DE4120213C2

DE4120213C2 - Monoklonale Antikörper gegen das TNF-bindende Protein I (TNF-BP I)

Info

Publication number: DE4120213C2
Application number: DE4120213A
Authority: DE
Inventors: Guenther Adolf
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1991-06-19
Filing date: 1991-06-19
Publication date: 2000-01-05
Anticipated expiration: 2011-06-20
Also published as: DE4120213A1; JP3425146B2; JPH06508743A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf monoklonale Antikörper gegen das TNF-bindende Protein I (TNF-BP I) und auf Hybridom-Zellinien, die diese sezernieren.

Die zwei strukturell verwandten Zytokine Tumornekrosefaktor (TNF-α) und Lymphotoxin (TNF-β) wurden ursprünglich aufgrund ihrer zytotoxischen in vitro Aktivität gegen Tumorzellen und ihrer Fähigkeit, hämorrhagische Nekrosen von Tumoren in einem Mausmodell zu induzieren, entdeckt. Die Klonierung ihrer cDNAs und deren Expression in E.coli haben die Verfügbarkeit dieser Proteine in praktisch unbegrenztem Ausmaß und die Entwicklung hochspezifischer Antikörper und empfindlicher Immunoassays ermöglicht. Es existiert eine Fülle von Information über die biologischen Aktivitäten dieser Proteine, ihre physiologischen Rollen als pleotrope Mediatoren von entzündlichen Prozessen und ihre Beteiligung bei pathologischen Zuständen. Insbesondere wurde eine erhöhte Produktion von TNF-α mit der Pathogenese von z. B. septischem Schock, Gewebeschädigungen bei der "Graft-versus-host"- Erkrankung und der zerebralen Malaria sowie von Kachexie in Zusammenhang gebracht (Beutler, 1988; Paul und Ruddle, 1988; Beutler und Cerami, 1989).

Die möglichen unerwünschten Wirkungen von TNF-α haben zur Suche nach natürlichen Inhibitoren dieses Zytokins veranlaßt. Ein Protein, das an TNF-α bindet und dadurch dessen Aktivität inhibiert, wurde ursprünglich im Harn von Patienten mit Nierenversagen (Peetre et al., 1988) und von Fieberpatienten (Seckinger et al., 1988) identifiziert. Dieses Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ca. 30 kDa wurde zur Homogenität gereinigt, teilweise sequenziert (EP-A2 308 378) und die cDNA kloniert (Olsson et al., 1989; Engelmann et al., 1989; Himmler et al., 1990; Schall et al., 1990). Die Struktur der cDNA zeigte, daß dieses Protein mit der Bezeichnung TNF-BP das extrazelluläre Fragment eines TNF-Rezeptors (TNF-R) darstellt. (Es wurde angenommen, daß dieses Fragment durch proteolytische Spaltung freigesetzt wird.) Diese Ergebnisse wurden durch die Isolierung des intakten Membranrezeptors für TNF-α, die unabhängig davon von anderen Arbeitsgruppen durchgeführt wurde (Loetscher et al., 1990), bestätigt. Das gesamte Rezeptorprotein besteht aus 455 Aminosäuren (55-60 kDa); TNF-BP umfaßt den größten Teil der extrazellulären Domäne des Rezeptors und enthält alle drei N-Glykosylierungsstellen. Es wurde gefunden, daß aus Harn isoliertes TNF-BP am N-Terminus aufgrund proteolytischer Spaltung heterogen ist und daher eine Mischung von zwei molekularen Formen, bestehend aus 161 Aminosäuren (Hauptfraktion) bzw. 172 Aminosäuren, darstellt (Himmler et al., 1990). Kürzlich wurde die Existenz eines zweiten TNF-bindenden Proteins nachgewiesen, das ein Fragment eines zweiten TNF-Rezeptor-Typs mit einem höheren Molekulargewicht (75-80 kDa; Engelmann et al., 1990a; Smith et al., 1990; Kohno et al., 1990) darstellt. Die beiden Rezeptoren und Bindungsproteine wurden daraufhin TNF-R I/TNF-BP I und TNF-R II/TNF-BP II (für den 60 kDa bzw. 80 kDa Rezeptor) bezeichnet. Der Sequenzvergleich zeigte, daß die beiden Proteine strukturverwandt sind; insbesondere ist die Anzahl und Verteilung der Cysteinreste sehr ähnlich. Die beiden Rezeptoren unterscheiden sich jedoch immunologisch voneinander (Engelmann et al., 1990a; Brockhaus et al., 1990).

Der humane 60 kDa TNF-Rezeptor spielt eine wesentliche Rolle bei der TNF-α-Signalübertragung. Die Aktivität des Rezeptors ist auf Proteinbasis mehreren regulatorischen Effekten unterworfen: Die Behandlung von Zellen mit Phorbolestern oder anderen Aktivatoren der Proteinkinase C hat eine rasche Verringerung in der Anzahl der zellulären Bindungsstellen für TNF-α zur Folge. Damit geht die Freisetzung des extrazellulären Teils des Rezeptors, entsprechend dem TNF-BP I, durch proteolytische Spaltung einher. Ähnliche Effekte, wenn auch mit unterschiedlicher Kinetik, werden durch verschiedene andere Substanzen, insbesondere durch die physiologischen Liganden TNF-α und TNF-β, hervorgerufen. Die Spaltstellen für die Protease auf dem humanen und dem Ratten-TNF-R I sind konserviert, sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Struktur von der Spezifität aller bekannten Proteasen. Es ist daher wahrscheinlich, daß ein hochspezifisches proteolytisches Enzym Bestandteil eines Regelkreises ist, der die Empfindlichkeit von Zellen gegenüber TNFs kontrolliert; der genaue Mechanismus dieser Ereignisse ist noch unbekannt. Kürzlich wurde dieses Phänomen auch in vivo beobachtet: Es wurde gefunden, daß die Verabreichung von TNF-α an Krebspatienten zu einer deutlichen Zunahme von TNF-BP I im Serum führt (Lantz et al., 1990a).

Die Konzentration von TNF-BP I in Kulturüberständen oder Körperflüssigkeiten ist daher ein Indikator für die Aktivierung des TNF-Rezeptor-Systems in vitro bzw. in vivo aufgrund von Wechselwirkungen mit den Liganden oder Transmodulation durch andere Mediatoren; die TNF- BP I-Konzentration in Körperflüssigkeiten kann somit als nützlicher Marker für verschiedene Krankheiten angesehen werden.

Es bestand daher der Bedarf nach effizienten, empfindlichen Nachweismethoden für TNF-BP I sowie nach Kits, die für derartige Nachweismethoden einsetzbar sind.

