DE3933850A1

DE3933850A1 - CYTOLYSIS INHIBITOR (ZLI), A DNA SEQUENCE ENCODING THIS BLOOD PLASMA PROTEIN, AND A PLASMIDE, A HOST ORGANISM AND A METHOD FOR OBTAINING THIS PROTEIN

Info

Publication number: DE3933850A1
Application number: DE3933850A
Authority: DE
Inventors: Juerg Prof Tschopp; Dieter Dr Jenne
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1989-10-06
Filing date: 1989-10-06
Publication date: 1991-04-18
Also published as: AU6517790A; JPH04502626A; EP0452433A1; WO1991005043A1; CA2042605A1

Abstract

A cytolysis inhibitor protein, DNA coding therefor, plasmids containing said DNA, host cells containing said plasmids and monoclonal antibodies to said protein are provided, as well as a method of isolating the cytolysis inhibitor for bodily fluid, a method of making the cytolysis inhibitor by recombinant technology, immunological methods of use of said antibodies and methods of treating various disease states.

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Blutplasmakomponente mit starker Hemmwirkung auf die durch terminale Komplementproteine wie z. B. durch das von Killerzellen sezernierte Perforin oder durch das α-Toxin von Staphylococcus aureus vermittelte Zielzell-Lyse.The invention relates to a new blood plasma component with a strong inhibitory effect on the by terminal complement proteins such. B. by that of killer cells secreted perforin or mediated by the α-toxin from Staphylococcus aureus Target cell lysis.

Die vorliegende Erfindung wird insbesondere durch die Ansprüche 1-25 wiedergegeben.The present invention is particularly represented by claims 1-25.

Die immunologische Abwehr gegenüber eingedrungenen Viren, Bakterien, virustransformierten und Virus-befallenen Zellen, maligne veränderten oder durch Alterung veränderten körpereigenen Zellen, gegen Spermien im weiblichen Genitaltrakt und gegen körperfremde Substanzen der Umwelt wird durch zwei sich ergänzende Effektrosysteme sichergestellt.The immunological defense against invading viruses, bacteria, virus-transformed and virus-infected cells, malignant or altered Aging altered the body's own cells, against sperm in the female genital tract and against foreign substances of the environment is complemented by two Effect systems ensured.

Das zelluläre Effektorsystem besteht aus speziell ausgereiften Immunzellen, den sogenannten zytotoxischen T-Lymphozyten und den natürlichen Killerzellen. Lymphozyten und natürliche Killerzellen sind in der Lage, mit Hilfe eigener Oberflächenrezeptoren körperfremde Strukturen auf anderen körpereigenen Zellen und im interstitiellen Gewebe zu erkennen und die Ausbreitung und Vermehrung dieser körperfremden Substanzen und Mikroorganismen wirksam zu verhindern. Aktivierte zytotoxische Lymphozyten und natürliche Killerzellen nehmen engen Kontakt mit den als fremd erkannten Zielzellen auf und setzen gezielt membranschädigende Moleküle frei, gegen die sie selbst geschützt sind. Das eigentliche membranschädigende Molekül der Killerzellen ist das sogenannte Perforin, das eine hohe Affinität für die lipophile Membran der Zielzelle besitzt. Mehrere Moleküle dringen in die Doppelschichtmembran der Zielzelle ein und bilden sodann einen Zylinder-ähnlichen wasserdurchlässigen Kanal quer durch die Lipiddoppelmembran der Zielzelle. Durch den hydrophilen Innenraum des transmembranösen Kanals können Wassermoleküle und Elektrolytsalze sich frei bewegen. Dadurch wird das osmotische Gleichgewicht der Zelle gestört und die Zielzelle geht infolge des Einströmens von Kochsalz- und Kalzium-haltigem Wasser aus dem extrazellulären Milieu zugrunde.The cellular effector system consists of specially developed immune cells, the so-called cytotoxic T lymphocytes and the natural killer cells. Lymphocytes and natural killer cells are able to use their own surface receptors foreign structures on other cells and to recognize in the interstitial tissue and the spread and multiplication of these to effectively prevent foreign substances and microorganisms. Activated cytotoxic lymphocytes and natural killer cells are in close contact target cells recognized as foreign and target membrane-damaging ones Free molecules against which they themselves are protected. The actual membrane-damaging The molecule of the killer cells is the so-called perforin, which is a high Has affinity for the lipophilic membrane of the target cell. Multiple molecules penetrate into the double-layer membrane of the target cell and then form one Cylinder-like water-permeable channel across the lipid double membrane the target cell. Through the hydrophilic interior of the transmembrane channel water molecules and electrolyte salts can move freely. This will make it The cell's osmotic balance is disturbed and the target cell goes as a result of Inflow of saline and calcium-containing water from the extracellular Milieu.

Das humorale System der Immunabwehr besteht aus einer Vielzahl löslicher Plasmaproteine, die miteinander interagieren und eine fein abgestufte Kaskade ähnlich der des Gerinnungssystems bilden. Der eigentliche terminale Schritt bei der Komplementaktivierung führt zu einer Membranschädigung der Zielzelle nach dem gleichen Prinzip wie bei der durch Perforin verursachten Lyse der Zielzellen. Die Zusammenlegung der terminalen Komponenten des Komplementsystems wird durch die Spaltung von Komplementprotein C5 in zwei Bruchstücke C5a und C5b eingeleitet. Das carboxy-terminale Hauptfragment C5b lagert sich mit C6, C7 und C8 zu einem makromolekularen Komplex zusammen, dessen Hydrophobizität mit der Anlagerung von C7 und C8 beträchtlich zunimmt und an die Lipiddoppelmembran binden kann. Der C5b-8 Komplex selbst bildet noch keine funktionelle Pore in der Lipidmembran. Membrangebunden übernimmt er die Rolle eines Rezeptors, der die Anlagerung mehrerer C9 Moleküle zu einem durchlässigen Membrankanal steuert.The humoral immune system consists of a large number of soluble plasma proteins, interacting with each other and resembling a finely graded cascade that of the coagulation system. The actual terminal step at the complement activation leads to membrane damage to the target cell the same principle as in the perforation-induced lysis of the target cells. The merging of the terminal components of the complement system will by cleaving complement protein C5 into two fragments C5a and C5b initiated. The main carboxy-terminal fragment C5b is associated with C6, C7 and C8 to a macromolecular complex, the hydrophobicity with the Attachment of C7 and C8 increases significantly and to the lipid double membrane can bind. The C5b-8 complex itself does not yet form a functional pore in the lipid membrane. Membrane-bound, it takes on the role of a receptor that the attachment of several C9 molecules to a permeable membrane channel controls.

Lösliche Perforin-Monomere und der stabile, lösliche C5b-6 Komplex können sich vom Ort ihrer Freisetzung bzw. Generierung entfernen und in die Umgebung diffundieren, so daß benachbarte gesunde Zellen getroffen werden könnten. Seit langem wurden daher wirksame Regulationsmechanismen vermutet, die eine unkontrollierte Ausbreitung potentiell lytischer Moleküle verhindern.Soluble perforin monomers and the stable, soluble C5b-6 complex can remove from the place of their release or generation and diffuse into the environment, so that neighboring healthy cells could be hit. since Effective regulatory mechanisms have long been suspected of being an uncontrolled one Prevent the spread of potentially lytic molecules.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher, natürliche Inhibitoren für die bekannten immunologischen Effektormoleküle, d. h. für das aus T-Zellen und Killerzellen stammende Perforin und für die terminalen Komplement-Proteine des menschlichen Plasmas, zu finden und gentechnisch herzustellen. The object of the present invention was therefore to use natural inhibitors for known immunological effector molecules, d. H. for that from T cells and Perforin derived from killer cells and for the terminal complement proteins of the human plasma, to find and produce genetically.

Gelöst wurde diese Aufgabe dadurch, daß die Aminosäuresequenz von Teilen des Glykoproteins ZLI durch Sequenzieren der ersten zwanzig aminoterminalen Aminosäuren nach dem Edman-Abbauverfahren aufgeklärt wurde, anhand dieser Sequenzen synthetische DNA-Sonden hergestellt wurden und hiermit eine im Beispiel genannte Leber-spezifische C-DNA-Bibliothek durchsucht wurde. Das neue Gen wurde im menschlichen Genom kloniert. Dieses Gen kodiert für ein Eiweißmolekül, das den internationalen Namen "Cytolysis inhibitor" (CLI oder ZLI) trägt. Dieses Polypeptid ist ein wesentlicher und charakteristischer Bestandteil einer neuen Blutplasmakomponente mit den oben genannten Eigenschaften.This problem was solved in that the amino acid sequence of parts of the Glycoproteins ZLI by sequencing the first twenty amino terminal amino acids after the Edman degradation process, based on these sequences synthetic DNA probes were produced and hereby one mentioned in the example Liver-specific C-DNA library was searched. The new gene was released in cloned human genome. This gene codes for a protein molecule that the international name "Cytolysis inhibitor" (CLI or ZLI) carries. This polypeptide is an essential and characteristic part of a new one Blood plasma component with the above properties.

Nach Isolierung des rekombinanten Plasmids pGEM4 des Klons ZLI-1 nach einer Routinemethode wurde dieses mit Hilfe von Restriktionsenzymen analysiert. Es wurde die Größe der DNA-Insertion mit pGEM4 Vektor bestimmt.After isolation of the recombinant plasmid pGEM4 of the clone ZLI-1 after a Routine method was analyzed with the help of restriction enzymes. It the size of the DNA insert was determined with pGEM4 vector.

