DE4117255A1

DE4117255A1 - Enzymatic hydrolysis of carboxylic acid derivs. - by forming a soln. of the acid deriv. in an organic solvent with only slight water miscibility, saturating the soln. with water and contacting with a hydrolase

Info

Publication number: DE4117255A1
Application number: DE4117255A
Authority: DE
Inventors: Maria Dipl Ing Buchner; Robert Estermann; Herbert Mayerhofer; Gerald Dr Banko
Original assignee: Chemie Linz Deutschland GmbH
Current assignee: Chemie Linz Deutschland GmbH
Priority date: 1991-05-27
Filing date: 1991-05-27
Publication date: 1992-12-03

Abstract

Process for enzymatic hydrolysis of a carboxylic acid deriv. (I) in which the (I) is dissolved in an organic solvent (II) which is only slightly miscible with water, the soln. is satd. with water and contacted with a hydrolase, whereby hydrolysis takes place with consumption of water, and the organic reaction soln. is resatd. with water and contacted with hydrolase until the desired degree of conversion has taken place. USE/ADVANTAGE - The process allows high conversion of the (I) to be achieved with maintenance of high activity of the hydrolase, without the necessity for chemical modification of the hydrolase. (I) is e.g. carboxylic acid esters, -diesters and -triesters, carboxylic acid amides, carboxylic acid thioesters or analagous thiocarboxylic derivs., which upon hydrolysis yield the corresponding carboxylic acid or thiocarboxylic acid and alcohols, amines, thiols etc. Pref. (I) is a chiral or prochiral carboxylic acid deriv., which can be hydrolysed with a stereospecific hydrolase into optically active cpds., in which one of the possible enantiomers, depending on the stereospecificity of the hydrolase, is at least enriched. (I) is esp. a mixt. of enantiomeric chiral carboxylic acid esters exhibiting the chiral centre in the acid part, esp. 2-substd. alkanoic acid esters and partic. 2-halopropionic acid esters.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse eines Carbonsäurederivates in einem organischen Lösungsmittel.The invention relates to a method for enzymatic hydrolysis a carboxylic acid derivative in an organic solvent.

Eine große Anzahl von Enzymen ist befähigt, Carbonsäurederivate mehr oder weniger spezifisch zu hydrolisieren. Diese Eigenschaft der Hydrolasen wird seit langem wirtschaftlich genutzt. Dabei ist zu beachten, daß Hydrolasen normalerweise in wäßrigen Lösungen gute Umsetzungsraten und im allgemeinen geringe Aktivitätsverluste zeigen, daß sie jedoch in Wasser löslich und nur selten aus wäßri gen Reaktionslösungen zurückzugewinnen und erneut einsetzbar sind. Kovalent immobilisierte Hydrolasen sind zwar aus wäßrigen Lösungen wiedergewinnbar, sie weisen jedoch geringere Umsetzungsraten und schlechtere Aktivitäten auf, als eine gleiche Mengen Hydrolase, die in nicht immobilisierter Form eingesetzt wird. Zusätzlich wird aus Enzymimmobilisaten in wäßrigen Systemen immer auch Enzym her ausgelöst.A large number of enzymes are capable of carboxylic acid derivatives to hydrolyze more or less specifically. This attribute the hydrolase has been used economically for a long time. It is note that hydrolases are normally in aqueous solutions good implementation rates and generally low activity losses show that, however, they are soluble in water and rarely from water recover reaction solutions and can be used again. Covalently immobilized hydrolases are from aqueous solutions recoverable, but they have lower conversion rates and worse activity than an equal amount of hydrolase, which is used in a non-immobilized form. In addition, Enzyme is always produced from enzyme immobilisates in aqueous systems triggered.

Es wurde daher auch schon versucht, enzymatische Hydrolysen in or ganischem Medium durchzuführen. So ist in Pakistan Journal of Bio chemistry, Vol. 10, Nr. 2, 1976 geoffenbart, daß bei der Hydrolyse von Carbonsäureestern die anfängliche Hydrolysegeschwindigkeit in organischem Medium manchmal höher sein kann, als in wäßrigem Me dium, allerdings sinkt die Aktivität der Hydrolase im organischen Medium rasch ab, da Hydrolasen gegenüber organischen Lö sungsmitteln empfindlich sind.Therefore, attempts have already been made to carry out enzymatic hydrolysis in or perform ganic medium. This is the Journal of Bio in Pakistan chemistry, Vol. 10, No. 2, 1976, disclosed in the hydrolysis of carboxylic acid esters the initial hydrolysis rate in organic medium can sometimes be higher than in aqueous Me dium, however, the activity of the hydrolase in the organic decreases Medium quickly, since hydrolases versus organic solvents solvents are sensitive.

In Chemical Abstracts Vol. 112, 154387z wird daher vorgeschlagen, Hydrolasen chemisch zu modifizieren, um deren Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln zu erhöhen.Chemical Abstracts Vol. 112, 154387z therefore proposes Chemically modify hydrolases to show their tolerance to increase organic solvents.

In Chemical Abstracts Vol. 109, 188832n ist eine enzymatische Hydrolyse mit einer chemisch modifizierten Hydrolase in wassergesättigtem Benzol beschrieben.In Chemical Abstracts Vol. 109, 188832n is an enzymatic Hydrolysis with a chemically modified hydrolase in described water-saturated benzene.

Es wurde nun unerwarteterweise gefunden, daß es für gute Umset zungsraten und gleichbleibend hohe Aktivität einer Hydrolase in einem organischen Lösungsmittel nicht notwendig ist, die Hydrolase chemisch zu modifizieren, wenn man ein organisches Lösungsmittel verwendet, das mit Wasser nur in geringem Ausmaß mischbar ist und wenn man dafür sorgt, daß das organische Lösungsmittel im Verlauf der Hydrolyse, bei der Wasser verbraucht wird, mit Wasser gesät tigt bleibt.It has now been unexpectedly found to be good for implementation rates and consistently high activity of a hydrolase in an organic solvent is not necessary, the hydrolase chemically modify it when using an organic solvent used, which is only miscible with water to a small extent and if you make sure that the organic solvent in the course the hydrolysis that consumes water is sown with water remains.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse eines Carbonsäurederivates, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Carbonsäurederivat in einem organischen Lösungsmit tel, das mit Wasser nur in einem geringen Ausmaß mischbar ist, ge löst wird, worauf die Lösung mit Wasser gesättigt und mit einer Hydrolase in Kontakt gebracht wird, wobei eine Hydrolyse unter Wasserverbrauch stattfindet, worauf die organische Reaktionslösung solange erneut mit Wasser gesättigt und mit der Hydrolase in Kon takt gebracht wird, bis der gewünschte Umsetzungsgrad erreicht ist.The invention therefore relates to a method for enzymatic Hydrolysis of a carboxylic acid derivative, characterized in that is that the carboxylic acid derivative in an organic solution tel, which is only miscible with water to a small extent, ge is dissolved, whereupon the solution is saturated with water and with a Hydrolase is contacted, with hydrolysis under Water consumption takes place, whereupon the organic reaction solution as long as saturated again with water and with the hydrolase in Kon clock is brought until the desired degree of implementation is achieved is.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Hydrolyse von Carbonsäure derivaten, die mit Hilfe einer Hydrolase enzymatisch hydrolisier bar sind, geeignet. Solche Carbonsäurederivate sind beispielsweise Carbonsäureester, -diester, -triester, Carbonsäureamide, Carbon säurethioester usw. oder deren analoge Thiocarbonsäurederivate. Eine besondere Bedeutung hat das Verfahren für die Hydrolyse von Carbonsäurederivaten, die im Säureteil oder im Derivatteil Substi tuenten tragen, die ein chirales Zentrum im Molekül bedingen oder von Carbonsäurederivaten, bei denen durch die Hydrolyse ein chirales Zentrum entsteht. Solche chirale oder prochirale Carbon säurederivate können mit Hilfe einer stereospezifischen Hydrolase in optisch aktive Verbindungen hydrolisiert werden, in denen eines der möglichen Enantiomeren je nach der Stereospezifität der Hydro lase zumindest angereichert vorliegt, wobei unter chiralen Carbon säurederivaten sowohl racemische Gemische als auch Gemische, in denen eines der möglichen Enantiomeren zumindest angereichert vor liegt, zu verstehen sind. The process according to the invention is for the hydrolysis of carboxylic acid derivatives which are hydrolysed enzymatically with the aid of a hydrolase are suitable. Such carboxylic acid derivatives are, for example Carboxylic acid esters, diesters, triesters, carboxamides, carbon acid thioesters etc. or their analog thiocarboxylic acid derivatives. The process is of particular importance for the hydrolysis of Carboxylic acid derivatives, the Substi in the acid part or in the derivative part tuenten that cause a chiral center in the molecule or of carboxylic acid derivatives, in which by hydrolysis chiral center arises. Such chiral or prochiral carbon Acid derivatives can be created using a stereospecific hydrolase be hydrolyzed into optically active compounds in which one the possible enantiomers depending on the stereospecificity of the hydro lase is at least enriched, with chiral carbon acid derivatives both racemic mixtures and mixtures, in which one of the possible enantiomers is at least enriched is to be understood.

Bevorzugt sind unter Carbonsäurederivate Mischungen von Enantiome ren chiraler Carbonsäureester, die das chirale Zentrum im Säureteil aufweisen, besonders bevorzugt 2-substituierte Alkansäure ester, ganz besonders bevorzugt 2-Halogenpropionsäureester, zu verstehen.Mixtures of enantiomes are preferred among carboxylic acid derivatives ren chiral carboxylic acid ester, which is the chiral center in the acid part have, particularly preferably 2-substituted alkanoic acid esters, very particularly preferably 2-halopropionic acid esters understand.

