Fa. Sigma). Dazu wurden 10 mg des Biotins in 10 ml Dimethylformamid aufgelöst und 100 ml der Lösung pro 1 mg IgG (dialysiert gegen 100 mM NaHCO₃, pH 8.0) mit dem Antikörper gemischt. Die Antikörper-Biotin-Suspension inkubierte 2 h unter Lichtschutz bei Raumtemperatur und wurde dann gegen 100 mM NaHCO₃, anschließend gegen PBS dialysiert.To determine the epitopes generated by the antibodies are recognized, the four antibodies were biotinylated and by means of indirect immunofluorescence and ELISA characterized. The biotinylation of the 4 different monoclonal antibody was carried out on N-OH Succinimidobiotin (Sigma). 10 mg of the Biotins dissolved in 10 ml of dimethylformamide and 100 ml of the solution per 1 mg IgG (dialyzed against 100 mM NaHCO₃, pH 8.0) mixed with the antibody. The Antibody-biotin suspension was incubated for 2 h Sun protection at room temperature and was then against 100 mM NaHCO₃, then dialyzed against PBS.

i) Immunofluorescence

Die Kompetition der biotinylierten mit den nicht markierten Antikörpern erfolgte an Gefrierschnitten normaler humaner Niere. Die Schnitte wurden zuerst mit unmarkiertem Streptavidin (Verdünnung 1 : 100) inkubiert, um freies Biotin abzublocken, und wurden dann mit jeweils einzelnen unmarkierten monoklonalen Antikörpern inkubiert (Aszites 1 : 100). Nach dem Spülen mit PBS wurden die Schnitte mit den verschiedenen biotinylierten Antikörpern inkubiert (1 : 50). Nach neuerlichem Spülen wurden die Schnitte mit Fluoreszin-Isothiozyanat-konjugiertem Avidin (Verdünnung 1 : 100) inkubiert, gewaschen und in einem Leitz Fluoreszenzmikroskop untersucht. Diese Untersuchung ergab, daß jeder der vier monoklonalen Antikörper sich selbst inhibiert, mgs(160/170)1 und mgs(160/170)4 inhibieren einander gegenseitig, erkennen also möglicherweise dasselbe Epitop. Da es in der Fluoreszenz selten zu einer vollständigen Inhibition kommt und für mgs(160/170)2 die Inhibition durch sich selbst und durch die anderen Antikörper unvollständig war, konnte für diesen Antikörper keine definitive Aussage gemacht werden.The competition of the biotinylated with the unlabelled antibodies Frozen sections of normal human kidney. The cuts were first treated with unlabelled streptavidin (dilution 1: 100) to block free biotin, and were then unmarked with individual monoclonal antibodies incubated (ascites 1: 100). After rinsing with PBS, the cuts were made with the various biotinylated antibodies (1:50). After rinsing again, the cuts were made with Fluoresin-isothiocyanate-conjugated avidin (Dilution 1: 100) incubated, washed and in one Leitz examines fluorescence microscope. These Examination revealed that each of the four monoclonal Antibody inhibits itself, mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 4 mutually inhibit each other, recognize so possibly the same epitope. Since it is in the Fluorescence rarely leads to complete inhibition comes and for mgs (160/170) 2 the inhibition by itself itself and incomplete due to the other antibodies was unable to find a definitive one for this antibody Statement to be made.

ii) ELISA

Der Versuch im ELISA wurde zunächst analog zur Immunfluoreszenz durchgeführt. 96-well- Mikrotiterplatten wurden mit geringen Antigenmengen beschichtet (Tween 20 Glomerulumlysat 1 : 200 verdünnt) und mit den einzelnen monoklonalen Antikörpern (Aszites 1 : 100) inkubiert. Nach dem Waschen der Platten wurden diese mit den einzelnen biotinylierten Antikörpern inkubiert. Das Ergebnis deckte sich mit dem Ergebnis der Immunfluoreszenz: mgs( 160/170)1 und mgs(160/170)4 erkennen offenbar dieselben oder überlappende Stellen des Antigens, mgs(160/170)2 wird durch die anderen Antikörper nur sehr schwach inhibiert, mgs(160/170)3 erkennt ein von den anderen verschiedenes Epitop.The experiment in the ELISA was initially analogous performed for immunofluorescence. 96-well Microtiter plates were made with small amounts of antigen coated (Tween 20 glomerular lysate diluted 1: 200) and with the individual monoclonal antibodies (Ascites 1: 100) incubated. After washing the plates these were biotinylated with the individual Antibodies incubated. The result coincided with the Result of immunofluorescence: mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 4 apparently recognize the same or overlapping sites of the antigen, mgs (160/170) 2 becomes very weak due to the other antibodies inhibited, mgs (160/170) 3 recognizes one of the others different epitope.

Es ergab sich somit, daß von den vier monoklonalen Antikörpern drei verschiedene Epitope erkannt werden. mgs(160/170)1, mgs(160/170)2 und mgs(160/170)3 eigneten sich, wenn sie einzeln verwendet wurden, besser für das Beschichten der Platten und als Detektionssystem als mgs(160/170)4. Wird mgs(160/170)4 sowohl als Beschichtungsantikörper als auch als markierter Antikörper verwendet, wurden deutlich niedrigere Extinktionen als bei derselben Versuchsanordnung mit den anderen Antikörpern erhalten. Es konnte gezeigt werden, daß mgs(160/170)4 auch bei Kombination mit anderen Antikörpern zu schwächeren Ergebnissen führt. Diese Beobachtungen stehen in Einklang mit den Ergebnissen der Kompetitionstests, nach denen mgs(160/170)4 dasselbe Epitop zu erkennen scheint wie mgs(160/170)1 und vermutlich insgesamt an weniger Antigenstellen bindet.It was found that of the four monoclonal Antibodies three different epitopes can be recognized. mgs (160/170) 1, mgs (160/170) 2 and mgs (160/170) 3 were suitable when used individually, better for that Coating the plates and as a detection system mgs (160/170) 4. Will mgs (160/170) 4 both as Coating antibodies as well as labeled Antibodies used were significantly lower Extinctions than in the same experimental set-up the other antibodies. It could be shown be that mgs (160/170) 4 even when combined with other antibodies lead to weaker results. These observations are in line with the Results of the competition tests, according to which mgs (160/170) 4 seems to recognize the same epitope as mgs (160/170) 1 and probably less overall Antigen sites bind.