Die Erfindung betrifft somit eine DNA, kodierend für den spezifischen Eiweißanteil einer neuen Blutplasmakomponente und für ein Reinigungsverfahren für die natürliche Blutplasmakomponente, die durch das ZLI-Eiweißmolekül gekennzeichnet ist und die eine Hemmwirkung auf die durch Komplementproteine vermittelte Zielzell-Lyse und auf das aus Killerzellen isolierte Perforin ausübt. Die Erfindung betrifft insbesondere die in Abb. 2 dargestellte Nukleotidbasensequenz vom Klon ZLI-1 und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz. Die Erfindung betrifft außerdem das in Abb. 1 dargestellte Plasmid pGEM4/ZLI-1, Wirtsorganismen, die mit diesem Plasmid transformiert sind und den Zytolyse-Inhibitor aus humanem Plasma, der erstmals isoliert wurde.The invention thus relates to a DNA coding for the specific protein content of a new blood plasma component and for a cleaning process for the natural blood plasma component, which is characterized by the ZLI protein molecule and which has an inhibitory effect on the target cell lysis mediated by complement proteins and on that isolated from killer cells Perforin exercises. The invention particularly relates to the nucleotide base sequence of clone ZLI-1 shown in Fig. 2 and the amino acid sequence derived therefrom. The invention also relates to the plasmid pGEM4 / ZLI-1 shown in Fig. 1, host organisms which are transformed with this plasmid and the cytolysis inhibitor from human plasma, which was isolated for the first time.

Des weiteren umfaßt diese Erfindung den monoklonalen Antikörper ZLI-9 aus der Hybridoma-Linie ZLI-9 und seine Verwendung zur Isolierung und Reinigung von ZLI aus humanem Plasma und seine Verwendung zum quantitativen Nachweis der natürlichen Blutplasmakomponente, des von der ZLI cDNA kodierten Polypeptides und der mit ZLI assoziierten Reaktionsprodukte in biologischen Flüssigkeiten. Schließlich betrifft diese Erfindung auch die pharmazeutische Verwendung von ZLI zu therapeutischen und prophylaktischen Zwecken. Furthermore, this invention comprises the monoclonal antibody ZLI-9 from the Hybridoma line ZLI-9 and its use for the isolation and purification of ZLI from human plasma and its use for the quantitative detection of natural Blood plasma component, the polypeptide encoded by the ZLI cDNA and the reaction products in biological fluids associated with ZLI. In the end This invention also relates to the pharmaceutical use of ZLI therapeutic and prophylactic purposes.

Bei der Charakterisierung des löslichen terminalen Komplementkomplexes mit Hilfe monoklonaler Antikörper stellte sich heraus, daß im terminalen Komplementkomplex neben dem bereits bekannten S-Protein/Vitronektin ein weiteres noch unbekanntes Protein, Zytolyse-Inhibitor, vorkommt. Dieses Protein wurde durch einen monoklonalen Antikörper identifiziert, der wider Erwarten nicht das S-Protein erkannte. Es stellte sich heraus, daß ZLI kein Bestandteil des membran-gebundenen, lytischen Komplementkomplexes ist.When characterizing the soluble terminal complement complex with the help monoclonal antibody was found to be in the terminal complement complex in addition to the already known S-protein / vitronectin another one unknown protein, cytolysis inhibitor. This protein was made by identified a monoclonal antibody that, contrary to expectations, does not S protein recognized. It turned out that ZLI is not part of the membrane-bound, lytic complement complex is.

Durch Affinitäschromatographie mit Hilfe des monoklonalen Antikörper ZLI-9 gelang es, die korrespondierende Komponente aus menschlichem Plasma in funktionell aktiver Form zu isolieren und anzusequenzieren. Gereinigtes ZLI hat ein Molekulargewicht von 70 kDa unter nichtreduzierenden Bedingungen und ein Molekulargewicht von 35 kDa unter reduzierenden Bedingungen in der Natrium-Dodecylsulfat-Gelelektrophorese. Ein Vergleich mit allen bisher bekannten Proteinsequenzen, die in der Literatur veröffentlicht worden sind, ergab, daß die komplette Proteinstruktur des ZLI und die entsprechende Nukleotidbasensequenz bisher nicht ermittelt worden sind.By affinity chromatography using the monoclonal antibody ZLI-9 managed to make the corresponding component from human plasma functional to isolate and sequence active form. Cleaned ZLI has one Molecular weight of 70 kDa under non-reducing conditions and a molecular weight of 35 kDa under reducing conditions in sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis. A comparison with all previously known protein sequences, which have been published in the literature showed that the complete Protein structure of the ZLI and the corresponding nucleotide base sequence so far have not been determined.

Aufgrund der immunologischen und molekularbiologischen Identifizierung des Glykoproteins ZLI konnte eine neue Komponente aus menschlichem Plasma mit Hilfe monoklonaler Antikörper in ausreichenden Mengen isoliert und gereinigt und auf seine inhibitorische Wirkung untersucht. Die isolierte Blutplasmakomponente wirkt einer unerwünschten Zellzerstörung entgegen. Sie neutralisiert in konzentrationsabhängiger Weise das zytolytische Potential der sich bildenden C5b-7 Komplexe in der extrazellulären Flüssigkeit und im Plasma. Die Empfindlichkeit körpereigener Zellen gegenüber Komplement- und Perforin-Lyse wird verringert und die Schwelle für Zellschädigung erhöht. Das Glykoprotein ZLI kommt auch in der menschlichen Samenflüssigkeit vor.Due to the immunological and molecular biological identification of the glycoprotein ZLI was able to use a new component from human plasma monoclonal antibodies isolated and purified in sufficient quantities and on investigated its inhibitory effect. The isolated blood plasma component counteracts unwanted cell destruction. It neutralizes in a concentration-dependent manner Way the cytolytic potential of the forming C5b-7 Complexes in extracellular fluid and plasma. The sensitivity the body's own cells against complement and perforin lysis is reduced and increases the threshold for cell damage. The glycoprotein ZLI also comes in of human semen.

Unter Verwendung gentechnologischer Methoden und basierend auf der erstellten partiellen Aminosäuresequenz, die mit einer bereits publizierten partiellen Sequenz übereinstimmte, konnte die komplette cDNA-Sequenz des ZLI aus einer Leber-spezifischen Genbank isoliert und analysiert worden. Der Klon ZLI-1 ist 1651 Basenpaare lang und weist einen offenen Leserahmen beginnend mit der 199. Nukleotidbase auf. Die von der Nukleotidbasensequenz abgeleitete Aminosäuresequenz hat 448 Aminosäurereste. Die ersten 21 Aminosäuren bilden ein typisches hydrophobes Signalpeptid, das bei der Translokation in das rauhe endoplasmatische Retikulum entfernt wird. Das reife sezernierte Protein beginnt daher mit der Sequenz D-Q-T-V-S-D-N-E (die Asparaginsäure, D, trägt die Nummer 1). Die zweikettige Form des ZLI rührt daher, daß noch vor der Sekretion des ZLI in das humane Plasma durch eine noch unbekannte zelluläre Protease die Peptidbindung zwischen dem Arginin-205 und dem Serin-206 hydrolysiert wird.Using genetic engineering methods and based on the created partial amino acid sequence with a previously published partial Sequence matched, the complete cDNA sequence of the ZLI could be derived from one Liver-specific library has been isolated and analyzed. The clone is ZLI-1 1651 base pairs long and has an open reading frame starting at 199. Nucleotide base. The amino acid sequence derived from the nucleotide base sequence has 448 amino acid residues. The first 21 amino acids form a typical one hydrophobic signal peptide that translocates into the rough endoplasmic Reticulum is removed. The mature secreted protein therefore begins with the sequence D-Q-T-V-S-D-N-E (the aspartic acid, D, bears the number 1). The The two-chain form of the ZLI stems from the fact that even before the secretion of the ZLI in the human plasma through a still unknown cellular protease the peptide bond is hydrolyzed between the arginine-205 and the serine-206.

Durch die sog. Southern-Blot-Analyse wurde gezeigt, daß ZLI nur durch ein einziges Gen im Genom des Menschen und in der Ratte repräsentiert wird. Die Existenz sehr ähnlicher oder hochhomologer Gene, d. h. das Vorhandensein einer Genfamilie, wurde dadurch mit großer Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen. Dieses Ergebnis ist besonders wichtig im Hinblick darauf, daß mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers ZLI-9 der Zytolyse-Inhibitor auch in der Samenflüssigkeit eindeutig identifiziert werden konnte.It was shown by the so-called Southern blot analysis that ZLI only by a single Gene is represented in the human genome and in the rat. The Existence of very similar or highly homologous genes, i.e. H. the presence of a Gene family was excluded with a high probability. This Result is particularly important in terms of using the monoclonal Antibody ZLI-9 the cytolysis inhibitor is also unique in the semen could be identified.

Sowohl das Molekulargewicht als auch die Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper ZLI-9 lassen den eindeutigen Schluß zu, daß es sich bei dem Protein in der menschlichen Samenflüssigkeit um das gleiche Genprodukt handelt.Both molecular weight and reactivity with the monoclonal antibody ZLI-9 allow the clear conclusion that the protein in human semen is the same gene product.

Die mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers ZLI-9 isolierte Blutplasmakomponente ist durch ihre speziellen biochemischen Eigenschaften in der Lage, die Membran-bindende und Membran-inserierende Aktivität der naszenten Komplement-Komplexe und des monomeren Perforins zu neutralisieren. Die biologische Aktivität der gereinigten Blutplasmakomponente könnte durch die Polypeptidkette, den damit assoziierten Kohlenhydratanteil oder durch ZLI-assoziierte Lipidanteile vermittelt werden.The blood plasma component isolated using the monoclonal antibody ZLI-9 Due to its special biochemical properties it is able to bind the membrane and membrane-inserting activity of the nascent complement complexes and neutralize the monomeric perforin. The biological activity of the Purified blood plasma component could be caused by the polypeptide chain associated carbohydrate portion or mediated by ZLI-associated lipid portions will.