Als Hydrolyseprodukte entstehen dementsprechend Carbonsäuren oder Thiocarbonsäuren und Alkohole, Amine, Thiole, usw. wobei entweder die Carbonsäuren oder die Alkohole, Amine, Thiole usw. oder auch beide als erwünschte Reaktionsprodukte vorgesehen sein und gewon nen werden können.Accordingly, carboxylic acids or are formed as hydrolysis products Thiocarboxylic acids and alcohols, amines, thiols, etc. being either the carboxylic acids or the alcohols, amines, thiols etc. or also both be provided as desired reaction products and won can be.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zuerst ein Carbonsäurederivat in einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nur in einem geringen Ausmaß mischbar ist, gelöst. Als organisches Lösungsmittel dienen z. B. Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Hexan, Benzol, Toluol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Ethylen chlorid, Chlorbenzole, oder Ether, wie Diethylether, Di isopropylether, oder Mischungen solcher Lösungsmittel. Bevorzugte Lösungsmittel sind Ether, insbesonders Diisopropylether. Die Aus wahl des Lösungsmittels kann dabei von Bedeutung sein, da die Re aktion in einem bestimmten Lösungsmittel schneller ablaufen kann, als in einem anderen. Es kann unter Umständen von Vorteil sein, dem organischen Lösungsmittel eine kleine Menge eines organischen Co-Lösungsmittels, das mit Wasser mischbar ist, wie etwa einen Al kohol, z. B. Methanol, Ethanol, Isopropanol, ein Keton, z. B. Ace ton usw. zuzugeben, um die Löslichkeit des Carbonsäurederivates im organischen Lösungsmittel zu erhöhen. Die zugegebene Menge des Co- Lösungsmittels muß aber so gering sein, daß das organische Lö sungsmittel durch Zugabe des Co-Lösungsmittels nicht völlig mit Wasser mischbar wird. Das Lösungsmittel für eine gewünschte Umset zung ist für den Fachmann durch einfache Vorversuche leicht zu finden.To carry out the method according to the invention, first a Carboxylic acid derivative in an organic solvent Water is only miscible to a small extent. As an organic solvent z. B. hydrocarbons, such as Pentane, hexane, benzene, toluene, halogenated hydrocarbons, such as methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride, ethylene chloride, chlorobenzenes, or ethers, such as diethyl ether, Di isopropyl ether, or mixtures of such solvents. Preferred Solvents are ethers, especially diisopropyl ether. The out The choice of solvent can be important because the Re action can run faster in a certain solvent, than in another. It may be an advantage the organic solvent a small amount of an organic Co-solvent that is miscible with water, such as an Al alcohol, e.g. B. methanol, ethanol, isopropanol, a ketone, e.g. B. Ace ton etc. to add to the solubility of the carboxylic acid derivative in increase organic solvents. The amount of Co- But solvent must be so low that the organic Lö not completely with the addition of the co-solvent Water becomes miscible. The solvent for a desired implementation Tension is easy for the specialist by simple preliminary tests Find.

Die Lösung der Ausgangsverbindung in dem organischen Lösungsmittel wird so konzentriert als möglich hergestellt, wobei die Kon zentration des Ausgangsproduktes im Lösungsmittel vom jeweiligen Ausgangsprodukt und vom jeweils verwendeten Lösungsmittel abhängig ist.The solution of the starting compound in the organic solvent is produced as concentrated as possible, the Kon concentration of the starting product in the solvent of the respective Starting product and depending on the solvent used is.

Die organische Lösung wird sodann mit Wasser gesättigt. Zur Sättigung mit Wasser wird die Lösung entweder mit einem Sy stem, das gebundenes Wasser enthält und das befähigt ist, dieses Wasser beim Kontakt mit einem organischen Lösungsmittel abzugeben, oder mit einer wäßrigen Phase in Kontakt gebracht. Systeme, die gebundenes Wasser enthalten, sind beispielsweise was serenthaltende Hydrogele, beispielsweise Polyacrylamidgele, Poly saccharidgele usw. Der organischen Lösung wird eine solche Menge an gebundenem Wasser zugegeben, die ausreicht, um die Lösung mit Wasser zu sättigen, wobei unter Wasser sowohl reines Wasser als auch Puffer- oder Salzlösungen zu verstehen sind. Die Menge der verwendeten Hydrogele hängt dabei von der Wasseraufnahmefähigkeit sowohl des Hydrogels als auch des organischen Lösungsmittels ab.The organic solution is then saturated with water. For saturation with water, the solution is either with a Sy stem which contains bound water and which is capable of this Release water on contact with an organic solvent, or brought into contact with an aqueous phase. Systems that contain bound water are something, for example hydrogels containing serum, for example polyacrylamide gels, poly saccharide gels etc. The organic solution becomes such an amount of bound water added, sufficient to mix the solution with To saturate water, being both pure water and buffer or salt solutions are also to be understood. The amount of The hydrogels used depend on the water absorption capacity from both the hydrogel and the organic solvent.

Als wäßrige Phase kommt reines Wasser, eine Pufferlösung oder auch eine wäßrige Salzlösung in Betracht. Als Pufferlösung wird zweck mäßig eine solche eingesetzt, in der die Hydrolase hohe Umset zungsraten und hohe Spezifität zeigt. Zur Sättigung mit Wasser wird die organische Lösung direkt in die wäßrige Phase eingebracht oder mit einer wäßrigen Phase vermischt und absetzen gelassen, wo bei sich 2 Phasen bilden.Pure water, a buffer solution or also comes as the aqueous phase an aqueous saline solution. It is used as a buffer solution moderately used one in which the hydrolase high conversion rates and high specificity shows. For saturation with water the organic solution is introduced directly into the aqueous phase or mixed with an aqueous phase and allowed to settle where form 2 phases with each other.

Die wassergesättigte Lösung wird anschließend mit einer Hydrolase in Kontakt gebracht.The water-saturated solution is then treated with a hydrolase brought into contact.

Als Hydrolasen kommen je nach Ausgangsverbindung und erwünschtem Produkt für die jeweilige Umsetzung geeignete Hydrolasen in Be tracht. Beispiele für Hydrolasen sind etwa Esterasen, Proteasen, Amidasen, usw. Zweckmäßig wird je nach gewünschter Umsetzung eine solche Hydrolase eingesetzt, die die Umsetzung möglichst spezi fisch, im Falle chiraler oder prochiraler Carbonsäurederivate mög lichst stereospezifisch ausführt. Bevorzugt wird im er findungsgemäßen Verfahren eine Lipase verwendet. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, daß die Hydrolase nicht che misch modifiziert werden muß, um deren Toleranz gegen chemische Lösungsmittel zu erhöhen. Es können im erfindungsgemäßen Verfahren aber auch chemisch modifizierte Hydrolasen eingesetzt werden. Die Hydrolase kann als solche, adsorbiert an einen Träger, etwa an Celite, Kieselgel, Staub, Glasperlen oder auch immobilisiert ein gesetzt werden. Bevorzugt wird die Hydrolase adsorbiert an einen inerten Träger, besonders bevorzugt an Celite eingesetzt, wobei es zur Adsorption der Hydrolase an Celite genügt, die Hydrolase ein fach mit Celite zu vermischen.Depending on the starting compound and what is desired, the hydrolases come Product suitable hydrolases in Be dress. Examples of hydrolases include esterases, proteases, Amidases, etc. One is appropriate depending on the desired implementation such hydrolase used that the implementation as speci fish, possible in the case of chiral or prochiral carboxylic acid derivatives stereospecific. He is preferred process according to the invention uses a lipase. An advantage of The inventive method is that the hydrolase is not che must be modified to reduce their tolerance to chemical Increase solvent. It can in the process according to the invention but also chemically modified hydrolases can be used. As such, the hydrolase can be adsorbed onto a carrier, for example onto Celite, silica gel, dust, glass beads or even immobilized be set. The hydrolase is preferably adsorbed on one inert carrier, particularly preferably used on Celite, it to adsorb the hydrolase on Celite, the hydrolase is sufficient to mix with Celite.

Ein wesentlicher Vorteil des Verfahrens ist, daß die Hydrolase nicht immobilisiert vorgelegt werden muß, da sie in organischen Lösungsmitteln nicht löslich ist.A major advantage of the process is that the hydrolase does not have to be presented immobilized as it is in organic Solvents is not soluble.

Wurde zur Wassersättigung der organischen Lösung ein wasserenthal tendes Hydrogel verwendet, wird die Hydrolase direkt in die was sergesättigte Lösung, in der sich auch das Hydrogel befindet, zu gegeben. Beim Kontakt der wassergesättigten Lösung mit der Hydro lase findet die Hydrolyse im enzymspezifischen Ausmaß und mit enzymspezifischer Selektivität statt, wobei das bei der Hydrolyse verbrauchte Wasser aus dem Hydrogel nachgeliefert wird, so daß die organische Reaktionslösung stets wassergesättigt bleibt.Was a water enthalpy for water saturation of the organic solution hydrogel is used, the hydrolase is directly in the what saturated solution, which also contains the hydrogel given. When the water-saturated solution comes into contact with the Hydro lase finds the hydrolysis in the enzyme-specific extent and with enzyme-specific selectivity instead, the hydrolysis used water is supplied from the hydrogel, so that the organic reaction solution always remains saturated with water.

Wurde ein chirales oder prochirales Carbonsäurederivat eingesetzt, wird die Reaktion bis zu einem gewünschten Umsetzungsgrad, der durch Bestimmung des optischen Drehwertes ermittelt werden kann, ablaufen gelassen.If a chiral or prochiral carboxylic acid derivative was used, the reaction to a desired degree of implementation, the can be determined by determining the optical rotation value, let out.

Nach Erreichen des gewünschten Umsetzungsgrades werden das Enzym und das Hydrogel abfiltriert. Die Lösung kann dann je nach ge wünschtem Produkt wie üblich aufgearbeitet werden, wobei das ge wünschte Produkt mit Hilfe von Extraktion, Umkristallisieren, De stillation oder Chromatographie wie üblich erhalten und/oder gereinigt werden kann.After reaching the desired degree of implementation, the enzyme and the hydrogel is filtered off. The solution can then depending on ge desired product are worked up as usual, the ge desired product with the help of extraction, recrystallization, De Stillation or chromatography obtained as usual and / or can be cleaned.

Wurde zur Sättigung der organischen Lösung mit Wasser eine wäßrige Phase verwendet, wird die Hydrolase in einen Reaktionsbehälter, beispielsweise in eine Säule eingebracht und die wassergesättigte, organische Lösung durch den Behälter und über die Hydrolase ge pumpt, so daß die Hydrolase nicht mit der wäßrigen Phase in Berüh rung kommt.Was an aqueous to saturate the organic solution with water Phase is used, the hydrolase is placed in a reaction vessel, for example placed in a column and the water-saturated, organic solution through the container and via the hydrolase pumps, so that the hydrolase is not in contact with the aqueous phase tion is coming.

