DE4243375C1 - Bestimmungsverfahren zur Bestimmung von Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein immunologisches Bestimmungsver­ fahren zur Bestimmung von Antikörpern in biologischen Flüs­ sigkeiten, insbesondere von Autoantikörpern, deren Nachweis die Diagnose einer Autoimmunerkrankung ermöglicht.

Immunologische Bestimmungsverfahren spielen in zahlreichen Varianten eine sehr wesentliche Rolle in der medizinischen Diagnostik. Neben derartigen Bestimmungsverfahren, die auf die qualitative und/oder quantitative Bestimmung von Antige­ nen oder Haptenen, z. B. Hormonen, abzielen, gibt es auch zahlreiche derartige Bestimmungsverfahren zur Bestimmung von Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere humanen Seren.

Antikörper sind Eiweißkörper, die als Immunglobuline (Ig) bezeichnet werden und die vom Körper als Reaktion auf ein Antigen gebildet werden. Da Antigene normalerweise zahlrei­ che antigene Determinanten aufweisen, sind Antikörper poly­ klonaler Natur, stellen also eine Population von Eiweißkör­ pern mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften gegenüber dem Antigen, gegen das sie gerichtet sind, dar. Sie werden normalerweise gegen körperfremde Antigene gebildet, um den Körper gegen Substanzen zu schützen, die entsprechende antigene Determinanten aufweisen. Erkennt das Immunsystem des Körpers fälschlich bestimmte körpereigene Zellen oder Zellstrukturen als fremd, können aber auch Antikörper gegen Antigendeterminanten körpereigener Elemente gebildet werden. Derartige körpereigene Elemente werden dann als Autoantigene bezeichnet, und die gegen sie gebildeten Antikörper als Autoantikörper.

Bekannte Bestimmungsverfahren für Antikörper verwirklichen in der einen oder anderen Form verschiedene Grundprinzipien, von denen zwei beispielsweise in der US-PS B1 3 654 090 in Spalte 3, oben, schematisch dargestellt sind. Gemäß einer Variante, die dem klassischen Radioimmunoassay (RIA) entspricht, wird ein Unterschuß eines immobilisierten Antigens verwendet, und der zu untersuchenden Probe wird eine markierte Form des zu bestimmenden Antikörpers in einer bekannten Menge zugesetzt. Aus dem Grad der Bindung des markierten Antikörpers an das immobilisierte Antigen kann auf die Anwesenheit bzw. Konzentration des gesuchten Anti­ körpers zurückgeschlossen werden. Für diesen nach dem Kon­ kurrenzprinzip arbeitenden Test wird das Antigen in hoch­ reiner Form benötigt.

Gemäß einem zweiten Verfahrensprinzip (vgl. US-PS B1 36 54 090 a.a.O. oder Arbeitsbeschreibungen DYNOtest® anti-TPO oder LUMItest® anti-TPO der Anmelderin) wird so vorgegangen, daß eine bekannte Menge des zu bestimmenden Antikörpers oder eines geeigneten Derivats davon an einem festen Träger immobilisiert wird, und man läßt dann den in der zu unter­ suchenden Probe vorhandenen Antikörper und den immobilisier­ ten Antikörper um ein dem Reaktionssystem zugesetztes mar­ kiertes Antigen konkurrieren. Die Anwesenheit bzw. Menge des zu bestimmenden Antikörpers ergibt sich aus der Verminderung der Bindung des markierten Antigens an den immobilisierten Antikörper und damit an die feste Phase.

Bei der zuletzt genannten Art der Bestimmung wird eine markierte Form des zugehörigen hochreinen Antigens benötigt, und der zu bestimmende Antikörper und der immobilisierte Antikörper müssen in solchen Mengen vorliegen, daß es, gegebenenfalls unter Berücksichtigung nicht völlig identi­ scher Affinitäten zu dem markierten Antigen, zu einer wirk­ samen Konkurrenz zwischen dem immobilisierten Antikörper und dem Antikörper in der zu untersuchenden Probe kommen kann.

Gemäß einem weiteren Verfahrensprinzip (vgl. DE-OS 37 25 504 A1) wird in analoger Vorgehensweise zu dem für die Antigenbestimmung gut bekannten Sandwich-Test zur Antikörperbestimmung zuerst ein Überschuß eines Antigens, üblicherweise in immobilisierter Form, vorgelegt, durch das die Gesamtmenge des zu bestimmenden Antikörpers gebunden wird, und durch eine nachfolgende zweite immunologische Umsetzung mit einem zweiten markierten Binder gegen den im ersten Schritt gebundenen Antikörper wird dieser unter Ausbildung eines sandwichartigen Immunkom­ plexes markiert. Der zweite Binder ist dabei häufig ein anti-Antikörper (Doppelantikörperverfahren), oder es werden zur Markierung markierte unspezifische Binder wie die soge­ nannten Proteine A oder G eingesetzt, die aus Bakterien gewonnene Proteine darstellen, die unspezifisch an zahl­ reiche IgG-Antikörper binden. Die Selektivität des Verfah­ rens in dieser Variante wird durch die Selektivität der Bindung zwischen dem immobilisierten Antigen und dem zu bestimmenden Antikörper gegen dieses Antigen gewährleistet, während die Markierungsreaktion ziemlich unspezifisch ist.