Es sind monoklonale Antikörper gegen TNF-R I beschrieben, die durch Immunisierung mit dem solubilisierten Rezeptor (Brockhaus et al., 1990; EP A2 334 165; Thoma et al., 1990) oder mit gereinigtem TNF-BP I (Engelmann et al., 1990b) hergestellt wurden; von diesen Antikörpern wurde jedoch nicht gezeigt, daß sie sich zur Verwendung in Immuno-Assays für TNF-BP I eignen.

Lantz et al. (1990a) haben einen kompetitiven ELISA entwickelt, bei dem in einer dreistufigen Testmethode mit TNF-BP I beschichtete Testplatten, polyklonale Kaninchenantikörper gegen TNF-BP I, Biotin-markierte Ziegenantikörper gegen Kaninchen-Immunglobulin und Avidin-gekoppelte alkalische Phosphatase verwendet wurden. Mit Hilfe dieses Assays wurden die Gegenwart von TNF-BP I im Serum von normalen Spendern und erhöhte TNF-BP I-Konzentrationen in Seren von Patienten mit Nierenversagen oder von Krebspatienten, die mit TNF-α behandelt wurden, nachgewiesen.

In der EP A1 412 486 werden monoklonale Antikörper gegen TNF-BP I beschrieben. Einer dieser Antikörper wurde in einem Sandwich-ELISA als Beschichtungs- Antikörper verwendet; als zweiter Antikörper wurden polyklonale Kaninchen-Anti-TNF-BP-I-Antikörper, als dritter, enzymgekoppelter Antikörper polyklonale Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper verwendet. Die hier geoffenbarten monoklonalen Antikörper weisen eine TNF-ähnliche Zytotoxizität und somit eine agonistische Wirkung zu TNF-α auf.

Die vorbekannten Assays sind vom Aufbau und der Durchführung her kompliziert, außerdem bedingt der Einsatz polyklonaler Antikörper die Verwendung von Tieren, die zu vermeiden man zunehmend bestrebt ist.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, monoklonale Antikörper mit Spezifität für TNF-BP I bereitzustellen, die sich zur Verwendung in einem einfach durchzuführenden, hochempfindlichen Immunoassay zum Nachweis von TNF-BP I eignen.

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper gegen TNF-BP I, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060555 bzw. ECACC 91060556, oder aktive Fragmente davon. Die Erfindung betrifft auch die Hybridomzellinien ECACC 91060555 und ECACC 91060556, die diese Antikörper produzieren.

Im folgenden wird der Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060555 als "tbp-1" und der Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060556 als "tbp-2" bezeichnet.

Die erfindungsgemäßen Hybridom-Zellinien wurden erhalten, indem Mäuse mit aus menschlichem Harn hochgereinigtem TNF-BP I (Olsson et al., 1989) nach an sich bekannten Methoden immunisiert und Milzzellen von Mäusen mit positiver Antikörper-Reaktion zur Fusionierung mit Myelomzellen verwendet wurden, um Hybridomzellen zu erhalten, die monoklonale Antikörper gegen TNF-BP I sezernieren. Die erste Zellfusion ergab zwei Kulturen, die monoklonale Antikörper gegen TNF-BP I produzieren; eine zweite Zellfusion ergab einen dritten Antikörper. Die erhaltenen Antikörper wurden als tbp-1, tbp-2 und tbp-6 bezeichnet. Die Antikörper wurden gereinigt und charakterisiert:

tbp-1 und tbp-6 sind IgG1-Antikörper, tbp-2 ist ein IgG2b-Antikörper. Alle drei Antikörper waren in der Lage, TNF-BP I in Western Blots zu erkennen, wobei tbp-1 die stärkste Reaktivität zeigte. tbp-2 reagierte schwächer, tbp-6 ergab die schwächste Färbung. Zur Charakterisierung der Epitope, die von den Antikörpern erkannt werden, wurden die drei Antikörper sowie ein vierter Antikörper mit der Bezeichnung H398, der durch Immunisierung mit solubilisiertem TNF-Rezeptor erhalten worden war (Thoma et al., 1990), untersucht. Die untersuchten Antikörper erkennen drei verschiedene Epitope auf dem TNF-BP I-Molekül, wobei tbp-2 und H398 dasselbe oder überlappende Epitope erkennen.

Die Hybridomzellinien mit der Bezeichnung TBP-1 und TBP-2 wurden am 5. Juni 1991 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC; Salisbury, Vereinigtes Königreich) nach dem Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentzwecke hinterlegt (TBP-1: Hinterlegungsnummer 91060555, TBP 2: Hinterlegungsnummer 91060556).

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die Verwendung von tbp-1 und/oder tbp-2 zum Nachweis von TNF-BP I in Körperflüssigkeiten oder Zellkulturüberständen mittels Immunoassay. (Unter die Bezeichnung tbp-1 oder tbp-2 fallen im Zusammenhang mit der Verwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper im folgenden auch die aktiven Fragmente der monoklonalen Antikörper, die an TNF-BP I binden. Dem Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet sind Methoden zur Herstellung aktiver Antikörper-Fragmente (Fab- Fragmente), z. B. mittels Enzymverdau, geläufig.)

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung anwendbaren Immunoassays beruhen auf Standardmethoden, die dem Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet geläufig sind und von denen ein großes Angebot zur Verfügung steht. Diese Methoden basieren auf der Bildung eines Komplexes zwischen der zu bestimmenden antigenen Substanz und einem oder mehreren Antikörpern. Einer oder mehrere der Komplexpartner ist dabei markiert, sodaß das Antigen nachgewiesen und/oder quantitativ bestimmt werden kann. Die Markierung kann z. B. in Form eines gekoppelten Enzyms, Radioisotops, Metallchelats, oder einer fluoreszierenden, chemilumineszierenden oder biolumineszierenden Substanz, vorliegen.

Im Falle eines kompetitiven Immunoassays konkurriert das Antigen in der zu analysierenden Probe mit einer bekannten Menge von markiertem Antigen um die Bindung an die Antikörper-Bindungstellen. Die Menge von markiertem Antigen, gebunden an den Antikörper, ist daher verkehrt proportional zur Antigenmenge in der Probe.

Bei Tests, in denen markierte Antikörper verwendet werden, ist die Menge an markiertem, gebundenem Antikörper direkt proportional zur Menge an Antigen.

Assays, die auf der Bildung eines Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexes basieren, wobei zwei Antikörper eingesetzt werden, die einander bei der Bindung an das Antigen nicht behindern, werden als "Sandwich"-Immunoassays bezeichnet.

Da monoklonale Antikörper in unbegrenzter Menge in konstanter Qualität verfügbar sind, weisen Immunoassays unter Verwendung monoklonaler Antikörper aufgrund ihrer konstanten Qualität und Reproduzierbarkeit gegenüber Assays, die sich polyklonaler Antikörper bedienen, entscheidende Vorteile auf. Außerdem wird der mit polyklonalen Antikörpern verbundene Nachteil, für deren Herstellung laufend Tiere einsetzen zu müssen, vermieden.

Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in einem Sandwich-Immunoassay, insbesondere in einem Sandwich-ELISA verwendet.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind in Sandwich-Immunoassays als Beschichtungs- und Markierungs-gekoppelte Antikörper einsetzbar und machen somit den Einsatz polyklonaler Antikörper überflüssig.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Immunoassay-Kits, insbesondere Sandwich- Immunoassay-Kits, die tbp-1 und/oder tbp-2 enthalten.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein Sandwich-Immunoassay-Kit, vorzugsweise ein Sandwich- ELISA-Kit, in dem tbp-1 den Beschichtungsantikörper und tbp-2 den markierten, vorzugsweise enzymgekoppelten Antikörper darstellt.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich, in einem Sandwich-Immunoassay tbp-1 oder tbp-2 durch einen anderen Antikörper zu ersetzen, der in der Lage ist, mit tbp-2 bzw. tbp-1 einen Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplex zu bilden.

Im Falle des Ersatzes von tbp-1 oder tbp-2 durch einen anderen Antikörper wird bevorzugt ein Antikörper verwendet, der jeweils dasselbe Epitop von TNF-BP I oder einen Bereich davon erkennt wie der zu ersetzende tbp-1 bzw. tbp-2.

Antikörper, die sich in dem erfindungsgemäßen Immunoassay aufgrund ihrer Fähigkeit, mit tbp-2 bzw. tbp-1 einen Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplex zu bilden, als Ersatz für tbp-1 oder tbp-2 eignen, können mit Hilfe von Sandwich-Immunoassays ermittelt werden. Dabei werden Immunoassay-Platten mit tbp-1 oder tbp-2 beschichtet, das Antigen aufgegeben und die zu untersuchenden, markierten Antikörper aufgetragen. Antikörper, die mit tbp-1 bzw. tbp-2 einen Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplex bilden können, was durch Messung der Markierung des Testantikörpers feststellbar ist, erkennen ein anderes Epitop auf dem Antigen als tbp-1 bzw. tbp-2. Antikörper, die nicht in der Lage sind, ein Sandwich mit tbp-1 bzw. tbp-2 zu bilden, weisen dieselbe oder überlappende Epitoperkennung auf wie diese Antikörper.

Im Falle des Ersatzes eines der erfindungsgemäßen Antikörper im Sandwich-Immunoassay wird bevorzugt der Markierungs-gekoppelte Antikörper tbp-2 durch einen Antikörper ersetzt, der dieselbe oder überlappende Epitop-Spezifität aufweist wie tbp-2. Ein Beispiel für einen geeigneten Antikörper ist der von Thoma et al. (1990) beschriebene monoklonale Antikörper H398, von dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt werden konnte, daß er an ein identisches oder überlappendes Epitop bindet.

Mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Sandwich-ELISAs konnte TNF-BP I in Humanserum, Plasma, Harn und Zellkulturüberständen bei einer Empfindlichkeit von ca. 200 ng/l und einer Genauigkeit von mehr als 10% nachgewiesen werden.

Während die monoklonalen Antikörper des Standes der Technik um die Bindung von TNF an den Rezeptor konkurrieren, wurde überraschend festgestellt, daß die Aussagekraft des erfindungsgemäßen Immunoassays durch die natürlichen Liganden für den TNF-Rezeptor, TNF-α und TNF-β, nicht beeinträchtigt wird: TNF-β übt keinen meßbaren Einfluß auf den Assay aus, TNF-α zeigt erst bei Konzentrationen von -10 µg/l eine meßbare Änderung des Signals. Da die TNF-α-Konzentrationen in gesunden Personen für gewöhnlich ...20 ng/l betragen und selbst bei ernsten pathologischen Zuständen die TNF-α- Konzentrationen nur in seltenen Fällen 1 µg/l übersteigen (z. B. Lähdevirta et al., 1988; Offner et al., 1990), kann eine Beeinträchtigung des erfindungsgemäßen Immunoassays durch endogenen TNF-α ausgeschlossen werden.

Aufgrund seiner Empfindlichkeit ist ein Immunoassay auf Basis der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper auch geeignet, nach unten von den Normwerten abweichende Konzentrationen von TNF-BP I nachzuweisen. Damit können Funktionsstörungen des Organismus diagnostisch erfaßt werden, die mit einer verminderten Produktion von TNF-BP I einhergehen.

Außer für den Nachweis von TNF-BP I in Serum, Plasma und Harn sowie in Zellkulturüberständen können die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper auch für den Nachweis von TNF-BP I in anderen Körperflüssigkeiten, z. B. in der Zerebrospinalflüssigkeit oder in Bronchoalveolarsekreten, verwendet werden.

Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung wird somit eine hochempfindliche Nachweismethode für TNF-BP I bereitgestellt, mit der die Aktivierung des TNF-Rezeptors durch seine physiologischen Liganden TNF-α und TNF-β sowie seine Transmodulation durch andere Mediatoren in verschiedenen pathologischen Zuständen festgestellt werden kann. Der Nachweis von TNF-BP I dient somit vor allem zur Diagnose von pathologischen Zuständen, die mit einer erhöhten TNF-α-Produktion einhergehen bzw. zur Absicherung solcher Diagnosen.

Ein Vorteil der TNF-BP I-Bestimmung gegenüber der TNF-α-Bestimmung ergibt sich dadurch, daß von TNF-BP I Normalwerte im Serum gefunden werden, wodurch eine Bestimmung auch geringfügig erhöhter Werte und damit eine Diagnose möglich ist.

Trotz des deutlichen Zusammenhanges zwischen der Induktion von TNF-α und dem Auftreten von septikämischen und endotoxämischen Reaktionen in Tieren brachte die Bestimmung von TNF-α in schwer an gram-negativen Infektionen erkrankten Patienten widersprüchliche Ergebnisse. Dies dürfte mit den Mechanismen in Zusammenhang stehen, die die Synthese und Ausscheidung von TNF-α kontrollieren. Nach Anregung durch einen geeigneten Stimulus wird TNF-α rasch von Makrophagen ausgeschüttet, im Anschluß daran dürften die Makrophagen gegen weitere Stimulierung resistent sein. Außerdem ist die Halbwertszeit im Plasma kurz, sie beträgt im Menschen nur 15 bis 17 min. Diese Phänomene dürften die Ursache dafür sein, daß das Auftreten von TNF-α im Blutkreislauf rasch und kurzlebig und daher schwierig nachweisbar ist (Michie et al., 1988). Wenn dem Patienten daher nicht rechtzeitig Blut abgenommen wird, ist es möglich, daß zum Zeitpunkt der Analyse die Erhöhung der TNF-α-Konzentration nicht mehr nachweisbar ist. Von Lantz et al. (1990a) wurde festgestellt, daß nach Infusion mit TNF-α der TNF-BP I-Spiegel im Serum wesentlich langsamer abfällt als der Serum-TNF-Spiegel. Dieser Befund zeigt, daß die Bestimmung von TNF-BP I-Konzentrationen als Grundlage für eine Diagnose insbesondere dann von Vorteil ist, wenn pathologische Zustände diagnostiziert werden sollen, die mit einer Aktivierung des TNF-Rezeptor-Systems, insbesondere durch TNF-α, verbunden sind und bei denen der TNF-α-Spiegel im Vergleich zum TNF-BP I-Spiegel rascher absinkt.