Die anti-zytolytische Aktivität des ZLI wurde durch in vitro-Experimente mit Schafserythrozyten nachgewiesen. Mit steigenden ZLI-Konzentrationen wurde die Effizienz der Erythrozytenlyse erschwert. Die wirksamen ZLI-Konzentrationen bewegen sich in einem Bereich, der in der Nähe oder etwas unterhalb des natürlichen Plasmaspiegels liegt. Die Erhöhung der ZLI-Plasmaspiegel durch externe Zufuhr stellt ein therapeutisches Prinzip dar, um erhöhte systemische Komplementaktivität im Körper zu kompensieren. The anti-cytolytic activity of the ZLI was determined by in vitro experiments with Sheep erythrocytes detected. With increasing ZLI concentrations, the Efficiency of erythrocyte lysis difficult. The effective ZLI concentrations move in an area that is close to or slightly below natural Plasma level. The increase in ZLI plasma levels by external Intake is a therapeutic principle to increase systemic complement activity to compensate in the body.

Durch die Isolierung und Charakterisierung von ZLI ist man in der Lage, Plasmaspiegel des Zytolyse-Inhibitors durch pharmazeutische oder biologische Wirkstoffe, die die Genexpression des Zytolyse-Inhibitors in der Leber oder in anderen Geweben, z. B. den Sertoli-Zellen, verändern, zu steuern. Damit ist auch die Entwicklung von immunologischen Methoden zur Bestimmung der ZLI-Konzentrationen in menschlichen Körperflüssigkeiten möglich.By isolating and characterizing ZLI one is able to get plasma levels the cytolysis inhibitor through pharmaceutical or biological agents, the gene expression of the cytolysis inhibitor in the liver or in others Fabrics, e.g. B. change the Sertoli cells to control. That is also the development of immunological methods for determining ZLI concentrations possible in human body fluids.

Die Erfindung beinhaltet außerdem die systemische oder lokale Verabreichung des ZLI zur Behandlung Gewebe-zerstörender Krankheitsvorgänge, die durch Komplement und Killerzellen bedingt sind, und die lokale oder systemische Verabreichung von ZLI zur Detoxifikation von membranaktiven Peptiden und zytolytischen Proteinen, die von Krankheitserregern, z. B. von Bakterien (u. a. Staphylokokkus aureus, Escherichia coli), Pilzen oder Insekten (z. B. im Gift von Honigbienen, Wespen, Hornissen, Hummeln enthalten) abgegeben werden.The invention also includes systemic or local administration of the ZLI used to treat tissue-destroying disease by complement and killer cells, and local or systemic administration from ZLI for detoxification of membrane-active peptides and cytolytic proteins, those of pathogens, e.g. B. of bacteria (including staphylococcus aureus, Escherichia coli), fungi or insects (e.g. in the poison of honeybees, Wasps, hornets, bumblebees).

Examples Example 1 Isolation of the cytolysis inhibitor (ZLI) gene a) Designing a probe and producing synthetic oligonucleotides

Von der partiellen Aminosäuresequenz der beiden Ketten des ZLI werden über den genetischen Code Nukleotidsäuresequenzen abgeleitet und die entsprechenden Oligonukleotide als Hybridisierungssonden synthetisiert. Da der genetische Code degeneriert ist, d. h. zumeist mehrere Codons für dieselbe Aminosäure kodieren können, werden zwei lange Oligonukleotide synthetisiert und gemäß den Regeln von Lathe, J. Mol. Biol. 183, 1-12, 1985, nur diejenigen Codons ausgewählt, die aufgrund statistischer Erfahrungswerte mit größter Wahrscheinlichkeit in menschlichen Genen für die jeweiligen Aminosäuren anzutreffen sind. Für die Sonde 1 wird die Partialsequenz DNELQEMSNQG, für die Sonde 2 die Partialsequenz PYEPLNFHAMFQPFLEM ausgewählt. Diese Proteinsequenzen werden nach Beispiel 2) bzw. nach Murphy et al., J. Clin. Invest. 81, 18 589-1864, 1988, bestimmt. Die resultierenden synthetischen Hybridisierungssonden haben die folgenden Nukleotidbasensequenzen für Sonde 1: 5′-GAC AAT GAG CTG CAG GAG ATG TCC AAC CAG GG-3′; für Sonde 2: 5′-CCC TAT GAG CCC CTG AAC TTC CAC GCC ATG TTC CAG CCC TTC CTG GAG ATG-3′. Der Vergleich mit der später ermittelten, korrekten cDNA-Sequenz ergibt, daß beide Sonden nur durch drei Nukleotidbasen von der richtigen cDNA-Sequenz abweichen und die Sonde 1, ein 32-Oligomer, für die Ameisensäure 6 bis 15 der a-Kette und die Sonde 2, ein 51-Oligomer, für die Aminosäuren 7 bis 23 auf der b-Kette kodiert.The partial amino acid sequence of the two chains of the ZLI are transferred via the genetic code derived nucleotide acid sequences and the corresponding Oligonucleotides synthesized as hybridization probes. Because the genetic code is degenerate, d. H. usually code several codons for the same amino acid can, two long oligonucleotides are synthesized and according to the rules by Lathe, J. Mol. Biol. 183, 1-12, 1985, only selected those codons that based on statistical experience with the greatest probability in human genes for the respective amino acids can be found. For the Probe 1 becomes the partial sequence DNELQEMSNQG, for probe 2 the partial sequence PYEPLNFHAMFQPFLEM selected. These protein sequences are according to Example 2) or according to Murphy et al., J. Clin. Invest. 81, 18 589-1864, 1988. The resulting synthetic hybridization probes have the following nucleotide base sequences for probe 1: 5′-GAC AAT GAG CTG CAG GAG ATG TCC AAC CAG GG-3 ′; for probe 2: 5′-CCC TAT GAG CCC CTG AAC TTC CAC GCC ATG TTC CAG CCC TTC CTG GAG ATG-3 ′. The comparison with the correct cDNA sequence determined later reveals that both probes are only correct by three nucleotide bases cDNA sequence deviate and probe 1, a 32-oligomer, for formic acid 6 to 15 of the a chain and probe 2, a 51 oligomer, for amino acids 7 to 23 encoded on the b chain.

b) Terminal labeling of the oligomer probes

Die Sonden werden am 5′-Terminus unter Verwendung von [Gamma-³²P]dATP (Amersham) und T4-Polynukleotidkinase (Pharmacia-LKB, Schweden) radioaktiv markiert. Die 20 µl Reaktionslösung enthält 70 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7.6, 10 mM MgCl₂ und 5 mM DTT, 3 pMol des jeweiligen Oligomers, 9 pMol [Gamma-³²P]dATP und 6 Einheiten T4-DNA-Polynukleotidkinase und wird bei 37°C für 30 Min. inkubiert. Das freie nicht verwertete [Gamma-³²P]dATP wird durch Gelfiltration (NAP 25, Pharmacia-LKB, Schweden) von den Oligonukleotiden abgetrennt. The probes are terminated at the 5'-terminus using [Gamma-32 P] dATP (Amersham) and T4 polynucleotide kinase (Pharmacia-LKB, Sweden) radioactively labeled. The 20 ul reaction solution contains 70 mM Tris hydrochloride, pH 7.6, 10 mM MgCl₂ and 5 mM DTT, 3 pmol of the respective oligomer, 9 pmol [gamma-32 P] dATP and 6 units T4 DNA polynucleotide kinase and is incubated at 37 ° C for 30 min. The free Unused [gamma-32 P] dATP is by gel filtration (NAP 25, Pharmacia-LKB, Sweden) separated from the oligonucleotides.

