DE4313933A1

DE4313933A1 - Funktionelle Rezeptorexpression in Dictyostelium discoideum

Info

Publication number: DE4313933A1
Application number: DE19934313933
Authority: DE
Inventors: Theo Prof Dr Dingermann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-04-28
Filing date: 1993-04-28
Publication date: 1994-11-03

Description

Die Erfindung betrifft transgene Dictyostelium discoideum Zellen, die als mikrobiologisches System für die Testung von Rezeptoragonisten und -antagonisten eingesetzt werden können, sowie ein Verfahren zur Herstellung derartiger Systeme.

In einem mikrobiologisches System für die Testung von Rezeptoragonisten und -antagonisten wird ein mikrobiologischer Stamm verwendet, der durch molekulartechnische Methoden so verändert wurde, daß er einen menschlichen Rezeptor exprimiert und dieses Protein auf seiner Oberfläche exponiert. Über diesen Rezeptor werden entsprechende Agonisten oder Antagonisten erkannt und gebunden. Durch Kopplung mit eigenen, intrazellulär lokalisierten O-Proteinen ist der transgene Organismus in der Lage, durch einen physiologischen Reiz - hier durch Chemotaxis - zu reagieren und so die Bindung eines Rezeptoragonisten oder - durch Kompetition mit einem Rezeptoragonisten - die Bindung eines Rezeptorantagonisten erkennbar zu machen.

Bisher können Rezeptoren physiologisch nur an Gewebepräparaten charakterisiert werden. Diese Technologie ist technisch kompliziert und erfordert den Einsatz sehr vieler Versuchstiere. Für ein Massenscreening eignet sich diese Methode nicht. Darüber hinaus sind natürliche Gewebe meist mit mehreren Rezeptorsubtypen ausgestattet, was die eindeutige Interpretation der erhaltenen physiologischen Daten weiter erschwert.

Menschliche Muskarinrezeptoren werden von 5 verschiedenen Genen (m1, m2, m3, m4, m5) kodiert. Vier der entsprechenden Genprodukte (M1, M2, M3, M4) wurden bisher pharmakologisch charakterisiert. Physiologisch koppeln die M2- und M4-Rezeptoren an intrazellulär lokalisierte G_i Proteine, die die Adenylatzyklase inhibieren. Dahingegen koppeln die M1-, M3- und M5-Rezeptoren an ein G-Protein, das die Phospholipase C stimuliert.

Die Expression von Muskarinrezeptorgenen in menschlichen Zellinien oder in Hefe ist zwar möglich, eine phänotypische Antwort wird jedoch nicht erhalten, so daß entweder nur Bindungsaffinitäten von Rezeptoragonisten oder -anatagonisten bestimmt werden können oder Rezeptoragonisten mit Hilfe komplexer biochemischer Methoden gemessen werden können. Ein mikrobiologisches Testsystem, das phänotypisch auf die Bindung eines Rezeptoragonisten reagiert, ist besonders auch unter dem zur Zeit heftig diskutierten Aspekt des Tierschutzes anstrebenswert.

Der zelluläre Schleimpilz Dictyostelium discoideum besitzt einen Rezeptor, der strukturell zur gleichen Klasse wie die menschlichen Muskarinrezeptoren zählt. Diese Rezeptoren sind nämlich dadurch gekennzeichnet, daß sie die Zytoplasmamembran siebenmal durchspannen. Der N- Terminus befindet sich auf der extrazellulären Seite, während sich der C-Terminus auf der zytoplasmatischen Seite befindet. Der D. discoideum Rezeptor (cAMP-Rezeptor) erkennt extrazelluläres zyklisches AMP (cAMP). Dies gestattet es den Zellen, auf cAMP chemotaktisch zu reagieren und sich so entlang eines cAMP-Gradienten zu bewegen.

Mit der Expression von Rezeptorgenen in Dictyostelium discoideum wäre es möglich, einen chemotaktischen Reiz auf den transgenen Organismus durch einen Rezeptoragonisten auszulösen. Als Konsequenz können positiv reagierende Zellen durch Aggregation phänotypisch erkannt werden. In Analogie können Rezeptorantagonisten dadurch erkannt werden, daß sie die chemotaktische Antwort auf einen gleichzeitig vorhandenen Rezeptoragonisten inhibieren.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten mit Hilfe eines einfachen mikrobiologischen Testsystems durch eine physiologische Antwort des Mikroorganismus nachzuweisen.

Die Aufgabe wurde gelöst durch Konstruktion eines transgenen Dictyostelium discoideum Stammes, umfassend

(a) einen authentischen menschlichen M2-Rezeptor,
(b) eine modifizierte m2 cDNA, deren Transkription von einem Aktin-Promotor aus Dictyostelium discoideum kontrolliert wird,
(c) ein Resistenzgen.