Eine andere Variante der Antikörper-Bestimmung nach dem Sandwich-Prinzip (vgl. z. B. K. Beever et al., Clinical Chemistry, Vol. 35, No. 9, 1989, S. 1949-1954), die insbesondere für die Bestimmung von Autoantikörpern angewandt wird und die den nächsten Stand der Technik bildet, von dem in der vorliegenden Anmeldung ausgegangen wird, unterscheidet sich von der eben geschil­ derten dadurch, daß zur quantitativen Bindung (Extraktion aus der Probenlösung) des zu bestimmenden Antikörpers an­ stelle eines selektiven Antigens ein eher unspezifischer Binder für Antikörper verwendet wird und daß die Selektivi­ tät des Bestimmungsverfahrens dadurch gewährleistet wird, daß als Marker für die "richtigen" gebundenen Antikörper ein hochreines markiertes Antigen gegen letztere verwendet wird. Wie bei der weiter oben geschilderten "kompetitiven" Ver­ fahrensvariante konnte dieses Verfahrensprinzip bisher nur dann verwirklicht werden, wenn das fragliche Antigen in reiner Form verfügbar war.

Bei der Bestimmung von Antikörpern gegen körperfremde Anti­ gene lassen sich die Funktionsvoraussetzungen für die ver­ schiedenen Tests häufig ohne größere Schwierigkeiten erfül­ len. Die Antikörperkonzentrationen gegen körperfremde Anti­ gene sind im Normalfalle relativ niedrig, und die zugehöri­ gen Antigene oder auch Haptene können häufig in ausreichen­ den Mengen auf chemischem oder biotechnologischem Wege synthetisiert oder aus natürlichem Material isoliert und angereichert werden.

Beabsichtigt man jedoch, nach einem der geschilderten Ver­ fahrensprinzipien Autoantikörper zu bestimmen, so stößt man auf eine Reihe von teilweise erheblichen Schwierigkeiten, und zwar sowohl aufgrund der auftretenden Autoantikörperkon­ zentrationen als auch aufgrund der Natur der Autoantigene.

Die Bestimmung von Autoantikörpern ist für den Nachweis des Vorliegens einer Autoimmunerkrankung sehr wichtig, insbeson­ dere um die beobachteten Krankheitserscheinungen richtig zu interpretieren und evtl. schädliche Falschbehandlungen zu vermeiden. Bekannte Autoimmunerkrankungen, die teilweise außerordentlich schwerer Natur sind, sind beispielsweise die rheumatoide Arthritis, der Diabetes mellitus Typ 1, die Myasthenia gravis sowie einige mit der Schilddrüse assozi­ ierte Autoimmunerkrankungen, wie die Basedow-Hyperthyreose (auch Graves-Krankheit genannt), die Myxödemanämie und die Hashimoto Thyreoiditis. Als Autoantigene wirken im Falle der Schilddrüsen-Autoimmunerkrankungen je nach Art der Krankheit das Thyreoglobulin, der TSH-Rezeptor und/oder die Schild­ drüsenperoxidase (TPO), wobei letztere nach jüngeren Er­ kenntnissen mit dem sogenannten mikrosomalen Antigen iden­ tisch ist. Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend ins­ besondere im Hinblick auf die Bestimmung von Schilddrüsen­ autoantikörpern, insbesondere von Antikörpern gegen hTPO, beschrieben. Das der Erfindung zugrundeliegende neue Ver­ fahrensprinzip ist jedoch nicht auf diese speziellen Bestim­ mungen beschränkt, sondern kann nutzbringend auch zur Be­ stimmung anderer Autoantikörper angewandt werden. Es kann ferner im Einzelfall auch bei der Bestimmung anderer Anti­ körper Vorteile gegenüber den nach den bekannten Verfahrens­ prinzipien arbeitenden Bestimmungsverfahren bieten.

Zusammenfassungen des derzeitigen Erkenntnisstandes auf dem Gebiet der Schilddrüsen-Autoimmunerkrankungen finden sich in der wissenschaftlichen Literatur beispielsweise in dem Artikel von Marian Ludgate und Gilbert Vassart in: Autoimmu­ nity, 1990, Band 7, Seiten 201-211; ferner in dem Review von Jadwiga Furmaniak und Bernard Rees Smith in: Autoimmunity, 1990, Band 7, Seiten 63-80; sowie in dem Artikel von P.-M. Schumm-Draeger, H.J.C. Wenisch in: Akt. Endokr. Stoffw. 10 (1989), Seiten 9-102 (Sonderheft), wo ein Überblick über die Methoden zum Nachweis von Schilddrüsenautoantikörpern gege­ ben wird.

