DE4118200C1 - In-vitro testing for adhesion of dressing to wound - by forming agar or agarose-collagen matrix, applying human plasma, calcium chloride soln. and clotting agent and warming until onset of fibrin net formation, etc. - Google Patents
In-vitro testing for adhesion of dressing to wound - by forming agar or agarose-collagen matrix, applying human plasma, calcium chloride soln. and clotting agent and warming until onset of fibrin net formation, etc.Info
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, das es ermöglicht in-vitro zu prüfen, inwieweit eine Wundauflage mit einer Wunde verklebt sowie ein Substrat dafür.The invention relates to a method that makes it possible to check in vitro to what extent a wound dressing has stuck to a wound and a substrate for it.
Die Prüfung der Verklebung von Wundauflagen erfolgt bisher u. a. an Versuchstieren. Ein in-vivo Modell an Meerschweinchen (Doppelringwunden-Modell) wurde von H. Baron (Baron, H., Untersuchung über Wundtextil- Verklebung, Arzneimittel-Forschung 1955, 4, 237-241) entwickelt. Diese Versuche sind mit dem Einsatz von Versuchstieren verbunden.The examination of the bonding of wound dressings is carried out so far u. a. on experimental animals. An in vivo model Guinea Pig (double ring wound model) was designed by H. Baron (Baron, H., Investigation of wound textile Bonding, drug research 1955, 4, 237-241) developed. These attempts are with the use of Laboratory animals connected.
Neuere Literatur zu diesem Thema beschreibt die klinische Studie, die von W. D. Malone durchgeführt wurde (Malone, W. D., Wound dressing adherence: a clinical comparative study, Archives of Emergency Medicine, 1987, 4, 101-105).More recent literature on this topic describes the clinical trial conducted by W. D. Malone (Malone, W.D., Wound dressing adherence: a clinical comparative study, Archives of Emergency Medicine, 1987, 4, 101-105).
In dieser Studie wurden 4 verschiedene Wundauflagen, die als nicht-klebend bezeichnet waren, an 40 Patienten getestet. In this study, 4 different wound dressings which were designated as non-sticky on 40 patients tested.
Der Grad der Verklebung wurde am Schmerzempfinden der Patienten beim Entfernen der Auflage von der Wunde gemessen.The degree of adhesion was based on the pain sensation of the Patient removing the pad from the wound measured.
Die von Baron entwickelte Prüfmethode und die Studie von Malone haben beide den Nachteil, daß eine Standardisierung der Versuche schwierig ist, da die Wundarten, Wundtiefe und die Zusammensetzung der Bakterienflora individuell verschieden sind.The test method developed by Baron and the study from Malone both have the disadvantage that one Standardization of the trials is difficult since the Wound types, wound depth and the composition of the Bacterial flora are individually different.
Eine Alternative zu tierexperimentellen Studien stellt die von Scales & Winter (Scales, J. T. & Winter, G. D., The adhesion of Wound dressings, an experimental study, Wound Healing: Proceedings of a Symposium 12/13 November 1959, 54-61) vorgeschlagene und durchgeführte in-vitro Methode mit verdünntem menschlichem Serum dar.An alternative to animal studies those of Scales & Winter (Scales, J. T. & Winter, G. D., The adhesion of wound dressings, an experimental study, Wound Healing: Proceedings of a Symposium 12/13 November 1959, 54-61) proposed and carried out in vitro method with diluted human serum.
Diese Methode basiert auf der Tatsache, daß die Wundauflage mit der Wunde durch das Wundexudat verklebt. Scales & Winter haben verschiedene Wundauflagen mit 33%iger Serumlösung getränkt und diese auf eine mit Human Serum beschichtete Oberfläche gelegt. Nach Trocknen bei 37°C und 60% rel. Luftfeuchte wurden in 1/2 stündlichem Abstand über 24 Stunden lang die Proben von der beschichteten festen Unterlage "abgeschält". Die hierfür benötigte Kraft wurde mit einem Tensiometer ermittelt.This method is based on the fact that the Wound dressing with the wound through the wound exudate glued. Scales & Winter have different ones Wound dressings soaked in 33% serum solution and this on a surface coated with human serum placed. After drying at 37 ° C and 60% rel. Humidity were at 1/2 hour intervals for 24 hours the samples from the coated solid support "peeled off". The force required for this was included determined with a tensiometer.
