DE4317958C2

DE4317958C2 - Vorrichtung und Verfahren zur Analyse von optischen Isomeren

Info

Publication number: DE4317958C2
Application number: DE4317958A
Authority: DE
Inventors: Yukie Inoue; Ryuzo Hayashi; Naoko Matsuya
Original assignee: Oji Paper Co Ltd
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd
Priority date: 1992-05-29
Filing date: 1993-05-28
Publication date: 1999-09-30
Anticipated expiration: 2013-05-29
Also published as: GB2267343B; GB2267343A; US5510244A; GB9311118D0; DE4317958A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur schnellen und einfachen Analyse von optischen Isomeren unter Verwendung einer Enzymreaktion.

Unter den von optischen Isomeren abgeleiteten Oxidationspro dukten ist z. B. Brenztraubensäure ein Stoffwechsel-Zwischen produkt in der Glykolyse und ein Ausgangsmaterial, das in verschiedene organische Säuren, wie z. B. Milchsäure, Äpfel säure und Oxalessigsäure, umgewandelt werden kann. Brenztrau bensäure spielt nicht nur in der Glykolyse sondern auch im Aminosäure-Stoffwechsel, Fettsäure-Stoffwechsel und derglei chen eine wichtige Rolle. Deshalb ist es von großem Wert, Brenztraubensäure-Spiegel im Blut und anderen Körperflüssig keiten zu bestimmen, oder Brenztraubensäure als ein Substrat oder Produkt bei der Bestimmung der Aktivität eines bestimm ten Enzyms in einem bestimmten Stoffwechselsystem zu bestim men. Weiterhin führt die abnormale Fermentation in Fermenta tionsverfahren wie z. B. der Alkoholgärung und der Milchsäu regärung zur Bildung von Brenztraubensäure.

Andererseits hat hinsichtlich der optischen Isomeren wie Milchsäure die Milchsäuregärung in der Lebensmittelindustrie breite Verwendung gefunden. So ist die Milchsäuregärung unter Verwendung von Mikroorganismen nicht nur bei der Herstellung von Milchsäure und Milchsäuregetränken sondern auch bei der Herstellung von Käse, Butter, Sake, Soyasauce, Miso, Marina den und dergleichen eingesetzt worden. Unter den bei einer derartigen Milchsäuregärung eingesetzten Mikroorganismen sind Milchsäurebakterien und Pilze, d. h. Schimmelpilze. Unter diesen schließen Milchsäurebakterien Spezies, die nur D- Milchsäure produzieren, Spezies, die nur L-Milchsäure produ zieren, und Spezies, die eine Mischung von D-Milchsäure und L-Milchsäure produzieren, ein, wie auf diesem Gebiet wohl bekannt ist.

Die Analyse von D-Milchsäure und L-Milchsäure beim Gärungs prozess ist deshalb u. a. für die Steuerung des Gärungsprozes ses und den Nachweis von Kontamination wesentlich.

Im Stand der Technik wird D-Milchsäure durch Verwendung von D-Lactatdehydrogenase (im folgenden kurz als "D-LDH" be zeichnet) und des in oxidierter Form vorliegenden Coenzyms Nikotinamidadenindinukleotid (im folgenden kurz als "NAD" bezeichnet") und Analyse des gebildeten Produkts, d. h. des in reduzierter Form vorliegenden Nikotinamidadenindinukleotids (im folgenden kurz als "NADH" bezeichnet) oder von Brenztrau bensäure durch Absorptionsspektroskopie oder Fluorometrie analysiert [Okada et al., Agric. Biol. Chem. 42: 1781-3 (1978), wie zitiert in Chemical Abstracts 90: 18672p (1979); Kobayashi, O. und Hiyama, K.; Kagaku to Kogyo (Osaka) 60: 375-8 (1986), wie zitiert in Chemical Abstracts 106: 100784j (1987); Buttery, J. E. und Pannall, P. R.; Clin. Biochem. 20: 237-239 (1987)]. Diese Analyseverfahren weisen jedoch verschiedene Probleme auf, die durch gewisse Eigen schaften von D-LDH bedingt sind.

Erstens ist die Reaktionseffizienz niedrig und deshalb ist die erforderliche Enzymmenge im Praxis-Maßstab zu groß; dies treibt die Analysekosten in die Höhe. Zur Verminderung der Enzymmenge sind Maßnahmen wie die Verlängerung der Reaktions zeit und die Einstellung der Reaktionstemperatur denkbar. Diese Maßnahmen führen jedoch zu negativen Wirkungen: das Verfahren wird kompliziert und mühsam und die Analysezeit wird länger. Zweitens begünstigt das Gleichgewicht der Reak tion, an der D-LDH beteiligt ist, die Bildung von D-Milch säure aus NADH und Brenztraubensäure und deshalb kommt die Reaktion vor der Umwandlung der gesamten Menge an D-Milch säure in Brenztraubensäure zum Stillstand. Zur vollständigen Umwandlung von D-Milchsäure in Brenztraubensäure sind neue Mittel, wie z. B. Verbrauch der erzeugten Brenztraubensäure durch Glutaminsäure-Brenztraubensäure-Transaminase, erforder lich, was das Reaktionsverfahren kompliziert macht und die Analysekosten steigert.

Wenn nicht nur D-Milchsäure sondern auch L-Milchsäure analy siert werden soll, ist es erforderlich, zunächst eine davon, z. B. D-Milchsäure, zu analysieren und daraufhin dasselbe Analyseverfahren wie für D-Milchsäure unter Verwendung von L- Lactatdehydrogenase (im folgenden kurz als "L-LDH" bezeich net) durchzuführen. Dies macht das Analyseverfahren kompli ziert und verdoppelt die Analysezeit und die Kosten.

Weiterhin besteht beim Assayverfahren unter Verwendung von Lactatdehydrogenase die Gefahr, daß es durch Trübheit und färbendes Material in der Probe beeinflußt wird, da das all gemeine Verfahren zum Nachweis der Enzymreaktion auf einer Änderung der Absorption von NAD oder NADH im ultravioletten Bereich, wie sie durch die Reaktion verursacht wird, basiert.

Bei der Analyse derartiger optischer Isomere wie Aminosäu ren, ist es schwierig, in kurzer Zeit genaue Analysen für die D-Form oder L-Form durchzuführen.

Für die Analyse von Brenztraubensäure sind u. a. das oben erwähnte Verfahren unter Verwendung von L-LDH und NADH und ein Verfahren unter Verwendung von Pyruvatoxidase zugänglich. Im Gegensatz zur Analyse von L-Milchsäure wird im Verfahren unter Verwendung von L-LDH und NADH die Abnahme der NADH- Menge mit Hilfe von Absorptionsmessungen bestimmt. Zwecks Bestimmung der Spiegel von sowohl D- und L-Milchsäure als auch von Brenztraubensäure muß die Milchsäure-Analyse jedoch durch ein anderes Verfahren durchgeführt werden.

Als weiteres Verfahren zur Analyse von Brenztraubensäure kann das Verfahren unter Verwendung der Reaktion, an der Pyruvat oxidase beteiligt ist, erwähnt werden. Dieses Verfahren er fordert die Verwendung von Thiaminpyrophosphat und Flavina denindinukleotid als Coenzymen und von zweiwertigen Ionen, wie z. B. Magnesium, Kalzium, Kobalt, Mangan, usw. als akti vierenden Faktoren und verursacht die Bildung von Acetylphos phat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid aus anorganischem Phosphat und Sauerstoff. Dieses enzymatische Verfahren ist jedoch inpraktikabel, da das Enzym ziemlich instabil ist und teure Coenzyme in großen Mengen erforderlich sind.

Die GB-A-2 042 722 beschreibt ein Verfahren zur Analyse von L-Milchsäure, das sich einer L-Lactatoxidase (im folgenden kurz als "LOD" bezeichnet) bedient. Dieses Verfahren verur sacht die Bildung von Wasserstoffperoxid und Brenztraubensäu re aus L-Milchsäure und Sauerstoff. Diese Reaktion erfordert keinerlei Coenzym. L-Milchsäure kann durch Bestimmung der Menge an Wasserstoffperoxid, die in dieser Reaktion gebildet wird, unter Verwendung eines Spektrophotometers analysiert werden. Das kolorimetrische Verfahren ist jedoch mit den oben erwähnten Problemen verbunden.

In Anbetracht des Vorstehenden kann kaum behauptet werden, daß die bis jetzt beschriebenen Verfahren zur Analyse der optischen D- und L-Isomeren, z. B. der zwei Komponenten D- Milchsäure und L-Milchsäure, oder zur Analyse von drei Kom ponenten, d. h. dem D-Isomeren und dem L-Isomeren und dem von diesem Isomeren abgeleiteten Oxidationsprodukt, z. B. von D- Milchsäure, L-Milchsäure und Brenztraubensäure, zufrieden stellend durchführbar sind.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die genaue und präzi se Analyse der zwei Komponenten, d. h. der optischen D- und L- Isomeren, in einer kurzen Zeit und auf einfache und leichte Weise unter Verwendung einer D-Dehydrogenase (D-DH) und einer L-Dehydrogenase (L-DH).

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereit stellung einer Analysevorrichtung und eines Analyseverfahrens zur exakten und genauen Analyse dieser zwei Komponenten, nämlich der optischen L- und D-Isomeren, in einer kurzen Zeit und auf einfache und leichte Weise unter Verwendung von je weils in immobilisierter Form vorliegender L-DH und D-DH.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Testsatzes für die obige Analyse.

Wenn für die Umwandlungsreaktion des L-Isomeren und D-Isome ren eine ausreichende Zeit aufgewendet wird; wird die Probe zu einer Mischung von beiden in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 und die unten unter Punkt 12 erwähnten Arbeitskurven 2 und 3 sind miteinander nahezu in Übereinstimmung; deshalb kann unter Verwendung von zwei Arbeitskurven, nämlich der Arbeits kurve 1 und der Arbeitskurve 2 oder 3, eine Berechnung vor genommen werden. Es muß darauf hingewiesen werden, daß die Ausführungen unter Punkt 12 unten eine Verallgemeinerung unter Einschluß dieses und anderer Fälle sind.

Detaillierte Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 zeigt eine Analyseapparatur vom Fluß-Typ zur Ana lyse von D-Milchsäure und L-Milchsäure.

Die Fig. 2 zeigt eine andere Analyseapparatur vom Fluß-Typ zur Analyse von D-Milchsäure und L-Milchsäure.

Die Fig. 3 und 4 zeigen weitere Ausführungsformen der vor liegenden Erfindung.

Die Fig. 5 zeigt eine in der vorliegenden Erfindung einge setzte Vorrichtung.

Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Analyse von optischen L- (oder D-)Isomeren bereit. Gegenstand der Erfindung ist insbesondere:

1. Ein Verfahren zur Analyse der optischen L- und D- Isomeren, wie sie in einer Probe vorliegen, welches umfaßt:
- 1. die Analyse des wie in der Probe vorliegenden L- (oder D-) Isomeren; und
- 2. die Umwandlung des optischen L-Isomeren und optischen D- Isomeren in dieser Probe in Anwesenheit einer L-Dehydrogenase und einer D-Dehydrogenase für diese Verbindung und von oxi diertem Coenzym und die anschließende Analyse des optischen L- (oder D-)Isomeren nach dieser Umwandlung.
2. Ein Verfahren gemäß Punkt 1, bei welchem die Analyse des wie in der Probe vorliegenden optischen L- (oder D-)Iso meren die Oxidation des L- (oder D-)Isomeren unter Verwendung einer Oxidase für dieses L- (oder D-)Isomere und die Bestim mung der Veränderung der Konzentration einer elektrochemisch aktiven Substanz, die durch die Reaktion, an der diese Oxida se beteiligt ist, bedingt ist, umfaßt.
3. Ein Verfahren gemäß Punkt 1, in welchem in Stufe (2) die Umwandlung der optischen L- und D-Isomeren in der Probe in einem Reaktor durchgeführt wird, der eine immobilisierte L-Dehydrogenase und eine immobilisierte D-Dehydrogenase ent hält.
4. Ein Verfahren nach Punkt 1, in welchem die Analyse des wie in der Probe vorliegenden L- (oder D-)Isomeren die Oxidation dieses Isomeren unter Verwendung einer Oxidase für dieses Isomere und die Bestimmung der Änderung der Konzen tration an elektrochemisch aktiver Substanz, wie sie aus dieser Reaktion unter Beteiligung dieser Oxidase resultiert, umfaßt.
5. Ein Verfahren nach Punkt 1, in welchem die Analyse des wie in der Probe auftretenden optischen (L- oder D-)Iso meren die Oxidation dieses Isomeren unter Verwendung einer Oxidase für dieses Isomere und die Bestimmung der Änderung der Konzentration von erzeugtem Wasserstoffperoxid oder ver brauchtem Sauerstoff als Ergebnis der Reaktion unter Beteili gung dieser Oxidase durch ein amperometrisches Verfahren unter Verwendung einer Elektrode umfaßt.
6. Ein Verfahren nach Punkt 1, in welchem in Stufe (2) die Umwandlungsreaktion zwischen den optischen L- und D-Iso meren in einer Lösung durchgeführt wird, die L-Dehydrogenase und D-Dehydrogenase enthält.
7. Ein Verfahren nach Punkt 1, in welchem die besagten L- und D-Isomeren L-Milchsäure und D-Milchsäure und die be sagten L- und D-Dehydrogenasen L-Lactatdehydrogenase und D- Lactatdehydrogenase sind.
8. Eine Vorrichtung zur Analyse der optischen L- und D- Isomeren durch das Flußverfahren, welche umfaßt:
- a) Mittel zur Einspritzung der Probe in einen Träger, der von stromaufwärts aus zugeführt wird;
- b) einen Reaktor, der die Dehydrogenase für das optische D- Isomere und die Dehydrogenase für das optische L-Isomere jeweils in immobilisierter Form enthält; und
- c) eine immobilisierte Oxidase für das L- (oder D-)Isomere und eine Elektrode zur Bestimmung der Änderung der Konzen tration einer elektrochemisch aktiven Substanz, wie sie durch die Oxidation des L- (oder D-)Isomeren in der Probe durch die Wirkung der immobilisierten Oxidase für das L- (oder D-)Iso mere hervorgerufen wird, wobei sich (iii) stromabwärts von (ii) befindet.
9. Eine Vorrichtung nach Punkt 8, die weiter Mittel zum Unterbrechen der Zuführung des Trägers oder der Verminderung der Fließgeschwindigkeit des Trägers in einem solchen Zu stand, daß der die Probe enthaltende Träger in Kontakt mit der D-Dehydrogenase und L-Dehydrogenase, die jeweils in immo bilisierter Form vorliegen, bleibt, umfaßt.
10. Eine Vorrichtung nach Punkt 8, welche weiter strom aufwärts vom Reaktor eine immobilisierte Oxidase für opti sches L- (oder D-)Isomer und eine Elektrode zur Bestimmung der Änderung der Konzentration einer elektrochemisch aktiven Substanz, die durch die Oxidation von L- (oder D-)Isomer in der Probe durch die Wirkung der immobilisierten Oxidase für das L- (oder D-)Isomere hervorgerufen wurde, umfaßt.
11. Eine Vorrichtung nach Punkt 8, in welcher die opti schen L- und D-Isomeren L-Milchsäure und D-Milchsäure und die L-Dehydrogenase und D-Dehydrogenase L-Lactatdehydrogenase und D-Lactatdehydrogenase sind.
12. Ein Verfahren zur Analyse der wie in einer Probe vorliegenden D- und L-Isomeren, welches umfaßt (1) das Inkon taktbringen von Probe und oxidiertem Coenzym mit einem Enzym system, das eine D-Dehydrogenase und eine L-Dehydrogenase enthält, um dadurch die Umwandlung des wie in der Probe vor liegenden D-Isomeren und L-Isomeren zu veranlassen, und (2) die elektrochemische Bestimmung der Änderung der Konzentra tion einer elektrochemisch aktiven Substanz als Ergebnis der Oxidation des L- (oder D-)Isomeren in der Probe durch die Wirkung einer Oxidase für das L- (oder D-)Isomere, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
- a) in Verfahren (2) das Erstellen einer Arbeitskurve 1, die die Beziehung zwischen der Konzentration des L- (oder D-)Iso mer und dem ausgegebenen Wert (im folgenden als "Ausgangs- Wert" bezeichnet) in einer elektrochemischen Bestimmung unter Verwendung von Standardlösungen des L- (oder D-)Isomeren als Proben zeigt,
- b) die Durchführung von Verfahren (I) unter Verwendung von Standardlösungen des L- (oder D-)Isomeren als Proben und die anschließende Durchführung des Verfahrens (2), um dadurch eine Arbeitskurve 2 zu erhalten, die die Beziehung zwischen der Konzentration des L- (oder D-)Isomeren und dem Ausgangs- Wert in der elektrochemischen Bestimmung zeigt,
- c) die Durchführung von Verfahren (I) unter Verwendung von Standardlösungen des D- (oder L-)Isomeren als Proben und die anschließende Durchführung von Verfahren (2), um dadurch eine Arbeitskurve 3 zu erhalten, die die Beziehung zwischen der Konzentration des D- (oder L-)Isomeren und dem Ausgangs-Wert in der elektrochemischen Bestimmung zeigt, anschließend
- d) die weitere Durchführung von Verfahren (2) unter Verwen dung der Analysenprobe, um einen Ausgangs-Wert 1 zu erhalten,
- e) die Durchführung von Verfahren (I) unter Verwendung der Analysenprobe und die anschließende Durchführung von Verfah ren (2), um einen Ausgangs-Wert 2 zu erhalten, und die Berechnung des Gehalts der D- und L-Isomeren in der Analysenprobe auf der Basis der Ausgangs-Werte 1 und 2 und der Arbeitskurven 1, 2 und 3.
13. Ein Verfahren nach Punkt 12, in welchem die D-Dehy drogenase und L-Dehydrogenase beide auf einem Träger immobi lisiert und in einem Reaktor gepackt sind und bei dem für eine gewisse Zeitspanne die Zuführung des Trägers in einem solchen Zustand gestoppt oder die Flußgeschwindigkeit des Trägers in einem solchen Zustand vermindert wird, daß oxi diertes Coenzym und die Probe in Kontakt mit den immobili sierten Dehydrogenasen bleiben.
14. Ein Verfahren nach Punkt 12, in welchem zwei par allele Wege, von denen jeder die Oxidase für das optische L- (oder D-)Isomere, die in einer immobilisierten Form vorliegt, und eine Elektrode umfaßt, verwendet werden und in dem in einem der Wege das ursprünglich in der Probe vorhandene L- (oder D-)Isomere unter Verwendung der immobilisierten Oxidase für das L- (oder D-)Isomere analysiert wird und im anderen Weg ein immobilisiertes Enzym, das die D-Dehydrogenase und L- Dehydrogenase enthält, an einer Stelle, die stromaufwärts von der immobilisierten Oxidase für das L- (oder D-)Isomere liegt, angebracht wird und das L- (oder D-)Isomere nach der Umwandlung des D-Isomeren und L-Isomeren, wie sie durch die D-Dehydrogenase und L-Dehydrogenase verursacht wurde, analy siert wird.
15. Ein Verfahren zur Analyse der optischen D- und L- Isomeren, welches die Durchführung von zwei Analysen unter Verwendung der unter Punkt 8 definierten Vorrichtung, eine in der Anwesenheit von oxidiertem Coenzym und die andere in der Abwesenheit von oxidiertem Coenzym, durch Inberührungbringen einer Probe mit einer D-Dehydrogenase und einer L-Dehydroge nase, die jeweils in immobilisierter Form vorliegen, umfaßt.
16. Ein Verfahren zur Analyse des Oxidationsprodukts, das von einem L- (oder D-)Isomeren abgeleitet ist, und der L- und D-Isomeren, wie sie in einer Probe vorliegen, welches die folgenden Stufen umfaßt:
- 1. Analyse des wie in der Probe vorliegenden optischen L- (oder D-)Isomeren,
- 2. Veranlassen der Umwandlung des L-Isomeren und D-Isomeren in der Probe in der Anwesenheit einer L-Dehydrogenase und einer D-Dehydrogenase dieses optischen Isomeren und von oxi diertem Coenzym und anschließende Analyse des L- (oder D-)Isomeren nach der Umwandlung, und
- 3. Inberührungbringen der Probe mit einer L-Dehydrogenase (oder D-Dehydrogenase) in Anwesenheit von reduziertem Coen zym, um dadurch das Oxidationsprodukt in das L- (oder D-)Iso mere umzuwandeln, und anschließende Analyse des L- (oder D-)Isomeren.
17. Ein Verfahren nach Punkt 16, bei welchem die Stufe der Analyse des L- (oder D-)Isomeren die Oxidation des L- (oder D-)Isomeren unter Verwendung einer Oxidase für das L- Isomere (oder einer Oxidase für das D-Isomere) und die Be stimmung der Änderung der Konzentration einer elektroche misch aktiven Substanz als Ergebnis der Reaktion, an der diese Oxidase beteiligt ist, umfaßt.
18. Ein Verfahren nach Punkt 17, bei welchem die elek trochemisch aktive Substanz Wasserstoffperoxid ist, dessen Konzentration im Laufe der Reaktion, an der die Oxidase be teiligt ist, zunimmt, oder Sauerstoff ist, dessen Konzentra tion im Laufe dieser Reaktion abnimmt.
19. Ein Testsatz, der umfaßt:
- 1. ein Reagenz, das L-Dehydrogenase und D-Dehydrogenase von optischen Isomeren und oxidiertes Coenzym enthält, um die Umwandlung von optischem L-Isomer und D-Isomer zu veranlas sen, und/oder
- 2. ein Reagenz, das L-Dehydrogenase (oder D-Dehydrogenase) der optischen Isomeren und reduziertes Coenzym umfaßt, um eine oxidierte Form des optischen Isomeren in einer Probe in L- (oder D-)Isomeres umzuwandeln.
20. Ein Verfahren nach Punkt 3, in welchem die Immo bilisierung der D-Dehydrogenase und L-Dehydrogenase durch Umsetzung eines Trägers mit Hydroxylgruppen mit einem Amino silan-Reagenz durchgeführt wird, um die Hydroxylgruppen in Aminosilan-Gruppen umzuwandeln, wobei die Aminogruppen-Teile der gebildeten Aminosilangruppen auf der Oberfläche des Trä gers mit einem polyfunktionellen Aldehyd umgesetzt werden, um den polyfunktionellen Aldehyd daran zu binden, und D-Dehydro genase und L-Dehydrogenase an den polyfunktionellen Aldehyd gebunden werden.

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung detaillierter unter Bezugnahme auf D-Milchsäure und L-Milchsäure als Bei spiel für die optischen D- und L-Isomeren und D-Lactatdehy drogenase (D-LDH) und L-Lactatdehydrogenase (L-LDH) als Bei spiele für die D-Dehydrogenase und die L-Dehydrogenase be schrieben. Selbstverständlich ist diese Art der Durchführung der vorliegenden Erfindung in keiner Weise beschränkend für den Umfang derselben.

Im folgenden wird die Analyse von L-Milchsäure und D-Milch säure durch Analyse von L-Milchsäure beschrieben. D-Milch säure kann durch Verwendung von "D-Milchsäure" anstelle von "L-Milchsäure" und "D-Lactatoxidase" anstelle von "L-Lactat oxidase" analysiert werden.

In der vorliegenden Beschreibung bedeutet "(oder D-)" im Ausdruck "optisches L- (oder D-)Isomer", daß die direkt be stimmte Substanz ein D-Isomeres, also nicht ein L-Isomeres ist.

Die Reaktionen, an denen D-LDH bzw. L-LDH beteiligt sind, werden im folgenden gezeigt.
D-LDH-Reaktion: D-Milchsäure + NAD⁺ = Brenztraubensäure + NADH + H⁺
L-LDH-Reaktion: L-Milchsäure + NAD⁺ = Brenztraubensäure + NADH + H⁺

Beide Reaktionen sind reversibel. Für beide Enzyme ist das Gleichgewicht jedoch hin zur Bildung von Milchsäure und NAD verschoben. Deshalb findet die Umwandlung von Brenztrauben säure kaum statt, selbst wenn die Probe mit einer großen Menge D-LDH in Anwesenheit von NAD in Kontakt gebracht wird.

Die vorliegenden Erfinder haben jedoch gefunden, daß wenn die Probe mit einer Mischung von D-LDH und L-LDH in Berührung gebracht wird, L-Milchsäure in der Probe in D-Milchsäure und D-Milchsäure in L-Milchsäure umgewandelt wird und nach einer ausreichenden Zeit schließlich ein Gleichgewicht zwischen D- Milchsäure und L-Milchsäure in einem Verhältnis von 1 : 1 er reicht wird. Wenn L-Milchsäure mit D-LDH und L-LDH in Berüh rung gebracht wird, nimmt die Menge an L-Milchsäure ab. Die ses Phänomen kann als Ergebnis der Oxidation von Milchsäure zu Brenztraubensäure und der Regeneration von Milchsäure aus dieser Brenztraubensäure und NADH unter der katalytischen Wirkung von D-LDH und L-LDH, die in der Nachbarschaft auf tritt, angesehen werden.

Es wurde noch eine weitere interessante Tatsache gefunden. D. h., selbst in einer Mischungsprobe, die D-Milchsäure und L- Milchsäure enthält, sind die Umwandlungsgeschwindigkeiten der optisch aktiven Milchsäureisomeren unabhängig voneinander. So werden die Probe und NAD mit D-LDH und L-LDH, die in enger Nachbarschaft zueinander auf einem Träger immobilisiert sind, in Berührung gebracht und die Menge an L-Milchsäure nach dem Kontakt mit den immobilisierten Enzymen wird bestimmt. L- Milchsäure kann unter Verwendung von z. B. einer immobilisier ten L-Lactatoxidase und einer Wasserstoffperoxidelektrode bestimmt werden. Wenn Proben, die nur L-Milchsäure in ver schiedenen Konzentrationen enthalten, mit diesen Enzymen in Berührung gebracht werden, wird ein Konzentrationsbereich beobachtet, in dem eine lineare Beziehung zwischen der L- Milchsäure-Konzentration und dem Ausgangs-Wert aus der Was serstoffperoxidelektrode gefunden wird. Deshalb wird ein Punkt in diesem Konzentrationsbereich ausgewählt, und D- Milchsäure wird in verschiedenen Konzentrationen zu einer L- Milchsäurelösung an diesem Konzentrationspunkt gegeben, wo durch eine weitere Arbeitskurve (im folgenden L1) erhalten werden kann. Daraufhin wird unter Verwendung von Proben, die nur D-Milchsäure in verschiedenen Konzentrationen enthalten, eine weitere Arbeitskurve (im folgenden L2) erhalten, die die Beziehung zwischen der D-Milchsäure-Konzentration und dem Ausgangs-Wert des elektrischen Stroms zeigt. In diesem Fall ist der Gradient von L1 identisch mit demjenigen von L2 und der Achsenabschnitt von L1 ist gleich dem Ausgangs-Wert des Stroms, wenn L-Milchsäure bei der entsprechenden Konzentra tion in Berührung gebracht wird. In diesem System führt der Ersatz von L-Milchsäure durch D-Milchsäure und umgekehrt zu denselben Ergebnissen.

Dies zeigt an, daß die Beziehungen zwischen der D-Milchsäure- Konzentration und der L-Milchsäure-Konzentration und dem Strom-Ausgangs-Wert unabhängig voneinander sind, und daß, selbst wenn D-Milchsäure und L-Milchsäure in einer tatsächli chen Probe in Mischung vorliegen, der Gehalt an D-Milchsäure berechnet werden kann, wenn die Konzentration von L-Milch säure, die ursprünglich darin enthalten war, separat bestimmt wird.

Wenn diese Reaktion nicht unter identischen Bedingungen durchgeführt wird, ist sie nicht reproduzierbar. Sobald je doch die Reaktionsbedingungen festgelegt worden sind, können D-LDH und L-LDH entweder in Lösungs-Form oder in immobili sierter Form eingesetzt werden.

Die Umwandlungsraten von D-Milchsäure und L-Milchsäure nehmen selbstverständlich mit zunehmender Kontaktzeit zwischen der Probe und NAD mit D-LDH und L-LDH zu. Nach einer ausreichend langen Reaktionszeit erreichen D-Milchsäure und L-Milchsäure schließlich ein Gleichgewicht unter Bildung einer racemischen Mischung und zu diesem Zeitpunkt hört die Umsetzung offen sichtlich auf. Deshalb ist es, wenn eine Lösung von D-LDH und L-LDH als solche eingesetzt wird, praktischer, Analysen in einem Zustand durchzuführen, in dem ein Gleichgewicht er reicht worden ist und die Reaktion zum Stillstand gekommen ist, als daß man die Reaktionsbedingungen spezifiziert.

Andererseits dauert es, wenn D-LDH und L-LDH in immobilisier ter Form eingesetzt werden ziemlich lange, bis die Reaktion den Gleichgewichtszustand erreicht. Eine derartige Arbeits weise ist deshalb für die kontinuierliche Analyse von vielen Proben in einer kurzen Zeit nicht geeignet, macht es jedoch möglich, Analysen unter konstanten Reaktionsbedingungen durchzuführen und deshalb D-Milchsäure und/oder L-Milchsäure exakt und präzise selbst in einem Nicht-Gleichgewichtszustand zu analysieren.

Die Aktivität von LDH wird im allgemeinen durch die Bestim mung der Geschwindigkeit, mit der Milchsäure aus Brenztrau bensäure gebildet wird, definiert. Der Anteil von L-LDH rela tiv zu D-LDH kann innerhalb des Aktivitätsverhältnisbereiches von etwa 1/10 bis etwa 20, vorzugsweise etwa 1/2 bis etwa 10, bevorzugter etwa 1/2 bis etwa 5 und am meisten bevorzugt etwa 1 bis etwa 5 variiert werden. Für diese Reaktion ist NAD erforderlich, das jedoch zurückgeführt werden kann; somit wird es in einer Menge vom etwa 1/20-Fachen bis etwa 10-Fa chen, vorzugsweise etwa 1/10-Fachen bis etwa 5-Fachen, bevor zugter etwa 1/5- bis etwa 4-Fachen der Konzentration der Milchsäure in der Probe eingesetzt.