Example 4 a) Development of an enzyme linked immunosorbent Assay (sandwich ELISA) for the detection of human MGS 160/170 in the urine

Der Assay wurde als sog. "zweistufiger" Assay entwickelt. Dabei handelt es sich um eine Methode, in der an die Inkubation der Probe ein Waschschritt angeschlossen und die Inkubation mit dem Antikörper- Enzymkonjugat getrennt durchgeführt wird. (Diese Methode hat den Vorteil, daß mögliche Störfaktoren für die Immunreaktion, wie z. B. der niedrige pH-Wert einiger Proben (der pH-Wert der Harnproben liegt zwischen 6.0 und 7.5), minimiert werden können. Im Fall der Anwendung einer "einstufigen" Methode könnten sich diese Faktoren negativ auf die Immunreaktion des Peroxidase-Konjugats auswirken.)
In Vorversuchen zur Optimierung des ELISA wurde die Konzentration des Beschichtungsantikörpers variiert, ebenso die Inkubationszeit für die Immunreaktion. Zweier- und Mehrfachkombinationen der Antikörper führten zu unterschiedlich starken Signalen im ELISA:The assay was developed as a so-called "two-step" assay. This is a method in which a washing step is connected to the incubation of the sample and the incubation with the antibody-enzyme conjugate is carried out separately. (This method has the advantage that potential interference factors for the immune reaction, such as the low pH of some samples (the pH of the urine samples is between 6.0 and 7.5), can be minimized. one-step "method, these factors could negatively affect the immune response of the peroxidase conjugate.)
In preliminary experiments to optimize the ELISA, the concentration of the coating antibody was varied, as was the incubation time for the immune response. Two and multiple combinations of the antibodies led to differently strong signals in the ELISA:

Es zeigte sich, daß die Kombination aus mgs(160/170)1, mgs(160/170)2 und mgs(160/170)3 sowohl als Festphasenantikörpersystem (Beschichtung) als auch als Detektionssystem zu höheren Extinktionen als einzelne Antikörper oder Kombinationen von zwei Antikörpern führte, wobei sogar stärkere Signale als mit polyklonalem Kaninchenantikörper bei geringerem Hintergrund erhalten wurden. Für die weitere Entwicklung wurde eine Testanordnung gewählt, in der paarweise zwei Antikörper zum Beschichten der Platte und zwei als Peroxidase-gekoppelte Antikörper verwendet werden. Es konnten dadurch bei niedrigem Hintergrund ausreichend hohe Extinktionen erzielt werden. Das Signal konnte im Vergleich zu dem bei Testanordnungen mit nur einem Antikörper in einem der zwei Lagen deutlich verstärkt werden. Für die paarweise Anordnung wurden die drei Antikörper mgs(160/170)1, mgs(160/170)2 und mgs(160/170)3 verwendet. Der Antikörper mgs(160/170)1 wird zweimal, einerseits als Beschichtungs-, andererseits auch als markierter Antikörper eingesetzt (in verschiedenen Versuchsanordnungen konnte gezeigt werden, daß mgs(160/170)1 eine hohe Avidität besitzt). Die Wahl der Antikörper in dieser Kombination führte zu den besten Ergebnissen.It was shown that the combination of mgs (160/170) 1, mgs (160/170) 2 and mgs (160/170) 3 both as Solid phase antibody system (coating) as well Detection system for higher extinctions than single ones Antibodies or combinations of two antibodies led, with even stronger signals than with polyclonal rabbit antibody with less Background were obtained. For the further A test set was chosen in the development two antibodies in pairs to coat the plate and two used as peroxidase-coupled antibodies become. It was possible with a low background sufficiently high extinctions can be achieved. The Signal could be compared to that in test arrangements with only one antibody in one of the two layers be significantly strengthened. For arrangement in pairs the three antibodies mgs (160/170) 1, mgs (160/170) 2 and mgs (160/170) 3 used. The antibody mgs (160/170) 1 is used twice, on the one hand as Coating, on the other hand as a marked Antibodies used (in different Experimental arrangements could be shown that mgs (160/170) 1 has a high avidity). The choice of Antibodies in this combination led to the best Results.

Aus Versuchen zeigte sich, daß Beschichtungs- und markierte Antikörperpaare auch für die jeweils andere Lage verwendet werden können. Aufgrund der Ergebnisse, daß mgs(160/170)1 und mgs(160/170)4 offenbar gleiche Stellen des Antigens erkennen, eignen sich die beiden Antikörper allein nicht für einen Assay. Es stellte sich jedoch heraus, daß mgs(160/170)4 zusammen mit mgs( 160/170)3 als Beschichtungsantikörper in Kombination mit dem Antikörper-Paar mgs(160/170)1/mgs(160/170)2 als markierte Antikörper zu guten Ergebnissen führt. Da diese Variante jedoch insgesamt schwächere Resultate lieferte, wurde die Variante, in der das Paar mgs(160/170)1/mgs(160/170)3 als markierte Antikörper und das Paar mgs( 160/170)1/mgs( 160/170)2 als Beschichtungsantikörper eingesetzt werden, für die weiteren Versuche verwendet.Experiments have shown that coating and labeled antibody pairs also for the other Location can be used. Based on the results, that mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 4 appear to be the same Recognize places of the antigen, the two are suitable Antibodies alone are not for an assay. It posed However, it turns out that mgs (160/170) 4 together with mgs (160/170) 3 as coating antibody in Combination with the antibody pair mgs (160/170) 1 / mgs (160/170) 2 as labeled antibodies good results. Since this variant, however delivered weaker results overall, the Variant in which the pair mgs (160/170) 1 / mgs (160/170) 3 as labeled antibodies and the pair mgs (160/170) 1 / mgs (160/170) 2 as coating antibodies are used for the further experiments.