c) Screening a liver cDNA library

Die sogenannte Kolonie-Hybridisierung für Bakterienklone wird unter Verwendung großer Koloniedichten durchgeführt. Ungefähr 200 000 Bakterien einer Leber-spezifischen cDNA-Bibliothek (Haefliger, J.-A., Jenne, D., Stanley, K. K. and Tschopp, J., Biochem. Biophys. Res. Commun. 149, 750-754, 1987) werden auf 20 Ampicillin-haltigen (50 µg/ml) Agarplatten der Größe 22 cm×22 cm ausgestrichen. Als Agar-Medium wird 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l NaCl, und 1,6% (G/V) BactoAgar verwendet. Nachdem die Bakterien 20 Stunden lang über Nacht bei 37°C kultiviert worden sind, werden die etwa 1 mm großen rundlichen Kolonien durch einfaches Abklatschen von den Agarplatten auf Nitrocellulose-Filter (Schleicher und Schüll) übertragen. Auf den ursprünglichen Agarböden werden die Bakterienkolonien für 7 Stunden weiterkultiviert und so ein vermehrungsfähiges Replikat für jede Kolonie auf den Nitrocellulosefiltern angelegt. Die Bakterien-Kolonnen auf den Nitrocellulosefiltern werden durch Natrium-Dodecylsulfat und Natronlauge solubilisiert. Während der Inkubation der Nitrocellulosefilter in alkalischer Lösung wird die bakterielle DNA freigesetzt, denaturiert und als einsträngige DNA an die Filtermembran gebunden. Nach einigen Waschvorgängen mit neutralen Puffern wird die DNA durch Erhitzen an die Nitrocellulose fest fixiert (Davies, L. G., Dibner, M. D. and Battey, J. F., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New York, 1986). Um die unspezifische Bindung der Sonde an die Nitrocellulose zu unterbinden, werden die Filter vier Stunden lang bei 50°C vorhybrisiert. Die Lösung besteht aus 6×SSC (1×SSC enthält 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat), 5×Denhardtsche Lösung (gemäß Maniatis, T. et al. in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982), 0,1% Natriumdodecylsulfat, 10 mM EDTA und 50 µg/ml beschallte und durch fünfminütiges Kochen denaturierte Lachsspermien-DNA (=Hybridisierungslösung). Die Hybridisierung mit der 51er Oligomer-Sonde erfolgt bei 50°C in frischer Hybridisierungslösung über vier Stunden. Die Konzentration der radioaktiven Sonde in der Hybridisierungslösung beträgt 5×10⁴ cpm/ml. Die Nitrocellulosefilter werden bei 45°C in 1×SSC und 0,1% SDS (Gewicht/Volumen) 60 Min. lang gewaschen und über Nacht einem Röntgenfilm bei -70°C ausgesetzt. Am nächsten Tag wird die 51er Sonde durch 10minütiges Kochen in einer 10 mM EDTA und 1%igen wäßrigen Glycerol-Lösung entfernt. Die Filter werden einem zweiten Screening-Verfahren mit der 32er Sonde unterworfen. Nur an drei Stellen auf den 20 Filtern wird ein starkes eindeutiges Signal mit beiden Sonden beobachtet. Bakterienklone von diese Stellen werden durch Ausstreichen und erneute Kultivierung auf kleinen Agarplatten ein zweites Mal untersucht. Dabei wird die Bakteriendichte soweit herabgesetzt, daß die Kolonien einzeln stehen und nicht mit Nachbarkolonien vermischt sind. Die Analyse von jeweils 30 Kolonien aus den drei positiven Regionen ergibt schließlich 3 unabhängige Bakterienklone, die mit beiden Sonden reagieren.The so-called colony hybridization for bacterial clones is used large colony densities. Approximately 200,000 liver-specific bacteria cDNA library (Haefliger, J.-A., Jenne, D., Stanley, K.K. and Tschopp, J., Biochem. Biophys. Res. Commun. 149, 750-754, 1987) are spread on 20 ampicillin-containing (50 µg / ml) agar plates measuring 22 cm × 22 cm. 10 g / l Bacto-Trypton, 5 g / l NaCl, and 1.6% (w / v) BactoAgar are used as agar medium used. After the bacteria are grown overnight at 37 ° C for 20 hours the roundish colonies, about 1 mm in size, are replaced by simple Clap off the agar plates onto nitrocellulose filters (Schleicher and Schüll) transferred. The bacterial colonies appear on the original agar soils cultivated for 7 hours and thus a replica capable of reproduction each colony laid out on the nitrocellulose filters. The bacteria columns on The nitrocellulose filters are replaced by sodium dodecyl sulfate and sodium hydroxide solution solubilized. During the incubation of the nitrocellulose filter in alkaline Solution, the bacterial DNA is released, denatured and as a single strand DNA bound to the filter membrane. After a few washes with neutral ones Buffering fixes the DNA to the nitrocellulose by heating (Davies, L.G., Dibner, M.D. and Battey, J.F., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New York, 1986). To the non-specific binding of To prevent probe from nitrocellulose, the filters are left for four hours pre-hybrized at 50 ° C. The solution consists of 6 × SSC (1 × SSC contains 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate), 5 × Denhardt's solution (according to Maniatis, T. et al. in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982), 0.1% Sodium dodecyl sulfate, 10 mM EDTA and 50 µg / ml sonicated and by five minutes Boil denatured salmon sperm DNA (= hybridization solution). The hybridization the 51 oligomer probe is used at 50 ° C in fresh hybridization solution over four hours. The concentration of the radioactive probe in the Hybridization solution is 5 × 10⁴ cpm / ml. The nitrocellulose filters become washed at 45 ° C in 1 × SSC and 0.1% SDS (weight / volume) for 60 min and Exposed to an x-ray film at -70 ° C overnight. The next day the 51 probe by boiling for 10 minutes in a 10 mM EDTA and 1% aqueous Glycerol solution removed. The filters undergo a second screening process subjected to the 32 probe. Only in three places on the 20 filters a strong clear signal was observed with both probes. Bacterial clones of these places are made by streaking and re-cultivating on small ones Agar plates examined a second time. The bacterial density is so far reduced that the colonies stand alone and not with neighboring colonies are mixed. Analysis of 30 colonies each from the three positive ones Regions finally yielded 3 independent bacterial clones, using both probes react.

d) Characterization and isolation of the cDNA of the clone ZLI-1

Das rekombinante Plasmid des Klon ZLI-1 wird nach einer Routine-Methode isoliert und durch Restriktionssenzyme analysiert (L. G. Davies et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New York, 1986). Die DNA wird mit den Restriktionsenzymen Bam HI und Kpn I gespalten. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die Größe der DNA-Insertion im pGEM4 Vektor bestimmt. Die Länge der cDNA beläuft sich auf 1,7 kb; es sind keine internen Bam HI und Kpn I Schnittstellen vorhanden (Abb. 1). Ungefähr 20 µg der cDNA werden durch Agarose-Gelelektrophorese vom pGEM4 Vektor-Plasmid getrennt und für die DNA-Sequenz-Bestimmung gereinigt.The recombinant plasmid of clone ZLI-1 is isolated according to a routine method and analyzed by restriction enzymes (LG Davies et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New York, 1986). The DNA is cleaved with the restriction enzymes Bam HI and Kpn I. The DNA fragments obtained are separated by agarose gel electrophoresis and the size of the DNA insert in the pGEM4 vector is determined. The length of the cDNA is 1.7 kb; there are no internal Bam HI and Kpn I interfaces ( Fig. 1). Approximately 20 μg of the cDNA are separated from the pGEM4 vector plasmid by agarose gel electrophoresis and purified for the DNA sequence determination.

e) cDNA base sequence determination

Die cDNA des Klons ZLI-1 wird nach Selbstligation durch Beschallung im Ultraschallwasserbad in zufallsmäßig verteilte Subfragmente zerlegt und durch Elektrophorese in 1,3%iger NA-Agarose (Pharmacia) der Größe nach fraktioniert. Diejenigen Fragmente, die in den Molekulargewichtsbereich von 300 bis 600 bp fallen, werden isoliert und die Enden mit Hilfe der T4 DNA-Polymerase repariert, so daß glatte Enden entstehen. Die auf diese Weise hergestellten cDNA-Stücke werden in die Sma I Restriktionsschnittstelle des M13mp8 Vektors unter Verwendung von T4 DNA Ligase eingefügt. Die einzelsträngigen Phagen des M13 Vektors werden nach Standardmethoden präpariert (L. G. Davies et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New York, 1986) und die Nukleotidsequenz von etwa 50 Subfragmenten mit Hilfe des Sequenase-Kits (United States Biochemical Corporation) bestimmt. Die Nukleotidbasensequenz der ZLI-1 cDNA wire auf beiden Strängen mindestens einmal bestimmt. Die sich überlappenden Teilsequenzen werden mit Hilfe eines Mikrocomputers verglichen und zur Gesamtsequenz zusammengefügt (Abb. 2). After self-ligation, the cDNA of the clone ZLI-1 is broken down into randomly distributed subfragments by sonication in an ultrasonic water bath and size-fractionated by electrophoresis in 1.3% NA agarose (Pharmacia). Those fragments that fall within the molecular weight range of 300 to 600 bp are isolated and the ends are repaired using T4 DNA polymerase, so that blunt ends are formed. The cDNA pieces thus prepared are inserted into the Sma I restriction site of the M13mp8 vector using T4 DNA ligase. The single-stranded phages of the M13 vector are prepared by standard methods (LG Davies et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New York, 1986) and the nucleotide sequence of approximately 50 subfragments is determined using the Sequenase kit (United States Biochemical Corporation) . The nucleotide base sequence of the ZLI-1 cDNA wire was determined at least once on both strands. The overlapping partial sequences are compared with the aid of a microcomputer and combined to form the overall sequence ( Fig. 2).

f) Southern analysis of the rat and human genome

5 µg Gesamt-DNA des Menschen und der Ratte (Genofit, Genf) werden mit Hilfe der Restriktionenzyme Bam HI, Bgl II, Eco RI und Hind III in Fragmente zerlegt und danach in 0,8% Agarose elektrophoretisch aufgetrennt. Nach Überführung auf eine Nylon-Membran durch die Vakuum-Blot-Methode (Pharmacia-LKB) wird die Filtermembran mit Hilfe radioaktiv-markierter einzelsträngiger cDNA des ZLI-1 Klons analysiert. Die cDNA Sonde hybridisiert mit ein bis höchstens drei Fragmenten im Genom der Ratte und des Menschen je nachdem, welches der fünf Restriktionsenzyme verwendet wird (Abb. 3). Die Tatsache, daß man sowohl bei der Ratte (Eco RI) als auch beim Menschen (Bam HI) die komplette cDNA-Sequenz des ZLI auf einem einzigen Restriktionsfragment lokalisieren kann, beweist, daß es nur ein einziges Gen für die Biosynthese des Zytolyse-Inhibitors bei der Ratte und beim Menschen gibt.5 µg of total human and rat DNA (Genofit, Geneva) are broken down into fragments using the restriction enzymes Bam HI, Bgl II, Eco RI and Hind III and then electrophoresed in 0.8% agarose. After transfer to a nylon membrane by the vacuum blot method (Pharmacia-LKB), the filter membrane is analyzed using radioactive-labeled single-stranded cDNA from the ZLI-1 clone. The cDNA probe hybridizes with one to a maximum of three fragments in the rat and human genome, depending on which of the five restriction enzymes is used ( Fig. 3). The fact that both the rat (Eco RI) and the human (Bam HI) can locate the complete cDNA sequence of the ZLI on a single restriction fragment proves that there is only one gene for the biosynthesis of the cytolysis inhibitor in the rat and in humans.