Beispiele für Erkrankungen, für deren Diagnose die Bestimmung von TNF-BP I herangezogen werden kann, sind gramnegative oder allgemeine bakterielle Infektionen, septischer Schock, Gewebeschädigungen bei der "Graft-versus-host"-Erkrankung und der zerebralen Malaria sowie Kachexie.

Der erfindungsgemäße Bioassay ist insbesondere bei der Diagnose von septischem Schock, der bei nicht rechtzeitig vorgenommener Therapie eine lebensbedrohende Erkrankung darstellt, von Vorteil.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Bioassays konnte TNF-BP I im Serum von normalen Spendern bei einer Durchschnittskonzentration von ca. 2 µg/l nachgewiesen werden. Erhöhte Werte wurden im Serum von Patienten mit schweren Verbrennungen bestimmt; sehr hohe Werte wurden in Dialysepatienten nachgewiesen, während die Seren von Patienten mit chronischer Polyarthritis keine erhöhten TNF-BP I-Konzentrationen aufwiesen.

Mit dem erfindungsgemäßen Bioassay wird außerdem erstmals eine einfache immunologische Nachweismethode für TNF-BP I im Harn bereitgestellt; in Harnproben von normalen Spendern wurde eine TNF-BP I- Durchschnittskonzentration von ca. 2 µg/l bestimmt.

Der erfindungsgemäße Bioassay kann somit zur Diagnose von pathologischen Zuständen, bei denen eine Korrelation von erhöhten TNF-BP I-Konzentrationen im Harn und im Serum besteht, wie sie bei Nierenversagen festgestellt wurde, eingesetzt werden, indem die TNF-BP I-Konzentration im Harn bestimmt wird. Diese Methode bietet den Vorteil, auf eine Blutabnahme verzichten und die Diagnose aufgrund der für den Patienten wesentlich angenehmeren Harnanalyse erstellen zu können.

Unter den Begriff "Diagnose", für die der erfindungsgemäße Bioassay verwendet werden kann, fällt auch die Überwachung des Verlaufs einer Erkrankung, die mit einer Aktivierung des TNF-Rezeptorsystems verbunden ist, bzw. des Verlaufs der Therapie zur Behandlung einer solchen Erkrankung, z. B. einer Therapie mit Antikörpern gegen TNF-α. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Bioassays ist weiters zweckmäßig für die Überwachung des Verlaufs von Therapien, bei denen TNF-α oder TNF-β verabreicht werden. Im Zuge dieser diagnostischen Anwendungen wird im allgemeinen in regelmäßigen Zeitabständen die Probe einer Körperflüssigkeit aus dem Patienten entnommen und deren Gehalt an TNF-BP I bestimmt.

Außer für die Bestimmung von TNF-BP I in Körperflüssigkeiten und Zellkulturüberständen können die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in immobilisierter Form für die Reinigung von TNF-BP I mittels Affinitätschromatographie verwendet werden.

Weiters können die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper, insbesondere tbp-1, für den Nachweis von TNF-BP I in Immunoblots verwendet werden.

Figurenübersicht

Fig. 1: ELISAs für TNF-BP I unter Verwendung monoklonaler Antikörper

Fig. 2: Repräsentative Eichkurven für TNF-BP I ELISAs von Serum- und Harnproben

Fig. 3: Einfluß von TNF-α auf die Immunreaktivität von TNF-BP I

Fig. 4: TNF-BP I-Konzentrationen in Humanserum und Harn

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1 Herstellung von monoklonalen Antikörpern mit Spezifität für TNF-BP I a) Immunisierung

3 ca. 6 Wochen alte weibliche BALB/c Mäuse wurden mit dem nach der in der EP A2 393 438 beschriebenen Methode zur Homogenität gereinigten TNF-BP I nach folgendem Schema immunisiert:

1. Immunisierung: 9 µg TNF-BP I pro Maus in komplettem Freund'schem Adjuvans, intraperitoneal
2. Immunisierung: 9 µg TNF-BP I pro Maus in inkomplettem Freund'schem Adjuvans, intraperitoneal, 3 Wochen nach der 1. Immunisierung
3. Immunisierung: 9 µg TNF-BP I pro Maus in inkomplettem Freund'schem Adjuvans, intraperitoneal, 5 Wochen nach der 2. Immunisierung.

8 Tage danach wurden den Mäusen Serumproben entnommen und mittels eines Sandwich-ELISA auf die Bildung von Antikörpern gegen TNF-BP I untersucht. Dazu wurde TNF-BP I an mit Kaninchenantikörpern gegen TNF-BP I beschichtete Testplatten gebunden und spezifische Antikörper mit Peroxidase-gekoppelten Kaninchenantikörpern gegen Mäuse-Immunglobulin nachgewiesen. Die Testseren wurden in Verdünnungen von 1 : 10², 1 : 10³, 1 : 10⁴ und 1 : 10⁵ aufgelegt. Es zeigten alle drei Mäuse positive Reaktion (Absorption mehr als zweifacher Untergrund) bei bis zu 10⁵facher Verdünnung. Die Maus mit dem höchsten Titer wurde ca. 8 Wochen nach der 3. Immunisierung an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit je 4 µg TNF-BP I in PBS geboostert; die Milzzellen dieser Maus wurden am folgenden Tag für die Fusion mit Hybridomzellen verwendet.