In Vorversuchen wurde die Konzentration des Beschichtungsantikörpers von 1 : 500 bis zu 1 : 32 000 variiert, ebenso die Inkubationszeit für die Immunreaktion von 1/2 bis 3 h. Die besten Ergebnisse konnten bei einer Verdünnung der Beschichtungsantikörper zwischen 1 : 2000 und 1 : 4000 erzielt werden. Für die Dauer der Immunreaktion bewährte sich jeweils 1 Stunde, die Verlängerung der Inkubationszeit führte zu keiner entscheidenden Verbesserung der Resultate. (Verdünnung des Konjugates um 2 Verdünnungsstufen auf 1 : 800 statt 1 : 200, dafür Entwicklungszeit 20 statt 5 min.)
Das Verhältnis der Antikörper zueinander in den Lagen (Beschichtung und Detektion) betrug jeweils 1 : 1.In preliminary experiments, the concentration of the coating antibody was varied from 1: 500 to 1: 32,000, as was the incubation time for the immune reaction from 1/2 to 3 hours. The best results were achieved when the coating antibodies were diluted between 1: 2000 and 1: 4000. For the duration of the immune reaction, 1 hour proved itself, the prolongation of the incubation time did not lead to a decisive improvement in the results. (Dilution of the conjugate by 2 dilution levels to 1: 800 instead of 1: 200, but development time 20 instead of 5 min.)
The ratio of the antibodies to each other in the layers (coating and detection) was 1: 1 in each case.

Der optimierte Assay für die Bestimmung von humanem MGS 160/170 im Harn wurde wie folgt durchgeführt:The optimized assay for the determination of human MGS 160/170 in the urine was carried out as follows:

96-well-Mikrotiterplatten wurden mit einer Kombination der beiden monoklonalen Antikörper mgs(160/170)1 und mgs(160/170)2 in einer Verdünnung von 1 : 3.000 in Beschichtungspuffer beschichtet (über Nacht bei 4°C; 100 µl/Vertiefung). Die Platten wurden 5 mal gewaschen und die verbleibenden Bindungsstellen mit 200 µl Blocking-Solution 1 h lang bei Raumtemperatur blockiert. Nach einem weiteren Waschzyklus wurden die einzelnen Standards in die Vertiefungen der vertikalen Reihen 1 und 2 pipettiert. Als Standardlösung wurde ein Detergensextrakt aus humanen Glomerula (Tween 20) hergestellt. Zur Ermittlung der Standardkurve wurden 8 Standardverdünnungen herangezogen. Die Konzentrationsunterschiede der einzelnen Standards liegen im Bereich von 2.5 µl des konzentrierten Glomerulumextraktes (Standard 1 = 0.5, Standard 2 = 1, Standard 3 = 2.5, Standard 4 = 5, Standard 5 = 7.5, Standard 6 = 10, Standard 7 = 12.5, Standard 8 = 15 µl des Glomerulumextraktes auf 100 µl PBS). Für jeden Standard wurde eine externe Vorverdünnung vorbereitet und das Volumen von je 100 µl direkt in die beiden Vertiefungen pipettiert (Doppelbestimmung). In die übrigen Vertiefungen (für Leerwert, Negativkontrolle und Harnproben; jeweils Doppelbestimmung) wurden gleiche Volumina von 100 µl gefüllt. Die Harnproben wurden unverdünnt im ELISA ausgetestet. Die Inkubationszeit für die Proben betrug 1 h bei 37°C. Nach 5maligem Waschen der Platten wurden die Vertiefungen mit jeweils 100 µl der Peroxidase gekoppelten Antikörper mgs( 160/170)1 und mgs( 160/170)3 1 h lang bei 37°C inkubiert. (Die Kopplung der Antikörper erfolgte mit Meerrettich-Peroxidase (Boehringer Mannheim) und wurde nach der von Wilson und Nakane (1978) beschriebenen Methode durchgeführt. Die Platten wurden daraufhin 5× gewaschen, Substratlösung hinzugefügt (200 µl/Vertiefung) und die Reaktion nach 4 min mit 100 µ1 Stopp-Lösung (1M H₂SO₄) gestoppt. Die Absorption der Proben wurde durch einen ELISA-Reader (Dynatech) bei einer Wellenlänge von 492 nm (Referenz 630 nm) bestimmt. Die MGS 160/170-Konzentration der Proben wurden anhand der Standardkurve berechnet. Sie erlaubt eine quantitative Bestimmung von MGS 160/170 im Harn in einem Konzentrationsbereich zwischen 0.5 und 15 Einheiten. 1 µl des Glomerulumextraktes wurde als eine MGS 160/170-Einheit definiert. Zeigte eine Probe die gleiche Extinktion, die man für den Standard 8 (15 µl Detergensextrakt) fand, betrug somit die Konzentration 15 MGS 160/170-Einheiten. Die Angabe in MGS 160/170-Einheiten ermöglicht die Aussage über den relativen MGS 160/170-Gehalt der Proben; die Einheiten können auf reines MGS 160/170 umgerechnet werden.96-well microtiter plates were made with a combination of the two monoclonal antibodies mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 2 in a dilution of 1: 3,000 in Coating buffer coated (overnight at 4 ° C; 100 µl / well). The plates were washed 5 times and the remaining binding sites with 200 µl Blocking solution for 1 hour at room temperature blocked. After a further wash cycle, the individual standards in the recesses of the vertical Pipettes rows 1 and 2. The standard solution was a Detergent extract from human glomerula (Tween 20) manufactured. To determine the standard curve 8 standard dilutions were used. The Differences in concentration of the individual standards are in the range of 2.5 µl of the concentrated Glomerular extract (standard 1 = 0.5, standard 2 = 1, Standard 3 = 2.5, Standard 4 = 5, Standard 5 = 7.5, Standard 6 = 10, standard 7 = 12.5, standard 8 = 15 µl of the glomerular extract to 100 µl PBS). For each An external pre-dilution was prepared as standard and the volume of 100 µl directly into the two Pipettes wells (double determination). In the other wells (for blank value, negative control and urine samples; double determination) equal volumes of 100 µl filled. The urine samples were tested undiluted in the ELISA. The Incubation time for the samples was 1 h at 37 ° C. After washing the plates 5 times, the Wells with 100 µl peroxidase each coupled antibodies mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 3 Incubated for 1 h at 37 ° C. (The coupling of the Antibody was made with horseradish peroxidase (Boehringer Mannheim) and was based on that of Wilson and Nakane (1978) performed the method described. The Plates were then washed 5 ×, substrate solution added (200 µl / well) and the reaction after 4 min with 100 µ1 stop solution (1M H₂SO₄) stopped. The Absorbance of the samples was assessed by an ELISA reader (Dynatech) at a wavelength of 492 nm (reference 630 nm). The MGS 160/170 concentration of the Samples were calculated using the standard curve. she allows a quantitative determination of MGS 160/170 in Urine in a concentration range between 0.5 and 15 units. 1 µl of the glomerular extract was used as defined an MGS 160/170 unit. Showed a sample the same absorbance as for the standard 8 (15 µl detergent extract) was found to be Concentration 15 MGS 160/170 units. The specification in MGS 160/170 units enables the statement about the relative MGS 160/170 content of the samples; the units can be converted to pure MGS 160/170.