Example 2 Purification, biochemical characterization and identification of ZLI with the help monoclonal antibody a) Isolation of the ZLI and S proteins from complement-activated serum

Der alternative Weg der Komplement-Kaskade wird in 1 l humanen Serum durch Zugabe von Inulin (10 mg/ml, Merck) aktiviert. Der entstandene lösliche terminale Komplement-Komplex, der sog. "SC5b-9-Komplex", wird nach Bhakdi und Roth (J. Immunol., 127, 576-582, 1981) isoliert. Im Falle der Abwesenheit von Zielzell-Membranen bei der Komplementaktivierung, entsteht dieser Komplex durch die Zusammenlagerung der Komplement-Proteine C5b, C6, C7, C8, C9, S-Protein und ZLI. In Anwesenheit von anionischen Detergenzien dissoziieren S-Protein und ZLI vom Komplex ab. Zu einer Lösung von 0,6 mg bis 1,2 mg/ml SC5b-9 Komplex wird 250 mM Deoxycholat (DOC) in fester Form dazugegeben. Diese Lösung wird in Anwesenheit von 2 mM PMSF bei 37°C eine Stunde inkubiert. Je 4 ml wurden auf einen linearen Sucrosegradienten (40 ml totales Volumen, 10 Gew.-% bis 40 Gew.-% Sucrose in 6,25 mM DOC, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,1, 50 mM NaCl und 7,5 mM NaN₃) geladen und 3 Stunden bei 4°C und 250 000 g in einem Beckman Vertikalrotor (Typ VTi-50) zentrifugiert. 2 ml Fraktionen werden vom Boden des Zentrifugenröhrchens gesammelt. Die Fraktionen, welche S-Protein und ZLI enthalten, werden gepoolt und ca. 5fach konzentriert (Amicon PM10 Membranen). Die Proteine werden dann mit Hilfe einer Gelfiltrationssäule (Sephacryl S-300, 1 cm×60 cm Säule, Pharmacia) aufgetrennt. Der Äquilibrierungsspuffer ist 10 mM Tris-Hydrochlorid, 50 mM NaCl, pH 8,1. ZLI und S-Protein eluieren in einem Peak. Die Fraktionen werden konzentriert (Proteinkonzentration zwischen 0,4 mg/ml und 0,6 mg/ml) und bei -20°C aufbewahrt.The alternative way of the complement cascade is in 1 l human serum Addition of inulin (10 mg / ml, Merck) activated. The resulting soluble Terminal complement complex, the so-called "SC5b-9 complex", is according to Bhakdi and Roth (J. Immunol., 127, 576-582, 1981) isolated. In the absence of Target cell membranes in complement activation, this complex arises from the assembly of the complement proteins C5b, C6, C7, C8, C9, S-protein and ZLI. In the presence of anionic detergents, S-protein and ZLI dissociate from the complex. To a solution of 0.6 mg to 1.2 mg / ml SC5b-9 complex 250 mM deoxycholate (DOC) was added in solid form. This solution will be in the presence incubated by 2 mM PMSF at 37 ° C for one hour. 4 ml were added to one linear sucrose gradient (40 ml total volume, 10% to 40% by weight Sucrose in 6.25 mM DOC, 10 mM Tris hydrochloride, pH 8.1, 50 mM NaCl and 7.5 mM NaN₃) loaded and 3 hours at 4 ° C and 250,000 g in a Beckman Vertical rotor (type VTi-50) centrifuged. 2 ml fractions are from the bottom of the Centrifuge tube collected. The fractions containing S protein and ZLI are pooled and concentrated approximately 5 times (Amicon PM10 membranes). The Proteins are then removed using a gel filtration column (Sephacryl S-300, 1 cm × 60 cm Column, Pharmacia) separated. The equilibration buffer is 10 mM Tris hydrochloride, 50 mM NaCl, pH 8.1. ZLI and S protein elute in one Peak. The fractions are concentrated (protein concentration between 0.4 mg / ml and 0.6 mg / ml) and stored at -20 ° C.

b) Production of monoclonal antibodies

500 µl des Gemisches aus S-Protein und ZLI werden in weibliche Balb/c Mäuse in komplettem Freundschen Adjuvanz (1 : 1; Vol./Vol.) subkutan eingespritzt. Nach 5 Wochen wird die Injektion von 500 µl des Antigens, diesmal in unvollständigem Freundschen Adjuvanz, wiederholt. Nach weiteren 5 Wochen werden 500 µl Antigen ohne Adjuvanz intraperitoneal verabreicht und die Mäuse dann nach 3-4 Tagen getötet.500 µl of the mixture of S-protein and ZLI are in female Balb / c mice complete Freund's adjuvant (1: 1; v / v) injected subcutaneously. After 5 Weeks will be the injection of 500 µl of the antigen, this time incomplete Freund's adjuvant, repeated. After a further 5 weeks, 500 ul antigen administered intraperitoneally without adjuvant and then the mice after 3-4 days killed.

Myelom-Zellen werden in RPMI 1640 Medium kultiviert, welches zusätzlich 10% inaktiviertes fötales Kälberserum, 1% Glutamin, 5000 U/ml Penicillin, 5 µg/ml Streptomycin und 0,02 mM 2-Mercaptoäthanol enthält (Myelom-Medium). Die Myelom-Zellen werden bei 37°C in 12 Petrischalen von 9 cm Durchmesser solange kultiviert, bis sie anfangen, konfluent zu werden. Die Myelom-Zellen und die Zellen der Milz einer immunisierten Maus werden in Serum-freiem Medium miteinander gemischt und bei 1200 Umdrehungen pro Minute pelletiert. Das Zell-Sediment wird in 2 ml der Fusionslösung (50% PEG 4000 in RPMI 1640) vorsichtig resuspendiert und 2 Min. lang bei 37°C langsam mit einer Pipette gemischt. Die Fusionslösung wird dann mit 20 ml RPMI 1640 verdünnt. Danach werden die Zellen sedimentiert und in 20 ml frischem Myelom-Medium auf 4 Mikrotiterplatten (96 Kammern) verteilt. Die Kulturkammern enthalten Macrophagen, welche durch Spülung der Peritonealhöhle von 2 Mäusen gewonnen werden. An jedem darauffolgenden zweiten Tag wird das Myelom-Medium, das zwecks Selektion dann zusätzlich 0,1×10^-2 mM Hypoxanthin, 4×10^-4 mM Aminopterin und 1,6×10^-2 mM Thymidin (=HAT-Medium) enthält, gewechselt. Hybridoma-Kulturüberstände werden mit Hilfe eines ELISA-Testes auf ZLI- und S-Protein-spezifische monoklonale Antikörper hin untersucht. Positive Hybridoma-Zellen werden 3× kloniert und anschließend in Balb/c Mäuse, die mit 500 ml Pristan vorbehandelt worden sind, eingespritzt. Aszites-Flüssigkeit wird 2-3 Wochen später aus der Bauchhöhle abpunktiert (Jenne, D., Hugo, F. und Bhakdi, S., Biosci. Rep. 5, 343-352, 1985). Der monoklonale Antikörper, ZLI-9, ist nicht gegen das S-Protein gerichtet und wird zur Affinitätsreinigung von ZLI benutzt (Bhakdi, S., Jenne, D., Hugo, F., J. Immunol. Meth. 80, 25-32, 1985). Durch Immunisierung mit gereinigtem ZLI werden weitere Immunglobulin-sezernierende Hybridoma-Linien etabliert. Die Hybridoma-Linie mit der Bezeichnung ZLI-9 wurde bei der European (Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, SP4 OJG, Großbritannien unter der "provisional accession number 89 052 602", hinterlegt. Die von ZLI-9 sezernierten monoklonalen Antikörper reagieren mit reduziertem und nichtreduziertem ZLI im Western Blot analog wie in Beispiel 2, e).Myeloma cells are cultivated in RPMI 1640 medium, which additionally contains 10% inactivated fetal calf serum, 1% glutamine, 5000 U / ml penicillin, 5 µg / ml streptomycin and 0.02 mM 2-mercaptoethanol (myeloma medium). The myeloma cells are cultivated at 37 ° C. in 12 petri dishes with a diameter of 9 cm until they start to become confluent. The myeloma cells and the spleen cells of an immunized mouse are mixed together in serum-free medium and pelleted at 1200 revolutions per minute. The cell sediment is carefully resuspended in 2 ml of the fusion solution (50% PEG 4000 in RPMI 1640) and slowly mixed with a pipette at 37 ° C. for 2 minutes. The fusion solution is then diluted with 20 ml RPMI 1640. The cells are then sedimented and distributed in 4 ml microtiter plates (96 chambers) in 20 ml of fresh myeloma medium. The culture chambers contain macrophages, which are obtained by flushing the peritoneal cavity of 2 mice. On each subsequent second day, the myeloma medium, which then contains 0.1 × 10 ^-2 mM hypoxanthine, 4 × 10 ^-4 mM aminopterin and 1.6 × 10 ^-2 mM thymidine (= HAT medium) for the purpose of selection , changed. Hybridoma culture supernatants are tested for ZLI and S protein specific monoclonal antibodies using an ELISA test. Positive hybridoma cells are cloned 3 × and then injected into Balb / c mice that have been pretreated with 500 ml pristan. Ascites fluid is punctured from the abdominal cavity 2-3 weeks later (Jenne, D., Hugo, F. and Bhakdi, S., Biosci. Rep. 5, 343-352, 1985). The monoclonal antibody, ZLI-9, is not directed against the S protein and is used for affinity purification of ZLI (Bhakdi, S., Jenne, D., Hugo, F., J. Immunol. Meth. 80, 25-32 , 1985). Additional immunoma-secreting hybridoma lines are established by immunization with purified ZLI. The hybridoma line with the designation ZLI-9 was deposited with the European (Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, SP4 OJG, Great Britain under the "provisional accession number 89 052 602". The monoclonal antibodies secreted by ZLI-9 react with reduced and non-reduced ZLI in a Western blot analogous to example 2, e).

