DE4318417A1

DE4318417A1 - Mutation determinations with the aid of SSCP

Info

Publication number: DE4318417A1
Application number: DE4318417A
Authority: DE
Inventors: Juergen Weidner
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-06-03
Filing date: 1993-06-03
Publication date: 1994-12-08

Abstract

The present invention relates to a method for determining and characterising mutations in DNA fragments, and to a kit for carrying out this method.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung und Charakterisierung von Mutationen an DNA-Frag menten, sowie ein Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.The present invention relates to a method for Determination and characterization of mutations on DNA frag elements, as well as a kit for performing this procedure.

Erbkrankheiten lassen sich auf der DNA Ebene durch verschie dene diagnostische Verfahren nachweisen. Eine der bekannten Verfahren ist die sogenannte SSCP-Diagnostik (single stranded conformation polymorphism). Die SSCP-Diagnostik basiert auf der Erkenntnis, daß sich mutierte DNA in ihrem Laufverhalten auf Polyacrylamidgelen von nicht mutierter DNA, bzw. anders mutierter DNA unterscheidet. Dieses Verhalten beruht auf der veränderten Konformation der mutierten DNA. Da selbst Punkt mutationen zu einer veränderten Konformation und damit zu veränderten Laufeigenschaften führen, sind auch solche durch die SSCP detektierbar (Orita, M. et al. (1989) Genomics 5, 874ff.). In den meisten Fällen werden derzeit SSCP-Diagnosen mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten auf Polyacrylamidge len durchgeführt. Diese Methodik weist als Nachteil einen großen Zeitbedarf auf, da die Gelelektophorese recht zeitauf wendig ist und lange Exponierungszeiten erforderlich sind. Seit kurzem ist ein Verfahren bekannt, das ohne radioaktive Markierung auskommt (Ainsworth, P.J. et al. (1991) Nucl. Acids Res. Vol. 19, No. 2, 405). Diese Verfahren wurde heiter optimiert, wodurch kürzere Gelelektrophoresezeiten möglich wurden (Dworniczak, B. et al. (1991) Nucl. Acids Res. Vol. 19, No. 9, 2500; Mohabeer, Ajay J. et al. (1991) Nucl. Acids Res. Vol. 19, No. 11, 3154; Yap, Eric P.H. et al. (1991) Nucl. Acids Res. Vol. 20, No. 1, 145).Hereditary diseases can be differentiated on the DNA level prove diagnostic procedures. One of the well known The procedure is so-called SSCP diagnostics (single stranded conformation polymorphism). SSCP diagnostics are based on the realization that mutated DNA changes in its running behavior on polyacrylamide gels from non-mutated DNA, or otherwise differentiates mutant DNA. This behavior is based on the changed conformation of the mutated DNA. Because even point mutations to a changed conformation and thus to changed running characteristics, are also the SSCP is detectable (Orita, M. et al. (1989) Genomics 5, 874ff.). In most cases, SSCP diagnoses are currently being made with radioactively labeled DNA fragments on polyacrylamide len performed. This methodology has one disadvantage takes up a lot of time because gel electophoresis is quite time-consuming is agile and long exposure times are required. Recently a method has been known which is radioactive Marking gets along (Ainsworth, P.J. et al. (1991) Nucl. Acids Res. Vol. 19, No. 2, 405). This procedure was cheerfully optimized, resulting in shorter gel electrophoresis times became possible (Dworniczak, B. et al. (1991) Nucl. Acids Res. Vol. 19, No. 9, 2500; Mohabeer, Ajay J. et al. (1991) Nucl. Acids Res. Vol. 19, No. 11, 3154; Yap, Eric P.H. et al. (1991) Nucl. Acids Res. Vol. 20, No. 1, 145).