Die Genauigkeit des Harn-Assays wurde überprüft, indem zwei Harnproben mit 6 bzw. 12 MGS 160/170-Einheiten in verschiedenen Tests analysiert wurden. Die Intra-Assay- Variationskoeffizienten betrugen 6.29 bzw. 6.3%; die Inter-Assay-Variationskoeffizienten betrugen 13.97 bzw. 6.57. Die Linearität der Standardkurven wurde bestimmt, indem die Verdünnungsreihen des Glomerulumextraktes (Konzentrationen zwischen 0.5 und 15 µl=Einheiten) untersucht und die lineare Regression der experimentell bestimmten Werte gegenüber den erwarteten Werten berechnet wurde. Die Korrelationskoeffizienten für die Kurve lagen in allen Tests zwischen 0.97 und 0.99. The accuracy of the urine assay was checked by two urine samples with 6 and 12 MGS 160/170 units in various tests were analyzed. The intra-assay Variation coefficients were 6.29 and 6.3%, respectively; the Inter-assay variation coefficients were 13.97 and 6.57. The linearity of the standard curves was determined by taking the dilution series of the glomerular extract (Concentrations between 0.5 and 15 µl = units) examined and the linear regression of the experimental certain values compared to the expected values was calculated. The correlation coefficients for the The curve was between 0.97 and 0.99 in all tests.

Die Wiederfindung des MGS 160/170-Standards (Tween 20-Glomerulumextraktes) wurde untersucht, indem dem Harn von 3 gesunden Normalpersonen der Kontrollgruppe der Extrakt in zwei verschiedenen Konzentrationen (10 bzw. 15 µl) zugesetzt wurde. Da die Harne der Normalpersonen nur ganz minimale Extinktionen (0.001-0.08) aufweisen, die geringfügig über dem Leerwert liegen, wurde ein Durchschnittsleerwert vor der Berechnung der Wiederfindung von den Extinktionen abgezogen. Die durchschnittliche Wiederfindung wurde mit 85% (Bereich 52-104%) berechnet.The recovery of the MGS 160/170 standard (Tween 20 glomerular extract) was examined by the urine of 3 healthy normal people Control the extract in two different ways Concentrations (10 or 15 µl) were added. Since the Normal people's urine has very minimal extinctions (0.001-0.08) that are slightly above the There was an average blank value the calculation of the recovery from the extinctions deducted. The average recovery was calculated with 85% (range 52-104%).

b) Testing of the monoclonal antibody PHM5 his ability to MGS 160/170 or fragments thereof to prove

Im gleichen Ansatz wurde der monoklonale Antikörper PHM5 (Hancock und Atkins, 1983) auf seine Einsatzfähigkeit in einem ELISA-Testsystem geprüft. Zu diesem Zweck wurden steigende Konzentrationen von 5 µg/ml bis 10 mg/ml als stabile Phase auf Mikrotiterplatten aufgetragen und danach ein ELISA-Assay, genau wie unter a) beschrieben, aufgesetzt. Mit keinem der Antikörper und in keiner Konzentration des Standards konnte nachgewiesen werden, daß der immobilisierte monoklonale Antikörper PHM5 in der Lage ist, MGS 160/170 aus der Standardlösung zu binden. Die Experimente wurden von der Standardlösung (glomeruläres Lysat) auch auf MGS 160/170-haltige Harne ausgetestet, die vorher mit dem unter a) beschriebenen Testsystem bestätigt worden waren. Auch in diesem Fall zeigte sich, daß PHM5 nicht in der Lage ist, MGS zu binden. Dies deutet darauf hin, daß PHM5 gegen ein Epitop von MGS 160/170 gerichtet ist, welches in den Fragmenten, die im Harn auftreten, nicht repräsentiert ist. In the same approach, the monoclonal antibody PHM5 (Hancock and Atkins, 1983) on his Usability tested in an ELISA test system. For this purpose, increasing concentrations of 5 µg / ml to 10 mg / ml as a stable phase Applied microtiter plates and then an ELISA assay, set up exactly as described under a). With none of the antibodies and no concentration of the It could be demonstrated that the immobilized monoclonal antibodies capable of PHM5 is to bind MGS 160/170 from the standard solution. The experiments were from the standard solution (glomerular lysate) also on MGS 160/170 containing urine tested, previously with that described under a) Test system had been confirmed. In this case, too showed that PHM5 is unable to MGS tie. This suggests that PHM5 is against one Epitope directed by MGS 160/170, which in the Fragments that occur in the urine are not represented is.

Es wurde auch die Fähigkeit von PHM5 geprüft, auf über immobilisierte monoklonale Antikörper gereinigtes MGS 160/170 als zweiter Detektionsantikörper zu fungieren. Auch hier wurde gefunden, daß bei keiner Konzentration eine meßbare Bindung von PHM5 an das immobilisierte MGS 160/170 aus den Standardlösungen bzw. den Fragmenten aus MGS 160/170-positiven Harnen zustande kam.The ability of PHM5 was also tested on over immobilized monoclonal antibody purified MGS 160/170 as a second detection antibody act. Here too it was found that none Concentration a measurable binding of PHM5 to the immobilized MGS 160/170 from the standard solutions or the fragments from MGS 160/170 positive urine came about.

Daraus kann geschlossen werden, daß der monoklonale Antikörper PHM5 nicht in der Lage ist, MGS 160/170 zu erkennen und sich somit nicht für einen Einsatz in einem ELISA-Assay eignet.From this it can be concluded that the monoclonal Antibody PHM5 is unable to MGS 160/170 recognize and therefore not for use in an ELISA assay.

