DE4328639C2

DE4328639C2 - Verfahren zur Messung des antioxidativen Potentials der Haut

Info

Publication number: DE4328639C2
Application number: DE19934328639
Authority: DE
Inventors: Thomas Herrling; Norbert Groth; Juergen Fuchs; Leonhard Zastrow; Klaus Stanzl
Original assignee: Lancaster Group AG
Current assignee: Lancaster Group AG
Priority date: 1993-08-23
Filing date: 1993-08-23
Publication date: 2002-10-24
Anticipated expiration: 2013-08-24
Also published as: DE4328639A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des antioxidativen Potentials in der lebenden Haut sowie eine transdermale Zubereitung zur Verwendung in einem solchen Verfahren gemäß den Patentansprüchen.

Jede Zelle besitzt ein antioxidatives Potential, das durch die Balance zwischen den Faktoren, die die Autooxidation ausüben und denen, die die antioxidative Wirkung hervorrufen, bestimmt wird. Dabei steht den in der Haut vorhandenen Antio xidantien ein Vorgang gegenüber, der unter dem Sammelbegriff "oxidativer Stress" die physiologischen Einflüsse von haut spezifischen Stoffwechselreaktionen sowie exogene Faktoren wie ionisierende und nicht-ionisierende Strahlung, Photosensibi lisierung, toxische und allergische Kontaktdermatitis usw. umfaßt, und der eine Verschiebung des Gleichgewichts zugunsten der Oxidantien und damit ein Auftreten molekularer Schäden bewirkt.

Die Antioxidantien haben die Aufgabe, die biologisch reaktiven Oxidantien wie z. B. das Superoxid-Anionradikal, Wasserstoffperoxid, Hydroxylradikale, Singulett-Sauerstoff, Übergangsmetalle, Radikalchelate, Hydroperoxide, Lipidradikale und Thiyl-Radikale abzubauen, um oxidative Zell- und Gewebe schäden zu vermeiden. Angriffsziele der Oxidantien z. B. in der Haut sind Lipide, Proteine, Kohlehydrate und Nukleinsäuren.

Aufgrund der niedrigen Konzentration der freien Radikale im Gewebe, der extrem hohen Reaktionsfreudigkeit, der geringen biologischen Halbwertzeit von einigen Nano- bis Millisekunden und dem komplexen Aufbau der Haut in mehreren biochemischen und morphologisch verschiedenen Abschnitten, ist der Nachweis freier Radikale und reaktiver Sauerstoffspezies in der Haut methodisch sehr schwierig und nur für einzelne Spezies möglich (Spin-Trap-Technik). Ein weiterer erschwerender Faktor ist die Vielzahl der chemisch sich überlagernden Verbindungen im bio logischen Material. Der qualitative und quantitative Nachweis von freien Radikalen und reaktiven Sauerstoffspezies in biolo gischem Material erfordert hochentwickelte Analysentechniken. Der direkte Nachweis reaktiver Oxidantien bzw. von deren Oxi dationsprodukten im biologischen Material kann in vereinzelten Fällen mit komplizierten technischen Methoden erbracht werden. Sehr oft ist jedoch der direkte Nachweis in vitro und in vivo nicht möglich. Indirekte Bestimmungsmethoden, wie die Messun gen des Konzentrationsanstiegs an Peroxidationsprodukten und Konzentrationsverminderung der Antioxidantien sind häufig durchgeführte Verfahren.

Ein indirektes Verfahren zur Erfassung reaktiver Oxidan tien in vitro ist die quantitative Bestimmung von spezifischen Reaktionsprodukten, z. B. Peroxidationsprodukten der Lipide, Nukleinsäuren und Proteine. Der Thiobarbitursäure-Test, disku tiert von Gutteridge, 1986, JMC, Aspects to condsider when detecting and measuring lipid peroxidation. Free Radical Research Communication, 1: 173-184, in der Literatur als ein fach und sensitiv beschriebenes Verfahren, weist neben Lipid peroxidationsprodukten auch Ketosäuren und Nucleinsäuren nach und ist nicht geeignet zur Messung der Lipidperoxidationskine tik. Die Bestimmung von Lipidperoxidationsprodukten der Zell membranen mit der optischen Spektroskopie transparenter Lösun gen zeigt hingegen nur Schäden an den Zellmembranen selbst, so daß eine qualitative und quantitative Analyse der Lipidoxida tion in biologischem Material schwierig erscheint.