Beim Kontakt der organischen wassergesättigten Lösung mit der Hy drolase findet die Hydrolyse in enzymspezifischem Ausmaß und mit enzymspezifischer Stereoselektivität statt. Dabei wird die wasser gesättigte Lösung kontinuierlich über die Hydrolase und anschlie ßend durch die wäßrige Phase geleitet, da beim einmaligen Kontakt der Hydrolase mit der Reaktionslösung der gewünschte Umsetzungs grad im allgemeinen nicht erreicht wird. Da Hydrolasen im allge meinen beide Enantiomeren eines optisch aktiven Carbonsäurederiva tes umsetzen können, wobei sie aber ein Enantiomer bevorzugt um setzen, ist es im Fall chiraler oder prochiraler Carbon säurederivate im allgemeinen angebracht, den optischen Drehwert der Reaktionslösung, der ein Maß für den jeweiligen Enantiomeren überschuß darstellt, kontinuierlich zu messen und die Reaktion nach Umsetzung des von der Hydrolase bevorzugten Enantiomeren ab zubrechen, um möglichst enantiomerenreine Produkte zu erhalten.When the organic water-saturated solution comes into contact with the Hy drolase finds the hydrolysis to an enzyme-specific extent and with enzyme-specific stereoselectivity instead. The water saturated solution continuously via the hydrolase and then ß passed through the aqueous phase, since the single contact the hydrolase with the reaction solution of the desired reaction degree is generally not achieved. Since hydrolases in general mean both enantiomers of an optically active carboxylic acid derivative tes can implement, but they prefer an enantiomer in the case of chiral or prochiral carbon Acid derivatives generally attached to the optical rotation the reaction solution, which is a measure of the respective enantiomer represents excess to measure continuously and the reaction after conversion of the enantiomer preferred by the hydrolase break to obtain products that are as enantiomerically pure as possible.

Beim kontinuierlichen Pumpen der organischen, wassergesättigten Lösung über das Enzym ist darauf zu achten, daß die Lösung beim Kontakt mit dem Enzym stets wassergesättigt ist. Da bei der Hy drolyse pro Mol gespaltener Bindung ein Mol Wasser verbraucht wird, muß dieses Wasser ersetzt werden, bevor die organische Lö sung erneut mit der Hydrolase in Kontakt kommt.When continuously pumping the organic, water-saturated Solution via the enzyme must be ensured that the solution at Contact with the enzyme is always saturated with water. Since at the Hy drolysis consumes one mole of water per mole of split bond , this water must be replaced before the organic Lö solution comes into contact with the hydrolase again.

Das verbrauchte Wasser kann etwa dadurch ersetzt werden, daß die organische Lösung nach dem Kontakt mit der Hydrolase über basi sche, Hydroxidionen enthaltende Agentien, die sich z. B. in einer Säule befinden, geleitet wird. Dabei bildet sich pro Mol Carbon säure 1 Mol Carbonsäuresalz und 1 Mol Wasser, so daß das bei der Hydrolyse verbrauchte Wasser ersetzt wird und die Lösung wasser gesättigt bleibt. Als basische Agentien können z. B. Ionenaustau scher in der OH-Form, Alkali- oder Erdalkalihydroxide verwendet werden.The water used can be replaced by the fact that the organic solution after contact with the hydrolase via basi cal, agents containing hydroxide ions, which z. B. in one Column are directed. This forms per mole of carbon acid 1 mole of carboxylic acid salt and 1 mole of water, so that in the Hydrolysis replaces used water and the solution water remains saturated. As basic agents such. B. ion exchange used in the OH form, alkali or alkaline earth metal hydroxides will.

Nach Verlassen der Säule enthält die Lösung keine bei der enzyma tischen Reaktion gebildete Carbonsäure mehr, da diese an die ba sischen Agentien gebunden bleibt, ist aber durch die Bildung von einem Mol Wasser pro Carbonsäuresalz wieder mit Wasser gesättigt. Die Reaktionslösung wird kontinuierlich solange über die Hydrolase und anschließend über die Säule mit den Hydroxidionen enthaltenden Agentien gepumpt, bis der gewünschte Umsetzungsgrad erreicht ist. Die organische Reaktionslösung kann aber auch zur Wassersättigung nach dem Kontakt mit der Hydrolase durch eine wäßrige Phase gelei tet oder mit einer wäßrigen Phase vermischt und absetzen gelassen werden. Als wäßrige Phase kommt reines Wasser, eine Pufferlösung oder eine Salzlösung in Betracht. Bevorzugt wird der pH-Wert der wäßrigen Phase, der durch das Einbringen der bei der Reaktion ge bildeten Säure sinkt, durch Zugabe einer Base etwa konstant ge halten. Der pH-Wert soll nicht unter 3 absinken und nicht über 11 ansteigen. Bevorzugt wird ein pH-Bereich von 5 bis 10, besonders bevorzugt von 6 bis 8 eingehalten.After leaving the column, the solution does not contain any at enzyma table reaction formed carboxylic acid more, since this to the ba agents remains bound, but is through the formation of one mole of water per carboxylic acid salt saturated with water again. The reaction solution is continuous over the hydrolase and then over the column containing the hydroxide ions Agents pumped until the desired degree of implementation is reached. The organic reaction solution can also be used for water saturation after contact with the hydrolase through an aqueous phase tet or mixed with an aqueous phase and allowed to settle will. Pure water, a buffer solution, comes as the aqueous phase or a saline solution. The pH is preferred aqueous phase by the introduction of the ge in the reaction formed acid drops, approximately constant by adding a base hold. The pH should not drop below 3 and not above 11 increase. A pH range of 5 to 10 is preferred, particularly preferably observed from 6 to 8.

Als Basen eignen sich zur Neutralisation übliche Basen, beispiels weise Alkali- oder Erdalkalihydroxide, -carbonate, -hydrogencarbo nate, NH₄OH usw., wobei bevorzugt Alkalihydroxide wie Kalium- oder Natriumhydroxid eingesetzt werden. Die Base wird als wäßrige Lö sung bevorzugt in Kombination mit einer pH-Wert-Meßanlage, z. B. einer Wasserstoffelektrode, bevorzugt automatisiert, zugegeben. Durch Zugabe der Base bildet die Carbonsäure ein Salz mit der zu gegebenen Base, welches in der wäßrigen Phase verbleibt, so daß die gebildete Carbonsäure dem Hydrolysegleichgewicht entzogen wird, während sich die organische Lösung von der wäßrigen Phase infolge ihrer geringen Mischbarkeit trennt und sich dabei mit Wasser sät tigt. Die wassergesättigte organische Lösung wird dann wieder über die Hydrolase geleitet. Diese Verfahrensführung wird solange fortgesetzt, bis der gewünschte Umsetzungsgrad erreicht ist. Die Reaktion wird sodann abgebrochen und die Reaktionsprodukte werden isoliert und gegebenenfalls gereinigt.Suitable bases for neutralization are customary bases, for example alkali or alkaline earth metal hydroxides, carbonates, hydrogen carbonates, NH ₄ OH, etc., alkali metal hydroxides such as potassium or sodium hydroxide being preferably used. The base is preferably in the form of an aqueous solution in combination with a pH measuring system, e.g. B. a hydrogen electrode, preferably automated, added. By adding the base, the carboxylic acid forms a salt with the base added, which remains in the aqueous phase, so that the carboxylic acid formed is removed from the hydrolysis equilibrium, while the organic solution separates from the aqueous phase due to its low miscibility and thereby separates Water saturates. The water-saturated organic solution is then passed over the hydrolase again. This procedure is continued until the desired degree of implementation is achieved. The reaction is then stopped and the reaction products are isolated and, if necessary, purified.

Die im Verlauf des Verfahrens gebildete Carbonsäure, die wie oben beschrieben als Salz isoliert wird, kann durch Ansäuern und gege benenfalls Extraktion wie üblich gewonnen und durch Destillation, Chromatographie oder Umkristallisieren gereinigt werden.The carboxylic acid formed during the process, as above described as salt can be isolated by acidification and counter optionally extracted as usual and by distillation, Chromatography or recrystallization can be purified.

Ist nicht die im Verlauf des Verfahrens entstehende Carbonsäure sondern das zweite Hydrolyseprodukt, also z. B. der Alkohol, das Amin, das Thiol oder sind sowohl Carbonsäure als auch der Alkohol, das Amin oder das Thiol das erwünschte Produkt, oder wurde bei der Wassersättigung der organischen Reaktionslösung keine Base zugege ben, werden die erwünschten Produkte nach Abbruch der Reaktion aus der organischen Reaktionslösung auf übliche Art und Weise, bei spielsweise durch Extraktion, Destillation, Kristallisation und Umkristallisieren oder Chromatographie erhalten und/oder gerei nigt.Is not the carboxylic acid created in the course of the process but the second hydrolysis product, e.g. B. the alcohol that Amine, the thiol or are both carboxylic acid and alcohol, the amine or the thiol was the desired product, or was in the No water added to the organic reaction solution ben, the desired products after the reaction is stopped the organic reaction solution in the usual way for example by extraction, distillation, crystallization and Recrystallize or get chromatography and / or gerei nends.

Es hat sich unerwarteterweise gezeigt, daß die Enzymaktivität durch Spülen der Hydrolase mit Chloroform nach einem Reaktionszy klus und vor dem folgenden Reaktionszyklus erheblich gesteigert werden kann, falls nicht Chloroform ohnehin als organisches Lö sungsmittel für das Carbonsäurederivat eingesetzt wurde. So wurde die spezifische Aktivität einer Lipase innerhalb einiger Reak tionszyklen insgesamt von 138 auf 339 mMol pro Stunde pro Gramm Lipase gesteigert, worauf die Aktivität der Lipase in etwa kon stant blieb.It was unexpectedly found that enzyme activity by rinsing the hydrolase with chloroform after a reaction cycle klus and significantly increased before the next reaction cycle can, if not chloroform anyway as an organic solvent was used for the carboxylic acid derivative. So it was the specific activity of a lipase within some reak tion cycles from 138 to 339 mmol per hour per gram Lipase increased, whereupon the activity of the lipase approximately remained constant.