c) ZLI affinity purification

Der monoklonale Antikörper ZLI-9 wird aus 1 ml Aszites-Flüssigkeit gereinigt. Dazu wird die Aszites-Flüssigkeit über eine 2 ml Protein-A Sepharose-Säule gegeben, welche in 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,4, 150 mM NaCl (nachfolgend TBS genannt) äquilibriert ist. Die Antikörper werden mit 10 ml 0,2 M Glycin, pH 2,8, 0,5 M NaCl eluiert. 4 mg des gereinigten Antikörpers werden anschließend an 1,5 ml Bromcyan-aktivierte Sepharose gekoppelt (gemäß der Vorschrift des Herstellers Pharmacia). Für eine zweite Säule werden 20 mg humanes Immunglobulin (Sandoglobin, Rotes Kreuz, Bern) an 4 ml Bromcyan-aktivierte Sepharose gekoppelt. 20 ml frisches humanes EDTA Plasma (10 mM EDTA), werden mit 10 ml TBS verdünnt und zuerst auf die humane IgG-Affinitätssäule aufgetragen (äquilibriert in TBS). Die nicht absorbierten Proteine werden danach über die anti-ZLI Affinitätssäule geschickt. Diese Säule wird mit 10 ml TBS-Puffer, dem 1,5 M NaCl zugemischt worden sind, gewaschen. Reines ZLI wird mit 10 ml 0,2 M Glycin-Puffer, 0,5 M NaCl, pH 2,8 eluiert. Ungefähr 0,5 mg ZLI können so in einem Puffervolumen von 5 ml gewonnen werden. Gereinigtes ZLI wird gegen TBS dialysiert (16 Stunden) und entweder bei 4°C für einige Tage gelagert oder in kleinen Portionen (100 µl) tiefgefroren (-20°C). The monoclonal antibody ZLI-9 is purified from 1 ml of ascites fluid. To do this, the ascites fluid is passed through a 2 ml Protein-A Sepharose column given in 10 mM Tris hydrochloride, pH 7.4, 150 mM NaCl (hereinafter Called TBS) is equilibrated. The antibodies are mixed with 10 ml of 0.2 M glycine, pH 2.8, 0.5 M NaCl eluted. 4 mg of the purified antibody are then coupled to 1.5 ml of cyanogen-activated Sepharose (according to the instructions of Manufacturer Pharmacia). For a second column, 20 mg of human immunoglobulin (Sandoglobin, Rotes Kreuz, Bern) on 4 ml cyanogen-activated Sepharose coupled. 20 ml of fresh human EDTA plasma (10 mM EDTA) are mixed with 10 ml Dilute TBS and apply first to the human IgG affinity column (equilibrated in TBS). The non-absorbed proteins are then via the anti-ZLI Sent affinity column. This column is filled with 10 ml of TBS buffer, the 1.5 M NaCl have been added, washed. Pure ZLI is mixed with 10 ml 0.2 M glycine buffer, 0.5 M NaCl, pH 2.8 eluted. About 0.5 mg of ZLI can be used in one Buffer volume of 5 ml can be obtained. Purified ZLI is dialyzed against TBS (16 hours) and either stored at 4 ° C for a few days or in small Portions (100 µl) frozen (-20 ° C).

d) ZLI amino acid sequence

10 µg des gereinigten ZLI werden gegen 10 mM Ammoniumacetat, pH 8,0, dialysiert und auf eine Polybren-behandelte Glasfibermembran aufgetropft. Die einzelnen Aminosäuren werden nach der Methode von Edman schrittweise abgebaut und mit Hilfe einer HPLC-Anlage analysiert (Applied Biosystems).10 µg of the purified ZLI are dialyzed against 10 mM ammonium acetate, pH 8.0 and dropped onto a polybrene-treated glass fiber membrane. The single ones Amino acids are gradually degraded using the Edman method and with Analyzed using an HPLC system (Applied Biosystems).

e) Detection of ZLI in plasma and in semen

Die sogenannte "Western Blot"-Analyse eignet sich besonders gut zur Identifizierung von ZLI. Dabei werden 1 µl der 1 : 10 verdünnten Samenflüssigkeit oder 10 µl einer 1 : 10 verdünnten Serumlösung durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970) nach Molekulargewichten aufgetrennt. Die Proteine werden anschließend elektrophoretisch auf Nitrocellulosemembranen (Schleicher & Schüll, 15 cm×10 cm) transferiert (Towbin, H., Staehelin, T. und Gordon, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4355, 1979). Der Elektrophoresepuffer besteht aus 25 mM Tris-Hydrochlorid, 192 mM Glycin und 20 Vol.-% Methanol. Die Proteine werden 3 Stunden bei 60 V und 220 mA transferiert. Die Nitrocellulosemembranen werden in Sättigungspuffer (1% Gelatine (Merck), 0,1% Rinder-Albumin (Böhringer), 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA und 0,02% Natriumazid) eine Stunde lang inkubiert, dreimal mit TBS gewaschen und über Nacht mit Aszites-Flüssigkeit des monoklonalen Antikörpers ZLI-9 (1 : 1000 verdünnt) in Inkubationspuffer (=Sättigungspuffer ohne Rinder-Albumin) inkubiert. Nach 3maligem Waschen in TBS (jeweils 5 Minuten) wird entweder ein Protein A-Peroxidase-Konjugat (1 : 1000 verdünnt, Sigma) oder ein Anti-Maus-IgG-Peroxidase-Konjugat (1 : 1000 verdünnt, Dakopatis) dazugegeben. Die Nitrocellulosemembranen werden zwei weitere Stunden inkubiert. Die Peroxidase-Aktivität bestimmt man mit 4-Chlor-1-naphthol (Merck 0,075%) in Gegenwart von 0,01% (Vol./Vol.) H₂O₂ in einem Puffergemisch, welches aus 20 Vol.-% Methanol und 80 Vol.-% 10 mM wäßriger Tris-HCl, pH 6,8 besteht. ZLI läßt sich deutlich als eine Bande im Molekulargewichtsbereich von 70 000 Dalton nachweisen. Der Antikörper ZLI-9 reagiert mit nichtreduziertem humanem ZLI, nicht jedoch mit reduziertem ZLI oder mit ZLI von anderen Tierspecies. The so-called "Western blot" analysis is particularly suitable for identification by ZLI. 1 µl of the 1:10 diluted semen or 10 µl a 1:10 diluted serum solution by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970) separated by molecular weights. The Proteins are then electrophoresed on nitrocellulose membranes (Schleicher & Schüll, 15 cm × 10 cm) transferred (Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4355, 1979). The electrophoresis buffer consists of 25 mM Tris hydrochloride, 192 mM glycine and 20 vol.% Methanol. The proteins are transferred for 3 hours at 60 V and 220 mA. The Nitrocellulose membranes are in saturation buffer (1% gelatin (Merck), 0.1% Bovine albumin (Böhringer), 20 mM Tris hydrochloride, pH 8.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA and 0.02% sodium azide) incubated for one hour, washed three times with TBS and overnight with ascites fluid from the monoclonal antibody ZLI-9 (diluted 1: 1000) in incubation buffer (= saturation buffer without bovine albumin) incubated. After washing 3 times in TBS (5 minutes each) either a protein A peroxidase conjugate (diluted 1: 1000, Sigma) or a Anti-mouse-IgG-peroxidase conjugate (diluted 1: 1000, Dakopatis) was added. The Nitrocellulose membranes are incubated for an additional two hours. Peroxidase activity determined with 4-chloro-1-naphthol (Merck 0.075%) in the presence of 0.01% (vol./vol.) H₂O₂ in a buffer mixture consisting of 20 vol .-% methanol and 80 vol% 10 mM aqueous Tris-HCl, pH 6.8. ZLI is clear as a band in the molecular weight range of 70,000 daltons. The Antibody ZLI-9 reacts with unreduced human ZLI, but not with reduced ZLI or with ZLI from other animal species.