Molekularer Sauerstoff ist das Substrat für die Bildung des Superoxid-Anionradikals, von Wasserstoffperoxid und des Hydroxylradikals. Die quantitative Bestimmung des Sauerstoffs mit der Methode Oxypolarographie ermöglicht indirekt die Er fassung reaktiver Sauerstoffspezies, wenn die zelluläre Atmung (4 Elektronen Reduktion des Sauerstoffs) gering ist und der Sauerstoffverbrauch durch Ein-Elektronen-Transfer (radikali sche Reaktion) dominiert. Dies ermöglicht in der Regel in vitro-Messungen an Zellorganellen oder isolierten Zellen nach Hemmung der physiologischen Atmung durch Cyanid.

Antioxidantien wie Glutathion, Ascorbat und Tocopherol werden durch reaktive Sauerstoffspezies und freie Radikale oxidiert. Die Bestimmung der Konzentration der Antioxidantien oder von deren Oxidationsprodukten mit sensitiven Meßmethoden (z. B. HPLC mit elektrochemischer, spektrophotometrischer oder fluorimetrischer Detektion) ermöglicht eine isolierte Erfas sung reaktiver Oxidantien in verschiedenen Gewebekompartimen ten. Nachteile der Methode sind, daß Rückschlüsse auf die chemische Natur des reaktiven Oxidans nicht eindeutig möglich sind, die Probengewinnung invasiv ist und Präparationartefakte auftreten können.

Das Verfahren zur Messung der Biolumineszenz ist zwar ein hochempfindliches Meßverfahren und durch Auswahl spezieller Inhibitoren und Wellenlängenbereiche erzielt die Methode eine hohe Selektivität, hat jedoch den Nachteil der direkten Erfas sung von Lichtquanten als ein Parameter für die Radikalbil dung, sowie die Nichtanwendbarkeit für Untersuchungen radika lischer Reaktionen ohne Entstehung von Chemilumineszenz und eine begrenzte Anwendbarkeit für in vivo-Messungen.

Aus der EP-A-351919 ist bekannt, daß deuterierte Nitroxidradikale in der ESRENRI (Electron Spin Resonance Enhanced Magnetic Resonance Imaging) als kontrastgebende Komponente (Kontrastmittel) verwendet werden können. Dabei erfolgt jedoch eine Messung der Beeinflussung der Relaxationszeit der Wasserstoffkerne zum Zwecke der Verbesserung des Bildkontrastes bei der NMR-Tomographie mit möglichst dauerhaft stabilen Nitroxiden, die auch nach der Messung als solche im Körper verbleiben.

In einer Veröffentlichung in Magnetic Resonance Micros copy, Verlag Chemie Weinheim 1992, 563, wird die Penetration von Spin-Markern und die spektrale Veränderung der Linien von Proxylmaleimid mittels spezieller EPR-Technik untersucht.

Insgesamt besteht das Problem auf diesem Gebiet darin, daß das Vorhandensein einzelner Antioxidantien oder von deren Oxidationsprodukten in der Haut in vitro nachgewiesen werden konnte oder auch das Eindringen von Radikalen in die Haut, nicht jedoch das gesamte in der Haut zur Verfügung stehende antioxidative Potential. Dies wäre jedoch eine entscheidende Größe für die Vergleichbarkeit bestimmter Mittel gegen anti oxidative Beanspruchung (Stress) der Haut.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung des antioxidativen Potentials auf der Haut und eine transdermale Zubereitung dafür bereitzustellen.