In ähnlicher Weise wurde eine zweite Immunisierung durchgeführt mit dem Unterschied, daß die dazu verwendete Maus zusätzlich 8 Monate nach der dritten Immunisierung eine vierte Dosis TNF-BP I (15 µg) erhielt und 7 Wochen danach geboostert wurde.

b) Fusion:

Die Milz der Maus wurde einen Tag nach der letzten Injektion steril entnommen, mechanisch zerkleinert und mit serumfreiem Kulturmedium (RPMI 1640) gewaschen. Ca. 10⁸ Milzzellen wurden nach der Methode von Köhler und Milstein (1975) in Gegenwart von PEG 4000 (Merck, 40% in serumfreiem Kulturmedium) mit ca. 5 × 10⁷ P3 X 63Ag8.653 BALB/c-Myelomzellen (Kearney et al., 1979) fusioniert. Danach wurden die Zellen in HAT-Selektionsmedium (RPMI 1640 - komplettiert mit 100 U/ml Natrium-Penicillin G, 50 U/ml Streptomycin und 20% FCS - mit 10^-4 M Hypoxanthin, 4 × 10^-7 M Aminopterin und 1.6 × 10^-5 M Thymidin) suspendiert und in 16 96-Loch- Mikrotiter-Platten, die peritoneale Mäusezellen als "Feeder Layer" enthielten, verteilt. Nach 11 Tagen wurden Überstände entnommen und auf Antikörperproduktion getestet. Von den 1500 Kulturen, die in selektives Medium ausgesät wurden, zeigten mehr als 90% Wachstum von Hybridomen.

c) Screening von Hybridom-Kulturüberständen

Sofern nicht anders angegeben, wurden für alle ELISA-Versuche die folgenden Puffer verwendet:
Beschichtungspuffer: 0.05 M Natriumcarbonat pH 9.6
Waschmedium: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung pH 7.4 (PBS) enthaltend Tween 20 zu 0.5 g/l
Testpuffer: PBS mit Rinderserumalbumin (5 g/l) und Tween 20 (0.5 g/l)
Substratlösung: Tetramethylbenzidindihydrochlorid (0.1 g/l) und Natriumperborat (0.05 g/l) in 0.05 M Kaliumcitrat pH 5.0
Stopp-Lösung: 2 M Schwefelsäure

96-Loch-Immunoassay-Platten wurden mit Kaninchenantikörpern gegen TNF-BP I, teilweise gereinigt durch Ammoniumsulfat-Fällung (50% Sättigung), in Beschichtungspuffer bei einer Konzentration entsprechend einer 1 : 3000 Serumverdünnung (50 µl/Vertiefung, Inkubation über Nacht bei 4°C oder während einer Stunde bei 37°C) beschichtet. Die Platten wurden einmal gewaschen und eine Stunde lang mit Testpuffer bei Raumtemperatur blockiert. Daraufhin wurden Hybridomüberstände (50 µl) zusammen mit dem Antigen (50 µl, 10 µg TNF-BP I/l in Testpuffer) zugegeben und 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden einmal gewaschen, eine Lösung von Peroxidase-gekoppelten Kaninchenantikörpern gegen Maus-Immunglobuline (DAKO, Dänemark, Verdünnung 1 : 5000 im Testpuffer, 50 µl/Vertiefung) hinzugefügt und 2 h lang bei Raumtemperatur bebrütet. Daraufhin wurden die Platten 3 × gewaschen und in jede Vertiefung 200 µl Substratlösung gegeben. Nach 20 bis 40 min wurde die Reaktion durch Hinzufügen von 50 µl Stopp-Lösung unterbrochen. Die Absorption der Lösung wurde in einem ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm (Referenz: 690 nm) gemessen, wobei Kulturmedium als negative und verdünntes Mausimmunserum als positive Kontrolle verwendet wurden.

Nur zwei von den untersuchten Kulturen aus der ersten Immunisierung zeigten Antikörperproduktion (TBP-1 und TBP-2); die zweite Fusion ergab eine dritte Antikörperpositive Zellinie (TBP-6).

Die positiven Kulturen wurden nach ca. 25 Tagen von HAT-Medium in HT-Medium überführt, nach weiteren 10 Tagen auf normales Kulturmedium (RPMI 1640 komplett, 1% Antibiotika, 10% L-Glutamin, 10% FCS) umgestellt.

d) Klonierung der Hybridome:

Die positiven Kulturen wurden nach der Methode der limitierenden Verdünnung ("limiting dilution") kloniert. Dabei wurde derart verdünnt, daß 100 µl Kulturmedium 1 Zelle enthielten, worauf die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte mit diesem Volumen beschickt wurden (es wurden insgesamt 3 Platten angesetzt, die am Vortag je Vertiefung mit 100 µl Maus-Peritoneal-Makrophagensuspension beschickt worden waren). Die Kulturüberstände wurden mittels ELISA, wie oben beschrieben getestet; positive Klone jeder Kultur wurden gepoolt, expandiert und eingefroren.

e) Produktion monoklonaler Antikörper

Zur Produktion von Antikörpern in vivo wurden von den Hybridomkulturen je ca. 10⁷ Zellen intraperitoneal in BALB/c Mäuse injiziert, die 2 bzw. 3 Tage vorher mit 0.5 ml inkomplettem Freund'schem Adjuvans konditioniert worden waren. Nach ca. 10 bis 14 Tagen wurde die Ascitesflüssigkeit entnommen. Die gebildeten monoklonalen Antikörper wurden nach Ammonsulfatfällung mittels Affinitätschromatographie über trägergebundenes Protein-G gereinigt.

Für die Antikörperproduktion in Zellkultur wurde fötales Kälberserum (FCS) durch Chromatographie auf Protein G Sepharose gereinigt, um Rinder-IgG zu entfernen; dieses Serumpräparat wurde in einer Konzentration von 5% für die Hybridomkulturen verwendet. Aus den Kulturüberständen wurden die Antikörper erneut über Protein-G-Sepharose isoliert. Alternativ wurden die Zellen in serumfreiem Medium (Serum-free and protein-free hybridoma medium, Fa. SIGMA, Kat.Nr. 5-2772; USA) gezüchtet und die Antikörper ebenso durch Chromatographie an Protein-G-Sepharose isoliert.

Beispiel 2 Charakterisierung der monoklonalen Antikörper

Die Antikörper-Subisotypen wurden unter Verwendung von Peroxidase-gekoppelten Kaninchenantikörpern (Serotec, Oxford, GB) bestimmt: tbp-1 und tbp-6 sind IgG1-Antikörper, tbp-2 ist ein IgG2b-Antikörper.

Im Western Blot erkannten alle drei Antikörper TNF-BP I; tbp-1 zeigte starke Reaktivität, tbp-2 reagierte schwächer, tbp-6 ergab nur eine sehr schwache Färbung.