Example 3 Biological activity of ZLI a) Inhibition of complement-mediated lysis by ZLI

Im folgenden werden die funktionellen, hemmenden Eigenschaften der natürlichen ZLI-Plasmakomponente, so wie sie nach Beispiel 2c aus Plasma gereinigt wurde, im Komplement-Lysetest untersucht. Für den Lysetest werden Schafserythrozyten (Biomerieux, 1×10⁹ Zellen pro ml) verwendet. Die Komplementproteine C5b-6 (Podack, E. R. and Müller-Eberhard, H.-J., J. Immunol. 124, 332-336, 1980), C7 (Podack, E. R., Kolb, W. P., Esser, A. F. and Müller-Eberhard, H. J., J. Immunol. 123, 1071-1077, 1979), C8 (Kolb, W. P. and Müller-Eberhard, H. J., J. Exp. Med. 143, 1131-1139, 1976) und C9 (Podack, E. R., Tschopp, J. and Müller-Eberhard, H. J., J. Exp. Med. 156, 268-282) werden nach Standardmethoden gereinigt. 1 µg C5b-6, das in Abwesenheit von ZLI unter den nachfolgend genannten Bedingungen ca. 80% der Erythrozyten lysiert, werden mit 30 µl Schafserythrozyten in 10 mM Veronal Puffer, pH 7,4, 142 mM NaCl, 0,1% Gelatine und 10 mM EDTA (abgekürzt GVBE) vermischt und 20 Minuten lang bei 25°C inkubiert. Anschließend werden C7 (1 µg/ml Endkonzentration), C8 (0,2 µg/ml Endkonzentration) und C9 (1 µg/ml Endkonzentration), C8 (0,2 µg/ml Endkonzentration) und C9 (1 µg/ml Endkonzentration) sowie ZLI in verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 0,25 µg/ml bis 50 µg/ml in einem Volumen von insgesamt 30 µl dazugegeben. Vor der Zugabe sind die vier Proteine 5 Minuten lang bei Raumtemperatur vorinkubiert worden. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 37°C werden die intakten Erythrozyten abzentrifugiert (1500 rpm, 2 Minuten) und die Menge des in den Überstand freigesetzten Hämoglobins bei 412 nm Wellenlänge im Spektrophotometer bestimmt.The following are the functional, inhibitory properties of the natural ZLI plasma component, as was purified from plasma according to Example 2c, examined in the complement lysis test. Sheep erythrocytes are used for the lysis test (Biomerieux, 1 × 10⁹ cells per ml) used. The complement proteins C5b-6 (Podack, E.R. and Müller-Eberhard, H.-J., J. Immunol. 124, 332-336, 1980), C7 (Podack, E.R., Kolb, W.P., Esser, A.F. and Müller-Eberhard, H.J., J. Immunol. 123, 1071-1077, 1979), C8 (Kolb, W.P. and Müller-Eberhard, H.J., J. Exp. Med. 143, 1131-1139, 1976) and C9 (Podack, E.R., Tschopp, J. and Müller-Eberhard, H. J., J. Exp. Med. 156, 268-282) are cleaned by standard methods. 1 µg C5b-6, which is in the absence of ZLI under the following conditions Approx. 80% of the erythrocytes are lysed with 30 μl sheep erythrocytes in 10 mM Veronal buffer, pH 7.4, 142 mM NaCl, 0.1% gelatin and 10 mM EDTA (abbreviated GVBE) mixed and incubated at 25 ° C for 20 minutes. Then C7 (1 µg / ml final concentration), C8 (0.2 µg / ml final concentration) and C9 (1 µg / ml final concentration), C8 (0.2 µg / ml final concentration) and C9 (1 µg / ml final concentration) and ZLI in various concentrations in the range of 0.25 µg / ml up to 50 µg / ml in a total volume of 30 µl. Before the In addition, the four proteins are preincubated for 5 minutes at room temperature been. After an incubation of 30 minutes at 37 ° C, the intact Erythrocytes centrifuged (1500 rpm, 2 minutes) and the amount of in the Supernatant released hemoglobin at 412 nm wavelength in the spectrophotometer certainly.

b) Inhibition of perforin-mediated lysis by ZLI

Perforin wird nach der Methode von Masson, D. und Tschopp, J., J. Biol. Chem. 260, 9069-9072, 1985, gereinigt. 30 µl Schafserythrozyten (1×10⁹ Zellen/ml) werden zuerst mit 30 µl ZLI (verschiedene Konzentrationen) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur vorinkubiert. Perforin, welches in GVBE soweit verdünnt wird, daß bei dem Test 80% der Erythrozyten lysieren, wird in 30 µl Puffervolumen dazugemischt. Nach 30minütiger Inkubation bei 37°C wird das Ausmaß der Erythrozyten-Lyse, wie oben beim Komplement-Lysetest beschrieben, ermittelt. Perforin is made according to the method of Masson, D. and Tschopp, J., J. Biol. Chem. 260, 9069-9072, 1985. 30 µl sheep erythrocytes (1 × 10⁹ cells / ml) are first with 30 µl ZLI (various concentrations) for 10 minutes Pre-incubated room temperature. Perforin, which is diluted so far in GVBE, that 80% of the erythrocytes lyse in the test is in 30 ul buffer volume mixed in. After 30 minutes of incubation at 37 ° C, the extent of erythrocyte lysis, as described above for the complement lysis test.

c) Inhibition of staphylococcal α-hemolysin-mediated lysis by ZLI

Staphylococcus aureus zählt zu den häufigsten bakteriellen Krankheitserregern beim Menschen. Das von fast allen menschenpathogenen Staphylococcus aureus-Stämmen gebildete α-Hämolysin wird heute als ein wichtiger Pathogenitätsfaktor angesehen. S. aureus sezeniert das α-Hämolysin als ein wasserlösliches monomeres Protein mit einem Molekulargewicht von 34 000. Auf der Plasmamembran von eukaryontischen Zielzellen lagern sich jeweils 6 Toxinmonomere zu einem hydrophilen, transmembranalen Kanal mit einem Durchmesser von 1-2 mm zusammen. Dadurch kommt es zu einer Störung des ionischen Milieus im Inneren der Zelle, zu einem raschen Einstrom von Kalzium aus dem Extrazellulärraum und im Extremfall zu einer kolloidosmotisch-bedingten Lyse der Zielzelle. In sublytischen Konzentrationen kann die Arachidonsäurekaskade mit Freisetzung von hochaktiven Prostaglandinen und Leukotrienen in Endothelzellen aktiviert werden. Menschliche Blutplättchen sind besonders empfindlich gegenüber subzytolytischen Dosen von Staphylokokken-α-Hämolysin. Durch die Toxinwirkung auf Plättchen kommt es zur Plättchenaggregation und Reduktion der Gerinnungszeit im Plättchen-reichen Plasma (Bhakdi et al., J. Exp. Med., 168, 527-542, 1988).Staphylococcus aureus is one of the most common bacterial pathogens in humans. That of almost all human-pathogenic Staphylococcus aureus strains α-Hemolysin formed is now considered an important pathogenicity factor viewed. S. aureus stages the α-hemolysin as a water-soluble monomer Protein with a molecular weight of 34,000. On the plasma membrane of eukaryotic target cells each store 6 toxin monomers to form a hydrophilic, transmembrane canal with a diameter of 1-2 mm together. Thereby the ionic environment inside the cell is disturbed a rapid influx of calcium from the extracellular space and in extreme cases to colloid-osmotic lysis of the target cell. In sublytic concentrations can the arachidonic acid cascade with the release of highly active Prostaglandins and leukotrienes are activated in endothelial cells. Human Platelets are particularly sensitive to subcytolytic doses of staphylococcal α-hemolysin. It happens due to the toxin effect on platelets for platelet aggregation and reduction of clotting time in platelet-rich Plasma (Bhakdi et al., J. Exp. Med., 168, 527-542, 1988).

Bisher geht man davon aus, daß spezifische neutralisierende Antikörper im Blutplasma und β-Lipoproteine (Plasma-LDL) die einzigen Faktoren darstellen, die Staphylokokken-α-Hämolysin-Moleküle inaktivieren können.So far it is assumed that specific neutralizing antibodies in the blood plasma and β-lipoproteins (plasma LDL) are the only factors that Can inactivate staphylococcal α-hemolysin molecules.

Zum Nachweis der biologischen Aktivitäten von ZLI gegenüber dem Staphylokokken-α-Hämolysin werden frisch gewaschene Kaninchen-Erythrozyten in dem nachfolgend beschriebenen Testsystem verwendet. Staphylokokken-α-Hämolysin (Staphylolysin-Reagenz, 5 Einheiten pro Flasche, Behringwerke, Marburg) wird in GVB-Puffer (GVBE-Puffer ohne EDTA, siehe oben) verdünnt und bei 37°C eine halbe Stunde lang vorinkubiert. Danach werden zu 200 µl dieser Lösung 50 µl einer Kaninchen-Erythrozyten-Suspension (10⁸/ml) hinzugemischt. Nach einer halbstündigen Inkubation bei 37°C werden die Proben abzentrifugiert (2 min bei 12 000 g) und das freigesetzte Hämoglobin im Überstand bei 412 nm spektrophotometrisch gemessen. Totale Hämolyse wird nach Zugabe von Sodiumdodecylsulfat (Endkonzentration, 0,2 Gew.-%) gemessen. Eine 1 : 400 Verdünnung einer Arbeitslösung mit 0,04 Einheiten/ml ergibt eine 71%ige Hämolyse. Diese Toxin-Verdünnung (100 µ Einheiten/ml) wird mit verschiedenen ZLI-Konzentrationen eine halbe Stunde lang bei 37°C vorinkubiert, danach 50 µl der Kaninchen-Erythrozytensuspension hinzugefügt und nach weiteren 30 min bei 37°C die Hämolyse wie oben in den verschiedenen Ansätzen gemessen. Abb. 8 zeigt die Meßergebnisse dieser Versuche. Bereits unterhalb physiologischer Konzentration (Normalbereich: 50-100 µg/ml), bei ungefähr 15 µg ZLI/ml wird die Aktivität des Staphylokokken-α-Hämolysins fast vollständig unterdrückt.Freshly washed rabbit erythrocytes are used in the test system described below to demonstrate the biological activities of ZLI against staphylococcal α-hemolysin. Staphylococcal α-hemolysin (staphylolysin reagent, 5 units per bottle, Behringwerke, Marburg) is diluted in GVB buffer (GVBE buffer without EDTA, see above) and preincubated at 37 ° C for half an hour. Then 50 ul of a rabbit erythrocyte suspension (10⁸ / ml) are added to 200 ul of this solution. After incubation at 37 ° C. for half an hour, the samples are centrifuged off (2 min at 12,000 g) and the released hemoglobin in the supernatant is measured spectrophotometrically at 412 nm. Total hemolysis is measured after the addition of sodium dodecyl sulfate (final concentration, 0.2% by weight). A 1: 400 dilution of a working solution with 0.04 units / ml results in 71% hemolysis. This toxin dilution (100 μ units / ml) is pre-incubated with various ZLI concentrations for half an hour at 37 ° C., then 50 μl of the rabbit erythrocyte suspension is added and after a further 30 min at 37 ° C. the hemolysis as in the above measured different approaches. Fig. 8 shows the results of these tests. Already below physiological concentration (normal range: 50-100 µg / ml), at approximately 15 µg ZLI / ml, the activity of the staphylococcal α-hemolysin is almost completely suppressed.