Diese Ersatzmethode für tierexperimentelle Studien entspricht jedoch nur zum Teil den Anforderungen, die an eine ideale in-vitro Alternative gestellt werden, da die Ausbildung des Fibrinnetzes in Verbindung mit der zu prüfenden Wundauflage und in Verbindung mit den Collagenfasern nicht in feuchtem Milieu wie bei einer wirklichen Wunde stattfindet und außerdem eine praktische und schnelle Durchführung der Versuche mit der Möglichkeit zur Übertragung auf in-vivo Bedingungen nur zum Teil gewährleistet ist.This replacement method for animal studies however only partially meets the requirements that an ideal in-vitro alternative, because the formation of the fibrin network in connection with the wound dressing to be tested and in connection with the Collagen fibers are not in a moist environment as in one real wound takes place and also a practical and quick execution of the tests the possibility of transfer to in vivo conditions is only partially guaranteed.
Das Verkleben einer Wundauflage ist u. a. ein Problem der Adhäsion von zwei Flächen durch einen Kleber, nämlich das Wundsekret.Gluing a wound dressing is u. a. a problem the adhesion of two surfaces with an adhesive, namely the wound secretion.
Die Adhäsion kann im Verlauf der Wundheilung in zwei Phasen unterteilt werden:Adhesion can occur in two during wound healing Phases are divided:
- - Die Phase I ist fibrinabhängig und verläuft zwischen dem Zeitraum der Wundentstehung und 72 Stunden danach.- Phase I is dependent on fibrin and proceeds between the period of wound formation and 72 Hours after.
- - Die Phase II beginnt 72 Stunden nachdem eine Wunde entstanden ist und ist eng gekoppelt an die Neubildung von Gefäßen und Granulationsgewebe.- Phase II begins 72 hours after a wound arose and is closely linked to the New formation of vessels and granulation tissue.
Es war daher Aufgabe der Erfindung, eine Nachstellung der Vorgänge, die in der Phase I der Wundheilung stattfinden und die für das Phänomen der Wundverklebung verantwortlich sind, in einem in-vitro Test zu realisieren.It was therefore an object of the invention to readjust of the processes involved in phase I wound healing take place and for the phenomenon of wound adhesion are responsible in an in vitro test realize.
Das heißt, es war ein Verfahren zu entwickeln, das es ermöglichte, in-vitro möglichst rasch, einfach und reproduzierbar zu prüfen, ob und wie stark eine Wundauflage mit einer Wunde verkleben würde.That said, it was a process to develop it enabled, in vitro as quickly, easily and reproducibly to check whether and how strong a Would stick to a wound dressing.
Da ein Verkleben der Wundauflage mit der Wunde in der Regel unerwünscht ist, ermöglicht ein solches Verfahren durch ständiges Testen die gezielte Entwicklung von nichtverklebenden Auflagen.Since the wound dressing sticks to the wound in the Such a method makes it generally undesirable through constant testing the targeted development of non-adhesive pads.
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1. This task is solved by a procedure according to Claim 1.
Das Wesentliche bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß sich dabei ein praktisch völlig gleichmäßiges Fibrinnetz auf der Oberfläche der Matrix ausbildet und gleichzeitig auch mit dieser einen Verbund eingeht.The essentials in the method according to the invention is that there is a practically completely uniform Fibrin network forms on the surface of the matrix and at the same time also enters into a network.
Durch die Fibrinnetzbildung in-vitro auf einer Agar-Collagen Matrix kann die in der Phase I der Wundheilung stattfindende biologische Verklebungsreaktion mit einer daraufliegenden Wundauflage im Versuch simuliert werden. Dabei entsteht das Fibrinnetz unter der zu prüfenden Wundauflage.Due to the in vitro formation of fibrin on a Agar collagen matrix can be used in phase I of the Biological healing Bonding reaction with an overlying one Wound dressing can be simulated in the experiment. This creates the fibrin network under the wound dressing to be tested.