Zur Bestimmung der Epitope, die von den Antikörpern erkannt werden, wurden die drei Antikörper tbp-1, tbp-2 und tbp-6 sowie der von Thoma et al. (1990) durch Immunisierung mit solubilisiertem TNF-Rezeptor entwickelte Antikörper H398 an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt und mittels ELISA charakterisiert: Testplatten wurden jeweils mit einem der unmarkierten Antikörper (10 mg/l) beschichtet, worauf eine Verdünnungsserie des Antigens zugegeben und anschließend jeweils einer der Enzym-gekoppelten Antikörper aufgetragen wurde. Dieser Versuch wurde in allen möglichen Anordnungen durchgeführt [Fig. 1: A: tbp-1; B: tbp-2, C: tbp-6, D: H398. Die Symbole zeigen die Peroxidase-Konjugate: tbp-1 (gefüllte Kreise), tbp-2 (gefüllte Quadrate), tbp-6 (gefüllte Dreiecke), H398 (offene Kreise)]. Es zeigte sich, daß keine der einzelnen Antikörper-Spezies in der Lage war, ein "Sandwich" zu bilden, was darauf hindeutet, daß das Antigen als Monomer vorliegt. Kombinationen der Antikörper tbp-1 mit tbp-2, tbp-6 oder H398 sowie Kombinationen von tbp-2 mit tbp-6 oder tbp-6 mit H398 waren in der Lage, dosisabhängige Signale zu geben, während tbp-2 in Kombination mit H398 nicht reagierte. Daraus wurde gefolgert, daß die Antikörper drei verschiedene Epitope auf dem TNF-BP I-Molekül erkennen; tbp-2 und H398 binden an identische oder überlappende Epitope. Für die weitere Entwicklung wurde eine Testanordnung gewählt, in der tbp-1 den Beschichtungsantikörper und tbp-2 den Peroxidase gekoppelten Antikörper darstellt.

Beispiel 3 Entwicklung eines Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Sandwich-ELISA)

Im Hinblick auf die Anwendung der ELISAs zum Nachweis von TNF-BP I in Humanserum wurden zunächst verschiedene Medien auf ihre Eignung als Verdünnungsmedium für Proben und Standard untersucht. Während sowohl FCS als auch Kälberserum brauchbare Dosis-Wirkungskurven ergaben, zeigte gepooltes normales Humanserum einen sehr hohen Leerwert. Um zu überprüfen, ob dieses Phänomen auf unspezifische Reaktivität oder auf die Gegenwart von Antigen zurückzuführen ist, wurde humanes Serum über eine Affinitätssäule, enthaltend immobilisierten TNF-α, geschickt. Als der Durchfluß der Chromatographiesäule als Verdünnungsmedium verwendet wurde, betrug der Leerwert etwa gleich viel wie mit Kälberserum. Dies deutete darauf hin, daß normales Humanserum immunreaktives und biologisch aktives TNF-BP I enthält. Die Konzentration von TNF-BP I in dem verwendeten Serum-Pool wurde auf ca. 1 µg/l geschätzt. Standardkurven, die mit 50% Kälberserum erstellt wurden, waren von denen mit 50% Humanserum, aus dem TNF-BP I entfernt worden war, nicht zu unterscheiden. Daher wurde das erstere Medium für alle folgenden Versuche verwendet (von allen verwendeten Lieferungen von Kälberserum, die von verschiedenen Firmen bezogen wurden, erwiesen sich nur zwei als geeignet; alle anderen zeigten niedrige Wiederfindung).

Die Etablierung und Durchführung der Tests erfolgte nach Standardmethoden.

Zunächst wurde in Vorversuchen für die Entwicklung eines Assays zur Bestimmung von TNF-BP I in Serum festgestellt, daß ein sog. "zweistufiger" Assay, das ist eine Methode, in der an die Inkubation der Probe ein Waschschritt angeschlossen wird und die Inkubation mit dem Antikörper-Enzymkonjugat getrennt durchgeführt wird, keinen Vorteil gegenüber der schnelleren und bequemeren "einstufigen" Methode bringt. In Vorversuchen wurde weiters die Konzentration des Beschichtungs-Antikörpers variiert, ebenso die Inkubationszeit für die Immunreaktion.

Der optimierte Assay wurde für die Bestimmung von TNF-BP I im Serum wie folgt durchgeführt: 96-Loch-Immunoassayplatten wurden mit dem monoklonalen Antikörper tbp-1 bei einer Konzentration von 3 mg/l in Beschichtungspuffer beschichtet (über Nacht bei 4°C oder 1 h lang bei Raumtemperatur; 100 µl/Vertiefung). Die Vertiefungen wurden einmal gewaschen und die verbleibenden Bindungsstellen mit 200 µl Testpuffer 1 h lang bei Raumtemperatur blockiert. Nach einem weiteren Waschzyklus wurden die Vertiefungen der Reihen 2 und 11 mit 100 µl 50% Kälberserum/50% PBS befüllt. Eine Standardlösung TNF-BP I (vgl. Beispiel 1a, 20 µg/l in 50% Kälberserum/50% PBS, 100 µl) wurde in die Vertiefungen A2 und A11 pipettiert; serielle Verdünnungen im Verhältnis 1 : 2 wurden in den Reihen 2 und 11 direkt in den Vertiefungen vorgenommen. Alle anderen Vertiefungen erhielten 50 µl PBS, und die Serumproben wurden jeweils zweifach auspipettiert (50 µl/Vertiefung). In alle Vertiefungen wurden 50 µl einer Lösung von Peroxidase-gekoppeltem Antikörper tbp-2 in Testpuffer gegeben, nachdem in Vorversuchen die geeignete Verdünnung bestimmt worden war. (Die Kopplung der Antikörper mit Meerrettich- Peroxidase (Boehringer Mannheim) wurde nach der von Wilson und Nakane (1978) beschriebenen Methode durchgeführt). Die Platten wurden 3 h lang auf einem Platten-Schüttelgerät bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden daraufhin 3 × gewaschen, Substratlösung hinzugefügt (200 µl), die Reaktion durch Zugabe von 50 µl Stopp-Lösung unterbrochen und die Absorptionswerte, wie oben angegeben, bestimmt. Die Konzentrationen von TNF-BP I in den Proben wurden mit Hilfe des Titercalc-Programms (Hewlett Packard) berechnet.

In analoger Weise wurde ein Assay für die Analyse von Zellkulturüberständen aufgebaut, mit dem Unterschied, daß bei der Erstellung der Eichkurve Zellkulturmedium mit einem Gehalt von 10% FCS eingesetzt und die Proben unverdünnt verwendet wurden.