In einer bevorzugten Ausführung betrifft die Erfindung einen transgenen Dictyostelium discoideum Stamm, der in seiner Membran einen authentischen, menschlichen M2 Rezeptor trägt.

Bei der m2 cDNA handelt es sich um eine modifizierte cDNA für das menschliche m2-Gen. Die Modifikationen betreffen die Codons 1-8, wobei nur der für Dictyostelium discoideum typische Codon-Gebrauch angepaßt wurde, das Codierungspotential - und damit die Aminosäure sequenz - jedoch nicht verändert wurde. Damit trägt die cDNA auch die Information für ein Leaderpeptid, das für den Einbau des Proteins in die Membran verantwortlich ist. Diese Information wird auch in Dictyostelium discoideum erkannt. Die Transkription der modifizierten m2 cDNA wird durch einen Aktin Promotor aus Dictyostelium discoideum kontrolliert. Die Fusion zwischen Aktin Promotor und m2 cDNA liegt im Dictyostelium discoideum Genom in tandem-artiger Anordnung multipler Copien stabil integriert vor.

Schließlich gehört zu dem erfindungsgemäßen einfachen mikrobiologischen Testsystem zur Auf findung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten noch ein Resistenzgen, das vorzugsweise in einem Eukaryonten exprimierbar ist; bevorzugt wird ein Neomycin (neo)- Resistenzgen. Das gesamte erfindungsgemäße einfache mikrobiologische Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten liegt auf einem Plasmid inseriert vor.

Die Erfindung umfaßt auch Dictyostelium Zellen, in die auch andere G-Protein gekoppelte heterologe Rezeptoren integriert werden können. Das prinzipielle Testverfahren entspricht dem Verfahren auf dem das Auffinden und Charakterisieren von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten mit Hilfe des erfindungsgemäßen einfachen mikrobiologischen Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten basiert.

Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines einfachen mikrobiologischen Testsystems zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten.

Das erfindungsgemäße Verfahren geht so vonstatten, daß eine cDNA an ihrem 5′-Ende so verändert wird, daß einerseits innerhalb der ersten 8 Aminosäuren ein optimaler Codongebrauch für Dictyostelium discoideum gewährleistet ist, andererseits aber der Informationsgehalt - und damit die Aminosäuresequenz - authentisch erhalten bleibt. Diese modifizierte cDNA wird dann hinter einen Aktin Promotor aus Dictyostelium discoideum kloniert. Der verwendete Vektor enthält außerdem noch ein Neo-Resistenzgen, dessen Expression ebenfalls von einem Aktin Promotor aus Dictyostelium discoideum kontrolliert wird. In einem weiteren Verfahrensschritt wird dann das Plasmid durch Transformation stabil in das Genom einer Dictyostelium discoideum Zelle integriert.

Das erfindungsgemäße einfache mikrobiologische Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten kann unter dem Aspekt alternativer Testsysteme zu Tierversuchen zum Massenscreening verwendet werden. Ein solches System ist nämlich in der Lage, nach erfolgter Rezeptor-spezifischer Signalperzeption das Signal Organismus-spezifisch zu transduzieren. Der Effekt der Signaltransduktion kann durch Dictyostelium discoideum-spezifische Chemotaxis - ausgelöst durch ein unphysiologisches Signal - beobachtet werden. Ferner läßt sich das erfindungsgemäße Testsystem auch im Rahmen automatisierter Verfahren verwenden.

Es wurde hier zunächst ein Muskarin m2-Rezeptorgen in Dictyostelium discoideum zur Expression gebracht, der den transgenen Organismus veranlaßt, z. B. auf den Rezeptoragonisten Carbachol chemotaktisch in analoger Weise zu reagieren, wie dies Dictyostelium discoideum physiologischer Weise auf cAMP tut.

Das verwendete Plasmid, das sowohl den Aktin Promotor zur Kontrolle der m2 cDNA als auch das in Dictyostelium discoideum exprimierbare neo-Resistenzgen enthält, ist das Plasmid pDneo2 (Mol. Cell Biol. 6, 3973).