Die immundiagnostische Bestimmung von Schilddrüsen-Auto­ antikörpern bzw. Autoantikörpern generell unter sinngemäßer Anwendung eines der eingangs genannten Bestimmungstypen stößt auf die grundsätzliche Schwierigkeit, daß die Auto­ antikörper sehr häufig gegen Autoantigene gerichtet sind, die in der Zellmembran verankert sind und in der für die übliche Verfahrensdurchführung erforderlichen hohen Reinheit und Menge nur schwer erhältlich sind. Im Falle der mensch­ lichen Schilddrüsenperoxidase (hTPO), eines Enzyms, das als Autoantigen für die Hashimoto Thyreoiditis verantwortlich ist, handelt es sich beispielsweise um ein glycosyliertes Hämoprotein, das an die Schilddrüsenmembranen gebunden ist. Seine antigenen Eigenschaften, einschließlich der vorhande­ nen Typen von Epitopen auf seiner Oberfläche, sind beschrie­ ben in dem Artikel von J. Ruf et. al. in: Endocrinology, Vol. 125, No. 3, S. 1211 bis 1218. Um für die immundiagnosti­ schen Bestimmungsverfahren nach den bekannten Verfahrens­ prinzipien diese Schilddrüsenperoxidase in ausreichender Reinheit und Menge als Antigen zur Verfügung zu haben, muß die Schilddrüsenperoxidase auf proteolytischem Wege oder mit Hilfe von Detergenzien aus der Membran herausgelöst und über Immunadsorbenzien oder mittels konventioneller Chromatogra­ phiemethoden an unterschiedlichen Trennphasen gereinigt werden, z. B. mittels Gelfiltration, Ionenaustauschchromato­ graphie, Chromatographie über hydrophobe Interaktionen, Chromatographie über aromatische Interaktionen, Adsorptions­ chromatographie und Chromatographie über Concanavalin A. Diese Verfahren sind aufwendig und mit dem Risiko ungewoll­ ter Veränderungen des zu isolierenden Enzyms sowie starkem Materialverlust verbunden. Hochgereinigte native Schild­ drüsenperoxidase (TPO) ist daher nur in geringen Mengen und zu hohen Preisen verfügbar. Diese Tatsache wirkt sich direkt auf alle obigen Verfahrensvarianten aus, bei denen das Antigen in reiner Form entweder zur selektiven Bindung der zu bestimmenden Antikörper oder als selektiver Marker ver­ wendet werden muß. Als Alternative zur Isolierung der Schilddrüsenperoxidase aus Schilddrüsen wurden daher auch schon Versuche unternommen bzw. Verfahren entwickelt, nach denen TPO auf gentechnologischem Wege erzeugbar ist. Auch die so gewonnene TPO ist jedoch nur in begrenzten Mengen und zu hohen Preisen verfügbar, und die Identität des gentechno­ logisch gewonnenen Materials mit der natürlichen Schild­ drüsenperoxidase, insbesondere was die antigenen Eigenschaf­ ten angeht, ist nicht in jedem Falle gewährleistet.

Eine weitere Schwierigkeit ergibt sich ferner daraus, daß die antigenen Eigenschaften der TPO sehr stark durch chemi­ sche Einwirkungen beeinträchtigt werden können, insbesondere wenn dadurch die dreidimensionale Struktur verändert wird und/oder die Disulfidbrücken geöffnet werden (vgl. den genannten Artikel von J. Ruf). Um TPO jedoch als mar­ kiertes Antigen in dem klassischen Verfahren zur Antikör­ perbestimmung einsetzen zu können, muß an das TPO ein Mar­ kierungsanteil chemisch gebunden werden. Zusätzlich zu der Schwierigkeit der Gewinnung von reinem TPO besteht auf dieser Stufe das Risiko, daß durch die mit der Markierung verbundenen Umsetzungen die antigenen Eigenschaften der TPO so beeinflußt werden, daß sie nicht mehr der nativen TPO entspricht und daher auch als Antigen zum Nachweis von Auto­ antikörpern nur noch bedingt geeignet ist. Beispielsweise können die durch die Isolierung und/oder Markierung der TPO bewirkten Veränderungen dazu führen, daß nur noch ein Teil der polyklonalen TPO-Autoantikörper mit einer derartigen markierten TPO reagiert.

Um die mit der Isolierung und Markierung von TPO verbundenen Probleme wenigstens teilweise zu umgehen, wurde als Abwand­ lung der eingangs geschilderten Sandwich-Tests zur Antikör­ perbestimmung auch schon ein Test entwickelt, bei dem als immobilisiertes Antigen ein nicht hochgereinigt, sondern roh eingesetztes TPO (humanes mikrosomales Antigen) verwendet wird (Arbeitsbeschreibung PROMAK-Assay® der Anmelderin). Bei diesem Test besteht jedoch die Gefahr, daß in dem immobilisierten rohen TPO noch andere Substanzen mit antigenen Eigenschaften vorhanden sind, die zu einer Immobilisierung anderer als der gesuchten Antikörper führen, und daß diese dann bei der nachfolgenden, relativ unspezifischen Markierung nach einem Doppelantikör­ perverfahren oder durch markiertes Protein A markiert werden und falsche positive Ergebnisse vortäuschen.