Für die Bestimmung von TNF-BP I im Harn wurde eine modifizierte (zweistufige) Methode entwickelt. Die Notwendigkeit dafür ergab sich, weil der niedrige pH-Wert einiger Proben sowie andere, ungeklärte, Faktoren den Test störten. Der durch den pH-Wert bedingte Effekt konnte durch den Standard-Testpuffer aufgrund zu geringer Pufferkapazität nicht kompensiert werden. Es war ein starker Phosphatpuffer (0.5 M) erforderlich, um sicherzustellen, daß auch die sauersten Proben (pH 5) auf neutralen pH-Wert gebracht werden konnten. Diese Maßnahme war noch nicht ausreichend, weil einige Proben noch immer eine geringe Wiederfindung ergaben. Dieses Problem wurde durch Anwendung einer zweistufigen Testmethode (aufeinanderfolgende Inkubation von Proben und Konjugat) gelöst: Die Platten wurden beschichtet, blockiert und gewaschen, wie für den Serum-Assay beschrieben. Anschließend wurde eine Lösung, bestehend aus Rinderserumalbumin (5 g/l) und Tween 20 (0.5 g/l) in 0.5 molarem Natriumphosphatpuffer pH 7.4 in die Vertiefungen der Platte pipettiert (50 µl/Vertiefung). Die Eichkurve wurde mit derselben Lösung hergestellt. Daraufhin wurden Harnproben (50 µl/Vertiefung; 2fach-Bestimmung) hinzugefügt und die Platten auf einem Schüttelgerät 2 h lang inkubiert. Die Platten wurden anschließend gewaschen und 100 µl einer Lösung von Enzymkonjugat in Testpuffer zugegeben, worauf weitere 2 h inkubiert wurde. Die abschließende Behandlung der Platten und die quantitative Bestimmung von TNF-BP I wurden vorgenommen, wie oben für den Serumtest angegeben.

Eine typische Eichkurve ist in Fig. 2 dargestellt (gefüllte Kreise: Serumproben; offene Kreise: Harnproben); sie erlaubt eine quantitative Bestimmung von TNF-BP I in einem Konzentrationsbereich zwischen 0.3 und 10 µg/l. Die nachweisbare Mindestmenge im Serum, definiert als Konzentration, die ein Signal entsprechend dem Blindwertsignal plus drei Standardabweichungen ergibt, wurde mit 0.2 µg/l bestimmt (Mittelwert, 4 unabhängige Assays). Bei Konzentrationen bis zu 1 mg/l (100facher Überschuß gegenüber dem normalen Testbereich) konnte kein "high-dose hook"-Effekt (Antigen im Überschuß) festgestellt werden. Die Empfindlichkeit des Tests für Harnproben war vergleichbar. Die Empfindlichkeit für Zellkulturproben liegt im Bereich von 0.1 µg/l, da diese Proben unverdünnt eingesetzt werden.

Die Genauigkeit des Serum-Asssays wurde überprüft, indem Serumproben mit einem Gehalt an TNF-BP I bei Konzentrationen von 2 und 10 µg/l in sechs verschiedenen Tests analysiert wurden. Die Intra-Assay- Variationskoeffizienten betrugen 4.7% bzw. 5.9%; die Inter-Assay-Variationskoeffizienten 6.6% bzw. 7.5%. Die Linearität wurde bestimmt, indem eine Serie von externen Zweifachverdünnungen von TNF-BP I im Serum (Konzentrationen zwischen 0.3 und 10 µg/l) untersucht und die lineare Regression der experimentell bestimmten Werte gegenüber den erwarteten Werten berechnet wurde. In drei unabhängigen Versuchen wurden Korrelationskoeffizienten zwischen 0.998 und 1 erhalten.

Die Wiederfindung von TNF-BP I mittels Serum-Assay wurde untersucht, indem exogenes TNF-BP I in zwei verschiedenen Konzentrationen (1 und 5 µg/l) dem Serum von 7 Normalspendern zugesetzt wurde. Dieser Versuch wurde dadurch erschwert, daß alle Proben endogenes TNF-BP I in verschiedenen Konzentrationen enthielten; diese Werte mußten daher vor der Berechnung der Wiederfindung abgezogen werden. Die durchschnittliche Wiederfindung wurde mit 83 ± 15% bei 1 µg/l und mit 85 ± 13% bei 5 µg/l (Bereich: 62-101% bzw. 65-105%) bestimmt.

Die Wiederfindung von TNF-BP I mittels des modifizierten Harn-Assays in 14 Harnproben, denen exogenes TNF-BP I zugesetzt wurde, wurde analog wie für die Serumproben untersucht; die durchschnittliche Wiederfindung bei einer nominalen Konzentration von 5 µg/l betrug 83 ± 15% (Bereich: 52-104%)

Um zu bestimmen, ob die physiologischen Liganden des TNF-Rezeptors die Wechselwirkung von TNF-BP I mit den Antikörpern beeinflussen, wurde der ELISA bei einer konstanten Konzentration von TNF-BP I (5 µg/l) in Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen von rekombinantem TNF-α (Gray et al., 1984) und rekombinantem TNF-β (Pennica et al., 1984), jeweils aus E.coli und mit einer Reinheit von < 99%, durchgeführt. Wie sich aus Fig. 3 ergibt (in C ist der Assay- Untergrund bei Fehlen von TNF-BP I dargestellt), inhibiert TNF-α die Reaktivität von TNF-BP I mit den Antikörpern bei Konzentrationen ≧ 10 µg/l; im Gegensatz dazu zeigte TNF-β keine Wirkung auch bei sehr hohen Konzentrationen (bis zu 100 mg/l).

Beispiel 4 Stabilität von TNF-BP I a) Stabilität im Serum

Filtersterilisierte Proben von gepooltem Normalserum wurden 24 h lang bei verschiedenen Temperaturen gelagert; außerdem wurden die Proben mehreren Einfrier/Auftauzyklen unterworfen. Wie sich aus Tab. 1 ergibt, beeinträchtigten weder die Inkubation bei Temperaturen von 37°C noch das mehrfache Gefrieren und Wiederauftauen die Immunreaktivität von TNF-BP I. Die Proben bestanden aus gepooltem Humanserum mit einem Gehalt von endogenem TNF-BP I (Probe 1: 1.2 µg/l) und derselben Serumprobe mit Zusatz von exogenem TNF-BP I (Probe 2: Endkonzentration 5 µg/l).

b) Stabilität im Harn

Die Versuche wurden durchgeführt, wie unter a) angegeben, wobei drei Proben untersucht wurden, die ein breites Spektrum von pH-Werten repräsentierten. Wie aus Tab. 1 hervorgeht, war TNF-BP I in allen Proben nach Gefrieren und Wiederauftauen stabil. Alle Proben konnten 24 h lang bei Temperaturen bis 37°C gelagert werden, ohne Aktivität einzubüßen. Die Harnproben stammten von drei verschiedenen Spendern (Probe 1: pH 5.1, 1.9 µg/l; Probe 2: pH 5.9, 4.0 µg/l; Probe 3: pH 7.2, 3.7 µg/l). "nd" bedeutet "nicht bestimmt".

Beispiel 5 Nachweis von TNF-BP I in Humanserum

Seren von 42 normalen Spendern (Blutspender und Laborpersonal) wurden mit Hilfe des in Beispiel 3 beschriebenen Serum-Sandwich-ELISAs untersucht.