Bei den bisher entwickelten SSCP-Verfahren ist es unerläß lich, daß die doppelsträngige DNA in Formamid bei 94°C ge schmolzen und anschließend in Eis abgeschreckt wird. Nur auf diese Weise gelingt es, die Reassoziierung des Doppelstranges weitestgehend zu unterbinden. Bei diesen Verfahrensschritten ist jedoch die Ausbeute an einzelsträngiger DNA, die für die SSCP-Diagnostik unerläßlich ist, selbst unter den stringente sten Bedingungen äußerst gering. Diese geringe Ausbeute macht es erforderlich, daß die Parameter der Gelelektrophorese für die nicht radioaktive SSCP-Diagnose in jedem Einzelfall empi risch für jedes zu untersuchende Fragment und den daraus re sultierenden Einzelsträngen genauestens eingestellt werden müssen.With the SSCP methods developed so far, it is essential Lich that the double-stranded DNA in formamide at 94 ° C ge melted and then quenched in ice. Only on in this way the double strand can be reassociated prevent as much as possible. In these process steps However, the yield of single-stranded DNA that is required for the SSCP diagnostics is essential, even under the stringent extremely low conditions. This low yield makes it is necessary that the parameters of gel electrophoresis for the non-radioactive SSCP diagnosis in each individual case for each fragment to be examined and the right one resulting individual strands can be set precisely have to.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein nicht radioaktives SSCP-Diagnose-Verfahren zu entwickeln, das die Nachteile der bekannten Verfahren überwindet. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war insbesondere, eine Methodik zu entwickeln, die sich routinemäßig bei der Diagnostik von DNA- Mutationen einsetzen läßt. Eine weitere Aufgabe bestand darin, ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah rens bereitzustellen.The object of the present invention was therefore not to develop radioactive SSCP diagnostic method that the Disadvantages of the known methods are overcome. Task of In particular, the present invention was a methodology too develop that are routinely used in the diagnosis of DNA Mutations. There was another task therein a kit for performing the method according to the invention rens to provide.

Erfindungsgemäß gelöst wurde diese Aufgabe dadurch, daß die Zielfragmente mit biotynilierten Primern amplifiziert und die amplifizierten Fragmente nicht mit Formamid denaturiert wur den. Statt dessen wurden diese Fragmente an magnetische Ku geln, die mit Strepavidin beschichtet sind, beispielsweise Dynabeats, gebunden. Mit Hilfe eines Magneten wurden die am plifizierten Fragmente anschließend separiert und alkalisch denaturiert. Durch diese Verfahrensweise konnte die Ausbeute an einzelsträngiger DNA überraschenderweise derart erhöht werden, daß die anschließende Gelelektophorese an einer nicht denaturierenden Matrix bei vergleichsweise geringer Elektro phoresedauer unter Standardbedingungen eine saubere Aufspal tung ermöglicht. Gleichzeitig konnte der an den Kugeln gekop pelte komplementäre DNA-Strang durch Festphasensequenzierung sequenziert und die aufgefundene Mutation charakterisiert werden.This object was achieved in that the Target fragments amplified with biotinylated primers and the amplified fragments were not denatured with formamide the. Instead, these fragments were sent to magnetic Ku gels coated with strepavidin, for example Dynabeats, bound. With the help of a magnet, the am then separated fragments and alkaline denatured. With this procedure, the yield surprisingly increased in single-stranded DNA be that the subsequent gel electophoresis on a non denaturing matrix with comparatively low electro a clear separation under standard conditions tion enables. At the same time, he was able to head on the balls complemented strand of DNA by solid phase sequencing sequenced and characterized the mutation found become.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch charakterisiert, daßThe method according to the invention is characterized in that that

a) the DNA to be examined with a biotinylated and a non-biotinylated primer using PCR amplifi is decorated;
b) the fragments of the excess d′NTP’s and the biotinylated primers are cleaned, preferably by ultrafiltration over molecular sieves, especially before added by ultrafiltration with Zentrikon 100;
c) the amplifi adorned fragments with the biotinylated primer on Btrepavi din coated magnetic balls, preferably on Dyna- Tied beats;
d) the DNA bound in this way by a Magnet is separated;
e) by alkaline denaturation one of the DNA strands is melted off;
f) the solution with the single-stranded DNA is neutralized;
g) the single-stranded DNA is purified, preferably by Na-Mg acetate / ethanol precipitation and
h) on a non de Naturating polyacrylamide gel separated and visible ge is made.