Bei einem Verhältnis L-LDH/D-LDH von etwa 1 bis etwa 5 ver läuft die Gleichgewichtsreaktion unabhängig davon, ob die Probe nur entweder D-Milchsäure oder L-Milchsäure oder beide davon in irgendeinem Verhältnis enthält, immer bis zu einem konstanten D-Milchsäure/L-Milchsäure-Verhältnis. Somit wird das D-Milchsäure/L-Milchsäure-Verhältnis etwa 1 : 1.

Das zu verwendende Enzym L-LDH kann aus verschiedenen Quellen stammen, z. B. aus Rinder-, Schweine-, Kaninchen- oder Hühner- Eingeweiden oder -Muskeln. Das Enzym D-LDH kann ein Produkt sein, das aus einem Mikroorganismus, wie z. B. Lactobazillus oder irgendeiner anderen Bakterien-Spezies, abgeleitet ist. Als LOD-Quelle ist z. B. von Pediococcus abgeleitete LOD be kannt. LOD-Spezies aus anderen Quellen können selbstverständ lich ebenfalls eingesetzt werden.

Im folgenden wird die Erfindung in zwei Aspekten davon be schrieben, nämlich dem Aspekt I (Analyse von D-Milchsäure und/oder L-Milchsäure) und dem Aspekt II (Analyse von Brenz traubensäure und D-Milchsäure und/oder L-Milchsäure).

Aspekt I

Obwohl die Reaktionen, an denen D-LDH bzw. L-LDH beteiligt ist, auf diesem Gebiet bereits bekannt sind, ist die Erkennt nis, daß z. B. D-Milchsäure effektiv unter Verwendung der beiden kombinierten Enzyme in L-Milchsäure umgewandelt werden kann, ziemlich unerwartet.

Basierend auf dieser neuen Erkenntnis kann D-Milchsäure effi zient in L-Milchsäure umgewandelt werden. Wenn diese Stufe mit einem selektiven Analyseverfahren für L-Milchsäure kom biniert wird, können D-Milchsäure und L-Milchsäure analysiert werden.

Ein Verfahren zur Analyse von D-Milchsäure und L-Milchsäure, bei dem diese Stufe mit einem selektiven Analyseverfahren für L-Milchsäure kombiniert ist, wird im folgenden detaillierter beschrieben.

Im Aspekt I der vorliegenden Erfindung liegt die Gleichge wichtsreaktion zwischen Milchsäure und Brenztraubensäure, die durch Lactatdehydrogenase in Anwesenheit von NAD katalysiert wird, weit auf der Seite der Bildung von Milchsäure, wie oben erwähnt, selbst wenn Brenztraubensäure daneben vorliegt, so daß die Menge an Brenztraubensäure im Vergleich zu derje nigen an Milchsäure vernachläßigbar ist. Deshalb sind die Ergebnisse der Analyse von Milchsäure gemäß dem Aspekt I der vorliegenden Erfindung praktisch frei vom Einfluß der Brenz traubensäure.

Das Verfahren zur Bestimmung der D-Milchsäure- und L-Milch säure-Gehalte, welches das In-den-Gleichgewichtszustand-Srin gen von D-Milchsäure und L-Milchsäure umfaßt, bedarf einer langen Zeit für die Bewirkung der Reaktion, wenn immobili sierte D-LDH und L-LDH eingesetzt werden, und ist deshalb für die kontinuierliche Analyse wenig geeignet. In allgemeinen Enzymreaktionen kann zwischen der Reaktionszeit und der Um wandlungsrate nur dann eine Linearität festgestellt werden, wenn die Substrat-Umwandlungsrate 20% oder weniger beträgt. Deshalb nimmt in einer für die Immobilisierung verwendeten Enzymmenge die Empfindlichkeit mit Verlängerung der Kontakt zeit im wesentlichen linear zu, bis die Umwandlungsrate 20% erreicht hat. Daraufhin nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit jedoch schrittweise ab und deshalb nimmt der dadurch erhält liche Effekt ab, selbst wenn die Kontaktzeit durch Verminde rung der Träger-Fließgeschwindigkeit verlängert wird. Bei der Durchführung der Analyse in einer Zeit innerhalb eines Be reichs, bei dem die Umwandlungsrate etwa 80% erreicht, kann die Analyse in einer kurzen Zeitspanne praktikabel beendet werden, selbst wenn der Fluß gestoppt oder die Fließgeschwin digkeit vermindert wird.

Eine Ausführungsform der Erfindung, in der der Fluß gestoppt oder die Fließgeschwindigkeit vermindert wird, wird später beschrieben.

Zur Verlängerung der Zeit des Kontakts der Probe und von NAD mit immobilisierter D-LDH und L-LDH kann die Fließgeschwin digkeit in einem solchen Zustand reduziert werden, daß die Probe und NAD mit immobilisierter D-LDH und L-LDH in Kontakt sind. Wenn der Fluß in einem Zustand gestoppt wird, in dem die Probe in Kontakt mit immobilisierter D-LDH und L-LDH ist, um dadurch die Reaktion für eine ausreichend lange Zeit fort schreiten zu lassen, kann möglicherweise eine Umwandlungsrate von 100% erhalten werden. In diesem Fall wird eine racemische Mischung von D-Milchsäure und L-Milchsäure (1 : 1) gebildet.

Erfindungsgemäß kann die Analyse unter Verwendung von immobi lisierter D-LDH und L-LDH unter konstanten Bedingungen durch geführt werden, wodurch eine exakte Analyse möglich ist, selbst wenn die Umwandlungsrate unter 100% liegt.

L-Milchsäure in einer Probe muß durch eine Verfahren analy siert werden, durch das die Analyse nicht durch andere Sub stanzen, die außer L-Milchsäure möglicherweise in der Probe vorliegen, z. B. D-Milchsäure und NAD, beeinflußt wird. Zu diesem Zweck kann das Assayverfahren, das sich L-Lactatoxida se bedient, eingesetzt werden.

Die Reaktion, an der LOD beteiligt ist, ist im folgenden dargestellt:
L-Milchsäure + O₂ → Brenztraubensäure + H₂O₂

Diese Reaktion wird nicht durch gleichzeitig anwesende D- Milchsäure und/oder NAD beeinflußt. L-Milchsäure kann analy siert werden, indem man das erzeugte Wasserstoffperoxid oder den verbrauchten Sauerstoff bestimmt, oder durch Zuhilfenahme des sogenannten Mittlers, der ein Elektronenüberträger ist, der die direkte Ladungsübertragung zwischen ihm und LOD ver anlassen kann, z. B. Dichlorindophenol, Kaliumferricyanid oder Benzochinon, anstelle von Sauerstoff.

Die L-Milchsäure-Konzentration in der Probe wird durch dieses Verfahren vorher bestimmt und daraufhin wird nach der oben erwähnten Umwandlung von D-Milchsäure in L-Milchsäure die resultierende L-Milchsäure-Konzentration bestimmt, wodurch D- Milchsäure auf der Basis des Unterschieds in der L-Milchsäu re-Konzentration analysiert werden kann. Da die Bildungsge schwindigkeit von L-Milchsäure aus D-Milchsäure (Geschwindig keit der Abnahme der L-Milchsäure-Konzentration) pro Zeit einheit konstant ist, selbst wenn die Reaktion noch nicht das Gleichgewicht zwischen D-Milchsäure und L-Milchsäure erreicht hat, ist es möglich, D-Milchsäure und L-Milchsäure durch Vergleich der L-Milchsäure-Konzentration nach der Reaktion mit derjenigen vor der Reaktion zu analysieren, vorausge setzt, daß die Zeit für die Enzymreaktion konstant gehalten wird.

Bei der Analyse von L-Milchsäure unter Verwendung von L-Lac tatoxidase sollte die Abnahme der Sauerstoffmenge oder die Zunahme der Wasserstoffperoxidmenge in geeigneter Weise be stimmt werden. Zu diesem Zweck stehen Verfahren zur Verfü gung, die eine Messung der Absorption im sichtbaren Bereich umfassen, z. B. das Verfahren, das Peroxidase und 2,2'-Azino di(3-ethylbenzothiazolin)-6-sulfonsäure oder 4-Aminoantipyrin verwendet (Trinder-Verfahren). Die Messung der Absorption im sichtbaren Bereich wird im Vergleich zur Absorptionsmessung im UV-Bereich weniger durch Trübheit beeinflußt.

Es kann auch ein elektrochemisches Verfahren eingesetzt wer den, bei dem die Änderung in der Konzentration einer elek trochemisch aktiven Substanz, wie z. B. Sauerstoff oder Was serstoffperoxid, nach der Umwandlung dieser Änderung in einen Wert für die elektrische Stromstärke gemessen wird. Dieses Verfahren wird durch eine Trübheit der Probe oder durch fär bendes Material in der Probe nicht beeinflußt und kann im Vergleich mit dem Verfahren unter Verwendung eines Spektro photometers leichter durchgeführt werden und wird deshalb bevorzugt.

Insbesondere kann durch Immobilisierung von L-Lactatoxidase eine hochempfindliche, einfache und leicht bedienbare Vor richtung konstruiert werden, mit der relativ hohe Reaktions geschwindigkeiten erhalten werden können. Die Änderung in der Konzentration von Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid kann durch ein kolorimetrisches oder elektrochemisches Verfahren bestimmt werden. Unter diesen wird das elektrochemische Ver fahren bevorzugt.

Verschiedene bekannte Sauerstoffelektroden, z. B. vom Garvani- Typ oder Clark-Typ, können als Sauerstoffelektrode zur Mes sung des Sauerstoffverbrauchs eingesetzt werden. Die Elek trode für die Wasserstoffperoxidbestimmung wird vorzugsweise in einer Zelle angebracht. Die Zelle kann aus einem nicht leitenden Material, wie z. B. Acrylharz, Fluorharz, Vinylchlo ridharz oder Glas, oder einem leitenden Material, wie z. B. Edelstahl, Gold, Platin oder Silber, oder Kombinationen die ser Materialien hergestellt werden. Wenn ein leitendes Mate rial verwendet wird, sollte darauf geachtet werden, dieses elektrisch vom Elektrodensystem zu isolieren.

Als Beispiel für die Elektrode können Zwei-Elektrodensysteme, die eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode umfassen, und Drei-Elektrodensysteme, die eine Arbeitselektrode, eine Bezugselektrode und eine Gegenelektrode umfassen, erwähnt werden. Die Elektroden können z. B. durch Implantieren einer leitfähigen Substanz in den Boden der Meßzelle, Dampfabschei dung eines Metalls auf der inneren Zellwandoberfläche, Me tallplattierung aus einer Lösung, nicht-elektrolytische Plat tierung oder Drucken gebildet werden. Die Gegenelektrode und Bezugselektrode werden wünschenswerterweise in der Nachbar schaft der Arbeitselektrode positioniert, so daß der Wider stand der Lösung minimiert werden kann.

Das Material der Arbeitselektrode kann irgendeines derjenigen Materialien sein, die im allgemeinen in elektrochemischen Messungen eingesetzt werden, wie Metalle, z. B. Gold, Platin und Silber, glasartiger Kohlenstoff, Kohlenstoffpaste und dergleichen.

Die Gegenelektrode kann aus einem leitfähigen Material wie z. B. Edelstahl oder irgendeinem derjenigen Materialien, die oben mit Bezug auf die Arbeitselektrode erwähnt wurden, her gestellt werden. Der mit der Lösung in Kontakt stehende Teil der Zelle kann unter Verwendung eines leitfähigen Materials wie z. B. rostfreiem Stahl hergestellt werden und kann auch als Gegenelektrode dienen.

Als Bezugselektrode können z. B. herkömmliche Bezugselektroden wie Silber-Silberchlorid-Bezugselektroden und gesättigte Kalomel-Bezugselektroden erwähnt werden.

D-LDH, L-LDH und LOD können in Form einer Lösung oder in auf einem geeigneten Träger immobilisierter Form eingesetzt wer den. Wenn sie in Form einer Lösung verwendet werden, können die Enzyme der Probe in den erforderlichen Mengen zugegeben werden. In diesem Fall können die Enzyme jedoch nur einmal verwendet werden und müssen dann verworfen werden, was die Analysekosten erhöht. Bei Verwendung in immobilisierter Form können die Enzyme wiederholt eingesetzt werden, mit dem Vor teil, daß die Reaktionsbedingungen dafür leicht eingestellt werden können.

D-LDH und L-LDH können durch irgendeines der herkömmlichen Verfahren, wie z. B. das Absorptionsverfahren, das chemische Kupplungs- oder kovalente Bindungsverfahren und das Ein schlußverfahren immobilisiert werden. Als Beispiele für den für die Enzymimmobilisierung zu verwendenden Träger können Diatomeenerde, kalzinierte Diatomeenerde, Kieselgel, Glaskü gelchen, Aluminiumoxid, keramische Materialien, Kohlenstoff, aktivierter Kohlenstoff, Molekularsiebe, Silikonkautschuke, Cellulose, Agarose, Polymere auf Aminosäurebasis und derglei chen erwähnt werden. Bezüglich der Form der immobilisierten Enzyme kann festgestellt werden, daß die Enzyme auf einem Film, der die Elektrodenoberfläche bedeckt, immobilisiert werden können oder auf einem Träger immobilisiert und in Form einer Säule in einem Reaktor gepackt werden können, oder in Form einer Membran oder Hohlfaser in der Oberfläche eines Reaktors immobilisert werden können, um nur einige Beispiele zu nennen. Insbesondere wenn ein Träger, auf dem sich die immobilisierten Enzyme befinden, in einer Säule gepackt wird, kann die Kontaktzeit zwischen der Probe und jedem immobili sierten Enzym vorteilhaft verlängert werden, um dadurch die Umwandlungsrate zu erhöhen. Obgleich eine Säule mit einer größeren Kapazität den Vorteil hat, daß der Träger darin in größeren Mengen gepackt werden kann, weist eine derartige Säule den Nachteil auf, daß eine längere Analysezeit erfor derlich ist. Eine wünschenswerte Kapazität liegt im Bereich von etwa 10 bis 500 µl. Die Säule kann aus Acrylharz, Flu orharz, Vinylchloridharz, Glas, Edelstahl oder irgendeinem anderen Material oder einer Kombination dieser Materialien hergestellt werden. In einem Beispiel für das chemische Kupp lungsverfahren wird mit Hilfe eines Aminosilan-Kupplungs mittels vorzugsweise eine Aminogruppe in die Trägeroberfläche eingeführt und nach der Formylierung unter Verwendung eines polyfunktionellen Aldehyds, wie z. B. Glutaraldehyd, werden das Enzym oder die Enzyme zwecks Immobilisierung mit dem Träger in Berührung gebracht. Konkreter wird ein Träger mit Hydroxylgruppen, wie z. B. Diatomeenerde, kalzinierte Diato meenerde (Brennziegel usw.), Cellulose, poröses Glas, Kiesel gel oder saurer Ton zwecks Umwandlung der Hydroxylgruppen in Aminosilan behandelt und mit einem polyfunktionellen Aldehyd umgesetzt, wodurch der polyfunktionelle Aldehyd an die auf der Oberfläche des Trägers gebildeten Aminogruppen gebunden wird, um die Aldehydgruppen auf dem Träger einzuführen. An schließend wird Enzym zwecks Immobilisierung an die Aldehyd gruppen gebunden. Unter Berücksichtigung der Arbeitseffizienz und geringeren Abnahme der Enzymaktivität wird eine derartige immobilisierte Dehydrogenase oder Oxidase bevorzugt. Unter diesen Trägern werden Diatomeenerde, kalzinierte Diatomeen erde, poröses Glas, Kieselgel, saurer Ton und dergleichen, die Silikat enthalten, bevorzugt. Bevorzugter sind Diatomeen erde und kalzinierte Diatomeenerde.