TNF-BP I-Konzentrationen variierten zwischen 0.5 und 5.4 µg/l, bei einem Mittelwert von 2.1 µg/l (Standardabweichung 1.0 µg/l; Fig. 4). Von zwei Personen waren Serum, EDTA-Plasma, Citratplasma und Heparinplasma, gewonnen zum selben Zeitpunkt, verfügbar; die TNF-BP I-Konzentrationen unterschieden sich nicht signifikant (Spender A: 1.7, 2.0, 1.6 und 1.9 µg/l; Spender B: 1.8, 1.8, 1.8 und 1.9 µg/l). Die TNF-BP I-Konzentrationen in Seren von 15 Patienten mit chronischer Polyarthritis unterschieden sich nicht signifikant von denen gesunder Personen (2.3 ± 0.79 µg/l; Bereich: 1.2-3.9 µg/l). Signifikant erhöhte Werte wurden in Seren von Patienten mit schweren Verbrennungen gefunden (6.5 ± 1.7 µg/l; Bereich: 3.1-9.1 µg/l; n = 10). Patienten mit Nierenversagen (n = 6) zeigten bemerkenswert hohe Konzentrationen in einem Bereich von 20-69 µg/l (Mittelwert ± Standardabweichung: 49 ± 17 µg/l).

Beispiel 6

Unter Verwendung des in Beispiel 3 spezifisch für Harnproben entwickelten Sandwich-ELISA wurden die TNF-BP I-Konzentrationen in Harnproben von 16 Normalspendern bestimmt. Sie variierten zwischen 0.78 und 4.3 µg/l (Mittelwert ± Standardabweichung: 2.2 ± 1.2 µg/l). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen weiblichen (2.1 ± 1.4 µg/l; n = 9) und männlichen (2.2 ± 1.0 µg/l; n = 7) Spendern.

Beispiel 7 Bestimmung von TNF-BP I in Kulturüberständen von humanen Zellinien

Um festzustellen, ob der entwickelte ELISA sich für den Nachweis von TNF-BP I eignet, das von humanen Zellkulturen produziert wird, wurde eine Reihe von Zellinien untersucht. Kulturmedien (mit einem Gehalt von 10% FCS) wurden von dichten Kulturen geerntet, im allgemeinen mehrere Tage nach Verdünnung mit frischem Medium oder nach Passage von adhärenten Zellen. Kulturmedium mit einem Gehalt von 10% FCS wurde als Standardverdünnungsmittel verwendet; die Assays wurden in der einstufigen Version durchgeführt. TNF-BP I war in Überständen der Zellinien A549 (Lungenkarzinom; 1.1 µg/l), HeLa (Zervixkarzinom; 0.38 µg/l) und Namalwa (Burkitt-Lymphom; 0.25 µg/l) nachweisbar, lag jedoch unterhalb der Nachweisgrenze (100 ng/l) in den Zellinien U937 (Histiozyten-Lymphom), EoL-3 (eosinophile Leukämie), Raji (Burkitt-Lymphom), HL-60 (myeloide Leukämie), U266 (Myelom) und LuKII (B-lymphoblastoide Zellinie, immortalisiert durch Epstein-Barr Virus). In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen (Lantz et al., 1990b) wurde beobachtet, daß HL-60-Zellen, die in Gegenwart von TNF-β (10 µg/l) kultiviert wurden, erhöhte Mengen von TNF-BP I freisetzten; nach 4 Tagen dieser Behandlung wurde eine Konzentration von 0.45 µg/l erreicht.

TABELLE 1

Stabilität von TNF-BP in Serum und Harn

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Claims

1. Monoklonale Antikörper gegen TNF-BP I, sezerniert von den Hybridomzellinien ECACC 91060555 bzw. ECACC 91060556, oder aktive Fragmente davon.

2. Hybridomzellinien, hinterlegt bei der ECACC unter den Hinterlegungsnummern 91060555 bzw. 91060556.

3. Verfahren zur Bestimmung von TNF-BP I in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit dem Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060555, und/oder mit dem Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060556, in Kontakt gebracht wird und die Bildung eines binären oder ternären Komplexes zwischen dem in der Probe enthaltenen TNF-BP I und dem bzw. den Antikörper(n) bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildung eines ternären Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexes bestimmt wird, wobei als erster Antikörper der Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060555, oder der Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060556, und als zweiter Antikörper ein solcher eingesetzt wird, der die Fähigkeit besitzt, mit dem ersten Antikörper einen Antikörper/Antigen/Antikörper- Komplex zu bilden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als erster Antikörper der Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060555, und als zweiter Antikörper der Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060556, eingesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe eine Körperflüssigkeit ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Serum ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Plasma ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Harn ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ein Zellkulturüberstand ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die Probe mit dem trägergebundenem Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060555, in Kontakt gebracht wird,
b) der in a) gebildete Komplex mit dem Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060556, oder einem Antikörper, der in der Lage ist, mit dem Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060555, einen Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplex zu bilden, in Berührung gebracht wird, wobei der in diesem Schritt eingesetzte Antikörper eine meßbare Markierung aufweist,
c) die Menge des gebildeten Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexes durch Messung der Markierung bestimmt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß in b) ein Antikörper eingesetzt wird, der dasselbe Epitop von TNF-BP I oder einen Bereich davon erkennt wie im Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060556.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß in b) ein Enzym-gekoppelter Antikörper eingesetzt wird.

14. Verfahren zur Diagnose von pathologischen Zuständen des menschlichen Körpers, die mit einer Aktivierung des TNF-Rezeptorsystems verbunden sind, insbesonderen von Zuständen, bei denen die TNF-α-Konzentration rascher absinkt als die TNF-BP I-Konzentration, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Körperflüssigkeit die Konzentration von TNF-BP I bestimmt, indem man die Konzentration von TNF-BP I über dessen Bindung an den Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060555, und/oder den Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060556, bestimmt.

15. Verfahren nach Anspruch 14 zur Diagnose von septischem Schock.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Serum ist.

17. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Plasma ist.

18. Sandwich-Immunoassay-Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 4 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß er in einem Behälter den Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060555, und in einem weiteren Behälter den Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060556, enthält, wobei einer der beiden Antikörper eine meßbare Markierung aufweist.

19. Kit nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der nicht-markierte Antikörper an einen festen Träger gebunden ist.

20. Kit nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060555, oder der Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060556, durch einen anderen Antikörper ersetzt ist, der die Fähigkeit aufweist, mit dem Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060556, bzw. dem Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060555, einen Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplex zu bilden.

21. Kit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der in Anspruch 20 definierte Ersatzantikörper an dasselbe oder an ein überlappendes Epitop von TNF-BP I bindet wie der Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060555, bzw. der Antikörper, sezerniert von der Hybridomzellinie ECACC 91060556.