Vorzugsweise wird das Verfahren in der Weise ausgeführt, daß man eine 1-3%ige wäßrige Lösung aus Agar oder Agarose, beispielsweise Agarose Standard Low mr, durch Erhitzen auf 100-150°C herstellt, diese auf etwa 50°C abkühlen läßt und 0,1 bis 2 Gew.-% im wesentlichen unlösliches Collagen, beispielsweise aus Rinderachillesferse, zufügt. Die Suspension wird anschließend in kleine Petrischalen gegossen (ca. 10 ml/Schale) und bei Raumtemperatur bis zum völligen Erkalten stehengelassen. Anschließend können die Petrischalen mit dem Agar/Collagen-Boden im Kühlschrank bei +4°C für 2 bis 3 Tage aufbewahrt werden.The process is preferably carried out in such a way that a 1-3% aqueous solution of agar or agarose, for example Agarose Standard Low m r , is prepared by heating to 100-150 ° C., allowed to cool to about 50 ° C. and 0.1 to 2% by weight of essentially insoluble collagen, for example from beef achilles heel, is added. The suspension is then poured into small petri dishes (approx. 10 ml / dish) and left at room temperature until it has completely cooled. The petri dishes with the agar / collagen base can then be stored in the refrigerator at + 4 ° C for 2 to 3 days.
Zur Herstellung des Fibrinnetzes werden 0,5-3 ml Humanplasma, 0,5-3 ml 0,025 mol. CaCl2-Lösung und 0,5-3 ml Gerinnungsreagenz (Actin® FS der Fa. Baxter, Reagenz zur Aktivierung der Gerinnung über das endogene System) nacheinander auf den Agar-Collagen Boden pipettiert.To produce the fibrin network, 0.5-3 ml of human plasma, 0.5-3 ml of 0.025 mol. CaCl 2 solution and 0.5-3 ml of coagulation reagent (Actin ® FS from Baxter, reagent for activating coagulation via the endogenous system) are successively pipetted onto the agar-collagen soil.
Die so beschichtete Petrischale wird bei 25°C-37°C für ca. 30 bis 60 min. in den Brutschrank gestellt. Das Fibrinnetz beginnt sich zu bilden.The Petri dish thus coated is at 25 ° C-37 ° C for approx. 30 to 60 min. placed in the incubator. The Fibrin network begins to form.
Die zu prüfenden Wundauflagen werden in ca. 2×2 cm große Stücke geschnitten und mittels Pinzette auf das noch flüssige und noch nicht vollständig ausgebildete Fibrinnetz gelegt. Dieser Zustand wird visuell überprüft und ist nach ca. 30 Minuten erreicht. Er kann je nach Blutspender jedoch auch etwa länger dauern. Anschließend wird die Petrischale wieder mit der Wundauflage bei 37°C für 60 bis 120 min. in den Brutschrank gestellt bis zur völligen Ausbildung des Fibrinnetzes.The wound dressings to be tested are approx. 2 × 2 cm Cut large pieces and use tweezers on the still fluid and not yet fully trained Fibrin network laid. This condition is checked visually and is after approx. 30 minutes reached. However, depending on the blood donor, it can also take longer. Then the petri dish again with the wound dressing at 37 ° C for 60 to 120 min. placed in the incubator until fully trained of the fibrin network.
Dann wird die Wundauflage mittels Pinzette von der Petrischale entfernt und das Fibrinnetz auf Verletzung hin untersucht.Then the wound dressing is removed from the Petri dish removed and the fibrin mesh on injury examined.
Die Verklebungseigenschaften von Wundauflagen werden anhand der Verletzung des Fibrinnetzes beurteilt, d. h. ein verletztes Fibrinnetz wird mit einer Verklebung der Wundauflage mit der Wunde gleichgesetzt. Morphologische Veränderungen im Fibrinnetz und Ablagerungen oder Verfärbungen können im Versuch mit beurteilt werden.The adhesive properties of wound dressings are judged by the violation of the fibrin network, d. H. an injured fibrin network is glued to the Wound dressing equated with the wound. Morphological Changes in the fibrin network and deposits or Discoloration can also be assessed in the test.