Example 5 Development of an enzyme linked immunosorbent assay (Sandwich ELISA) for the detection of MGS 160/170 in serum

Für die quantitative Bestimmung von MGS 160/170 im Humanserum wurden Vorversuche zur Optimierung der Versuchsbedingungen durchgeführt. Es wurde gefunden, daß der für den Nachweis von MGS 160/170 im Harn entwickelte Test auch für den Nachweis dieses Moleküls im Serum zufriedenstellende Resultate ergibt.For the quantitative determination of MGS 160/170 in Human serum were preliminary trials to optimize the Test conditions carried out. It was found, that the for the detection of MGS 160/170 in the urine developed test also for the detection of this molecule gives satisfactory results in serum.

Um den Einfluß der Serumproteine auf die Spezifität und Sensitivität des Serum-ELISA zu klären, wurden Standardverdünnugsreihen in unterschiedlichen Medien angefertigt. Dabei wurden jeweils gleiche Standardmengen (hergestellt von glomerulären Lysaten, wie oben in Beispiel 4 beschrieben) in PBS, oder in PBS mit 7% BSA, oder in Serum von klinisch gesunden Probanden aufgelöst. Es zeigte sich, daß die Extinktionen der Standards in 7% BSA in allen Konzentrationen durchwegs um 35% höher lagen als die des Standards in PBS, hingegen betrugen die Extinktionen nur etwa 50% der im Verdünnungsmedium PBS erreichten Werte, wenn Serum zur Verdünnung benutzt wurde (d. h. die Wiederfindung betrug durchschnittlich 50%).To the influence of the serum proteins on the specificity and The sensitivity of the serum ELISA was clarified Standard dilution series in different media prepared. They were the same Standard amounts (made from glomerular lysates, as described above in Example 4) in PBS, or in PBS with 7% BSA, or in serum from clinically healthy Subjects dissolved. It turned out that the Absorbance of the standards in 7% BSA in all Concentrations were consistently 35% higher than that of the standard in PBS, whereas the were Absorbances only about 50% of that in the PBS dilution medium achieved when using serum for dilution (i.e. recovery was average 50%).

Zur Beurteilung der Anwendbarkeit des Tests wurden 42 Serumproben von 38 gesunden Personen auf deren Gehalt an MGS 160/170 untersucht. Die Proben von 35 gesunden Probanden enthielten keine meßbaren Mengen des Antigens. Dagegen enthielten die Sera von drei Personen MGS 160/170 in relativ hoher Konzentration (5-15 "Harn-Einheiten"/100 ml Serum). Diese Personen hatten zum Zeitpunkt der Blutabnahme einen grippalen Infekt (2×) bzw. eine inzipiente Borelliose (1×).To assess the applicability of the test 42 serum samples from 38 healthy people on their MGS 160/170 content examined. The samples from 35 healthy volunteers contained no measurable amounts of the antigen. In contrast, the sera contained three People MGS 160/170 in relatively high concentration (5-15 "urine units" / 100 ml serum). These people had a flu at the time the blood was drawn Infectious (2 ×) or incipient borelli (1 ×).

Zusammenfassend ergab sich aus den Vorversuchen, daß die Ergebnisse gut reproduzierbar und die Intra- bzw. Interassayvarianz gering waren. Daher wurde für die Bestimmung von MGS 160/170 im Serum die Testanordnung zur Bestimmung im Harn übernommen.In summary, the preliminary experiments showed that the results are reproducible and the intra- or Interassay variance were low. Therefore, for the Determination of MGS 160/170 in serum the test arrangement taken for determination in the urine.

Example 6 Determination of MGS 160/170 as a diagnostic parameter a) Determination of MGS 160/170 in the urine of Normal people

Es wurden Harnproben von 20 Normalpersonen mit Hilfe des in Beispiel 4 beschriebenen Harn-Sandwich-ELISAs untersucht. Die Extinktionen lagen in einem vernachlässigbar niedrigen Bereich zwischen 0.05 und 0.10, so daß angenommen werden konnte, daß MGS 160/170 bei gesunden Normalpersonen im Harn nicht vorkommt. (Für die Untersuchung der Harnproben von Nierenpatienten variierten die MGS 160/170-Mengen zwischen 0 und 30 MGS 160/170-Einheiten.)
Bei der Auswertung der Testergebnisse wurde das Schwergewicht auf die im ELISA stark positiven (< 5 MGS 160/170-Einheiten) Patienten gelegt, weil diese Gruppe im Hinblick auf die klinische Fragestellung am relevantesten schien.Urine samples from 20 normal persons were examined using the urine sandwich ELISA described in Example 4. The extinctions were in a negligibly low range between 0.05 and 0.10, so that it could be assumed that MGS 160/170 does not occur in healthy normal persons in the urine. (For the examination of urine samples from kidney patients, the MGS 160/170 quantities varied between 0 and 30 MGS 160/170 units.)
When evaluating the test results, the focus was placed on the patients who were very positive in the ELISA (<5 MGS 160/170 units) because this group seemed the most relevant with regard to the clinical question.

b) Determination of MGS 160/170 in urine and in serum of kidney transplanted patients

Bei einem Teil der Patienten wurden im Western Blot MGS 160/170-Fragmente von relativ hohem Molekulargewicht (ca. 150 kD, bestimmt mittels SDS-PAGE bzw. Immunoblotting) nachgewiesen, wobei diese Patienten negative Serumwerte zeigten. In der zweiten Patientengruppe wurde sowohl im Serum als auch im Harn MGS 160/170 nachgewiesen, außerdem wurden im Harn Fragmente von MGS 160/170 (um 70 kD, bestimmt mittels Immunoblotting) nachgewiesen.Some of the patients were Western blotted MGS 160/170 fragments of relatively high Molecular weight (approx. 150 kD, determined using SDS-PAGE or immunoblotting), whereby this Patients showed negative serum values. In the second Patient group was in both serum and urine MGS 160/170 detected, also were in the urine Fragments of MGS 160/170 (around 70 kD, determined by means of Immunoblotting) detected.