Das Verfahren wird zweckmäßig bei einer Temperatur, bei der die Hydrolase die höchste Aktivität zeigt, durchgeführt. Dabei liegen die Temperaturen im allgemeinen zwischen 0 und 40°C, bevorzugt zwischen 20 und 30°C, besonders bevorzugt bei Raumtemperatur, in speziellen Fällen auch höher, aber jedenfalls unter dem Siedepunkt des Lösungsmittels und unter der Deaktivierungstemperatur der ver wendeten Hydrolase.The process is useful at a temperature at which the Hydrolase shows the highest activity. Lying there the temperatures generally between 0 and 40 ° C, preferred between 20 and 30 ° C, particularly preferably at room temperature, in in special cases also higher, but in any case below the boiling point of the solvent and below the deactivation temperature of the ver applied hydrolase.

Das Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durch geführt werden und wird bevorzugt kontinuierlich durchgeführt.The process can be carried out continuously or batchwise be performed and is preferably carried out continuously.

Ist im Falle der Verwendung chiraler oder prochiraler Carbonsäure derivate der Enantiomerenüberschuß eines Enantiomeren im erhalte nen Produkt, das bei der Reaktion mit der Hydrolase entsteht, in folge einer geringen Stereospezifität der Hydrolase nicht ausrei chend, kann das nach einem Reaktionszyklus erhaltene Produkt er neut in ein Carbonsäurederivat übergeführt und in das erfindungs gemäße Verfahren eingesetzt werden, wobei eine weitere Anreiche rung des gewünschten Enantiomeren des Produktes erreicht wird. Manchmal ist es auch zur Erreichung einer höheren En antiomerenreinheit zweckmäßig, das Verfahren schon nach kleinen Umsetzungsraten abzubrechen.Is in the case of using chiral or prochiral carboxylic acid Derivatives of the enantiomeric excess of an enantiomer in the preservation NEN product that results from the reaction with the hydrolase in follow a low stereospecificity of the hydrolase accordingly, the product obtained after a reaction cycle neut converted into a carboxylic acid derivative and in the fiction appropriate procedures are used, with another enrichment tion of the desired enantiomer of the product is achieved. Sometimes it is also to achieve a higher En antiomeric purity useful, the process after small Abort implementation rates.

In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens wird ein op tisch aktives Carbonsäurederivat, insbesonders ein optisch aktiver Carbonsäureester, der das chirale Zentrum im Säureteil aufweist, wobei das gewünschte Produkt vorwiegend ein Enantiomer einer op tisch aktiven Carbonsäure ist, in Diisopropylether oder Toluol möglichst konzentriert gelöst und in einem Vorratsbehälter, in dem eine wäßrige Phase vorgelegt wurde unter Rühren durch Mischen mit der wäßrigen Phase mit Wasser gesättigt. Die wassergesättigte or ganische Phase wird mit Hilfe einer Pumpe aus dem Vorratsbehälter über eine Lipase geleitet, die adsorbiert an einen inerten Träger außerhalb des Vorratsbehälters zweckmäßigerweise in eine Säule eingebracht ist, so daß die Lipase nicht mit der wäßrigen Phase des Vorratsbehälters in Kontakt kommt. Dabei findet die Hydrolyse in enzymspezifischem Ausmaß statt. Die organische Reaktionslösung wird dann in die wäßrige Phase des Vorratsbehälters zurückgelei tet. Der pH-Wert der wäßrigen Phase, der durch das Einbringen der gebildeten Carbonsäure absinkt, wird durch Zugabe einer wäßrigen Natriumhydroxid- oder Kaliumhydroxidlösung etwa auf pH 7 gehalten. Dadurch bildet die Carbonsäure ein Salz und verbleibt in der wäß rigen Lösung. Der freigesetzte Alkohol und die nicht umgesetzte Ausgangsverbindung verbleiben gelöst in der organischen Reaktions lösung, die sich infolge ihrer geringen Mischbarkeit mit Wasser von der wäßrigen Phase des Vorratsbehälters trennt und in einem Kreisprozeß so lange wieder über die Hydrolase und dann wieder über die wäßrige Phase geleitet wird, bis der gewünschte Umset zungsgrad erreicht ist. Die Reaktion wird sodann abgebrochen und die wäßrige Phase von der organischen getrennt. Zur Isolierung der gebildeten Carbonsäure wird die wäßrige Phase wie üblich ange säuert und die freigesetzte Carbonsäure extrahiert. Eine Reinigung durch Umkristallisieren, Destillation oder Chromatographie kann angeschlossen werden, wobei durchaus eine weitere Anreicherung des gewünschten Enantiomeren erreicht werden kann.In a special embodiment of the method, an op table active carboxylic acid derivative, especially an optically active Carboxylic acid ester, which has the chiral center in the acid part, the desired product predominantly an enantiomer of an op is table-active carboxylic acid, in diisopropyl ether or toluene dissolved as concentrated as possible and in a storage container in which an aqueous phase was introduced with stirring by mixing with the aqueous phase saturated with water. The water-saturated or The ganic phase is pumped out of the reservoir passed over a lipase that adsorbs to an inert carrier in a column outside of the storage container is introduced so that the lipase does not with the aqueous phase of the Storage container comes into contact. The hydrolysis takes place in enzyme-specific extent instead. The organic reaction solution is then returned to the aqueous phase of the storage container tet. The pH of the aqueous phase caused by the introduction of the formed carboxylic acid drops, is by adding an aqueous Sodium hydroxide or potassium hydroxide solution kept at about pH 7. As a result, the carboxylic acid forms a salt and remains in the water solution. The alcohol released and the unreacted Starting compound remain dissolved in the organic reaction solution due to its low miscibility with water separates from the aqueous phase of the storage container and in one Cyclic process for so long again via the hydrolase and then again is passed over the aqueous phase until the desired conversion degree of efficiency is reached. The reaction is then stopped and the aqueous phase is separated from the organic. To isolate the formed carboxylic acid, the aqueous phase is turned on as usual acidifies and the released carboxylic acid extracted. A cleaning by recrystallization, distillation or chromatography be connected, although a further enrichment of the desired enantiomers can be achieved.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemä ßen Verfahrens wird destilliertes Wasser in einem Vorratsbehälter vorgelegt und unter Rühren mit der Lösung eines enantiomeren Gemi sches eines Carbonsäureesters, der in 2-Stellung des Säureteils, bevorzugt durch Halogen substituiert ist, in Diisopropylether ver setzt und absetzen gelassen. Die organische Phase wird daraufhin kontinuierlich über eine Lipase, die sich an Celite adsorbiert außerhalb des Vorratsbehälters, in eine Säule gepackt, befindet und danach in die wäßrige Phase des Vorratsbehälters zurückgeleitet, wobei der pH-Wert der wäßrigen Phase durch Zugabe eines wäßrigen Alkalihydroxids in einem Bereich von 6 bis 9 konstant gehalten wird. Die wäßrige Phase kann dabei dem Vorratsbehälter entnommen und durch Zugabe frischer, wäßriger Phase ersetzt werden. Auch die organische Phase, die vorwiegend das von Enzym nicht verwertete Enantiomere des chiralen Carbonsäureesters und den gebildeten Al kohol enthält, kann nach Erreichen des gewünschten Umset zungsgrades dem Vorratsbehälter entnommen und durch frische orga nische Phase ersetzt werden. Die Gewinnung des reinen oder ange reicherten Enantiomeren der optisch aktiven Carbonsäure aus der wäßrigen Lösung erfolgt durch Ansäuern und Extraktion der wäßrigen Lösung mit einem organischen Lösungsmittel für die Carbonsäure.In a particularly preferred embodiment of the invention The process is distilled water in a storage container submitted and with stirring with the solution of an enantiomeric mixture of a carboxylic acid ester in the 2-position of the acid part, is preferably substituted by halogen, in diisopropyl ether settles and let settle. The organic phase will then continuously via a lipase that adsorbs on Celite outside the storage container, packed in a column, and then returned to the aqueous phase of the storage container, wherein the pH of the aqueous phase by adding an aqueous Alkali hydroxide kept constant in a range from 6 to 9 becomes. The aqueous phase can be removed from the storage container and can be replaced by adding fresh, aqueous phase. Also the organic phase which mainly does not use the enzyme Enantiomers of the chiral carboxylic acid ester and the Al formed contains alcohol, can be achieved after the desired implementation Degree of efficiency removed from the storage container and by fresh organization African phase to be replaced. Obtaining the pure or ang enriched enantiomers of the optically active carboxylic acid from the aqueous solution is carried out by acidification and extraction of the aqueous Solution with an organic solvent for the carboxylic acid.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird auf einfache Weise ein Carbonsäurederivat in einem organischen Lösungsmittel enzyma tisch hydrolisiert und das erwünschte Produkt auf einfache Weise isoliert, wobei das Enzym nicht immobilisiert vorgelegt werden muß, wobei insbesonders ein Enantiomerengemisch einer chiralen Ausgangsverbindung gegebenenfalls durch Anwendung mehrerer Reak tionszyklen in ein hochangereichertes Enantiomeres einer optisch aktiven Verbindung übergeführt werden kann, wobei das Lö sungsmittel immer wieder verwendet wird, wobei praktisch kein En zymverlust oder Aktivitätsverlust des Enzyms über lange Zeiträume auftritt und wobei keine umweltschädigenden Abfallprodukte entste hen und wiederaufbereitet oder entsorgt werden müssen. Das Verfah ren stellt somit eine Bereicherung der Technik dar.With the help of the method according to the invention is simple a carboxylic acid derivative in an organic solvent enzyma hydrated table and the desired product in a simple way isolated, the enzyme not being presented immobilized must, in particular an enantiomer mixture of a chiral Starting compound, if necessary, by using several reacts tion cycles into a highly enriched enantiomer one optically active connection can be transferred, the Lö is used again and again, with practically no en Loss of enzyme or loss of activity of the enzyme over long periods occurs and with no environmentally harmful waste products and must be reprocessed or disposed of. The procedure ren thus represents an enrichment of technology.

example 1

20,05 g eines Enantiomerengemisches aus 5,61 g S- und 14,44 g R-2- Brompropionsäure-2-ethyl-hexyl-ester, das entspricht einem Enan tiomerenüberschuß des R-Enantiomeren von 44%, hergestellt durch Veresterung eines entsprechenden Enantiomoerengemisches von 2- Brompropionsäure mit 2-Ethylhexanol, wurden mit Diisopropylether gelöst, so daß 170 ml Lösung entstanden. Die Lösung wurde in 140 ml Wasser, das mit 5,5 ml Ethanol versetzt und in einem Behälter vor gelegt worden war, eingetragen und verrührt.20.05 g of an enantiomer mixture of 5.61 g of S- and 14.44 g of R-2- Bromopropionic acid 2-ethyl-hexyl ester, which corresponds to an enane tiomeric excess of the R enantiomer of 44%, produced by Esterification of a corresponding enantiomer mixture of 2- Bromopropionic acid with 2-ethylhexanol were mixed with diisopropyl ether dissolved so that 170 ml of solution were formed. The solution was poured into 140 ml Water mixed with 5.5 ml of ethanol and placed in a container had been laid, entered and stirred.