Angesichts der geschilderten Schwierigkeiten einer Bestim­ mung von Autoantikörpern nach den bekannten immundiagnosti­ schen Bestimmungsverfahren besteht daher ein dringender Bedarf nach einem verbesserten Verfahren zur immundiagnosti­ schen Bestimmung von Autoantikörpern in biologischen Flüs­ sigkeiten, das eine sichere qualitative Bestimmung von Anti­ körpern in biologischen Flüssigkeiten ermöglicht, das durch geeignete Eichung und Optimierung der Verfahrensparameter auch zur zuverlässigen quantitativen Bestimmung von Antikör­ pern geeignet ist und bei dem es nicht nötig ist, hochgerei­ nigte Antigene zu den zu bestimmenden Antikörpern in nen­ nenswerten Mengen einzusetzen. Das in dem nicht vorveröffentlichen Patent DE 41 20 412 C1 beschriebene Ver­ fahren der Anmelderin löst diese und andere Aufgaben für den Fall von Antikörper-Assays, insbesondere Autoantikörper-Assays, bei denen sich die Anwesenheit der gesuchten Auto­ antikörper als Störung der Bindung eines markierten Antikör­ pers an die feste Phase äußert und bei dem man das Auto­ antigen, insbesondere TPO, nicht in hochgereinigter Form benötigt sondern in Form eines rohen, nativen (cruden) Organextrakts einsetzen kann.

Da bei der nach dem Sandwichverfahren arbeitenden Verfah­ rensvariante, bei der die zu bestimmenden Antikörper, ins­ besondere Autoantikörper, durch eine relativ unspezifische Bindung mit einem "Binder" extrahiert werden, die Selektivi­ tät des Verfahrens von der Selektivität des Markers für die gesuchten Antikörper abhängt, erschien bisher bei dieser Verfahrensvariante die Verwendung eines hochgereinigten markierten Antigens und damit die Inkaufnahme aller geschil­ derten Nachteile als unumgänglich.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Antikörperbestimmung, bei dem diese durch Bindung an einen unspezifischen Binder aus der Reaktions­ lösung extrahiert und dann spezifisch markiert werden, zu entwickeln, bei dem die mit der Verwendung hochgereinigter markierter Antigene verbundenen Probleme gelöst werden können.

Diese Aufgabe wird durch ein immunologisches Bestimmungsver­ fahren gelöst, wie es im Patentanspruch 1 dargestellt wird.

Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen enthalten.

Erfindungsgemäß wird zur Bestimmung von Antikörpern (Ak), insbesondere von Autoantikörpern wie humanen Autoantikörpern gegen Schilddrüsenperoxidase (hTPO), so vorgegangen, daß die zu bestimmenden Antikörper unter Verwendung unspezifischer Binder auf herkömmliche Weise an eine feste oder ungelöste Phase gebunden werden und dann anschließend durch Umsetzung mit einer cruden Antigenpräparation und einem weiteren, markierten Antikörper oder Antikörperfragment, die für das Antigen spezifisch sind, jedoch von dem Binder nicht oder nicht nennenswert gebunden werden, für eine nachfolgende Messung selektiv markiert werden. Die Anwesenheit der zu bestimmenden Antikörper äußert sich in Form eines an die feste bzw. ungelöste Phase gebundenen Markierungsanteils, dessen Menge der Menge der zu bestimmenden Antikörper in der Probe proportional ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird kein gereinigtes Antigen, z. B. hTPO benötigt, und dieses Antigen muß auch nicht direkt markiert werden. Die Selektivität des Verfah­ rens wird dadurch gewährleistet, daß aus durch eine Folge relativ unspezifischer Umsetzungen gebildeten Immunkomplexen oder Sandwichs aus Binder/(gebundenen Antikörpern, die auch die zu bestimmenden Antikörper umfassen) sowie gegebenenfalls crudem Antigen und Begleitsubstanzen durch eine Markierung mit einem nur für das Antigen spezifischen markierten Anti­ körper oder Antikörperfragment die "richtigen" Sandwiches für die Bestimmung ausgewählt werden. Weder bei der Extrak­ tion der Antikörper mittels des Binders, noch bei der Umset­ zung des erhaltenen Immunkomplexes mit dem cruden Antigen kann man davon ausgehen, daß dabei mit einer für eine Mes­ sung ausreichenden Selektivität die "richtigen" Sandwiches aus Binder/zu bestimmendem Antikörper/Antigen gebildet werden. Indem man jedoch bei der Markierung so arbeitet, daß für die nachfolgende Bestimmung selektiv nur gebundene Antigene erfaßt werden, wird ein insgesamt sehr spezifisches Bestimmungsverfahren erhalten.