Durch die Neutralisation im Schritt f) wird die Ausbildung einer Sekundärstruktur ermöglicht, die für die SSCP-Diagnostik erforderlich ist. Eine weitere vorzugsweise Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, zusätzlich zu den Schritten a) bis h) den an den magnetischen Kugeln gekoppelten komplementären Einzelstrang durch Festpha sensequenzierung zu sequenzieren und damit die Charakterisie rung der Mutation zu ermöglichen.By neutralizing in step f) Formation of a secondary structure allows for the SSCP diagnostics is required. Another preferably Embodiment of the method according to the invention consists in in addition to steps a) to h) the magnetic ones Balls coupled complementary single strand by Festpha sequencing sense sequencing and thus the characterization enable mutation.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Kit zur Mutations bestimmung an DNA-Fragmenten, der dadurch gekennzeichnet ist, daß erThe invention further relates to a kit for mutations determination of DNA fragments, which is characterized by that he

a) a biotinylated and a non-biotinylated Primer for the amplification of the corresponding target area with Help of PCR,
b) to purify the amplified fragments molecular sieves suitable by ultrafiltration, preferred Zentrikon 100 and
c) Strepavidin coated magnetic Contains balls, preferably Dynabeats.

Zusätzlich kann dieser Kit noch die für das Verfahren notwendigen Chemikalien enthalten.In addition can this kit still contains the chemicals necessary for the process contain.