In den Transformanden werden sowohl das m2-Rezeptorgen als auch das neo-Resistenzgen unter Aktin-6-Promotorkontrolle konstitutiv exprimiert. Das ebenfalls in den Zellen natürlicherweise vorhandene cAMP-Rezeptorgen wird hingegen während des Wachstums der Zellen kaum exprimiert. Durch Stimulierung der Transformanden z. B. mit dem nicht selektiven M2- spezifischen Agonisten Carbachol werden die Zellen veranlaßt, entlang dem Carbachol- Gradienten zu aggregieren. In gleicher Weise würden nicht-transformierte - aber auch transformierte - Zellen reagieren, wenn sie einem cAMP Gradienten ausgesetzt würden. Demzufolge koppelt der durch Carbachol stimulierte heterologe Rezeptor ein homologes - intrazellulär lokalisiertes - G-Protein, wodurch das extrazelluläre Signal physiologisch weitergeleitet wird und phänotypisch durch Aggregation erkannt werden kann.

Kurze Beschreibung der Figuren:

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pDNeo2.hm2.

Dieses Plasmid enthält eine an ihrem 5′-Ende modifizierte cDNA (hm2) für den menschlichen M2 Rezeptor integriert hinter dem Aktin-6-Promotor (A6P) aus Dictyostelium discoideum. Die Termination der Transkription der A6P::hm2-Fusion erfolgt an dem entsprechenden Signal des Actih-8-Gens (A8T) aus Dictyostelium discoideum. Ferner trägt das Plasmid den Selektionsmarker für die Dictyostelium Transformation. Dieser Marker ist das bakterielle Neomycin-Resistenzgen (Neo®) aus dem Transposon Tn903, das in Dictyostelium discoideum unter Actin-15-Promotor- (A15P) und Terminator- (A15T) -Kontrolle transkribiert wird. Das Produkt, die Neomycinphosphotransferase, verleiht den Transformanden Resistenz gegenüber dem Neomycinanalogen G418.

Fig. 2 zeigt das Ergebnis eines Rezeptortests.

In (A) sind transfomierte Dictyostelium discoideum Zellen ohne chemischen Reiz dargestellt. In der Mitte der Kulturschale befindet sich ein Agarblock (Durchmesser ca. 0,5 cm) ohne weitere Zusätze.

(B) zeigt das Ergebnis einer ähnlichen Zellpopulation wie in (A) nach 30 Minuten, wobei die Zellen durch Carbachol chemotaktisch angelockt wurden, das sich in einer Konzentration von 100 µM in einem Agarblock (Durchmesser ca. 0,5 cm) im Zentrum einer Petrischale befand.
(C) zeigt das Ergebnis einer ähnlichen Zellpopulation wie in (A) und (B) nach 30 Minuten, wobei die Zellen durch cAMP chemotaktisch angelockt wurden, das sich in einer Konzentration von 10 µM in einem Agarblock (Durchmesser ca. 0,5 cm) im Zentrum einer Petrischale befand.

Ein solches System hat folgende Vorteile:

- Das System gestattet es, Rezeptoragonisten und -antagonisten in einem mikrobiologischen Testsystem zu detektieren.
- Die Detektion erfolgt über eine physiologische Reaktion, die sich dahingehend ergibt, daß die Zellen entlang eines Gradienten des Rezeptoragonisten chemotaktisch angelockt werden und aggregieren.
- Das System kann im Massenscreening als effiziente Alternative zu komplexen Tierversuchen eingesetzt werden.

Beispiele Beispiel 1 Organismen, Medien und Dictyostelium discoideum-Transformation

Der axenisch wachsende Dictyostelium discoideum Stamm Ax-2 wurde in HL-5 Medium (Biochem. J. 119, 175) bei 22°C gezüchtet Zellen, die zur Transformation eingesetzt werden sollten wurden in Morpholinäthansulfonsäure-haltigem HL-5 Medium gezüchtet (Mol. Cell. Biol. 4, 2890). Die Dictyostelium discoideum Transformation erfolgte wie publiziert (Gene 59, 99; Gene 39, 155; Mol. Cell. Biol. 4, 2890). Transformanden wurden in Gegenwart von Klebsiella aerogenes rekloniert (DNA 8, 193; Gene 85, 353). Die zur Transformation eingesetzte Plasmid- DNA lag in Transformanden stabil ins Genom integriert und 10 bis 100-fach amplifiziert vor.

Beispiel 2

Die physikalische Karte des Plasmids pDNeo2.hm2 ist in Fig. 1 dargestellt. Die cDNA des menschlichen M2-Rezeptors wurde durch PCR aus dem Plasmid pcD.hm2 aufamplifiziert (Science 237, 527). Dabei wurden folgende Primer verwendet: A) 5′-Primer: 5′- GAGAATTTCAAAATGAATAATTCAACTAACTCATCT-3′;B) 3′-Primer: 5′- CCTTCTAGATTTTTCAAAG-3′. Durch Mißpaarung im 5′-Primer an den Positionen 7, 8, 20, 26 und 32 wurden die Codons innerhalb der ersten 8 Aminosäuren an den Codon-Gebrauch von Dictyostelium discoideum angepaßt. Ferner wurde durch die Sequenz des Primers am unmittelbaren 5′-Ende der aufamplifizierten cDNA eine EcoRI-Restriktionsschnittstelle eingeführt. Durch die Sequenz des 3′-Primers wurde am 3′-Ende der aufamplifizierten cDNA eine XbaI-Restriktionsschnittstelle eingeführt.