Aus praktischen Gründen, und zwar zur Verminderung der Zahl der dem Endverbraucher in die Hand gegebenen Reagenzien, ist es zwar vorzuziehen, die Umsetzung zwischen cruder Antigen­ präparation und dem für das Antigen spezifischen Tracer separat durchzuführen, so daß in die Bestimmung eine crude Antigenpräparation eingesetzt wird, in der nur die eigentli­ chen Antigene eine Markierung tragen, das Verfahren kann aber grundsätzlich ohne weiteres auch so durchgeführt wer­ den, daß man erst die Umsetzung Binder/Probenflüssigkeit/- crude Antigenpräparation durchführt und anschließend in einem getrennten Schritt markiert oder daß man alle genann­ ten Reagenzien gleichzeitig inkubiert.

Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung wird der Begriff "Antigen" in einem engen Sinne verwendet, nämlich nur für solche Substanzen, die nicht gleichzeitig Antikörper dar­ stellen und Immunglobulincharakter aufweisen, obwohl gut bekannt ist, daß auch Antikörper als Antigene wirken können und die Bildung von anti-Antikörpern veranlassen können. Insbesondere sind Antigene im Sinne der vorliegenden Be­ schreibung solche körpereigenen Substanzen, die auch wie eingangs beschrieben als Autoantigene wirken und die Bildung von Autoantikörpern bewirken können.

Als Tracer werden zur Vermeidung einer Kreuzreaktion mit dem zur Extraktion der zu bestimmenden Antikörper verwendeten Binder vorzugsweise markierte Fragmente von monoklonalen Antikörpern F(Ak)* verwendet, z. B. Fragmente der mit F(ab)₂ oder F(ab) bezeichneten Art oder auch andere Fragmente, die auf eine Region des Antigens gerichtet sind, die von Auto­ antikörpern nicht erkannt wird. Antikörperfragmente ohne den Fc-Teil sind bevorzugt. Der Grund der bevorzugten Verwendung derartiger Antikörperfragmente ist der, daß die unspezifi­ schen Binder wie Protein A oder Protein G Antikörper über das Fc-Fragment erkennen und binden, das für verschiedene Antikörper im wesentlichen identisch ist. Wird dafür ge­ sorgt, daß die zur selektiven Markierung verwendeten Anti­ körper gegen das Antigen dieses Fc-Fragment nicht aufweisen, kann eine Verfälschung der Meßergebnisse aufgrund einer direkten Bindung des Tracers an den Binder verhindert wer­ den. Es liegt jedoch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, auch andere Antikörperfragmente, auch von polyklonalen Antikörpern, und intakte Antikörper als Tracer zu verwenden, vorausgesetzt, diese sind selektiv für das Antigen und werden durch den Binder nicht in einem die Messung verfäl­ schenden Ausmaße gebunden.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels noch näher erläutert.

In den Figuren zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung des erfindungs­ gemäßen Verfahrens, wobei die Grundbestandteile des Ver­ fahrens zur leichteren Identifizierung mit den auch in den Ansprüchen verwendeten Symbolen bezeichnet werden, ohne daß diese Symbole als solche die jeweiligen Assaybestandteile substanzmäßig in irgendeiner Weise einschränkend definieren sollen.

Fig. 2 eine typische Standardkurve des in dem Bei­ spiel beschriebenen Verfahrens.

Fig. 3 eine graphische Darstellung mit einer Gegen­ überstellung von erfindungsgemäßem Verfahren und dem als IMMUtest anti-TPO der Anmelderin im Handel befindlichen Grundverfahren.

Fig. 4 eine graphische Darstellung mit einer Gegen­ überstellung von erfindungsgemäßem Verfahren und dem als DYNOtest® anti-TPO der Anmelderin im Handel befindlichen Bestimmungsverfahren.

Beispiel

Das nachfolgende Beispiel zeigt die Durchführung und die praktischen Vorteile eines Assays, in dem das erfindungs­ gemäße Verfahren verwirklicht wird, anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels, das den Nachweis von humanen Autoanti­ körpern gegen humane Schilddrüsenperoxidase (hTPO) betrifft.

Es stellt eine erfindungsgemäße Weiterentwicklung des Grund­ verfahrens zur Bestimmung von Autoantikörpern gegen hTPO dar, das grundsätzlich beschrieben ist im Artikel von Beever et al., Clinical Chemistry 35, 1989, 1949-1954 und in dem im Handel befindlichen IMMUtest anti-TPO der Anmelderin prak­ tisch verwirklicht wird. Bei diesem Grundverfahren werden die Autoantikörper enthaltende Probe, unlösliches Protein A zu deren Bindung (vorzugsweise als direkte Staphylococcus aureus Suspension, wie sie von der Fa. Calbiochem unter der Bezeichnung Pansorbin® vertrieben wird) und direkt markierte gereinigte TPO als Tracer miteinander kontaktiert. Protein A liegt in einem hinreichenden Überschuß vor, um sämtliche in der Probe vorhandenen Antikörper zu binden. Bei Anwesenheit von Autoantikörpern gegen hTPO erfolgt die Bildung eines Sandwich und damit eine Bindung des Tracers an die ungelöste Phase. Gebundener TPO-Tracer wird dann durch Zentrifugation von gelöster TPO abgetrennt, und das Sediment wird vermes­ sen. Bei diesem Grundverfahren wurde bisher gereinigte, direkt markierte TPO benötigt.