Abb. 1 zeigt ein Schema des rekombinanten pGEM4/ZLI-1 Plasmids, das die vollständige kodierende Sequenz für den Zytolyse-Inhibitor enthält, und einige wichtige Restriktionsschnittstellen. Das Plasmid besitzt ein Ampicillin-Resistenz-Gen, das für das Enzym Beta-Lactamase kodiert, und den Sp6 bzw. T7 Promotor in unmittelbarer Nähe zur Klonierungsschnittstelle Bam HI im Polylinker. Die beiden Enden der cDNA-Insertion sind mit den Adaptor-Oligomeren A und B gemäß Haymerle, H., Herz, J., Bressan, G. M., Frank, R. and Stanley, K. K., Nucleic Acids Res. 154, 8615-8624, 1986, versehen. Dieses Plasmid wurde in E. coli K12 am 28. 3. 1989 bei der DSM unter der DSM-Nr. 5269 hinterlegt. Figure 1 shows a schematic of the recombinant pGEM4 / ZLI-1 plasmid, which contains the complete coding sequence for the cytolysis inhibitor, and some important restriction sites. The plasmid has an ampicillin resistance gene which codes for the enzyme beta-lactamase and the Sp6 or T7 promoter in the immediate vicinity of the Bam HI cloning interface in the polylinker. The two ends of the cDNA insertion are with the adapter oligomers A and B according to Haymerle, H., Herz, J., Bressan, GM, Frank, R. and Stanley, KK, Nucleic Acids Res. 154, 8615-8624, 1986. This plasmid was in E. coli K12 on March 28, 1989 at DSM under DSM-No. 5269 deposited.

Abb. 2 zeigt die Nukleotidbasen-Sequenz vom Klon ZLI-1 und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz in der Zeile darunter. Die amino-terminalen Sequenzen unterstrichen. Am linken Bildrand ist die Nummerierung der Nukleotidbasen, am rechten Bildrad die der Aminosäuren angegeben. Fig. 2 shows the nucleotide base sequence of clone ZLI-1 and the amino acid sequence derived therefrom in the line below. The amino-terminal sequences underlined. The numbering of the nucleotide bases is shown on the left edge of the picture, and the number of amino acids on the right side of the picture.

Abb. 3 zeigt die Ergebnisse der Southern-Analyse; am linken Bildrand ist die Position der Molekulargewichtmarker in Kilobasen angegeben. Fig. 3 shows the results of the Southern analysis; the position of the molecular weight markers in kilobases is indicated on the left edge of the image.

Abb. 4 zeigt das gereingte ZLI nach Auftrennung durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nichtreduzierenden (links) und reduzierenden Bedingungen (rechts). Fig. 4 shows the cleaned ZLI after separation by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing (left) and reducing conditions (right).

Abb. 5 Western-Blot Nachweis (Streifen 1 bis 3′) des ZLI in humanem Plasma (1), im gereinigten SC5b-9 Komplex (2), in Seminalflüssigkeit (3 und 3′). Streifen 4 zeigt die Proteine der Seminalflüssigkeit nach Anfärbung des SDS-Gels mit Commassie Blau. Fig. 5 Western blot detection (strips 1 to 3 ′) of the ZLI in human plasma (1), in the purified SC5b-9 complex (2), in seminal fluid (3 and 3 ′). Strip 4 shows the proteins of the seminal fluid after staining the SDS gel with Commassie Blue.

Abb. 6 Hemmung der Komplementlyse durch ZLI: ZLI hemmt die Lyse der Erythrozyten durch lösliches C5b-6, C7, C8 und C9 in konzentrationsabhängiger Weise (untere Kurve), nicht jedoch die Lyse von C5b-7 Erythrozytenzwischenstufen durch C8 und C9 (obere Kurve). Fig. 6 Inhibition of complement lysis by ZLI: ZLI inhibits the lysis of the erythrocytes by soluble C5b-6, C7, C8 and C9 in a concentration-dependent manner (lower curve), but not the lysis of C5b-7 erythrocyte intermediates by C8 and C9 (upper curve ).

Abb. 7 Hemmung der Perforin-vermittelten Erythrozytenlyse bei verschiedenen ZLI-Konzentrationen. Fig. 7 Inhibition of perforin-mediated erythrocyte lysis at various ZLI concentrations.

Abb. 8 Hemmung der Staphylokokken-α-Hämolysin-vermittelten Erythrozyten-Lyse durch ZLI. Fig. 8 Inhibition of staphylococcal α-hemolysin-mediated erythrocyte lysis by ZLI.

Staphylokokken-α-Hämolysin wird mit unterschiedlichen ZLI-Konzentrationen bei 37°C in GVB-Puffer vorinkubiert und danach mit einer Kaninchen-Erythrozyten-Suspension in GBV-Puffer vermischt. Subphysiologische ZLI-Konzentrationen (15 µg/ml) unterdrücken die Toxin-bedingte Lyse der Erythrozyten fast vollständig.Staphylococcal α-hemolysin is used with different ZLI concentrations Pre-incubated 37 ° C in GVB buffer and then with a rabbit erythrocyte suspension mixed in GBV buffer. Subphysiological ZLI concentrations (15 µg / ml) suppress the erythrocyte lysis caused by toxins almost completely.

Claims

1. DNA, code for the protein portion of a blood plasma component with an inhibitory effect on the target cell lysis mediated by complement proteins and on the perforin isolated from killer cells.

2. DNA according to claim 1, characterized in that it has the nucleotide base sequence shown in the formula below corresponds.

3. DNA according to one of claims 1 or 2, characterized in that it has an open reading frame starting with the 199th nucleotide base.

4. DNA according to one of claims 1 or 3, characterized in that the first 21 amino acids of the amino acid sequence derived from the nucleotide base sequence as a hydrophobic signal peptide during translocation into the endoplasmic Split off the reticulum.

5. DNA, characterized in that it is an allele to one of those in the previous DNA described claims.

6. DNA, characterized in that it is a degenerative form of one of those in the DNA described above claims.

7. DNA according to claims 1 to 6, characterized in that it is in a vector plasmid, which is replicable in eulkaryotes.

8. Plasmid pGEM4 / ZLI-1 (deposited in E. coli under DSM No. 5269).

9. host organism, characterized in that it contains a DNA according to claims 7 or 8 is transformed.

10. E. coli, characterized in that it is with the plasmid according to claim 8 is transformed.

11. A method for producing a DNA according to claim 7, characterized in that that you cut into one with the help of restriction endonucleases Vector DNA inserts an end-capped DNA for a Coded polypeptide with the properties of the cytolysis inhibitor.

12. Cytolysis inhibitor with the properties of the inhibitory effect on the Complement proteins mediated target cell lysis.

13. cytolysis inhibitor according to claim 12, characterized by the formula

14. Bioactive, derived from the natural sequence of the cytolysis inhibitor Polypeptides.

15. Pharmaceutically tolerable salts of the polypeptides according to one of the claims 12-14.

16. Monoclonal antibodies specific to segments of the cytolysis inhibitor and bind to the isolated cytolysis inhibitor.

17. Monoclonal antibody ZLI-9, characterized in that it is from the hybridoma line ZLI-9 (deposited with the ECACC under No. 89052602) is secreted.

18. Method for isolating the natural ZLI plasma component from human Plasma, characterized in that human plasma using monoclonal Antibody according to one of claims 16 and 17 of affinity chromatography submits.

19. Use of the proteins or the isolated plasma component according to one of the Claims 12 or 13 for therapeutic or prophylactic treatment of the human or animal body.

20. Use of the proteins or the isolated plasma component according to one of the Claims 12 or 13 for the manufacture of pharmaceutical preparations.

21. Use of the proteins or the isolated plasma component according to one of the Claims 12 or 13 as agents for the treatment of inflammatory and immunological related diseases and disease states caused by one Deficiency of the ZLI or the natural ZLI plasma component marked are.

22. Use of the proteins according to one of claims 12 or 13 as a means for Treatment of infertility in congenital or acquired deficiency in ZLI.

23. Use of those occurring in the cytolysis inhibitor of the Sennval liquid Carbohydrate structures for the production of a contraceptive vaccine.

24. Use of ZLI for the manufacture of agents for treating tissue-destructive Disease processes caused by complements and killer cells are conditional.

25. Use of ZLI for the production of agents for defoxification of membrane-active peptides and cytolytic proteins derived from pathogens, Mushrooms or insects are released.

26. Use of the ZLI-9 antibody to develop quantitative immunological Methods of determination for ZLI and ZLI-containing protein complexes in Body fluids in particular for the diagnosis of diseases caused by Changes in physiological ZLI levels or by the appearance of ZLI reaction products are labeled.