Alle untersuchten Patienten wurden einer Nierenbiopsie unterworfen, mit deren Hilfe aufgrund des histologischen Bildes eine Abstoßungsepisode eindeutig erkennbar ist. Bei Feststellung einer Abstoßungsepisode erfolgte eine Behandlung mit Corticoiden, die im allgemeinen zu einem Abklingen der Transplantatabstoßung führt (die Angabe der Behandlungszeitpunkte bezieht sich auf die Meßzeitpunkte der MGS 160/170-Konzentration). Während der Beobachtungsperiode wurden parallel zu MGS 160/170 (bestimmt mittels ELISA, wie in Beispiel 4 beschrieben) die Kreatinin-Werte bestimmt, deren Ansteigen im Serum eine Abstoßungsepisode anzeigt. Der Verlauf der Beobachtungsperiode ist in Fig. 5A bis 5D dargestellt (die Kreatininwerte sind in mg/dl angegeben; der Gehalt an MGS 160/170 in MGS 160/170-Einheiten, dividiert durch 5).All examined patients were subjected to a kidney biopsy, with the help of which a rejection episode is clearly recognizable on the basis of the histological picture. If a rejection episode was found, treatment with corticoids followed, which generally leads to a decrease in the transplant rejection (the treatment times given relate to the measurement times of the MGS 160/170 concentration). During the observation period, the creatinine values were determined in parallel to MGS 160/170 (determined by means of ELISA as described in Example 4), the increase in serum of which indicates a rejection episode. The course of the observation period is shown in FIGS. 5A to 5D (the creatinine values are given in mg / dl; the MGS 160/170 content in MGS 160/170 units divided by 5).

A: Patient 1, 67 years old, kidney transplant 5 years ago. 6 urine samples were examined in the period shown, at the point in time shown in the figure (open squares) 6-methylprednisolone (Urbason, Hoechst) was administered. It was found that the 3rd sample, which was examined for MGS 160/170, contained no MGS 160/170 after cortisone therapy and the 6th sample had a significantly lower MGS 160/170 content with normal creatinine value. At time 5 , the patient's serum was also tested for MGS 160/170; the result was negative. No infection occurred during the observation period. The molecular weight determination showed only high molecular weight MGS 160/170.
B: Patient 2, 55 years old, kidney transplant three months and one week ago. Eight urine samples were examined in the period shown, and Urbason was administered at the times indicated in the figure (open squares). There were four graft faults and one cytomegalovirus infection in the patient; antiviral therapy was therefore carried out at the times marked with filled squares. A biopsy of the graft kidney performed one day after the first measurement showed acute vascular graft rejection. It was found that the MGS 160/170 concentration increased as the kidney function deteriorated and the creatinine levels increased. The values dropped after cortisone therapy and after antiviral therapy. At time 4 , a serum ELISA was also carried out, which gave a content of MGS 160/170 corresponding to 6.0 ELISA units. The molecular weight determination showed only high molecular weight MGS 160/170.
C: Patient 3, 38 years old, kidney transplant almost three years ago. It was in period shown 5 urine samples examined to the labeled with open squares in the figure Urbason was administered at times. The samples were during the rejection reactions (increased Creatinine values) in the ELISA clearly MGS 160/170 positive. No viral occurred during the observation period or bacterial infection.
D: Patient 4, 41 years old, kidney transplant 14 months ago. 7 urine samples were examined in the time period shown, at the times indicated by open squares in the figure, Urbason was administered. Samples 1 and 2 , with which increased creatinine values correlated, were positive in the ELISA, the third sample with less elevated creatinine values was also positive in the ELISA. From this point on immunosuppressive therapy was given by adding Imurek (azathioprine sodium, Wellcome) and prednisolone (Chemie Linz) to cyclosporin A, a drop in creatinine values and negative results in the ELISA were then observed. At time 3 , a content of MGS 160/170 corresponding to 1.3 ELISA units was detected in the serum ELISA. The molecular weight determination showed not only high molecular weight MGS 160/170 but also fragments with a molecular weight of approx. 70 kD.

c) Determination of MGS 160/170 in urine and in serum from non-transplanted kidney patients

In diesem Beispiel wurden insgesamt 28 Patienten, die nicht nierentransplantiert waren und deren Hauptsymptom eine Proteinurie darstellte, dem Kollektiv von 20 nierengesunden Probanden, die keine nachweisbaren Konzentrationen MGS 160/170 im Harn aufwiesen, gegenübergestellt.In this example, a total of 28 patients who were not kidney transplanted and their main symptom was a proteinuria, the collective of 20 healthy kidneys who had no detectable Had concentrations of MGS 160/170 in the urine, juxtaposed.

Die Meßwerte dieser Patienten fielen durch relativ hohe Konzentrationen von MGS 160/170 im Harn auf. Nierenbioptisch wurden festgestellt: epimembranöse Glomerulonephritis, agressiv verlaufende IgA-Nephritis, fokale Sklerose, chronische Glomerulonephritis, Membrano-proliferative Glomerulonephritis, Vaskulitis/Glomerulonephritis (Churg-Strauss-Weber) diagnostiziert. Im Western Blot wurden die Harne der Patienten auf die Größe der MGS 160/170 Fragmente untersucht; es wurde in allen Patienten gefunden, daß nur sehr große Bestandteile von MGS 160/170 auftraten (um 150 kD in Immunoblots). Die Größe der Fragmente weist darauf hin, daß die Quelle für das im Harn nachgewiesene Molekül die glomerulären Epithelzellen sind. Im Serum zeigten die Patienten mit dem Churg- Strauss-Weber Syndrom neben positiven Harnwerten auch im Serum meßbare Konzentrationen von MGS 160/170. Das Ergebnis der Untersuchungen ist in der Tabelle angeführt.The measured values of these patients fell through relatively high ones Concentrations of MGS 160/170 in the urine. Renal biopsies were found: epimembranous Glomerulonephritis, aggressive IgA nephritis, focal sclerosis, chronic glomerulonephritis, Membrane proliferative glomerulonephritis, Vasculitis / glomerulonephritis (Churg-Strauss-Weber) diagnosed. In the Western blot, the urine from Patients on the size of MGS 160/170 fragments examined; it was found in all patients that only very large components of MGS 160/170 occurred (around 150 kD in immunoblots). The size of the fragments indicates that the source of this is in the urine proven molecule the glomerular epithelial cells are. In the serum, the patients with the Churg Strauss-Weber syndrome in addition to positive urine values Measurable concentrations of MGS 160/170 in serum. The The result of the investigations is in the table cited.

Im unselektierten Gesamtkollektiv von nicht nierentransplantierten Patienten einer nephrologischen Ambulanz, in welchem Gefäßkrankheiten ausgeschlossen wurden, konnte MGS 160/170 im Harn nur im Zusammenhang mit glomerulären Erkrankungen nachgewiesen werden. In the unselected collective of not kidney transplanted patients of a nephrological Outpatient clinic in which vascular diseases are excluded MGS 160/170 in urine could only be related with glomerular diseases.