Dabei bildeten sich 2 Phasen. Die wassergesättigte organische Phase wurde anschließend über 1,5 g einer Candida cylindracea Li pase, die vermischt mit 12 g Celite außerhalb des Behälters in eine Säule gepackt angebracht war, mit einer ungefähren Pumpgeschwindigkeit von 100 ml/min gepumpt. Nach dem Durchgang durch die Säule wurde die organische Reaktionslösung in die wäß rige Phase des Behälters geleitet. Der pH-Wert der wäßrigen Phase wurde automatisch durch Zugabe von wäßrigem 2 M Natriumhydroxid auf 5 bis 8 gehalten. Dadurch bildete sich das Natriumsalz der bei der Reaktion entstandenen 2-Brompropionsäure, das in der wäßrigen Lösung verblieb, während sich die organische Reaktionslösung mit Wasser sättigte und von der wäßrigen Phase des Behälters trennte. Die nunmehr wieder wassergesättigte organische Lösung wurde wieder kontinuierlich über die Lipase und anschließend durch die wäßrige Phase gepumpt. Nach 0,5 Stunden waren dabei 2,05 ml, nach 1,5 Stunden 5,85 ml 2 M wäßriges Natriumhydroxid verbraucht und ein Umsetzungsgrad von 15% erreicht. Die wäßrige Lösung wurde anschließend mit Schwefelsäure angesäuert, die dadurch freige setzte 2-Brompropionsäure mit Hilfe von Diisopropylether extra hiert und durch Abdampfen des Extraktionsmittels isoliert. Dabei wurden 1,65 g eines Enantiomerengemisches von R- und S-2-Brom propionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +25,4°, das entspricht einen Enantiomerenüberschuß von 90,4% des R- Enantiomeren erhalten, d. h. es waren 0,08 g S- und 1,57 g R-2- Brompropionsäure gebildet worden. Die spezifische Aktivität der Lipase betrug 5,2 mMol pro Stunde pro Gramm Lipase. Two phases were formed. The water-saturated organic phase was then pumped over 1.5 g of a Candida cylindracea lipase, which was mixed with 12 g of Celite packed outside of the container packed in a column, at an approximate pumping speed of 100 ml / min. After passing through the column, the organic reaction solution was passed into the aqueous phase of the container. The pH of the aqueous phase was automatically kept at 5 to 8 by adding aqueous 2 M sodium hydroxide. This formed the sodium salt of the 2-bromopropionic acid formed in the reaction, which remained in the aqueous solution while the organic reaction solution saturated with water and separated from the aqueous phase of the container. The now water-saturated organic solution was again pumped continuously through the lipase and then through the aqueous phase. After 0.5 hours 2.05 ml, after 1.5 hours 5.85 ml of 2 M aqueous sodium hydroxide had been consumed and a degree of conversion of 15% had been reached. The aqueous solution was then acidified with sulfuric acid, which released 2-bromopropionic acid extracted with the aid of diisopropyl ether and isolated by evaporating the extractant. 1.65 g of an enantiomer mixture of R- and S-2-bromo-propionic acid with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of + 25.4 ° were obtained, which corresponds to an enantiomeric excess of 90.4% of the R-enantiomer, ie 0.08 g of S- and 1.57 g of R-2 bromopropionic acid had been formed. The specific activity of the lipase was 5.2 mmol per hour per gram of lipase.

Examples 2 to 10

Die Beispiele 2 bis 7 wurden auf die gleiche Art und Weise wie im Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung derselben Candida cylin dracea Lipase des Beispiels 1 ausgeführt, wobei die Reaktionszeit auf etwa 4 Stunden ausgedehnt und bei Erreichen eines Umsetzungs grades von etwa 44% abgebrochen wurde. Die Säule mit der Candida cylindracea Lipase wurde nach jedem Reaktionszyklus mit Diisopro pylether gespült.Examples 2 to 7 were carried out in the same manner as in Example 1 described using the same Candida cylin dracea lipase of Example 1, the reaction time extended to about 4 hours and when an implementation is reached degree of about 44% was canceled. The pillar with the candida cylindracea lipase was treated with Diisopro after each reaction cycle pylether rinsed.

Die Beispiele 8 bis 10 wurden auf die gleiche Art und Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, jedoch unter Verwendung der 6-fachen Menge an Enantiomerengemisch des 2-Brompropionsäure-2-ethyl hexylesters, an Diisopropylether, an Wasser und an Ethanol unter Verwendung derselben Candida cylindracea Lipase der Beispiele l bis 7 ausgeführt. Die Säule mit der Candida cylindracea Lipase wurde nach jedem Reaktionszyklus mit Diisopropylether gespült. Dabei wurden die Ergebnisse, die in den Tabellen 1 und 2 zu sammengefaßt sind, erhalten.Examples 8-10 were in the same manner as described in Example 1, but using 6 times Amount of enantiomer mixture of 2-bromopropionic acid-2-ethyl hexylesters, on diisopropyl ether, on water and on ethanol Use of the same Candida cylindracea lipase from Example 1 run to 7. The column with the Candida cylindracea lipase was rinsed with diisopropyl ether after each reaction cycle. The results shown in Tables 1 and 2 were are summarized, preserved.

Tabelle 1 Table 1

Tabelle 2 Table 2

Die Candida cylindracea Lipase des Beispieles 1 wurde also insge samt etwa 95 Stunden eingesetzt, ohne an Aktivität zu verlieren.The Candida cylindracea lipase of Example 1 was thus in total spent a total of about 95 hours without losing activity.

In den Tabellen bedeutetIn the tables means

h: Reaktionszeit (Stunden)
Prozent Umsetzung: Umgesetzter Anteil des Enantiomerengemisches des 2-Brompropionsäure-2-ethyl-hexylesters
G (g): Ausbeute in Gramm
alpha (°): optischer Drehwert (alpha)_D²⁰
ee (%): Enantiomerenüberschuß der gewonnenen R- gegenüber der S-2-Brompropionsäure
Akt: spezifische Aktivität der Candida cylindracea Lipase in mMol pro Stunde pro Gramm Lipaseh: response time (hours)
Percent conversion: fraction of the enantiomer mixture of 2-bromopropionic acid-2-ethyl-hexyl ester converted
G (g): Yield in grams
alpha (°): optical rotation value (alpha) _D ²⁰
ee (%): Enantiomeric excess of the R- over the S-2-bromopropionic acid obtained
Act: specific activity of Candida cylindracea lipase in mmol per hour per gram of lipase

Example 11

20 g einer racemischen Mischung von R- und S-2-Brompropionsäure-2- ethyl-hexylester wurden in 150 ml Diisopropylether gelöst. Diese Lösung wurde in einem Behälter, in dem 70 ml Wasser vorgelegt wor den waren, eingetragen und verrührt. Dabei bildeten sich 2 Phasen. Die organische wassergesättigte Phase wurde anschließend über 50 mg einer Candida cylindracea Lipase, vermischt mit 2,8 g Celite, eingebracht in eine Säule außerhalb des Behälters mit einer ungefähren Pumpgeschwindigkeit von 100 ml/min gepumpt. Nach dem Durchgang durch die Säule wurde die organische Reaktionslösung wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt.20 g of a racemic mixture of R- and S-2-bromopropionic acid 2- ethyl hexyl ester was dissolved in 150 ml of diisopropyl ether. These Solution was placed in a container in which 70 ml of water was placed which were registered and stirred. Two phases were formed. The organic water-saturated phase was then over 50 mg of a Candida cylindracea lipase mixed with 2.8 g Celite, placed in a column outside of the container pumped at an approximate pumping speed of 100 ml / min. To the passage through the column became the organic reaction solution treated as described in Example 1.

Nach 6,22 Stunden war ein Umsetzungsgrad von 29,17% erreicht und die Reaktion wurde abgebrochen. Dabei wurden 4,3 g eines Enantio merengemisches von R- und S-2-Brompropionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +20,6°, das entspricht einem Enan tiomerenüberschuß des R-Enantiomeren von 73,3%, erhalten.After 6.22 hours, a degree of conversion of 29.17% was reached and the reaction was stopped. 4.3 g of an enantiomeric mixture of R- and S-2-bromopropionic acid with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of + 20.6 °, this corresponds to an enantiomeric excess of the R-enantiomer of 73.3%, were obtained .

Die spezifische Aktivität der Lipase betrug 70,78 mMol pro Stunde pro Gramm Lipase.The specific activity of the lipase was 70.78 mmol per hour per gram of lipase.

Examples 12-17

Wurden wie im Beispiel 11 beschrieben unter Verwendung der glei chen Ausgangsmengen durchgeführt, wobei die Säule, die dieselbe Lipase des Beispiels 11 enthielt, vor jedem neuen Durchgang mit Chloroform gespült worden war.Were described as in Example 11 using the same Chen output quantities carried out, the column being the same Example 11 lipase included before each new run Chloroform had been rinsed.

Dabei wurden die Ergebnisse erhalten, die in Tabelle 3 zusammenge stellt sind.The results obtained, which are summarized in Table 3 represents are.

Tabelle 3 Table 3

Example 18

Wurde wie im Beispiel 11 beschrieben durchgeführt unter Verwendung von 45,1 g eines racemischen Gemisches von R- und S-2-Brompro pionsäure-2-ethyl-hexylester und 50 mg einer Candida cylindracea Lipase. Dabei wurde nach 19,25 Stunden ein Umsetzungsgrad von 45% erzielt. Es wurden 9,88 g eines Enantiomerengemisches von R- und S-2-Brompropionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +21,5°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des R-Enantio meren von 76,5%, erhalten.Was carried out as described in Example 11 using 45.1 g of a racemic mixture of R- and S-2-bromopropionic acid 2-ethyl-hexyl ester and 50 mg of a Candida cylindracea lipase. A degree of conversion of 45% was achieved after 19.25 hours. There were 9.88 g of an enantiomer mixture of R- and S-2-bromopropionic acid with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of + 21.5 °, which corresponds to an enantiomeric excess of the R-enantiomer of 76.5%.