Nachfolgend wird die Erfindung am Exon 11 des cystischen Fibrose Gens näher erläutert, ohne sie dadurch jedoch einzu schränken. Das eingesetzte Gen kann drei unterschiedliche Mu tationen im amplifizierten Bereich enthalten. Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) wurde mit einem biotynilierten und einem nicht biotynilierten Primer durchgeführt. Die DNA von drei Patienten mit den Mutationen G 542 X +/-, G 551 D +/-, R 553 X +/- und eine wildtyp DNA wurden amplifiziert. Als Amplifikationsprimer wurden die Typen 1192 B und 516, als PCR-Bedingungen 94°C für 30 sek., 55°C für 60 sek. und 72°C für 60 sek. eingesetzt; Amplifikationsansatz: 50 µl. Aus dem 50 µl Amplifikationsansatz wurden jeweils 2 µl Proben entnom men, um die Qualität des Amplifikationsansatzes zu überprü fen. Diese Qualitätskontrolle wurde auf einem 1,5% Agarosegel durchgeführt. Im Anschluß daran wurden die Fragmente über Zentrikon 100 (Amicon), einer Ultrafiltration durch ein Molekularsieb, aufgereinigt, um die überschüssigen bioty nilierten Primer und d,NTP¹s zu entfernen. Zur Probenaufbereitung wurden 30 µl Dynabeats (Dynal) pro Probe benötigt, die wie folgt vorbereitet wurden: Die Beats wurden über einen Magneten separiert, der Überstand verworfen. An schließend wurden die Beats mit 40 µl PBS und 0,1% BSA gewa schen, wobei zweimal jeweils 10 min drehend inkubiert wurde. Die so behandelten Beats wurden erneut über einen Magneten separiert und mit 40 µl "Binding and Washing-Buffer" (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA; 2,0 M NaCl) gewaschen (10 min Drehen). Diese Behandlung wurde zweimal wiederholt, der Oberstand jeweils verworfen. Nachdem die Beats auf diese Art vorbereitet worden waren, wurden ca. 40 µl PCR-Produkt zu den Beats pipettiert. Dieses Gemisch aus Beats und PCR-Produkt wurde anschließend 30 min inkubiert, um das Biotin an das Strepavidin zu koppeln. Die Beats wurden danach erneut sepa riert, der Oberstand wurde entnommen. Zu den Beats wurden 8 µl 0,1 N NaOH pipettiert. Nach 10 min Inkubation wurde der Oberstand entnommen und aufbewahrt. Anschließend wurde den Beats erneut 50 µl 0,1 N NaOH zugegeben und 10 min inkubiert. Nach erneuter Separierung der Beats wurde der Überstand entnommen und mit dem ersten Oberstand vereinigt. Der gesamte gesammelte Oberstand (58 µl) wurde mit 5,8 µl 1 N HCl neutralisiert. Im Oberstand befand sich die abgeschmolzene, einzelsträngige DNA. Zur weiteren Aufreinigung der DNA wurde eine Na-Mg-Acetat/Ethanol-Fällung durchgeführt. Der jeweilige Ansatz wurde bei -70°C/15 min gefällt und anschließend bei 13.000 U/min,für 5 min abzentrifugiert. Der Rückstand wurde zur Entfernung der Salze in 70% Ethanol aufgenommen und erneut bei 13.000 U/min abzentrifugiert. Der Oberstand wurde verworfen, die pelletierte einzelsträngige DNA getrocknet und in 10 µl TE-Puffer resuspendiert. Die auf diese Weise aufgereinigte einzelsträngige DNA wurde auf einem 7,5%igem nicht denaturierendem Polyacrylamidgel aufgetrennt und durch eine anschließende Silberfärbung sichtbar gemacht (Phast- System Pharmacia). Nach einer Elektrophoresedauer von ca. 1,5 h bei 120 v/h und 16°C konnten die drei genannten Mutationen mit hoher Qualität aufgespalten und alle drei heterozygoten Zustände diagnostiziert werden. Das Ergebnis ist in Abb. 1 zu sehen. Die einzelnen Spuren bedeuten: 1 und 6=G542 X +/-; 2 und 3=Silvia wt; 4=R 553 x +/-; 5=G 551 D +/-; 7=Standard PHYX/HAE III (wt bedeutet Wildtyp). Die erhaltenen DNA-Banden wurden mit einem Laserdensitometer gescannt. Das Ergebnis ist in Abb. 2 zu sehen. Hierin entspricht Kurve a dem Wildtyp-Allel, Kurve b entspricht der Mutation G 551 D +/- (zwei Banden, heterozygoter Patient), Kurve c entspricht G 542 X +/- (zwei Banden, heterozygoter Patient) und Kurve d entspricht R 553 X +/- (zwei Banden, heterozygoter Patient). Alle heterozygoten Mutationen wurden so verschoben, daß das wt-Allel sich mit dem Original wt- Allel überlagert. Durch diese Maßnahme konnten Fehler, die durch das Gel hervorgerufen wurden, ausgeglichen werden.The invention is explained in more detail below on exon 11 of the cystic fibrosis gene, but without restricting it thereby. The gene used can contain three different mutations in the amplified region. The polymerase chain reaction (PCR) was carried out with a biotinylated and a non-biotinylated primer. The DNA of three patients with the mutations G 542 X +/-, G 551 D +/-, R 553 X +/- and a wild-type DNA were amplified. Types 1192 B and 516 were used as amplification primers, 94 ° C. for 30 seconds as PCR conditions, 55 ° C. for 60 seconds. and 72 ° C for 60 sec. used; Amplification batch: 50 µl. 2 µl samples were taken from the 50 µl amplification batch in order to check the quality of the amplification batch. This quality control was carried out on a 1.5% agarose gel. The fragments were then purified via Zentrikon 100 (Amicon), ultrafiltration through a molecular sieve, in order to remove the excess biotinylated primers and d, NTP¹s. For the sample preparation, 30 µl of Dynabeats (Dynal) were required per sample, which were prepared as follows: The beats were separated by a magnet, the supernatant was discarded. The beats were then washed with 40 μl PBS and 0.1% BSA, with incubation twice for 10 min each. The beats treated in this way were separated again by means of a magnet and washed with 40 μl of “binding and washing buffer” (10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EDTA; 2.0 M NaCl) (rotating for 10 min). This treatment was repeated twice, the supervisory board was discarded in each case. After the beats had been prepared in this way, approximately 40 μl of PCR product were pipetted into the beats. This mixture of beats and PCR product was then incubated for 30 minutes to couple the biotin to the strepavidin. The beats were then separated again and the supreme board was removed. 8 μl of 0.1 N NaOH were pipetted into the beats. After 10 minutes of incubation, the supernatant was removed and saved. Then 50 μl of 0.1 N NaOH was again added to the beats and incubated for 10 min. After separating the beats again, the supernatant was removed and combined with the first supernatant. The entire collected supernatant (58 ul) was neutralized with 5.8 ul 1N HCl. The melted, single-stranded DNA was in the top. Na-Mg acetate / ethanol precipitation was carried out to further purify the DNA. The respective batch was precipitated at -70 ° C./15 min and then centrifuged at 13,000 rpm for 5 min. The residue was taken up in 70% ethanol to remove the salts and centrifuged again at 13,000 rpm. The supernatant was discarded, the pelleted single-stranded DNA was dried and resuspended in 10 ul TE buffer. The single-stranded DNA purified in this way was separated on a 7.5% non-denaturing polyacrylamide gel and made visible by subsequent silver staining (Phast-System Pharmacia). After an electrophoresis time of approx. 1.5 h at 120 v / h and 16 ° C, the three mutations mentioned could be split up with high quality and all three heterozygous conditions were diagnosed. The result can be seen in Fig. 1. The individual tracks mean: 1 and 6 = G542 X +/-; 2 and 3 = Silvia wt; 4 = R 553 x +/-; 5 = G 551 D +/-; 7 = standard PHYX / HAE III (wt means wild type). The DNA bands obtained were scanned with a laser densitometer. The result can be seen in Fig. 2. Curve a corresponds to the wild-type allele, curve b corresponds to the mutation G 551 D +/- (two bands, heterozygous patient), curve c corresponds to G 542 X +/- (two bands, heterozygous patient) and curve d corresponds to R 553 X +/- (two bands, heterozygous patient). All heterozygous mutations were shifted so that the wt allele overlaps with the original wt allele. This measure made it possible to compensate for errors caused by the gel.