Die Umwandlung von Hydroxylgruppen in Aminosilan kann durch Inkontaktbringen eines Reagenzes, wie z. B. 3-Aminopropyltri ethoxysilan, 2-Aminoethyltrimethoxysilan oder dergleichen mit dem Träger in einem Lösungsmittel wie wasserfreiem Benzol, Toluol oder dergleichen bewerkstelligt werden. Brauchbare polyfunktionelle Aldehyde schließen Glutaraldehyd, Glyoxal, Succinyldialdehyd und dergleichen ein.

Da die Umwandlungsreaktion von Milchsäure in der Probe auf den oben erwähnten D-LDH- und L-LDH-Reaktionen basiert, ist es wünschenswert, daß die Probe und NAD D-LDH und L-LDH im wesentlichen gleichzeitig kontaktieren können. Konkreter wird eine Membran, auf der sich immobilisierte D-LDH befindet, auf eine Membran, auf der sich immobilisierte L-LDH befindet, gelegt, oder ein Träger, auf dem sich immobilisierte D-LDH befindet, wird mit einem Träger gemischt, auf dem sich immo bilisierte L-LDH befindet, oder eine D-LDH-Lösung und ein L- LDH-Lösung werden gemischt und die gemischte Lösung wird zwecks Immobilisierung auf einen Träger oder eine Membran aufgebracht, um nur einige Beispiele zu nennen. Die Immobili sierung auf der Elektrodenoberfläche zwecks Bewirkung der Milchsäure-Umwandlungsreaktion ist jedoch nicht notwendiger weise zufriedenstellend, da D-LDH und L-LDH im allgemeinen eine niedrige Aktivität aufweisen und die entsprechenden Enzymreaktionen langsam ablaufen. Deshalb ist es wünschens wert, die Enzyme auf einem Träger für eine Packung für einen Reaktor, wie z. B. eine Säule, zu immobilisieren.

Bei der Immobilisierung von LOD können wie im oben erwähnten Fall von D-LDH und L-LDH zwecks Packen in einen Reaktor, wie z. B. eine Säule, das Adsorptionsverfahren, das chemische Kupplungsverfahren und das Einschlußverfahren eingesetzt werden, um nur einige Beispiele zu nennen. Es ist auch mög lich, unter Verwendung eines Vernetzungsmittels, wie z. B. Glutaraldehyd, Formaldehyd oder Succinaldehyd, eine Membran zu erhalten, die immobilisierte LOD enthält, und die so er haltene Membran an einer Elektrode zu befestigen. Bei der Enzymimmobilisierung kann LOD vernetzt werden, indem man weiter ein Protein, wie z. B. Albumin, Globulin oder Gelatine zugibt.

NAD kann entweder der Probe oder dem Träger (Pufferlösung) zugegeben werden. Wenn NAD zur Probe gegeben wird, wird sie vorzugsweise bis zu einer Konzentration von etwa 2 mM bis etwa 20 mM zugegeben und diese Zugabeweise ist für Fälle geeignet, wo die Probenzahl gering ist. Im Fall der Zugabe zum Träger durch ein Fließverfahren ist NAD stets in Kontakt mit immobilisierter D-LDH und L-LDH und die Effizienz seiner Verwendung ist höher als im Fall der Zugabe zur Probe, wes halb NAD vorzugsweise bis zu einer Konzentration von etwa 1 mM bis etwa 10 mM zugegeben wird. Dieses Zugabeverfahren eignet sich für den Fall, bei dem die Probenzahl groß ist.

Die NAD-Zugabemenge kann in dem Maße vermindert werden, wie die Zeit des Kontakts der Probe und von NAD mit immobilisier ter D-LDH und L-LDH verlängert wird.

Weiterhin können, da die Reaktionsgeschwindigkeiten an immo bilisierter D-LDH und L-LDH relativ gering sind, Mittel zum Stoppen der Trägerbeschickung oder zur Verminderung des Trä gerflusses für eine gewisse Zeitspanne, um dadurch die Probe und NAD für diese Zeitspanne in Kontakt mit immobilisierter D-LDH und L-LDH zu halten, so daß ein ausreichendes Empfind lichkeitsniveau erreicht werden kann und die Umwandlungsrate erhöht werden kann, um einen Zustand, der nahe am Gleichge wicht liegt, zu erzielen, vorgesehen werden.

Im Fall des Abstoppens der Einführung der Trägers für eine gewisse Zeit sollte dieses Abstoppen vorzugsweise begonnen werden, nachdem die gesamte Menge der Probe in den Reaktor, der immobilisierte D-LDH und L-LDH enthält, eingetreten ist, während die Zeitdauer dieses Abstoppens innerhalb eines Be reichs ausgewählt werden kann, in dem die Schnelligkeit der Analyse, die ein Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, nicht geopfert wird. Vom praktischen Gesichtspunkt aus liegt diese Zeitspanne wünschenswerterweise innerhalb von 5 Minu ten, so daß jedes Analyseverfahren in einer kurzen Zeit been det werden kann.

Im Falle der Verminderung der Fließgeschwindigkeit des Trä gers für eine gewisse Zeitdauer ist es erforderlich, die Fließgeschwindigkeit zumindest vor dem Verlassen der Proben- Träger-Mischungsfront des Reaktors, der immobilisierte D-LDH und L-LDH enthält, und vorzugsweise vor dem Zeitpunkt, an dem diese Proben-Träger-Mischungsfront eine Eingangsöffnung die ses Reaktors passiert hat, zu vermindern. Im obigen Fall sollte die Zeitdauer der Fließgeschwindigkeitsverminderung wünschenswerterweise innerhalb von 5 Minuten liegen, so daß jede Analyse in kurzer Zeit beendet werden kann.

Zum Abstoppen der Beschickung des Trägers oder zur Verminde rung der Träger-Fließgeschwindigkeit für eine gewisse Zeit spanne im Reaktor, der immobilisierte D-LDH und L-LDH ent hält, kann beispielsweise der Kontrollwert für die Pump- Fließgeschwindigkeit geeigneterweise zum Zeitpunkt der An kunft an der immobilisierten D-LDH und L-LDH auf der Basis der Zeitspanne zwischen der Zeit der Einspritzung der Probe und der Zeit der Ankunft an der immobilisierten D-LDH und L- LDH, wie durch Berechnung auf der Basis der Länge und des Durchmessers der Leitung von der Proben-Einspritzöffnung zum Reaktor und der Beschickungsgeschwindigkeit an der Pumpe oder durch vorläufige tatsächliche Messung bestimmt, um nur zwei Beispiele zu nennen, modifiziert werden.

Als ein typisches Verfahren dafür kann z. B. das Verfahren erwähnt werden, das die Steuerung der Pumpen-Fließgeschwin digkeit über einen D/A-Wandler unter Verwendung eines spe ziellen elektronischen Schaltkreises oder eines Computers und die gleichzeitige exakte Überwachung der Zeit vom Beginn der Probeneinspritzung bis zur Ankunft an den immobilisierten Enzymen, wie oben erwähnt, umfaßt.

Es ist auch möglich, den Reaktor, der immobilisierte D-LDH und L-LDH enthält, an einen Schleifenteil anzuschließen, der mit einem Selektorventil verbunden ist, und die Probe für eine gewisse Zeit im Reaktor zurückzuhalten, um dadurch eine hohe Umwandlungsrate zu erhalten.

Als einzuführender Träger können Pufferlösungen mit einem pH von etwa 7, was für D-LDH und L-LDH und LOD geeignet ist, die keinerlei elektrochemischen Einfluß auf die Elektroden aus üben können, z. B. Phosphatpuffer, erwähnt werden.

Aspekt II

Im folgenden werden hauptsächlich weitere zusätzliche Schrit te und Modifikationen von Aspekt I beschrieben.

Die Reaktionen, an denen D-LDH bzw. L-LDH beteiligt ist, sind die folgenden.
D-LDH-Reaktion: D-Milchsäure + NAD⁺ = Brenztraubensäure + NADH + H⁺
L-LDH-Reaktion: L-Milchsäure + NAD⁺ = Brenztraubensäure + NADH + H⁺

Beide Reaktionen sind reversibel. Für jedes Enzym liegt das Gleichgewicht jedoch mehr auf der Seite der Bildung von Milchsäure und NAD⁺. Deshalb verursacht L-LDH in Anwesenheit von NADH eine nahezu 100%ige Umwandlung von Brenztraubensäure in L-Milchsäure. L-LDH verursacht eine Umwandlung von L- Milchsäure in Brenztraubensäure selbst dann sehr langsam, wenn sie mit NAD⁺ gemischt wird. Dasselbe trifft auf D-LDH zu.

Unerwarteterweise haben die vorliegenden Erfinder jedoch gefunden, daß wenn man Milchsäure in Anwesenheit von NAD in Kontakt mit L-LDH und D-LDH bringt, ein Gleichgewichtszustand erreicht wird, in dem das Verhältnis zwischen D-Milchsäure und L-Milchsäure etwa 1 : 1 ist (Racemisierung). Somit können, wenn diese Reaktionen mit einem Bestimmungsverfahren, das für L-Milchsäure spezifisch ist, kombiniert werden, L-Milchsäure, D-Milchsäure und Brenztraubensäure in Proben analysiert wer den.

Im folgenden werden nacheinander (a) die Analyse von L-Milch säure, (b) die Analyse von D-Milchsäure und (c) die Analyse von Brenztraubensäure beschrieben.

a) L-Milchsäure: Wie oben erwähnt, wird L-Milchsäure in der Probe speziell unter Verwendung von LOD analysiert.
b) D-Milchsäure-Analyse: Die Probe wird in Anwesenheit von NAD zwecks ungefährer Racemisierung mit L-LDH und D-LDH in Kontakt gebracht, gefolgt von einer Analyse der L-Milchsäure. Der Milchsäure-Gesamtgehalt in der Probe kann dann aus den Ergebnissen dieser Analyse berechnet werden. Der Wert für die D-Milchsäure kann erhalten werden, indem man die in (a) er haltene L-Milchsäure-Konzentration vom Milchsäure-Gesamtge halt abzieht.

Die Racemisierung in dieser Stufe (b) kann auch durchgeführt werden, indem man unter Verwendung eines Vernetzungsmittels oder dergleichen L-LDH und D-LDH auf einem Träger immobili siert. Eine derartige Verwendung der LDHs in immobilisierter Form ist wirtschaftlich, da die immobilisierten Enzyme wie derholt für die Analyse eingesetzt werden können. Anderer seits sind, wenn die LDHs in Lösung eingesetzt werden, die Enzym-Reaktionsgeschwindigkeiten hoch, wodurch die Analysen zeit kurz wird. Deshalb werden für die Analyse einer groben Anzahl von Proben auf einmal die LDHs vorzugsweise in Form einer wäßrigen Lösung eingesetzt.

a) Brenztraubensäure-Analyse: Die Probe wird in Anwesenheit von NADH mit L-LDH in Kontakt gebracht, um die Umwandlung von Brenztraubensäure in L-Milchsäure zu veranlassen, und darauf hin wird die L-Milchsäure analysiert. Der Analysenwert ent spricht der Summe des Teils der L-Milchsäure, der ursprüng lich in der Probe vorhanden war, und des Teils der L-Milch säure, der aus Brenztraubensäure gebildet wurde. Deshalb kann der Brenztraubensäuregehalt in der Probe durch Abziehen des in Stufe (a) erhaltenen L-Milchsäuregehalts vom Gesamtwert berechnet werden.

Die Reaktion, die in Anwesenheit von L-LDH L-Milchsäure aus Brenztraubensäure bildet, kann rasch fortschreiten und des halb wird L-LDH nur in etwa einem Zehntel der Menge benötigt, die bei der Racemisierungsreaktion in der obigen Stufe (b) erforderlich ist. Da NADH in dieser L-LDH-Reaktion in einer Menge verbraucht wird, die äquimolar zur L-Milchsäure ist, wird NADH in einer Menge eingesetzt, die größer ist als die jenige von Brenztraubensäure in der Probe, vorzugsweise in einer Menge von 2 Mol oder mehr pro Mol Brenztraubensäure in der Probe.

Wenn L-LDH und D-LDH bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung in Lösungsform verwendet werden, wird LOD in immo bilisierter Form eingesetzt. Der Grund hierfür liegt darin, daß die Verwendung von LOD in Lösung die folgenden Probleme nach sich zieht.

Erstens, wenn LOD in Lösungsform zusammen mit L-LDH, D-LDH und NAD vorliegt, nimmt nur L-Milchsäure als Ergebnis des Verbrauchs derselben durch LOD ab und dies induziert die Racemisierungsreaktion, wodurch D-Milchsäure proportional in L-Milchsäure umgewandelt wird. Schließlich wird die gesamte Menge an Milchsäure in Wasserstoffperoxid und Brenztrauben säure umgewandelt. Zweitens, wenn LOD zusammen L-LDH und NADH vorliegt, reagiert die aus L-Milchsäure gebildete Brenztrau bensäure mit NADH und die Rückführungsreaktion führt zur Bildung von L-Milchsäure. Als Ergebnis werden Wasserstoffper oxid und Brenztraubensäure gebildet, bis kein NADH mehr zu rückbleibt. In einem derartigen Fall ist eine exakte Analyse von L-Milchsäure nicht möglich. Deshalb wird es unprakti scherweise erforderlich, den pH der LDH-haltigen Reaktions mischung zu modifizieren oder die Mischung zwecks Enzymin aktivierung zu erhitzen, so daß die Rezyklisierung inhibiert werden kann.

Von immobilisiertem LOD sind theoretisch Probleme, wie sie oben erwähnt wurden, ebenfalls voraussagbar.

Die Geschwindigkeit der Reaktion, an der LOD beteiligt ist, ist im Vergleich mit L-LDH und D-LDH jedoch schneller und deshalb kann, wenn LOD in immobilisierter Form verwendet wird, eine exakte Analyse von L-Milchsäure durchgeführt wer den, indem man die Reaktionsmischung nach der Beendigung der Reaktionen, an denen L-LDH und D-LDH beteiligt sind, mit immobilisierter LOD für eine Zeitdauer in Kontakt bringt, die ausreichend kurz ist, um eine wie oben erwähnte Rezyklisie rungsreaktion, die Probleme verursacht, zu vermeiden. Aus diesem Grund sind in diesem Fall die Reaktionen, an denen L- LDH und D-LDH, die zu der Probe gegeben werden, beteiligt sind, vernachlässigbar.

Die Immobilisierung von LOD kann auf dieselbe Weise wie im oben erwähnten Fall von L-LDH und D-LDH bewirkt werden.

Als Sauerstoffelektrode zur Bestimmung des Sauerstoffver brauchs können die Sauerstoffelektroden, die bereits oben erwähnt wurden, eingesetzt werden. Die Wasserstoffperoxid elektrode zur Bestimmung der Wasserstoffperoxidbildung kann irgendeine bekannte Wasserstoffperoxidelektrode sein, in welcher Kohlenstoff, Platin, Nickel, Palladium oder derglei chen als Anodenbasiskörper und Silber oder dergleichen auf der Kathodenseite verwendet werden. Im allgemeinen wird Pla tin als Anode bevorzugt, weil die Überspannung gering ist und eine hohe Empfindlichkeit erhalten werden kann. Diejenigen Elektroden, die eine selektiv permeable Membran, wie z. B. eine Polysiloxan-, Acrylharz-, Protein- oder Acetylcellulose- Membran aufweisen, sind vom Gesichtspunkt der Entfernung von störenden Substanzen aus bevorzugt.