Die Protokollierung und die Auswertung der Versuche erfolgt in der Regel mittels Licht- und evtl. Rasterelektronenmikroskopie.The logging and evaluation of the tests usually takes place by means of light and possibly Scanning electron microscopy.
Die Ergebnisse der Versuche werden anhand von drei Bewertungskriterien ausgewertet:The results of the trials are based on three Evaluation criteria evaluated:
- 1. Die Wundauflage verklebt nicht, bedeutet, daß ein vollständiges Fibrinnetz unter der Wundauflage gebildet wurde. Nach Entfernung derselben bleibt das Fibrinnetz intakt.1. The wound dressing does not stick, means that a complete fibrin network under the wound dressing was formed. After removing it remains the fibrin network is intact.
- 2. Die Wundauflage verklebt, bedeutet, daß das Fibrinnetz nicht vollständig unter der Wundauflage gebildet wird, bzw. beim Entfernen derselben reißt das gebildete Netz auf und bleibt an der Oberfläche der Wundauflage haften.2. The wound dressing glued means that the Fibrin mesh not completely under the wound dressing is formed, or tears when removing them the network formed and remains on the Adhere to the surface of the wound dressing.
- 3. Nebeneffekte: Als Nebeneffekt werden die nach Entfernung der Wundauflage evtl. vorhandenen Rückstände aus der Wundauflage auf dem Fibrinnetz festgestellt.3. Side effects: As a side effect, the after Removal of the wound dressing, if any Residues from the wound dressing on the fibrin mesh detected.
Die Anwendung des erfindungemäßen in-vitro Wundverklebungstests kann durch folgende Beispiele näher erläutert werden:The application of the in vitro according to the invention Wound adhesive tests can be done by the following examples are explained in more detail:
In eine Petrischale wurden 10 ml einer noch warmen 1%igen, wäßrigen Agarose-Lösung mit 0,1% Collagen pipettiert. Anschließend wurde die Schale bei Raumtemperatur bis zum Erkalten stehengelassen. Danach wurden 1 ml Humanblutplasma, 1 ml wäßrige 0,025 molare CaCl2-Lösung und 1 ml Gerinnungsreagenz (Actin® FS der Fa. Baxter, München, Reagenz zur Aktivierung der Gerinnung über das endogene System) nacheinander hinzupipettiert.10 ml of a warm 1% aqueous agarose solution containing 0.1% collagen were pipetted into a petri dish. The dish was then left to cool at room temperature. Then 1 ml of human blood plasma, 1 ml of aqueous 0.025 molar CaCl 2 solution and 1 ml of coagulation reagent (Actin ® FS from Baxter, Munich, reagent for activating coagulation via the endogenous system) were pipetted in successively.
Die Petrischale wurde vorsichtig in einen auf 37°C vorgeheizten Brutschrank gelegt und für 30 min. inkubiert. Das Fibrinnetz beginnt sich zu bilden. Anschließend wurden ein 2×2 cm großes Gelatine-Folienstück und ein 2×2 cm großes Stück der Wundauflagen von Hansamed® soft und Hansamed® universal (ein Spezial-Zellstoff-Gewirke und ein Viskose-Zellwoll-Vlies mit Polyesterschicht) in die Mitte jeweils einer Petrischale gelegt. Der Versuch wurde mit 12fachen Wiederholungsansätzen ausgeführt.The Petri dish was carefully placed in an incubator preheated to 37 ° C and left for 30 min. incubated. The fibrin network begins to form. Then a 2 × 2 cm piece of gelatin film and a 2 × 2 cm piece of the wound dressings from Hansamed ® soft and Hansamed ® universal (a special cellulose knitted fabric and a viscose cellulose fleece with a polyester layer) were placed in the middle placed in a petri dish. The experiment was carried out with 12 repetitions.