1. Herstellung eines hTPO-Extraktes aus humaner Schilddrüse

Gefrorene humane Schilddrüsen (60 g) wurden zerkleinert, mit Puffer (200 ml phosphatgepufferter Salzlösung, PBS) versetzt und anschließend mittels eines Homogenisators (Ultraturrax der Firma IKA Werke) homogenisiert. Nach einer einstündigen Zentrifugation bei 100 000 g wurde der Überstand entfernt, und das erhaltene Pellet wurde auf die gleiche Weise wie die zerkleinerten Schilddrüsen rehomogenisiert. Daran schloß sich eine weitere Zentrifugation bei 100 000 g für 1 Stunde an. Das nunmehr erhaltene Pellet wurde wieder in PBS (200 ml) rehomogenisiert, das zusätzlich als Detergens 0,5% Triton X 100 der Firma PIERCE (Katalog-Nr. 28314) enthielt, und es wurde 1 Stunde bei 4°C gerührt. Zuletzt wurde das erhaltene Homogenisat bei 100 000 g für 2 Stunden zentrifu­ giert. Der resultierende Überstand stellt den hTPO-Extrakt dar, der als rohes natives Antigen (Ag) in das erfindungs­ gemäße Verfahren zur Bestimmung von Autoantikörpern gegen hTPO eingesetzt wird.

2. Herstellung eines mit ¹²⁵I markierten F(ab)₂ Fragments eines monoklonalen anti-hTPO-Antikörpers (F(ab)₂*)

Es wurde ein monoklonaler Antikörper (MAK) gewählt, der an hTPO bindet, wobei seine Bindungsstelle jedoch nicht der Region entspricht, die von humanen anti-hTPO-Antikörpern erkannt wird. Dieser Antikörper wurde gemäß der Veröffentli­ chung von J. Ruf et al. (Endocrinology, 1989, 125, S. 1211-1218) hergestellt und gereinigt.

Zur Vermeidung einer Bindung dieses Antikörpers an das als Binder für die zu bestimmenden Autoantikörper verwendete Protein A wurde der Fc-Anteil von dem MAK entfernt. Dazu wurde auf an sich bekannte Weise der gereinigte MAK (1 mg in 1 ml 20 mM Phosphatpuffer) mit immobilisiertem Pepsin (Sigma, Katalognummer P 3286) in die Fc und F(ab)₂ Fragmente gespal­ ten. Je 1 mg Antikörper wurde mit 1000 Units Pepsin für 20 h bei 24° inkubiert. Die erhaltenen Fragmente wurden mittels Gelchromatographie (im Pharmacia System) über eine Superose- 12 Säule auf einer FPLC-Anlage getrennt. Anschließend wurden die gereinigten F(ab)₂ Fragmente nach der Chloramin T Methode mit ¹²⁵I markiert. Dazu wurden 100 µg des F(ab)₂ Fragments in 280 µl 20 mM Phosphatpuffer mit 67 MBq Na¹²⁵I (Amersham, Nr. IMS. 30) und 10 µg Chloramin T (Merck, Katalog-Nr. 2426) für eine Minute gemischt. Der Markierungsansatz wurde dann über HPLC gereinigt, um freies ¹²⁵I von dem an F(ab)₂ Fragmente gebundenen zu trennen. Die Trennung erfolgte über eine HPLC-Anlage mit einer Zorbax GF250/9 Säule.

3. Herstellung eines Tracer-Komplexes zur Bestimmung von anti-hTPO-Autoantikörpern

Zur Bestimmung von humanen Autoantikörpern gegen hTPO wurde im vorliegenden Falle zuerst ein Tracer-Komplex bestehend aus Antigen (Ag aus der als hTPO-Extrakt unter 1. erhaltenen cruden Antigenpräparation) und markierten F(ab)₂ Fragmenten hergestellt. Dazu wurden beide Proteine im molaren Verhält­ nis von 1 : 1 gemischt und 20 h bei 24°C inkubiert. Innerhalb dieser Zeit bindet das F(ab)₂* an das Ag, der resultierende Komplex wird auf eine Aktivität (¹²⁵I) eingestellt und an­ schließend in das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt. Der Inkubations- und Verdünnungspuffer hatte folgende Zusammen­ setzung: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Tween, 0,5% BSA (bovines Serumalbumin), 3 mM NaN₃.