Erfindungsgemäß besteht das Verfahren zur Messung des antioxidativen Potentials darin, daß man

a) eine transdermale Zubereitung auf die Haut aufträgt, bestehend aus einem physiologisch annehmbaren, in die Haut eindringenden Trägerstoff und einer physiologisch annehmbaren, paramagnetischen Modellsubstanz in Form eines freie Radikale tragenden Nitroxids oder Nitroxidgemisches, die in der Haut durch Antioxidantien innerhalb von 5 bis 60 Minuten abgebaut werden, wobei die Konzentration der Modellsubstanz im Bereich von 1 bis 100 mMol liegt;
b) eine gemäß (a) behandelte Haut einem oxidativen Stress unterzieht;
c) die magnetischen Momente der freien Elektronen der Nitroxidradikale mittels der paramagnetischen Elektronenreso nanz (EPR) nicht-invasiv unter den Bedingungen Mikrowellenleistung 1 bis 20 mM, Frequenzbereich 1 bis 10 GHz, Einsatz einer Oberflächenspule, Linienbreite der Modellsubstanz 0,1 bis 5 Gauss (0,1 bis 5 T) misst; und (d) die unter (c) erhaltenen Meßwerte der Intensität des low- field-Peaks oder des mid-field-Peaks des EPR-Spektrums als zeitabhängige Intensität erfaßt und im Vergleich mit nur gemäß (a) behandelter und danach gemäß (c) gemessener Haut als rela tive Intensität ausweist.

Mit der EPR wird der Nachweis des ungepaarten Elektrons des Radikals der Modellsubstanz (Nitroxid) ermöglicht.

Ausgehend von einer relativ schnellen Abbaubarkeit im Zeitraum von 5 bis 60 Minuten eignen sich als Modellradikale 5- und 6-Ringsysteme, zu denen die folgenden Nitroxide gehören Proxo (2,2,5,5-Tetramethyl-1-dihydropyrrolinoxy-nitroxid), Proxad (2,2,5,5-Tetramethyl-1-dihydropyrroloxy-nitroxid), Doxo (2,2,5,5-Tetramethyl-3-oxazolidinoxy-nitroxid), Tempo (2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinoxy-nitroxid), Tempol (2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinoxy-4-ol-nitroxid), CAT 1 (2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinoxy-4-trimethylammo niumbromid-nitroxid). Diese Verbindungen sowie die Verbindung DTBN (Di-tert.-Butyl-nitroxid) mit besonders kleinem Molekül haben eine geringe Stabilität, d. h. sie sind leicht abbaubar im Bereich der vorgesehenen Meßzeit, sie haben ein gutes Dif fusionsverhalten beim Eindringen in das zu untersuchende Ob jekt, und sie sind physiologisch verträglich.

Die Abbauzeit eines Modellradikals liegt im Bereich von 10 bis 60 Minuten, vorzugsweise 10 bis 30 Minuten. Unter dem hier verwendeten Begriff "Abbauzeit" wird die Zeit verstanden, in der das Radikal neutralisiert wird (Reduktion).

Die Löslichkeit der Modellradikale richtet sich nach dem Einsatzgebiet (Target). Für die dermatologische Verwendung sind Transportsysteme auf der Basis von Liposomen oder Mikro emulsionen möglich. Auch der Einsatz von mit Fluorcarbonen hergestellten asymmetrischen lamellaren Aggregaten (DE-A-42 21 255) als Trägersystem ist möglich.

Bei der praktischen Durchführung des Verfahrens wird zur Bestimmung des antioxidativen Potentials eines biologischen Systems dem zu untersuchenden System ein Modellradikal in einer Konzentration von 1 bis 100 mMol, zum Beispiel 10 mMol zugesetzt und die EPR-Signalintensität (low field peak oder mid field peak des Spektrums) nach einer definierten Zeit t gemessen. Diese relative Intensität I_r wird als "0" gesetzt. Zur Bestimmung des relativen antioxidativen Potentials wird die Größe A_p definiert, die ein Maß für das relative AOP dar stellt:

A_p(t, k) = 1 - I_r(t, k)

wobei k ein Maß für die Konzentration des verwendeten Modell radikals darstellt. Entsprechend I_r = 0 ergibt sich A_p = 1. Zur Bestimmung der relativen Signalintensität I_r werden die Para meter Meßzeitpunkt t und Modellradikalkonzentration k für eine Meßreihe konstant gehalten.