Die so beschichteten und bestückten Petrischalen wurden abermals vorsichtig in den Brutschrank bei 37°C für 120 min. gelegt. Das Fibrinnetz ist nach dieser Zeit vollständig ausgebildet.The Petri dishes were coated and equipped in this way again carefully in the incubator at 37 ° C for 120 min. placed. The fibrin network is after that time fully trained.
Anschließend wurden die Schalen aus dem Brutschrank entnommen, und es erfolgte die Auswertung der Versuche.The trays were then removed from the incubator removed and the tests were evaluated.
Hierfür wurden die zu prüfenden Gelatine-Labormuster und die Wundauflagen mittels Pinzette entfernt und das Fibrinnetz nach Schäden bzw. Rückständen untersucht. Die Versuche zeigten, daß die Gelatinefolien beim Entfernen von der Petrischale das Fibrinnetz völlig zerreißen, d. h. die Gelatinefolie verklebt mit der Wunde.The gelatin laboratory samples to be tested were used for this and removed the wound dressings with tweezers and that Fibrin network examined for damage or residues. The experiments showed that the gelatin foils at Completely remove the fibrin network from the Petri dish tear, d. H. the gelatin film glued to the Wound.
Nach Entfernung der beiden anderen Wundauflagen von der Petrischale zeigte sich ein intakt gebildetes und gebliebenes Fibrinnetz. Lediglich ein Abdruck der Wundauflage auf dem Fibrinnetz war zu erkennen. Es fand keine Verklebung statt.After removing the other two wound dressings from the Petri dish showed an intact and formed remained fibrin network. Just an imprint of the Wound dressing on the fibrin network was recognizable. It found no gluing instead.
In diesem Versuch wurde die gleichmäßige Fibrinnetz-Bildung und die Verbindung zwischen Fibrinnetz und der Agar-Collagen Matrix mittels Färbung ermittelt.In this experiment, the uniform Fibrin network formation and the connection between Fibrin network and the agar-collagen matrix by means of staining determined.
In eine Petrischale wurden wieder 10 ml einer warmen 1%igen Agarose-Lösung mit 0,1% Collagen pipettiert. Die Schale wurde anschließend bis zum völligen Erkalten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurden 1 ml Humanplasma, 1 ml 0,025 mol. CaCl2-Lösung und 1 ml Gerinnungsreagenz (Actin® FS der Fa. Baxter, Reagenz zur Aktivierung der Gerinnung über das endogene System) nacheinander zupipettiert. 10 ml of a warm 1% agarose solution with 0.1% collagen were pipetted into a petri dish. The dish was then left to cool to room temperature. Then 1 ml of human plasma, 1 ml of 0.025 mol. CaCl 2 solution and 1 ml of coagulation reagent (Actin® FS from Baxter, reagent for activating coagulation via the endogenous system) are pipetted in successively.
Die Petrischale wurde vorsichtig in einen auf 37°C vorgeheizten Brutschrank gelegt und für 120 min. inkubiert.The petri dish was carefully placed in a 37 ° C preheated incubator placed and for 120 min. incubated.
Das Fibrinnetz war nach dieser Zeit vollständig ausgebildet.The fibrin network was complete after this time educated.
Anschließend wurde eine Farblösung hergestellt nach einem Vorschlag von Marion Bradford (M. Bradford, 1976, A Rapid and Sensitiv Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein Dye Binding, Analytical Biochemistry 72, 248- 254).A color solution was then prepared according to a suggestion by Marion Bradford (M. Bradford, 1976, A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein Dye Binding, Analytical Biochemistry 72, 248- 254).
100 mg Coomassie Brilliant Blue 6-250 (der Fa. Sigma, Deisenhofen) wurden in 50 ml 95%igem Ethanol gelöst. Anschließend wurden 100 ml 85%ige Phosporsäure hinzupipettiert. Die Lösung wurde auf ein Endvolumen von 1 Liter mit dest. Wasser aufgefüllt.100 mg Coomassie Brilliant Blue 6-250 (from Sigma, Deisenhofen) were dissolved in 50 ml of 95% ethanol. Then 100 ml of 85% phosphoric acid pipetted in. The solution was made to a final volume of 1 liter with dist. Replenished water.