Example 7 Localization of MGS 160/170 in tissue sections a) Immunohistochemical localization of MGS 160/170 in tissue

Für den immunhistochemischen Nachweis von MGS 160/170 wurde die indirekte Immun-Peroxidase-Methode verwendet:For the immunohistochemical detection of MGS 160/170 the indirect immune peroxidase method was used:

Paraffinschnitte von Formaldehyd-fixierten humanen Nieren wurden wie folgt aufgearbeitet:
Xylol: 2×5 min
Absoluter Alkohol: 5 min
Blockierung der endogenen Peroxidase (96 ml Methanol + 3 ml H₂O₂): 15 min
Tris pH 7.2, 50 mM: 3 × zwei min
Protease (Typ 10 Sigma, Pronase): 3 Einheiten, 10 min
Waschen in Tris: 3×2 min
Erster Antikörper: Monoklonaler Antikörper mgs(160/170)3 oder mgs(160/170)2 oder mgs(160/170)1, (Verdünnung 1 : 200, von Nutridoma-Überstand, 1 Stunde)
Waschen in Tris: 3×2 min
Zweiter Antikörper: Peroxidase-konjugiertes Kaninchen anti-Maus IgG (1 : 100, 30 min) Waschen in Tris: 3×2 min
Chromogen: Diaminobenzidin-Medium (5 min)
Wässern: 5 min
Hämalaun: 1 min
Wässern: 5 min
Aufsteigende Alkoholreihe und Einbettung.Paraffin sections from formaldehyde-fixed human kidneys were processed as follows:
Xylene: 2 × 5 min
Absolute alcohol: 5 min
Blocking of the endogenous peroxidase (96 ml of methanol + 3 ml of H₂O₂): 15 min
Tris pH 7.2, 50 mM: 3 × two min
Protease (type 10 sigma, pronase): 3 units, 10 min
Wash in Tris: 3 × 2 min
First antibody: monoclonal antibody mgs (160/170) 3 or mgs (160/170) 2 or mgs (160/170) 1, (dilution 1: 200, from Nutridoma supernatant, 1 hour)
Wash in Tris: 3 × 2 min
Second antibody: peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse IgG (1: 100, 30 min) washing in Tris: 3 × 2 min
Chromogen: diaminobenzidine medium (5 min)
Soak: 5 min
Haalum: 1 min
Soak: 5 min
Ascending alcohol series and embedding.

Fig. 6 zeigt:
A: Immunhistochemischer Nachweis von MGS 160/170 mittels Antikörper mgs(160/170)1 in einem Paraffinschnitt einer normalen menschlichen Niere mittels indirekter Immunperoxydase. Die Glomerula sind massiv markiert, die interstitiellen Blutgefäße in geringerem Ausmaße. Vergrößerung 280×.
B: Paraffinschnitt durch die gleiche Niere, welche mit Natriumperjodat vorbehandelt wurde und danach mit dem monoklonalen Antikörper mgs(160/170)1 inkubiert wurde. Die Natriumperjodat-Vorbehandlung unterdrückt vollständig die Bindung dieses monoklonalen Antikörpers, der somit als Zuckerreste-abhängig definiert werden kann. Vergrößerung 280×. Fig. 6 shows:
A: Immunohistochemical detection of MGS 160/170 using antibody mgs (160/170) 1 in a paraffin section of a normal human kidney using indirect immunoperoxidase. The glomerules are marked, the interstitial blood vessels to a lesser extent. Magnification 280 ×.
B: Paraffin section through the same kidney, which was pretreated with sodium periodate and then incubated with the monoclonal antibody mgs (160/170) 1. The sodium periodate pretreatment completely suppresses the binding of this monoclonal antibody, which can therefore be defined as sugar-dependent. Magnification 280 ×.

Fig. 7 zeigt die Lokalisation von MGS 160/170 in einer menschlichen Niere im Paraffinschnitt, ebenso wie in Fig. 6. In diesem Fall wurde der monoklonale Antikörper mgs(160/170)2 verwendet, welcher sowohl ohne als auch mit Vorbehandlung mit Natriumperjodat in gleicher Intensität die Glomerula anfärbt. Es kann daher geschlossen werden, daß dieser monoklonale Antikörper unabhängig von der Zuckerkomponente des MGS 160/170 Moleküls bindet. Fig. 7 shows the localization of MGS 160/170 in a human kidney in paraffin section, as in Fig. 6. In this case the monoclonal antibody mgs (160/170) 2 was used, which both without and with pretreatment with sodium periodate stains the glomerula with the same intensity. It can therefore be concluded that this monoclonal antibody binds independently of the sugar component of the MGS 160/170 molecule.

Fig. 8 zeigt ein Beispiel der immunhistochemischen Färbung von humaner Niere im Paraffinschnitt mittels monoklonalem Antikörper mgs(160/170)3 ohne (A) und mit (B) Vorbehandlung mit Natriumperjodat. In dieser hochauflösenden Aufnahme wird die Oberflächenmarkierung der glomerulären Epithelzellen und das Nachzeichnen der peripheren Kapillarschlingen deutlich. Vergrößerung 1200×. Fig. 8 shows an example of immunohistochemical staining of human kidney paraffin section by means of monoclonal antibody mgs (160/170) 3 without (A) and (B) pre-treatment with sodium periodate. This high-resolution image shows the surface marking of the glomerular epithelial cells and the tracing of the peripheral capillary loops. 1200 × magnification.

Mit dieser Methode ergibt sich eine sehr charakteristische Verteilung von MGS 160/170 im Nierengewebe: die glomerulären Epithelzellen sind stark positiv, die Endothelzellen der interstitiellen Kapillaren sind gleichfalls positiv. Alle anderen Strukturen weisen keine spezifische Markierung auf. Die Färbung ist bei Antikörper mgs(160/170)3 und mgs(160/170)1 besonders stark, mgs(160/170)2 etwas schwächer ausgeprägt. (Bei Weglassen des Proteaseverdaus, erhöht sich der Hintergrund leicht, das Signal, insbesondere in den Glomerula, ist jedoch mit den Antikörpern mgs(160/170)1 und mgs(160/170)3 und etwas schwächer auch mit mgs(160/170)2 deutlich ablesbar.This method results in a very characteristic distribution of MGS 160/170 in Kidney tissue: the glomerular epithelial cells are strong positive, the endothelial cells of the interstitial Capillaries are also positive. All other Structures have no specific marking. The Staining is at antibody mgs (160/170) 3 and mgs (160/170) 1 particularly strong, mgs (160/170) 2 somewhat less pronounced. (If the Protease digestion, the background increases slightly, however, the signal, especially in the glomerula, is with the antibodies mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 3 and somewhat weaker also clearly with mgs (160/170) 2 readable.