In einem zweiten Schritt wird das biologische System dem zu untersuchenden oxidativen Stress ausgesetzt, wobei es sich beispielsweise um eine endogene Entzündungsreaktion oder exogene Beeinflussung durch elektromagnetische Strahlung (UV- Strahlung, radioaktive Strahlung, Wärmestrahlung) oder mecha nische Einwirkungen (Schlag, Pressung) handeln kann. Der erhöhte oxidative Stress führt zu einem verlangsamten Abbau des anschließend zugeführten Modellradikals. Je nach der Größe des oxidativen Stresses wird die gemessene Intensität I_r größer als 0 sein. Dementsprechend ergibt sich ein antioxida tives Potential des untersuchten biologischen Systems, das kleiner als 1 ist.

Werden dem betrachteten biologischen System Antioxidan tien, wie beispielsweise Ascorbat und/oder Tocopherol zuge führt, so wird das AOP wieder erhöht, d. h. A_p steigt an.

Die Unterschiedlichkeit der physiologisch vorkommenden Antioxidantien, die auch bedingt sind durch eine Vielzahl von reaktiven Oxidantien, führt zu unterschiedlichen Reaktionsge schwindigkeiten mit den Modellradikalen. So reduziert bei spielsweise Ascorbat bevorzugt Piperidin-Nitroxide, wohingegen die Reaktionsgeschwindigkeit mit Pyrrolidin-Nitroxiden gering ist. Piperidin-Nitroxide werden im Gegensatz zu Pyrrolidin- Nitroxiden NADPN-abhängig durch Thioredoxin-Reduktase redu ziert. Thioredoxin-Reduktase komplementiert das Ascorbat als Reduktionsmittel für Nitroxidradikale. Die Nitroxidreduktion wird beispielsweise durch NADPH, NADP und NADH stimuliert. Liposomal gebundenes Nitroxid kann durch Ascorbat, nicht aber durch Thioredoxin-Reduktase reduziert werden.

Die relativ hohe Reduktionsrate von Pyrrolidin-Nitroxiden in der Haut läßt darauf schließen, daß dort noch andere Reduk tantien als Ascorbat und Thioredoxin vorhanden sind.

Das eingesetzte Modellradikal enthält semistabile Nitro xidradikale, deren hohe chemische Selektivität eine Reduktion durch Enzyme und spezifische Antioxidantien wie Glutathion, Ascorbat und Tocopherol begünstigt. Durch Auswahl einzelner Testsysteme wie Piperidin-Nitroxid kann das AOP entsprechender Antioxidantien wie z. B. Ascorbat selektiv gemessen werden.

Durch die Verwendung von perdeuterierten und ¹⁵N-markier ten Nitroxidradikalen kann die Signalintensität und damit die Empfindlichkeit des Verfahrens um ein Vielfaches erhöht wer den.

Eine weitere Verbesserung des Verfahrens besteht darin, daß mit Hilfe EPR-Tomographie das antioxidative Potential räumlich aufgelöst werden kann. Eine besonders günstige Ver fahrensvariante ist die mit modulierten Gradienten. Diese Variante ermöglicht eine schichtweise Messung des antioxidati ven Potentials beispielsweise in der Haut, wodurch entspre chende Rückschlüsse auf die Effizienz medizinischer oder kos metischer Behandlung der Haut gezogen werden können. Eine nähere Erläuterung zu diesem Verfahren ist in der bereits zitierten Literaturstelle Magnetic Resonance Microscopy ent halten, auf die in diesem Zusammenhang ausdrücklich Bezug genommen wird.