1 ml dieser Lösung wurde auf die Petrischale pipettiert.1 ml of this solution was placed on the petri dish pipetted.
Es zeigte sich deutlich eine Blaufärbung der Schale mit abgesetzten Collagenfasern und einem auf der Oberfläche netzartigen Gebilde, welches das Fibrinnetz darstellt.There was a clear blue coloration of the shell contrasted collagen fibers and one on the surface net-like structure, which represents the fibrin network.
Das Fibrinnetz war gleichmäßig ausgebildet und ging eindeutig eine Verbindung mit der darunterliegenden Agar-Collagen Matrix ein. Diese Tatsache ist für den Einsatz dieses Testmodells als in-vitro Test zur Bewertung der Verklebung von Wundversorgungsprodukten von Bedeutung, weil die in-vivo vorhandene Verbindung zwischen den Fibrinfasern und dem Collagen im in-vitro Test gewährleistet ist.The fibrin network was even and developed clearly a connection with the one below Agar collagen matrix. This fact is for the Use of this test model as an in vitro test for Evaluation of the bonding of wound care products important because of the in vivo connection between the fibrin fibers and the collagen in in vitro Test is guaranteed.
Claims (3)
Herstellen einer Agar/Collagen- oder Agarose/Collagen-Matrix,
Aufbringen auf diese Matrix von Humanplasma, eine wäßrige CaCl2-Lösung und Gerinnungsreagenz, Erwärmen bei ca. 37°C bis sich das Fibrinnetz zu bilden beginnt,
Auflegen einer Probe der zu prüfenden Wundauflage, weiteres Warmhalten bei ca. 37°C bis sich das Fibrinnetz vollständig ausgebildet hat,
Abziehen der Wundauflage und Auswerten des Versuchs. 1. Method for testing the adhesion of a wound dressing to a wound in vitro, characterized by the process steps
Preparation of an agar / collagen or agarose / collagen matrix,
Application to this matrix of human plasma, an aqueous CaCl 2 solution and coagulation reagent, heating at about 37 ° C. until the fibrin network begins to form,
Place a sample of the wound dressing to be tested, keep warm at approx. 37 ° C until the fibrin network has completely formed,
Remove the wound dressing and evaluate the test.
daß man eine 1-3%ige wäßrige Lösung aus Agar oder Agarose durch Erhitzen auf 100-750°C herstellt, nach Abkühlen auf ca. 50°C 0,1 bis 2% im wesentlichen unlösliches Collagen zufügt, beispielsweise ca. 10 ml dieser Suspension in beispielsweise eine kleine Petrischale gibt und abkühlen läßt,
daß man auf diese Unterlage nacheinander etwa 0,5 bis 3 ml Humanplasma, 0,5 bis 3 ml ca. 0,025 molare wäßrige CaCl2-Lösung und 0,5 bis 3 ml Gerinnungsreagenz gibt,
daß man die Schale bei 25-37°C für ca. 30-60 Minuten erwärmt, bis sich das Fibrinnetz zu bilden beginnt,
daß man ein Stückchen der zu prüfenden Wundauflage auf die noch flüssige Schicht legt,
daß man die Schale nochmals ca. 60-120 Minuten lang bei ca. 37°C warm hält,
daß man die Wundauflage abnimmt und das Ergebnis auswertet.2. The method according to claim 1, characterized in that
that a 1-3% aqueous solution of agar or agarose is prepared by heating to 100-750 ° C., after cooling to about 50 ° C. 0.1 to 2% essentially insoluble collagen is added, for example about 10 ml of this Put the suspension in a small petri dish and let it cool,
that about 0.5 to 3 ml of human plasma, 0.5 to 3 ml of about 0.025 molar aqueous CaCl 2 solution and 0.5 to 3 ml of coagulation reagent are added to this support in succession,
that the shell is heated at 25-37 ° C for about 30-60 minutes until the fibrin network begins to form,
that a piece of the wound dressing to be tested is placed on the still liquid layer,
that the dish is kept warm again at about 37 ° C for about 60-120 minutes,
that you remove the wound dressing and evaluate the result.
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