Unter dem Gesichtspunkt der Stabilität und Präzision sollten die Wasserstoffperoxideelektrode und die Sauerstoffelektrode vorzugsweise vom Drei-Elektrodentyp, der eine Arbeitselek trode, eine Gegenelektrode und eine Bezugselektrode umfaßt, sein, obwohl sie auch vom Zwei-Elektrodentyp, der eine Ar beitselektrode und eine Gegenelektrode umfaßt, sein können.

In einer Ausführungsform von Aspekt II der vorliegenden Er findung können z. B. L-Milchsäure, D-Milchsäure und Brenztrau bensäure unter Verwendung einer Vorrichtung analysiert wer den, die immobilisierte LOD und eine Elektrode umfaßt.

Konkreter wird unter Verwendung von Standardlösungen, die aus L-Milchsäure oder einer Mischung von D-Milchsäure und L- Milchsäure mit einem bekannten Anteil von L-Milchsäure herge stellt wurden, zunächst eine Arbeitskurve erstellt. Unter Verwendung der so erhaltenen Arbeitskurve für L-Milchsäure wird die L-Milchsäure-Konzentration in der Probe bestimmt.

Daraufhin wird die Probe mit L-LDH und NADH zwecks Umwandlung von Brenztraubensäure in L-Milchsäure behandelt. Die Reak tionsmischung wird dann mit immobilisierter LOD in Kontakt gebracht und basierend auf der resultierenden elektrochemisch aktiven Substanz (z. B. Wasserstoffperoxid) wird der Gesamt gehalt an L-Milchsäure und Brenztraubensäure bestimmt.

Schließlich wird die Racemisierungsreaktion in Anwesenheit von L-LDH, D-LDH und NAD durchgeführt und basierend auf der L-Milchsäure-Konzentration in der Reaktionsmischung wird die Summe von gesamter Milchsäure und Brenztraubensäure bestimmt. Die L-Milchsäure-, D-Milchsäure- und Brenztraubensäure-Gehal te können jeweils aus den oben erwähnten Analysenwerten be rechnet werden. Bei dieser Gelegenheit wird, wenn die Probe und das Reagenzenzym in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt werden, z. B. die L-Milchsäure-Konzentration durch Verdoppeln des Analysenwerts nach der Racemisierungsreaktion berechnet.

Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung können Milch säure und Brenztraubensäure jeweils in der freien Form oder in Form eines Salzes davon vorliegen und die freien Säuren können ebenso wie die Salze davon für die Herstellung von Standardlösungen eingesetzt werden. Insbesondere ist das Lithiumsalz am wenigsten hygrospkopisch und deshalb einfach zu handhaben. Bei der Analyse der drei Spezies, d. h. L-Milch säure, D-Milchsäure und Brenztraubensäure, durch das Verfah ren der vorliegenden Ausführungsform sind die herzustellenden Standardlösungen Standardlösungen von L-Milchsäure allein, wodurch die Zeit für die Herstellung von Standardlösungen und für die Durchführung der Analyse verkürzt werden kann. Orga nische Säuren sind im allgemeinen instabil und eine Langzeit lagerung derselben in Lösung ist schwierig. Reagenzien von hoher Reinheit sind teuer, insbesondere Lithium-D-Lactat ist sehr teuer. Lithiumpyruvat ist schlecht löslich und schwierig zu handhaben. In der Praxis dieser Ausführungsform werden nur Standardlösungen von Lithium-L-Lactat allein benötigt. Dies macht das Verfahren einfach und gleichzeitig unter dem Ge sichtspunkt der Kosten vorteilhaft.

Die folgenden Analysevorrichtungen können als typische Bei spiele des Aspekts I erwähnt werden.

Eine erste Vorrichtung ist eine Analysevorrichtung (Fig. 1), die sich der Fließtechnik bedient. Sie teilt die Probe und NAD, die von einem Träger, z. B. einer Pufferlösung, mitge führt werden, in zwei Ströme auf und bringt einen zwecks L- Milchsäure-Analyse in Kontakt mit L-Lactatoxidase (6'). Der andere Teil wird für eine gewisse spezifizierte Zeitspanne mit D-LDH und L-LDH (8') in Berührung gebracht und daraufhin mit L-Lactatoxidase (9') kontaktiert und L-Milchsäure wird nach der Umwandlungsreaktion analysiert. Die Analyse kann schnell und auf einfache Weise durchgeführt werden, indem man den Strom in zwei Richtungen aufteilt, wie in Fig. 1 gezeigt. Es ist auch möglich, zwei Analysen in zwei Analysensystemen ohne Verzweigung des Trägerstroms, der die Probe und NAD enthält, durchzuführen.

Eine zweite Vorrichtung (Fig. 3) ist eine Vorrichtung, die sich der Fließtechnik bedient, wie sie durch Verbinden in Reihe, in der folgenden Reihenfolge von stromaufwärts an, einer Säule, die immobilisierte L-Lactatoxidase (LOD) (44) enthält, einer Wasserstoffperoxidelektrode (45), einer Säule, die immobilisierte D-LDH und L-LDH (46) enthält, einer Säule, die immobilisierte LOD (47) enthält, und einer Wasserstoff peroxidelektrode (48) aufgebaut wird. Die Probe und NAD, die von einem Träger wie z. B. einer Pufferlösung mitgeführt wer den, werden zunächst mit der immobilisierten LOD (44) in der ersten Säule zwecks Bestimmung von L-Milchsäure, darauf mit der immobilisierten D-LDH und L-LDH (46) in der zweiten Säule für eine gewisse spezifizierte Zeitspanne und schließlich mit der immobilisierten LOD (47) in der dritten Säule in Kontakt gebracht, um einen Analysenwert für L-Milchsäure nach der Um wandlungsreaktion zu erhalten.

Eine dritte Vorrichtung (Fig. 2) ist eine Analysenvorrich tung, die sich der Fließtechnik bedient und eine Säule, die immobilisierte D-LDH und L-LDH (25) enthält, und stromabwärts davon Mittel zur Bestimmung von L-Milchsäure (27), die L-LOD (28) und eine Elektrode (29) umfassen, umfaßt. In dem Fall, in dem die Probe in Anwesenheit von NAD mit D-LDH und L-LDH (25) in Kontakt gebracht wird, wird L-Milchsäure nach der Umwandlung zwischen L-Milchsäure und D-Milchsäure analysiert. Und für den Fall, in dem NAD nicht anwesend ist, wird L- Milchsäure ohne Umwandlungsreaktion der Isomeren analysiert, d. h. die L-Milchsäure in der ursprünglichen Probe wird analy siert. Und basierend auf beiden erhaltenen Analysenwerten werden L-Milchsäure und D-Milchsäure bestimmt.

Bei der Durchführung der Analysen unter Verwendung dieser Vorrichtungen kann NAD der Pufferlösung oder der Probe zu gegeben werden.

Bei der tatsächlichen Analyse werden zuerst Arbeitskurven für D-Milchsäure bzw. L-Milchsäure erstellt und eine Arbeitskurve wird auf der Basis der erhaltenen Stromstärkenwerte konstru iert.

Die Arbeitskurve 1 ist eine Arbeitskurve für L-Milchsäure, wie sie durch die Durchführung von Analysen ohne Umwandlung von D-Milchsäure und L-Milchsäure erhalten wird, d. h. durch Kontaktbringen der Proben nur mit immobilisierter LOD, ent weder ohne Durchleiten durch die Säule, die immobilisierte D- LDH und L-LDH enthält, oder vor Durchleiten durch diese Säule oder durch Analysieren ohne daß NAD veranlaßt wird, mit immo bilisierter D-LDH und L-LDH in Kontakt zu treten. Unter die sen Bedingungen führt das Einspritzen von D-Milchsäure zu keinerlei Stromstärkewert.

Die Arbeitskurve 2 ist eine Arbeitskurve, die erhalten wird aus den Stromstärkewerten nach der Durchleitung von L-Milch säure durch die Säule, die immobilisierte D-LDH und L-LDH enthält, in der Anwesenheit von NAD. In Arbeitskurve 2 ist der Anteil an Wasserstoffperoxid, der aus L-Milchsäure gebil det wird, im Vergleich mit der Arbeitskurve 1 niedrig, da ein Teil der L-Milchsäure in Brenztraubensäure umgewandelt wird.

Die Arbeitskurve 3 stellt die Ergebnisse dar, die aus Stan dardlösungen von D-Milchsäure unter denselben Bedingungen wie im Fall der Arbeitskurve 2 erhalten wurden. Bei der Analyse einer Probe wird der elektrische Stromstärkenwert 1 in der selben Stufe wie im Fall der Arbeitskurve 1 erhalten und der elektrische Stromstärkenwert 2 wird in derselben Stufe wie im Falle der Arbeitskurven 2 und 3 erhalten.

Die D-Milchsäure- und L-Milchsäure-Konzentrationen werden wie unten anhand eines Beispiels gezeigt berechnet. Der Strom stärkewert 1 wird auf die Arbeitskurve 1 angewendet, um die L-Milchsäure-Konzentration zu berechnen. Die erhaltene L- Milchsäure-Konzentration wird auf die Arbeitskurve 2 angewen det, um den durch die L-Milchsäure bedingten Stromstärkewert, der zum Stromstärkewert 2 beiträgt, zu berechnen. Der Beitrag der D-Milchsäure kann bestimmt werden durch Subtraktion des von der L-Milchsäure herrührenden Stromstärkewertes, der zum Stromstärkewert 2 beiträgt, vom Stromstärkewert 2. Die D- Milchsäure-Konzentration kann durch Anwendung dieses D-Milch säure-Beitrags auf die Arbeitskurve 3 berechnet werden.

Nachdem ein Gleichgewicht zwischen D-Milchsäure und L-Milch säure erreicht ist, werden die Arbeitskurve 2 und die Ar beitskurve 3 theoretisch identisch miteinander, wobei der Gradient die Hälfte dessen der Arbeitskurve 1 ist. Deshalb genügt es, wenn Bestimmungen durch das Lösungsverfahren mit einer ausreichenden Reaktionszeit, nachdem die Reaktion am Gleichgewicht angekommen ist, ohne Immobilisierung von D-LDH und L-LDH, durchgeführt werden, um bei der Analyse nur L- Milchsäure zu bestimmen. Zu diesem Zweck wird die Analyse nur unter Verwendung von immobilisierter L-LOD und einer Wasser stoffperoxidelektrode durchgeführt. Die Arbeitskurve in die sem Fall ist allein die Arbeitskurve 1. In diesem Fall sind jedoch zwei Analyseverfahren erforderlich, eines, das für L- Milchsäure erhalten wird, indem man die Probe als solche einer Analyse der ursprünglich in einer Probe enthaltenen L- Milchsäure unterzieht, und die andere, die erhalten wird für L-Milchsäure nach der Gleichgewichtsreaktion. Da der Analy senwert nach der vollständigen Gleichgewichtsreaktion der Summe von gleichen Mengen von L-Milchsäure und D-Milchsäure entspricht, wird der Analysenwert für L-Milchsäure verdop pelt, um den Gesamtgehalt von L-Milchsäure und D-Milchsäure zu liefern. Der Analysenwert für D-Milchsäure kann erhalten werden durch Abziehen des zuerst für L-Milchsäure erhaltenen Analysenwerts von diesem Gesamtgehalt.

Die Verwendung von L-LOD (oder D-LOD), D-LDH und L-LDH in immobilisierter Form ist vorteilhaft, z. B. weil die Enzyme wiederholt verwendet werden können und weil die Bedingungen für die Enzymreaktionen ohne weiteres eingestellt werden können.

Das Verfahren der Enzymimmobilisierung, das Mischungsverhält nis zwischen D-LDH und L-LDH, die Zugabeweise von NAD, das Verfahren zum Abstoppen des Probenflusses oder zur Verminde rung der Fließgeschwindigkeit, das Verfahren zur Analyse von L-Milchsäure, die Wasserstoffperoxidelektrode und die Sauer stoffelektrode sind, unter anderem, die gleichen wie diejeni gen, die bezüglich Aspekt I der vorliegenden Erfindung er wähnt wurden.

Vorstehend ist hauptsächlich der Fall beschrieben worden, bei dem die Umwandlungsreaktion von L-Milchsäure und D-Milchsäure unter Verwendung immobilisierter D-LDH und L-LDH durchgeführt wird. Der Fall, bei dem die Umwandlungsreaktion unter Ver wendung von D-LDH und L-LDH in Form einer Lösung durchgeführt werden kann, wird im folgenden beschrieben.

Wenn D-Milchsäure mit D-LDH und L-LDH in Lösung in Kontakt gebracht wird, wird wie oben erwähnt L-Milchsäure ebenfalls aus der gebildeten Brenztraubensäure und NADH gebildet.

Wenn L-Milchsäure mit D-LDH und L-LDH in Kontakt gebracht wird, nimmt die L-Milchsäure ab und L-Milchsäure wird gebil det.

Die optischen D- und L-Isomeren und Dehydrogenasen, die von den Milchsäuren und Lactatdehydrogenasen verschieden sind, werden im folgenden gezeigt.

Gemäß der folgenden Tabelle können, wenn D- und L-Milchsäure, Lactatdehydrogenase, NAD, Brenztraubensäure und L-Lactatoxi dase durch einen Satz von Substanzen ersetzt werden, die in der zweiten Reihe der Tabelle oder darunter angegeben sind, andere optische Isomere und Substrate in oxidierter Form, die in der linken Spalte der Tabelle angegeben sind, analysiert werden.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter. Selbstverständlich sind sie in keiner Weise beschränkend aufzufassen.

Für alle Lösungen mit einem pH von 7,0, wie sie in den fol genden Beispielen verwendet werden, wurde 100 mM Natrium phosphatpuffer als Lösungsmittel verwendet.

BEISPIEL 1 (1) Herstellung einer Säule, die immobilisierte L-Lactat oxidase (LOD) enthält

Ein Brennziegelpulver (Typ kalzinierte Diatomeenerde; 30-60 mesh; 150 mg) wird gründlich getrocknet, in eine 10%ige Lö sung von γ-Aminopropyltriethoxysilan in wasserfreiem Toluol 1 Stunde lang eingetaucht, dann gründlich mit Toluol gewa schen und getrocknet. Der Aminosilan-modifizierte Träger wird 1 Stunde in eine 5%ige Glutaraldehydlösung eingetaucht und dann gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, gefolgt von der Substitution mit 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0). Der Puffer wird soweit wie möglich entfernt. Eine Lö sung (200 µl) von L-Lactatoxidase (Sigma Chemical Company) (50 Einheiten/ml) in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) wird mit dem formylierten Brennziegel in Kontakt gebracht: Man läßt die Mischung zur Enzymimmobilisierung einen Tag bei 0°C bis 4°C stehen. Der so erhaltene Träger mit immobilisier tem Enzym wird in eine Acrylharzsäule (3,5 mm Innendurchmes ser, Länge 30 mm) gepackt, um eine Säule zu ergeben, die immobilisierte L-Lactatoxidase (L-LOD) enthält.