Es zeigt sich somit, daß sämtliche der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gegen MGS 160/170 auch für den immunhistochemischen Nachweis am humanen Material in Routine-Histopathologie- Schnitten als Marker für Endothelzellen und für viscerale glomeruläre Epithelzellen einsetzbar sind.It shows that all of the monoclonal antibodies according to the invention against MGS 160/170 also for immunohistochemical detection on human material in routine histopathology Sections as markers for endothelial cells and for visceral glomerular epithelial cells can be used.

b) Immunoelectron microscopic localization of MGS 160/170 more normal on ultra-thin frozen sections human kidneys

Fig. 9 zeigt die immunelektronenmikroskopische Lokalisation von MGS 160/170 an ultradünnen Gefrierschnitten normaler menschlicher Nieren mittels einer indirekten Goldmethode, unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers mgs(160/170)2 und einer affinitätsgereinigten Kaninchen-anti Maus IgG-Brücke, gefolgt von einem Ziegen-Anti-Kaninchen-Goldkonjugat (Kerjaschki et al., 1989; Tokuyasu, 1989). MGS 160/170 wird mit dieser Methode ausschließlich an der Oberfläche der glomerulären Epithelzellen und der Endothelzellen lokalisiert. An der Basis der Fußfortsätze in der Kontaktfläche zur Basalmembran ist keine Markierung erkennbar. A: Vergrößerung 35 000×. B: 50 000×. Figure 9 shows the immunoelectron microscopic localization of MGS 160/170 on ultra-thin frozen sections of normal human kidneys using an indirect gold method using the monoclonal antibody mgs (160/170) 2 and an affinity-purified rabbit anti-mouse IgG bridge, followed by a goat Anti-rabbit gold conjugate (Kerjaschki et al., 1989; Tokuyasu, 1989). With this method MGS 160/170 is localized exclusively on the surface of the glomerular epithelial cells and the endothelial cells. No markings can be seen at the base of the foot extensions in the contact area with the basement membrane. A: Magnification 35,000 ×. B: 50,000 ×.

literature

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Claims

1. A method for diagnosing human diseases which manifest primarily or in the course of generalized vascular diseases secondary to damage to the kidney glomerula, characterized in that a body fluid is examined for its content of human MGS 160/170 and / or fragments thereof.

2. The method according to claim 1 for the diagnosis of Glomerulonephritis.

3. The method according to claim 1 for monitoring States following one Kidney transplant.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized characterized that the body fluid urine is.

5. The method according to claim 1 to 3, characterized characterized that the body fluid serum is.

6. The method according to claim 5, characterized in that the examination of serum in addition to Examines urine.

7. The method according to claim 4 to 6, characterized characterized in that you also the size of the Fragments of MGS 160/170 in serum and / or in Urine examined.

8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the content of MGS 160/170 or fragments thereof due to the Binding to one or more antibodies determined.

9. The method according to claim 8, characterized in that the content of MGS 160/170 or fragments of which due to the attachment to one or more monoclonal antibodies determined.

10. Monoclonal antibody against human MGS 160/170 the designation mgs (160/170) 1 by the Hybridoma cell line MGS (160/170) 1 is produced.

11. Monoclonal antibody against human MGS 160/170 the designation mgs (160/170) 2 by the Hybridoma cell line MGS (160/170) 2 is produced.

12. Monoclonal antibody against human MGS 160/170 the designation mgs (160/170) 3 by the Mybridoma cell line MGS (160/170) 3 is produced.

13. Hybridoma cell line of the designation MGS (160/170) 1, deposited with the ECACC under the Accession number 92021323.

14. Hybridoma cell line of the designation MGS (160/170) 2, deposited with the ECACC under the Accession number 92021324.

15. Hybridoma cell line of the designation MGS (160/170) 3, deposited with the ECACC under the Accession number 92021325.

16. The method according to claim 8, characterized in that that the sample to be examined with an or several monoclonal antibodies in contact brings and the formation of a binary or ternary Complex between MGS 160/170 and the Antibody (s) determined.

17. The method according to claim 16, characterized in that the sample

a) in contact with a carrier-bound combination of mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 2;
b) the reaction mixture obtained in step a), which contains a complex between MGS 160/170 and the antibodies in the case of a positive reaction, is brought into contact with a combination of mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 3, where the antibodies used in this step have a measurable label;
c) the amount of the antibody / MGS160 / 170 / antibody complex formed in step b) is determined by measuring the label, if appropriate after reaction with a suitable substrate.

18. The method according to claim 16, characterized in that the sample

a) in contact with a carrier-bound combination of mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 3;
b) the reaction mixture obtained in step a), which contains a complex between MGS 160/170 and the antibodies in the case of a positive reaction, is brought into contact with a combination of mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 2, where the antibodies used in this step have a measurable label;
c) the amount of the antibody / MGS 160/170 / antibody complex formed in step b) is determined by measuring the label, if appropriate after reaction with a suitable substrate.

19. Sandwich ELISA kit for the determination of human MGS 160/170 in body fluids, containing as separate units

a) one or more ELISA plates;
b) a combination of the antibody mgs (160/170) 1

and mgs (160/170) 2;

c) a combination of the antibodies mgs (160/170) 1 and mgs (160/170) 3 conjugated to an enzyme that provides a measurable reaction product with a suitable substrate;
d) the substrate required for the enzyme reaction;
e) one or more dilution buffers for the antibodies;
f) optionally one or more wash buffers;
g) a preparation containing a defined amount of human MGS 160/170, preferably recombinant MGS 160/170 as a lyophilisate or as a solution.

20. Use of the antibody mgs (160/170) 1, mgs (160/170) 2, or mgs (160/170) 3 for immunohistochemical or immunoelectron microscopic localization of MGS 160/170 in human tissue samples.