Example 19

Die in Beispiel 18 erhaltene 2-Brompropionsäure wurde mit 2-Ethyl hexanol chemisch verestert. Der Ester wurde wie im Beispiel 18 be schrieben mit einer dort beschriebenen Lipase umgesetzt. Dabei wurde nach 15,25 Stunden ein Umsetzungsgrad von 72,3% erzielt. Dabei wurden 6,62 g eines Enantiomerengemisches von R- und S-2- Brompropionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +26,4°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß der A-2-Brom propionsäure von 94% erhalten.The 2-bromopropionic acid obtained in Example 18 was chemically esterified with 2-ethyl hexanol. As described in Example 18, the ester was reacted with a lipase described there. A degree of conversion of 72.3% was achieved after 15.25 hours. This gave 6.62 g of an enantiomer mixture of R- and S-2-bromopropionic acid with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of + 26.4 °, which corresponds to an enantiomeric excess of A-2-bromopropionic acid of 94%.

Examples 20 to 25

Die Beispiele 20-21, 22-23 und 24-25 wurden wie die Bei spiele 18-19 unter Verwendung jeweils derselben Menge an Ausgangsstoffen und unter jeweiliger Verwendung derselben Candida cylindracea Lipase des Beispiels 18 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.Examples 20-21, 22-23 and 24-25 were like the Bei play 18-19 using the same amount each Starting materials and using the same Candida cylindracea lipase of Example 18. The results are summarized in Table 4.

Tabelle 4 Table 4

Example 26

41 g eines racemischen Gemisches von R- und S-2-Chlorpropionsäure butylester wurden in 360 ml Diisopropylether gelöst und mit 200 ml Wasser, das in einem Behälter vorgelegt wurde, unter Rühren einge bracht. Dabei bildeten sich 2 Phasen. Die organische Oberphase wurde über 15 g einer Geotrichum candidum Lipase, die mit 60 g Celite vermischt in einer Säule außerhalb des Behälters angebracht war, mit einer Pumpgeschwindigkeit von 100 ml/min gepumpt. Die organische Reaktionslösung wurde danach in die wäßrige Phase des Behälters zurückgeleitet, die mit Hilfe einer automatisierten pH- Meßeinrichtung unter Zugabe von wäßrigen 2 H Natriumhydroxid auf einen pH-Wert zwischen 6 und 8 gehalten wurde. Dadurch bildete sich das Natriumsalz der bei der Reaktion entstandenen 2-Chlorpro pionsäure, das in der wäßrigen Phase verblieb. Die organische Reaktionslösung trennte sich von der wäßrigen Phase und wurde kontinuierlich über die Lipase und dann wieder durch die wäßrige Phase gepumpt.41 g of a racemic mixture of R- and S-2-chloropropionic acid butyl esters were dissolved in 360 ml of diisopropyl ether and 200 ml Water that was placed in a container was added with stirring brings. Two phases were formed. The organic upper phase was over 15 g of a Geotrichum candidum lipase, which with 60 g Celite mixed in a column attached outside the container was pumped at a pumping speed of 100 ml / min. The organic reaction solution was then in the aqueous phase of Returned container, which with the help of an automated pH Measuring device with the addition of aqueous 2 H sodium hydroxide a pH between 6 and 8 was maintained. This formed the sodium salt of the 2-chloroprop pionic acid, which remained in the aqueous phase. The organic Reaction solution separated from the aqueous phase and became continuously through the lipase and then again through the aqueous Phase pumped.

Nach 44,5 Stunden war ein Umsetzungsgrad von 20,6% erreicht und die Reaktion wurde abgebrochen.A degree of conversion of 20.6% was reached after 44.5 hours the reaction was stopped.

Die wäßrige Lösung wurde durch Zugabe von Schwefelsäure angesäuert und mit Chloroform extrahiert und das organische Lösungsmittel über Natriumsulfat getrocknet und abgedampft.The aqueous solution was acidified by adding sulfuric acid and extracted with chloroform and the organic solvent Dried over sodium sulfate and evaporated.

Dabei wurden 5,3 g eines Enantiomerengemisches von R- und S-2- Chlorproprionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von -12°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des S-Enantio meren von 73,2%, erhalten.5.3 g of an enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of -12 °, this corresponds to an enantiomeric excess of the S-enantiomer of 73.2%, were obtained.

Example 27

55,5 g eines racemischen Gemisches von R- und S-2-Chlorpro pionsäure-2-ethyl-hexylester wurden in 360 ml Diisopropylether ge löst und in einen Behälter, in dem 200 ml Wasser vorgelegt waren, unter Rühren eingebracht. Dabei bildeten sich 2 Phasen. Die orga nische, wassergesättigte Oberphase wurde über 1 g einer Candida cylindracea Lipase, die sich vermischt mit 10 g Celite in eine Säule gepackt außerhalb des Behälters befand, geleitet. Anschließend wurde wie im Beispiel 1 beschrieben verfahren. Nach Erreichen eines Umsetzungsgrades von 32% wurde die Reaktion abgebrochen. Dabei wurde ein Enantiomergemisch von R- und S-2- Chlorpropionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +6,9°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des R-Enan tiomeren von 42,1% erhalten. Die spezifische Aktivität der Lipase betrug 11,58 mMol pro Stunde pro Gramm Lipase.55.5 g of a racemic mixture of R- and S-2-chloropropionic acid-2-ethyl-hexyl ester were dissolved in 360 ml of diisopropyl ether and introduced into a container in which 200 ml of water had been introduced with stirring. Two phases were formed. The organic, water-saturated upper phase was passed over 1 g of a Candida cylindracea lipase, which was mixed with 10 g of Celite packed in a column outside the container. The procedure was then as described in Example 1. After a degree of conversion of 32% had been reached, the reaction was stopped. An enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of + 6.9 ° was obtained, which corresponds to an enantiomeric excess of the R-enantiomer of 42.1%. The specific activity of the lipase was 11.58 mmol per hour per gram of lipase.

Example 28

55,5 g eines racemischen Gemisches von R- und S-2-Chlorpro pionsäure-2-ethyl-hexylester wurden in 360 ml Diisopropylether ge löst und in einem Behälter, in dem 200 ml Wasser vorgelegt waren, unter Rühren eingebracht. Dabei bildeten sich 2 Phasen. Die orga nische, wassergesättigte Oberphase wurde mit einer Pumpgeschwin digkeit von 100 ml/min über eine Säule, die 2 g einer Candida cy lindracea Lipase, die durch Rühren mit 2 ml 50% Glutardialdehyd in Diisopropylether vernetzt und mit 13 g Celite vermischt worden war, enthielt, gepumpt. Anschließend wurde wie im Beispiel l beschrieben verfahren.55.5 g of a racemic mixture of R- and S-2-chloroprop 2-ethylhexyl pionate was dissolved in 360 ml of diisopropyl ether dissolves and in a container in which 200 ml of water were placed, introduced with stirring. Two phases were formed. The orga niche, water-saturated upper phase was with a pump speed of 100 ml / min on a column containing 2 g of a Candida cy Lindracea lipase by stirring with 2 ml of 50% glutardialdehyde crosslinked in diisopropyl ether and mixed with 13 g of Celite was, contained, pumped. Then, as in Example 1 proceed as described.

Nach Erreichen eines Umsetzungsgrades von 32% wurde die Reaktion abgebrochen. Dabei wurde ein Enantiomerengemisch von R- und S-2- Chlorpropionsäure mit einem Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +7,3°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des R-Enantiomeren von 44,5%, erhalten. Die spezifische Aktivität der Lipase betrug 4,8 mMol pro Stunde pro Gramm Lipase.After a degree of conversion of 32% had been reached, the reaction was stopped. An enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid with a rotation (alpha) _D ²⁰ of + 7.3 ° was obtained, which corresponds to an enantiomeric excess of the R-enantiomer of 44.5%. The specific activity of the lipase was 4.8 mmol per hour per gram of lipase.

Example 29

Unter Verwendung von 55,2 g eines racemischen Enantiomerengemi sches von 2-Chlorpropionsäure-2-ethyl-hexylester, 400 ml Hexan an statt Diisopropylether und 3 g einer Candida cylindracea Lipase, vermischt mit 21 g Celite wurden nach der im Beispiel 26 beschrie benen Art und Weise nach 19 Stunden ein Umsetzungsgrad von 78,6% erreicht. Dabei wurde ein Enantiomerengemisch von R- und S-2- Chlorpropionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +2,5°, das entspricht einem Enantiomerüberschuß des R-Enantiomeren von 15,2%, erhalten. Der Enantiomerenüberschuß des S-Enantiomeren im nicht umgesetzten Ester betrug 56%.Using 55.2 g of a racemic enantiomer mixture of 2-chloropropionic acid-2-ethyl-hexyl ester, 400 ml of hexane instead of diisopropyl ether and 3 g of a Candida cylindracea lipase, mixed with 21 g of Celite, were prepared in the manner described in Example 26 and achieved a degree of conversion of 78.6% after 19 hours. An enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid was obtained with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of + 2.5 °, which corresponds to an enantiomeric excess of the R-enantiomer of 15.2%. The enantiomeric excess of the S enantiomer in the unreacted ester was 56%.

Example 30

Unter Verwendung von 294,1 g eines racemischen Enantiomerengemi sches von 2-Chlorpropionsäure-2-ethyl-hexylester, 100 ml Diisopro pylether und 20 ml Aceton anstatt reinem Diisopropylether und 10 g Candida cylindracea Lipase, vermischt mit 50 g Celite wurde nach der im Beispiel 26 beschriebenen Art und Weise bis zu einem Umsetzungsgrad von 57% verfahren. Dabei wurde ein En antiomerengemisch von R- und S-2-Chlorpropionsäure mit einem opti schen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +6,1°, das entspricht einem En antiomerenüberschuß des R-Enantiomeren von 37%, erhalten.Using 294.1 g of a racemic enantiomer mixture of 2-chloropropionic acid, 2-ethyl-hexyl ester, 100 ml of diisopropyl ether and 20 ml of acetone instead of pure diisopropyl ether and 10 g of Candida cylindracea lipase, mixed with 50 g of celite according to the example 26 described procedure up to a degree of implementation of 57%. An en antiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid was obtained with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of + 6.1 °, which corresponds to an en antiomeric excess of the R enantiomer of 37%.