(2) Herstellung einer Wasserstoffperoxidelektrode

Die Seitenfläche eines Platindrahtes mit einem Durchmesser von 2 mm wird mit wärmeschrumpfendem Teflon bedeckt und ein Ende des Drahtes wird unter Verwendung einer Feile und von Schmiergelpapier Nr. 1500 geglättet. Unter Verwendung dieses Drahtes als Arbeitselektrode, einer Platinplatte (1 cm × 1 cm) als Gegenelektrode und einer gesättigten Kalomelelektrode als Bezugselektrode wird 10 Minuten lang eine elektrolytische Behandlung in 0,1 M Schwefelsäure bei +2,0 V durchgeführt. Der Platindraht wird dann gründlich mit Wasser gewaschen, 10 Minuten bei 40°C getrocknet, in eine 10%ige Lösung von γ- Aminopropyltriethoxysilan in wasserfreiem Toluol 1 Stunde lang eingetaucht und dann mit Toluol gewaschen. Glutaraldehyd wird zu einer Lösung von 20 mg Rinderserumalbumin (Sigma Chemical Co., Fraktion V) in 1 ml destilliertem Wasser in einer solchen Menge gegeben, daß eine Glutaraldehydkonzen tration von 0,2% resultiert. Eine 5 µl-Portion der resultie renden Mischung wird schnell auf den wie oben hergestellten Platindraht gegeben, gefolgt von Trocknung und Härtung bei 40°C für 15 Minuten, wodurch eine für Wasserstoffperoxid selektiv permeable Membran gebildet wird, die dazu dienen kann, Beeinträchtigungen durch störende Substanzen wie z. B. Ascorbinsäure zu eliminieren. Der so verarbeitete Platin draht wird als Arbeitselektrode einer Wasserstoffperoxidelek trode eingesetzt. Eine Silber-Silberchlorid (Ag/AgCl)-Elektrode wird als Be zugselektrode verwendet und eine leitfähige Leitung wird als Gegenelektrode verwendet.

(3) Herstellung einer Säule, die immobilisierte D-LDH und L-LDH enthält

Dieselbe formylierte kalzinierte Diatomeenerde (Brennziegel), die zur Immobilisierung von L-Lactatoxidase verwendet wurde, wird mit 500 µl einer Lösung von D-Lactatdehydrogenase (D- LDH) (Boehringer Yamanouchi) (300 Einheiten/ml) und L-Lactat dehydrogenase (L-LDH) (Sigma Chemical Co.) (900 Einheiten/ml) in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) in Kontakt gebracht und man läßt die Mischung zwecks Enzymimmobilisierung einen Tag bei 0°C bis 4°C stehen. Der so erhaltene Träger mit immo bilisiertem Enzym wird in eine Acrylharzsäule (Innendurch messer 3,5 mm, Länge 30 mm) gepackt, um eine Säule zu lie fern, die immobilisierte D-LDH und L-LDH enthält.

(4) Analysenvorrichtungen (I)

Die Analyse von L-Milchsäure wird unter Verwendung einer Analysenapparatur vom Fluß-Typ, wie sie in Fig. 4 gezeigt ist, durchgeführt. Eine Pufferlösung wird aus einem Puffer tank (1) mit Hilfe einer Pumpe (2) zugeführt, während 5 µl einer Probe über einen Probenspender (3) in die Vorrichtung eingespritzt werden. Die eingespritzte Probe läuft durch die oben erwähnte Säule (5) mit immobilisierter LOD in einem Gefäß (4), das bei einer konstanten Temperatur von 30°C ge halten wird, woraufhin Wasserstoffperoxid aus L-Milchsäure gebildet wird. Die Änderung in der elektrischen Stromstärke wird durch eine Wasserstoffperoxidelektrode (6) bestimmt. Die Änderung in der elektrischen Stromstärke an der Elektrode wird durch einen Detektor (7) nachgewiesen. Die Signale kön nen an einen PC (10) weitergeleitet werden. Die Wasserstoff peroxidelektrode (6), die eine Arbeitselektrode, eine Bezugs elektrode und eine Gegenelektrode umfaßt, befindet sich in einer Zelle und ist der L-Milchsäure-Analysenapparatur ein verleibt. In Fig. 4 bezeichnen die Bezugszeichen (8), (9), (11), (12) und (13) einen Computer mit einem Board, RS232C-Code, ein den Probenspender steuerndes Signal, ein die Pumpe steuerndes Signal bzw. einen Ablaß. Die Pufferlösung weist einen pH von 7,0 und die folgende Zusammensetzung auf: 100 mM Natriumphosphat, 50 mM Kalium chlorid und 1 mM Natriumazid. Die Fließgeschwindigkeit durch die Pumpe beträgt 1,0 ml/Minute.

(5) Analysenvorrichtung (II)

L-Milchsäure und D-Milchsäure werden unter Verwendung einer Analysenvorrichtung vom Fluß-Typ, wie sie in Fig. 1 gezeigt ist, analysiert. Eine Pufferlösung wird von einem Puffertank (1') mit Hilfe einer Pumpe (2') zugeführt, während 1 µl einer Probe über einen Probenspender (3') in die Vorrichtung einge spritzt wird. Die eingespritzte Probe wird durch eine Drei wegverbindung (5') in zwei Ströme aufgeteilt. Einer fließt durch eine L-Lactatoxidase-Säule (6'), worauf Wasserstoffper oxid aus L-Milchsäure gebildet wird, und die Änderung in der elektrischen Stromstärke wird mit einer Wasserstoffperoxid elektrode (7') gemessen. Diese Elektrode wird als erste Elek trode bezeichnet. Der andere fließt durch eine D-LDH/L-LDH- Säule (8'), woraufhin die Umwandlung von D-Milchsäure und L- Milchsäure stattfindet. Die Umwandlungsmischung fließt durch eine weitere L-Lactatoxidase-Säule (9') und die Änderung in der elektrischen Stromstärke wird durch eine weitere Wasser stoffperoxidelektrode (10') bestimmt. Diese Elektrode wird als zweite Elektrode bezeichnet. Die Säulen und Elektroden befinden sich in einem Gefäß (4'), das bei einer konstanten Temperatur von 30°C gehalten wird. Die Änderung in der elek trischen Stromstärke an jeder Elektrode wird durch einen Detektor (11') gemessen. Die Signale können an einen PC (14') weitergegeben werden. In der Fig. 1 stehen die Bezugszeichen (12'), (13'), (15'), (16') und (17') für einen Computer mit einem Board, RS232C- Code, ein den Probenspender steuerndes Signal, ein die Pumpe steuerndes Signal bzw. einen Auslaß. Die Zusammensetzung des Puffers, der einen pH von 7,0 hat, ist wie folgt: 100 mM Natriumphosphat, 50 mM Kaliumchlorid, 1 mM Natriumazid und 5 mM NAD. Die Fließgeschwindigkeit durch die Pumpe ist 1,3 ml/Minute, die Fließgeschwindigkeit an der ersten Elektrode beträgt 0,7 ml/Minute und die Fließgeschwin digkeit an der zweiten Elektrode beträgt 0,6 ml/Minute.

BEISPIEL 2

Unter Verwendung einer Analysenvorrichtung I (Fig. 4), einer Elektrode (6) und Säulen, wie sie in Beispiel 1 (1) und (2) hergestellt wurden, wurde die folgende Analyse durchgeführt.

Standard-Probenlösungen, die 5 mM NAD und einen pH von 7,0 aufwiesen und sich wie unten gezeigt im Milchsäuregehalt unterschieden, wurden mit und ohne Zugabe der Enzyme wie folgt hergestellt: D-LDH 54,3 Einheiten/ml und L-LDH 54,3 Einheiten/ml.

Zu jeder der Lösungen mit oder ohne D- und L-LDH wurde D- Milchsäure in Konzentrationen von 1, 2, 5, 10 mM oder L- Milchsäure in Konzentrationen von 1, 2, 5, 10 mM gegeben, um Standardlösungen von D- und L-Milchsäure herzustellen. De stilliertes Wasser mit oder ohne Enzyme wurde als Kontroll probe eingesetzt. Die Lösungen, die mit den Enzymen versetzt waren, wurden für mehr als 10 Minuten (etwa 20 Minuten) bei 30°C inkubiert, um die Lösungen in den Gleichgewichtszustand zu bringen, und daraufhin einer Milchsäureanalyse unterzogen. Die enzymfreien Lösungen wurden ohne Inkubation einer Milch säureanalyse unterzogen. Als Proben mit oder ohne L- und D- LDH wurden die folgenden Proben (a) bis (c) hergestellt:

a) 2,5 mM D-Milchsäure + 5 mM L-Milchsäure;
b) 5 mM D-Milchsäure + 2,5 mM L-Milchsäure;
c) 5 mM D-Milchsäure + 5 mM L-Milchsäure.

Die Standardlösungen wurden auf Milchsäure analysiert, um Arbeitskurven für L-Milchsäure und D-Milchsäure unter Ver wendung von elektrischen Stromstärkewerten zu erstellen.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Die in Tabelle 1 gezeigten Stromstärkewerte, wie sie aus den Standard-Milchsäurelösungen ohne Enzymzugabe und den inku bierten Standard-Milchsäurelösungen, die mit Enzym versetzt waren, erhalten wurden, ergaben die folgenden drei Arbeits kurven.

- Arbeitskurve 1 (ohne Enzymzugabe) Arbeitskurve für L-Milchsäure:
Y = 55,66 X - 2,44
- Arbeitskurve 2 (mit Enzymzugabe) Arbeitskurve für L-Milchsäure
Y = 27,54 X - 0,52
- Arbeitskurve 3 (mit Enzymzugabe) Arbeitskurve für D-Milchsäure
Y = 27,36 X - 0,39

In den obigen Arbeitskurven steht Y für den Stromstärkewert (nA) und X für die Milchsäurekonzentration (mM) in der Probe vor der Inkubation.

Daraufhin wurden die oben erwähnten drei Proben, die mit den Enzymen versetzt waren, bei 30°C etwa 20 Minuten inkubiert, um die Proben ins Gleichgewicht zu bringen, und daraufhin zusammen mit den drei entsprechenden enzymfreien Proben unter Verwendung der obigen Arbeitskurven auf L-Milchsäure und D- Milchsäure-Konzentrationen analysiert.

Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

BEISPIEL 3

Fünf handelsübliche Milchsäuregetränke, nämlich A (Kansai Luna's Yoghurt), B (Yakult's fermentierte Milch), C (Kyodo Nyugyo's sterilisiertes Milchsäurebakteriengetränk), D (Snow Brand Milk Products Yoghurt) und E (Snow Brand Milk Pro duct s fermentierte Milch) wurden auf D-Milchsäure, L-Milch säure und Gesamtmilchsäure analysiert. Demgemäß wurde jede Probe auf das 20- bis 40-Fache verdünnt, dann mit NAD, D-LDH und L-LDH in Lösung in Kontakt gebracht und nach einer gewis sen Zeitspanne einer L-Milchsäure-Konzentrationsbestimmung unterzogen.

Die L-Milchsäure-Konzentrationsbestimmung wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 durch Immobilisierung von L-Lactat oxidase und Quantifizierung des gebildeten Wasserstoffper oxids unter Verwendung einer Wasserstoffperoxidelektrode (Fig. 4) durchgeführt. Die immobilisierte L-Lactatoxidase enthaltende Säule (5), die Wasserstoffperoxidelektrode (6) mit einer Platinelektrode als Arbeitselektrode und die L- Milchsäure-Analysenvorrichtung, die verwendet wurden, waren dieselben wie diejenigen, die in Beispiel 2 eingesetzt wurden (Fig. 4).

(1) Analysenverfahren

1. Für die Analyse der L-Milchsäure wurden die verdünn ten Proben als solche verwendet und die L-Milchsäurekonzen trationen wurden bestimmt.
2. L-Milchsäureanalyse nach enzymatischer Isomeren- Umwandlungsreaktion in einer Pufferlösung: Zu 0,5 ml einer jeden verdünnten Probe wurden 0,5 ml eines Reaktionsmediums gegeben, das 10 mM NAD, 10 Einheiten/ml D-LDH, 50 Einhei ten/ml L-LDH und 200 mM Phosphat (pH 7,5) enthielt. Die Mi schung wurde für wenigstens 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, um die Reaktion dadurch fortschreiten zu lassen, und nach der Umwandlungsreaktion wurde die L-Milch säurekonzentration bestimmt. Durch Analyse von 1, 2 und 5 mM L-Milchsäure und von destilliertem Wasser als Kontrollprobe wurde eine Arbeitskurve erstellt. Die Milchsäurekonzentratio nen (%) in den ursprünglichen Proben wurden aus den gemesse nen erhaltenen Werten berechnet.

(2) Ergebnisse

Die D-Milchsäure-, L-Milchsäure und Gesamt-Milchsäure-Konzen trationen (%) in den fünf Milchsäuregetränken sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Vergleichsbeispiel 1

Die obigen fünf im Handel erhältlichen Milchsäuregetränke A bis E wurden unter Verwendung des F-Testsatzes (Boehringer Yamanouchi) auf D-Milchsäure-, L-Milchsäure- und Gesamt- Milchsäure-Konzentrationen analysiert.

(1) Analysenverfahren

In diesem Vergleichsbeispiel wurden die verdünnten Proben zentrifugiert (18000 U/min. 20 Minuten), um die Präzipitat fraktion zu entfernen und dadurch den Einfluß von Probentrüb heit zu eliminieren und so eine exakte Absorptionsmessung im ultravioletten Bereich (340 nm) zu ermöglichen. Somit war ein Vorbehandlungsschritt erforderlich. Die Milchsäurekonzentra tionen in jeder verdünnten Probe wurden auf der Basis der erhaltenen Absorptionswerte bestimmt und daraufhin durch Berechnung in die Milchsäurekonzentrationen (%) in der ent sprechenden ursprünglichen Probe umgewandelt.

So wurden unter Verwendung des F-Testsatzes NAD, Glutaminsäu re, Glutaminsäure-Brenztraubensäure-Transaminase mit jeder Analysenprobe gemischt und die Absorption bei 340 nm wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen und als Kontrollprobe verwendet.

Daraufhin wurde weiter D-LDH zugegeben und die Mischung wurde 20 Minuten stehengelassen und daraufhin einer Absorptions messung unterzogen. Die D-Milchsäure in jeder Probe wurde auf der Basis der Änderung in der Absorption, die durch D-LDH verursacht wurde, berechnet.

Zur Analyse von L-Milchsäure wurde L-LDH der obigen Reak tionsmischung zugegeben und nach Mischen wurde die Mischung 20 Minuten stehengelassen, gefolgt von einer Absorptionsmes sung. Die L-Milchsäurekonzentration in jeder Probe wurde aus der Änderung in der Absorption, die durch L-LDH hervorgerufen wurde, berechnet.

(2) Ergebnisse

Die D-Milchsäure-, L-Milchsäure und Gesamt-Milchsäure-Konzen trationen (%) in den fünf Milchsäuregetränken sind in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Auf der Basis dieser Werte wurden die Beziehungen zwischen den Analysenwerten (Y), die in Beispiel 3 durch das erfin dungsgemäße Verfahren erhalten wurden, und denjenigen (X), die im Vergleichsbeispiel 1 unter Verwendung des F-Testsatzes erhalten wurden, untersucht.