Mit der vorliegenden Erfindung wird erstmals der Begriff des antioxidativen Potentials eingeführt und zugleich ein einfaches und gut vergleichbare Meßergebnisse bietendes Verfahren bereitgestellt. Die verwendeten Modellsubstanzen sind in der angewandten Konzentration hautverträglich und werden durch Antioxidationsmittel problemlos abgebaut. Das Verfahren ist wiederholbar, während bisherige in vitro-Verfahren immer nur den Einzelnachweis eines Antioxidans innerhalb einer be stimmten Gewebeprobe erbrachten und damit einen Zustand "nach"dokumentierten. Das neue Verfahren bietet dadurch eine bisher einzigartige Möglichkeit, am Lebewesen Antioxidations potentiale nicht nur der Haut an sich, sondern auch Potentiale in verschiedenen Schichttiefen nachzuweisen und damit die Eindringtiefe von kosmetisch oder medizinisch aufgetragenen Antioxidantien.

Die Erfindung soll nachstehend durch Beispiele näher er läutert werden. In der dazugehörigen Zeichnung ist

Fig. 1 eine grafische Darstellung des in den Beispielen 1, 2 und 3 mit der dazugehörigen Kurve 1, 2 und 3 gemesse nen AOP über die Gesamtzeit

Zur Messung des AOP an der Haut wurde das AOP anhand der Abnahme der Radikalkonzentration des Modellradikalsystems CAT 1 für drei unterschiedliche exogene Einflußfaktoren gemessen.

Beispiel 1 Bestrahlung mit UVA/B

Die Haut wurde mit UVA/B bestrahlt. Nach einer dreifachen MED (minimalen Erythemdosis) wurde die Modellsubstanz CAT 1 in einer Konzentration von 10 mMol in einer Mikroemulsion mit PEG 80 als Trägersubstanz transdermal appliziert. Die Konzentra tion des Modellradikals wurde im Abstand von 5 Minuten gemes sen; Mikrowellenleistung 20 mM; Frequenz 3,5 GHz. Nach t = 25 Minuten betrug die Radikalkonzentration noch I_r = 0,23. Danach erhielt man in diesem Fall nach 25 Minuten ein A_p = 0,77.

Beispiel 2 Bestrahlung und Verstärkung mit 8-Methoxy-Psoralen

In diesem Beispiel wurde mit 8-Methoxy-Psoralen der Haut eine Substanz zugefügt, die die Bildung von reaktiven Oxidan tien bei UV-Bestrahlung begünstigt. Nach der anschließenden Applikation des Modellradikals wie im Beispiel 1 und Messungen im Abstand von 5 Minuten betrug die Radikalkonzentration nach 25 Minuten noch I_r = 0,36, so daß sich ein A_p = 0,64 ergab.