4. Beschreibung des Testverfahrens zur Bestimmung von huma­ nen anti-hTPO-Autoantikörpern

Zum Nachweis von humanen Autoantikörpern gegen hTPO bzw. zur Eichung wurde jeweils wie folgt vorgegangen:

• 1. Es wurden jeweils 50 µl der zu untersuchenden Probe bzw. des Standards oder Serums in Teströhrchen (Spitzbodenröhr­ chen 4,5 ml) pipettiert.
• 2. Anschließend wurden 50 µl einer Protein-A Suspension (Calbiochem: Katalog-Nr. 507858) pipettiert.
• 3. Als letztes wurden 50 µl des gemäß Punkt 3. beschriebe­ nen Tracerkomplexes pipettiert, der das Antigen hTPO in Form des Extraktes aus humanen Schilddrüsen gemäß Punkt 1. und die daran gebundenen markierten F(ab)₂* Fragmente des mono­ klonalen anti-hTPO-Antikörpers enthält.
• 4. Die Reaktionsmischung wurde kurz geschüttelt und an­ schließend für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
• 5. Nach der Inkubation wurde in jedes Röhrchen 1 ml Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-Detergenz, 3 mM NaN₃) pipettiert.
• 6. Anschließend wurden die Röhrchen 15 min bei 2000 g zen­ trifugiert, dekantiert, und das verbleibende Sediment wurde in einem Gamma-Counter gemessen.

Fig. 2 zeigt eine typische Standardkurve dieses Verfahrens.

5. Klinische Daten

In einer klinischen Untersuchung wurden die mit dem be­ schriebenen neuartigen Verfahren erhaltenen Meßergebnisse mit denen verglichen, die unter Verwendung existierender immunologischer Bestimmungsverfahren zur Autoantikörperbe­ stimmung gegen hTPO für 200 Seren erhalten wurden.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und den Fig. 3 und 4 zusammengefaßt.

In Tabelle 1 betreffen die Spalten a) und b) die Ergebnisse von Bestimmungsverfahren des Standes der Technik, die nach­ folgend noch genauer erläutert werden. Dagegen werden die Werte, die nach dem neuen, wie vorstehend beschrieben durch­ geführten Verfahren erhalten wurden, unter c) aufgeführt. Die Meßergebnisse sind in der Tabelle in Units/ml angegeben.

Die als Vergleichsverfahren dem erfindungsgemäßen Verfahren gegenübergestellten Verfahren des Standes der Technik waren im einzelnen:

• a) Ein Verfahren, bei dem ein anti-hTPO-Antikörper auf der Festphase verwendet wird. Radioaktiv markiertes und gereinigtes hTPO wird durch humane Autoantikörper in einer Konkurrenzreaktion von der Festphase ver­ drängt. Der verwendete Test ist ein kommerziell er­ hältlicher Test, der als DYNOtest® anti-TPO der Anmel­ derin im Handel ist.
• b) Bei diesem Test gemäß dem obigen Grundverfahren wird analog zum erfindungsgemäßen Verfahren Protein A auf der Festphase immobilisiert. Der Nachweis von Auto­ antikörpern in einer Probe erfolgt durch deren Bin­ dung an die Festphase und ihren anschließenden Nach­ weis mit Hilfe von markierter gereinigter hTPO. Im konkreten Falle wird ¹²⁵I markiertes hTPO gemäß dem IMMUtest anti-TPO der Anmelderin verwendet (vgl. auch Beever et al., Clin. Chem., 1989, 35: 1949-1954).

Bei der Bewertung von Meßergebnissen von Autoimmunerkrankun­ gen hat es sich als sinnvoll erwiesen, zwischen dem ein­ deutig negativen und eindeutig positiven Bereich eine Über­ gangszone, den sogenannten "Graubereich", zu definieren. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem Vergleichsverfahren b) liegt dieser Bereich zwischen 100 und 200 Units/ml, und bei dem Verfahren a) zwischen 70 und 130 Units/ml. Unter Berücksichtigung der Graubereiche korrelieren die Ergebnisse der beiden Vergleichsverfahren sehr gut mit denen des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens c). Vergleicht man das erfindungs­ gemäße Verfahren c) mit Verfahren b), so wird lediglich eine von 200 Patientenproben diskrepant gefunden, nämlich schwach positiv im erfindungsgemäßen Verfahren und negativ in b). Bei der Korrelation der Verfahren a) und c) werden vier von 200 Proben in a) schwach positiv gefunden, die in c) ein­ deutig als negativ zu betrachten sind. Eine Probe wird dagegen mit c) als schwach positiv und mit Hilfe von a) als negativ erkannt.

Wie bereits eingangs erwähnt wurde, ist das neue Verfahren­ sprinzip nicht auf die Bestimmung von Autoantikörpern gegen hTPO beschränkt. Es läßt ähnliche Vorteile auch für die Bestimmung anderer Autoantikörper erwarten, die gegen mem­ branassoziierte und andere Autoantigene gebildet werden. Es kann in diesem Zusammenhang die Bestimmung von Autoantikör­ pern gegen Acetylcholinrezeptoren vom Nikotintyp erwähnt werden, deren Auftreten nach allgemeiner Ansicht für die schwere Autoimmunerkrankung Myasthenia gravis kennzeichnend ist.

Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Verfahren jedoch auch zur Bestimmung von Antikörpern verwendet werden, die keine Autoantikörper sind und gegebenenfalls in den biologischen Flüssigkeiten in sehr viel geringeren Konzen­ trationen vorkommen als Autoantikörper. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in diesem Falle in Einzelfällen den Vorteil bieten, daß nur schwer in reiner Form erhältliche Antigene in Rohform eingesetzt werden können und/oder daß eine direkte Markierung empfindlicher und/oder schwer zu markierender Antigene vermieden werden kann.

Tabelle 1

Claims (14)

1. Immunologisches Bestimmungsverfahren zur Bestimmung von Antikörpern (Ak) in biologischen Flüssigkeiten, bei dem die biologische Flüssigkeit umgesetzt wird mit

• a) einem Binder für Antikörper, von der Art der zu be­ stimmenden Antikörper, wobei der Binder an eine feste oder in der Reaktionsmischung ungelöste Phase gebunden ist, und
• b) einem Antigen (Ag) zu den zu bestimmenden Antikörpern (Ak), das Tracerfunktion erfüllt,

und bei dem man anschließend die feste oder ungelöste Phase von der flüssi­ gen Phase trennt und die Menge einer über das Antigen (Ag) an den unlöslichen Binder gebundenen oder in der flüssigen Phase verbliebenen Markierung feststellt und dann durch qualitative Bewertung oder durch rechnerische Auswertung der erhaltenen Meßergebnisse unter Verwendung von Eichkurven die Anwesenheit oder die Menge der zu bestimmenden Antikörper in der biologischen Probe ermittelt, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen (Ag) als crude Antigenpräparation und in unmarkierter Form eingesetzt wird und daß bei der Bestimmung ein Antikörper oder ein Antikörperfragment (F(Ak)*) eingesetzt werden, die einen detektierbaren Markierungsanteil aufweisen und ebenfalls spezifisch an das Antigen (Ag) binden, jedoch nicht oder nicht nennenswert von dem Binder gebunden werden, und daß die Anwesenheit oder Menge des zu bestimmenden Anti­ körpers (Ak) in der zu untersuchenden biologischen Flüs­ sigkeit ermittelt wird anhand der an die feste oder ungelö­ ste Phase gebundenen Menge des markierten Antikörpers oder Antikörperfragments (F(Ak)*).

2. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die zu bestimmenden Antikörper humane Antikör­ per sind und der Binder ein unspezifischer Binder für humane Antikörper ist, der ausgewählt ist aus einer Gruppe, die besteht aus Protein A, Protein G und anti-human-Antikörpern nicht-humanen Ursprungs.

3. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Antikörper oder das mar­ kierte Antikörperfragment (F(Ak)*) an eine solche Region des Antigens binden, die nicht von dem zu bestimmenden Antikör­ per (Ak) erkannt wird und von der Bindung des Antigens (Ag) an den zu bestimmenden Antikörper (Ak) nicht beeinflußt wird.

4. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmenden Antikörper Autoantikörper sind, deren Nachweis die Diagnose einer Auto­ immunerkrankung ermöglicht.

5. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die zu bestimmenden Antikörper Autoantikörper gegen Schilddrüsenperoxidase (thyroid peroxidase - TPO) sind.

6. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das crude Antigen (Ag) ein rohes natives Antigen ist, das keiner Hochreinigung unter­ zogen wurde.

7. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das rohe native Antigen ein humaner oder tierischer Organextrakt ist.

8. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen (Ag) rohes natives hTPO ist.

9. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das als Antigen verwendete rohe native hTPO in Form eines Extrakts aus zerkleinerten humanen Schilddrüsen eingesetzt wird.

10. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Antikörper oder das markierte Antikörperfragment (F(Ak)*) ein monoklonaler Antikörper oder das Fragment eines monoklonalen Antikörpers gegen das Antigen (Ag) ist.

11. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der an den markierten Anti­ körper oder an das markierte Antikörperfragment (F(Ak)*) gebundene detektierbare Markierungsanteil ein radioaktives Isotop, ein Enzym, ein Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzla­ bel oder ein Substrat für eine enzymatische Nachweisreaktion oder ein anderes bekanntes, bei immunologischen Bestimmungs­ verfahren verwendetes Label ist.

12. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das crude Antigen (Ag) in einer vorgeschalteten Stufe mit dem markierten Antikörper oder markierten Antikörperfragment (F(Ak)*) umsetzt und auf diese Weise den Anteil des eigentlichen Antigens in der cruden Antigen-Präparation (Ag) indirekt markiert, und daß man das markierte crude Antigen (Ag) dann einer vorinkubier­ ten Reaktionsmischung zusetzt, die den zu bestimmenden Anti­ körper (Ak) über den Binder an eine feste oder ungelöste Phase gebunden enthält.

13. Verwendung von rohen nativen Antigenen (Ag) zur Herstellung von Kits zur Bestimmung von Antikörpern (Ak) in biologischen Flüssigkeiten nach einem immunologischen Be­ stimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12.