D-Milchsäure-Analysenwerte

Y = 1,02 X + 0,00 (r = 1,000);

L-Milchsäure-Analysenwerte

Y = 0,98 X + 0,02 (r = 0,998);

Gesamt-Milchsäure-Analysenwerte

Y = 1,03 X - 0,01 (r = 0,999).

Es wurde für jeden der Werte für D-Milchsäure, L-Milchsäure und Gesamt-Milchsäure eine gute Übereinstimmung erzielt, was anzeigt, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren exakte und präzise Analysen möglich sind. Das erfindungsgemäße Analysen verfahren wurde durch die Probentrübheit nicht beeinfluß, wodurch die oben erwähnte Vorbehandlung weggelassen werden konnte.

Das erfindungsgemäß Analysenverfahren ist genauer und leich ter zu handhaben als das F-Testsatz-Verfahren, da weniger oft eine Pipette verwendet werden muß. Weiter ist der Konzentra tionsbereich der optischen Isomeren breiter.

BEISPIEL 4 (1) Analyse von Standardlösungen

Destilliertes Wasser, 1, 2, 5 und 10 mM L-Milchsäure und 2, 5, 10, 20 und 50 mM D-Milchsäure wurden jeweils in die in Beispiel 1 (5) erwähnte Analysenvorrichtung (II) (Fig. 1) eingespritzt. Die über die ersten und zweiten Elektroden erhaltenen Stromstärkenwerte sind in Tabelle 9 gezeigt und die unten gezeigten Arbeitskurven wurden erhalten, in denen Y der Stromstärkewert (nA) ist und X für die Milchsäurekon zentration (mM) in der Probe steht.

Da die erste Elektrode (7') nur mit L-Milchsäure reagiert, ist die Arbeitskurve 1 ausschließlich für L-Milchsäure. An der zweiten Elektrode (10') findet die L-Milchsäure/D-Milch säure-Umwandlungsreaktion statt und bei der Analyse von Stan dard-L-Milchsäurelösungen nimmt die L-Milchsäure mit einer gewissen konstanten Geschwindigkeit ab und bei der Analyse von Standard-D-Milchsäurelösungen wird die D-Milchsäure mit einer bestimmten konstanten Geschwindigkeit in L-Milchsäure umgewandelt und die letztere wird bestimmt. Da somit sowohl D-Milchsäure als auch L-Milchsäure bestimmt werden können, können die Arbeitskurve 2 für L-Milchsäure und die Arbeits kurve 3 für D-Milchsäure erhalten werden.

Arbeitskurve 1 (für L-Milchsäure), erste Elektrode

Y = 15,5 X + 0,9

Arbeitskurve 2 (für L-Milchsäure), zweite Elektrode

Y = 11,8 X - 0,6

Arbeitskurve 3 (für D-Milchsäure), zweite Elektrode

Y = 1,5 X - 0,6

Tabelle 9

(2) Analyse der Mischungsproben

Mischungen von D-Milchsäure und L-Milchsäure wurden in die in Beispiel 1 (5) erwähnte Analysenapparatur (II) (Fig. 1) ein gespritzt. Die über die ersten und zweiten Elektroden erhal tenen Stromstärkenwerte und die D-Milchsäure- und L-Milch säure-Konzentrationen, wie sie unter Verwendung der durch Analyse der Standardlösungen erhaltenen Arbeitskurven berech net wurden, sind in Tabelle 10 gezeigt. Zur Berechnung der Milchsäurekonzentrationen in einer unbekannten Probe wird die L-Milchsäurekonzentration in der Probe zunächst durch Anwen dung des über die erste Elektrode (7') erhaltenen Stromstär kenwertes auf die Arbeitskurve 1 bestimmt. Basierend auf dieser Konzentration wird der Stromstärkenwert für L-Milch säure, die an der Reaktion an der zweiten Elektrode beteiligt ist, unter Verwendung der Arbeitskurve 2 bestimmt. Das Abzie hen dieses Stromstärkenwerts für L-Milchsäure vom Stromstär kenwert, der an der zweiten Elektrode (10') erhalten wurde, ergibt den durch D-Milchsäure hervorgerufenen Stromstärken wert. Durch Anwendung dieses Wertes auf Arbeitskurve 3 kann die D-Milchsäurekonzentration bestimmt werden.

Tabelle 10

Das erfindungsgemäße Milchsäureanalysenverfahren ermöglicht es, D-Milchsäure und L-Milchsäure exakt und präzise auf ein fache und leichte Art und Weise zu analysieren. Das erfin dungsgemäße Verfahren hat u. a. die folgenden Merkmale. Im Vergleich mit dem F-Testsatz-Verfahren ist die Anzahl der Pipettieroperationen geringer und das Verfahren ist einfa cher.

Die Zahl der erforderlichen Reagenzien und Enzyme ist eben falls klein und dies erleichtert das Verfahren und vermindert die Analysenkosten. Der analysierbare Konzentrationsbereich ist breit und kann durch Variation der Probengröße, die in die Analysenvorrichtung eingespritzt werden soll, variiert werden. Wenn eine Probeneinspritzvorrichtung bei der Analyse verwendet wird, können auch Arbeitskräfte eingespart werden.

Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Analysenvorrichtung ist es nunmehr möglich, D-Milchsäure und L-Milchsäure exakt und präzise auf einfache Weise innerhalb einer kurzen Zeit zu analysieren. Gemäß der in Beispiel 4 gezeigten Ausführungs form der Erfindung ist die wiederholte Verwendung der Enyzme L-LDH und D-LDH in immobilisierter Form möglich und die En zymreaktionsbedingungen können ohne weiteres eingestellt werden, selbst wenn die Umwandlungsreaktionszeit gering ist; dies steht im Gegensatz zu den Verfahren zur Analyse von D- Milchsäure und L-Milchsäure, die sich L-LDH und L-LDH in Lösungsform bedienen.

BEISPIEL 5 (1) Herstellung einer Säule, die immobilisierte L-Laatat oxidase enthält

Eine immobilisierte L-Lactatoxidase enthaltende Säule wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.

(2) Herstellung einer immobilisierte D-LDH und L-LDH ent haltenden Säule

Die obige Säule wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.

(3) Herstellung einer Wasserstoffperoxidelektrode

Diese Elektrode wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.

(4) Analysenvorrichtung

L-Milchsäure und D-Milchsäure wurden unter Verwendung der in Fig. 5 gezeigten Analysenvorrichtung vom Fluß-Typ analy siert. Eine Pufferlösung wird aus einem Puffertank (1") mit Hilfe einer Pumpe (2") zugeführt, während 1 µl einer Probe über einen Probenspender (3") in die Analysenvorrichtung ein gespritzt wird. Die eingespritzte Probe tritt durch eine Säule (5") mit immobilisierter D-LDH und L-LDH, wo eine Um wandlungsreaktion von D-Milchsäure und L-Milchsäure statt findet, wenn NAD zugegeben wird. Anschließend tritt die Probe durch eine Säule (6") mit immobilisierter L-LOD und die Ände rung im elektrischen Stromstärke-Wert wird mit Hilfe einer Wasserstoffperoxidelektrode (7") bestimmt. Die Säulen und die Elektrode befinden sich in einem auf eine konstante Tempera tur von 30°C gehaltenen Gefäß (4"). Die Änderung in der elek trischen Stromstärke an der Elektrode wird mit einem Detektor (8") gemessen. Die Signale können an einen PC (11") weiterge leitet werden.

In der Fig. 5 bezeichnen die Bezugszeichen (9"), (10"), (12"), (13") und (14") einen Computer mit einem Board, RS232C-Code, ein den Probenhalter steuerndes Signal, ein die Pumpe steuerndes Signal bzw. 11665 00070 552 001000280000000200012000285911155400040 0002004317958 00004 11546 einen Auslaß.

Die Pufferlösung hat einen pH von 7,0 und die folgende Zu sammensetzung: 100 mM Natriumphosphat, 50 mM Kaliumchlorid und 1 mM Natriumazid. Zur Pufferlösung werden 5 mM NAD gege ben, wenn es der Isomerumwandlungsreaktion bedarf. Die Fließ geschwindigkeit durch die Pumpe beträgt 0,6 ml/min.

(5) Analyse von Standardlösungen

Destilliertes Wasser, 1, 2 und 5 mM L-Milchsäure und 2, 5 und 10 mM D-Milchsäure wurden jeweils in die in (4) erwähnte Analysenvorrichtung (Fig. 5) eingespritzt und analysiert. Für jede Probe wurde die Analyse mit und ohne 5 mM NAD in jeder Pufferlösung durchgeführt. Wenn NAD zugegeben wird, findet eine Isomerumwandlungsreaktion statt. Die gemessenen elek trischen Stromstärke-Werte sind in Tabelle 11 angegeben, und lieferten die folgenden Arbeitskurven, in denen Y für den elektrischen Stromstärke-Wert (nA) und X für die Milchsäure konzentration (mM) in der Probe stehen.

Arbeitskurve 1 (für L-Milchsäure), ohne NAD

Y = 27,74 X + 0,204

Arbeitskurve 2 (für L-Milchsäure), mit NAD

Y = 22,04 X+ 0,064

Arbeitskurve 3 (für D-Milchsäure), mit NAD

Y = 6,13 X + 0,004

Tabelle 7

(6) Analyse von Mischungsproben

Mischungen von D-Milchsäure und L-Milchsäure wurden jeweis mit und ohne Zugabe von NAD unter Verwendung der in (4) er wähnten Analysenvorrichtung (Fig. 5) analysiert. Die erhal tenen elektrischen Stromstärke-Werte und die D-Milchsäure- und L-Milchsäure-Konzentrationen, die unter Verwendung der Arbeitskurven berechnet wurden, die durch Analyse der Stan dardlösungen erhalten wurden, sind in Tabelle 12 gezeigt. Die Milchsäurekonzentrationen in unbekannten Proben wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 berechnet.

TABELLE 12

BEISPIEL 6

Als ein Beispiel für Aspekt II der vorliegenden Erfindung wurde die folgende Analyse unter Verwendung der Vorrichtung (I) (Fig. 4), einer Säule und einer Elektrode, wie sie in Beispiel 1 (1), (2) und (4) hergestellt wurden, durchgeführt.

(1) Analyse von L-Milchsäure und D-Milchsäure

L-Milchsäure, D-Milchsäure und L-Milchsäure/D-Milchsäure- Mischungen wurden in zwei Verfahren analysiert, nämlich (1) in Form von Proben als solchen und (2) in Form von Reaktions mischungen nach Behandlung mit D-LDH, L-LDH und NAD zwecks Erreichung eines 1 : 1-Gleichgewichts zwischen D-Milchsäure und L-Milchsäure. Um geeignete Racemisierungsbedingungen zu er halten, wurden 0,2 ml einer Reagenzlösung mit einem pH von 7,5, die 50 Einheiten/ml L-LDH, 20 Einheiten/ml D-LDH, 10 mM NAD und 200 mM Natriumphosphat enthielt, zu jeweils 0,2 ml einer Probe gegeben und die Mischungen wurden 60 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Probe oder die Standardlö sungen wurden in 5 µl-Portionen eingespritzt und die elek trischen Stromstärke-Werte wurden erhalten. Die eingesetzten Standardlösungen waren 1, 2 und 5 mM L-Milchsäure und destil liertes Wasser als Kontrollprobe. Eine Arbeitskurve wurde aus den mit den Standardlösungen erhaltenen Daten erhalten. Und die Stromstärke-Werte für die Proben wurden durch Berechnung in L-Milchsäure-Konzentrationen (mM) umgewandelt.

Die erhaltene Arbeitskurve ist, ausgedrückt in Form einer Gleichung, als Arbeitskurve A gezeigt, in der X die Milch säurekonzentration in der Probe und Y der Stromstärken-Wert ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 zusammengefaßt. Arbeitskurve A (Arbeitskurve für L-Milchsäure)

Y = 44,87 X + 0,59.

TABELLE 13

In Tabelle 13 sind die in den Spalten (1) gezeigten Werte die Ergebnisse der L-Milchsäure-Analyse, ausgedrückt als Strom stärken-Wert und L-Milchsäure-Konzentration. Die Werte in Spalte (2) sind die Stromstärke-Werte, wie sie durch L-Milch säure nach der Racemisierungsreaktion hervorgerufen wurden, und die entsprechenden L-Milchsäure-Analysenwerte. Die D- Milchsäurekonzentrationen wurden durch Verdoppeln der L- Milchsäurekonzentration in jeder Reaktionsmischung (da jede Probe auf ½ verdünnt wurde), weiteres Verdoppeln des resul tierenden Produkts (weil der L-Milchsäure-Gehalt nach der Racemisierung die Hälfte des gesamten Milchsäuregehalts ist), um den Gesamt-Milchsäure-Gehalt zu erhalten, und Abziehen des L-Milchsäuregehalts in der ursprünglichen Probe von diesem Gesamt-Milchsäure-Gehalt berechnet.

(2) Analyse von L-Milchsäure und Brenztraubensäure

L-Milchsäure, Brenztraubensäure und Mischungen von L-Milch säure und Brenztraubensäure wurden in zwei Verfahren analy siert, nämlich (1) in Form von Proben als solchen und (2) nach Umwandlung von Brenztraubensäure in L-Milchsäure durch Behandlung mit L-LDH und NADH in einer Lösung. Die Reaktions bedingungen waren wie folgt: 0,2 ml einer Reagenzlösung mit einem pH von 7,0, die zwei Einheiten pro ml L-LDH, 10 mM NADH und 200 mM Natriumphosphat enthielt, wurden zu 0,2 ml einer jeden Probe gegeben und die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Proben oder Standardlösun gen wurden in 5 µl-Portionen eingespritzt und die elektri schen Stromstärke-Werte wurden erhalten. Als Standardlösungen wurde 1, 2 und 5 mM L-Milchsäure und destilliertes Wasser als Kontrollprobe eingesetzt. Eine Arbeitskurve wurde unter Ver wendung der Standardlösungen erhalten und die Stromstärke- Werte für die Proben wurden durch Berechnung in L-Lactat- Konzentrationen (mM) umgewandelt.

Die erhaltene Arbeitskurve ist, ausgedrückt als Gleichung, unten als Arbeitskurve B gezeigt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 zusammengefaßt.

Arbeitskurve B (Arbeitskurve für L-Milchsäure)

Y = 41,21 X + 0,53.

TABELLE 14

In Tabelle 14 sind die in den Spalten (I) gezeigten Ergeb nisse die Stromstärke-Werte und die L-Milchsäure-Analysenwer te, wie sie durch Analysieren der Proben bezüglich L-Milch säure erhalten wurden, und die in den Spalten (2) gezeigten Daten sind die L-Milchsäure-Analysenwerte, die nach der Um wandlung von Brenztraubensäure in L-Milchsäure erhalten wur den. Um die Brenztraubensäurekonzentrationen zu erhalten, wurden die L-Milchsäure-Konzentrationen nach der Reaktion verdoppelt (weil jede Probe auf die Hälfte verdünnt worden war) und die L-Milchsäure-Analysenwerte für die entsprechen den Proben wurden von den verdoppelten Ergebnissen abgezogen. In der Arbeitskurve steht Y für den Stromstärken-Wert (nA) und X für die Milchsäure-Konzentration (mM) in der Probe.

BEISPIEL 7 (1) Verfahren zur Herstellung einer Säule, die immobili sierte LOD enthält

Eine Säule, die immobilisierte LOD enthielt, wurde auf die selbe Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.