Beispiel 3 UV-Bestrahlung und Antioxidans-Zusatz

In diesem Beispiel wurde die Haut vor der Bestrahlung mit einer antioxidativen Komposition (enthaltend z. B. Tocopherol, Ascorbat) behandelt. Die durchgeführte Messung mit der Modellsubstanz wie in Beispiel 1 nach einer bei gleicher Dosis wie im Beispiel 1 erfolgten Bestrahlung ergab nach 25 Minuten den Abfall des Radikalsignals auf 6%. Daraus ergab sich ein antioxidatives Potential von A_p = 0,94. Das an der Haut vor der Bestrahlung gemessene antioxidative Potential hatte einen Wert A_p = 0,86. Der Vergleich der A_p-Werte zeigt deutlich eine Zunahme des AOP in der Haut nach der äußerlichen Anwendung von Antioxidantien und damit eine genaue Widerspiegelung der Ver änderung des AOP, das mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt werden konnte.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung des antioxidativen Potentials in der lebenden Haut, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine transdermale Zubereitung auf die Haut aufträgt, bestehend aus einem physiologisch annehmbaren, in die Haut eindringenden Trägerstoff und einer physiologisch annehmbaren, paramagnetischen Modellsubstanz in Form eines freie Radikale tragenden Nitroxids oder Nitroxidgemisches, die in der Haut durch Antioxidantien im Bereich von 5 bis 60 Minuten abgebaut werden, wobei die Konzentration der Modellsubstanz im Bereich von 1 bis 100 mMol liegt;
b) eine gemäß (a) behandelte Haut einem oxidativen Stress unterzieht;
c) die magnetischen Momente der freien Elektronen der Nitroxidradikale mittels der paramagnetischen Elektronenreso nanz (EPR) nicht-invasiv unter den Bedingungen Mikrowellenleistung 1 bis 20 mM, Frequenzbereich 1 bis 10 GHz, Einsatz einer Oberflächenspule, Linienbreite der Modellsub stanz 0,1 bis 5 Gauss (0,1 bis 5 T) misst; und
d) die unter (c) erhaltenen Meßwerte der Intensität des low- field-Peaks oder des mid-field-Peaks des EPR-Spektrums als zeitabhängige Intensität erfaßt und im Vergleich mit nur gemäß (a) behandelter und danach gemäß (c) gemessener Haut als rela tive Intensität ausweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Modellsubstanz auswählt aus der Gruppe, die aus Nitroxiden wie
2,2,5,5-Tetramethyl-1-dihydropyrrolinoxy-nitroxid,
2,2,5,5-Tetramethyl-1-dihydropyrroloxy-nitroxid,
2,2,5,5-Tetramethyl-3-oxazolidinoxy-nitroxid,
2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinoxy-nitroxid,
2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinoxy-4-ol-nitroxid,
2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinoxy-4-trimethylammoniumbromid- nitroxid,
Di-tert.-butyl-nitroxid
besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Nitroxide auswählt deren Abbauzeit durch Antioxidan tien im Bereich von 10 bis 30 Minuten liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerstoff eine physiologisch annehmbare, das Stratum corneum durchdringende Substanz ist, ausgewählt unter Liposomen, Mikroemulsionen, alkoholischen Auszügen und asymmetrischen la mellaren Aggregaten.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitroxidradikal perdeuteriert oder ¹⁵N-markiert ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, daß das Nitroxidradikal als Gemisch in Form einer Emulsion lipophiler und hydrophiler Nitroxidradikale vorliegt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn zeichnet, daß man als paramagnetisches Elektronenresonanzver fahren die EPR-Tomografie mit moduliertem Gradienten ein setzt und das antioxidative Potential in verschiedenen Haut schichten mit einer Auflösung von 10 bis 100 µm misst.

8. Transdermale Zubereitung zur nicht-invasiven Messung des antioxidativen Potentials in der lebenden Haut mittels der EPR oder EPR-Tomografie, wobei die Zubereitung eine physiologisch annehmbare, lipophile und/oder hydrophile, paramagnetische Mo dellsubstanz mit freien Radikalen enthält, mit der Antioxidan tien in der Haut innerhalb von 5 bis 60 Minuten abgebaut wer den, und einen physiologisch annehmbaren Träger.

9. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Modellsubstanz ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Nitroxiden wie
2,2,5,5-Tetramethyl-1-dihydropyrrolinoxy-nitroxid,
2,2,5,5-Tetramethyl-1-dihydropyrroloxy-nitroxid,
2,2,5,5-Tetramethyl-3-oxazolidinoxy-nitroxid,
2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinoxy-nitroxid,
2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinoxy-4-ol-nitroxid,
2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinoxy-4-trimethylammoniumbromid- nitroxid,
Di-tert.-butyl-nitroxid
besteht.

10. Zubereitung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeich net, daß die Abbauzeit der paramagnetischen Modellsubstanz durch Antioxidantien im Bereich von 10 bis 30 Minuten liegt.

11. Zubereitung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerstoff eine physiologisch annehmbare, das Stratum corneum durchdringende Substanz ist, ausgewählt unter Liposo men, Mikroemulsionen, alkoholischen Auszügen und asymmetri schen lamellaren Aggregaten.

12. Zubereitung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch ge kennzeichnet, daß das Nitroxidradikal perdeuteriert oder ¹⁵N- markiert ist.