Die durch PCR aufamplifizierte cDNA wurde zunächst mit EcoRI, dann mit XbaI geschnitten. Das resultierende Fragment wurde in den Vektor pATIII.2 (Appl. Mikobiol. 35, 496) ligiert, der durch Hydrolyse mit EcoRI und XbaI vorbereitet war. Das Plasmid pATIII.2 ist eine Variante des Plasmids pDNeo2 (Mol. Cell. Biol. 6, 3973). Dieses Plasmid trägt ein Neomycin-Restistenzgen, das in Dictyostelium discoideum unter der Kontrolle des homologen Aktin-15-Promoters exprimiert wird und den Transformanden eine Resistenz gegen das Neomycin-Analoge 0418 verleiht.

Beispiel 3 Test auf Rezeptoragonist

Suspensionen transgener Dictyostelium discoideum Zellen wurden in einer Konzentration von ca. 1 × 10⁵ Zellen/ml HL-5 Medium in Petrischalen (Durchmesser 12cm) ausgebracht. Nach 3 Stunden wurden ins Zentrum der Petrischalen Agarblöcke (Durchmesser ca. 0,5 cm) gelegt, die keine weiteren Zusätze (A), Carbachol in einer Konzentration von 100 µM (B) oder cAMP in einer Konzentration von 10 µM (C) enthielten.

Nach 30 Minuten war das Ergebnis wie in Fig. 2 dokumentiert. In der Negativkontrolle (A) hatte sich die Verteilung der Zellen während Inkubationszeitraums nicht signifikant verändert. Durch Carbachol werden die transgenen Dictyostelium discoideum Zellen chemotaktisch angelockt und konzentrieren sich am Rand des Agar-Blocks, der das Chemoattraktant in einer Konzentration von 100 µM enthält. Ein ähnliches Resultat wird in der Positivkontrolle erhalten, wo Zellen physiologischer Weise von cAMP (10 µM) durch den homologen cAMP-Rezeptor chemotaktisch angelockt werden und sich ebenfalls am Rand des Agar-Blocks konzentrieren (C).

Claims

1. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten, umfassend

(a) ein authentischer menschlicher Rezeptor,

eine an ihrem 5′-Ende modifizierte cDNA für ein Rezeptorgen, die in Dictyostelium discoideum expimierbar ist,
ein Resistenzgen, das in Dictyostelium discoideum exprimierbar ist.

2. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA für ein menschliches Rezeptorgen codiert.

3. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA für ein menschliches Rezeptorgens in ihren ersten 8 Codons dem Codongebrauch von Dictyostelium discoideum angepaßt ist.

4. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das die cDNA des Rezeptorgens ein Leaderpeptid trägt, das in Dictyostelium discoideum erkannt wird.

5. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese des Rezeptors unter der Transkriptionskontrolle des Aktin 6-Promotors aus Dictyostelium discoideum gebildet wird.

6. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktin-6-Promotor:Rezeptorgen-Fusion stabil in Dictyostelium discoideum integriert ist.

7. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA für den menschlichen M2-Rezeptor kodiert.

8. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß von der modifizierten cDNA ein authentischer, humaner M2-Rezeptor gebildet wird.

9. Plasmid pDNeo2.hm2 (Fig. 1).

10. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pDNeo2.hm2 stabil ins Dictyostelium discoideum Genom integriert ist.

11. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 10, dadurch kennzeichnet, daß der authentische M2-Rezeptor von entsprechenden Agonisten oder Antagonisten erkannt wird.

12. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der im heterologen System Dictyostelium discoideum gebildete Rezeptor/Agonist-Komplex eine für Dictyostelium discoideum homologe Signaltransduktion auslöst.

13. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sich die durch den Rezeptor/Agonist-Komplex ausgelöste homologe Signaltransduktion durch Chemotaxis äußert, wobei die transgenen Zellen entlang eines Gradienten gebildet durch den Rezeptoragonisten chemotaktisch angelockt werden.

14. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß Rezeptorantagonisten mit einem Rezeptoragonisten um die Bindung am Rezeptor konkurrieren und damit die Signaltransduktionseffektivität des Rezeptoragonisten schwächen.