(2) Verfahren zur Herstellung einer Wasserstoffperoxidelek trode

Eine Wasserstoffperoxidelektrode wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.

(3) Analysenvorrichtung (I)

Es wurde dieselbe L-Milchsäure-Analysenvorrichtung wie in Beispiel 1 (4) (Fig. 4) verwendet.

(4) Analyse von tatsächlichen Proben

Sieben im Handel erhältliche Milchsäuregetränke wurden je weils nach 20- bis 40-facher Verdünnung denselben Analysen verfahren wie in Beispiel 6 unterzogen. Die L-Milchsäure- Analyse wurde (1) mit der verdünnten Probe als solcher, (2) nach Zugabe von 0,2 ml einer Reagenzlösung mit einem pH von 7,5, die 50 Einheiten pro ml L-LDH, 20 Einheiten/ml D-LDH, 10 mM NAD und 200 mM Natriumphosphat enthielt, zu 0,2 ml einer jeden Verdünnung, gefolgt von 60-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur, und (3) nach Zugabe von 0,2 ml einer Reagenz lösung mit einem pH von 7,0, die zwei Einheiten pro ml L- LDH, 10 mM NADH und 200 mM Natriumphosphat enthielt, zu 0,2 ml einer jeden verdünnten Probe, gefolgt von 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur, durchgeführt. Die Probe und die Standardlösungen wurden in 5 µl-Portionen eingespritzt und die elektrischen Stromstärke-Werte wurden erhalten. Als Standardlösungen wurden 1, 2 und 5 mM L-Milchsäure und de stilliertes Wasser als Kontrollprobe verwendet. Auf der Basis der Daten für die Standardlösungen wurde eine Arbeitskurve erhalten und die Stromstärke-Werte für die Proben wurden durch Berechnung in L-Milchsäurekonzentrationen (mM) umgewan delt. Die so erhaltenen L-Milchsäure-, D-Milchsäure- und Brenztraubensäure-Konzentrationen (%) in den Proben sind in Tabelle 15 angegeben.

TABELLE 15

Weiter wurde jede Probe zentrifugiert (20000 U/min. 20 Minu ten) und dann unter Verwendung des D/L-Milchsäure-Analysensy stems des F-Testsatzes einer Analyse unterzogen. Wie unten ausgedrückt als Beziehung gezeigt, waren die so erhaltenen Werte in guter Übereinstimmung mit den oben durch das erfin dungsgemäße Verfahren erhaltenen Werten.

Das Analysenverfahren unter Verwendung des F-Testsatzes war wie folgt:

NAD, Glutaminsäure und Glutaminsäure-Brenztraubensäure-Trans aminase wurden jeder Probe zugegeben und nach einem Mischen wurde die Absorption bei 340 nm unter Verwendung eines Spek trophotometers gemessen. Diese Daten wurden als Kontrolldaten verwendet. Weiter wurde D-LDH mit der obigen Mischung ge mischt und nach 20 Minuten Stehenlassen wurde auf dieselbe Weise eine Messung der Absorption durchgeführt. Die D-Milch säure-Konzentration in der Probe wurde aus der von D-LDH her vorgerufenen Änderung in der Absorption berechnet.

Für die Analyse von L-Milchsäure wurde L-LDH mit der obigen Mischung gemischt und nach 20-minütigem Stehenlassen wurde eine Messung der Absorption durchgeführt. Die L-Milchsäure konzentration in der Probe wurde aus der durch L-LDH hervor gerufenen Änderung in der Absorption berechnet.
L-Milchsäure: Y = 1,03 X + 0,01 (Korrelationskoeffizient 0,999)
D-Milchsäure: Y = 1,02 X - 0,00 (Korrelationskoeffizient 1,000)

In den obigen Gleichungen steht Y für das Analysenergebnis, das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wurde, und X steht für das Analysenergebnis, das mit dem F-Testsatz erhalten wurde.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch Trübheit oder fär bendes Material nicht beeinflußt und erfordert deshalb keine Vorbehandlung wie z. B. Zentrifugieren. Die Zahl der einzuset zenden Reagenzien ist gering und die Zahl der Pipettieropera tionen ist ebenfalls gering und deshalb ist das Verfahren einfach. Während bei der Analyse von L-Milchsäure und D- Milchsäure durch das Verfahren mit dem F-Testsatz der Verdün nungsgrad der zu analysierenden Proben variiert werden muß, wenn die D : L-Verhältnisse große Unterschiede zeigen, kann das erfindungsgemäße Verfahren, indem es L-Milchsäure bestimmt, denselben Empfindlichkeitsgrad in der Gesamt-Milchsäure-Be stimmung z. B. bei einer Konzentration, die viermal höher ist, zeigen und kann somit präzise Analysenergebnisse bei der Analyse von unbekannten Proben mit einer geringeren Anzahl von Wiederholungen liefern.

Claims

1. Verfahren zur Analyse der optischen L- und D-Isomeren, wie sie in einer Probe vorliegen, dadurch gekennzeich net, daß es umfaßt:

1. die Analyse des optischen L- (oder D-)Isomeren, wie es in der Probe vorliegt; und
2. das Veranlassen der Umwandlung des optischen L- Isomeren und optischen D-Isomeren in der Probe in Anwesenheit einer L-Dehydrogenase und einer D- Dehydrogenase für die Isomeren und von oxidiertem Coenzym und die anschließende Analyse des optischen L- (oder D-)Isomeren nach der Umwandlung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse des L- (oder D-)Isomeren, wie es in der Probe vorliegt, die Oxidation des L- (oder D-)Isomeren unter Verwendung einer Oxidase für das L- (oder D-)- Isomere und die Bestimmung der aus der Reaktion, an der diese Oxidase beteiligt ist, resultierenden Änderung der Konzentration einer elektrochemisch aktiven Sub stanz umfaßt.

3. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 und 2, da durch gekennzeichnet, daß in Stufe (2) die Umwandlung des L-Isomeren und des D-Isomeren in der Probe in einem Reaktor durchgeführt wird, der eine immobilisierte L- Dehydrogenase und eine immobilisierte D-Dehydrogenase enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilisierung der D-Dehydrogenase und L-Dehy drogenase durch Umsetzung eines Trägers mit Hydroxyl gruppen mit einem Aminosilan-Reagenz zwecks Umwandlung der Hydroxylgruppen in Aminosilan-Gruppen, Umsetzung der Aminogruppen-Teile der auf der Oberfläche des Trä gers gebildeten Aminosilangruppen mit einem polyfunk tionellen Aldehyd, um den polyfunktionellen Aldehyd daran zu binden, und Binden der D-Dehydrogenase und L- Dehydrogenase an den polyfunktionellen Aldehyd durch geführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, in der die elektrochemisch aktive Substanz das erzeugte Wasserstoffperoxid oder der verbrauchte Sauerstoff ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Änderung der Konzentration des erzeugten Wasser stoffperoxids oder des verbrauchten Sauerstoffs durch ein amperometrisches Verfahren unter Verwendung einer Elektrode bestimmt wird.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (2) die Reaktion zwischen L- und D-Isomerem in einer Lösung durchgeführt wird, die L-Dehydrogenase und D-Dehydrogenase enthält.

8. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen L- und D- Isomeren L-Milchsäure und D-Milchsäure und die L-Dehy drogenase und D-Dehydrogenase L-Lactatdehydrogenase und D-Lactatdehydrogenase sind.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in Stufe (2) umfaßt: (A) das Inkontaktbringen von Probe und oxidiertem Coenzym mit einem Enzymsystem, das eine D-Dehydrogenase und eine L-Dehydrogenase enthält, um dadurch eine Umwandlung des D-Isomeren und L-Isome ren, wie sie in der Probe vorliegen, zu veranlassen, und (B) den elektrochemischen Nachweis der Änderung in der Konzentration einer elektrochemisch aktiven Sub stanz als Ergebnis der Oxidation des L- (oder D-)Isome ren in der Probe durch die Einwirkung einer Oxidase für das L-(oder D-)Isomere, wobei das Verfahren die fol genden Stufen beinhaltet:

a) in (B) das Erstellen einer Arbeitskurve 1, die die Beziehung zwischen der Konzentration des L- (oder D-)Isomeren und dem Ausgangs-Wert bei der elektro chemischen Bestimmung unter Verwendung von Stan dardlösungen des L- (oder D-)Isomeren als Proben zeigt,
b) die Durchführung von (A) unter Verwendung von Stan dardlösungen des L- (oder D-)Isomeren als Proben und die anschließende Durchführung von (B), um dadurch eine Arbeitskurve 2 zu erhalten, die die Beziehung zwischen der Konzentration des L- (oder D-)Isomeren und dem Ausgangs-Wert bei der elektro chemischen Bestimmung zeigt;
c) die Durchführung von (A) unter Verwendung von Stan dardlösungen des D- (oder L-)Isomeren als Proben und die anschließende Durchführung von (B), um dadurch eine Arbeitskurve 3 zu erhalten, die die Beziehung zwischen der Konzentration des D- (oder L-)Isomeren und dem Ausgangs-Wert bei der elektro chemischen Bestimmung zeigt, anschließend
d) eine weitere Durchführung von (B) unter Verwendung der Analysenprobe, um einen Ausgangs-Wert 1 zu erhalten,
e) die Durchführung von (A) unter Verwendung der Ana lysenprobe und die anschließende Durchführung von (B), um einen Ausgangs-Wert 2 zu erhalten,

und die Berechnung des Gehalts der D- und L-Isomeren in der Analysenprobe auf der Basis der Ausgangs-Werte 1 und 2 und der Arbeitskurven 1, 2 und 3.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die D-Dehydrogenase und L-Dehydrogenase beide auf einem Träger immobilisiert und in einem Reaktor gepackt sind und für eine gewisse Zeitspanne die Zuführung des Trä gers so gestoppt oder die Trägerfließgeschwindigkeit so vermindert wird, daß das oxidierte Coenzym und die Probe in Berührung mit den immobilisierten Dehydrogena sen bleiben.

11. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß zwei parallele Wege, von denen jeder die Oxidase für L-(oder D-)Isomer, die in einer immobilisierten Form vorliegt, und eine Elektrode umfassen, verwendet werden, und daß in einem der Wege das ursprünglich in der Probe vorhandene L- (oder D-) Isomere unter Verwendung der immobilisierten Oxidase für das L- (oder D-)Isomere analysiert wird und daß im anderen Weg ein immobilisiertes Enzym, das die D-Dehy drogenase und L-Dehydrogenase enthält, an einer Posi tion stromaufwärts von der immobilisierten Oxidase für das L- (oder D-)Isomere vorgesehen wird und das L- (oder D-)Isomere nach der Umwandlung des D-Isomeren und L-Isomeren, wie sie durch die D-Dehydrogenase und L- Dehydrogenase verursacht wurde, analysiert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Durchführung von zwei Analysen, eine in Anwe senheit von oxidiertem Coenzym und die andere in Ab wesenheit von oxidiertem Coenzym, durch Inkontaktbrin gen einer Probe mit einer D-Dehydrogenase und einer L-Dehydrogenase, jeweils in immobilisierter Form, um faßt, wobei die Analysen unter Verwendung einer Vor richtung zur Analyse der optischen L- und D-Isomeren durch die Flußtechnik erfolgen, welche umfaßt:

a) Mittel zum Einspritzen der Probe in einen Träger, der von stromaufwärts aus zugeführt wird;
b) einen Reaktor, der die Dehydrogenase für das D- Isomere und die Dehydrogenase für das L-Isomere jeweils in immobilisierter Form enthält; und
c) eine immobilisierte Oxidase für das L- (oder D-)Isomere und eine Elektrode zum Nachweis der Änderung der Konzentration einer elektrochemisch aktiven Substanz als Ergebnis der Oxidation des L- (oder D-)Isomeren in der Probe durch die Wir kung der immobilisierten Oxidase für das L- (oder D-)Isomere,

wobei (iii) stromabwärts von (ii) angeordnet ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner die Analyse des Oxidationsprodukts umfaßt, das von einem optischen L- (oder D-)Isomeren abgeleitet ist, wie es in der Probe vorkommt, dadurch gekennzeichnet, daß das Ver fahren zusätzlich zu Stufe (I) und (2) umfaßt:

1. das Inkontaktbringen der Probe mit einer L-Dehy drogenase (oder D-Dehydrogenase) in Anwesenheit von reduziertem Coenzym, um dadurch das Oxida tionsprodukt in das L- (oder D-)Isomere umzu wandeln, und anschließende Analyse des L- (oder D-)Isomeren.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse des L- (oder D-)Tsomeren die Oxidation des L- (oder D-)Isomeren unter Verwendung einer Oxidase für das L-Isomere (oder einer Oxidase für das D-Isomere) und die Bestimmung der Änderung in der Konzentration einer elektrochemisch aktiven Substanz als Ergebnis der Reaktion, an der diese Oxidase beteiligt ist, umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrochemisch aktive Substanz Wasserstoffperoxid ist, dessen Konzentration nach der die Oxidase beinhal tenden Reaktion ansteigt, oder Sauerstoff ist, dessen Konzentration nach dieser Reaktion abnimmt.

16. Vorrichtung zur Analyse der optischen L- und D-Isome ren durch die Flußtechnik, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt:

a) Mittel zum Einspritzen der Probe in einen Träger, der von stromaufwärts aus zugeführt wird;
b) einen Reaktor, der die Dehydrogenase für das D- Isomere und die Dehydrogenase für das L-Isomere jeweils in immobilisierter Form enthält; und
c) eine immobilisierte Oxidase für das L- (oder D-)Isomere und eine Elektrode zum Nachweis der Änderung der Konzentration einer elektrochemisch aktiven Substanz als Ergebnis der Oxidation des L- (oder D-)Isomeren in der Probe durch die Wir kung der immobilisierten Oxidase für das L- (oder D-)Isomere;

wobei (iii) stromabwärts von (ii) angeordnet ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiter Mittel zum Abstoppen der Zuführung des Trägers oder zur Verminderung der Fließgeschwindigkeit des Trägers in einem solchen Zustand, daß der Träger, der die Probe enthält, in Kontakt mit der jeweils in immobilisierter Form vorliegenden D-Dehydrogenase und L-Dehydrogenase bleibt, umfaßt.

18. Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiter stromaufwärts vom Reaktor eine immobilisierte Oxidase für L- (oder D-)Isomer und eine Elektrode für den Nachweis der Ände rung in der Konzentration einer elektrochemisch akti ven Substanz als Ergebnis der Oxidation von L- (oder D-)Isomer in der Probe durch das Einwirken der immobi lisierten Oxidase auf das L- (oder D-)Isomere aufweist.

19. Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die L- und D-Isomeren L- Milchsäure und D-Milchsäure sind und daß die L-Dehydro genase und die D-Dehydrogenase L-Lactatdehydrogenase und D-Lactatdehydrogenase sind.

20. Testsatz, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:

1. ein Reagenz, das L-Dehydrogenase und D-Dehydroge nase von optischen Isomeren und oxidiertes Coen zym zur Veranlassung der Umwandlung von L-Isomer und D-Isomer umfaßt, und/oder
2. ein Reagenz, das L-Dehydrogenase (oder D-Dehydro genase) der optischen Isomeren und reduziertes Coenzym zur Umwandlung einer oxidierten Form des optischen Isomeren in einer Probe in L- (oder D-)Isomer umfaßt.