Durch die vorliegende Erfindung ist es erstmals möglich geworden, Mutationen an zu untersuchender DNA routinemäßig in hoher Qualität zu diagnostizieren. Erfindungsgemäß ist es je doch nicht nur möglich, bereits bekannte Mutationsmuster und damit Erbkrankheiten nachzuweisen, es ist darüber hinaus auch möglich, gänzlich unbekannte Mutationsmuster zu identifizie ren. Aufgrund der speziellen, erfindungsgemäßen Verfahrens weise zur Aufarbeitung der einzelsträngigen DNA läßt sich die unbekannte Mutation unmittelbar analysieren. Hierbei macht man sich zunutze, daß der komplemäntäre Einzelstrang noch an den magnetischen Kugeln gekoppelt ist. Dieser Einzelstrang läßt sich direkt über Festphasensequenzierung, beispielsweise mit Hilfe der "Solid-phase sequencing of in vitro amplified genomic DNA" (Dynal) sequenzieren. Die Mutation läßt sich auf diese Weise genau charakterisieren.The present invention makes it possible for the first time become, routinely mutations in DNA to be examined in diagnose high quality. According to the invention, it is ever not only possible, already known mutation patterns and in order to prove hereditary diseases, it is also beyond possible to identify completely unknown mutation patterns ren. Because of the special method according to the invention way to work up the single-stranded DNA analyze unknown mutation immediately. Here makes one takes advantage of the fact that the complementary single strand is still on the magnetic balls is coupled. This single strand can be done directly via solid phase sequencing, for example using the "Solid-phase sequencing of in vitro amplified sequence genomic DNA "(Dynal). The mutation can be opened characterize this way exactly.

Claims

1. A method for mutation determination on DNA fragments, characterized in that

a) the DNA to be examined is plotted with a biotinylated and a non-biotinylated primer using PCR,
b) the fragments are purified from the excess d′NTP′s and the biotinylated primers,
c) the amplified fragments are bound with the biotinylated primer to strepavidin-coated magnetic balls, preferably to Dynabeats,
d) the DNA bound in this way is separated by a magnet,
e) it is melted by alkaline denaturation of one of the DNA strands and separated from the complementary DNA strand coupled to the magnetic balls,
f) the solution is neutralized with the single-stranded DNA
g) the single-stranded DNA in the solution is purified and
h) is separated and made visible on a non-denaturing polyacrylamide gel.

2. Method for mutation determination on DNA fragments according to Claim 1, characterized in that in addition to the Steps a) to h) the one coupled to the magnetic balls Complementary single strand by solid phase sequencing se and the mutation is characterized.

3. Method for mutation determination on DNA fragments according to Claim 1 or 2, characterized in that the cleaning the amplified fragments by ultrafiltration over moles molecular sieves, particularly preferably by ultrafiltration with Zentrikon 100 takes place.

4. Method for mutation determination on DNA fragments according to one of the preceding claims, characterized in that that the single-stranded DNA is replaced by a Na-Mg acetate / ethanol Precipitation is cleaned up.

5. Kit for mutation determination on DNA fragments, characterized in that it

a) a biotinylated and a non-biotinylated primer for the amplification of the corresponding target area using the PCR,
b) suitable for the purification of the amplified fragments by ultrafiltration molecular sieves, preferably Zentri kon 100 and
c) Strepavidin coated magnetic balls, preferably containing Dynabeats.

6. Kit for mutation determination on DNA fragments according to Claim 5, characterized in that it additionally for the process contains necessary chemicals.