Example 31

Unter Verwendung von 57,2 g eines racemischen Enantiomerengemi sches von R- und S-2-Chlorpropionsäurephenylethylester, gelöst in 400 ml Diisopropylether und 3 g einer Candida cylindracea Lipase, vermischt mit 15 g Celite, wurde nach der im Beispiel 26 be schriebenen Art und Weise nach 1,30 Stunden ein Umsetzungsgrad von 60% erreicht. Dabei wurde ein Enantiomerengemisch von R- und S-2- Chlorpropionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +6,1°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des R-Enan tiomeren von 37%, erhalten.Using 57.2 g of a racemic mixture of enantiomers of R- and S-2-chloropropionic acid phenyl ethyl ester, dissolved in 400 ml of diisopropyl ether and 3 g of a Candida cylindracea lipase, mixed with 15 g of Celite, was carried out in the manner described in Example 26 and A degree of conversion of 60% is achieved after 1.30 hours. An enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of + 6.1 °, this corresponds to an enantiomeric excess of the R-enantiomer of 37%, was obtained.

Die spezifische Aktivität der Lipase betrug 41,7 mMol pro Stunde pro Gramm Lipase.The specific activity of the lipase was 41.7 mmol per hour per gram of lipase.

Example 32

Wurde wie Beispiel 31 unter Verwendung von 159 g eines racemischen Enantiomerengemisches von R- und S-2-Chlorpropionsäurephe nylethylester als Ausgangsmaterial, gelöst in 400 ml Diisopro pylether und derselben im Beispiel 31 verwendeten Lipase, die mit Diisopropylether gespült worden war, ausgeführt. Nach 4,12 Stunden war ein Umsetzungsgrad von 67% erreicht und die Reaktion wurde abgebrochen. Dabei wurde ein Enantiomerengemisch von R- und S-2- Chlorpropionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +5,3°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des R-Enantio meren von 32,3%, erhalten.Was carried out as Example 31 using 159 g of a racemic enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid, methyl ethyl ester as starting material, dissolved in 400 ml of diisopropyl ether and the same lipase used in Example 31, which had been rinsed with diisopropyl ether. After 4.12 hours, a degree of conversion of 67% was reached and the reaction was stopped. An enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of + 5.3 ° was obtained, which corresponds to an enantiomeric excess of the R-enantiomer of 32.3%.

Die spezifische Aktivität der Lipase betrug 40,8 mMol pro Stunde pro Gramm Lipase.The specific activity of the lipase was 40.8 mmol per hour per gram of lipase.

Examples 33 to 35

41 g eines racemischen Enantiomerengemisches von 2-Chlorpropi onsäurebutylester wurden in 360 ml Lösungsmittel gelöst und in ei nem Behälter, in dem 200 ml Wasser vorgelegt worden waren, unter Rühren eingebracht. Dabei bildeten sich 2 Phasen. Die organische, wassergesättigte Phase wurde über einer Säule, die 3 g einer Candida cylindracea Lipase, vermischt mit 9 g Celite, enthielt, bis zu einem Umsetzungsgrad von 33% gepumpt. Anschließend wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, verfahren. Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten:41 g of a racemic mixture of enantiomers of 2-chloropropi butyl acid ester were dissolved in 360 ml of solvent and in egg nem in which 200 ml of water had been placed under Stirring introduced. Two phases were formed. The organic, water-saturated phase was over a column containing 3 g of a Candida cylindracea lipase, mixed with 9 g Celite, contained pumped up to a degree of implementation of 33%. Subsequently, proceed as described in Example 1. The following were Get results:

Example 36

55,2 g eines racemischen Gemisches von 2-Chlorpropionsäure-2 ethyl-hexylesters wurden in 400 ml Diisopropylether gelöst und in einem Behälter, in dem 200 ml Wasser vorgelegt worden waren, unter Rühren eingebracht. Dabei bildeten sich 2 Phasen. Die organische, wassergesättigte Phase wurde über 6 g einer Humicola lanuginosa Lipase, vermischt mit 20 g Celite geleitet. Anschließend wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, verfahren. Nach 25 Stunden war ein Umsetzungsgrad von 32,4% erreicht und die Reaktion wurde abgebrochen. 55.2 g of a racemic mixture of 2-chloropropionic acid-2 ethyl hexylesters were dissolved in 400 ml of diisopropyl ether and in a container in which 200 ml of water had been placed under Stirring introduced. Two phases were formed. The organic, water-saturated phase was over 6 g of a Humicola lanuginosa Lipase mixed with 20 g of Celite. Subsequently, proceed as described in Example 1. After 25 hours there was one Degree of conversion reached 32.4% and the reaction was canceled.

Dabei wurde ein Enantiomerengemisch von R- und S-2-Chlorpro pionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +8,9°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des R-Enantiomeren von 54,3%, erhalten. Die spezifische Aktivität der Lipase betrug 0,54 mMol pro Stunde pro Gramm Lipase.An enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of + 8.9 ° was obtained, which corresponds to an enantiomeric excess of the R-enantiomer of 54.3%. The specific activity of the lipase was 0.54 mmol per hour per gram of lipase.

Example 37

Wurde wie Beispiel 36 unter Verwendung der gleichen Ausgangspro dukte und -mengen und unter Verwendung derselben, in Beispiel 36 eingesetzten Lipase nach Spülen der enzymenthaltenden Säule mit Diisopropylether wiederholt. Nach 48 Stunden war ein Umset zungsgrad von 64,8% erreicht und die Reaktion wurde abgebrochen. Dabei wurde ein Enantiomerengemisch von R- und S-2-Chlorpro pionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +4,7°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des R-Enantiomeren von 28,7%, erhalten. Die spezifische Aktivität der Lipase betrug 0,56 mMol pro Stunde pro Gramm Lipase.Was repeated as Example 36 using the same starting products and amounts and using the same lipase used in Example 36 after rinsing the enzyme-containing column with diisopropyl ether. After 48 hours, a degree of conversion of 64.8% was reached and the reaction was stopped. An enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of + 4.7 ° was obtained, which corresponds to an enantiomeric excess of the R-enantiomer of 28.7%. The specific activity of the lipase was 0.56 mmol per hour per gram of lipase.

Example 38

Unter Verwendung der organischen Phase aus Beispiel 37, die 19,4 g 2-Chlorpropionsäure-2-ethylhexylester enthielt, und einer Pseu domonas fluorescens Lipase, die mit 12,5 g Celite vermischt war, wurde auf die im Beispiel 36 beschriebene Art und Weise nach 8,6 Stunden ein Umsatz von 35,8% erreicht. Dabei wurde ein Enantiomerengemisch von R- und S-2-Chlorpropionsäure mit einem Drehwert (alpha)_D ²⁰ von -12,6°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des S-Enantiomeren von 76,8%, erhalten. Die Aktivität der Lipase betrug 1,48 mMol pro Stunde pro Gramm Lipase.Using the organic phase from Example 37, which contained 19.4 g of 2-chloropropionic acid-2-ethylhexyl ester, and a Pseu domonas fluorescens lipase, which was mixed with 12.5 g of Celite, was carried out in the manner described in Example 36 after 8.6 hours, sales reached 35.8%. An enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid was obtained with a rotation (alpha) _D ²⁰ of -12.6 °, which corresponds to an enantiomeric excess of the S-enantiomer of 76.8%. The activity of the lipase was 1.48 mmol per hour per gram of lipase.

Example 39

Unter Verwendung von 102,5 g eines Enantiomerengemisches von R und S-2-Chlorpropionsäure-2-ethyl-hexylester, mit einem Enan tiomerenüberschuß des S-Enantiomeren von 58,5%, hergestellt durch Veresterung der entsprechenden 2-Chlorpropionsäureenantiomeren mit 2-Ethyl-hexanol, und 4,8 mg einer Chromabakterium viscosum Lipase, vermischt mit 10 g Celite, wurde auf die im Beispiel 36 beschriebene Art und Weise ein Umsetzungsgrad von 22,5% erreicht. Dabei wurden 4,7 g eines Enantiomerengemisches von R- und S-2- Chlorpropionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von -12,9°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des S- Enantiomeren von 78,7%, erhalten. Die spezifische Aktivität der Lipase betrug 1,04 Mol pro Stunde pro Gramm Lipase.Using 102.5 g of a mixture of enantiomers of R and S-2-chloropropionic acid-2-ethyl-hexyl ester, with an enantiomeric excess of the S-enantiomer of 58.5%, prepared by esterification of the corresponding 2-chloropropionic acid enantiomers with 2-ethyl -hexanol, and 4.8 mg of a Chromabacterium viscosum lipase, mixed with 10 g of Celite, a degree of conversion of 22.5% was achieved in the manner described in Example 36. This gave 4.7 g of an enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of -12.9 °, which corresponds to an enantiomeric excess of the S-enantiomer of 78.7%. The specific activity of the lipase was 1.04 moles per hour per gram of lipase.

Example 40

57,6 g eines in Beispiel 27 beschriebenen racemischen Enantiome rengemisches wurde auf die im Beispiel 27 beschriebene Art und Weise aber bei 0 +1,5°C mit 6 g einer Candida cylindracea Lipase, die mit 24 g Celite vermischt war, in 5 Stunden mit einem Umset zungsgrad von 70% zu einem Enantiomerengemisch aus R- und S-2- Chlorpropionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +4,3°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß von 26%, umgesetzt. Die spezifische Aktivität der Lipase betrug 5,83 mMol pro Stunde pro Gramm Lipase.57.6 g of a racemic enantiomer mixture described in Example 27 was in the manner described in Example 27 but at 0 + 1.5 ° C with 6 g of a Candida cylindracea lipase, which was mixed with 24 g of Celite, in 5 hours with a degree of conversion of 70% to an enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of + 4.3 °, which corresponds to an enantiomeric excess of 26%. The specific activity of the lipase was 5.83 mmol per hour per gram of lipase.

Example 41

Auf die im Beispiel 40 beschriebene Art und Weise, aber bei einer Temperatur von 10°C wurde in 2,8 Stunden ein Umsetzungsgrad von 70% erreicht. Die spezifische Aktivität der Lipase betrug 10,3 mMol pro Stunde pro Gramm Lipase. Der optische Drehwert (alpha)_D ²⁰ des entstandenen Enantiomerengemisches betrug 4,4°.In the manner described in Example 40, but at a temperature of 10 ° C., a degree of conversion of 70% was achieved in 2.8 hours. The specific activity of the lipase was 10.3 mmol per hour per gram of lipase. The optical rotation (alpha) _D ^{20 of} the resulting enantiomer mixture was 4.4 °.

Example 42

56,6 g eines racemischen Enantiomerengemisches von 2-Chlorpro pionsäure-2-ethyl-hexylester wurden in 400 ml wassergesättigtem Diisopropylether gelöst und in einem Behälter vorgelegt. Die Lö sung wurde über 3 g einer Candida cylindracea Lipase, die mit 15 g Celite vermischt war, gepumpt. Die dabei gebildete Reaktionslösung wurde anschließend über eine Säule gepumpt, die 10 g Kalcium hydroxid, vermischt mit 20 g Celite, enthielt. Dabei verblieb die bei der Reaktion gebildete 2-Chlorpropionsäure infolge von Salz bildung in der Säule, während das bei der Hydrolyse verbrauchte Wasser in der organischen Lösung wieder ersetzt wurde. Die weitere Reaktionsführung erfolgte kontinuierlich auf die oben beschriebene Art und Weise, bis nach 4 Stunden ein Umsetzungsgrad von 34,3% erreicht war. Dabei wurde ein Enantiomerengemisch der R- und S-2- Chlorpropionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +7,0°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des R-En antiomeren von 43%, erhalten.56.6 g of a racemic enantiomer mixture of 2-chloropropionic acid-2-ethyl-hexyl ester were dissolved in 400 ml of water-saturated diisopropyl ether and placed in a container. The solution was pumped over 3 g of a Candida cylindracea lipase mixed with 15 g of Celite. The reaction solution thus formed was then pumped through a column which contained 10 g of calcium hydroxide mixed with 20 g of Celite. The 2-chloropropionic acid formed in the reaction remained in the column as a result of salt formation, while the water used in the hydrolysis was replaced in the organic solution. The further reaction was carried out continuously in the manner described above until a degree of conversion of 34.3% was reached after 4 hours. An enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid was obtained with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of + 7.0 °, which corresponds to an enantiomeric excess of the R-ene antiomer of 43%.

Example 43

6,59 g eines racemischen Enantiomerengemisches von 2-Chlorpro pionsäurebutylester. wurden in 75 ml Diisopropylether gelöst und mit 1,6 ml eines Natriumphosphatpuffers (pH = 7), 0,1 g Sephadex G 50 der Fa. Pharmacia, vorgequollen in Wasser, 6 g Celite und 6 g einer Geotrichum candidum Lipase versetzt und bei Raumtemperatur gerührt. Nach 168,8 Stunden war ein Umsetzungsgrad von 37,4% er reicht und die Reaktion wurde abgebrochen. Dabei wurde ein Enan tiomerengemisch von R- und S-2-Chlorpropionsäure mit einem optischen Drehwert von (alpha)_D ²⁰ von -8,8°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des S-Enantiomeren von 53,7%, erhalten.6.59 g of a racemic mixture of enantiomers of 2-chloropropyl butyl ester. were dissolved in 75 ml of diisopropyl ether and mixed with 1.6 ml of a sodium phosphate buffer (pH = 7), 0.1 g of Sephadex G 50 from Pharmacia, pre-swollen in water, 6 g of Celite and 6 g of a Geotrichum candidum lipase and at room temperature touched. After 168.8 hours, a degree of conversion of 37.4% was sufficient and the reaction was stopped. An enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid with an optical rotation value of (alpha) _D ²⁰ of -8.8 °, which corresponds to an enantiomeric excess of the S-enantiomer of 53.7%, was obtained.

Example 44

Wie im Beispiel 43 beschrieben, aber unter Verwendung von 15 g ei nes racemischen Enantiomerengemisches von 2-Chlorpropionsäurepro pylester, 5 g einer Geotrichum candidum Lipase, 5 g Celite, 2,5 ml eines 10 mM Natriumphosphatpuffers (pH = 7), 340 mg Hydrogel Evergreen 500, Chemie Linz AG, vorgequollen in Wasser, wurde nach 118,5 Stunden ein Umsatz von 24,5% erreicht. Dabei wurde ein Enantiomerengemisch der R- und S-2-Chlorpropionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +3,0°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des R-Enantiomeren von 18,3%, erhalten. As described in Example 43, but using 15 g of a racemic enantiomer mixture of propyl 2-chloropropionate, 5 g of a Geotrichum candidum lipase, 5 g of Celite, 2.5 ml of a 10 mM sodium phosphate buffer (pH = 7), 340 mg of hydrogel Evergreen 500, Chemie Linz AG, pre-swollen in water, achieved a turnover of 24.5% after 118.5 hours. An enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of + 3.0 ° was obtained, which corresponds to an enantiomeric excess of the R-enantiomer of 18.3%.

Example 45

Auf die im Beispiel 43 beschriebene Art und Weise aber unter Ver wendung von 0,1 g Hydrogel Evegreen 500, Chemie Linz AG, vorge quollen in Wasser, anstatt Sephadex G 50, wurde nach 46,8 Stunden ein Umsetzungsgrad von 24% erreicht. Dabei wurde ein Enantiomerengemisch von R- und S-2-Chlorpropionsäure mit einem optischen Drehwert (alpha)_D ²⁰ von -11,7°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des S-Enantiomeren von 71,3%, erhalten.In the manner described in Example 43 but using 0.1 g of Hydrogel Evegreen 500, Chemie Linz AG, pre-swollen in water instead of Sephadex G 50, a degree of conversion of 24% was reached after 46.8 hours. An enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid was obtained with an optical rotation (alpha) _D ²⁰ of -11.7 °, which corresponds to an enantiomeric excess of the S-enantiomer of 71.3%.

Example 46

6,58 g eines racemischen Enantiomerengemisches von 2-Chlorpro pionsäurebutylester wurden in 50 ml Diisopropylether gelöst und mit 1 g Celite, 0,1 g Sephadex G 50 der Firma Pharmacia, vorge quollen in Wasser, 0,8 g 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 7) und 0,8 g einer Candida cylindracea Lipase versetzt und bei Raumtemperatur gerührt. Nach 1,75 Stunden betrug der Umsetzungsgrad 34,5%. Die Reaktion wurde abgebrochen und das Hy drogel und die Lipase abfiltriert. Die Reaktionslösung enthielt ein Enantiomerengemisch von R- und S-2-Chlorpropionsäure mit einem Drehwert (alpha)_D ²⁰ von +4,3°, das entspricht einem Enantiomerenüberschuß des R-Enantiomeren von 26,2%. Die spezifi sche Aktivität der Lipase betrug 9,86 mMol pro Stunde pro Gramm Lipase.6.58 g of a racemic enantiomer mixture of 2-chloropropionic acid butyl ester were dissolved in 50 ml of diisopropyl ether and pre-swollen with 1 g of Celite, 0.1 g of Sephadex G 50 from Pharmacia, in water, 0.8 g of 10 mM sodium phosphate buffer (pH = 7) and 0.8 g of a Candida cylindracea lipase and stirred at room temperature. After 1.75 hours, the degree of conversion was 34.5%. The reaction was stopped and the hydrogel and lipase filtered off. The reaction solution contained an enantiomer mixture of R- and S-2-chloropropionic acid with a rotation (alpha) _D ²⁰ of + 4.3 °, which corresponds to an enantiomeric excess of the R-enantiomer of 26.2%. The specific activity of the lipase was 9.86 mmol per hour per gram of lipase.

Der in den Beispielen angegebene spezifische, optische Drehwert der erhaltenen Produkte (alpha)_D ²⁰ wurde in allen Beispielen bei einer Wellenlänge von 589 nm (Natrium D-Linie), 20°C, c=1 in Chloroform gemessen.The specific optical rotation value of the products (alpha) _D ²⁰ given in the examples was measured in all examples at a wavelength of 589 nm (sodium D-line), 20 ° C., c = 1 in chloroform.

Als Celite wurde in den Beispielen "Celite Hyflo Super-Cel" der Fa. Fluka, Partikelgröße 2 bis 25 µ eingesetzt."Celite Hyflo Super-Cel" was the Celite in the examples Fluka, particle size 2 to 25 µ used.

Claims

1. A process for the enzymatic hydrolysis of a carboxylic acid derivative, characterized in that the carboxylic acid derivative is dissolved in an organic solvent which is only miscible with water to a slight extent, whereupon the solution is saturated with water and brought into contact with a hydrolase is, with hydrolysis taking place using water, whereupon the organic reaction solution is again saturated with water and brought into contact with the hydrolase until the desired degree of conversion is reached.

2. The method according to claim 1, characterized in that the What saturation of the organic phase with the help of a water ent hydrogel holding.

3. The method according to claim 1, characterized in that the What saturation after hydrolysis by transferring the organi reaction solution via agents containing hydroxide ions takes place, the carboxylic acid formed The reaction equilibrium is stripped and this during hydrolysis used water is replaced.

4. The method according to claim 1, characterized in that the car bonsäurederivat dissolved in the organic solvent and the formed organic solution in an aqueous phase Storage container is introduced, the organic Solution saturated with water and moving away from the aqueous phase separates what this water saturated organic solution through a reaction vessel containing the hydrolase is pumped and the formed organic reaction solution in the aqueous phase of the Storage container, its pH value by adding a base is kept constant, is pumped back, the formed carboxylic acid as a salt of the base added in the aqueous phase remains and the hydrolysis balance is withdrawn while the organic phase is back with Water saturates, separates from the water and then for so long via the hydrolase and then into the aqueous phase is pumped until the desired degree of implementation is reached.

5. The method according to claim 4, characterized in that the Hy drolase after completion of a reaction cycle with chloroform is rinsed before being put into a new reaction cycle is set.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized records that a chiral or prochiral carboxylic acid derivative is used.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized records that an enantiomer mixture of a Halogenpropionsäu reesters is used.

8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized records that an ether is used as the organic solvent is set.

9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized records that a lipase is used as hydrolase.

10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized records that the hydrolase adsorbed on a carrier is set.